JP5586453B2 - 特異的薬理シャペロンによるゴーシェ病の治療および代理マーカーを用いた治療の監視 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、共に全体が参照により本明細書に援用されている２００７年４月１３日出願の米国仮特許出願６０／９１１，６９９号明細書および２００８年２月１２日出願の米国仮特許出願第６１／０２８，１２３号明細書に対する優先権を主張するものである。

本発明は、グルコセレブロシダーゼ、グルコシルセラミド、キトトリオシダーゼ、炎症性サイトカインおよびケモカイン、グルコシルセラミド含有マクロファージ、骨代謝マーカー類およびα−シヌクラインなどの特異的代理マーカーの存在およびレベルを判定することによりゴーシェ病を患う個体の特異的薬理シャペロンを用いた治療を監視するための方法を提供する。本発明は同様に、細胞レベルでの治療の効果を評価することにより、ゴーシェ病を患う個体の特異的薬理シャペロンを用いた治療を監視するための方法をも提供する。

ゴーシェ病
ゴーシェ病は、罹患した個体の細胞、特に単球およびマクロファージ内のスフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）の蓄積に関連するリソソーム蓄積障害である。ＧＳＬのこの異常な集積は、ＧＳＬグルコシルセラミド（ＧｌｕＣｅｒ）を破壊するリソソーム加水分解酵素であるリソソーム酵素酸性β−グルコシダーゼ（ＧＣａｓｅ；グルコセレブロシダーゼ）の遺伝的欠損（突然変異）によって起こる。Ｇｂａ変異の大部分は、ＧＣａｓｅタンパク質が小胞体（ＥＲ）内で誤った折畳みを行なう原因となる。誤って折畳まれたＧＣａｓｅは、ＥＲ品質管理系によって認識され、その後、処理されリソソームまで輸送される代りに分解される(非特許文献１)。

ゴーシェ病は、全体的疾病頻度が出生数５０，０００〜１００，０００人あたり約１件の割合の汎人種的疾病である。一部の個体群は、ゴーシェ病の比較的高い有病率を有する。例えばアシュケナージ系ユダヤ人の個体群においては、約１５人に１人が、Ｇｂａ変異のキャリヤである(非特許文献２)。国立ゴーシェ基金（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｇａｕｃｈｅｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）によると、約２５００人のアメリカ人がゴーシェ病を患っている。

ゴーシェ病は、常染色体劣性疾患であり、最も一般的なリソソーム蓄積症である。この疾患は、神経系病変および疾病の重症度に応じて３つの臨床タイプに分類された(非特許文献３）。１型は最も一般的であり、神経系病変が無いことを特徴とする。１型患者は、広範囲の重症度を示し、一生無症候であり続ける可能性もある。大部分の１型患者は、脾臓と肝臓の腫大、骨格異常および骨病変、および持続的炎症反応を示す。肝臓グルコセレブロシドレベルは、Ｉ型ゴーシェ病患者において、正常レベルの２３倍から３８９倍まで上昇する。

２型ゴーシェ病は最も稀で最も重症の形態であり、急性神経系疾患の早期開始が付随する。神経細胞障害性ゴーシェ病の特性は、水平注視の異常である。罹患した患者は進行性脳障害および錐体外路症候、例えば硬直およびパーキンソン様の動き（パーキンソニズム）を発生させる。大部分の２型ゴーシェ病患者は、神経機能の低下に起因する無呼吸または誤嚥のため小児期早期に死亡する。

３型ゴーシェ病も同様に神経系の病変を有するが、その程度は２型よりも低い。３型患者も１型に特徴的である肝脾腫大症および骨格異常、および運動協調不良（運動失調）、発作、眼筋の麻痺、てんかんおよび認知症を含めた中枢神経系症候を有する。３型ゴーシェ病を患う人は、成人となるまで生存できるが、寿命は短いかもしれない。３型には３つの亜型が報告されている。すなわち、顕著な肝脾腫大症と骨髄疾患が関連する３ａ型；限定的な全身性症候が関連する３ｂ型；および肝脾腫大症、角膜混濁、進行性失調症および認知症、および心臓弁および大動脈起始部の石灰化が関連する３ｃ型、である。

罹患したゴーシェ病患者において２００超のＧｂａ変異が同定された。大部分のゴーシェ病患者は、幾分かの残留ＧＣａｓｅ活性を示す。しかしながら、表現型と遺伝子型の相関関係が弱いことが、表現型変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）についての分子基盤を解明するための研究の問題となってきた(非特許文献４)。同じ遺伝的変異を内包する一組の双生児の間でさえ、表現型の一致が欠如している。これにも関わらず、３つの疾病タイプには異なる変異が関連している。少なくとも１つの対立遺伝子（ヘテロ接合体）上の点変異Ｎ３７０Ｓの存在は、ほぼ普遍的に、１型ゴーシェ病と関連する（非特許文献３、上掲書）。

治療
臨床所見のある１型および３型疾患の治療は、大部分が組換え型ＧＣａｓｅの酵素補充療法（ＥＲＴ）によるものである（Ｃｅｒｅｄａｓｅ（登録商標）およびＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）、Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｃ．）。骨髄移植（ＢＭＴ）も同様に、ゴーシェ病（１型および３型）向け治療として利用されてきた。マクロファージは骨髄系幹細胞に由来することから、少数のゴーシェ病患者において、同種骨髄移植（ＢＭＴ）が応用され成功を収めた。しかしながら、ＢＭＴには重症の病的状態と死亡率が随伴する可能性があり、適切な組織適合ドナーを有する患者の割合はわずかである。

タンパク質欠損症を治療するための第３の比較的最近の手法には、欠損している酵素タンパク質の天然の基質の合成を阻害して病状を改善させるための小分子阻害物質の使用が関与している。この「基質還元」手法（ＳＲＴ）は、ゴーシェ病を含む、リソソーム蓄積障害またはスフィンゴ糖脂質蓄積障害と呼ばれる約４０の関連する酵素障害からなる一連の障害について、具体的に記述されてきた。

特異的シャペロン戦略である第４の手法は、おそらくは小胞体（ＥＲ）またはその他の細胞タンパク質分解／排出システムにおいて、変異タンパク質を分解から救済する。特定の実施形態においては、この戦略は、特定のリソソーム障害に結びつけられる欠陥あるリソソーム酵素に対して特異的に結合する小分子可逆的阻害物質を利用する。治療が不在の場合、変異酵素はＥＲ内で誤って折畳まれ（非特許文献５）、最終製品に至るその成熟が遅延し、その後ＥＲに関連する分解経路を介して分解される。シャペロン戦略には、ＥＲ品質管理システムからの不当なまたは異常な分解または誤って折畳まれたタンパク質の細胞内蓄積を防止するための、変異タンパク質の正しい折畳みを促進する化合物の使用が関与する。これらの特異的シャペロンは、特異的薬理シャペロン（または活性部位特異的シャペロン）と呼称される。

シャペロン戦略は、全体が参照により本明細書に援用されているＦａｎらに対する特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、および特許文献５中にあるように、リソソーム蓄積障害に関与する酵素について記述され例示されてきた。ゴーシェ病患者の細胞由来のＧＣａｓｅの救済については、イミノ糖、イソファゴミン（ＩＦＧ）およびその誘導体を用いかつ（共に２００４年１１月１２日出願の係属中の特許文献６および特許文献７の中で記述されている）ＧＣａｓｅに特異的なその他の化合物を用いて記述された。かかる化合物としては、グルコイミダゾール（（５Ｒ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｓ）−５−ヒドロキシメチル−５，６，７，８−テトラヒドロイミダゾ［１，２ａ］ピリジン−６，７，８−トリオール）が含まれる。

代理マーカー
表現型の不一致にもかかわらず、ゴーシェ病患者は、この疾病のいくつかの一貫した代理マーカーを示し、治療に対する臨床応答を評価するために用いられる。本発明は、ゴーシェ病の少なくとも１つ、そして好ましくは多数の代理マーカーの変化を評価することにより、特異的薬理シャペロンによる治療後のゴーシェ病患者の治療を監視する方法に関する。

米国特許第６，２７４，５９７号明細書 米国特許第６，５８３，１５８号明細書 米国特許第６，５８９，９６４号明細書 米国特許第６，５９９，９１９号明細書 米国特許第７，１４１，５８２号明細書 米国特許出願第１０／９８８，４２８号明細書 米国特許出願第１０／９８８，４２７号明細書

Street et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2006; vol. 103; no. 37: 13813-18 Aharon-Peretz et al., New Eng. J. Med. 2004; 351: 1972-77 Cox et al., Q J Med. 2001; 94: 399-402 Sidransky, Mol. Genetics and Metab. 2004; 83: 6-15 Ishii et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1996; 220: 812-815

本発明は、ゴーシェ病に関連する代理マーカーの存在および／またはレベルの変化を評価することにより、酸性β−グルコシダーゼ（ＧＣａｓｅ）のための特異的薬理シャペロンを用いたゴーシェ病患者の治療を監視する方法であって、改善によってその個体がシャペロン療法に応答していることが標示される方法を提供する。

１つの実施形態において、代理マーカーは全身性代理マーカーである。

全身的代理マーカーには以下のものの少なくとも１つが含まれる：細胞および尿中のリソソームＧＣａｓｅ活性の減少；脂質を持ったマクロファージ（「ゴーシェマクロファージ」）の存在；肝脾腫大症；キトトリオシダーゼレベルの上昇；肝酵素レベルの上昇；ＬＡＭＰ−１およびサポシンＣを含めたリソソームタンパク質レベルの上昇；肺ケモカインＰＡＲＣ／ＣＣＬ１８レベルの上昇；血漿α−シヌクラインレベルの上昇；アンジオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）および総酸性ホスファターゼレベルの上昇；免疫学的欠陥例えば貧血症、血小板減少症、白血球減少症、高ガンマグロブリン血症、脾臓中のＴ−リンパ球の量の減少、全身性Ｂ細胞過剰増殖、形質細胞増加症、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１α、ＩＬ−６）および骨代謝および多発性骨髄腫に関連するものを含めたケモカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＶＥＧＦおよびＴＲＡＣＰ５ｂ、ＢＡＰ）のレベルの上昇、マクロファージ、リンパ球および好中球を含む組織または臓器内の炎症性病巣の存在、および好中球走化性の障害；骨格異常例えば骨髄内のゴーシェ細胞の浸潤、溶解性病変、骨硬化症、骨粗鬆症、骨クリーゼおよび骨痛、骨折、椎体圧潰、およびトリグリセリドレベルの低下；骨特異的アルカリホスファターゼレベルの低下；神経学的症候例えばニューロンの欠損、神経変性、水平注視異常、ミオクローヌス運動、角膜混濁、運動失調、認知症、痙性；発作、聴覚障害；認識機能障害；ゴーシェマクロファージの肺浸潤、および肺高血圧症。

１つの具体的実施形態においては、薬理シャペロンを用いたゴーシェ病治療の後に予想されるマーカーの組合せは、以下のものである：白血球、皮膚、脳脊髄液（ＣＳＦ）および尿中のβ−グルコセレブロシダーゼ（ＧＣａｓｅ）レベルの上昇；白血球、血漿、血清、尿、ＣＳＦおよび皮膚内のグルコセレブロシド（ＧｌｃＣｅｒ）レベルの低下；血漿およびＣＳＦ中のα−シヌクラインレベルの低下；血漿中の骨特異的アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）活性の増大；血漿中の酒石酸塩耐性酸ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＣＰ５ｂ）活性の減少、血漿中のキトトリオシダーゼ活性の低下；血漿および尿中の肺および活性化調節型ケモカイン（ＰＡＲＣ）の減少および血漿中のインタロイキン８、インタロイキン１７、ＶＥＧＦ ＭＩＰ−１βおよびＭＩＰ−１αレベルならびにＬＡＭＰ−１およびカテプシンＤの減少。評価される付加的なマーカーとしては、肝臓および脾臓体積のベースラインからの減少；ヘモグロビンレベルのベースラインからの上昇；ヘマトクリットレベルのベースラインからの変化；血小板数のベースラインからの変化；骨ミネラル濃度のベースラインからの改善；Ｘ線写真所見のベースラインからの改善；血漿、尿、白血球（ＷＢＣ）およびＣＳＦ中のＧＭ３レベルの低下；血漿およびＣＳＦ中のキトトリシダーゼ活性特にＣＳＦ中のＩＬ−８、ＩＬ−６、膜マーカーの減少が含まれる。

別の実施形態においては、代理マーカーは、細胞内代理マーカーである。

細胞内代理マーカーには以下のものの少なくとも１つが含まれる：ゴーシェ病患者由来の細胞内におけるＥＲからリソソームへのＧＣａｓｅの異常輸送；エンドソーム経路を通した細胞脂質の異常輸送；ＥＲまたは細胞質ゾル内における誤って折畳まれた大量のＧＣａｓｅの存在；（ストレス関連マーカーの遺伝子および／またはタンパク質発現により判定されるような）ＧＣａｓｅの毒性蓄積が起こすＥＲおよび／またはストレスの存在；エンドソームｐＨレベルの異常；単球上のＭＨＣＩＩおよび／またはＣＤ１ｄの血漿膜発現増大の存在；細胞形態の異常；ユビキチン／プロテアソーム経路の抑制；およびユビキチン化タンパク質の量の増加。

