CN108699256B - 多孔粒子的制造方法、多孔粒子、担载体、柱和靶物质的分离方法 - Google Patents

多孔粒子的制造方法、多孔粒子、担载体、柱和靶物质的分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供尽管为合成高分子系粒子也不易发生非特异性吸附且机械强度高、结合配体时的动态结合载量大的多孔粒子及其制造方法。该多孔粒子的制造方法包括以下的工序1和2。(工序1)使选自乙烯醇聚合物和乙烯‑乙烯醇共聚物中的1种以上的聚合物溶解于水系溶剂而制备聚合物溶液的工序；(工序2)使上述聚合物溶液分散于非水系溶剂而形成W/O乳液的工序。

Description

多孔粒子的制造方法、多孔粒子、担载体、柱和靶物质的分离 方法
技术领域
本发明涉及多孔粒子的制造方法、多孔粒子、担载体、柱和靶物质的分离方法。
背景技术
从血清、血浆、细胞培养液、尿等生物样本中分离蛋白质、抗体等靶物质的技术存在困难，寻求一种可有效地分离的技术。
例如，出于从生物样本选择性分离靶物质的目的，一直使用将由合成高分子构成的有机系多孔粒子作为支承体并对其结合配体而成的担载体。
作为将由合成高分子构成的有机系多孔粒子作为支承体的担载体，开发了使用聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酸酯凝胶、聚苯乙烯、乙烯-乙烯醇共聚物等的担载体(专利文献1和2)，但合成高分子系的多孔粒子具有容易发生非特异性吸附这样的缺点。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2011-224360号公报
专利文献2:日本特开2012-214550号公报
发明内容
特别是既可抑制非特异性吸附又能满足结合配体时的动态结合载量并不容易，此外还要具备充分的机械强度，因此特别困难。
本发明想要解决的课题在于提供一种尽管为合成高分子系的粒子也不易发生非特异性吸附且机械强度高、结合配体时的动态结合载量大的多孔粒子及其制造方法。
因此，本发明人等经过深入研究，结果发现通过如下的方法进行制造，能够得到尽管为合成高分子系的粒子也不易发生非特异性吸附且机械强度高、结合配体时的动态结合载量大的多孔粒子，从而完成了本发明，该方法包括：(工序1)使选自乙烯醇聚合物和乙烯-乙烯醇共聚物中的1种以上的聚合物溶解于水系溶剂而制备聚合物溶液的工序；和(工序2)使上述聚合物溶液分散于非水系溶剂而形成W/O乳液的工序。
另外，发现来源于选自乙烯醇聚合物和乙烯-乙烯醇共聚物中的1种以上的聚合物且空隙率为75％以上的多孔粒子尽管为合成高分子系的粒子也不易发生非特异性吸附且机械强度高，结合配体时的动态结合载量大，从而完成了本发明。
即，本发明提供以下的〔1〕～〔15〕。
〔1〕一种多孔粒子的制造方法，包括以下的工序1和2(以下，也称为“本发明的多孔粒子的制造方法”)。
(工序1)使选自乙烯醇聚合物和乙烯-乙烯醇共聚物中的1种以上的聚合物溶解于水系溶剂而制备聚合物溶液的工序
(工序2)使上述聚合物溶液分散于非水系溶剂而形成W/O乳液的工序
〔2〕根据上述〔1〕所述的制造方法，其中，作为上述乙烯-乙烯醇共聚物，使用相对于共聚物中的全部重复单元具有大于0摩尔％且为50摩尔％以下的下述式(1)表示的来自乙烯的重复单元(以下，也称为“重复单元(1)”)的乙烯-乙烯醇共聚物。
Figure BDA0001669166470000021
〔3〕根据上述〔1〕或〔2〕所述的制造方法，其中，还包括以下的工序3。
(工序3)将上述W/O乳液冷却而形成多孔粒子的工序
〔4〕根据上述〔3〕所述的制造方法，其中，还包括以下的工序4。
(工序4)将工序3中形成的多孔粒子进行化学交联的工序
〔5〕根据上述〔1〕～〔4〕中任一项所述的制造方法，其中，上述水系溶剂为混合溶剂或者水，所述混合溶剂含有从亚砜系溶剂中的与水混合的溶剂、多元醇系溶剂中的与水混合的溶剂、醇系溶剂中的与水混合的溶剂和酰胺系溶剂中的与水混合的溶剂中选择的1种或2种以上以及水。
〔6〕一种多孔粒子，是来源于选自乙烯醇聚合物和乙烯-乙烯醇共聚物中的1种以上的聚合物的多孔粒子，其空隙率为75％以上(以下，也称为“本发明的多孔粒子”)。
〔7〕根据上述〔6〕所述的多孔粒子，其中，上述乙烯-乙烯醇共聚物为相对于共聚物中的全部重复单元具有大于0摩尔％且为50摩尔％以下重复单元(1)的乙烯-乙烯醇共聚物。
〔8〕根据上述〔6〕或〔7〕所述的多孔粒子，其中，具有化学交联结构。
〔9〕根据上述〔6〕～〔8〕中任一项所述的多孔粒子，其中，具有下述式(2)表示的来自乙烯醇的重复单元(以下，也称为“重复单元(2)”)。
Figure BDA0001669166470000031
〔10〕一种担载体(以下，也称为“本发明的担载体”)，是使配体结合于上述〔6〕～〔9〕中任一项所述的多孔粒子而成的。
〔11〕根据上述〔10〕所述的担载体，其中，上述配体为含有免疫球蛋白结合结构域的蛋白质。
〔12〕根据上述〔10〕或〔11〕所述的担载体，其用于分离靶物质。
〔13〕根据上述〔10〕或〔11〕所述的担载体，其用于体液灌流吸附。
〔14〕一种柱(以下，也称为“本发明的柱”)，是将上述〔10〕～〔13〕中任一项所述的担载体填充于柱容器而成的。
〔15〕一种靶物质的分离方法(以下，也称为“本发明的靶物质的分离方法”)，其特征在于，使用上述〔10〕～〔13〕中任一项所述的担载体。
根据本发明的多孔粒子的制造方法，能够简便且容易地制造尽管为合成高分子系的粒子也不易发生非特异性吸附且机械强度高、结合配体时的动态结合载量大的多孔粒子。
本发明的多孔粒子尽管为合成高分子系的粒子也不易发生非特异性吸附且机械强度高，结合配体时的动态结合载量大。
附图说明
图1是表示制备例1中得到的粒子A～C和担载体A的粉末X射线衍射的峰的图。
具体实施方式
〔多孔粒子〕
本发明的多孔粒子是来源于选自乙烯醇聚合物和乙烯-乙烯醇共聚物中的1种以上的聚合物且空隙率为75％以上的多孔粒子。
(空隙率)
本发明的多孔粒子的空隙率为75％以上。通过使空隙率为75％以上，能够明显增大结合配体时的动态结合载量。
作为空隙率，从结合配体时的动态结合载量和靶物质捕捉性能的观点考虑，优选为80％以上，更优选为85％以上，特别优选为90％以上，另外，从机械强度的观点考虑，优选小于100％，更优选为95％以下。特别是通过使空隙率为80％以上，结合配体时的动态结合载量被明显改善。
空隙率可以通过将多孔粒子填充于柱容器并流入基准物质而算出。具体而言与实施例同样地进行测定即可。
从机械强度、结合配体时的动态结合载量的观点考虑，作为本发明的多孔粒子，优选具有晶体结构。晶体结构的有无可以通过X射线衍射等来确认。另外，本说明书中，多孔粒子是指在表面具有多个细孔(孔)的粒子。
