KR20180086421A - 다공질 입자의 제조 방법, 다공질 입자, 담체, 칼럼 및 표적 물질의 분리 방법 - Google Patents

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제이에스알 마이크로, 인크.
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Abstract

합성 고분자계의 입자임에도 불구하고 비특이 흡착이 발생하기 어렵고, 또한 기계적 강도가 높고, 리간드를 결합한 경우의 동적 결합 용량이 큰 다공질 입자 및 그의 제조 방법을 제공하는 것. 이하의 공정 1 및 2를 포함하는, 다공질 입자의 제조 방법.
(공정 1) 비닐알코올 중합체 및 에틸렌-비닐알코올 공중합체로부터 선택되는 1종 이상의 중합체를 수계 용매에 용해시켜, 중합체 용액을 제조하는 공정
(공정 2) 상기 중합체 용액을 비수계 용매에 분산시켜 W/O 에멀션을 형성하는 공정

Description

다공질 입자의 제조 방법, 다공질 입자, 담체, 칼럼 및 표적 물질의 분리 방법
본 발명은, 다공질 입자의 제조 방법, 다공질 입자, 담체, 칼럼 및 표적 물질의 분리 방법에 관한 것이다.
혈청, 혈장, 세포 배양액, 오줌 등의 생체 시료로부터, 단백질이나 항체 등의 표적 물질을 분리하는 데에는 곤란이 수반되어, 효율적으로 분리하는 기술이 요구되고 있다.
예를 들어, 생체 시료로부터 표적 물질을 선택적으로 분리하는 목적으로서, 합성 고분자로 구성되는 유기계 다공질 입자를 지지체로 하고, 이것에 리간드를 결합한 담체가 사용되고 있다.
합성 고분자로 구성되는 유기계 다공질 입자를 지지체로 한 담체로서, 폴리아크릴아미드 겔, 폴리아크릴레이트 겔, 폴리스티렌, 에틸렌-비닐알코올 공중합체 등을 사용한 것이 개발되어 있지만(특허문헌 1 및 2), 합성 고분자계의 다공질 입자는, 비특이 흡착이 일어나기 쉽다는 결점이 있다.
일본 특허 공개 제2011-224360호 공보 일본 특허 공개 제2012-214550호 공보
특히, 비특이 흡착을 억제하면서, 리간드를 결합한 경우의 동적 결합 용량을 충족시키는 것은 용이하지 않아, 이들에 첨가하여 충분한 기계적 강도도 구비한 것으로 하는 것은 특히 곤란한 것으로 되어 있었다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 합성 고분자계의 입자임에도 불구하고 비특이 흡착이 발생하기 어렵고, 또한 기계적 강도가 높고, 리간드를 결합한 경우의 동적 결합 용량이 큰 다공질 입자 및 그의 제조 방법을 제공하는 데 있다.
그래서, 본 발명자들은 예의 검토한 결과, (공정 1) 비닐알코올 중합체 및 에틸렌-비닐알코올 공중합체로부터 선택되는 1종 이상의 중합체를 수계 용매에 용해시켜, 중합체 용액을 제조하는 공정 및 (공정 2) 상기 중합체 용액을 비수계 용매에 분산시켜 W/O 에멀션을 형성하는 공정을 포함하는 방법으로 제조함으로써, 합성 고분자계의 입자임에도 불구하고 비특이 흡착이 발생하기 어렵고, 또한 기계적 강도가 높고, 리간드를 결합한 경우의 동적 결합 용량이 큰 다공질 입자가 얻어지는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.
또한, 비닐알코올 중합체 및 에틸렌-비닐알코올 공중합체로부터 선택되는 1종 이상의 중합체에서 유래하고, 또한 공극률이 75％ 이상인 다공질 입자가, 합성 고분자계의 입자임에도 불구하고 비특이 흡착이 발생하기 어렵고, 또한 기계적 강도가 높고, 리간드를 결합한 경우의 동적 결합 용량이 큰 것을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 이하의 〔1〕 내지 〔15〕를 제공하는 것이다.
〔1〕 이하의 공정 1 및 2를 포함하는, 다공질 입자의 제조 방법(이하, 「본 발명의 다공질 입자의 제조 방법」이라고도 칭함).
(공정 1) 비닐알코올 중합체 및 에틸렌-비닐알코올 공중합체로부터 선택되는 1종 이상의 중합체를 수계 용매에 용해시켜, 중합체 용액을 제조하는 공정
(공정 2) 상기 중합체 용액을 비수계 용매에 분산시켜 W/O 에멀션을 형성하는 공정
〔2〕 상기 에틸렌-비닐알코올 공중합체로서, 하기 식 (1)로 표시되는 에틸렌 유래의 반복 단위(이하, 「반복 단위 (1)」이라고도 칭함)를 공중합체 중의 전체 반복 단위에 대하여, 0몰％ 초과 50몰％ 이하 갖는 에틸렌-비닐알코올 공중합체를 사용하는, 상기 〔1〕에 기재된 제조 방법.
Figure pct00001
〔3〕 이하의 공정 3을 추가로 포함하는, 상기 〔1〕 또는 〔2〕에 기재된 제조 방법.
(공정 3) 상기 W/O 에멀션을 냉각하여, 다공질 입자를 형성시키는 공정
〔4〕 이하의 공정 4를 추가로 포함하는, 상기 〔3〕에 기재된 제조 방법.
(공정 4) 공정 3에서 형성된 다공질 입자를 화학 가교하는 공정
〔5〕 상기 수계 용매가, 술폭시드계 용매 중 물과 혼화하는 것, 폴리올계 용매 중 물과 혼화하는 것, 알코올계 용매 중 물과 혼화하는 것 및 아미드계 용매 중 물과 혼화하는 것으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상과 물을 포함하는 혼합 용매, 또는 물인, 상기 〔1〕 내지 〔4〕 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
〔6〕 비닐알코올 중합체 및 에틸렌-비닐알코올 공중합체로부터 선택되는 1종 이상의 중합체에서 유래되는 다공질 입자이며, 공극률이 75％ 이상인, 다공질 입자(이하, 「본 발명의 다공질 입자」라고도 칭함).
〔7〕 상기 에틸렌-비닐알코올 공중합체가, 반복 단위 (1)을 공중합체 중의 전체 반복 단위에 대하여, 0몰％ 초과 50몰％ 이하 갖는 에틸렌-비닐알코올 공중합체인, 상기 〔6〕에 기재된 다공질 입자.
〔8〕 화학 가교 구조를 갖는, 상기 〔6〕 또는 〔7〕에 기재된 다공질 입자.
〔9〕 하기 식 (2)로 표시되는 비닐알코올 유래의 반복 단위(이하, 「반복 단위 (2)」라고도 칭함)를 갖는 상기 〔6〕 내지 〔8〕 중 어느 한 항에 기재된 다공질 입자.
Figure pct00002
〔10〕 상기 〔6〕 내지 〔9〕 중 어느 한 항에 기재된 다공질 입자에 리간드가 결합된, 담체(이하, 「본 발명의 담체」라고도 칭함).
〔11〕 상기 리간드가, 이뮤노글로불린 결합 도메인을 포함하는 단백질인, 상기 〔10〕에 기재된 담체.
〔12〕 표적 물질의 분리용인, 상기 〔10〕 또는 〔11〕에 기재된 담체.
〔13〕 체액 관류 흡착용인, 상기 〔10〕 또는 〔11〕에 기재된 담체.
〔14〕 상기 〔10〕 내지 〔13〕 중 어느 한 항에 기재된 담체가 칼럼 용기에 충전된, 칼럼(이하, 「본 발명의 칼럼」이라고도 칭함).
〔15〕 상기 〔10〕 내지 〔13〕 중 어느 한 항에 기재된 담체를 사용하는 것을 특징으로 하는, 표적 물질의 분리 방법(이하, 「본 발명의 표적 물질의 분리 방법」이라고도 칭함).
본 발명의 다공질 입자의 제조 방법에 의하면, 합성 고분자계의 입자임에도 불구하고 비특이 흡착이 발생하기 어렵고, 또한 기계적 강도가 높고, 리간드를 결합한 경우의 동적 결합 용량이 큰 다공질 입자를, 간편 또한 용이하게 제조할 수 있다.
본 발명의 다공질 입자는, 합성 고분자계의 입자임에도 불구하고 비특이 흡착이 발생하기 어렵고, 또한 기계적 강도가 높고, 리간드를 결합한 경우의 동적 결합 용량이 크다.
도 1은, 제조예 1에서 얻은 입자 A 내지 C 및 담체 A의 분말 X선 회절의 피크를 도시하는 도면이다.
〔다공질 입자〕
본 발명의 다공질 입자는, 비닐알코올 중합체 및 에틸렌-비닐알코올 공중합체로부터 선택되는 1종 이상의 중합체에서 유래하고, 또한 공극률이 75％ 이상의 다공질 입자이다.
(공극률)
본 발명의 다공질 입자의 공극률은, 75％ 이상이다. 공극률을 75％ 이상으로 함으로써, 리간드를 결합시켰을 경우에 있어서의 동적 결합 용량을 비약적으로 증대시킬 수 있다.
공극률로서는, 리간드를 결합시켰을 경우에 있어서의 동적 결합 용량 및 표적 물질 포착 성능의 관점에서, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 85％ 이상, 특히 바람직하게는 90％ 이상이고, 또한 기계적 강도의 관점에서, 바람직하게는 100％ 미만, 보다 바람직하게는 95％ 이하이다. 특히, 공극률을 80％ 이상으로 함으로써, 리간드를 결합시켰을 경우에 있어서의 동적 결합 용량이 현저하게 개선된다.
공극률은, 다공질 입자를 칼럼 용기에 충전하고, 기준 물질을 흘림으로써 산출할 수 있다. 구체적으로는 실시예와 동일하게 하여 측정하면 된다.
본 발명의 다공질 입자로서는, 기계적 강도, 리간드를 결합시켰을 경우에 있어서의 동적 결합 용량의 관점에서, 결정 구조를 갖는 것이 바람직하다. 결정 구조의 유무는 X선 회절 등에 의해 확인할 수 있다. 또한, 본 명세서에 있어서, 다공질 입자란, 표면에 다수의 세공(포어)을 갖는 입자를 말한다.
여기서, 본 발명에서 사용하는 비닐알코올 중합체, 에틸렌-비닐알코올 공중합체에 대하여 상세하게 설명한다.
상기 비닐알코올 중합체는, 하기 식 (2)로 표시되는 비닐알코올 유래의 반복 단위에서 구성되는 중합체를 의미한다.
Figure pct00003
또한, 상기 에틸렌-비닐알코올 공중합체란, 하기 식 (1)로 표시되는 에틸렌 유래의 반복 단위와 반복 단위 (2)로 구성되는 중합체를 의미한다. 또한, 에틸렌-비닐알코올 공중합체는 랜덤 공중합체, 블록 공중합체, 그래프트 공중합체 등 어느 것의 공중합체여도 이들의 혼합물이어도 된다.