具体的実施形態においては、個体は心臓病変を伴う３型ゴーシェ病を有し、代理マーカーは大動脈および／または僧帽弁の石灰化である。

さらなる実施形態においては、療法中で使用される特異的薬理シャペロンは、酸性β−グルコシダーゼの阻害物質、例えば可逆的競合阻害物質である。

具体的実施形態においては、阻害物質はイソファゴミン、Ｃ−ベンジル−イソファゴミン、または、全て本明細書に参照により援用されている米国特許第６，５８３，１５８号明細書；同第６，７４４，１３５号明細書；同第６，５９９，９１９号明細書；同第６，５８９，９６４号明細書；同第６，９１６，８２９号明細書；同第７，１４１，５８２号明細書；同第５，８４４，１０２号明細書；同第５，８６３，９０３号明細書；同第６，０４６，２１４号明細書；同第５，８５４，２７２号明細書；同第６，５４１，８３６号明細書；同第６，３１６，４８９号明細書；同第６，２３９，１６３号明細書；同第６，５９０，１１８号明細書およびＰＣＴ出願国際公開第０４／０３７２３３号パンフレットの中で開示されている化合物である。

本発明は同様に、酸性β−グルコシダーゼに結合する有効量の特異的化学シャペロンを用いてゴーシェ病を治療しかつ細胞の細胞質染色に対するその効果を監視するための方法であって、異常の回復が、ゴーシェ病を患う個体がシャペロン治療に対し応答していることを表している方法も提供する。１実施形態においては、細胞質染色はリソソーム染色、特にリソソーム内の酸性β−グルコシダーゼまたはＬＡＭＰ−１発現の検出である。

別の実施形態においては、細胞質染色はポリユビキチン化タンパク質の検出である。

特定の実施形態においては、特異的薬理シャペロンは酸性β−グルコシダーゼの阻害物質例えば可逆的競合阻害物質である。

具体的実施形態においては、阻害物質はイソファゴミン、Ｃ−ベンジル−イソファゴミンまたはグルコイミダゾールである。

本特許出願は少なくとも１枚のカラー図面を含む。カラー図面を伴う本特許または特許出願のコピーは、特許庁に申請し所要手数料を支払うことで提供される。

健常なボランティアにおける酒石酸イソファゴミンの第１相多重逐次漸増用量試験からのＧＣａｓｅ増強の結果を示す。 イソファゴミン（ＩＦＧ）を用いた治療後の肝臓内におけるＧＣａｓｅ活性の変化を示す。 イソファゴミン（ＩＦＧ）を用いた治療後の脾臓内におけるＧＣａｓｅ活性の変化を示す。 イソファゴミン（ＩＦＧ）を用いた治療後の肺内におけるＧＣａｓｅ活性の変化を示す。 イソファゴミン（ＩＦＧ）を用いた治療後の脳内におけるＧＣａｓｅ活性の変化を示す。 ２〜２４週間後の体内組織（脾臓）の重量に対するイソファゴミンを用いた治療の効果を示す。 ２〜２４週間後の体内組織（肝臓）の重量に対するイソファゴミンを用いた治療の効果を示す。 ＩＦＧを用いた治療後のゴーシェ病のマウスモデルにおけるキトトリオシダーゼレベルの変化を示す。 ２週間、４週間および１２週間のＩＦＧを用いた治療後のコレステロールについての血清パラメータを示す。 ２週間、４週間および１２週間のＩＦＧを用いた治療後の肝臓酵素ＡＬＴについての血清パラメータを示す。 ２週間、４週間および１２週間のＩＦＧを用いた治療後のＡＳＴについての血清パラメータを示す。 ２週間、４週間および１２週間のＩＦＧを用いた治療後のＩｇＧについての血清パラメータを示す。 健常なボランティアおよびゴーシェ病患者由来の血漿α−シヌクラインレベルの比較を示す。 ゴーシェ線維芽細胞からの細胞内でのＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄを用いたリソソームの蛍光染色を示す。 正常な線維芽細胞からの細胞内でのＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄを用いたリソソームの蛍光染色を示す。 同様に正常な線維芽細胞上で実施されたリソソームタンパク質ＬＡＭＰ−１についての染色を示す。 同様にゴーシェ線維芽細胞上で実施されたリソソームタンパク質ＬＡＭＰ−１についての染色を示す。 ゴーシェ線維芽細胞における２重のＧＣａｓｅおよびＬＡＭＰ−１染色のオーバーレイを示す。 ゴーシェ線維芽細胞における２重のＧＣａｓｅおよびＬＡＭＰ−１染色のオーバーレイを示す。 特異的薬理シャペロンイソファゴミンで治療されたゴーシェ細胞の２重オーバーレイ（ＬＡＭＰ−１およびＧＣａｓｅ）を示す。 特異的薬理シャペロンイソファゴミンで治療されたゴーシェ細胞の２重オーバーレイ（ＬＡＭＰ−１およびＧＣａｓｅ）を示す。 特異的薬理シャペロンＣ−ベンジル−イソファゴミンで治療されたゴーシェ細胞の２重オーバーレイ（ＬＡＭＰ−１およびＧＣａｓｅ）を示す。 特異的薬理シャペロンＣ−ベンジル−イソファゴミンで治療されたゴーシェ細胞の２重オーバーレイ（ＬＡＭＰ−１およびＧＣａｓｅ）を示す。 ＧＣａｓｅのみについてのゴーシェ細胞の染色を示す。対照ゴーシェ細胞は二次抗体のみで染色された。 ＧＣａｓｅのみについてのゴーシェ細胞の染色を示す。対照ゴーシェ細胞は処置されなかった。 ＧＣａｓｅのみについてのゴーシェ細胞の染色を示す。対照ゴーシェ細胞はイソファゴミンで処置された。 ＧＣａｓｅのみについてのゴーシェ細胞の２染色を示す。Ｃ−ベンジル−イソファゴミンで処置された。 ゴーシェ病患者におけるＷＢＣ中のＧＣａｓｅ活性、ＷＢＣ中のＧｌｃＣｅｒ濃度、血漿中のキトトリオシダーゼ活性および血漿中のα−シヌクラインレベルを対照と比較したものである。 ゴーシェ病患者における、血漿中のＴＲＡＣＰ５ｂ活性（女性）、血漿中のＴＲＡＣＰ５ｂ活性（男性）、血漿中のＢＡＰ活性（女性）および血漿中のＢＡＰ活性（男性）を対照と比較したものである。 ゴーシェ病患者における、血漿中のＶＥＧＦ活性（女性）に対するＰＡＲＣ、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＩＬ−１７、ＶＥＧＦおよびＩＬ−１７を対照と比較したものである。

本発明は、ゴーシェ病の特異的代理マーカーの治療後の評価により証明される通りのゴーシェ病モデルにおけるＳＰＣでの治療に対する応答を実証する。したがって、本発明は、特異的代理マーカーの変化すなわち改善について患者を評価することによりゴーシェ病患者におけるＳＰＣ治療に対する応答を評価するための標準的治療を提供する。

定義
本明細書中で使用される用語は一般に、本発明に関しておよび各用語が使用される具体的状況の中で当該技術分野におけるその通常の意味を有する。一部の用語について、本発明の組成物および方法そしてその作製および使用方法を説明する上で実施者に対するさらなる指針を提供することを目的として、以下でまたは明細書の他の箇所で論述される。

「ゴーシェ病」という用語は、１型、２型および３型（３ａ、３ｂおよび３ｃを含めた）および中間体そして表現型徴候に基づいたその亜型を含む。

ゴーシェ病患者とは、以下でさらに定義する通りの変異型酸性β−グルコシダーゼに起因するゴーシェ病と診断された個体を意味する。

「変異型ＧＣａｓｅ」とは、ＥＲ内のＧＣａｓｅタンパク質の折畳みおよび処理に影響を及ぼす変異を含むＧＣａｓｅタンパク質である。したがって、特異的薬理シャペロンを用いて適正な立体構造に変異体を折畳んだ時点で、変異型ＧＣａｓｅタンパク質はゴルジを通してＥＲからリソソームまで進行または輸送できることになる。折畳みひいてはＧＣａｓｅの輸送を損なう変異は、当該技術分野において周知の日常的な検定、例えば、ゴルジ体にタンパク質が入るか否かを判定するためのグリコシダーゼ処置を伴うおよび伴わないパルスチェイス代謝標識、または細胞内のＧＣａｓｅ局在化についての蛍光免疫染色によって判定可能である。神経細胞障害性疾患に関連するＧＣａｓｅ折畳み変異体の具体的実施形態には、Ｎ３７０Ｓ、Ｌ４４４Ｐ、Ｋ１９８Ｔ、Ｄ４０９Ｈ、Ｒ４９６Ｈ、Ｖ３９４Ｌ、８４ＧＧ、およびＲ３２９Ｃが含まれるが、これらに限定されるわけではない。

本書で使用される「ＭＩＰ」とは、マクロファージ炎症性タンパク質を意味する。

「ＴＮＦ」とは、腫瘍壊死因子を意味する。

「ＩＬ」とは、インタロイキンを意味する。

「ＧＭ３」は、ＳＴ３ベータ−ガラクトシダーゼアルファ−２，３−ジアリルトランスフェラーゼ５を意味し、これはＳＴ３ＧＡＬ５またはガングリオシドＧＭ３としても知られている。

本明細書中で使用される「特異的薬理シャペロン」（「ＳＰＣ」）という用語は、１つのタンパク質に特異的に結合し、（ｉ）タンパク質の安定した分子立体構造の形成を増強する；（ｉｉ）ＥＲから別の細胞位置好ましくは未変性細胞位置までの輸送を誘発する、すなわちタンパク質のＥＲ関連分解を防止する；（ｉｉｉ）誤って折畳まれたタンパク質の凝集を防止する；および／または（ｉｖ）タンパク質に対し少なくとも部分的な野生型機能および／または活性を回復させるまたは増強させる、という効果のうちの１つ以上を有する、小分子、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物などを含めたあらゆる分子を意味する。例えばＧＣａｓｅに対し特異的に結合する化合物とは、包括的一群の関係するまたは無関係の酵素ではなくＧＣａｓｅに結合しそれに対してシャペロン効果を及ぼす化合物を意味する。以下では、本発明が企図しているいくつかの特異的薬理シャペロンについて記述する：

イソファゴミン（ＩＦＧ；（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（ヒドロキシメチル）−３，４−ピペリジンジオール）は、

という構造を有する化合物を意味する。ＩＦＧはＣ_６Ｈ_１３ＮＯ３という分子構造式と１４７．１７の分子量を有する。この化合物はさらに、Ｓｉｅｒｋｓらに対する米国特許第５，８４４，１０２号明細書およびＬｕｎｄｇｒｅｎらに対する米国特許第５，８６３，９０３号明細書中に記載されている。Ｎ−アルキルＩＦＧ誘導体は、米国特許第６，０４６，２１４号明細書中に記載されている。

Ｃ−ベンジル−ＩＦＧは、

という構造式をもつ化合物を意味する。

ＧＣａｓｅのためのその他のＳＰＣとしては、係属中のＰＣＴ公報国際出願公開第２００５／０４６６１１号パンフレットおよび国際出願公開第２００５／０４６６１２号パンフレットそして２００４年１１月１２日付けの米国特許出願第１０／９８８，４２８号明細書中に記載されているヒドロキシピペリジン誘導体が含まれる。同様に、ＧＣａｓｅのためのシャペロンとしては、２００４年１１月１２日付けの米国特許出願第１０／９８８，４２７号明細書中に記載されているグルコイミダゾールおよびポリヒドロキシシクロヘキセニルアミン誘導体が含まれる。

一例として、グルコイミダゾールは以下の構造を有する化合物を意味する：

ＧＣａｓｅのためのさらなるその他のＳＰＣは、Ｆａｎらに対する米国特許第６，５９９，９１９号明細書中に記載されており、カリステジンＡ_３、カリステジンＡ_５、カリステジンＢ_１、カリステジンＢ_２、カリステジンＢ_３、カリステジンＢ_４、カリステジンＣ_１、Ｎ−メチル−カリステジンＢ_２、ＤＭＤＰ、ＤＡＢ、カスタノスペルミン、１−デオキシノジリマイシン、Ｎ−ブチル−デオキシノジリマイシン、１−デオキシノジリマイシンビスルファイト、Ｎ−ブチル−イソファゴミン、Ｎ−（３−シクロヘキシルプロピル）−イソファゴミン、Ｎ−（３−フェニルプロピル）−イソファゴミンおよびＮ−［（２Ｅ，６Ｚ，１０Ｚ）−３，７，１１−トリメチルドデカトリエニル］−イソファゴミンを含む。

ゴーシェ病の「代理マーカー」または「代理臨床マーカー」とは、ゴーシェ病に関連し、かつ単独でまたはゴーシェ病のその他の異常なマーカーまたは症候と組合せた形でゴーシェ病の信頼度の高い指標である（ただし健常な個体には関連しない）バイオマーカーの異常な存在、レベルの上昇、異常な不在またはレベルの低下を意味する。