此处，对本发明中使用的乙烯醇聚合物、乙烯-乙烯醇共聚物进行详细说明。
上述乙烯醇聚合物是指由下述式(2)表示的来自乙烯醇的重复单元构成的聚合物。
Figure BDA0001669166470000041
另外，上述乙烯-乙烯醇共聚物是指由下述式(1)表示的来自乙烯的重复单元和重复单元(2)构成的聚合物。应予说明，乙烯-乙烯醇共聚物可以为无规共聚物、嵌段共聚物、接枝共聚物等中的任一种共聚物，也可以为它们的混合物。
Figure BDA0001669166470000051
在本发明所使用的乙烯-乙烯醇共聚物中，相对于乙烯-乙烯醇共聚物中的全部重复单元，重复单元(1)的含量大于0摩尔％，从结合配体时的动态结合载量的观点考虑，相对于乙烯-乙烯醇共聚物中的全部重复单元，重复单元(1)的含量优选大于1摩尔％，更优选大于5摩尔％，进一步优选为10摩尔％以上，特别优选为15摩尔％以上，另外，从非特异性吸附量、排除极限分子量、结合配体时的动态结合载量的观点考虑，重复单元(1)的含量优选为50摩尔％以下，更优选为45摩尔％以下，进一步优选为40摩尔％以下，进一步优选为35摩尔％以下，特别优选为30摩尔％以下。
另外，乙烯-乙烯醇共聚物中，除重复单元(1)以外，还具有重复单元(2)，重复单元(2)的含量为除重复单元(1)以外的余量。
重复单元(1)、(2)的含量例如可以通过对乙烯-乙烯醇共聚物进行NMR测定而算出。
(皂化度)
从非特异性吸附量的观点考虑，本发明中使用的乙烯醇聚合物和乙烯-乙烯醇共聚物的皂化度优选为90摩尔％以上，更优选为92摩尔％以上，进一步优选为95摩尔％以上，特别优选为98摩尔％以上。应予说明，上限只要为100摩尔％以下即可，优选为99.9摩尔％以下。
本说明书中，皂化度可以基于JIS K6726来测定。
(聚合度)
从机械强度的观点考虑，本发明中使用的乙烯醇聚合物和乙烯-乙烯醇共聚物的聚合度优选为50以上，更优选为100以上，另外，从溶解于水系溶剂而制备聚合物溶液时能够抑制溶液的粘性，使粒子化变得容易的观点考虑，优选小于1000，更优选小于500。
本说明书中聚合度是指粘度平均聚合度，可以基于JIS K6726算出。
作为本发明的多孔粒子的原料，除乙烯醇聚合物、乙烯-乙烯醇共聚物以外，还可以组合使用其它的聚合物(聚乙烯吡咯烷酮等)或其单体。相对于多孔粒子所含的全部重复单元，来源于选自乙烯醇聚合物和乙烯-乙烯醇共聚物中的1种以上的聚合物的聚合物部分的含量优选为85～100质量％，更优选为90～100质量％，进一步优选为95～100质量％，特别优选为99～100质量％。
作为多孔粒子的原料聚合物，从容易形成晶体结构且提高机械强度的观点、成为适合于结合配体而用作担载体的排除极限分子量的观点、改善结合配体时的动态结合载量和靶物质捕捉性能的观点等考虑，特别优选由重复单元(1)和(2)构成的聚合物，也就是乙烯-乙烯醇共聚物。
乙烯醇聚合物、乙烯-乙烯醇共聚物可以为市售品，也可以为基于常规方法合成的物质。乙烯醇聚合物和乙烯-乙烯醇共聚物一般而言是通过使乙酸乙烯酯单体聚合后，或者使乙酸乙烯酯单体与乙烯共聚后，进行皂化而制造的。
(化学交联结构)
作为本发明的多孔粒子，优选具有化学交联结构。由此，机械强度、耐压性提高，例如，结合配体而使用时，能够在更高流速下使用。
作为化学交联结构，优选多孔粒子所含的2个以上的重复单元(2)中的羟基的残基进行化学交联而得的交联结构，更优选多孔粒子所含的2个以上的重复单元(2)中的羟基的残基通过单键或者2价以上的连接基团进行化学交联而得的交联结构。此时，多孔粒子可以含有重复单元(2)、和重复单元(2)经化学交联而成的结构这两者(在多孔粒子所含的重复单元(2)中，可以一部分进行化学交联，也可以全部进行化学交联)。
作为上述单键或者2价以上的连接基团，可举出来源于交联剂的单键或者2价以上的连接基团。另外，作为2价以上的连接基团，优选为2～4价的连接基团，从机械强度等观点考虑，特别优选为4价的连接基团。
作为交联剂，可举出醛化合物、环氧化合物、N-羟甲基化合物、二羧酸、卤素化合物、异氰酸酯化合物等，优选醛化合物、环氧化合物、N-羟甲基化合物，从容易控制反应的观点考虑，优选醛化合物。
作为醛化合物的具体例，可举出甲醛、乙醛、丙醛、巴豆醛、苯甲醛等单醛化合物；乙二醛、丙二醛、丁二醛、己二醛、柠檬醛(Citraldehyde)、邻苯二甲醛、间苯二甲醛、马来醛、戊二醛、对苯二甲醛等二醛化合物；双醛淀粉、聚丙烯醛等多醛化合物等。这些中，从机械强度等观点考虑，优选为二醛化合物，从安全性高的观点考虑，特别优选为戊二醛。
作为环氧化合物的具体例，可举出乙二醇二缩水甘油醚、新戊二醇二缩水甘油醚、间苯二酚二缩水甘油醚、氢化双酚A二缩水甘油醚、丙三醇二缩水甘油醚、三羟甲基丙烷二缩水甘油醚、二乙二醇二缩水甘油醚、丙二醇二缩水甘油醚等二官能性双环氧化物类；丙三醇多缩水甘油醚、三羟甲基丙烷多缩水甘油醚、季戊四醇多缩水甘油醚、二丙三醇多缩水甘油醚、聚丙三醇多缩水甘油醚、山梨糖醇多缩水甘油醚等三官能以上的多环氧化物类；环氧氯丙烷、环氧溴丙烷、环氧氟丙烷、环氧碘丙烷等环氧卤丙烷类；缩水甘油等。
作为N-羟甲基化合物的具体例，可举出二羟甲基脲、二羟甲基亚乙基脲、二羟甲基亚丙基脲、四氢化-3,5-双(羟甲基)-4H-1,3,5-氧二氮杂环己烷-4-酮(dimethylol uron)、二羟甲基三嗪酮、二羟甲基-4-甲氧基-5,5-二甲基亚丙基脲、二羟甲基二羟基亚乙基脲、二羟甲基烷基氨基甲酸酯、甲基化二羟甲基二甲氧基亚乙基脲、1,3-二甲基-4,5-二羟基亚乙基脲、三羟甲基三聚氰胺、六羟甲基三聚氰胺、甲基化三羟甲基三聚氰胺、甲基化六羟甲基三聚氰胺等。
(反应性官能团)
作为本发明的多孔粒子，优选具有可与配体结合的反应性官能团。该方式的多孔粒子因仅结合配体而可用作担载体，作为支承体有用。
作为可与配体结合的反应性官能团，优选羧基、甲酰基、氨基、马来酰亚胺基、活性酯基、环氧基。这些中，从在温和的条件下进行与配体的反应的观点考虑，特别优选为环氧基。
(分配系数Kav、排除极限分子量)
从结合配体时的动态结合载量的观点考虑，本发明的多孔粒子的Kav优选为0.2以上，更优选为0.4以上，进一步优选为0.5以上，特别优选为0.6以上，另外，从非特异性吸附量、结合配体时的动态结合载量的观点考虑，优选为0.9以下，更优选为0.8以下，特别优选为0.75以下。
从非特异性吸附量、结合配体时的动态结合载量的观点考虑，本发明的多孔粒子的排除极限分子量优选为500KDa以上，更优选为1000KDa以上，进一步优选为10000KDa以上，进一步优选为50000KDa以上，进一步优选为75000KDa以上，特别优选为10万KDa以上，另外，从非特异性吸附量、结合配体时的靶物质捕捉性能的观点考虑，优选为100万KDa以下，更优选为75万KDa以下，特别优选为50万KDa以下。