Figure pct00004
본 발명에서 사용하는 에틸렌-비닐알코올 공중합체에 있어서, 반복 단위 (1)의 함유량은, 에틸렌-비닐알코올 공중합체 중의 전체 반복 단위에 대하여, 0몰％ 초과인데, 리간드를 결합시켰을 경우에 있어서의 동적 결합 용량의 관점에서, 에틸렌-비닐알코올 공중합체 중의 전체 반복 단위에 대하여, 바람직하게는 1몰％ 초과, 보다 바람직하게는 5몰％ 초과, 더욱 바람직하게는 10몰％ 이상, 특히 바람직하게는 15몰％ 이상이고, 또한 비특이 흡착량, 배제 한계 분자량, 리간드를 결합시켰을 경우에 있어서의 동적 결합 용량의 관점에서, 바람직하게는 50몰％ 이하, 보다 바람직하게는 45몰％ 이하, 더욱 바람직하게는 40몰％ 이하, 더욱 바람직하게는 35몰％ 이하, 특히 바람직하게는 30몰％ 이하이다.
또한, 에틸렌-비닐알코올 공중합체는, 반복 단위 (1) 이외에, 반복 단위 (2)를 갖는 것인데, 반복 단위 (2)의 함유량은, 반복 단위 (1) 이외의 잔여이다.
반복 단위 (1), (2)의 함유량은, 예를 들어 에틸렌-비닐알코올 공중합체를 NMR 측정함으로써 산출할 수 있다.
(비누화도)
본 발명에서 사용하는 비닐알코올 중합체 및 에틸렌-비닐알코올 공중합체의 비누화도는, 비특이 흡착량의 관점에서, 바람직하게는 90몰％ 이상, 보다 바람직하게는 92몰％ 이상, 더욱 바람직하게는 95몰％ 이상, 특히 바람직하게는 98몰％ 이상이다. 또한, 상한에 대해서는 100몰％ 이하이면 되지만, 바람직하게는 99.9몰％ 이하이다.
본 명세서에 있어서, 비누화도는, JIS K6726에 의해 측정할 수 있다.
(중합도)
본 발명에서 사용하는 비닐알코올 중합체 및 에틸렌-비닐알코올 공중합체의 중합도는, 기계적 강도의 관점에서, 바람직하게는 50 이상, 보다 바람직하게는 100 이상이고, 또한 수계 용매에 용해시켜서 중합체 용액을 제조하는 경우에 용액의 점성을 억제할 수 있고, 입자화가 용이해지는 점에서, 바람직하게는 1000 미만, 보다 바람직하게는 500 미만이다.
본 명세서에 있어서 중합도는, 점도 평균 중합도를 의미하고, JIS K6726을 따라서 산출할 수 있다.
본 발명의 다공질 입자의 원료로서, 비닐알코올 중합체, 에틸렌-비닐알코올 공중합체에 첨가하여 다른 중합체(폴리비닐피롤리돈 등)나 그의 단량체를 조합하여 사용해도 된다. 비닐알코올 중합체 및 에틸렌-비닐알코올 공중합체로부터 선택되는 1종 이상의 중합체에서 유래되는 중합체부의 함유량은, 다공질 입자에 포함되는 전체 반복 단위에 대하여, 바람직하게는 85 내지 100질량％, 보다 바람직하게는 90 내지 100질량％, 더욱 바람직하게는 95 내지 100질량％, 특히 바람직하게는 99 내지 100질량％이다.
다공질 입자의 원료 중합체로서는, 결정 구조가 형성되기 쉬워지고 기계적 강도가 향상되는 점, 리간드를 결합하여 담체로서 사용하기에 적합한 배제 한계 분자량이 되는 점, 리간드를 결합시켰을 경우에 있어서의 동적 결합 용량 및 표적 물질 포착 성능이 개선되는 점 등으로부터, 반복 단위 (1) 및 (2)로 구성되는 것, 즉, 에틸렌-비닐알코올 공중합체가 특히 바람직하다.
비닐알코올 중합체, 에틸렌-비닐알코올 공중합체는, 시판품이어도, 통상법에 따라 합성한 것이어도 된다. 비닐알코올 중합체 및 에틸렌-비닐알코올 공중합체는, 일반적으로는 아세트산비닐 단량체를 중합시킨 후, 또는 아세트산비닐 단량체와 에틸렌을 공중합시킨 후, 비누화함으로써 제조된다.
(화학 가교 구조)
본 발명의 다공질 입자로서는, 화학 가교 구조를 갖는 것이 바람직하다. 이에 의해, 기계적 강도, 내압성이 향상되고, 예를 들어 리간드를 결합하여 사용한 경우에, 보다 고유속에서의 사용이 가능하게 된다.
화학 가교 구조로서는, 다공질 입자에 포함되는 2개 이상의 반복 단위 (2) 중의 히드록시기의 잔기가 화학 가교되어 있는 것이 바람직하고, 다공질 입자에 포함되는 2개 이상의 반복 단위 (2) 중의 히드록시기의 잔기가, 단결합 또는 2가 이상의 연결기로 화학 가교되어 있는 것이 보다 바람직하다. 이 경우, 다공질 입자는, 반복 단위 (2)와, 반복 단위 (2)가 화학 가교된 구조와의 양자를 포함하고 있어도 된다(다공질 입자에 포함되는 반복 단위 (2) 중 일부가 화학 가교되어 있어도 전부가 화학 가교되어 있어도 된다).
상기 단결합 또는 2가 이상의 연결기로서는, 가교제 유래의 것을 들 수 있다. 또한, 2가 이상의 연결기로서는, 2 내지 4가의 연결기가 바람직하고, 기계적 강도 등의 관점에서, 4가의 연결기가 특히 바람직하다.
가교제로서는 알데히드 화합물, 에폭시 화합물, N-메틸올 화합물, 디카르복실산, 할로겐 화합물, 이소시아네이트 화합물 등을 들 수 있고, 알데히드 화합물, 에폭시 화합물, N-메틸올 화합물이 바람직하고, 반응 제어가 용이한 점에서, 알데히드 화합물이 바람직하다.
알데히드 화합물의 구체예로서는, 포름알데히드, 아세트알데히드, 프로피온알데히드, 크로톤알데히드, 벤즈알데히드 등의 모노알데히드 화합물; 글리옥살, 말론디알데히드, 숙신알데히드, 아디포알데히드, 시트르알데히드, 프탈알데히드, 이소프탈알데히드, 말레알데히드, 글루타르알데히드, 테레프탈알데히드 등의 디알데히드 화합물; 디알데히드 전분, 폴리아크롤레인 등의 폴리알데히드 화합물 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 기계적 강도 등의 관점에서, 디알데히드 화합물이 바람직하고, 안전성이 높은 점에서, 글루타르알데히드가 특히 바람직하다.
에폭시 화합물의 구체예로서는, 에틸렌글리콜디글리시딜에테르, 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르, 레조르시놀디글리시딜에테르, 히도로게나토비스페놀 A 디글리시딜에테르, 글리세롤디글리시딜에테르, 트리메틸올프로판디글리시딜에테르, 디에틸렌글리콜디글리시딜에테르, 프로필렌글리콜디글리시딜에테르 등의 2관능성 비스에폭시드류; 글리세롤폴리글리시딜에테르, 트리메틸올프로판폴리글리시딜에테르, 펜타에리트리톨폴리글리시딜에테르, 디글리세롤폴리글리시딜에테르, 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르, 소르비톨폴리글리시딜에테르 등의 3관능 이상의 폴리에폭시드류; 에피클로로히드린, 에피브로모히드린, 에피플루오로히드린, 에피요오도히드린 등의 에피할로히드린류; 글리시돌 등을 들 수 있다.
N-메틸올 화합물의 구체예로서는, 디메틸올 요소, 디메틸올에틸렌 요소, 디메틸올프로필렌 요소, 디메틸올우론, 디메틸올트리아존, 디메틸올-4-메톡시-5,5-디메틸프로필렌 요소, 디메틸올디히드록시에틸렌 요소, 디메틸올알킬카바메이트, 메틸화 디메틸올디메톡시에틸렌 요소, 1,3-디메틸-4,5-디히드록시에틸렌 요소, 트리메틸올멜라민, 헥사메틸올멜라민, 메틸화 트리메틸올멜라민, 메틸화 헥사메틸올멜라민 등을 들 수 있다.
(반응성 관능기)
본 발명의 다공질 입자로서는, 리간드와 결합 가능한 반응성 관능기를 갖는 것이 바람직하다. 이러한 양태의 다공질 입자는, 리간드를 결합시키는 것만으로 담체로서 사용할 수 있고, 지지체로서 유용하다.
리간드와 결합 가능한 반응성 관능기로서는 카르복시기, 포르밀기, 아미노기, 말레이미드기, 활성 에스테르기, 에폭시기가 바람직하다. 이들 중에서도, 온화한 조건에서 리간드와의 반응이 진행되는 점에서, 에폭시기가 특히 바람직하다.
(분배 계수 Kav, 배제 한계 분자량)
본 발명의 다공질 입자의 Kav는, 리간드를 결합시켰을 경우에 있어서의 동적 결합 용량의 관점에서, 바람직하게는 0.2 이상, 보다 바람직하게는 0.4 이상, 더욱 바람직하게는 0.5 이상, 특히 바람직하게는 0.6 이상이고, 또한 비특이 흡착량, 리간드를 결합시켰을 경우에 있어서의 동적 결합 용량의 관점에서, 바람직하게는 0.9 이하, 보다 바람직하게는 0.8 이하, 특히 바람직하게는 0.75 이하이다.
본 발명의 다공질 입자의 배제 한계 분자량은, 비특이 흡착량이나 리간드를 결합한 경우의 동적 결합 용량의 관점에서, 바람직하게는 500KDa 이상, 보다 바람직하게는 1000KDa 이상, 더욱 바람직하게는 10000KDa 이상, 더욱 바람직하게는 50000KDa 이상, 더욱 바람직하게는 75000KDa 이상, 특히 바람직하게는 10만KDa 이상이고, 또한 비특이 흡착량이나 리간드를 결합시켰을 경우에 있어서의 표적 물질 포착 성능의 관점에서, 바람직하게는 100만KDa 이하, 보다 바람직하게는 75만KDa 이하, 특히 바람직하게는 50만KDa 이하이다.
분배 계수 Kav, 배제 한계 분자량은, 다공질 입자를 칼럼 용기에 충전하고, 기준 물질을 흘림으로써 산출되는 Kav, 배제 한계 분자량을 의미하고, 구체적으로는 실시예와 동일하게 하여 측정하면 된다.
(부피 밀도)
본 발명의 다공질 입자의 부피 밀도는, 기계적 강도 및 리간드 결합량 등의 관점에서, 바람직하게는 0.005g/mL 이상, 보다 바람직하게는 0.01g/mL 이상, 특히 바람직하게는 0.05g/mL 이상이고, 또한 리간드를 결합시켰을 경우에 있어서의 동적 결합 용량 및 표적 물질 포착 성능의 관점에서, 바람직하게는 1g/mL 이하, 보다 바람직하게는 0.5g/mL 이하, 더욱 바람직하게는 0.3g/mL 이하, 특히 바람직하게는 0.14g/mL 이하이다. 특히, 부피 밀도를 0.14g/mL 이하로 함으로써, 리간드를 결합한 경우의 동적 결합 용량이 현저하게 개선된다.
부피 밀도는, 다공질 입자의 충전층 부피당의 중량을 의미하고, 구체적으로는 실시예와 동일하게 하여 측정하면 된다.