非限定的な例として、ゴーシェ病の代理マーカーには、リソソームＧＣａｓｅ活性の減少；脂質を持ったマクロファージ（「ゴーシェマクロファージ」）の存在；肝脾腫大症；キトトリオシダーゼの増加；肺ケモカインＰＡＲＣ／ＣＣＬ１８の増加；アンジオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）および総酸性ホスファターゼレベルの上昇；貧血症、血小板減少症、白血球減少症および高ガンマグロブリン血症を含めた血液学的異常または免疫異常、脾臓中のＴ−リンパ球の欠損、全身性Ｂ細胞過剰増殖、形質細胞増加症、マクロファージ、リンパ球および好中球を含む組織または臓器内の炎症性病巣の存在、炎症性サイトカイン（例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＭＩＰ−１α、ＶＥＧＦ）の増大、好中球走化性の障害；Ｔ細胞および単球サブセットの不均衡；単球上の細胞膜発現ＭＨＣＩＩおよびＣｄ１ｄの過剰発現；骨髄内のゴーシェ細胞の浸潤、血漿中の骨特異的アルカリホスファターゼ活性（ＢＡＰ）、溶解性病変、骨硬化症、骨痛、骨折、椎体圧潰またはトリグリセリド存在の低下を含む骨格異常；神経学的症候例えばニューロンの欠損；神経変性、水平注視異常、ミオクローヌス運動、角膜混濁、運動失調、認知症および痙性；および肺高血圧症を導く可能性のあるゴーシェマクロファージの肺浸潤、血漿中の肺および活性化調節型ケモカイン（ＰＡＲＣ）および血漿中の酒石酸塩耐性酸ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＣＰ５ｂ）活性が含まれる。

その他の代理マーカーは、細胞内レベルで存在し（「細胞内代理マーカー」）、ゴーシェ患者由来の細胞内におけるＥＲからリソソームへのＧＣａｓｅの異常輸送；エンドソーム経路を通した脂質の異常輸送；ＥＲまたは細胞質ゾルにおいて誤って折畳まれた大量のＧＣａｓｅの存在；（ストレス関連マーカーの遺伝子および／またはタンパク質発現により判定した際の）ＧＣａｓｅの毒性蓄積が起こすＥＲおよび／または細胞ストレスの存在；エンドソームｐＨレベルの異常；細胞形態の異常；ユビキチン／プロテアソーム経路の抑制；およびユビキチン化タンパク質の量の増加を含む。

「代理マーカーの改善」とは、ゴーシェ病を患っておらずしかもその代理マーカーの異常な存在、不在またはレベルの変化を説明するその他の疾病を患っていない健常な個体と対比してゴーシェ病において異常に存在するかまたは異常に上昇している１つ以上の臨床的代理マーカーの改善または削減、あるいはゴーシェ病において異常に減少しているかまたは不在である１つ以上の臨床的代理マーカーの存在または増加というＳＰＣを用いた治療の後の効果を意味する。

「応答者」とは、ゴーシェ病などのＧＣａｓｅタンパク質の誤った折畳みをひき起こすＧｂａ変異に関連する疾病の診断を受けここで権利請求されている方法にしたがって治療され、１つ以上の臨床症候の改善、向上または予防または以上で言及した１つ以上の代理マーカーの改善を示す個体である。

さらに、個体が応答者であるか否かの決定は、ＳＰＣを用いた治療に応答した変異型ＧＣａｓｅタンパク質の細胞内輸送などの細胞内代理マーカーの改善を評価することによって、細胞内レベルで行なうことができる。ＥＲからの輸送の回復は、応答を示す。個体が応答者であるか否かを決定するために査定され得るその他の細胞内評価には、上述の細胞内代理マーカーの改善が含まれる。

「治療上有効な用量」および「有効量」という用語は、治療応答を得るのに充分である特異的薬理シャペロンの量を意味する。治療応答とは、前述の症候および代理臨床マーカーのいずれかの改善を含め、療法に対する有効な応答としてユーザー（例えば臨床医）が認識するあらゆる応答であってよい。したがって治療応答は、一般的に、上述のもののような疾患または障害の１つ以上の症候の改善である。

「薬学的に許容できる」という語句は、生理学的に許容可能であり、ヒトに投与された場合に典型的には、望ましくない反応を生成しない分子的実体および組成物を意味する。好ましくは、本明細書で使用されている「薬学的に許容できる」という用語は、連邦または州政府の規制機関により承認されていることまたは、動物、より詳細にはヒトにおける使用のために米国薬局方またはその他の一般的に認知された薬局方の中に列挙されていることを意味する。「担体」という用語は、化合物を投与する場合に用いられる希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを意味する。かかる薬学的担体は、水および油などの無菌の液体であり得る。特に注射用溶液用の担体として、好ましくは、水または水溶液食塩溶液およびデキストロースおよびグリセロール水溶液が利用される。適切な薬学的担体は、“Remington's Pharmaceutical Sciences” by E.W. Martin, 18th Editionの中で記述されている。

「約」および「およそ」という用語は、一般に、測定の性質または精度から許容可能な程度の測定数量についての誤差を意味する。典型的には、例示的な誤差の程度は所与の値または値範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、そしてより好ましくは５％以内である。あるいは、特に生体系において、「約」および「およそ」という用語は、１桁以内、好ましくは所与の値の１０倍または５倍以内、より好ましくは２倍以内の値を意味し得る。本明細書中で示されている数値的数量は、特に明記しないかぎり近似値であり、これは、明示的に記載されていない場合に「約」または「およそ」という用語が暗示され得る、ということを意味している。

調合物、投薬量および投与
ＩＦＧおよび誘導体は、例えば錠剤、カプセルまたは液体の形での経口投与または注射用の滅菌水溶液の形を含む任意の投与経路に適した形態で投与可能である。具体的実施形態においては、酒石酸ＩＦＧは粉末充填型カプセルとして投与される。酒石酸ＩＦＧは、本明細書に参照により援用されている係属中の仮特許出願第６０／８０８，０２０号明細書および６０／８９０，７１９号明細書中に記載されている。化合物を経口投与向けに調合する場合、錠剤またはカプセルは、結合剤（例えばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えばラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えばジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容できる賦形剤を用いて従来の手段により調製可能である。錠剤は、当該技術分野において周知の方法によりコーティングされてよい。

経口投与のための液体調製物は、例えば溶液、シロップまたは懸濁液などの形をとっていてもよいし、または使用前に水または別の適切なビヒクルと共に構成するための乾燥製品としての体裁をとっていてもよい。このような液体調製物は、懸濁剤（例えば水、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用油）；乳化剤（例えばレシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えばアーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコールまたは分留植物油）；および防腐剤（例えばメチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの薬学的に許容できる添加剤を用いて、従来の手段によって調製されてよい。調製物は同様に、適宜、緩衝塩、着香料、着色剤および甘味料を含有していてよい。経口投与向けの調製物は、セラミド特異的グルコシルトランスフェラーゼ阻害物質の制御放出または持続放出を提供するように適切に調合され得る。

非経口／注射用途に適したＩＦＧまたは誘導体の医薬製剤には一般に、無菌水溶液または分散剤、そして無菌注射溶液または分散剤の即時調製用の無菌粉末が含まれる。全てのケースにおいて、形態は無菌でなくてはならず、注射針を容易に通過する程度に流動的でなくてはならない。それは、製造および貯蔵条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用を受けないように保存されていなくてはならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物および植物油を含む溶媒または分散媒質であり得る。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用、分散の場合には所要粒径の維持そして界面活性剤の使用などによって維持可能である。微生物の作用の予防は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ベンジルアルコール、ソルビン酸などといったさまざまな抗細菌および抗真菌剤により得ることができる。数多くのケースにおいて、例えば糖または塩化ナトリウムなどの等張剤を含み入れることが合理的である。注射用組成物の長時間吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンといった吸収を遅延させる作用物質を組成物中に使用することによって得ることができる。

無菌注射溶液は、必要に応じて以上で列挙したその他の成分のさまざまなものと共に適切な溶媒中に所要量でＩＦＧまたは誘導体を取込み、その後ろ過または最終滅菌を行なうことによって調製される。一般に、分散剤は、以上に列挙したその他の所要成分および基本的分散媒質を含有する無菌ビヒクル中にさまざまな滅菌済み活性成分を取込むことによって調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、事前に無菌ろ過した溶液から、活性成分に任意の付加的な所望の成分が加わった粉末を生成する真空乾燥および凍結乾燥技術である。

上述の製剤は、１つまたは複数の賦形剤を含有し得る。製剤中に含み入れてよい薬学的に許容できる賦形剤は、緩衝液例えばクエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、および重炭酸塩緩衝液、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質例えば血清アルブミン、コラーゲンおよびゼラチン；塩例えばＥＤＴＡまたはＥＧＴＡおよび塩化ナトリウム；リポソーム；ポリビニルピロリドン；糖例えばデキストラン、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロール；プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ−４０００、ＰＥＧ−６０００）；グリセロール、グリシンまたはその他のアミノ酸および脂質である。製剤と共に使用するための緩衝系としては、クエン酸塩、酢酸塩、重炭酸塩、およびリン酸塩緩衝液が含まれる。リン酸塩緩衝液が好ましい実施形態である。

製剤は同様に非イオン洗浄剤も含有できる。好ましい非イオン洗浄剤にはポリソルベート２０、ポリソルベート８０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ノニデットＰ−４０、オクチルα−グルコシド、オクチルβ−グルコシド、ブリッジ３５、プルロニックおよびトゥイーン２０が含まれる。

投与
ＩＦＧまたは誘導体の投与経路は、（好ましくは）経口であるかまたは、静脈内、皮下、動脈内、腹腔内、眼内、筋内、口腔、直腸、膣内、眼窩内、脳内、皮内、頭蓋内、髄腔内、心室内、鞘内、嚢内、関節包内、肺内、鼻腔内、経粘膜、経皮、または吸入を介したものであってよい。

ＩＦＧまたは誘導体の上述の非経口製剤の投与は、調製物の定期的なボーラス注入によるものであってよく、または、体外容器（例えば静注用バッグ）または体内容器（例えば生体侵食性移植片）からの静脈内または腹腔内投与によって投与されてよい。例えば、各々参照により本明細書に援用されている米国特許第４，４０７，９５７号明細書および同第５，７９８，１１３号明細書を参照のこと。肺内送達の方法および器具は、例えば各々参照により本明細書に援用されている米国特許第５，６５４，００７号明細書、同第５，７８０，０１４号明細書および同第５，８１４，６０７号明細書の中に記載されている。その他の有用な非経口送達系としては、エチレン酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な輸液系、ポンプ送達、カプセル化細胞送達、リポソーム送達、針送達型注射、無針注射、ネブライザ、エアロゾル化装置、電気穿孔、および経皮パッチが含まれる。無針注射装置は、参照により本明細書に援用されている米国特許第５，８７９，３２７号明細書；同第５，５２０，６３９号明細書；同第５，８４６，２３３号明細書および同第５，７０４，９１１号明細書の中に記載されている。上述の製剤のいずれもこれらの方法を用いて投与可能である。

さらに、詰め替え可能なペン型注射器および無針注射装置などの患者に便利なように設計されたさまざまな装置を本明細書中で論述されている本発明の製剤について使用してよい。

投薬量
当業者であれば、本発明の方法において使用されているＩＦＧまたは誘導体の有効量は、日常的実験により判定され得るが、０．０１〜１００μＭの間、好ましくは０．０１〜１０μＭの間、最も好ましくは０．０５〜１μＭの間の血清レベルを得るための量になるものと予想される、ということを理解する。化合物の有効用量は、一日体重１ｋｇあたり０．５〜１０００ｍｇ、好ましくは０．５〜１００、最も好ましくは一日体重１ｋｇあたり１〜５０ｍｇと予想される。具体的実施形態においては、この用量は、約１０〜６００ｍｇ／日、より具体的には２５〜３００ｍｇ／日、より具体的には５０〜１５０ｍｇ／日であるかあるいは規定通り適切な間隔がとられる。例えば、企図されている二投薬計画には、約７日間に１５０ｍｇ／日の酒石酸ＩＦＧでの治療とそれに続く約４日おきまたは７日おきの間隔投薬が含まれる。

代理マーカーを用いたゴーシェ病治療の監視
本発明は、特異的薬理シャペロンを用いたゴーシェ病患者の治療を監視する方法も提供している。具体的には、疾患の進行およびＩＦＧでの治療に対するその応答を評価するためにさまざまな検定が利用される。特に、さまざまな全身および細胞内マーカーを検定することができる。本発明の監視態様は、さまざまな細胞物質の侵襲的測定および非侵襲的測定の両方を包含している。

グルコシルセラミド（ＧｌｕＣｅｒ）蓄積
ＧｌｕＣｅｒは、ゴーシェ病患者主として１型及びＩＩＩ型患者において病的に蓄積する糖脂質である。許容されたさまざまな方法を用いて、尿および血漿そして組織内のレベルを測定することができる。さらに、１つの一般的なゴーシェ代理マーカーは、「ゴーシェマクロファージ」の存在である。ゴーシェマクロファージは、活性化されたマクロファージを表す全く異なる形態を有する有脂質拡大型マクロファージである。

特に蓄積ＧｌｕＣｅｒのみが、Ｉ型ゴーシェ病を患う個体のマクロファージ内だけに現われる。ゴーシェマクロファージの存在は、例えばヘマトキシリンおよびエオシン染色および顕微鏡検査により、形態学的に容易に査定される。