分配系数Kav、排除极限分子量是指通过将多孔粒子填充于柱容器并流入基准物质而算出的Kav、排除极限分子量，具体而言与实施例同样地进行测定即可。
(堆积密度)
从机械强度和配体结合量等观点考虑，本发明的多孔粒子的堆积密度优选为0.005g/mL以上，更优选为0.01g/mL以上，特别优选为0.05g/mL以上，另外，从结合配体时的动态结合载量和靶物质捕捉性能的观点考虑，优选为1g/mL以下，更优选为0.5g/mL以下，进一步优选为0.3g/mL以下，特别优选为0.14g/mL以下。特别是通过使堆积密度为0.14g/mL以下，可明显改善结合配体时的动态结合载量。
堆积密度是指多孔粒子的填充层的单位体积的重量，具体而言与实施例同样地进行测定即可。
(比表面积)
从非特异性吸附量、机械强度、结合配体时的动态结合载量的观点考虑，本发明的多孔粒子的比表面积优选为50m2/g以上，更优选为70m2/g以上，进一步优选为80m2/g以上，特别优选为90m2/g以上，另外，从机械强度的观点考虑，优选为150m2/g以下。
本发明中的比表面积是指由水银孔率测定计测得的细孔直径10～5000nm的细孔所具有表面积除以多孔粒子的干燥质量而得的值。
(平均粒径)
作为本发明的多孔粒子的平均粒径，优选为10～1000μm。通过使平均粒径为10μm以上，从而在结合配体而用于靶物质的分离时可抑制背压的上升，即便在高流速下也容易利用。另一方面，通过使粒径为1000μm以下，从而在靶物质的分离等中，可有效地利用到粒子内部的细孔。
平均粒径是指用基于ISO 13320和JIS Z 8825-1的激光衍射法测定的体积平均粒径。具体而言，是指利用激光散射衍射法粒度分布测定装置(例如，LS 13 320(BeckmanCoulter株式会社等)测定粒径分布，使用Fluid R.I.Real 1.333、Sample R.I.Real1.54Imaginary 0等作为光学模型，测定体积基准的粒度分布而求出的平均粒径。
本发明的多孔粒子可以为导入有上述化学交联结构、反应性官能团的多孔粒子，在这种情况下，作为上述多孔粒子，可以具有重复单元(2)。
而且，本发明的多孔粒子尽管为合成高分子系的粒子也在减少对宿主细胞所含的HCP(Host Cell Protein)、DNA等生物体来源杂质等的吸附量的方面优异，具有优异的防污性。另外，机械强度高，结合配体时的靶物质的动态结合载量大。
〔担载体〕
本发明的担载体是使配体结合于本发明的多孔粒子而成的。应予说明，本发明的担载体为粒状。作为本发明的担载体，从非特异性吸附量、机械强度、动态结合载量的观点考虑，优选具有晶体结构。晶体结构的有无可以通过X射线衍射等来确认。
另外，配体向多孔粒子的结合可以为直接的结合，也可以为介由接头(linker)等的间接结合。
本发明的担载体除使用本发明的多孔粒子以外，可以通过基于共价键法将配体向多孔粒子结合等的常规方法来制造。作为结合配体的方法，从工序简便的方面考虑，优选利用上述的反应性官能团直接作为与配体的结合部位的方法。除此之外，反应性官能团为环氧基时，可举出以下方法：将由多孔粒子所含的环氧基开环而生成的醇性羟基用对甲苯磺酰基等活化后结合配体的方法；从多孔粒子所含的环氧基、或者由该环氧基的开环而生成的开环环氧基进一步延伸接头后，介由该接头结合配体的方法。
配体的结合条件可以根据反应性官能团的含量、配体的种类适当地选择。配体为蛋白质时，蛋白质的N末端的氨基、蛋白质所含的赖氨酸残基的ε-氨基、半胱氨酸残基的巯基等可成为与环氧基等反应性官能团的反应点。结合蛋白质时，例如，可以使用接近蛋白质的等电点的缓冲液类的水溶液，根据需要添加氯化钠、硫酸钠等盐，一边将蛋白质与多孔粒子混合，一边在0～40℃下反应1～48小时，由此使反应性官能团与蛋白质结合。
应予说明，在结合配体后，可以对残留于担载体的反应性官能团进行亲水化处理(封端处理)。对该反应性官能团的处理可以根据公知的方法进行，作为具体的方法，可举出使巯基乙醇、硫甘油等含有巯基的醇与残留于担载体的反应性官能团反应的方法等。
(配体)
作为与本发明的多孔粒子结合的配体，只要为对靶物质具有适当的亲和性的配体，其种类没有特别限定。作为配体的具体例，可以使用蛋白A、蛋白G、蛋白L、Fc结合蛋白、亲和素、链霉亲和素、凝集素、它们的功能性变异体等蛋白质；氨基酸；胰岛素等肽；单克隆抗体等抗体；抗原；酶；激素；DNA、RNA等核酸；核苷酸；核苷；肝素、Lex、神经节苷脂等糖或多糖；亚氨基二乙酸、合成色素、2-氨基苯硼酸、4-氨基苯甲脒、谷胱甘肽、生物素、其衍生物这样的低分子化合物。上述例示的配体可以使用其整体，但也可以使用经过酶处理等而得到的其片段。另外，也可以为人工合成的肽、肽衍生物、重组体。
作为适合免疫球蛋白的分离或纯化的配体，可举出含有免疫球蛋白结合结构域的蛋白质。作为免疫球蛋白结合结构域，优选为选自蛋白A的免疫球蛋白结合结构域、蛋白G的免疫球蛋白结合结构域和蛋白L的免疫球蛋白结合结构域中的1种或2种以上的免疫球蛋白结合结构域。应予说明，配体可以具有多个相同或不同种类的免疫球蛋白结合结构域。
在这样的配体中，优选选自蛋白A、蛋白G、蛋白L和它们的功能性变异体中的1种或者2种以上，更优选选自蛋白A、蛋白G和蛋白L中的1种或者2种以上，特别优选为蛋白A。
配体的结合量根据配体的种类、靶物质的种类等适当地调节，结合像蛋白A这样的含有免疫球蛋白结合结构域的蛋白质作为配体的情况下，每1g粒子，配体的结合量优选为10～200mg，更优选为25～100mg。结合含有免疫球蛋白结合结构域的蛋白质作为配体的情况下，如果每1g粒子的配体的结合量为10mg以上，则动态结合载量优异。另一方面，如果为200mg以下，则为了使结合的抗体等解离而使用的解离液的量成为适当的量。
而且，本发明的担载体在减少非特异性吸附量方面优异。另外，机械强度高，靶物质的动态结合载量大。
本发明的担载体作为靶物质分离用的担载体有用。另外，本发明的担载体作为体液灌流吸附用的担载体有用。特别是作为亲和性型担载体有用。
作为靶物质，例如，可举出抗原；单克隆抗体、多克隆抗体等抗体；细胞(正常细胞、和大肠癌细胞、血液循环癌细胞等癌细胞)；DNA、RNA等核酸；蛋白质、肽、氨基酸、糖、多糖、脂质、维生素等生物体相关物质，也可以是成为药物靶点的药物、生物素等低分子化合物。应予说明，靶物质可以为被荧光物质等标记化的物质。
〔柱〕
本发明的柱是将本发明的担载体填充于柱容器而成的。
本发明的柱可用于靶物质的检测或分离、体液灌流吸附。特别是适合用于亲和色谱法，用作全血灌流型体外循环用柱等。
应予说明，作为体液，除全血、血清、血浆、血液成分、各种血细胞、血小板等血液组成成分以外，还可举出尿、精液、母乳、汗、间质液、间质性淋巴液、骨髄液、组织液、唾液、胃液、关节液、胸腔积液、胆汁、腹水、羊水等。