(비표면적)
본 발명의 다공질 입자의 비표면적은 비특이 흡착량, 기계적 강도, 리간드를 결합시켰을 경우에 있어서의 동적 결합 용량의 관점에서, 바람직하게는 50㎡/g 이상, 보다 바람직하게는 70㎡/g 이상, 더욱 바람직하게는 80㎡/g 이상, 특히 바람직하게는 90㎡/g 이상이고, 또한 기계적 강도의 관점에서, 바람직하게는 150㎡/g 이하이다.
본 발명에 있어서의 비표면적이란, 수은 포로시미터에 의해 얻어지는 세공 직경 10 내지 5000nm의 세공이 갖는 표면적을, 다공질 입자의 건조 질량으로 나눈 값을 의미한다.
(평균 입자 직경)
본 발명의 다공질 입자의 평균 입자 직경으로서는, 10 내지 1000㎛가 바람직하다. 평균 입자 직경을 10㎛ 이상으로 함으로써, 리간드를 결합하여 표적 물질의 분리에 사용한 경우에 있어서의 배압의 상승이 억제되고, 고유속으로도 이용하기 쉬워진다. 한편, 입자 직경을 1000㎛ 이하로 함으로써, 표적 물질의 분리 등에 있어서, 입자 내부의 세공까지 효율적으로 이용할 수 있다.
평균 입자 직경은, ISO 13320 및 JIS Z 8825-1에 준한 레이저 회절법으로 측정한 부피 평균 입자 직경을 의미한다. 구체적으로는, 레이저 산란 회절법 입도 분포 측정 장치(예를 들어, LS 13320((주)베크만·콜터 등)에 의해 입경 분포를 측정하고, Fluid R. I. Real 1.333, Sample R. I. Real 1.54 Imaginary 0 등을 광학모델로서 사용하고, 부피 기준의 입도 분포를 측정하여 구해지는 평균 입자 직경을 말한다.
본 발명의 다공질 입자는, 상기 화학 가교 구조나 반응성 관능기가 도입된 것이어도 되지만, 이러한 경우에 있어서도, 상기 다공질 입자로서는, 반복 단위 (2)를 갖고 있어도 된다.
그리고, 본 발명의 다공질 입자는, 합성 고분자계의 입자임에도 불구하고 숙주 세포에 포함되는 HCP(Host Cell Protein)나 DNA 등의 생체 유래 불순물 등에 대하여 흡착량 저감이 우수하고, 우수한 방오성을 갖는다. 또한, 기계적 강도가 높고, 리간드를 결합시켰을 경우에 있어서의 표적 물질의 동적 결합 용량이 크다.
〔담체〕
본 발명의 담체는, 본 발명의 다공질 입자에 리간드가 결합된 것이다. 또한, 본 발명의 담체는, 입상이다. 본 발명의 담체로서는 비특이 흡착량, 기계적 강도, 동적 결합 용량의 관점에서, 결정 구조를 갖는 것이 바람직하다. 결정 구조의 유무는 X선 회절 등에 의해 확인할 수 있다.
또한, 리간드의 다공질 입자로의 결합은, 직접적인 결합이어도 링커 등을 통한 간접적인 결합이어도 된다.
본 발명의 담체는, 본 발명의 다공질 입자를 사용하는 것 이외에는, 리간드를 공유 결합법을 따라서 다공질 입자에 결합시키는 등의 통상법에 따라 제조할 수 있다. 리간드를 결합시키는 방법으로서는, 프로세스가 간편한 점에서, 상술한 반응성 관능기를 그대로 리간드와의 결합 부위로서 이용하는 방법이 바람직하다. 그 밖에, 반응성 관능기가 에폭시기인 경우에는, 다공질 입자에 포함되는 에폭시기를 개환하여 생성하는 알코올성 수산기를 토실기 등으로 활성화시키고 나서 리간드를 결합시키는 방법이나, 다공질 입자에 포함되는 에폭시기, 또는 당해 에폭시기의 개환에 의해 생성되는 개환 에폭시기로부터 추가로 링커를 신장시키고 나서, 당해 링커를 통하여 리간드를 결합시키는 방법을 들 수 있다.
리간드의 결합 조건은, 반응성 관능기의 함유량이나 리간드의 종류에 따라 적절히 선택하면 된다. 리간드가 단백질인 경우에는, 단백질의 N 말단의 아미노기, 단백질에 포함되는 리신 잔기의 ε-아미노기, 시스테인 잔기의 머캅토기 등이 에폭시기 등의 반응성 관능기와의 반응점이 될 수 있다. 단백질을 결합시키는 경우, 예를 들어 단백질의 등전점에 가까운 버퍼류의 수용액을 사용하고, 필요에 따라 염화나트륨이나 황산나트륨 등의 염을 첨가하여, 단백질과 다공질 입자를 혼합하면서, 0 내지 40℃에서 1 내지 48시간 반응시킴으로써, 반응성 관능기에 단백질을 결합시킬 수 있다.
또한, 리간드를 결합시킨 후, 담체에 잔존하는 반응성 관능기에 친수화 처리(블로킹 처리)를 해도 된다. 당해 반응성 관능기에 대한 처리는, 공지된 방법에 따라서 행하면 되고, 구체적인 방법으로서는, 머캅토에탄올, 티오글리세롤 등의 머캅토기를 포함하는 알코올을, 담체에 잔존하는 반응성 관능기에 반응시키는 방법 등을 들 수 있다.
(리간드)
본 발명의 다공질 입자에 결합되는 리간드로서는, 표적 물질에 대하여 적당한 어피니티를 갖는 것이면, 그 종류는 특별히 한정되지 않는다. 리간드의 구체예로서는 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, Fc 결합 단백, 아비딘, 스트렙트아비딘, 렉틴, 이들 기능성 변이체 등의 단백질; 아미노산; 인슐린 등의 펩티드; 모노클로날 항체 등의 항체; 항원; 효소; 호르몬; DNA, RNA 등의 핵산; 뉴클레오티드; 뉴클레오시드; 헤파린, 루이스 X, 강글리오시드 등의 당 또는 다당; 이미노디아세트산, 합성 색소, 2-아미노페닐붕소산, 4-아미노벤즈아미딘, 글루타티온, 비오틴이나 그의 유도체와 같은 저분자 화합물을 사용할 수 있다. 상기에 예시한 리간드는 그 전체를 사용해도 되지만, 효소 처리 등에 의해 얻어지는 그의 프래그먼트를 사용해도 된다. 또한, 인공적으로 합성된 펩티드나 펩티드 유도체, 리콤비넌트여도 된다.
이뮤노글로불린의 분리 또는 정제에 적합한 리간드로서는, 이뮤노글로불린 결합 도메인을 포함하는 단백질을 들 수 있다. 이뮤노글로불린 결합 도메인으로서는, 단백질 A의 이뮤노글로불린 결합 도메인, 단백질 G의 이뮤노글로불린 결합 도메인 및 단백질 L의 이뮤노글로불린 결합 도메인으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 이뮤노글로불린 결합 도메인이 바람직하다. 또한, 리간드는, 복수의 동일 또는 상이한 종류의 이뮤노글로불린 결합 도메인을 갖고 있어도 된다.
이러한 리간드 중에서는, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L 및 그것들의 기능성 변이체로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상이 바람직하고, 단백질 A, 단백질 G 및 단백질 L로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상이 보다 바람직하고, 단백질 A가 특히 바람직하다.
리간드의 결합량은 리간드의 종류, 표적 물질의 종류 등에 의해, 적절히 조절되지만, 단백질 A와 같은 이뮤노글로불린 결합 도메인을 포함하는 단백질을 리간드로서 결합하는 경우, 입자 1g당, 바람직하게는 10 내지 200mg, 보다 바람직하게는 25 내지 100mg이다. 이뮤노글로불린 결합 도메인을 포함하는 단백질을 리간드로서 결합하는 경우, 입자 1g당의 리간드의 결합량이 10mg 이상이면 동적 결합 용량이 우수한 것이 된다. 한편, 200mg 이하이면, 결합한 항체 등의 해리를 위하여 사용하는 해리 액의 양이 적절한 양이 된다.
그리고, 본 발명의 담체는, 비특이 흡착량 저감이 우수하다. 또한, 기계적 강도가 높고, 표적 물질의 동적 결합 용량이 크다.
본 발명의 담체는, 표적 물질 분리용의 담체로서 유용하다. 또한, 본 발명의 담체는, 체액 관류 흡착용의 담체로서 유용하다. 특히 어피니티형 담체로서 유용하다.
표적 물질로서는, 예를 들어 항원; 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 등의 항체; 세포(정상 세포 및 대장 암세포, 혈중 순환 암세포 등의 암세포); DNA, RNA 등의 핵산; 단백질, 펩티드, 아미노산, 당, 다당, 지질, 비타민 등의 생체 관련 물질을 들 수 있고, 창약 타깃이 되는 약물, 비오틴 등의 저분자 화합물이어도 된다. 또한, 표적 물질은, 형광 물질 등에 의해 표지화된 것일 수도 있다.
〔칼럼〕
본 발명의 칼럼은, 본 발명의 담체가 칼럼 용기에 충전된 것이다.
본 발명의 칼럼은, 표적 물질의 검출 또는 분리, 체액 관류 흡착에 사용할 수 있다. 특히, 친화성 크로마토그래피 그래피로의 사용이나 전혈관류형 체외 순환용 칼럼으로서의 사용 등에 적합하다.
또한, 체액으로서는 전혈, 혈청, 혈장, 혈액 성분, 각종 혈구, 혈소판 등의 혈액 조성 성분 외에, 오줌, 정액, 모유, 땀, 간질액, 간질성 림프액, 골수액, 조직액, 타액, 위액, 관절액, 흉수, 담즙, 복수, 양수 등을 들 수 있다.
〔표적 물질의 분리 방법〕
본 발명의 표적 물질의 분리 방법은, 본 발명의 담체를 사용하는 것을 특징으로 하는 것이다.
본 발명의 표적 물질의 분리 방법은, 본 발명의 담체를 사용하는 것 이외에는 통상의 방법에 따라서 행하면 된다. 예를 들어, 본 발명의 담체와 표적 물질을 포함하는 시료를 혼합하거나 하여 접촉시키는 공정(접촉 공정), 및 표적 물질을 포착한 담체를 시료로부터 분리하는 공정(분리 공정)을 포함하는 방법을 들 수 있다. 또한, 당해 분리 공정 후에, 리간드와 표적 물질을 해리시키는 공정을 포함하고 있어도 된다.
또한, 시료는, 표적 물질을 포함하는 것 또는 표적 물질을 포함할 가능성이 있는 것이면 된다. 예를 들어, 체액, 균체액, 세포 배양의 배지, 세포 배양 상청, 조직 세포의 파쇄액, 표적 물질을 함유하는 버퍼 용액 등을 들 수 있다.
그리고, 본 발명의 분리 방법에 의하면, 표적 물질을 선택적 또한 효율적으로 분리할 수 있다.
〔다공질 입자의 제조 방법〕
본 발명의 다공질 입자를 제조하는 방법으로서는, 예를 들어 이하의 공정 1 및 2를 포함하는 방법을 들 수 있다.