酸性β−グルコシダーゼ活性
ＧＣａｓｅの減少は、ゴーシェ病の３つの型全てに随伴する。上述の通り、ＧＣａｓｅ活性の非侵襲性査定を、ゴーシェ病患者由来の末梢リンパ球および多核白血球（ＰＭＮ）について評価することができる。皮膚生検からの培養済み線維芽細胞も使用可能である。かかる検定には標準的に、患者からの血液白血球の抽出、細胞の溶解、そして４−メチルウンベリフェリルベータ−Ｄ−グルコシドまたは４−ヘプチル−ウンベリフェリル−ベータ−Ｄ−グルコシドなどの基質を添加した時点での活性の判定が関与する（例えばForsyth et al., Clin Chim Acta. 1993; 216(1-2):11-21; Beautler et al., J Lab Clin Med. 1970; 76:747-755を参照のこと）。別の検定では、短アシル鎖基質Ｎ−（１−ヘキサノイル）−Ｄ−エリスロ−グルコシルスフィンゴシン（ヘキサノイル−ＧｌｃＣｅｒ）が使用される。ヘキサノイルＧｌｃＣｅｒ加水分解レベルとヒトの皮膚線維芽細胞内のゴーシェタイプの間に厳密な相関関係が観察された（Meivar-Levy et al., Biochem J. 1994;303 (Pt 2):377-82）。

患者の細胞内のＧＣａｓｅ活性を評価するために、フローサイトメトリを使用することもできる（Lorincz et al., Blood. 1997; 189: 3412-20; and Chan et al., Anal Biochem. 2004;334(2):227-33）。この方法では、飲作用により細胞中に取り込まれた蛍光発生ＧＣａｓｅ基質ＣＭＦＤＧｌｕが利用された。その後、従来のフルオレセイン発光光学素子を用いて、細胞を評価した。蛍光レベルはＧＣａｓｅ活性の量と相関関係をもつ。

細胞形態学
血液白血球およびＰＭＮの微細構造的解析が記述されてきた（Laslo et al., Acta Paediatr. Hung. 1987; 28: 163-73）。簡単に言うと、電子顕微鏡検査法により、ゴーシェ病患者における空胞形成中の病変が明らかにされた。この方法は、ゴーシェマクロファージの存在を判定するためにも使用できる。

キトトリオシダーゼ
１型ゴーシェ病患者では血漿中の酵素キトトリオシダーゼ（キチナーゼ１）の活性が上昇している（Hollak et al., J. Clin. Invest. 1994; 93: 1288-92）。キトトリオシダーゼは、３９ｋＤａのヒトキチンヒドロラーゼ（キチナーゼ）である。ゴーシェ病におけるこの酵素の機能は、細菌細胞壁、真菌、線虫およびその他の病原体の中に発見される構成要素であるその基質キチンから不明瞭である。ほぼ全ての症候性ゴーシェ病患者の血漿中では、キトトリオシダーゼ（キチナーゼ）活性が正常の少なくとも１００倍（最高６００倍）増大しているが、前症候性個体においてはそうではない。無症候性個体においては、キトトリオシダーゼ活性も同様に高まり、正常な個体と症候性ゴーシェ病患者の中間である。キトトリオシダーゼは、ゴーシェマクロファージおよびＰＭＮによって分泌され、ＥＲＴ内の野生型ＧＣａｓｅの追加時点で削減される。

キトトリオシダーゼ活性が１５，０００ｎｍｏｌ ｍｌ^−１ ｈ^−１を超えると、ゴーシェ病の治療が必要であることが示唆されてきた（Aerts et al., Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 2003; 358: 905-14）。限定的な意味なく、酵素用基質の添加による患者から単離した細胞内の酵素活性の検出を含め、キトトリオシダーゼの上昇を検出するために数多くの検定を用いることができる。このような基質の１つが基質分子４−メチルウンベリフェリル−（４−デオキシ）キトビオースである。キトトリオシダーゼ活性についてこの基質を利用する検定が、Aguilara et al., J Biol Chem. 2003; 278(42):40911-6中に記載されている。

高脂血症
ゴーシェ病患者は、血漿総コレステロール、低比重リポタンパクコレステロール（ＬＤＬ）および高比重リポタンパクコレステロール（ＨＤＬ）レベルの減少ならびにアポリポタンパク質（ａｐｏ）Ａ−ＩおよびＢの減少を示す。逆に、血漿アポＥの濃度は上昇している。コレステロールレベルの分析は、日常的なコレステロール検査によって達成可能である。

骨髄分析
上述の通り、ゴーシェ病患者は、骨髄中にゴーシェ細胞の浸潤を示す。ゴーシェマクロファージを検出するための骨髄生検（吸引）に加えて、骨髄の磁気共鳴（ＭＲ）イメージングが最近になって記述された（Poll et al., Skleletal Radiol. 2001; 30: 496-502）。この試験では、ＥＲＴの後にゴーシェ病患者を評価し、黄色骨髄の外観の変化を評価するためにＭＲが使用された。信号強度の増加は、骨梗塞を有するゴーシェ病患者における不均質でまだらな信号強度とは対照的に、治療後に脂肪髄の部分的再転換を実証した。

さらに、腰骨髄のトリグリセリド含有量を試験するために定量的化学シフトイメージングが応用された（Hollak and Aerts, J. Inherit. Metab. Dis. 2001; 24: 97-105）。トリグリセリド含有量は、ゴーシェマクロファージによるトリグリセリド脂肪細胞の変化に起因して低くなっている。したがって、療法後の骨髄脂肪含有量の補正は、骨合併症の発生を予測するものである。

骨分析
ゴーシェ病の骨格徴候は、大腿遠位の無症候性エレンマイアーフラスコ奇形から病的骨折、椎体圧潰、溶解性病変そして骨梗塞発現から起こり骨硬化症を導く急性骨クリーゼまでの範囲に広がる。骨減少症、骨壊死、乏血壊死も同様に存在する。骨痛は、骨格病変に随伴する。ゴーシェ病の骨格徴候は、骨格Ｘ線撮影を用いて検出および評価でき、骨減少症を査定するためには、２重エネルギーＸ線吸光光度分析法（ＤＥＸＡ）走査が使用された。

一実施形態においては、ＤＫＫ１レベルが測定され、ここでＤＫＫ１の低レベルがゴーシェ病を表わす。

骨病変の生化学的指標は、カルシウム、リン、骨特異的アルカリホスファターゼ、Ｉ型プロコラーゲンのカルボキシ末端側プロペプチド（ＰＩＣＰ）、Ｉ型コラーゲンのカルボキシ末端側テロペプチド（ＩＣＴＰ）、オステオカルシン、無傷副甲状腺ホルモンの血清濃度および尿中カルシウム、リン、ヒドロキシプロリンおよび遊離デオキシピリジノリンのなどの骨代謝および腰ＢＭＤのマーカーを使用して測定可能である（Ciana et al., J Inherit Metab Dis.2005;28(5):723-32）。

血液学的徴候
ゴーシェ病の血液学的徴候としては、ＸＩ因子の欠損によりひき起こされる後天的凝血障害および血球減少症が含まれる。血球減少症が脾臓摘出後に発生する場合、ゴーシェ細胞による骨髄浸潤が現われる。血小板減少症、貧血症および白血球減少症が特に一般的である。ゴーシェ病における免疫異常障害には、高ガンマグロブリン血症、脾臓内のＴ−リンパ球欠損症、および好中球走化性障害が含まれる。その他の免疫異常としては、全身性Ｂ細胞過剰増殖、形質細胞増加症、マクロファージ、リンパ球および好中球を含む組織または臓器内の炎症性病巣の存在、および炎症性サイトカイン（例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、ＭＩＰ−１αおよびＶＥＧＦ）の上昇が含まれる。上述のものの評価は、血球減少症を決定するためのＣＢＣといったような日常的生化学試験を用いて達成可能である。

一実施形態においては、ゴーシェ病患者が酵素補充療法（ＥＲＴ）および／または基質還元療法（ＳＲＴ）で治療されてきたかまたは現在それで治療されている場合、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−７はゴーシェ病のための代理マーカーとしは除外され、一方ＥＲＴおよび／またはＳＲＴでの治療を受けていない患者またはＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−７レベルが前−ＥＲＴおよび／または前−ＳＲＴレベルに戻るのに充分長い間ＥＲＴおよび／またはＳＲＴを受けていなかった患者については、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−７は、ゴーシェ病のための代理マーカーとして含み入れられる。

さらに、ＭＨＣＩＩ抗原および脂質結合分子ＣＤ１ｄの細胞膜発現の増加が、１型ゴーシェ病患者由来の単球上で観察され、これは、脂質のエンドソーム輸送の障害を示唆していた（Balreira et al., Br. J. Haematology. 2005; 129: 667-76）。ＥＲＴでの治療はＭＨＣＩＩの過剰発現を軽減し、これらの患者におけるＴ細胞サブセットの均衡を回復させた。したがって、ＭＨＣＩＩおよびＣＤ１ｄはゴーシェ病のバイオマーカーであり、その過剰発現は、例えばＦＡＣＳ分析および／または逆転写酵素ＰＣＲを用いてシャペロン療法で治療された患者由来の単球上で監視可能である。

肺バイオマーカー
１型ゴーシェ病患者は、多くの場合、特に脾臓摘出後に、肺高血圧を示す。このことは、疾病の重症度の増大と相関関係をもつ。ＰＨの診断は、ドップラー心エコー検査法を用いて心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）を査定することにより達成できる。心エコー検査法は、肺動脈圧の間接的尺度として三尖弁閉鎖不全（ＴＩ）勾配を査定するために、日常的に実施される。肺機能異常のその他のマーカーには、気道閉塞、呼気流の減少、肺容量の減少および肺胞毛管拡散異常が含まれる。これらのパラメータは、例えば機能残余容量の減少および総肺容量の減少および空気トラッピングの兆候を観察することにより査定可能である。機能残余容量（ＦＲＣ）は、古典的開回路、窒素洗い流し技術および標準的肺活量測定法により測定可能である。空気トラッピングは高い残余容量または残余容量／総肺容量によって証明される。肺徴候の程度を査定するために、胸部Ｘ線を用いることもできる。最後に、肺異常をも促進し得る脊椎の有害な変化について査定するために、高解像度のＣＴ（ＨＲＣＴ）を使用することができる。

ゴーシェ病においては、ＰＡＲＣ／ＣＣＬ１８と呼ばれる肺ケモカインが、疾病の重症度および治療に対する応答を反映する臨床的開発のためのバイオマーカーとして同定された（Cox et al., Acta Paediatr Suppl. 2005; 94(447):39-42）。ゴーシェ病におけるＰＡＲＣ／ＣＣＬ１８の高いレベル（１０〜５０倍）が、脾臓および肝臓体積の増加および血小板数の減少の信頼性の高い指標であることが示された。

臓器肥大症
全てのタイプのゴーシェ病における理学的検査は通常、肝脾腫大症の存在を明らかにする。脾腫は、体重で補正した場合５倍から８０倍超の範囲でサイズが増大し得る。脾臓の表面上の小結節は、髄外造血領域、ゴーシェ細胞の集合または梗塞の分解を表わし得る。被膜下脾臓梗塞は局在化した腹痛として現われる可能性がある。巨大な臓器肥大症を有する患者においては、小人症および消耗が見られる場合がある。

肝腫張は、野生型１型ゴーシェ病患者の５０％超、そして２型および３型疾患患者の大部分に発生する。肝体積は、正常から正常の約８．７倍にまで至る。肝臓グルコセレブロシドレベルは２５倍から４００倍に上昇する。ゴーシェ病罹患が軽度である患者においてさえ、ＡＳＴおよびＡＬＴといった肝酵素のわずかな上昇は一般的であるが、黄疸または肝細胞合成機能不全の存在は、予後不良の指標である。肝生検時点で、糖脂質を含むゴーシェ細胞は、類洞内で明白である。

腹部の超音波検査法またはＭＲイメージングは、ゴーシェ病患者における臓器肥大症の程度を判定することができる。

神経学的症候および目の症候
２型および３型ゴーシェ病は、ＧｌｕＣｅｒおよびその代謝産物が患者の脳内に蓄積することに起因する神経細胞障害性症候を随伴する。かかる症候には、ニューロンの欠損、神経変性、水平注視異常、ミオクローヌス運動、角膜混濁、運動失調、認知症、痙性、聴覚異常、異常ＥＥＧ／発作；認識機能障害および進行性球麻痺が含まれる。特殊な眼球運動異常には、（眼球運動先行症としても知られている）水平サッカード開始障害（ｈＳＩＦ）、水平サッカード減速、垂直サッカード開始障害（ｖＳＩＦ）（特に下向き）、垂直サッカード減速（特に下向き）および第６神経不全麻痺が含まれる。

さらに、硝子体混濁を伴うゴーシェ病患者由来の硝子体における脂質の蓄積は、抽出マトリクス援用型レーザー脱離イオン化飛行時間計測式質量分析法（ＤＥ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）法（Fujiwaki et al., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2004; 806(1):47-51）を用いて検出された。

心臓血管
大動脈および僧帽弁の石灰化を伴う３型ゴーシェ表現型も同定された（George et al., Clin Genet. 2001;59(5):360-3）。

その他の代理マーカー
アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）および現状総酸性ホスファターゼが、ゴーシェ病患者において上昇している。

これらのマーカーは、治療前に異常性を特定された場合にのみ、治療監視用として使用可能であると理解すべきである。例えば、遺伝子変異に起因して、個体群の約５〜６％がキトトリオシダーゼを発現することができない。この遺伝子欠陥を有するゴーシェ病患者においてキトトリオシダーゼが上昇しないと思われるということは自明である。したがって、キトトリオシダーゼは、治療を査定するのに用いる上で適切な代理マーカーではないと思われる。さらに、マーカーの異常な上昇を疾病の存在と相関関係づけし、肝臓病、虚血壊死、骨粗鬆症または免疫グロブリン異常症といったようなその他の原因または合併症に原因を求めないことが好ましい。

