JP2005512517A - 誘導性Hsp70由来のポリペプチドとこのポリペプチドを含有する医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
・該第1のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列、
・前に引用した配列群から選択され、該第1のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列、
・前に引用した配列群から選択されたいずれのアミノ酸配列と異なるエピトープアミノ酸配列
である少なくとも第2のアミノ酸配列を含むポリエピトープにも関する。
HLAクラスIに対するペプチドの相対的親和性の測定。研究対象のHLAクラスI分子(3x105細胞/mL)を発現するTap−/−細胞を、16時間、37℃で100ng/mlのヒトβ−2mを補給した無血清RPMI1640培地中で100μM〜0.1μMの範囲の各種ペプチド濃度を用いて培養した。次に、細胞を2回洗浄し、まず特異的抗クラスImAbで、続いてFITC結合ヤギ抗マウスIg mAbで染色して、HLA−A*0201の発現を定量化した。各種ペプチド濃度ごとに、HLA特異的染色率を、100μMの基準ペプチドで得た染色の%として計算した。相対的親和性(RA)は、RA=(20%のHLA発現を誘導する各ペプチドの濃度/20%のHLA発現を誘導する基準ペプチドの濃度):として決定した。RA値が低くなるほど、HLAに対するペプチド結合が増強していく。各ペプチドの平均RA値は、少なくとも3回の独立した実験から決定した。
コラゲナーゼ溶液で固形腫瘍を粉砕した小片を溶解することによって、腫瘍浸潤リンパ球と腫瘍細胞株を調製した。大半の腫瘍株は10%FCSのDMEM培地中で培養し、最後にクローン化した。さらに、切除した新鮮な腫瘍浸潤リンパ節から、押しつぶして細胞を培地中に放出させてTリンパ球を取得した。
実施例1:特異的Hsp70領域の選択。ヒト誘導性Hsp70と構成的Hsc70のアミノ酸配列を整列し、不一致を目立たせた(図1)。少なくとも1つの不一致を含む、9−merペプチドまたは10−merペプチドは、この後研究が集中し選択した領域を形成していた。
正常な細胞における基本の発現プロファイルにもかかわらず、Hsp70は免疫学的な自己に属し、胸腺または末梢で提示されるHsp70エピトープが、特異的CD8+レパートリーに寛容を有することを除外できない。ペプチドがHLA−A*0201トランスジェニックHHDマウスの免疫学的な自己にも属する場合には、このようなモデルで、エキソビボにおける寛容現象を研究できる。したがって、Hspの免疫原性配列を同定するためのアプローチは、ネズミHsp70配列と共有するHsp70ペプチドの研究に限定した。
我々は、HHDマウスで、選択した4つのHLA−A*0201制限Hsp70ペプチドの免疫原性を研究した。インビボで4つのペプチドすべてに対してCTLを誘導し、高活性CTL株をインビトロで再刺激した後に得た。実際に、各CTL株は、HSP380に対しては約10nMの活性(最大溶解度の50%)で、HSP134、HSP391およびHSP393に対しては10nM未満の活性でそれぞれのHsp70ペプチドを認識している。ただし、これらの後者ペプチドに対する活性が常にHsp70同系ペプチドに対してより約3ログ(log)分高いので、これらは、Hsc70同系ペプチドをかすかに認識するに過ぎなかった(図2)。これらのCTL株はそれぞれ、mCTL134、mCTL380、mCTL391およびmCTL393として表されている。
乳ガン(MCF−7)、肉腫(SAOS)、結腸ガン(Caco−2)および膀胱ガン(SEG)のプールを同定した(図4)。
前に選択した3つのHSPエピトープに対してヒトCTLを誘導可能であるかどうかを調査するため、我々は、ペプチド負荷樹状細胞でCD8+細胞を刺激した。我々はペプチド特異的CTLを誘導した(hCTL380、hCTL391およびhCTL393に関しては図7Aと図7Bのデータを参照)。これらのヒトCTLは、図3に記載されているHsp70を過剰発現する各種組織学的型の数多くのパネルの腫瘍細胞の表面における特異的エピトープを認識できる。
22 a.a.天然ポリエピトープは、HHDネズミモデルにおけるインビボでの3種類のHSP380、HSP391およびHSP393エピトープに対する3種類の異なる免疫反応を生じることができるという特徴をもつ。HHDマウスにワクチンを接種し、各エピトープに対するそれらの免疫反応をエキソビボでIFN−γエリスポット検査によって評価した。22−merポリエピトープでのワクチン接種によって、ほとんどのマウスで免疫反応が誘導された(図8Aの左のパネルと図8B)。面白いことに、22−merポリエピトープでのワクチン接種は、3つのHsp70エピトープすべてに対する免疫反応を誘導したが、3種類の混合物でワクチン接種したときには、HSP391だけに対する偏った反応が生じた(図8Aの右のパネル)。このことは、22−merポリエピトープが、HHDマウスでは、複数のHsp70エピトープに対してインビボで多特異的免疫反応を生じるという利点のあることを実証している。
Claims (28)
- 誘導性Hsp70のアミノ酸配列内の同じ長さの部分と少なくとも65%一致する、少なくとも8個の連続したアミノ酸のアミノ酸配列を含有するペプチドであって、ペプチドのアミノ酸配列が、構成的Hsc70アミノ酸配列と同じ長さのアミノ酸配列と、少なくとも1つのアミノ酸で異なっており、誘導性Hsp70を自然に産生する細胞を特異的に認識でき、Hsc70エピトープではなく変異型および非変異型Hsp70エピトープの両方を認識できる細胞傷害性Tリンパ球をインビトロまたはインビボで誘導できることを特徴とするペプチド。
- アミノ酸配列が、誘導性Hsp70のアミノ酸配列内の同じ長さの部分と少なくとも75%一致する、請求項1に記載のペプチド。