〔靶物质的分离方法〕
本发明的靶物质的分离方法的特征在于，使用本发明的担载体。
本发明的靶物质的分离方法除使用本发明的担载体以外，可以根据常规方法来进行。例如，可举出包括以下工序的方法：将本发明的担载体和含有靶物质的样本混合等使其接触的工序(接触工序)；和将捕捉到靶物质的担载体从样本分离的工序(分离工序)。应予说明，在该分离工序之后，可以包括使配体与靶物质解离的工序。
应予说明，样本只要为含有靶物质的样本或者可能含有靶物质的样本即可。例如，可举出体液、细菌液、细胞培养的培养基、细胞培养上清液、组织细胞的粉碎液、含有靶物质的缓冲溶液等。
于是，根据本发明的分离方法，可选择性且有效地分离靶物质。
〔多孔粒子的制造方法〕
作为制造本发明的多孔粒子的方法，例如，可举出包括以下的工序1和2的方法。
(工序1)使选自乙烯醇聚合物和乙烯-乙烯醇共聚物中的1种以上的聚合物溶解于水系溶剂而制备聚合物溶液的工序
(工序2)使上述聚合物溶液分散于非水系溶剂而形成W/O乳液的工序
(工序1)
工序1是使选自乙烯醇聚合物和乙烯-乙烯醇共聚物中的1种以上的聚合物(将选自乙烯醇聚合物和乙烯-乙烯醇共聚物中的1种以上的聚合物也统称为“原料聚合物α”)溶解于水系溶剂而制备聚合物溶液的工序。作为乙烯醇聚合物、乙烯-乙烯醇共聚物，可以使用上述说明的衍生出本发明多孔粒子的化合物。应予说明，在工序1中，作为本发明的多孔粒子的原料，除乙烯醇聚合物、乙烯-乙烯醇共聚物以外，还可以组合使用其它的聚合物(聚乙烯吡咯烷酮等)、其单体。相对于对多孔粒子赋予重复单元的化合物总量，选自乙烯醇聚合物和乙烯-乙烯醇共聚物中的1种以上的聚合物的使用量优选为85～100质量％，更优选为90～100质量％，进一步优选为95～100质量％，特别优选为99～100质量％。
作为工序1，优选使乙烯-乙烯醇共聚物溶解于水系溶剂而制备聚合物溶液的工序。通过使用乙烯-乙烯醇共聚物，可改善结合配体时的动态结合载量和靶物质捕捉性能。另外，可成为适合于结合配体而作为担载体使用的排除极限分子量，且容易形成晶体结构，机械强度提高。
相对于原料聚合物α和水系溶剂的合计使用量，工序1中使用的原料聚合物α的使用量(聚合物浓度)优选为0.1质量％以上，更优选为1质量％以上，特别优选为3质量％以上，另外，优选为25质量％以下，更优选为15质量％以下，特别优选为10质量％以下。通过使原料聚合物α的使用量为3质量％以上，容易粒子化，另一方面，通过使原料聚合物α的使用量为15质量％以下，容易确保足够大小的细孔尺寸。另外，通过使原料聚合物α的使用量为10质量％以下，可明显改善多孔粒子结合配体时的动态结合载量。
本说明书中，水系溶剂是指包括水、与水混合的溶剂和含有它们的混合溶剂的概念。
作为水系溶剂，例如，可举出水；二甲基亚砜等亚砜系溶剂中的与水混合的溶剂；乙二醇等多元醇系溶剂中的与水混合的溶剂；异丙醇等醇系溶剂中的与水混合的溶剂；二甲基甲酰胺等酰胺系溶剂中的与水混合的溶剂。它们可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。
这些中，从结晶化速度的观点考虑，优选混合溶剂、水，该混合溶剂含有选自亚砜系溶剂中的与水混合的溶剂、多元醇系溶剂中的与水混合的溶剂、醇系溶剂中的与水混合的溶剂和酰胺系溶剂中的与水混合的溶剂中的1种或2种以上(以下，也称为“溶剂a”)和水，更优选含有选自二甲基亚砜、乙二醇、异丙醇和二甲基甲酰胺中的1种或2种以上与水的混合溶剂、水，特别优选为含有二甲基亚砜和水的混合溶剂。
使用含有溶剂a和水的混合溶剂时，溶剂a的使用量相对于混合溶剂总量，优选为40质量％以上，更优选为45质量％以上，进一步优选为50质量％以上，另外，优选小于90质量％，更优选小于80质量％，进一步优选小于70质量％。
从使原料聚合物α的晶体部容易解离的观点考虑，工序1中使原料聚合物α溶解的温度优选为70℃以上，更优选为80℃以上，特别优选为90℃以上，另外，优选为100℃以下。
另外，工序1中使原料聚合物α溶解的时间没有特别限定，通常为0.1～24小时左右。
(工序2)
工序2是使上述聚合物溶液分散于非水系溶剂而形成W/O乳液的工序。通过形成W/O乳液，容易获得晶体结构，能够改善机械强度。另外，能够增大结合配体时的动态结合载量，另外，还能够减少非特异性吸附量。
非水系溶剂只要为可分散聚合物溶液而形成W/O乳液的溶剂就没有特别限定，通常使用不与水混合的非水系溶剂。
作为非水系溶剂，例如，可举出脂肪族烃系溶剂、芳香族烃系溶剂、脂环式烃系溶剂、卤代烃系溶剂等烃系溶剂。它们可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。具体而言，可举出己烷、庚烷、辛烷、异辛烷、壬烷、甲基环己烷、煤油、液体石蜡、苯、甲苯、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、二氯甲烷、邻二氯苯、对二氯苯、间二氯苯等。
相对于聚合物溶液100质量份，非水系溶剂的使用量通常为30～200质量份左右，优选为50～150质量份。
工序2可以在分散剂的存在下进行。作为分散剂，例如，可举出各种表面活性剂；聚乙二醇、聚丙二醇等聚氧烷撑类；聚乙烯基甲醚、聚乙烯基乙醚等聚乙烯基醚类；聚(甲基)丙烯酸2-乙基己酯、聚(甲基)丙烯酸月桂酯、聚(甲基)丙烯酸十八酯等聚(甲基)丙烯酸烷基酯类；聚乙烯吡咯烷酮、聚(甲基)丙烯酰胺等可溶于水系溶剂的高分子分散剂；以聚叔碳酸乙烯酯、聚2-乙基己酸乙烯酯等高级脂肪酸乙烯酯的聚合物为代表的可溶于非水系溶剂的高分子分散剂。它们可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。
这些中，优选为表面活性剂，更优选为失水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯等非离子性表面活性剂。
相对于非水系溶剂100质量份，分散剂的使用量通常为1～30质量份左右，优选为5～20质量份。
另外，形成W/O乳液的方法没有特别限定，优选通过对聚合物溶液和非水系溶剂进行混合·搅拌而形成W/O乳液。由此，能够在不使用特殊设备的情况下简便地形成W/O乳液。
工序2的分散温度可以在溶剂的沸点以下适当地选择，通常为2～95℃，优选为25～90℃。另外，分散时间没有特别限定，通常为0.1～2小时，优选为0.5～1小时。
(工序3)
作为本发明的多孔粒子的制造方法，优选进一步包括(工序3)将工序2中形成的W/O乳液冷却而形成多孔粒子的工序的方法。通过工序3中的冷却，促进W/O乳液的结晶化，提高多孔粒子的机械强度。另外，得到的多孔粒子的细孔容易形成为所希望的尺寸。
工序3中的冷却与工序2中的分散温度相比为相对较低的温度，作为冷却温度，从促进结晶化的观点考虑，优选为0℃以上，另外，从结晶化速度和粒子化的观点考虑，优选为20℃以下，更优选为10℃以下，特别优选为5℃以下。