細胞内マーカーを検出するための分子生物学監視検定
特異的薬理シャペロンを用いたゴーシェ病の治療の監視は、上述の全身的または巨視的レベルに加えて細胞内レベルで行なうことができる。例えば、ゴルジ複合体への脂質のエンドソーム−リソソーム膜輸送の障害が、リソソーム蓄積症の特徴である（Sillence et al., J Lipid Res. 2002;43(11):1837-45）。したがって、ゴーシェ病治療の１つの監視方法は、標識された脂質（ＢＯＤＩＰＹ−ＬａｃＣｅｒ）を有する患者由来の細胞に接触し、エンドソーム構造内でのその輸送を監視することにある。例えばエンドソーム構造内の病的蓄積は、その患者が治療にうまく応答していないことの指標であると考えられる。

一例として、リソソームおよびエンドソーム内のｐＨ範囲を測定するために、細胞により取り込まれるｐＨ感応性蛍光プローブを使用することができる（すなわち、フルオレセインはｐＨ５で赤色であり、５．５〜６．５で青色乃至緑色である）。リソソームの形態およびｐＨが、野生型細胞とシャペロン治療された患者および未治療の患者の細胞において比較される。この検定は、ｐＨ感受性を判定するために平板読取り装置検定と並行して実行できる。例えば、ＢＯＤＩＰＹ−ＬａｃＣｅｒは、正常細胞中ではゴルジまで輸送されるが、脂質蓄積障害では細胞のリソソームに蓄積する。ＢＯＤＩＰＹ−ＬａｃＣｅｒは、膜内の濃度に応じて緑色または赤色の蛍光を発し、リソソーム内の緑色／赤色比を用いて濃度変化を測定することができる。

化合物で処理されたおよび未処理の生きた健常な細胞および患者の細胞がＢＯＤＩＰＹ−ＬａｃＣｅｒでインキュベートされ、ＦＡＣＳおよび／または共焦点顕微鏡で赤色／緑色比を測定することができ、共焦点顕微鏡を用いて染色パターン（リソソーム対ゴルジ）を決定することができる。

輸送は、ｐＨ勾配に沿って細胞内で発生し（すなわちＥＲのｐＨ約７、ゴルジのｐＨ約６．２〜７．０、トランスゴルジ網のｐＨ約６．０、早期および後期エンドソームのｐＨ約６．５、リソソームのｐＨ約４．５）、ゴーシェ細胞などの輸送欠陥を有する細胞内では内腔およびエンドソームｐＨが分断される。したがって、輸送に対するｐＨのプラス効果に相関された場合、野生型細胞、ＳＰＣ治療を受けた患者および未治療の患者の細胞におけるｐＨ感受性を判定するための検定を用いて、ゴーシェ病患者における輸送の回復を監視することができる。患者の細胞のｐＨ変化に対する感受性がさらに強い場合には、細胞ｐＨ感受性を低減させ、リソソームの形態または機能を回復させ、またより一般的には正常な輸送を回復させるＳＰＣについてのスクリーニング検定を作り出すことが可能となる。

さらに、輸送欠陥の軽減は、Ｌｙｓｏ−Ｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）などのリソソームマーカーでの欠損酵素（ＧＣａｓｅ）の同時局在化を判定することにより分子レベルで査定可能である。リソソーム内のＧＣａｓｅの局在化は、ＥＲからリソソームまでの輸送が特異的薬理シャペロンを用いた治療により回復することの証拠である。かかる検定は、実施例３において後述されている。簡単に言うと、正常な細胞ならびにＳＰＣで治療されたおよび未治療の患者の細胞が酵素およびエンドソーム／リソソームマーカー（例えばＲａｂ７、Ｒａｂ９、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ジストロフィン関連タンパク質ＰＡＤ）に対する一次抗体および蛍光タグ付けされた二次抗体と共に固定され染色される。酵素およびその他のエンドサイトーシス経路マーカーの濃度に起因する蛍光の量を定量化するためにＦＡＣＳおよび／または共焦点顕微鏡が使用され、染色パターンの変化を判定するために共焦点顕微鏡を用いることができる。

さらに、エンドグリコシダーゼＨ処理の組合わされたパルス−チェイス代謝標識などの従来の生化学方法。Ｅｎｄｏ Ｈは、ＥＲグリコシル化を獲得した（高マンノースＮ−連結）、すなわちＥＲに局在化されているタンパク質のみを分割し、ＥＲ外でゴルジまでそれを行ないゴルジ内で付加的なグリコシル化を獲得したタンパク質を分割しない。したがって、Ｅｎｄｏ Ｈ感受性ＧＣａｓｅのレベルが高くなればなるほど、ＥＲ内のタンパク質の蓄積が増大する。ＧＣａｓｅがゴルジ内へそれを行なった場合、全てのＮ連結糖が分割されることから、タンパク質がゴルジから退出したか否かを確認するためにグリコシダーゼＰＮＧアーゼＦを使用することができる。

ＥＲストレス
ゴーシェ病患者における誤って折畳まれたＧＣａｓｅなどの細胞のＥＲ内の誤って折畳まれたタンパク質の毒性蓄積は、ＥＲストレスをもたらすことが多い。これにより、細胞ホメオスタシスの分断を解消しようと試みる細胞ストレス応答が誘発されることになる。したがって、特異的薬理シャペロンでの治療の後の患者におけるＥＲストレスのマーカーを測定することで、治療の効果を監視する別の方法が提供される。かかるマーカーには、ＢｉＰ、ＩＲＥ１、ＰＥＲＫ／ＡＴＦ４、ＡＴＦ６、ＸＢＰ１（Ｘ−ｂｏｘ結合因子１）およびＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ）を含む、折畳まれていないタンパク質の応答と関連付けられる遺伝子およびタンパク質が含まれる。ＥＲストレスを査定するための１つの方法は、野生型細胞とゴーシェ病患者細胞との間と同様、ＳＰＣ治療を受けた細胞と未治療の細胞との間の発現レベルを比較することにある。対照として、ＥＲストレス誘発物質（例えばＥＲ内の折畳まれていないタンパク質のＮ−グリコシル化および蓄積の阻害ためのツニカマイシン、ラクタシスチンまたはＨ_２Ｏ_２）およびストレス緩和剤（例えばタンパク質合成を阻害するためのシクロヘキサミド）を使用することができる。

ＥＲストレス応答を監視するために企図されている別の方法は、遺伝子チップ解析を介したものである。例えばさまざまなストレス遺伝子を伴う遺伝子チップを用いて、ＥＲストレス応答のタイプ（早期、後期、アポトーシスなど）および発現レベルを測定することができる。一例として、ＨＧ−Ｕ９５Ａアレイを使用することができる（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．）。

最後に、長期にわたるＥＲストレスが、ＥＲ内の折畳まれていないタンパク質のレベルおよび結果としてのストレスレベルに応じて、アポトーシスおよび細胞死をもたらし得ることから、細胞は多少の差こそあれ、ツニカマイシンまたはプロテアソーム阻害物質などのＥＲストレス誘発物質に対する感受性を有する。ストレス誘発物質に対する細胞の感受性が高くなればなるほど、観察されるアポトーシスまたは死細胞の数は多くなる。アポトーシスは、カスパーゼ３（アポトーシスの早期指標）について蛍光基質類似体、ＦＡＣＳ、共焦点顕微鏡を使用して、かつ／または蛍光平板読取り装置（ハイスループット検定のためには９６ウェルのフォーマット）を用いてアポトーシスまたは細胞死について陽性の細胞の百分率を決定すること（ＦＡＣＳおよび／または共焦点顕微鏡検査）を用いて測定でき、そうでなければ蛍光平板読取り装置で９６ウェルのフォーマットでのタンパク質濃度との関係において蛍光強度を測定することができる。

ＥＲ中の毒性タンパク質蓄積の結果としてもたらされるＥＲストレスに対する別の応答は、ユビキチン／プロテアソーム経路の抑制である。これにより、エンドサイトーシス経路は全体的に破壊される（Rocca et al., Molecular Biology of the Cell. 2001; 12: 1293-1301）。誤って折畳まれたタンパク質の蓄積は時として、ポリユビキチンの量の増加と相関される（Lowe et al., Neuropathol Appl Neurobiol. 1990; 16: 281-91）。

プロテアソーム機能およびユビキチン化は、日常的検定を用いて査定できる。例えば、生きた動物における２６Ｓプロテアソーム機能のイメージングによる評価が、生物発光イメージング用のユビキチン−ルシフェラーゼリポータにより達成された（Luker et al., Nature Medicine. 2003. 9, 969 - 973）。プロテアソーム単離のためのキットは、例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｃａｔ．Ｎｏ．５３９１７６）から市販されている。ユビキチン化は、免疫組織化学または免疫蛍光を用いて、形態学的試験によって検査可能である。例えば、健常な細胞ならびにＳＰＣで治療されたおよび未治療の患者の細胞を、ユビキチン化されたタンパク質に対する一次抗体と共に固定および染色することができ、ＦＡＣＳおよび／または共焦点顕微鏡検査による二次抗体の蛍光検出を用いて、ユビキチン化されたタンパク質レベルの変化を判定する。

ユビキチン化されたタンパク質を検出するための別の検定は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ(商標)（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）である。このモデルでは、ビオチン−ユビキチン（ｂｉｏ−Ｕｂ）を用いて、ＧＳＴ−ＵｂｃＨ５ａ融合タンパク質のＧＳＴ部分がユビキチン化される。ＡＴＰの存在下でのＥ１によるユビキチン活性化の後、ｂｉｏ−ＵｂがＵｂｃＨ５ａに移送される。この反応において、ＵｂｃＨ５ａはｂｉｏ−Ｕｂをそのタグ付けされたＧＳＴ部分に移送するための担体として作用する。ビオチン化されたユビキチン化された状態となったタンパク質は次に、抗−ＧＳＴアクセプタおよびストレプトアビジンにより捕捉される。ドナーはビーズを作り、結果としてシグナルを生成する。ユビキチン化が無い場合、いかなるシグナルも生成されない。

最後に、ＥＬＩＳＡサンドイッチ検定を用いて、変異型ＧＣａｓｅを捕捉することができる。ＧＣａｓｅ（例えばウサギ）に対する一次抗体は表面に吸収され、酵素が、細胞溶解物または血清とのインキュベーション中に捕捉され、次に二次酵素結合検出を伴って、ユビキチン化タンパク質に対する抗体（例えばマウスまたはラット）を用いてユビキチン化酵素の量が検出かつ定量化される。あるいは、検定を用いて、細胞抽出物または血清中のマルチユビキチン化タンパク質の合計量を定量化することができると思われる。

併用療法
本発明の治療的監視は同様に、ＩＦＧおよび誘導体およびＥＲＴまたは遺伝子療法の組合せを用いた患者の治療の後にも適用可能である。このような併用療法は、同一所有者の米国特許出願公開第２００４／０１８０４１９号明細書（出願番号第１０／７７１，２３６号）、および米国特許出願公開第２００４／０２１９１３２号明細書（出願番号第１０／７８１，３５６号）の中に記載されている。両方の出願共、その全体が参照により本明細書に援用されている。

本発明は、以下で提示する実施例を用いて詳細に記述される。かかる実施例の使用は、例示にすぎず、本発明またはいずれかの例示された用語の範囲および意味を決して限定するものではない。同様にして、本発明は、本明細書中に記載されているいずれかの特定の好ましい実施形態に限定されるわけではない。実際、本明細書を読んだ時点で、当業者にとっては、本発明の数多くの修正および変形形態が明らかになる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲の文言ならびに特許請求の範囲の権利対象である等価物の全範囲によってのみ限定されるものである。

実施例１：ゴーシェ病の治療のための酒石酸ＩＦＧの安全性、薬物動態および薬力学の第Ｉ相試験
細胞ベースの動物モデルを用いて、イソファゴミンが、ゴーシェ病において欠損している酵素であるグルコセレブロシダーゼ（ＧＣａｓｅ）の細胞レベルを上昇させることを示した。無作為化２重盲検第Ｉ相臨床試験を７２人の健常なボランティア（男性３９人、女性３３人）において実施した。酒石酸イソファゴミンを水溶液として経口投与した。ヒト初回投与（first-in-human）単一逐次漸増試験において、８、２５、７５、１５０（２コホート）および３００ｍｇの用量を投与した（各コホート中被験薬６名、プラセボ２名）。多重逐次漸増試験において、７日間にわたり、２５、７５および２２５ｍｇの用量を毎日投与した（各コホート中被験薬６名、プラセボ２名）。両方の試験において、酒石酸イソファゴミンは一般に全ての用量で充分な耐容性を示し、両方の試験において治療中に発生する有害事象は大部分が軽度であった。重度の有害事象は発生しなかった。

酒石酸イソファゴミンは、経口で優れた全身性曝露を示した。単回投与試験では、血漿ＡＵＣおよびＣｍａｘ値は、投与した用量と線形相関関係を示した。平均血漿レベルは、３．４時間でピークに達し（ＳＥＭ：０．６時間）、血漿消失半減期は１４時間であった（ＳＥＭ：２時間）。複数回投与試験では、７日間の経口投与後、薬物動態挙動は用量に伴って線形であり、予想外の酒石酸イソファゴミン蓄積が全く無いことが発見された。Ｔｍａｘおよび半減期の値は、単回投与試験で観察されたものと類似していた。