- アミノ酸配列が、誘導性Hsp70のアミノ酸配列内の同じ長さの部分に一致する、請求項1または2に記載のペプチド。
- アミノ酸配列が、構成的Hsc70アミノ酸配列の同じ長さのアミノ酸配列と、ペプチドの3番目から最後のC末端アミノ酸までに配置されるアミノ酸の少なくとも1個で異なることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載のペプチド。
- アミノ酸配列が、構成的Hsc70アミノ酸配列の同じ長さのアミノ酸配列と、ペプチドの4番目から最後のC末端アミノ酸までに配置されるアミノ酸の少なくとも1個で異なることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載のペプチド。
- アミノ酸配列が、9個のアミノ酸を含有し、構成的Hsc70アミノ酸配列の同じ長さのアミノ酸配列と、ペプチドの4番目から9番目のアミノ酸までに配置されるアミノ酸の少なくとも1個で異なることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載のペプチド。
- アミノ酸配列が、10個のアミノ酸を有し、構成的Hsc70アミノ酸配列の同じ長さのアミノ酸配列と、ペプチドの4番目から10番目のアミノ酸までに配置されるアミノ酸の少なくとも1個で異なることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載のペプチド。
- アミノ酸配列が、誘導性Hsp70アミノ酸配列の同じ長さのアミノ酸配列と、ペプチドの1番目、2番目または最後のC末端アミノ酸に配置されるアミノ酸の少なくとも1個で異なることを特徴とする、請求項1、2または請求項4〜7のいずれか1項に記載のペプチド。
- 3番目のアミノ酸から最後のC末端アミノ酸の1つ前までのアミノ酸配列が、誘導性Hsp70のアミノ酸配列内の同じ長さの部分と一致することを特徴とする、請求項1、2または請求項4〜8のいずれか1項に記載のペプチド。
- アミノ酸配列が、誘導性Hsp70アミノ酸配列の同じ長さのアミノ酸配列と、少なくとも1個のアミノ酸で異なることを特徴とする、請求項1、2または請求項4〜9のいずれか1項に記載のペプチド。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載の第1のアミノ酸配列と、
該第一のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列、
請求項1〜14のいずれか1項に記載され、該第1のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列、
請求項1〜14のいずれか1項に記載のアミノ酸配列とは異なるエピトープアミノ酸配列
からなる群から選択した少なくとも1つの第2のアミノ酸配列とを含有するポリエピトープ。 - アミノ酸配列LMGDKSENVQDLLLLDVAPLSLを含有するか、またはこのアミノ酸配列からなる、請求項15に記載のポリエピトープ。
- 生物分解性微粒子である担体に連結していることを特徴とする、請求項1〜14のいずれか1項に記載のペプチド、または請求項15または16に記載のポリエピトープ。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載のペプチド、または請求項15または16に記載のポリエピトープをコードする核酸配列。
- ベクターに連結していることを特徴とする、請求項18に記載の核酸配列。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載のペプチド、または請求項15もしくは16に記載のポリエピトープ、または請求項17に記載のペプチドもしくはポリエピトープ、または請求項18もしくは19に記載の核酸を用いることにより、誘導性Hsp70を自然に発現する細胞を特異的に標的とする細胞傷害性Tリンパ球反応をインビトロで誘導するための方法。
- 請求項20に記載の方法によって取得し得る、細胞傷害性Tリンパ球。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載の、少なくとも1個のペプチドを表面上に提示する、抗原提示細胞。
- 製剤上許容可能な賦形剤と一緒に、請求項1〜14のいずれか1項に記載のペプチド、請求項15もしくは16に記載のポリエピトープ、請求項17に記載のペプチドもしくはポリエピトープ、請求項18もしくは19に記載の核酸、請求項21に記載の細胞傷害性Tリンパ球、または請求項22に記載の抗原提示細胞を少なくとも含有する医薬組成物またはワクチン。
- 製剤上許容可能な賦形剤と一緒に、SLFEGIDFY、SLFEGIDFYTおよびLMGDKSENVからなる群から選択したアミノ酸配列を含有するかまたはこのアミノ酸配列からなるペプチドを少なくとも含有する、医薬組成物またはワクチン。
- 製剤上許容可能な賦形剤と一緒に、次の配列LMGDKSENVと少なくとも65%同一であるアミノ酸配列を含有するか、またはこのアミノ酸配列からなるペプチドを少なくとも含有する、医薬組成物またはワクチン。
- ガンもしくはウイルス性疾患の治療に有用な薬剤の調製のための、請求項1〜14のいずれか1項に記載のペプチド、請求項15もしくは16に記載のポリエピトープ、請求項17に記載のペプチドもしくはポリエピトープ、請求項18もしくは19に記載の核酸、請求項21に記載の細胞傷害性Tリンパ球、または請求項22に記載の抗原提示細胞の使用。
- ガンの治療に有用な薬剤の調製のための、SLFEGIDFY、SLFEGIDFYT、LMGDKSENVからなる群から選択したアミノ酸配列を含有するかまたはこのアミノ酸配列からなるペプチドの使用。
- ガンまたはウイルス性疾患の治療に有用な薬剤の調製のための、LMGDKSENVのアミノ酸配列を含有するかまたはこのアミノ酸配列からなるペプチドの使用。
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