另外，冷却时间没有特别限定，通常为0.5～12小时左右，优选为1～5小时。
另外，从粒子的机械强度的观点考虑，优选在上述冷却之后，将体系内加热至超过20℃且为40℃以下的温度范围。加温时间通常为0.5～3小时左右，优选为1～2小时。
(工序4)
作为本发明的多孔粒子的制造方法，优选进一步包括(工序4)将工序3中形成的多孔粒子进行化学交联的工序的方法。通过工序4，得到的多孔粒子的机械强度进一步提高。
化学交联可以基于公知的方法(例如，参照日本特开2005-171040号公报)，使用交联剂等进行。
作为交联剂，可以使用上述的交联剂作为赋予化学交联结构的交联剂。
相对于工序3中得到的多孔粒子100质量份(粒子干燥质量)，交联剂的使用量通常为25～300质量份左右，优选为50～150质量份。
使用醛化合物作为交联剂时，化学交联优选在酸催化剂存在下进行。作为酸催化剂，可举出盐酸、硝酸、硫酸、磷酸等无机酸；草酸、乙酸等有机酸，但优选无机酸，特别优选硫酸。应予说明，酸催化剂可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。
从机械强度的观点考虑，相对于醛化合物100质量份，酸催化剂的使用量通常为1～200质量份，优选为10～100质量份。
工序4优选在溶剂存在下进行。作为该溶剂，优选不溶解原料聚合物α但溶解交联剂的溶剂。具体而言，可举出水；甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、甘油等醇系溶剂；它们的混合溶剂等。这些中，从产业上的利用容易的角度出发，优选水、乙醇、它们的混合溶剂。
相对于工序3中得到的多孔粒子100质量份(粒子干燥质量)，溶剂的使用量通常为500～5000质量份左右，优选为1000～4000质量份。
工序4的反应温度通常为40～70℃。另外，工序4的反应时间没有特别限定，通常为3～24小时左右。
(工序5)
本发明的多孔粒子的制造方法可以进一步包括(工序5)使工序4中经过化学交联的多孔粒子与选自乙烯醇聚合物和乙烯-乙烯醇共聚物中的1种以上的聚合物接触的工序。工序4中使用醛化合物作为交联剂的情况下，经过工序5，由于乙烯醇聚合物、乙烯-乙烯醇共聚物所含的重复单元(2)中的羟基与多孔粒子的残留甲酰基反应，所以能够对多孔粒子的残留甲酰基进行封端。
作为上述乙烯醇聚合物、乙烯-乙烯醇共聚物，可举出与本发明中作为原料聚合物使用的乙烯醇聚合物、乙烯-乙烯醇共聚物同样的化合物。另外，相对于工序4中经过化学交联的多孔粒子100质量份(粒子干燥质量)，乙烯醇聚合物、乙烯-乙烯醇共聚物的使用量通常为5～75质量份左右，优选为10～50质量份。
工序5优选在酸催化剂、溶剂存在下进行。作为该酸催化剂、溶剂，可举出与工序4中的酸催化剂、溶剂同样的化合物。
工序5的反应温度通常为40～70℃。另外，工序5的反应时间没有特别限定，通常为1～24小时左右。
(工序6)
本发明的多孔粒子的制造方法可以进一步包括(工序6)向工序3中形成的多孔粒子、工序4中经过化学交联的多孔粒子、或者工序5中实施过封端的多孔粒子(工序6中，将它们统称为“多孔粒子Z”)导入可与配体结合的反应性官能团的工序。
反应性官能团的导入可以基于常规方法进行，导入环氧基作为反应性官能团时，作为其方法，优选使多孔粒子Z与环氧化合物接触的方法。此处使用的环氧化合物是在具有与原料聚合物所含的重复单元(2)中的羟基反应的官能团(环氧基、卤素原子等)的基础上还具有1个以上的环氧基的化合物。作为这样的环氧化合物，例如，可举出环氧氯丙烷、环氧溴丙烷、环氧氟丙烷、环氧碘丙烷等环氧卤丙烷；乙二醇二缩水甘油醚、新戊二醇二缩水甘油醚、间苯二酚二缩水甘油醚、氢化双酚A二缩水甘油醚、丙三醇二缩水甘油醚、三羟甲基丙烷二缩水甘油醚、二乙二醇二缩水甘油醚、丙二醇二缩水甘油醚等二官能性环氧化物类；丙三醇多缩水甘油醚、三羟甲基丙烷多缩水甘油醚、季戊四醇多缩水甘油醚、二丙三醇多缩水甘油醚、聚丙三醇多缩水甘油醚、山梨糖醇多缩水甘油醚等三官能以上的环氧化合物。它们可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。
工序6根据需要可以在氯化钠、硫酸钠等盐的存在下进行。另外，工序6优选在溶剂存在下进行。作为该溶剂，可举出与工序4中的溶剂同样的溶剂。
工序6的反应温度通常为20～37℃。另外，工序6的反应时间没有特别限定，通常为0.5～12小时左右。
应予说明，在上述工序3～6中，各生成物的分离根据需要可通过适当地组合过滤、清洗、干燥、重结晶、再沉淀、透析、离心分离、利用各种溶剂的提取、中和、色谱法等通常的手段来进行。
于是，根据本发明的多孔粒子的制造方法，能够简便且容易地制造尽管为合成高分子系的粒子也不易发生非特异性吸附、作为担载体的支承体原料或者支承体有用的本发明的多孔粒子。另外，由该制法得到的多孔粒子的机械强度高，结合配体时的动态结合载量也大。
实施例
以下，举出实施例对本发明进行详细说明，但本发明不限于这些实施例。
(合成例1乙烯-乙烯醇共聚物的合成)
在高压釜中投入乙酸乙烯酯100质量份、甲醇50质量份，升温至60℃后通过30分钟氮气鼓泡而将体系中置换成氮气。将偶氮二异丁腈溶解于甲醇，制备浓度0.4质量％的聚合引发剂的甲醇溶液(聚合引发剂溶液)之后，进行氮气鼓泡而进行氮气置换。在充分进行反应釜的乙烯置换后，将反应釜内温调整至60℃，注入聚合引发剂溶液67质量份，开始聚合。聚合中将反应釜的乙烯压力维持在1.57MPa，将聚合温度维持在60℃。在6小时后冷却使聚合停止。打开反应釜进行脱乙烯之后，进行氮气鼓泡而除去乙烯。接下来在减压下除去未反应乙酸乙烯酯后，制成共聚物的甲醇溶液。
向调整为10质量％的该共聚物溶液中添加摩尔比(NaOH的摩尔数/聚乙酸乙烯酯的摩尔数)为0.05的NaOH甲醇溶液(10质量％)，并维持在40℃，实施2小时皂化反应。将除去聚合后未反应乙酸乙烯酯单体而得到的共聚物的甲醇溶液投入到正己烷中使共聚物沉淀，用丙酮溶解回收的共聚物，将该再沉淀纯化进行3次后，在60℃下进行减压干燥而得到共聚物的纯化物。
在得到的乙烯-乙烯醇共聚物中，来自乙烯的重复单元(1)与来自乙烯醇的重复单元(2)的摩尔比通过质子NMR来测定，结果为15:85。另外，基于JIS K6726计算的聚合度为400，根据JIS K6726测定的皂化度为99摩尔％。
(合成例2乙烯-乙烯醇共聚物的合成)
将聚合中的反应釜的乙烯压力变更为0.60MPa，除此之外，与合成例1同样地合成乙烯-乙烯醇共聚物。
在得到的乙烯-乙烯醇共聚物中，来自乙烯的重复单元(1)与来自乙烯醇的重复单元(2)的摩尔比通过质子NMR来测定，结果为5:95。另外，基于JIS K6726计算的聚合度为400，根据JIS K6726测定的皂化度为99摩尔％。