複数回投与試験においては、単離した白血球中のＧＣａｓｅ活性を、酒石酸イソファゴミンの投与中１、３、５および７日目に測定し、治療後の休薬期間中は９、１４および２１日目に測定した。酒石酸イソファゴミンを受けた全ての対象において、薬物治療期間中ＧＣａｓｅレベルの顕著な増加とそれに続いて薬物除去時点での減少および２１日目までのほぼベースラインレベルへの復帰が見られた（図１）。酵素レベルの上昇は、用量に関連し、ベースラインレベルのおよそ３．５倍に達した。健常なボランティアにおける安全性、薬物動態および予備薬力学的効果についてのこれらの結果は、ゴーシェ病の治療のための酒石酸イソファゴミンのさらなる評価を裏づけている。

実施例２：特異的薬理シャペロンで治療されたＬ４４４Ｐ遺伝子導入マウスにおけるゴーシェ病の代理マーカーの判定
Ｌ４４４Ｐ遺伝子導入マウス（グルコシルセラミドシンターゼヌルバックグラウンド上でヒトＬ４４４Ｐ変異型Ｇｂａについてホモ接合型）は、多臓器炎症；Ｂ細胞過剰増殖；脳、肝臓、脾臓および肺の中のＧＣａｓｅ活性の欠損；肝臓および脾臓重量の増大；３ヵ月目のキトトリオシダーゼの血漿レベル上昇；ならびにＩｇＧ血漿レベルの上昇（Mizukami et al., J. Clin. Inves. 2002; 109: 1215-21）を示す。しかしながら、グルコシルセラミドシンターゼ遺伝子内の分断に起因して、これらのマウスは例えばマクロファージ内でＧｌｕＣｅｒの蓄積を示さない。表皮内の透過障壁機能障害に起因して、以前に作られたＬ４４４Ｐ遺伝子導入マウスは誕生から３日以内に死亡したことから、同時グルコシルセラミドシンターゼ分断が必要である。

この実験においては、Ｌ４４４Ｐ遺伝子導入マウスをイソファゴミンまたはＣ−ベンジル−イソファゴミンで治療し、１、３、６および１２ヵ月目に代理マーカーを測定してシャペロンの効能を判定した。さらに、４週間の治療後に２週間の非シャペロン治療「休薬」期間にあるマウスも、未治療の対照において見られた、レベルの代理マーカー逆転について評価した。

方法
イソファゴミン治療
マウスに対し、酒石酸イソファゴミンを２０ｍｇ／ｋｇの濃度で飲料水中に入れて適宜、投与した。

代理マーカー測定
４週、１２週または２４週の最終日にマウスを屠殺し、（ｉ）肝臓、脾臓、肺および脳内のＧＣａｓｅ酵素活性の増強、（ｉｉ）キトトリオシダーゼ活性；（ｉｉ）体重、脾臓および肝臓重量および（ｉｖ）血清ＩｇＧ、コレステロールおよび肝臓酵素レベルについて評価した。さらに、血漿中および前述の組織中のシャペロン濃度も決定される。

ａ． 組織中のＧＣａｓｅ活性検定：
肝臓、脳、脾臓および肺の組織を新鮮な形で採取する（ＰＢＳで血液を洗い出す）かまたは、冷凍備蓄から解凍する。組織は、細く刻んだ組織であり、これを２００〜５００μｌのマックイルバイン（ＭＩ）緩衝液（ｐＨ５．２の０．１Ｍのクエン酸および０．２Ｍのリン酸緩衝液中の０．２５％のタウロコール酸ナトリウム、０．１％のトリトンＸ１００）中で氷上均質化させ、１０，０００×ｇで遠心分離する。上清を収集し、このステップにおいて冷凍してもよい。

組織ホモジネートからの約１〜１０μｌの上清を、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡタンパク質検定用の透明な９６ウェル平板（Ｐｉｅｒｃｅ，ｃａｔ＃２３２３５）に添加して、メーカーのプロトコルにしたがって総タンパク質量を定量する。負の対照として、さらに１０μｌを黒色平板に添加し、ＧＣａｓｅ活性の阻害物質である１０μｌの２．５ｍＭのＣＢＥ（６．７ｍｌの緩衝液中の２．７ｍｇのコンズリトールＢエポキシド）と混合し、３０分間室温（ＲＴ）に放置する。次に、ＧＣａｓｅ基質である３ｍＭの４−メタルウンベリフェリルベータ−Ｄ−グルコシド（４−ＭＵ−ベータ−Ｄ−グルコシド；作り立ての粉末を０．２ｍｌのＤＭＳＯ中に溶解させ、次に適切な体積までの十分量のＭＩ緩衝液を用いて溶解させる）を５０μｌ添加し、黒色平板を１時間３７℃でさらにインキュベートする。インキュベーションの後、１０μｌの上清を第２の黒色平板に添加し、１０μｌのＭＩ緩衝液および５０μｌの６ｍＭのＧＣａｓｅ基質４−ＭＵ−ベータ−Ｄ−グルコシドと混合し、１時間３７℃でインキュベートした。その後、ｐＨ１０．８の７０μｌの０．２Ｍグリシンを添加することにより反応を停止させる。平板読取り装置（Ｖｉｃｔｏｒ ２ １４２０マルチラベルカウンタ；Ｗａｌｌａｃ）内においてＦ_４６０で平板を読取る。

以下の等式により、相対的ベータ−グルコース活性を決定する：
（ＣＢＥ無しのＦ_４６０−ＣＢＥを伴うＦ_４６０）／（Ａ_５５０試料−Ａ_５５０緩衝液）

Ｆ_４６０の読取り値を４−ＭＵ標準曲線に基づいて４−ＭＵのｎｍｏｌｅ数に変換し、タンパク質標準曲線に基づいてＡ_５５０をタンパク質ｍｇに変換する。ＧＣａｓｅ活性１単位は、１時間で放出される４−ＭＵのｎｍｏｌｅ数として定義される。

ｂ． 体重および組織重量の測定：
４、３、６および１２ヵ月後の屠殺に先立ち、動物を秤量した。屠殺の後、脾臓および肝臓を取り出し秤量した。

ｃ． キトトリオシダーゼ活性：
５μｌのアリコート（２つ）中で検定を目的として、血漿を収集し、残りを−８０℃で保管する。５μｌの血漿／ＥＤＴＡを、９６ウェルの黒色平板内で、リン酸クエン酸緩衝液（１８５ｍｌの０．１Ｍのクエン酸と２００ｍｌの０．２Ｍのリン酸ナトリウムを混合することによって作られた０．１Ｍのクエン酸塩と０．２Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ５．２）中の２２μＭの４−ＭＵ−ｂ−Ｄ−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリアセチルキトトリオース１００μｌと混合する。負の対照として５μｌのＥＤＴＡ／ＰＢＳ（血漿無し）を使用する。標準血清を用いた標準曲線を、平板の１列の中で連続希釈によって調製する。その後、３７℃で１５分間平板をインキュベートし（湯浴中での浮動）、ｐＨ１０．８の１５０μｌの１Ｍグリシンを添加して、反応を停止する。Ｖｉｃｔｏｒ^２ １４２０マルチラベルカウンタ（Ｗａｌｌａｃ）内でＦ_３５５／Ｆ_４６０で平板を読取る。

ｄ． ＩｇＧ測定：
血漿中のＩｇＧ濃度の決定のために、マウスＩｇＧ ＥＬＩＳＡ定量キット（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｔ ＃ Ｅ９０−１３１）を使用した。９６ウェルの平板を１００μｌのコーティング緩衝液（１００ｍｌの２重脱イオン水中にコーティング抗原１カプセルを溶解させることで作ったもの）でコーティングし、室温で１時間インキュベートした。１５０μｌの洗浄緩衝液（５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）；０．１４ＭのＮａＣｌ；０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０）で３回ウェルを洗浄し、各洗浄の後吸引した。洗浄の後、２００μｌのブロッキング溶液を添加し（５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）；０．１４ＭのＮａＣｌ；１％のＢＳＡ）、平板を１時間ＲＴでまたは一晩４℃でインキュベートした。インキュベーションの後、ウェルを洗浄緩衝液と９５μｌの試料希釈剤緩衝液（５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０；０．１４ＭのＮａＣｌ；０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０；１％のＢＳＡ）で３回再洗浄し、５μｌの被験血漿をウェルに添加し、ＲＴで一時間インキュベートした。

標準として、既知濃度の連続希釈した標準マウスＩｇＧ抗体１００μｌをウェルの１列に添加した（５０００ｎｇ／ｍｌ〜７．８ｎｇ／ｍｌの濃度での希釈剤緩衝液で希釈したもの）。

インキュベーションの後、ウェルを５回洗浄緩衝液で洗浄して未結合試料を除去し、１００μｌの二次抗体（希釈剤緩衝液中１：２００００）を添加し、その後ＲＴで１時間、再びインキュベートした。未結合の試料を除去するべく（５回）洗浄した後、１００μｌの顕色剤（等しい割合の試薬ＡとＢ）を各ウェルに添加し、ＲＴで２０分間インキュベートした。１Ｍのリン酸１００μｌを添加することで反応を停止させ、平板読取り装置内において４５０ｎｍで色の強さを測定した。

ｅ． コレステロールおよび肝臓酵素の測定
これらを通常の技術によって測定した。

休薬期間試験
治療の停止後、飲料水を介して投薬したイソファゴミンのＬ４４４Ｐマウスに対する効果が退行するか否かそしていかなる時間枠で退行するかを判定するために、休薬期間試験を実施した。３月齢の９匹の雄Ｌ４４４Ｐマウスに、４週間１日１ｋｇあたり約１０ｍｇの投薬を行ない、対照として同数のマウスを未治療状態とした。４週間の経過時点で４匹の治療マウスと４匹の未治療マウスを屠殺し、残りの動物はそれ以上イソファゴミンで治療しなかった。すなわち、それらにさらに２週間通常の飲料水を与えてから屠殺し、上述の代理マーカーを評価した。

結果
組織内のＧＣａｓｅ活性
肝臓、脾臓、肺および脳の中でイソファゴミンでのわずか２週間の治療後にＧＣａｓｅ活性の有意な増加が観察され（図２Ａ−Ｄ）、これは４〜１２週間にわたり持続した。とりわけ脳内では、イソファゴミン治療は、未治療のマウスにおける約１Ｕ／ｍｇから２週間および４週間の治療後の約４．５Ｕ／ｍｇまで増大し、さらに１２週間後には約６Ｕ／ｍｇまで増大する（ｐ＜０．００１）という結果をもたらした（図２Ｂ）。ＧＣａｓｅ活性の増加は３、６および１２ヵ月目にも持続し、シャペロンが投与されるかぎり持続する。

同様にして、２週間後に、Ｃ−ベンジル−イソファゴミンで治療したマウスもまた脾臓内でＧＣａｓｅ活性の有意な増加を示し、肺および脳内では活性増加傾向を示した（データ示さず）。ＧＣａｓｅ活性の増加は、さらなる治療の時点でその他の臓器内でも観察されるものと予想されている。

体重および組織重量
１２週間のイソファゴミン治療後に、治療したマウスは、野生型マウス（約４０ｇ）と未治療マウス（約２９ｇ）の中間である約３３ｇの体重を示した（データ示さず）。対照的に、脾臓重量（図３Ａ）は、未治療マウス（０．１１ｍｇ）に比べて治療したマウスにおいては１２週間の治療時までに著しく減少した（０．０９ｍｇ）。野生型脾臓は約０．０８ｍｇであった。これは１２週間の治療後も持続し（有意性に達した）、この時点で脾臓重量は未治療マウスにおける０．１５ｍｇおよび正常なマウスにおける０．１０ｍｇに対比して、治療したマウスでは０．１２ｍｇであった。脾臓重量の正規化は、治療持続期間中続くものと予想される。

肝臓重量は、１２週間後の時点で、治療済み、未治療そして対照の野生型マウスの間で有意な形で変化しなかった（図３Ｂ）が、２４時間後有意な減少を達成した（データ示さず）。

キトトリオシダーゼ活性
４週間のイソファゴミン治療の後キトトリオシダーゼレベルの差異は全く見られなかったが、未治療のマウスにおいて見られるレベル（２０，０００Ｆ_４６０μｇ超のタンパク質）と比べて１２週間後にレベルが低下した（約１７０００μｇのタンパク質）（ｐ＝０．１）（図４）。ただし野生型マウス（これは約７５００μｇのタンパク質を有していた）に比べると、レベルはなおも上昇していた。ここでもまた、連続的治療でキトトリオシダーゼレベルの連続的低下が予想される。

ＩｇＧ、コレステロールおよび肝臓酵素
コレステロールまたは肝臓アミノトランスフェラーゼ（アスパルタイトアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）またはアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ））には、４週間または１２週間目に、イソファゴミン治療したマウスと未治療マウスに有意な差異はなかった（それぞれ図５Ｂ−Ｄ）。対照的に、血清ＩｇＧレベルは、未治療マウスと比べて、２週間の治療までに有意な低下を示し、これは４週間および１２週間の治療まで持続した（図５Ａ）。これは、酵素補充療法中の組換え型ＧＣａｓｅでの治療に比べて有意な改善である。メーカーによると、１５％の患者が組換え型酵素に対するＩｇＧを発生させ、うち４６％の患者が結果として超過敏反応も発生させる。