(공정 1) 비닐알코올 중합체 및 에틸렌-비닐알코올 공중합체로부터 선택되는 1종 이상의 중합체를 수계 용매에 용해시켜, 중합체 용액을 제조하는 공정
(공정 2) 상기 중합체 용액을 비수계 용매에 분산시켜 W/O 에멀션을 형성하는 공정
(공정 1)
공정 1은, 비닐알코올 중합체 및 에틸렌-비닐알코올 공중합체로부터 선택되는 1종 이상의 중합체(비닐알코올 중합체 및 에틸렌-비닐알코올 공중합체로부터 선택되는 1종 이상의 중합체를 총칭하여 「원료 중합체 α」라고도 함)를, 수계 용매에 용해시켜, 중합체 용액을 제조하는 공정이다. 비닐알코올 중합체, 에틸렌-비닐알코올 공중합체로서는, 상기에서 설명한 본 발명의 다공질 입자를 유도하는 것을 사용하면 된다. 또한, 공정 1에 있어서, 본 발명의 다공질 입자의 원료로서, 비닐알코올 중합체, 에틸렌-비닐알코올 공중합체에 첨가하여 다른 중합체(폴리비닐피롤리돈 등)나 그의 단량체를 조합하여 사용해도 된다. 비닐알코올 중합체 및 에틸렌-비닐알코올 공중합체로부터 선택되는 1종 이상의 중합체 사용량은, 다공질 입자에 반복 단위를 부여하는 화합물 전량에 대하여, 바람직하게는 85 내지 100질량％, 보다 바람직하게는 90 내지 100질량％, 더욱 바람직하게는 95 내지 100질량％, 특히 바람직하게는 99 내지 100질량％이다.
공정 1로서는, 에틸렌-비닐알코올 공중합체를 수계 용매에 용해시켜, 중합체 용액을 제조하는 공정이 바람직하다. 에틸렌-비닐알코올 공중합체를 사용함으로써, 리간드를 결합시켰을 경우에 있어서의 동적 결합 용량 및 표적 물질 포착 성능이 개선된다. 또한, 리간드를 결합하여 담체로서 사용하기에 적합한 배제 한계 분자량이 되고, 또한 결정 구조가 형성되기 쉬워져 기계적 강도가 향상된다.
공정 1에서 사용하는 원료 중합체 α의 사용량(중합체 농도)은, 원료 중합체 α와 수계 용매와의 합계 사용량에 대하여, 바람직하게는 0.1질량％ 이상, 보다 바람직하게는 1질량％ 이상, 특히 바람직하게는 3질량％ 이상이고, 또한 바람직하게는 25질량％ 이하, 보다 바람직하게는 15질량％ 이하, 특히 바람직하게는 10질량％ 이하이다. 원료 중합체 α의 사용량을 3질량％ 이상으로 함으로써 입자화하기 쉬워지고, 한편, 원료 중합체 α의 사용량을 15질량％ 이하로 함으로써, 충분한 크기의 세공 사이즈를 확보하기 쉬워진다. 또한, 원료 중합체 α의 사용량을 10질량％ 이하로 함으로써, 다공질 입자에 리간드를 결합한 경우의 동적 결합 용량이 현저하게 개선된다.
본 명세서에 있어서, 수계 용매는 물, 물과 혼화하는 용매 및 이들을 포함하는 혼합 용매를 포함하는 개념을 말한다.
수계 용매로서는, 예를 들어 물; 디메틸술폭시드 등의 술폭시드계 용매 중 물과 혼화하는 것; 에틸렌글리콜 등의 폴리올계 용매 중 물과 혼화하는 것; 이소프로판올 등의 알코올계 용매 중 물과 혼화하는 것; 디메틸포름아미드 등의 아미드계 용매 중 물과 혼화하는 것을 들 수 있다. 이들은 1종을 단독으로 사용해도 2종 이상을 조합하여 사용해도 된다.
이들 중에서도, 결정화 속도의 관점에서, 술폭시드계 용매 중 물과 혼화하는 것, 폴리올계 용매 중 물과 혼화하는 것, 알코올계 용매 중 물과 혼화하는 것 및 아미드계 용매 중 물과 혼화하는 것으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상(이하, 「용매 a」라고도 칭함)과 물을 포함하는 혼합 용매, 물이 바람직하고, 디메틸술폭시드, 에틸렌글리콜, 이소프로판올 및 디메틸포름아미드로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상과 물을 포함하는 혼합 용매, 물이 보다 바람직하고, 디메틸술폭시드와 물을 포함하는 혼합 용매가 특히 바람직하다.
용매 a와 물을 포함하는 혼합 용매를 사용하는 경우, 용매 a의 사용량은, 혼합 용매 전량에 대하여, 바람직하게는 40질량％ 이상, 보다 바람직하게는 45질량％ 이상, 더욱 바람직하게는 50질량％ 이상이고, 또한 바람직하게는 90질량％ 미만, 보다 바람직하게는 80질량％ 미만, 더욱 바람직하게는 70질량％ 미만이다.
공정 1에서 원료 중합체 α를 용해시키는 온도는, 원료 중합체 α의 결정부를 용이하게 이해시키는 점에서, 바람직하게는 70℃ 이상, 보다 바람직하게는 80℃ 이상, 특히 바람직하게는 90℃ 이상이고, 또한 바람직하게는 100℃ 이하이다.
또한, 공정 1에서 원료 중합체 α를 용해시키는 시간은 특별히 한정되지 않지만, 통상 0.1 내지 24시간 정도이다.
(공정 2)
공정 2는, 상기 중합체 용액을 비수계 용매에 분산시켜 W/O 에멀션을 형성하는 공정이다. W/O 에멀션을 형성시킴으로써 결정 구조가 얻어지기 쉬워지고, 기계적 강도를 개선할 수 있다. 또한, 리간드를 결합시켰을 경우에 있어서의 동적 결합 용량을 크게 할 수 있고, 또한 비특이 흡착량도 저감할 수 있다.
비수계 용매는, 중합체 용액을 분산시켜 W/O 에멀션을 형성할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 물과 혼화하지 않는 비수계 용매가 통상 사용된다.
비수계 용매로서는, 예를 들어 지방족 탄화수소계 용매, 방향족 탄화수소계 용매, 지환식 탄화수소계 용매, 할로겐화 탄화수소계 용매 등의 탄화수소계 용매를 들 수 있다. 이들은 1종을 단독으로 사용해도 2종 이상을 조합하여 사용해도 된다. 구체적으로는 헥산, 헵탄, 옥탄, 이소옥탄, 노난, 메틸시클로헥산, 등유, 유동 파라핀, 벤젠, 톨루엔, 클로로포름, 사염화탄소, 디클로로에탄, 디클로로메탄, 오르토디클로로벤젠, 파라디클로로벤젠, 메타디클로로벤젠 등을 들 수 있다.
비수계 용매의 사용량은, 중합체 용액 100질량부에 대하여, 통상 30 내지 200질량부 정도, 바람직하게는 50 내지 150질량부이다.
공정 2는, 분산제의 존재 하에서 행해도 된다. 분산제로서는, 예를 들어 각종 계면 활성제; 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜 등의 폴리옥시알킬렌류; 폴리비닐메틸에테르, 폴리비닐에틸에테르 등의 폴리비닐에테르류; 폴리2-에틸헥실(메트)아크릴레이트, 폴리라우릴(메트)아크릴레이트, 폴리스테아릴(메트)아크릴레이트 등의 폴리알킬(메트)아크릴레이트류; 폴리비닐피롤리돈, 폴리(메트)아크릴아미드 등의 수계 용매에 가용인 고분자 분산제; 폴리비닐버사테이트, 폴리비닐2-에틸헥사노에이트 등의 고급 지방산 비닐에스테르의 중합체를 비롯한, 비수계 용매에 가용인 고분자 분산제를 들 수 있다. 이들은 1종을 단독으로 사용해도 2종 이상을 조합하여 사용해도 된다.
이들 중에서도, 계면 활성제가 바람직하고, 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌알킬에스테르, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르 등의 비이온성 계면 활성제가 보다 바람직하다.
분산제의 사용량은, 비수계 용매 100질량부에 대하여, 통상 1 내지 30질량부 정도, 바람직하게는 5 내지 20질량부이다.
또한, W/O 에멀션을 형성시키는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 중합체 용액과 비수계 용매를 혼합·교반함으로써 W/O 에멀션을 형성시키는 것이 바람직하다. 이에 의해, 특수한 설비를 사용하지 않고 간편하게 W/O 에멀션을 형성시킬 수 있다.
공정 2의 분산 온도는, 용매의 비점 이하에서 적절히 선택하면 되지만, 통상 2 내지 95℃, 바람직하게는 25 내지 90℃이다. 또한, 분산 시간은 특별히 한정되지 않지만, 통상 0.1 내지 2시간이고, 바람직하게는 0.5 내지 1시간이다.
(공정 3)
본 발명의 다공질 입자의 제조 방법으로서는, (공정 3) 공정 2에서 형성된 W/O 에멀션을 냉각하여, 다공질 입자를 형성시키는 공정을 추가로 포함하는 방법이 바람직하다. 공정 3에서의 냉각에 의해, W/O 에멀션의 결정화가 촉진되어, 다공질 입자의 기계적 강도가 향상된다. 또한, 얻어지는 다공질 입자의 세공이 원하는 사이즈로 형성되기 쉬워진다.
공정 3에서의 냉각은, 공정 2에서의 분산 온도보다도 상대적으로 낮은 온도로 하면 되지만, 냉각 온도로서는, 결정화 촉진의 관점에서, 바람직하게는 0℃ 이상이고, 또한 결정화 속도 및 입자화의 관점에서, 바람직하게는 20℃ 이하, 보다 바람직하게는 10℃ 이하, 특히 바람직하게는 5℃ 이하이다.
또한, 냉각 시간은 특별히 한정되지 않지만, 통상 0.5 내지 12시간 정도이고, 바람직하게는 1 내지 5시간이다.
또한, 입자의 기계적 강도의 관점에서, 상기 냉각 후, 20℃ 초과 40℃ 이하의 온도 범위로 계 내를 가온하는 것이 바람직하다. 가온 시간은, 통상 0.5 내지 3시간 정도이고, 바람직하게는 1 내지 2시간이다.
(공정 4)
본 발명의 다공질 입자의 제조 방법으로서는, (공정 4) 공정 3에서 형성된 다공질 입자를 화학 가교하는 공정을 추가로 포함하는 방법이 바람직하다. 공정 4에 의해, 얻어지는 다공질 입자의 기계적 강도가 더욱 향상된다.
화학 가교는, 공지된 방법(예를 들어, 일본 특허 공개 제2005-171040호 공보 참조)에 따라, 가교제를 사용하거나 하여 행하면 된다.
가교제로서는, 화학 가교 구조를 부여하는 것으로서 전술한 가교제를 사용하면 된다.
가교제의 사용량은, 공정 3에서 얻어진 다공질 입자 100질량부(입자 건조 질량)에 대하여, 통상 25 내지 300질량부 정도, 바람직하게는 50 내지 150질량부이다.