(制备例1蛋白A结合多孔粒子的制备)
＜粒子制备＞
将合成例1中得到的乙烯-乙烯醇共聚物100质量份、二甲基亚砜(和光纯药工业公司制)827质量份和蒸馏水502质量份投入到带挡板(バッフル)的7L可分离式烧瓶中，一边以100rpm进行搅拌，一边在95℃下加热0.5小时，使乙烯-乙烯醇共聚物溶解。将该溶液作为乙烯-乙烯醇共聚物溶液L。应予说明，该溶液中的乙烯-乙烯醇共聚物的浓度为7质量％。
接下来，将该共聚物溶液L冷却至80℃，向其中加入另外制备的由SPAN-80(东京化成工业制)143质量份和异辛烷(和光纯药工业公司制)1287质量份构成的溶液，以125rpm进行搅拌，由此制备W/O乳液。用30～50分钟左右将W/O乳液冷却至0℃附近，保持2～4小时左右，其后升温至常温，继续搅拌1小时，由此使共聚物成为球形。其后，搅拌下用4000质量份的乙醇清洗反应溶液，通过抽滤而回收粒子层。将该多孔粒子设为“粒子A”。
＜交联反应＞
将回收的粒子A100质量份(换算成粒子干燥质量)分散于乙醇2399质量份中，接下来，加入47质量％硫酸水溶液43质量份和20质量％戊二醛水溶液(和光纯药工业制)500质量份，在60℃下实施6～9小时左右交联反应。其后，用5000质量份的水进行清洗，通过抽滤回收粒子层。将该用戊二醛实施过交联的多孔粒子设为“粒子B”。
＜封端＞
使粒子B100质量份(换算成粒子干燥质量)分散于水2600质量份中，向其中加入47质量％硫酸水溶液11质量份和合成例1中得到的乙烯-乙烯醇共聚物的5质量％水溶液400质量份后，加热至50℃，反应1～3小时左右。其后，用布氏漏斗过滤，用水清洗，回收粒子。将该实施过封端的多孔粒子设为“粒子C”。
＜导入环氧基＞
将硫酸钠100质量份、磷酸二氢钠24质量份和50质量％的氢氧化钠水溶液36质量份加入到水1876质量份中，制备环氧基导入用缓冲液。在该环氧基导入用缓冲液4750质量份中加入粒子C100质量份(换算成粒子干燥质量)和乙二醇二缩水甘油醚(和光纯药工业制)1500质量份，在室温下反应2小时。其后，用布氏漏斗过滤，用水清洗，回收环氧基导入多孔粒子。将该环氧基导入多孔粒子设为“粒子D”。
＜蛋白A固定化＞
将环氧基导入多孔粒子D100质量份(换算成粒子干燥质量)、48.68mg/mL的蛋白A(利用国际公开第2015/080174号的实施例中记载的方法制作)的溶液(溶剂:磷酸缓冲液)600质量份和1M的柠檬酸缓冲液(pH12)8100质量份进行混合，在25℃下颠倒混合5小时，由此使蛋白A与环氧基导入多孔粒子D结合。将生成的粒子进行过滤后，与1M硫甘油水溶液7500质量份混合，在25℃下反应12小时。接下来，用0.1M的磷酸缓冲液(pH7.6)15000质量份、0.5M的NaOH水溶液15000质量份和0.1M的柠檬酸缓冲液(pH3.2)15000质量份清洗粒子，由此得到目标的蛋白A结合多孔粒子。将该蛋白A结合多孔粒子设为“担载体A”。
(制备例2蛋白A结合多孔粒子的制备)
将＜粒子制备＞的工序中使用的乙烯-乙烯醇共聚物100质量份变更为合成例2中得到的乙烯-乙烯醇共聚物(来自乙烯的重复单元(1)与来自乙烯醇的重复单元(2)的摩尔比＝5:95)85质量份，并且将＜封端＞的工序中使用的乙烯-乙烯醇共聚物变更为合成例2中得到的乙烯-乙烯醇共聚物，除此之外，通过与制备例1同样的步骤而制备蛋白A结合多孔粒子。应予说明，＜粒子制备＞的工序中的乙烯-乙烯醇共聚物溶液中的乙烯-乙烯醇共聚物的浓度为6质量％。
将制备例2中得到的实施过封端的多孔粒子设为“粒子E”。另外，将制备例2中得到的蛋白A结合多孔粒子设为“担载体B”。
(制备例3蛋白A结合多孔粒子的制备)
将＜粒子制备＞的工序中使用的乙烯-乙烯醇共聚物100质量份变更为来自乙烯的重复单元(1)与来自乙烯醇的重复单元(2)的摩尔比为27:73的乙烯-乙烯醇共聚物(Kuraray公司制EVAL L171B)85质量份，并且将＜封端＞的工序中使用的乙烯-乙烯醇共聚物变更为Kuraray公司制EVAL L171B，除此之外，通过与制备例1同样的步骤而制备蛋白A结合多孔粒子。应予说明，＜粒子制备＞的工序中的乙烯-乙烯醇共聚物溶液中的乙烯-乙烯醇共聚物的浓度为6质量％。
将制备例3中得到的实施过封端的多孔粒子设为“粒子F”。另外，将制备例3中得到的蛋白A结合多孔粒子设为“担载体C”。
(制备例4蛋白A结合多孔粒子的制备)
将＜粒子制备＞的工序中使用的乙烯-乙烯醇共聚物100质量份变更为来自乙烯的重复单元(1)与来自乙烯醇的重复单元(2)的摩尔比为38:62的乙烯-乙烯醇共聚物(Kuraray公司制EVAL H171B)85质量份，并且将＜封端＞的工序中使用的乙烯-乙烯醇共聚物变更为Kuraray公司制EVAL H171B，除此之外，通过与制备例1同样的步骤而制备蛋白A结合多孔粒子。应予说明，＜粒子制备＞的工序中的乙烯-乙烯醇共聚物溶液中的乙烯-乙烯醇共聚物的浓度为6质量％。
将制备例4中得到的实施过封端的多孔粒子设为“粒子G”。另外，将制备例4中得到的蛋白A结合多孔粒子设为“担载体D”。
(制备例5蛋白A结合多孔粒子的制备)
将＜粒子制备＞的工序中使用的乙烯-乙烯醇共聚物100质量份变更为来自乙烯的重复单元(1)与来自乙烯醇的重复单元(2)的摩尔比为44:56的乙烯-乙烯醇共聚物(Kuraray公司制EVAL G156B)85质量份，并且将＜封端＞的工序中使用的乙烯-乙烯醇共聚物变更为Kuraray公司制EVAL G156B，除此之外，通过与制备例1同样的步骤而制备蛋白A结合多孔粒子。应予说明，＜粒子制备＞的工序中的乙烯-乙烯醇共聚物溶液中的乙烯-乙烯醇共聚物的浓度为6质量％。
将制备例5中得到的实施过封端的多孔粒子设为“粒子H”。另外，将制备例5中得到的蛋白A结合多孔粒子设为“担载体E”。
(制备例6蛋白A结合多孔粒子的制备)
将＜粒子制备＞的工序中使用的乙烯-乙烯醇共聚物100质量份变更为聚乙烯醇(JAPAN VAM&POVAL CO.,LTD.制JF-04，皂化度:98％)85质量份，并且将＜封端＞的工序中使用的乙烯-乙烯醇共聚物变更为JAPAN VAM&POVAL CO.,LTD.制JF-04，除此之外，通过与制备例1同样的步骤而制备蛋白A结合多孔粒子。应予说明，＜粒子制备＞的工序中的聚乙烯醇溶液中的聚乙烯醇的浓度为6质量％。
将制备例6中得到的实施过封端的多孔粒子设为“粒子I”。另外，将制备例6中得到的蛋白A结合多孔粒子设为“担载体F”。
(比较制备例1蛋白A结合多孔粒子的制备)
如下制备以甲基丙烯酸酯为原料的蛋白A结合多孔粒子。
向纯水4090质量份中添加聚乙烯醇(Kuraray公司制PVA-217)8.5质量份、十二烷基硫酸钠(花王公司制EMAL10G)2.13质量份和碳酸钠4.26质量份，搅拌一晩而制备水溶液(S-1)。