休薬期間
上述の場合と同様、１０ｍｇ／ｋｇ／日での４週間の治療の後、ＧＣａｓｅ活性は、Ｌ４４４Ｐ遺伝子導入マウスにおいて肝臓、脾臓、肺および脳内で有意に上昇した。同様にして、ＩｇＧは有意に減少した。

実施例３：ＩＦＧは、ゴーシェ病患者由来の細胞におけるグルコセレブロシダーゼ、炎症性サイトカインおよび骨代謝のレベルを上昇させる
変異ＧＣａｓｅレベルに対するＩＦＧの効果を評価するために、６０人の患者の末梢白血球に由来するマクロファージおよびＥＢＶ形質転換されたリンパ芽球を用いた生体外応答試験を実施した。炎症、骨代謝そして多発性骨髄腫と関連する潜在的バイオマーカーについて血漿をスクリーニングした。試験は、米国内の８ヵ所の場所で実施された。

結果
この試験は、Ｉ型ゴーシェ病を患う２１人の男性、ＩＩＩ型ゴーシェ病を患う１人の男性、そしてＩ型ゴーシェ病を患う１８人の女性を含んでいた。患者の年令は７〜８３才で、４０人中３８人の患者が酵素補充療法（ＥＲＴ）を受けていた。４０人のうち３４人の患者からのマクロファージの抽出に成功し、そのうち３２人が、酒石酸ＩＦＧで治療された（５日間）時点でＧＣａｓｅレベルの用量依存性上昇（平均＝２．８倍）を実証した。５つのさらなる患者由来リンパ芽球細胞系列について、類似の結果が観察された。ＩＦＧはＮ３７０Ｓ／Ｎ３７０Ｓ（１１）、Ｎ３７０Ｓ／Ｌ４４４Ｐ（８）、Ｎ３７０Ｓ／８４ｉｎｓＧ（１１）、Ｎ３７０Ｓ／Ｒ１６３Ｘ、Ｎ３７０Ｓ／Ｙ２１２Ｈ、Ｌ４４４Ｐ／ｄｅｌ１３６Ｔ、Ｌ４４４Ｐ／Ｆ２１６Ｙ、Ｌ４４４Ｐ／Ｌ１７４Ｆ、Ｇ２０２Ｒ／Ｒ４６３Ｃ、およびＫ７９Ｎ／複合体Ｂエクソン９／１０（ＩＩＩ型ＧＤ）を含めた、異なる遺伝子型をもつ患者由来の細胞中のＧＣａｓｅレベルを有意な形で上昇させた。マクロファージ中のＧＣａｓｅの最大増強は、約３０μＭのＩＦＧで達成された。

破骨細胞活性のマーカーであるＴＲＡＣＰ５ｂは、ＥＲＴを受けていた患者でさえ、特に男性のゴーシェ対象の血漿中で上昇した。同時に、骨特異的アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）の活性は、ゴーシェ対象（特に女性）の血漿中で減少した。このことは、ゴーシェ病患者において骨被着よりも骨吸収の方が強く作用を受け、骨病を促進する可能性があるということを示唆している。

その他の炎症誘発性サイトカインおよびケモカインも同様に一部のゴーシェ対象において上昇した。これらにはＩＬ−８、ＩＬ−１７、ＶＥＧＦ、ＰＡＲＣおよびＭＩＰ−１αが含まれていた。サイトカインのこの組合せは、同様に、骨吸収および多発性骨髄腫（特にＩＬ−１７、ＶＥＧＦ、およびＭＩＰ−１α）と関連づけされた。未治療かＥＲＴで治療中であるゴーシェ病患者が多発性骨髄腫を発生する高いリスクを有する、という事実を考慮すると、これは興味深いことである。ゴーシェ対象において抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３）の血漿レベルは高くなかった。

実施例４：ゴーシェ病患者の血漿中の代理マーカーの同定
最近になって、リソソーム酵素の変異とＬＳＤ以外の神経障害の関連性が確立されてきた。一例としては、Ｇｂａ遺伝子内の変異とパーキンソニズムおよびパーキンソン病の間には、揺るぎない関連性が存在する。一試験においては、稀な若年性難治性パーキンソニズムを患う１７人の患者のグループが、典型的に１型の非神経細胞障害性疾患に関連する変異であるＮ３７０Ｓについてのホモ接合性およびヘテロ接合性個体を含め、Ｇｂａミスセンス変異を伴う少なくとも１つの対立遺伝子を有することが発見された（Tayebi et al., Mol. Genet. Metab. 2003; 79; 104-109）。別の試験においては、特発性パーキンソン病に罹患した９９人のアシュケナージ系ユダヤ人の集団を、６つのＧｂａ変異（Ｎ３７０Ｓ、Ｌ４４４Ｐ、８４ＧＧ、Ｖ３９４ＬおよびＲ４９６Ｈ）について評価した。３１人のパーキンソン病患者は、１つまたは２つの変異Ｇｂａ対立遺伝子を有していた。すなわち、２３人はＮ３７０Ｓについてヘテロ接合性であり、３人はＮ３７０Ｓについてホモ接合性であり、４人は８４ＧＧについてヘテロ接合性であり、１人はＲ４９６Ｈについてヘテロ接合性であった（Aharon-Peretz et al., New Eng. J. Med. 2004; 351: 1972-77）。変異Ｎ３７０Ｓ対立遺伝子の頻度は、１５７３の正常な対象中のものの５倍であり、８４ＧＧの頻度は正常な対象のものの２１倍であった。パーキンソン病患者のうち、Ｇｂａ変異を担持する患者は同様に、キャリヤでない患者よりも若かった。この試験はＧｂａ変異についてのヘテロ接合性がアシュケナージ系ユダヤ人にパーキンソン病に対する素因を与えるかもしれないということを示唆している。

パーキンソン病およびゴーシェ病は、同様に、ニューロンの欠損、アストログリオーシスおよび海馬ニューロン（ＣＡ２−４領域）内の細胞毒性レヴィ小体様α−シヌクライン包接の存在を含めた、いくつかの病理学的特徴も共有している。最近の１刊行物がゴーシェ病の３つの形態全てにおける神経学的病状の程度について記述している（Wong et al., Mol. Genet. Metabol. 2004; 38: 192-207）。大脳皮質層３および５、海馬ＣＡ２〜４および層４ｂ内の異常は、３つのタイプ全てを有するゴーシェ患者において発見された。ニューロンの欠損は、２型および３型を患う患者においてのみ明白であり、一方１型患者は、アストログリオースを伴って現われた（Wong et al., 上掲書）。１型ゴーシェ病およびパーキンソン病／認知症を患う２人の患者が、海馬ＣＡ２−４ニューロン内のα−シヌクライン陽性包接を示し、１人の患者が脳幹型および皮質型レヴィ小体を有し、１人が黒質ニューロンの顕著なニューロン欠損を有していた（Wong et al.,上掲書）。要約すると、パーキンソニズムおよび認知症を患う４人の患者は全て、海馬ＣＡ２−４グリオーシス、およびニューロン枯渇、グリオーシス、および黒質中の脳幹型レヴィ小体を有していた。

ＥＬＩＳＡで測定した場合、α−シヌクラインの血漿レベルは、健常な対照に比べるとパーキンソン病患者において高い（Lee et al. J Neural Transm. 2006;113(10):1435-9）。シャペロン療法、ＥＲＴ、ＳＲＴまたはその他の治療で治療の進行を監視するためのバイオマーカーとして使用するために、α−シヌクラインがゴーシェ病患者由来の血漿中で高かったか否かを判定する目的でゴーシェ病患者４０人において血漿α−シヌクラインレベルを測定し、１２人の健常なボランティア由来の血漿中のレベルと比較した。

方法
患者試料
実施例３で記載されているように、患者の血漿試料を入手した。

ＥＬＩＳＡ
メーカーの使用説明書にしたがい、市販のＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を用いてα−シヌクラインレベルを判定した。簡単に言うと、ＥＬＩＳＡ平板を、０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有するｐＨ９．６の２００ｍＭのＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）中の１μｇ／ｍＬの非ビオチン化ｍＡｂ２１１（１００μＬ／ウェル；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）と共に４℃で一晩インキュベートすることによってコーティングし、ＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ）で４回洗浄し、２００μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液（２．５％のゼラチンと０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ）と共に３７℃で２時間インキュベートした。平板をＰＢＳＴで４回洗浄し、試験すべき試料１００μＬを各ウェルに（ニート（ｎｅａｔ）で）添加した。平板を２時間３７℃でインキュベートした。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、ブロッキング緩衝液中で１μｇ／ｍＬまで希釈した１００μＬのビオチン化ｍＡｂ２１１を添加し、２時間３７℃でインキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで４回洗浄し、ブロッキング緩衝液中で３：５０００に希釈され３７℃で１時間インキュベートされた１００μＬ／ウェルのＥｘｔｒ Ａｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。その後ウェルをＰＢＳＴで４回洗浄してから酵素基質Ｙｅｌｌｏｗ「ｐＮＰＰ」（Ｓｉｇｍａ）（１００μＬ／ウェル）を添加し、室温で３０分間発色させた。４０５ｎｍにおける吸光度値を判定し、対応の無い両側ｔ検定を用いて結果を比較した。

結果
健常なボランティア対照に比べて、α−シヌクラインレベルは、ゴーシェ病患者由来の血漿中で有意な形で上昇していた（ｐ＝０．０１９；図６）。集団間の分散は、有意に異なっていなかった。

したがって、ゴーシェ病治療を評価するための予後マーカーとして血漿α−シヌクラインを使用することができる。

実施例５：ゴーシェ線維芽細胞内で分断されたリソソーム輸送の回復
（ヒト患者由来の）Ｎ３７０Ｓゴーシェ線維芽細胞は、細胞質中の基質（すなわちＧｌｕＣｅｒ）の蓄積を実証していないものの、これらの線維芽細胞は、野生型線維芽細胞と比べて異常なリソソームタンパク質およびＧＣａｓｅ染色を示す。ＳＰＣイソファゴミンを用いたＮ３７０Ｓ線維芽細胞の治療は、リソソーム中に見られるＧＣａｓｅの量を増大させ、細胞に対する正常なリソソーム染色パターンを回復した。

方法
細胞培養
５％のＣＯ_２を用いて１０％のＦＢＳおよび１％のｐｅｎｎ／ｓｔｒｅｐと共にＤＭＥＭ中でＮ３７０Ｓ線維芽細胞（ＤＭＮ８９．１５）を３７℃で培養した。健常な個体由来の野生型線維芽細胞細胞系列ＣＲＬ−２０９７を対照として使用した。細胞を１０ｃｍの平板からカバースリップを備えた１２ウェルの平板内に二次培養した。１つの集密的１０ｃｍ平板からの細胞を３８ｍｌの培地中で稀釈させた。１０ｍＭの原液（５％ＤＭＳＯ）から１２ウェルの平板の各ウェルに、以下の濃度でイソファゴミンまたはＣ−ベンジル−イソファゴミンを添加した。

Ｃ−ベンジル−イソファゴミン−対照（二次抗体のみ）；未治療；０．０３μＭ；０．１μＭ；０．３μＭ；１．０μＭ；３．０μＭ；および１０．０μＭ。

イソファゴミン対照（二次抗体のみ）；未治療；１０μＭ；３０μＭ；１００μＭ；１ｎＭ；３ｎＭ；および１０ｎＭ。

合計約６日間、細胞を培養した。

定着および染色
細胞をＰＢＳ中で５分間洗浄し、１５分間３．７％のパラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）で定着させ、ＰＢＳ中で５分間再度洗浄し、５分間０．５％サポニンで透過化した。その後、０．１％のサポニンを含有するＰＢＳで細胞を洗浄し、新鮮な０．１％の水素化ホウ素ナトリウム／０．０１％のサポニンで５分間処置し、各５分ずつ３回、０．１％のサポニン／１％のＢＳＡを伴うＰＢＳで洗浄した。

１％のＢＳＡを伴うＰＢＳ中の一次抗ＧＣａｓｅ（１：２００）または抗ＬＡＭＰ−１（１：２００；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５５５７９８）抗体溶液５００μｌと共に１時間、細胞をインキュベートした。メーカーの使用説明書にしたがって、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｅａｓｔ Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）を用いたリソソーム染色を実施した。インキュベーションの後、ＰＢＳ中の０．１％のサポニンを含む１％ＢＳＡ中で３回、細胞を洗浄し、その後二次抗体溶液（１：５００；抗ＧＣａｓｅについては抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５８８そして抗ＬＡＭＰ−１については抗マウスＩｇＧ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４）と共にインキュベートした。細胞をカバースリップ上に載せ、密封し、直ちに検分した。

共焦点顕微鏡法
細胞を、共焦点顕微鏡を用いて視覚化した。赤色および緑色チャンネル利得を６に設定し、強度ウインドウを用いてレーザー出力を最適化し、実験の残りの部分については調整しなかった。全てのスライドを同じシッティング（ｓｉｔｔｉｎｇ）で分析し、２０倍および６０倍のレンズ、小さなピンホール、最適な画素サイズ、平均２回の走査を用いていかなるズームもなく全ての画像を収集し、以前の実験全てと同様、赤色および緑色チャンネルを同時に獲得した。