가교제로서 알데히드 화합물을 사용하는 경우, 화학 가교는 산 촉매 존재 하에서 행하는 것이 바람직하다. 산 촉매로서는 염산, 질산, 황산, 인산 등의 무기산; 옥살산, 아세트산 등의 유기산을 들 수 있지만, 무기산이 바람직하고, 황산이 특히 바람직하다. 또한, 산 촉매는 1종을 단독으로 사용해도 2종 이상을 조합하여 사용해도 된다.
산 촉매의 사용량은, 기계적 강도의 관점에서, 알데히드 화합물 100질량부에 대하여, 통상 1 내지 200질량부, 바람직하게는 10 내지 100질량부이다.
공정 4는, 용매 존재 하에서 행하는 것이 바람직하다. 당해 용매로서는, 원료 중합체 α를 용해시키지 않고 가교제를 용해시키는 용매가 바람직하다. 구체적으로는, 물; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 헥산올, 글리세린 등의 알코올계 용매; 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 산업상의 이용이 용이한 점에서, 물, 에탄올, 이들의 혼합 용매가 바람직하다.
용매의 사용량은, 공정 3에서 얻어진 다공질 입자 100질량부(입자 건조 질량)에 대하여, 통상 500 내지 5000질량부 정도, 바람직하게는 1000 내지 4000질량부이다.
공정 4의 반응 온도는, 통상 40 내지 70℃이다. 또한, 공정 4의 반응 시간은 특별히 한정되지 않지만, 통상 3 내지 24시간 정도이다.
(공정 5)
본 발명의 다공질 입자의 제조 방법은, (공정 5) 공정 4에서 화학 가교된 다공질 입자와, 비닐알코올 중합체 및 에틸렌-비닐알코올 공중합체로부터 선택되는 1종 이상의 중합체를 접촉시키는 공정을 추가로 포함하고 있어도 된다. 공정 4에서 가교제로서 알데히드 화합물을 사용한 경우에는, 공정 5에 의해, 비닐알코올 중합체, 에틸렌-비닐알코올 공중합체에 포함되는 반복 단위 (2) 중의 히드록시기와, 다공질 입자의 잔존 포르밀기가 반응하기 때문에, 다공질 입자의 잔존 포르밀기를 블로킹할 수 있다.
상기 비닐알코올 중합체, 에틸렌-비닐알코올 공중합체로서는, 본 발명에 있어서 원료 중합체로서 사용되는 비닐알코올 중합체, 에틸렌-비닐알코올 공중합체와 동일한 것을 들 수 있다. 또한, 비닐알코올 중합체, 에틸렌-비닐알코올 공중합체의 사용량은, 공정 4에서 화학 가교된 다공질 입자 100질량부(입자 건조 질량)에 대하여, 통상 5 내지 75질량부 정도, 바람직하게는 10 내지 50질량부이다.
공정 5는 산 촉매, 용매 존재 하에서 행하는 것이 바람직하다. 당해 산 촉매, 용매로서는, 공정 4에서의 산 촉매, 용매와 동일한 것을 들 수 있다.
공정 5의 반응 온도는, 통상 40 내지 70℃이다. 또한, 공정 5의 반응 시간은 특별히 한정되지 않지만, 통상 1 내지 24시간 정도이다.
(공정 6)
본 발명의 다공질 입자의 제조 방법은, (공정 6) 공정 3에서 형성된 다공질 입자, 공정 4에서 화학 가교된 다공질 입자, 또는 공정 5에서 블로킹이 실시된 다공질 입자(공정 6에서, 이들을 「다공질 입자 Z」라고 총칭함)에, 리간드와 결합 가능한 반응성 관능기를 도입하는 공정을 추가로 포함하고 있어도 된다.
반응성 관능기의 도입은 통상법에 따라 행하면 되지만, 반응성 관능기로서 에폭시기를 도입하는 경우, 그 방법으로서는, 다공질 입자 Z와, 에폭시 화합물을 접촉시키는 방법이 바람직하다. 여기서 사용하는 에폭시 화합물은, 원료 중합체에 포함되는 반복 단위 (2) 중의 히드록시기와 반응하는 관능기(에폭시기, 할로겐 원자 등)에 첨가하여, 추가로 에폭시기를 1개 이상 갖는 화합물이다. 이러한 에폭시 화합물로서는, 예를 들어 에피클로로히드린, 에피브로모히드린, 에피플루오로히드린, 에피요오도히드린 등의 에피할로히드린; 에틸렌글리콜디글리시딜에테르, 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르, 레조르시놀디글리시딜에테르, 히드로게나토비스페놀 A 디글리시딜에테르, 글리세롤디글리시딜에테르, 트리메틸올프로판디글리시딜에테르, 디에틸렌글리콜디글리시딜에테르, 프로필렌글리콜디글리시딜에테르 등의 2관능성 비스에폭시드류; 글리세롤폴리글리시딜에테르, 트리메틸올프로판폴리글리시딜에테르, 펜타에리트리톨폴리글리시딜에테르, 디글리세롤폴리글리시딜에테르, 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르, 소르비톨폴리글리시딜에테르 등의 3관능 이상의 에폭시 화합물을 들 수 있다. 이들은 1종을 단독으로 사용해도 2종 이상을 조합하여 사용해도 된다.
공정 6은, 필요에 따라 염화나트륨이나 황산나트륨 등의 염의 존재 하에서 행해도 된다. 또한, 공정 6은, 용매 존재 하에서 행하는 것이 바람직하다. 당해 용매로서는, 공정 4에서의 용매와 동일한 것을 들 수 있다.
공정 6의 반응 온도는, 통상 20 내지 37℃이다. 또한, 공정 6의 반응 시간은 특별히 한정되지 않지만, 통상 0.5 내지 12시간 정도이다.
또한, 상기 공정 3 내지 6에서, 각 생성물의 단리는 필요에 따라, 여과, 세정, 건조, 재결정, 재침전, 투석, 원심 분리, 각종 용매에 의한 추출, 중화, 크로마토그래피 등의 통상의 수단을 적절히 조합하여 행하면 된다.
그리고, 본 발명의 다공질 입자의 제조 방법에 의하면, 합성 고분자계의 입자임에도 불구하고 비특이 흡착이 발생하기 어렵고, 담체의 지지체 원료 또는 지지체로서 유용한 본 발명의 다공질 입자를 간편 또한 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 이 제법에서 얻어지는 다공질 입자는, 기계적 강도가 높고, 리간드를 결합한 경우의 동적 결합 용량도 크다.
실시예
이하, 실시예를 들어서 본 발명을 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
(합성예 1 에틸렌-비닐알코올 공중합체의 합성)
고압 오토클레이브에 아세트산비닐 100질량부, 메탄올 50질량부를 투입하고, 60℃로 승온한 후 30분간 질소 버블링에 의해 계 중을 질소 치환하였다. 아조비스이소부티로니트릴을 메탄올에 용해하고, 농도 0.4질량％의 중합 개시제 메탄올 용액(중합 개시제 용액)을 제조한 후, 질소 가스를 버블링함으로써 질소 치환을 행하였다. 반응부의 에틸렌 치환을 충분히 행한 후, 반응부 내온을 60℃로 조정하고, 중합 개시제 용액 67질량부를 주입하여, 중합을 개시하였다. 중합 중에는 반응부의 에틸렌 압력을 1.57MPa로, 중합 온도를 60℃로 유지하였다. 6시간 후에 냉각하여 중합을 정지하였다. 반응부를 개방하여 탈에틸렌 한 후, 질소 가스를 버블링하여 에틸렌을 제거하였다. 이어서 감압 하에 미반응 아세트산비닐을 제거한 후, 공중합체의 메탄올 용액으로 하였다.
10질량％로 조정한 해당 공중합체 용액에 몰비(NaOH의 몰수/폴리아세트산비닐의 몰수) 0.05의 NaOH 메탄올 용액(10질량％)을 첨가하여 40℃로 유지하고, 비누화 반응을 2시간 실시하였다. 중합 후에 미반응 아세트산비닐 단량체를 제거하여 얻어진 공중합체의 메탄올 용액을 노르말 헥산에 투입하여 공중합체를 침전시키고, 회수한 공중합체를 아세톤에서 용해하는 재침 정제를 3회 행한 후, 60℃에서 감압 건조하여 공중합체의 정제물을 얻었다.
얻어진 에틸렌-비닐알코올 공중합체에 있어서, 에틸렌 유래의 반복 단위 (1)과 비닐알코올 유래의 반복 단위 (2)의 몰비를 프로톤 NMR에 의해 측정한 바, 15:85였다. 또한, JIS K6726을 따라서 산출한 중합도는 400이고, JIS K6726에 의해 측정한 비누화도는 99몰％였다.
(합성예 2 에틸렌-비닐알코올 공중합체의 합성)
중합 중의 반응부의 에틸렌 압력을 0.60MPa로 변경한 것 이외에는, 합성예 1과 동일하게 하여 에틸렌-비닐알코올 공중합체를 합성하였다.
얻어진 에틸렌-비닐알코올 공중합체에 있어서, 에틸렌 유래의 반복 단위 (1)과 비닐알코올 유래의 반복 단위 (2)의 몰비를 프로톤 NMR에 의해 측정한 바, 5:95였다. 또한, JIS K6726을 따라서 산출한 중합도는 400이고, JIS K6726에 의해 측정한 비누화도는 99몰％였다.
(제조예 1 단백질 A 결합 다공질 입자의 제조)
<입자 제조>
합성예 1에서 얻어진 에틸렌-비닐알코올 공중합체 100질량부, 디메틸술폭시드(와코 쥰야쿠 고교사제) 827질량부 및 증류수 502질량부를 배플 구비 7L 세퍼러블 플라스크에 투입하고, 100rpm으로 교반하면서 95℃에서 0.5시간 가온함으로써 에틸렌-비닐알코올 공중합체를 용해시켰다. 이 용액을, 에틸렌-비닐알코올 공중합체 용액 L로 한다. 또한, 이 용액 중의 에틸렌-비닐알코올 공중합체의 농도는 7질량％이다.
이어서, 이 공중합체 용액 L을 80℃까지 냉각하고, 이것에 별도 제조한 SPAN-80(도꾜 가세이 고교제) 143질량부 및 이소옥탄(와코 쥰야쿠 고교사제) 1287질량부를 포함하는 용액을 첨가하여, 125rpm으로 교반함으로써 W/O 에멀션을 제조하였다. W/O 에멀션을 30 내지 50분 정도 걸쳐서 0℃ 부근으로 냉각하고, 2 내지 4시간 정도 유지하고, 그 후 상온으로 승온시켜 1시간 교반을 계속함으로써 공중합체를 구형으로 하였다. 그 후, 반응 용액을, 4000질량부의 에탄올로 교반 하에서 세정하고, 흡인 여과에 의해 입자층을 회수하였다. 이 다공질 입자를 「입자 A」로 한다.
<가교 반응>
회수한 입자 A 100질량부(입자 건조 질량 환산)를 에탄올 2399질량부에 분산하고, 이어서, 47질량％ 황산 수용액 43질량부 및 20질량％ 글루타르알데히드 수용액(와코 쥰야쿠 고교제) 500질량부를 첨가하고, 60℃에서 6 내지 9시간 정도 가교 반응을 실시하였다. 그 후, 5000질량부의 물로 세정하고, 흡인 여과에 의해 입자층을 회수하였다. 이 글루타르알데히드로 가교를 실시한 다공질 입자를 「입자 B」로 한다.