另外预先取出水溶液(S-1)30质量份，在剩余的水溶液(S-1)中溶解亚硝酸钠2.13质量份，制备水溶液(S-2)。
接下来，使二甲基丙烯酸甘油酯(新中村化学工业公司制)125质量份、甲基丙烯酸缩水甘油酯(三菱丽阳公司制)17.9质量份和丙三醇单甲基丙烯酸酯(日本油脂公司制)35.9质量份溶解于2-辛酮(东洋合成公司制)86.4质量份和苯乙酮(和光纯药工业公司制)253质量份的混合液，制备单体溶液。应予说明，在该单体总量中，二甲基丙烯酸甘油酯为70质量％，甲基丙烯酸缩水甘油酯为10质量％，丙三醇单甲基丙烯酸酯为20质量％。
接下来，在预先取出的水溶液(S-1)30质量份中添加2,2’-偶氮二异丁腈(和光纯药工业公司制)2.2质量份进行分散，制成引发剂分散液。
接下来，将准备的水溶液(S-2)和单体溶液投入到带挡板的7L可分离式烧瓶内，安装温度计、搅拌叶片和冷却管后设置于温水浴中，在氮气气氛下，以220rpm开始搅拌。接着，利用温水浴加热可分离式烧瓶，在达到85℃后，添加上述引发剂分散液，一边将温度保持在85℃，一边进行5小时搅拌。接下来，使反应液冷却后，将该反应液用布氏漏斗过滤，用纯水和异丙醇清洗。将清洗的粒子移到聚乙烯瓶中，使其分散于水进行3次倾析，除去小粒子。经过以上的操作得到分散于水中的12.5质量％的多孔粒子(粒子干燥质量123g)。将该多孔粒子设为“粒子J”。
此处，测定粒子J的环氧基含量。即，以由聚合中使用的含有环氧基的单体量计算的环氧基摩尔数成为2.00mmol的方式，向聚乙烯瓶中量取浓度约10质量％的粒子J的水分散体(浓度已知)，向其中加入浓度38质量％的氯化钙水溶液25mL和2N的盐酸2.00mL，在75℃下搅拌150分钟使环氧基开环，冷却后，用2当量的氢氧化钠水溶液2.50mL中和，进一步一边用pH测定仪监控pH一边用0.1当量的盐酸进行返滴定，由此进行测定。测定的结果，粒子J的环氧基含量为0.47mmol/g。
接下来，使蛋白A0.1质量份分散于0.1M磷酸缓冲液(pH6.8)25质量份，将该分散液和以粒子干燥质量换算为1质量份的粒子J混合，在10℃下颠倒混合24小时，使蛋白A与粒子J结合。将生成的粒子进行过滤后，与1M硫甘油25质量份混合，在30℃下反应4小时，使残余的环氧基开环，用PBS/0.5质量％Tween20进行清洗后，进一步用PBS清洗。将得到的多孔粒子设为“担载体G”。
(比较制备例2蛋白A结合粒子的制备)
对来自乙烯的重复单元(1)与来自乙烯醇的重复单元(2)的摩尔比为27:73的乙烯-乙烯醇共聚物(Kuraray公司制EVAL L171B)100质量份一边进行搅拌一边使其溶解于二甲基亚砜(和光纯药工业公司制)1570质量份，制备聚合物溶液。应予说明，该溶液中的乙烯-乙烯醇共聚物的浓度为6质量％。
接下来，从内径150μm的喷嘴喷出上述聚合物溶液，使其呈滴状落在凝固水中，得到聚合物粒子。
接下来，对得到的聚合物粒子进行与制备例1的＜交联反应＞、＜封端＞、＜导入环氧基＞、＜蛋白A固定化＞同样的处理。应予说明，＜封端＞的工序中，将水2600质量份变更为二甲基亚砜2600质量份，将合成例1中得到的乙烯-乙烯醇共聚物的5质量％水溶液400质量份变更为Kuraray公司制EVAL L171B的5质量％二甲基亚砜溶液400质量份来进行实施。
将比较制备例2中得到的实施过封端的粒子设为“粒子K”。另外，将比较制备例2中得到的蛋白A结合粒子设为“担载体H”。
(试验例1X射线衍射)
使制备例1中得到的粒子A分散于水中而得到浆料，将该浆料用叔丁醇溶液置换后，在冷冻库冻结30分钟，用真空干燥机干燥3小时，得到干燥粒子粉末。使用研钵和研棒研碎该干燥粒子粉末，使用X射线衍射装置SmartLab(Rigaku公司制)，确认粉末X射线衍射图案。对于制备例1中制作的粒子B～C和担载体A，也同样地确认粉末X射线衍射图案。将这些粉末X射线衍射图案示于图1。
如图1所示，确认了粒子A～C和担载体A均在来源于乙烯醇的晶体结构的2θ＝19.4°附近具有峰(参照Macromolecules 2004，37，1921-1927)。
(试验例2分配系数Kav和排除极限分子量)
使用GE Healthcare公司制AKTAprime plus，利用线性流速300cm/hr下的下述各标志物分子洗脱体积(mL)，测定制备例1中得到的粒子C的分配系数Kav。另外，使用测定的Kav，测定排除极限分子量。柱容器为容量4mL(5mmφ×200mm长)，将标志物(1)～(6)溶解到20mM磷酸钠/150mM氯化钠水溶液(pH7.5)中使用。
标志物(1):聚苯乙烯磺酸钠(Sigma-Aldrich公司制，MW:2260kDa)
标志物(2):碳酸酐酶(Sigma-Aldrich公司制，近似分子量(ApproximateMolecular Mass):29kDa)
标志物(3):白蛋白(Sigma-Aldrich公司制，近似分子量:66kDa)
标志物(4):β-淀粉酶(Sigma-Aldrich公司制，近似分子量:200kDa)
标志物(5):甲状腺球蛋白(Sigma-Aldrich公司制，近似分子量:669kDa)
标志物(6):人类免疫球蛋白G(Equitech Bio公司制HGG-1000)
标志物(7):0.5M氯化钠水溶液(和光纯药工业公司制)
分配系数Kav由下式求出。
Kav＝(Ve－Vo)/(Vt－Vo)
Ve为各标志物的洗脱体积。
Vo为聚苯乙烯磺酸钠的洗脱体积。
Vt为将粒子C填充于柱容器时粒子的填充层所占的体积(粒子层体积)。
以各标志物的分子量的对数{ln(分子量)(MW)}为横轴、以Kav为纵轴作图，由显示直线性的部分求出下述式的斜率和截距。由所求出的斜率和截距算出Kav为0的分子量，作为排除极限分子量。
Kav＝(斜率)×ln(MW)+(截距)
对于制备例2～6和比较制备例2中制作的粒子E～I和K也同样地测定Kav和排除极限分子量。将试验例2的结果示于表2。
(试验例3空隙率)
使用AKTAprime plus(GE Healthcare公司制)，填充于与试验例2同样的柱，通过下式算出制备例1中得到的粒子C的空隙率。
空隙率[％]＝(Vi－Vo)/(CV－Vo)×100
Vi为试验例2中流过氯化钠水溶液时的洗脱体积。
Vo如试验例2所述。
CV为柱体积，是由柱的直径和柱的高度求出的值。
对于制备例2～6和比较制备例1～2中制作的粒子E～K也同样地测定空隙率。将试验例3的结果示于表2。
(试验例4堆积密度)
使制备例1中得到的粒子C分散于水中而得到浆料，将该浆料投入到量筒中，称量投入量。使量筒静置，利用重力使浆料完全沉降，求出沉降体积，通过下式算出堆积密度。
堆积密度＝投入浆料量[g]×固体成分浓度[质量％]/沉降体积[mL]