全ての画像を同じ強度で表示し、最大数の細胞の上にカーソルを設置することにより各画像について赤色＋緑色チャンネル強度グラフを生成した。

重複する赤色（ＬＡＭＰ−１）および緑色（ＧＣＡＳＥ）画素についての比率を計算することにより、将来の測定を行なうことができる。

結果
５日超にわたり集密的であったゴーシェＮ３７０Ｓ線維芽細胞は、断続的染色パターンを有する（図７Ｂ）正常な線維芽細胞と比較して、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）レッドを用いた粒状リソソーム染色パターン（図７Ａ）を示す。Ｌ４４４Ｐ線維芽細胞についても類似の結果が示された（データ示さず）。リソソームＬＡＭＰ−１についての染色は、Ｎ３７０Ｓおよび正常な線維芽細胞の両方において示されている（それぞれ図７Ｃ〜Ｄ）。ゴーシェ線維芽細胞においてはより多くのＬＡＭＰ−１が示される。

３０．０μＭのイソファゴミン（図７Ｇ〜Ｈ）と３．０μｌのＣ−ベンジル−イソファゴミン（図７Ｉ〜Ｊ）での治療は、２重染色によって示されているように、未治療の対照（図７Ｅ〜Ｆ）と比べリソソーム内のＧＣａｓｅの量を増加させ、ＧＣａｓｅおよびＬＡＭＰ−１についての正常なリソソームの断続的染色パターンを再度確立した。

図７Ｋ〜Ｎは、以下のようなＮ３７０Ｓゴーシェ線維芽細胞内のＧＣａｓｅリソソーム染色の変化を示している：（Ｋ）−対照（二次抗体のみ）；（Ｌ）−未治療のＮ３７０Ｓ線維芽細胞；（Ｍ）−３０μＭのイソファゴミン；および（Ｎ）３μＭのＣ−ベンジル−イソファゴミン。ＧＣａｓｅ染色は、未治療対照に対比して、シャペロン治療された細胞内のリソソームに局在化することが示されている。類似の結果は、Ｌ４４４Ｐゴーシェ線維芽細胞についても得られた（データ示さず）。

これらの結果は、薬理学シャペロンでの治療がリソソーム内のＧＣａｓｅレベルを上昇させることを立証している。リソソームの輸送の増加に加えて、パルスチェイス実験は、ＩＦＧがＥＲ中のＮ３７０Ｓ ＧＣａｓｅを増大させることを実証した（データ示さず）。

シャペロン治療での通常の細胞形態のこの改善は、ＥＲおよび／または細胞質ゾル内の場合によっては会合体の形をした変異ＧＣａｓｅの量または貯蔵の減少に起因する。評価されたＳＰＣが血液−脳関門を横断することが実証されていることから、この戦略は神経細胞障害性ゴーシェ病（２型および３型）を患うゴーシェ病患者のＣＮＳ症候を軽減することができた。

実施例６：ゴーシェ線維芽細胞内でのシャペロン治療によるポリユビキチン化タンパク質の増大；プロテアソーム分解経路の回復
健常なヒト線維芽細胞の抗ポリユビキチン化タンパク質（ＰＵＰ）および抗−ＧＣａｓｅ標識化を、Ｌ４４４Ｐ Ｇｂａ変異を有するゴーシェ病患者由来の線維芽細胞およびＮ３７０Ｓ Ｇｂａ変異を有するゴーシェ病患者の線維芽細胞の中のものと比較した。

方法
細胞培養
５％のＣＯ_２を用いて１０％のＦＢＳおよび１％のＰＳを伴うＤＭＥＭ中で、Ｌ４４４Ｐゴーシェ線維芽細胞（細胞系列ＧＭ１０９１５）；Ｎ３７０Ｓゴーシェ線維芽細胞（細胞系列ＤＭＮ８９．１５）および健常な個体からの線維芽細胞（ＣＲＬ−２０９７）を３７℃で培養した。細胞を１０ｃｍの平板から、滅菌カバーストリップを伴う１２ウェルの平板内に二次培養した。１つの集密的Ｔ−７５フラスコからのＮ３７０Ｓ細胞を１：６で希釈し、さらに４日間培養した。

１０ｍＭの原液（５％ＤＭＳＯ）から１２ウェルの平板の各ウェルに、以下の濃度でシャペロンイソファゴミンまたはＣ−ベンジル−イソファゴミンを添加した。

Ｃ−ベンジル−イソファゴミン：未治療；対照（二次抗体のみ）；０．０３μＭ；０．１μＭ；０．３μＭ；１．０μＭ；３．０μＭ；および１０．０μＭ。

イソファゴミン：未治療；対照（二次抗体のみ）；１０μＭ；３０μＭ；１００μＭ；１ｎＭ；３ｎＭ；および１０ｎＭ。

定着および染色
細胞をＰＢＳ中で一回５分間洗浄し、その後１５分間新鮮な３．７％のパラホルムアルデヒド中で定着させた。次に細胞をＰＢＳ中で５分間一回洗浄し、その後５分間０．２％のトリトンＸ−１００中で透過化した。その後、ＰＢＳ中で再度５分間細胞を洗浄し、新鮮な０．１％の水素化ホウ素ナトリウムで５〜１０分間処置した。１％のＢＳＡを伴うＰＢＳ中で３回（各５分ずつ）細胞を洗浄した。

（１％のＢＳＡを伴うＰＢＳ中で１：２００に希釈した）以下の一次抗体５００μｌと共に１時間、細胞をインキュベートした：
１． ユビキチン化タンパク質クローンＦＫ１に対するマウスモノクローナル抗体（ＡＦＦＩＮＩＴＩ（登録商標）Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＰＷ ８８０５）。
２． ウサギ抗ＧＣａｓｅ抗体

その後、１％のＢＳＡを伴うＰＢＳで細胞を３回洗浄し、その後以下の二次抗体の１：５００の希釈物と共に１時間インキュベートした：
１． ヤギ抗マウスＩｇＭ（μ鎖）ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ２１０４３）
２． ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）高交差吸収型ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１１０３４）

細胞を、ＢＳＡを伴うＰＢＳ中で３回洗浄し、取付け、視覚化に先立ち４℃に貯蔵した。

結果
初期実験は、細胞内のポリユビキチン化タンパク質（ＰＵＰ）の濃度が、ゴーシェＮ３７０ＳおよびＬ４４４Ｐ線維芽細胞（はるかに弱い）よりも、健常な細胞内で大きい（非常に強い）ことを示した。さらに、特異的化学シャペロンでのゴーシェ線維芽細胞の治療は、ゴーシェ細胞内のＰＵＰ染色を増大させる。上述の通り、これは、タンパク質の凝集がユビキチン／プロテアソーム経路を阻害するものとして知られているためである。したがって、シャペロンを用いて凝集を減少させることで、プロテアソーム媒介型分解経路を再開させることができる。

実施例７：ヒトゴーシェ病患者とヒト対照における代理マーカーの分析
この試験は、Ｉ型ＧＤを患う２６人の男性、ＩＩＩ型ＧＤを患う６人の男性、Ｉ型ＧＤを患う２６人の女性および１９の異なる遺伝子型を代表するＩＩＩ型ＧＤを患う５人の女性を含んでいた。患者の年令は４〜８３才の範囲に入り、６３人中５９人の患者は酵素補充療法を受けており、酵素輸液注入の直前に採血した。未治療ＷＢＣの分析から、対照に比べて低いＧＣａｓｅ活性、正常なＧｌｃＣｅｒレベル（大部分の患者がＥＲＴを受けていた）そして高いキトトリオシダーゼ活性（図８）が得られた。多数の試験がシヌクレオパチーにとっての潜在的危険因子であるＧＣａｓｅについてコードする遺伝子であるＧｂａ内の変異を同定していたことから、α−シヌクレインの血漿レベルについてスクリーニングした。意外にも、ＧＤ患者は、対照に比べて高い総α−シヌクレインレベルを示した（図８）。興味深いことに、本発明者らは、ＧＣａｓｅ活性が有意に低減されているマウスモデルのグルコシルセラミドの蓄積とα−シヌクレライン蓄積が相関関係をもつことも同様に発見した。破骨細胞（ＴＲＡＣＰ５ｂ）および骨芽細胞（ＢＡＰ）の活性のマーカーは、大部分の患者について異常であった。一般に、ＴＲＡＣＰ５ｂ活性は、多くの患者において高く、一方ＢＡＰレベルは正常より低かった（図９）。これらの結果は、骨代謝が大部分の患者において改変され、破骨細胞の活性および骨吸収に強く作用するということを示唆している。興味深いことに、炎症誘発性サイトカインおよびケモカインＰＡＲＣ（ＣＣＬ１８）、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、ＶＥＧＦおよびＭＩＰ−１αは、対照に比べて一部の患者において高くなっており、ＩＬ−１７およびＶＥＧＦレベルについては有意な相関関係（ｐ＜０．０００１）が観察された（図１０）。ＩＬ−１７は専らＣＤ４＋記憶Ｔ−細胞によって産生され、その他の細胞によるＶＥＧＦの産生を誘発できる。これらのサイトカインは、破骨細胞形成および破骨細胞の存続を促進でき、ゴーシェ病患者では多発性骨髄腫を発生させるリスクが増大していることが報告されているためＧＤに関連しうるこの多発性骨髄腫の発病機序にも関与していた可能性がある。

同様にＤＫＫ１についても患者をスクリーニングし、それが、年令をマッチングした対照に関して大部分のゴーシェ病患者においてより低いものであることを発見した（データ示さず）。その他の炎症誘発性（ＩＬ−１［α，β］、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、フラクタルキン、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ｓＣＤ４０Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦ、エオタキシン、ｓＣＤ１４、ＩＰ−１０、ＩＦＮ−ｖ、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１β、ＴＮＦα、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０）、抗炎症性（ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３）および心臓血管（ＣＲＰ、ＳＡＡ、ＳＡＰ）マーカーの血漿レベルは、対照と比較した場合、大部分のＧＤ患者について凡庸なものであった。

本発明は、本明細書中に記載された具体的実施形態によってその範囲が限定されるものではない。実際、以上の記述および添付図面から当業者には、本明細書に記載されているものに加えて本発明のさまざまな修正が明らかになる。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内に包含されるものである。

さらに、全ての値は近似値であり、説明のために示されているものであることを理解されたい。

本出願全体を通して特許、特許出願、公報、製品関連文書およびプロトコルが引用されているが、その開示は、あらゆる目的のために全体が本明細書に参照により援用されている。

Claims (5)

1. イソファゴミンを投与した後にゴーシェ病に関連する代理マーカーの改善が存在するか否かを判定するステップを含む、ゴーシェ病の治療下の患者に由来する試料の検査方法であって、
   代理マーカーは骨特異的アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）であり、該試料を用いて代理マーカーが検定され、ＢＡＰ活性の増加は、患者がイソファゴミンでの治療に応答していることを示すことを特徴とする方法。
2. 代理マーカーが、リソソーム酸性βグルコシダーゼ活性；脂質を持ったマクロファージ（「ゴーシェマクロファージ」）の存在；肝脾腫大症；キトトリオシダーゼレベル；肝酵素レベル；肺ケモカインＰＡＲＣ／ＣＣＬ１８レベル；アンジオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）および総酸性ホスファターゼのレベル；免疫学的欠陥、貧血症、血小板減少症、白血球減少症、高ガンマグロブリン血症、脾臓中のＴ−リンパ球の量の減少、全身性Ｂ細胞過剰増殖、形質細胞増加症、血漿α−シヌクライン；炎症性サイトカインレベル、マクロファージ、リンパ球および好中球を含む組織または臓器内の炎症性病巣の存在、および好中球走化性の障害；骨格異常、骨髄内のゴーシェ細胞の浸潤、溶解性病変、骨硬化症、骨痛、骨折、椎体圧潰、およびトリグリセリドレベルの低下；骨密度およびその他の異常なＸ線写真所見；神経学的症候、ニューロンの欠損、神経変性、水平注視異常、ミオクローヌス運動、角膜混濁、運動失調、認知症、痙性；発作、聴覚障害；認識機能障害；ゴーシェマクロファージの肺浸潤、肺高血圧症；ゴーシェ病患者由来の細胞内におけるＥＲからリソソームへの酸性βグルコシダーゼの異常輸送；エンドソーム経路を通した細胞脂質の異常輸送；ＥＲまたは細胞質ゾル内における誤って折畳まれた大量の酸性βグルコシダーゼの存在；（ストレス関連マーカーの遺伝子および／またはタンパク質発現により判定される）ＧＣａｓｅの毒性蓄積が起こすＥＲおよび／またはストレスの存在；エンドソームｐＨレベルの異常；単球上のＭＨＣＩＩおよび／またはＣＤ１ｄの血漿膜発現増大の存在；細胞形態の異常；ユビキチン／プロテアソーム経路の抑制；およびユビキチン化タンパク質の量の増加、からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる代理マーカーと組み合わせて用いられる、請求項１に記載の方法。
3. 代理マーカーが、ゴーシェ病患者由来の細胞の細胞質染色によって測定されるリソソーム酸性βグルコシダーゼ活性である、請求項２に記載の方法。
4. 細胞質染色が、ＬＡＭＰ−１発現およびポリユビキチン化タンパク質の一方または両方の検出である、請求項３に記載の方法。
5. 患者が２型または３型ゴーシェ病を有する、請求項１に記載の方法。

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