<블로킹>
입자 B 100질량부(입자 건조 질량 환산)를 물 2600질량부에 분산시키고, 거기에, 47질량％ 황산 수용액 11질량부 및 합성예 1에서 얻은 에틸렌-비닐알코올 공중합체의 5질량％ 수용액 400질량부를 첨가한 후, 50℃로 가열하고, 1 내지 3시간 정도 반응시켰다. 그 후, 누체로 여과하고, 물로 세정하여, 입자를 회수하였다. 이 블로킹을 실시한 다공질 입자를 「입자 C」로 한다.
<에폭시기 도입>
황산나트륨 100질량부, 인산이수소나트륨 24질량부 및 50질량％의 수산화나트륨 수용액 36질량부를, 물 1876질량부에 첨가하여, 에폭시기 도입용 버퍼를 제조하였다. 이 에폭시기 도입용 버퍼 4750질량부에, 입자 C 100질량부(입자 건조 질량 환산) 및 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(와코 쥰야쿠 고교제) 1500질량부를 첨가하여, 실온에서 2시간 반응시켰다. 그 후, 누체로 여과하고, 물로 세정하여, 에폭시기 도입 다공질 입자를 회수하였다. 이 에폭시기 도입 다공질 입자를 「입자 D」로 한다.
<단백질 A 고정화>
에폭시기 도입 다공질 입자 D 100질량부(입자 건조 질량 환산)와, 48.68mg/mL의 단백질 A(국제 공개 제2015/080174호의 실시예에 기재된 방법에 의해 제작)의 용액(용매: 인산 버퍼) 600질량부와, 1M의 시트르산 버퍼(pH12) 8100질량부를 혼합하고, 25℃에서 5시간 전도 혼화함으로써, 단백질 A를 에폭시기 도입 다공질 입자 D에 결합시켰다. 생성한 입자를 여과한 후, 1M 티오글리세롤 수용액 7500질량부와 혼합하여 25℃에서 12시간 반응시켰다. 이어서, 0.1M의 인산 버퍼(pH7.6) 15000질량부, 0.5M의 NaOH 수용액 15000질량부 및 0.1M의 시트르산 버퍼(pH3.2) 15000질량부로 입자를 세정함으로써, 목적으로 하는 단백질 A 결합 다공질 입자를 얻었다. 이 단백질 A 결합 다공질 입자를 「담체 A」로 한다.
(제조예 2 단백질 A 결합 다공질 입자의 제조)
<입자 제조>의 공정에서 사용한 에틸렌-비닐알코올 공중합체 100질량부를, 합성예 2에서 얻어진 에틸렌-비닐알코올 공중합체(에틸렌 유래의 반복 단위 (1)과 비닐알코올 유래의 반복 단위 (2)의 몰비=5:95) 85질량부로 변경하고, 또한 <블로킹>의 공정에서 사용한 에틸렌-비닐알코올 공중합체를, 합성예 2에서 얻어진 에틸렌-비닐알코올 공중합체로 변경한 것 이외에는, 제조예 1과 동일한 수순으로 단백질 A 결합 다공질 입자를 제조하였다. 또한, <입자 제조>의 공정에서의 에틸렌-비닐알코올 공중합체 용액 중의 에틸렌-비닐알코올 공중합체의 농도는 6질량％이다.
제조예 2에서 얻어진 블로킹이 실시된 다공질 입자를 「입자 E」로 한다. 또한, 제조예 2에서 얻어진 단백질 A 결합 다공질 입자를 「담체 B」로 한다.
(제조예 3 단백질 A 결합 다공질 입자의 제조)
<입자 제조>의 공정에서 사용한 에틸렌-비닐알코올 공중합체 100질량부를, 에틸렌 유래의 반복 단위 (1)과 비닐알코올 유래의 반복 단위 (2)의 몰비가 27:73의 에틸렌-비닐알코올 공중합체(쿠라레사제 에발 L171B) 85질량부로 변경하고, 또한 <블로킹>의 공정에서 사용한 에틸렌-비닐알코올 공중합체를, 쿠라레사제 에발 L171B로 변경한 것 이외에는, 제조예 1과 동일한 수순으로 단백질 A 결합 다공질 입자를 제조하였다. 또한, <입자 제조>의 공정에서의 에틸렌-비닐알코올 공중합체 용액 중의 에틸렌-비닐알코올 공중합체의 농도는 6질량％이다.
제조예 3에서 얻어진 블로킹이 실시된 다공질 입자를 「입자 F」로 한다. 또한, 제조예 3에서 얻어진 단백질 A 결합 다공질 입자를 「담체 C」로 한다.
(제조예 4 단백질 A 결합 다공질 입자의 제조)
<입자 제조>의 공정에서 사용한 에틸렌-비닐알코올 공중합체 100질량부를, 에틸렌 유래의 반복 단위 (1)과 비닐알코올 유래의 반복 단위 (2)의 몰비가 38:62의 에틸렌-비닐알코올 공중합체(쿠라레사제 에발 H171B) 85질량부로 변경하고, 또한 <블로킹>의 공정에서 사용한 에틸렌-비닐알코올 공중합체를, 쿠라레사제 에발H171B로 변경한 것 이외에는, 제조예 1과 동일한 수순으로 단백질 A 결합 다공질 입자를 제조하였다. 또한, <입자 제조>의 공정에서의 에틸렌-비닐알코올 공중합체 용액 중의 에틸렌-비닐알코올 공중합체의 농도는 6질량％이다.
제조예 4에서 얻어진 블로킹이 실시된 다공질 입자를 「입자 G」로 한다. 또한, 제조예 4에서 얻어진 단백질 A 결합 다공질 입자를 「담체 D」로 한다.
(제조예 5 단백질 A 결합 다공질 입자의 제조)
<입자 제조>의 공정에서 사용한 에틸렌-비닐알코올 공중합체 100질량부를, 에틸렌 유래의 반복 단위 (1)과 비닐알코올 유래의 반복 단위 (2)의 몰비가 44:56의 에틸렌-비닐알코올 공중합체(쿠라레사제 에발 G156B) 85질량부로 변경하고, 또한 <블로킹>의 공정에서 사용한 에틸렌-비닐알코올 공중합체를, 쿠라레사제 에발 G156B로 변경한 것 이외에는, 제조예 1과 동일한 수순으로 단백질 A 결합 다공질 입자를 제조하였다. 또한, <입자 제조>의 공정에서의 에틸렌-비닐알코올 공중합체 용액 중의 에틸렌-비닐알코올 공중합체의 농도는 6질량％이다.
제조예 5에서 얻어진 블로킹이 실시된 다공질 입자를 「입자 H」로 한다. 또한, 제조예 5에서 얻어진 단백질 A 결합 다공질 입자를 「담체 E」로 한다.
(제조예 6 단백질 A 결합 다공질 입자의 제조)
<입자 제조>의 공정에서 사용한 에틸렌-비닐알코올 공중합체 100질량부를, 폴리비닐알코올(니혼 사쿠비·포발사제 JF-04, 비누화도: 98％) 85질량부로 변경하고, 또한 <블로킹>의 공정에서 사용한 에틸렌-비닐알코올 공중합체를, 니혼 사쿠비·포발사제 JF-04로 변경한 것 이외에는, 제조예 1과 동일한 수순으로 단백질 A 결합 다공질 입자를 제조하였다. 또한, <입자 제조>의 공정에서의 폴리비닐알코올 용액 중의 폴리비닐알코올 농도는 6질량％이다.
제조예 6에서 얻어진 블로킹이 실시된 다공질 입자를 「입자 I」로 한다. 또한, 제조예 6에서 얻어진 단백질 A 결합 다공질 입자를 「담체 F」로 한다.
(비교 제조예 1 단백질 A 결합 다공질 입자의 제조)
메타크릴레이트를 원료로 하는 단백질 A 결합 다공질 입자를 이하와 같이 제조하였다.
순수 4090질량부에, 폴리비닐알코올(쿠라레사제 PVA-217) 8.5질량부, 도데실황산나트륨(가오사제 에말 10G) 2.13질량부 및 탄산나트륨 4.26질량부를 첨가하고, 밤새 교반하여 수용액 (S-1)을 제조하였다.
수용액 (S-1) 30질량부를 별도로 발취해 두고, 나머지 수용액 (S-1)에 아질산나트륨 2.13질량부를 용해하여, 수용액 (S-2)를 제조하였다.
이어서, 글리세린디메타크릴레이트(신나까무라 가가꾸 고교사제) 125질량부, 글리시딜메타크릴레이트(미쓰비시 레이온사제) 17.9질량부 및 글리세롤모노메타크릴레이트(닛본 유시사제) 35.9질량부를, 2-옥타논(도요 고세이사제) 86.4질량부 및 아세토페논(와코 쥰야쿠 고교사제) 253질량부의 혼합액에 용해시켜, 단량체 용액을 제조하였다. 또한, 이 단량체 전량 중, 글리세린디메타크릴레이트는 70질량％이고, 글리시딜메타크릴레이트는 10질량％이고, 글리세롤모노메타크릴레이트는 20질량％이다.
이어서, 발취해 둔 수용액 (S-1) 30질량부에 2,2'-아조이소부티로니트릴(와코 쥰야쿠 고교사제) 2.2질량부를 첨가하여 분산하고, 개시제 분산액으로 하였다.
이어서, 준비한 수용액 (S-2) 및 단량체 용액을 배플 구비 7L 세퍼러블 플라스크 내에 투입하고, 온도계, 교반 날개 및 냉각관을 장착하여 온수 배스에 세팅하고, 질소 분위기 하에서, 220rpm으로 교반을 개시하였다. 계속해서, 세퍼러블 플라스크를 온수 배스에 의해 가온하고, 85℃에 도달했을 때, 상기 개시제 분산액을 첨가하여, 85℃로 온도를 유지하면서, 5시간 교반을 행하였다. 이어서, 반응액을 냉각한 후, 이러한 반응액을 누체로 여과하고, 순수와 이소프로필알코올로 세정하였다. 세정한 입자를 폴리 병에 옮기고, 물에 분산하여 데칸테이션을 3회 행하고, 소 입자를 제거하였다. 이상의 조작에 의해 물에 분산한 12.5질량％의 다공질 입자(입자 건조 질량 123g)를 얻었다. 이 다공질 입자를 「입자 J」로 한다.
여기서, 입자 J의 에폭시기 함유량을 측정하였다. 즉, 중합에서 사용한 에폭시기 함유 단량체량으로부터 계산되는 에폭시기 몰수가 2.00mmol이 되도록, 농도 약 10질량％의 입자 J의 수분산체(농도 기지)를 폴리에틸렌 보틀에 측정하여 취하고, 이것에 농도 38질량％의 염화칼슘 수용액 25mL 및 2N의 염산 2.00mL를 첨가하여, 75℃에서 150분간 교반함으로써 에폭시기를 개환하고, 냉각 후, 2N의 수산화나트륨 수용액 2.50mL로 중화하고, 이어서 pH 미터에서 pH를 모니터하면서 0.1N의 염산으로 역적정함으로써 측정하였다. 측정의 결과, 입자 J의 에폭시기 함유량은 0.47mmol/g이었다.