应予说明，固体成分浓度如下求出。将上述浆料投入到铝皿上，用200℃的热板进行加热，由此完全除去水分。用残留在铝皿上的固体成分的质量除以浆料的质量，再乘以100，作为固体成分浓度[质量％]。
对于制备例2～6和比较制备例1～2中制作的粒子E～K也同样地测定堆积密度。将试验例4的结果示于表2。
(试验例5比表面积)
使用水银孔率测定计(岛津制作所公司制AutoPore IV9520)，以10nm-5000nm的测定范围算出制备例1中得到的粒子C的比表面积。
对于制备例2～6和比较制备例1～2中制作的粒子E～K也同样地测定比表面积。将试验例5的结果示于表2。
(试验例6非特异性吸附性的评价)
在容量1mL(5mmφ×50mm长)的柱容器中，以填充高度约5cm填充制备例1中得到的担载体A。将得到的柱与GE Healthcare公司制AKTAPrime Plus连接，用20mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)使其平衡化。
接下来，使含有单克隆抗体Trastuzumab的CHO细胞培养上清液以流速0.2mL/分钟流过柱。
接下来，使20mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)、20mM磷酸钠/1M氯化钠缓冲液(pH7.5)和20mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)分别以5柱容量、流速0.2mL/分钟依次流过柱。
其后，使100mM乙酸钠缓冲液(pH3.2)以流速0.2mL/分钟流过柱，将被捕捉到柱内的单克隆抗体洗脱，回收波长280nm的UV的吸光度为100mAu的洗脱馏分。
然后，使用分光光度计，测定回收的馏分中含有的抗体浓度(mg/mL)。另外，使用Cygnus Technologies公司制CHO HCP ELISA kit,3G，测定回收的馏分中含有的宿主细胞蛋白(HCP)的浓度(ng/mL)。进而用HCP的浓度除以抗体浓度，算出每单位抗体量的HCP量，基于以下的评价基准来评价非特异性吸附性。
·非特异性吸附性评价基准
AA:2000ppm/IgG以下
A:超过2000ppm/IgG且为3000ppm/IgG以下
B:超过3000ppm/IgG且为4000ppm/IgG以下
C:超过4000ppm/IgG
对于制备例2～6和比较制备例1～2中制作的担载体B～H也同样地进行，定量HCP，评价非特异性吸附性。将试验例6的结果示于表3。
(试验例7动态结合载量(Dynamic Binding Capacity(DBC)的测定)
使用GE Healthcare公司制色谱装置AKTA prime plus，测定线性流速300cm/hr下的制备例1中得到的担载体A对蛋白质(人类多克隆IgG抗体，Equitech Bio公司制HGG-1000)的DBC。作为柱容器，使用容量4mL(5mmφ×200mm长)的柱容器，作为蛋白质，使用在20mM磷酸钠/150mM氯化钠水溶液(pH7.5)中以5.3mg/mL的浓度溶解蛋白质而得的物质，利用吸光度监视器，由洗脱液中的人类多克隆IgG的浓度突破(超过)10％时的蛋白质捕捉量和柱填充体积算出DBC，基于以下的评价基准来评价DBC。
·DBC评价基准
AA:为55mg/mL以上且小于75mg/mL
A:为45mg/mL以上且小于55mg/mL
B:为25mg/mL以上且小于45mg/mL
C:小于25mg/mL
对于制备例2～6和比较制备例1～2中制作的担载体B～H也同样地测定DBC。将试验例7的结果示于表3。
(试验例8机械强度的评价(可测定线性流速))
使用GE Healthcare公司制AKTA Avant，使超纯水以线性流速300cm/hr流过16mmφ×150mm的柱容器，将制备例1中得到的担载体A以填充高度成为约10cm的方式进行填充。每1分钟使线性流速上升100cm/hr，测定施加于柱的压力不超过2MPa的最大的流速作为可测定线性流速。
·机械强度评价基准
A:可测定线性流速为2000cm/hr以上
B:可测定线性流速为1000cm/hr以上且小于2000cm/hr
C:可测定线性流速小于1000cm/hr
对于制备例2～6和比较制备例1～2中制作的担载体B～H也同样地测定可测定线性流速。将试验例8的结果示于表3。
[表1]
Figure BDA0001669166470000271
[表2]
Figure BDA0001669166470000281
[表3]
Figure BDA0001669166470000291
如表1～3所示，将甲基丙烯酸酯系聚合物作为原料聚合物的情况下(比较制备例1)，非特异性吸附量多，另外，机械强度也差。
另外，通过形成O/W乳液而制备空隙率为62％的多孔粒子，并使用它的情况下(比较制备例2)，动态结合载量小。
与此相对，使用来源于选自乙烯醇聚合物和乙烯-乙烯醇共聚物中的1种以上的聚合物的、空隙率为75％以上的多孔粒子的情况下(制备例1～6)，非特异性吸附量少，动态结合载量大，显示优异的机械强度。特别是使用使乙烯-乙烯醇共聚物溶解于水系溶剂制备聚合物溶液并使该聚合物溶液分散于非水系溶剂形成W/O乳液而得到的多孔粒子的情况下(制备例1～5)，动态结合载量特别大。

Claims (4)

1.一种多孔粒子的制造方法，包括以下的工序1～4，
工序1：使乙烯-乙烯醇共聚物溶解于水系溶剂而制备聚合物溶液的工序；
工序2：使所述聚合物溶液分散于非水系溶剂而形成W/O乳液的工序；
工序3：将所述W/O乳液冷却而形成多孔粒子的工序；
工序4：将工序3中形成的多孔粒子进行化学交联的工序；
作为所述乙烯-乙烯醇共聚物，使用相对于共聚物中的全部重复单元具有大于0摩尔％且为50摩尔％以下的下述式(1)表示的来自乙烯的重复单元的乙烯-乙烯醇共聚物，
Figure FDA0003245532820000011
2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，作为所述乙烯-乙烯醇共聚物，使用相对于共聚物中的全部重复单元具有大于1摩尔％且为50摩尔％以下的所述式(1)表示的来自乙烯的重复单元的乙烯-乙烯醇共聚物。
3.根据权利要求1或2所述的制造方法，其中，还包括以下的工序5，
工序5：使工序4中经过化学交联的多孔粒子与乙烯-乙烯醇共聚物接触的工序。
4.根据权利要求1或2所述的制造方法，其中，所述水系溶剂为混合溶剂或者水，所述混合溶剂含有从亚砜系溶剂中的与水混合的溶剂、多元醇系溶剂中的与水混合的溶剂、醇系溶剂中的与水混合的溶剂和酰胺系溶剂中的与水混合的溶剂中选择的1种或2种以上以及水。
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