이어서, 단백질 A 0.1질량부를 0.1M 인산 버퍼(pH6.8) 25질량부에 분산시켜, 이 분산액과 입자 건조 질량 환산으로 1질량부의 입자 J를 혼합하고, 10℃에서 24시간 전도 혼화함으로써, 단백질 A를 입자 J에 결합시켰다. 생성한 입자를 여과한 후, 1M 티오글리세롤 25질량부와 혼합하여 30℃에서 4시간 반응시켜, 잔여의 에폭시기를 개환하고, PBS/0.5질량％ Tween20으로 세정 후, PBS로 추가로 세정하였다. 얻어진 다공질 입자를 「담체 G」로 한다.
(비교 제조예 2 단백질 A 결합 입자의 제조)
에틸렌 유래의 반복 단위 (1)과 비닐알코올 유래의 반복 단위 (2)의 몰비가 27:73의 에틸렌-비닐알코올 공중합체(쿠라레사제 에발 L171B) 100질량부를, 디메틸술폭시드(와코 쥰야쿠 고교사제) 1570질량부에 교반하면서 용해하고, 중합체 용액을 제조하였다. 또한, 이 용액 중의 에틸렌-비닐알코올 공중합체의 농도는 6질량％이다.
이어서, 상기 중합체 용액을, 내경 150㎛의 노즐로부터 토출하여 응고수 중에 적상(滴狀)으로 낙하시켜, 중합체 입자를 얻었다.
이어서, 얻어진 중합체 입자에, 제조예 1의 <가교 반응>, <블로킹>, <에폭시기 도입>, <단백질 A 고정화>과 동일한 처리를 행하였다. 또한, <블로킹>의 공정은, 물 2600질량부를 디메틸술폭시드 2600질량부로, 합성예 1에서 얻은 에틸렌-비닐알코올 공중합체의 5질량％ 수용액 400질량부를 쿠라레사제 에발 L171B의 5질량％ 디메틸술폭시드 용액 400질량부로, 각각 변경하여 실시하였다.
비교 제조예 2에서 얻어진 블로킹이 실시된 입자를 「입자 K」로 한다. 또한, 비교 제조예 2에서 얻어진 단백질 A 결합 입자를 「담체 H」로 한다.
(시험예 1 X선 회절)
제조예 1에서 얻은 입자 A를 물에 분산시켜서 슬러리를 얻고, 이 슬러리를 t-부틸알코올 용액으로 치환 후, 냉동고에서 30분 동결시키고, 진공 건조기에서 3시간 건조시켜, 건조 입자 분말을 얻었다. 이 건조 입자 분말을 유발과 막자를 사용하여 갈아 으깨서, X선 회절 장치 SmartLab(Rigaku사제)을 사용하여, 분말 X선 회절 패턴을 확인하였다. 제조예 1에서 제작한 입자 B 내지 C 및 담체 A에 대해서도 동일하게 하여 분말 X선 회절 패턴을 확인하였다. 이들의 분말 X선 회절 패턴을 도 1에 도시한다.
도 1에 도시한 바와 같이, 입자 A 내지 C 및 담체 A 모두, 비닐알코올의 결정 구조에서 유래되는 2θ=19.4° 부근에 피크를 갖는 것이 확인되었다(Macromolecules 2004, 37, 1921-1927 참조).
(시험예 2 분배 계수 Kav 및 배제 한계 분자량)
GE 헬스 케어사제 AKTAprime plus를 사용하여, 선 유속 300cm/hr에서의 하기의 각 마커 분자 용출 부피(mL)로부터, 제조예 1에서 얻은 입자 C의 분배 계수 Kav를 측정하였다. 또한, 측정한 Kav를 사용하여, 배제 한계 분자량을 측정하였다. 칼럼 용기는 용량 4mL(5mmφ×200mm 대표)이고, 마커 (1) 내지 (6)은 20mM 인산나트륨/150mM 염화나트륨 수용액(pH7.5)에 용해하여 사용하였다.
마커 (1): 폴리스티렌술폰산나트륨(시그마 알드리치사제, MW: 2,260kDa)
마커 (2): Carbonic Anhydrase(시그마 알드리치사제, Approximate Molecular Mass: 29kDa)
마커 (3): Albumin(시그마 알드리치사제, Approximate Molecular Mass: 66kDa)
마커 (4): β-amylase(시그마 알드리치사제, Approximate Molecular Mass: 200kDa)
마커 (5): Thyroglobulin(시그마 알드리치사제, Approximate Molecular Mass: 669kDa)
마커 (6): Human Immunoglobulin G(Equitech Bio사제 HGG-1000)
마커 (7): 0.5M 염화나트륨 수용액(와코 쥰야쿠 고교사제)
분배 계수 Kav는 다음 식으로 구하였다.
Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)
Ve는, 각 마커의 용출 부피이다.
Vo는, 폴리스티렌술폰산나트륨의 용출 부피이다.
Vt는, 칼럼 용기에 입자 C를 충전했을 때에, 입자의 충전층이 차지하는 부피(입자층 부피)이다.
각 마커의 분자량 대수 {ln(분자량)(MW)}을 횡축, Kav를 종축에 플롯하고, 직선성을 나타내는 부분으로부터 하기 식의 기울기와 절편을 구하였다. 구한 기울기와 절편으로부터, Kav가 0이 되는 분자량을 산출하고, 배제 한계 분자량으로 하였다.
Kav=(기울기)×ln(MW)+(절편)
제조예 2 내지 6 및 비교 제조예 2에서 제작한 입자 E 내지 I 및 K에 대해서도 동일하게 하여 Kav 및 배제 한계 분자량을 측정하였다. 시험예 2의 결과를 표 2에 나타내었다.
(시험예 3 공극률)
제조예 1에서 얻은 입자 C의 공극률을, AKTAprime plus(GE 헬스 케어사제)를 사용하여, 시험예 2와 동일한 칼럼에 충전하고, 이하의 식에서 산출하였다.
공극률[％]=(Vi-Vo)/(CV-Vo)×100
Vi는, 시험예 2에서 염화나트륨 수용액을 통액했을 때의 용출 부피이다.
Vo는, 시험예 2에서 기재한 대로이다.
CV는 칼럼 볼륨이고, 칼럼의 직경과 칼럼의 높이로부터 구한 값이다.
제조예 2 내지 6 및 비교 제조예 1 내지 2에서 제작한 입자 E 내지 K에 대해서도 동일하게 하여 공극률을 측정하였다. 시험예 3의 결과를 표 2에 나타내었다.
(시험예 4 부피 밀도)
제조예 1에서 얻은 입자 C를 물에 분산시켜서 슬러리를 얻고, 이 슬러리를 메스실린더에 투입하여, 투입량을 칭량하였다. 메스플라스크를 정치하고, 중력에 의해 슬러리를 완전히 침강시켜, 침강 부피을 구하고, 부피 밀도를 이하의 식에서 산출하였다.
부피 밀도=투입 슬러리량[g]×고형분 농도[질량％]/침강 부피[mL]
또한, 고형분 농도는 이하와 같이 구하였다. 상기 슬러리를 알루미늄 접시 상에 투입하고, 200℃의 핫 플레이트에서 가열함으로써, 수분을 완전히 제거하였다. 알루미늄 접시 상에 남은 고형분의 질량을 슬러리의 질량으로 나누고, 100을 곱하여, 고형분 농도[질량％]로 하였다.
제조예 2 내지 6 및 비교 제조예 1 내지 2에서 제작한 입자 E 내지 K에 대해서도 동일하게 하여 부피 밀도를 측정하였다. 시험예 4의 결과를 표 2에 나타내었다.
(시험예 5 비표면적)
제조예 1에서 얻은 입자 C의 비표면적을, 수은 포로시미터(시마즈 세이사쿠쇼사제 오토포어 IV9520)을 사용하여 10nm-5000nm의 측정 범위에서 산출하였다.
제조예 2 내지 6 및 비교 제조예 1 내지 2에서 제작한 입자 E 내지 K에 대해서도 동일하게 하여 비표면적을 측정하였다. 시험예 5의 결과를 표 2에 나타내었다.
(시험예 6 비특이 흡착성의 평가)
용량 1mL(5mmφ×50mm 길이)의 칼럼 용기에, 제조예 1에서 얻은 담체 A를 충전 높이 약 5cm로 충전하였다. 얻어진 칼럼을 GE 헬스 케어사제 AKTA Prime Plus에 접속하고, 20mM 인산나트륨 버퍼(pH7.5)로 평형화시켰다.
이어서, 모노클로날 항체 Trastuzumab를 함유하는 CHO 세포 배양 상청을 유속 0.2mL/분으로 칼럼에 통액하였다.
이어서, 20mM 인산나트륨 버퍼(pH7.5), 20mM 인산나트륨/1M 염화나트륨 버퍼(pH7.5) 및 20mM 인산나트륨 버퍼(pH7.5)를 각각 5칼럼 용량, 유속 0.2mL/분으로 칼럼에 순차 통액하였다.
그 후, 100mM 아세트산나트륨 버퍼(pH3.2)를, 유속 0.2mL/분으로 칼럼에 통액하고, 칼럼 내에 포착되어 있었던 모노클로날 항체를 용출시켜, 파장 280nm의 UV의 흡광도가 100mAu인 용출 프랙션을 회수하였다.
그리고, 분광 광도계를 사용하여, 회수한 프랙션 중에 함유되는 항체 농도(mg/mL)를 측정하였다. 또한, Cygnus Technologies사제 CHO HCP ELISA kit, 3G를 사용하여, 회수한 프랙션 중에 함유되는 Host Cell Protein(HCP)의 농도(ng/mL)를 측정하였다. 또한 HCP의 농도를 항체 농도로 나눔으로써, 단위 항체량당의 HCP량을 산출하고, 이하의 평가 기준에 따라 비특이 흡착성을 평가하였다.
·비특이 흡착성 평가 기준
AA: 2000ppm/IgG 이하
A: 2000ppm/IgG 초과 3000ppm/IgG 이하
B: 3000ppm/IgG 초과 4000ppm/IgG 이하
C: 4000ppm/IgG 초과
제조예 2 내지 6 및 비교 제조예 1 내지 2에서 제작한 담체 B 내지 H에 대해서도 동일하게 하여, HCP를 정량하고, 비특이 흡착성을 평가하였다. 시험예 6의 결과를 표 3에 나타내었다.
(시험예 7 동적 결합 용량(Dynamic Binding Capacity(DBC)의 측정)
GE 헬스 케어사제 크로마토그래피 장치 AKTA prime plus를 사용하여, 선 유속 300cm/hr에서의 단백질(인간 폴리클로날 IgG 항체, Equitech Bio사제 HGG-1000)에 대한 제조예 1에서 얻은 담체 A의 DBC를 측정하였다. 칼럼 용기로서 용량 4mL(5mmφ×200mm 대표)의 칼럼 용기를, 단백질로서 20mM 인산나트륨/150mM 염화나트륨 수용액(pH7.5)에 5.3mg/mL의 농도로 단백질을 용해한 것을, 각각 사용하여, 흡광도 모니터에서 용출액 중의 인간 폴리클로날 IgG의 농도가 10％ 브레이크스루(파과)했을 때의 단백질 포착량과 칼럼 충전 부피로부터 DBC를 산출하고, 이하의 평가 기준에 따라 DBC를 평가하였다.
·DBC 평가 기준
AA: 55mg/mL 이상 75mg/mL 미만
A: 45mg/mL 이상 55mg/mL 미만
B: 25mg/mL 이상 45mg/mL 미만
C: 25mg/mL 미만
제조예 2 내지 6 및 비교 제조예 1 내지 2에서 제작한 담체 B 내지 H에 대해서도 동일하게 하여 DBC를 측정하였다. 시험예 7의 결과를 표 3에 나타내었다.
(시험예 8 기계적 강도의 평가(측정 가능 선 유속))
GE 헬스 케어사제 AKTA Avant를 사용하여, 16mmφ×150mm의 칼럼 용기에 선 유속 300cm/hr으로 초순수를 통액하고, 제조예 1에서 얻은 담체 A를 충전 높이가 약 10cm가 되도록 충전하였다. 1분간마다 선 유속을 100cm/hr씩 상승시켜, 칼럼에 가하는 압력이 2MPa를 초과하지 않는 최대의 유속을 측정 가능 선 유속으로서 측정하였다.
·기계적 강도 평가 기준
A: 측정 가능 선 유속이 2000cm/hr 이상
B: 측정 가능 선 유속이 1000cm/hr 이상 2000cm/hr 미만
C: 측정 가능 선 유속이 1000cm/hr 미만
제조예 2 내지 6 및 비교 제조예 1 내지 2에서 제작한 담체 B 내지 H에 대해서도 동일하게 하여 측정 가능 선 유속을 측정하였다. 시험예 8의 결과를 표 3에 나타내었다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
표 1 내지 3에 나타내는 대로, 메타크릴레이트계 중합체를 원료 중합체로 했을 경우(비교 제조예 1)는 비특이 흡착량이 많고, 또한 기계적 강도가 떨어지는 것이 되었다.
또한, O/W 에멀션을 형성시킴으로써 공극률이 62％의 다공질 입자를 제조하고, 이것을 사용한 경우(비교 제조예 2)는, 동적 결합 용량이 작았다.
이에 비해, 비닐알코올 중합체 및 에틸렌-비닐알코올 공중합체로부터 선택되는 1종 이상의 중합체에서 유래되는 공극률 75％ 이상의 다공질 입자를 사용한 경우(제조예 1 내지 6)는, 비특이 흡착량이 적고, 동적 결합 용량이 크고, 우수한 기계적 강도를 나타내었다. 특히, 에틸렌-비닐알코올 공중합체를 수계 용매에 용해시켜서 중합체 용액을 제조하고, 이 중합체 용액을 비수계 용매에 분산시켜 W/O 에멀션을 형성시켜 얻은 다공질 입자를 사용한 경우(제조예 1 내지 5)는, 동적 결합 용량이 특히 커졌다.

Claims (15)

  1. 이하의 공정 1 및 2를 포함하는, 다공질 입자의 제조 방법.
    (공정 1) 비닐알코올 중합체 및 에틸렌-비닐알코올 공중합체로부터 선택되는 1종 이상의 중합체를 수계 용매에 용해시켜, 중합체 용액을 제조하는 공정
    (공정 2) 상기 중합체 용액을 비수계 용매에 분산시켜 W/O 에멀션을 형성하는 공정
  2. 제1항에 있어서, 상기 에틸렌-비닐알코올 공중합체로서, 하기 식 (1)로 표시되는 에틸렌 유래의 반복 단위를, 공중합체 중의 전체 반복 단위에 대하여, 0몰％ 초과 50몰％ 이하 갖는 에틸렌-비닐알코올 공중합체를 사용하는, 제조 방법.
    Figure pct00008
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 이하의 공정 3을 추가로 포함하는, 제조 방법.
    (공정 3) 상기 W/O 에멀션을 냉각하여, 다공질 입자를 형성시키는 공정
  4. 제3항에 있어서, 이하의 공정 4를 추가로 포함하는, 제조 방법.
    (공정 4) 공정 3에서 형성된 다공질 입자를 화학 가교하는 공정
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수계 용매가, 술폭시드계 용매 중 물과 혼화하는 것, 폴리올계 용매 중 물과 혼화하는 것, 알코올계 용매 중 물과 혼화하는 것 및 아미드계 용매 중 물과 혼화하는 것으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상과 물을 포함하는 혼합 용매, 또는 물인, 제조 방법.
  6. 비닐알코올 중합체 및 에틸렌-비닐알코올 공중합체로부터 선택되는 1종 이상의 중합체에서 유래되는 다공질 입자이며, 공극률이 75％ 이상인, 다공질 입자.
  7. 제6항에 있어서, 상기 에틸렌-비닐알코올 공중합체가, 하기 식 (1)로 표시되는 에틸렌 유래의 반복 단위를, 공중합체 중의 전체 반복 단위에 대하여, 0몰％ 초과 50몰％ 이하 갖는 에틸렌-비닐알코올 공중합체인, 다공질 입자.
    Figure pct00009
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 화학 가교 구조를 갖는, 다공질 입자.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 식 (2)로 표시되는 비닐알코올 유래의 반복 단위를 갖는, 다공질 입자.
    Figure pct00010
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 다공질 입자에 리간드가 결합된, 담체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 리간드가, 이뮤노글로불린 결합 도메인을 포함하는 단백질인, 담체.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 표적 물질의 분리용인, 담체.
  13. 제10항 또는 제11항에 있어서, 체액 관류 흡착용인, 담체.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 담체가 칼럼 용기에 충전된, 칼럼.
  15. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 담체를 사용하는 것을 특징으로 하는, 표적 물질의 분리 방법.
KR1020187014116A 2015-11-24 2016-11-24 다공질 입자의 제조 방법, 다공질 입자, 담체, 칼럼 및 표적 물질의 분리 방법 KR102666108B1 (ko)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210027153A (ko) * 2019-08-29 2021-03-10 도요타 지도샤（주） 에틸렌-비닐알코올 공중합체의 다공질체의 제조 방법

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20230046628A1 (en) * 2019-11-22 2023-02-16 Stichting Voor De Technische Wetenschappen Macromolecular compositions for binding small molecules
CN117177812A (zh) * 2021-03-26 2023-12-05 东丽株式会社 多孔吸附材料和使用其的生物药品精制用分离柱、以及生物药品的制造方法
JPWO2023058409A1 (ko) 2021-10-05 2023-04-13
CN113984726B (zh) * 2021-10-20 2024-02-02 上海大学 一种氨基苯硼酸功能化磁珠/乙二醛修饰dna检测汞离子的方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0256293A2 (en) * 1986-07-09 1988-02-24 Mitsubishi Kasei Corporation Process for producing porous cross-linked polyvinyl alcohol particles
JPH028230A (ja) * 1988-06-27 1990-01-11 Dainichiseika Color & Chem Mfg Co Ltd 樹脂粒子及びその製造方法
WO1998004616A1 (en) * 1996-07-31 1998-02-05 Kanebo Limited Porous spherical polyvinyl acetal particles, process for producing the same, and microbial carriers
JPH11510836A (ja) * 1995-07-31 1999-09-21 ミューラー−シュルテ，デトレフ ポリビニルアルコールを主成分とする磁性ポリマー粒子及びその製造方法及び使用方法
JP2010233825A (ja) * 2009-03-31 2010-10-21 Asahi Kasei Kuraray Medical Co Ltd 顆粒球及び単球の選択的除去材
JP2011224360A (ja) 2010-03-31 2011-11-10 Asahi Kasei Kuraray Medical Co Ltd 多孔質粒子、多孔質粒子の製造方法及び担体
JP2012214550A (ja) 2011-03-31 2012-11-08 Asahi Kasei Medical Co Ltd 多孔質粒子、多孔質粒子の製造方法及び担体

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0255714A (ja) * 1988-08-19 1990-02-26 Kuraray Co Ltd 高重合度ポリビニルアルコール系重合体の多孔質粉体及びその製造方法
DE3900945A1 (de) * 1989-01-14 1990-07-19 Mueller Schulte Detlef Dr Verfahren zur herstellung perlfoermiger polymertraeger auf der basis von pval
JP2997559B2 (ja) * 1991-04-03 2000-01-11 株式会社クラレ 抗菌性エチレン−ビニルアルコール系共重合体繊維、糸およびその製造方法
JP3805427B2 (ja) * 1996-05-31 2006-08-02 株式会社クラレ ポリビニルアルコール粉末
AU6366799A (en) * 1998-12-24 2000-07-31 Sumitomo Bakelite Company Limited Container for immunologic assay
US7462366B2 (en) 2002-03-29 2008-12-09 Boston Scientific Scimed, Inc. Drug delivery particle
GB2399084B (en) * 2002-07-30 2007-01-31 Univ Liverpool Porous beads and method of production thereof
EP1534351B1 (en) * 2002-08-09 2006-10-04 Boston Scientific Limited Embolization
JP2005171040A (ja) 2003-12-10 2005-06-30 Kuraray Co Ltd ポリビニルアルコール系含水ゲルの製造方法
US7507439B2 (en) * 2004-05-06 2009-03-24 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Use and preparation of crosslinked polymer particles for inkjet recording materials
CN104755543B (zh) * 2012-10-30 2018-02-02 可乐丽股份有限公司 多孔接枝共聚物粒子、其制造方法以及使用其的吸附材料
WO2014192607A1 (ja) * 2013-05-31 2014-12-04 東レ株式会社 エチレン－ビニルアルコール系共重合体微粒子およびそれを含有する分散液と樹脂組成物並びにその微粒子の製造方法
WO2015080174A1 (ja) 2013-11-27 2015-06-04 Jsr株式会社 固相担体、固相担体の製造方法、アフィニティ精製用担体、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤の製造方法、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤、クロマトグラフィーカラムおよび精製方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0256293A2 (en) * 1986-07-09 1988-02-24 Mitsubishi Kasei Corporation Process for producing porous cross-linked polyvinyl alcohol particles
JPH028230A (ja) * 1988-06-27 1990-01-11 Dainichiseika Color & Chem Mfg Co Ltd 樹脂粒子及びその製造方法
JPH11510836A (ja) * 1995-07-31 1999-09-21 ミューラー−シュルテ，デトレフ ポリビニルアルコールを主成分とする磁性ポリマー粒子及びその製造方法及び使用方法
WO1998004616A1 (en) * 1996-07-31 1998-02-05 Kanebo Limited Porous spherical polyvinyl acetal particles, process for producing the same, and microbial carriers
JP2010233825A (ja) * 2009-03-31 2010-10-21 Asahi Kasei Kuraray Medical Co Ltd 顆粒球及び単球の選択的除去材
JP2011224360A (ja) 2010-03-31 2011-11-10 Asahi Kasei Kuraray Medical Co Ltd 多孔質粒子、多孔質粒子の製造方法及び担体
JP2012214550A (ja) 2011-03-31 2012-11-08 Asahi Kasei Medical Co Ltd 多孔質粒子、多孔質粒子の製造方法及び担体

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210027153A (ko) * 2019-08-29 2021-03-10 도요타 지도샤（주） 에틸렌-비닐알코올 공중합체의 다공질체의 제조 방법

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Publication number Publication date
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