KR20170075731A - 환상 펩티드 유도체와 그 제조 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

아스트로사이트 증식 활성을 갖는 눈꽃동충하초에 유래하는 환상 펩티드 유도체 또는 그 염.

Description

환상 펩티드 유도체와 그 제조 방법 및 조성물{CYCLIC PEPTIDE DERIVATIVE, METHOD FOR PREPARING SAME AND COMPOSITION THEREOF}

본 발명은 환상 펩티드 유도체와 그 제조 방법 및 조성물에 관한 것이다.

무척추동물인 곤충은 척추동물과는 다른 대사경로나 면역계를 구비하고 있고, 생체 내에서 합성한 여러가지 생리활성물질에 의한 강력한 자연면역으로 병원균이나 바이러스에의 저항성을 발휘하고 있다. 또한, 곤충은 그 생태로서, 외부와의, 예를 들면 다른 생물, 병원균, 바이러스 등과의 특이한 상호 관계를 형성하고도 있다. 이 때문에, 최근, 곤충이나 그 생태 유래의 생리활성물질에 관한 연구가 진행되고 있고, 종래 알려져 있지 않았던 신규 구조를 갖는 화합물이 다수 발견되고 있다.

본 발명자들은 이러한 배경의 일환으로서, 지금까지 동충하초의 약리효과 등에 관한 연구를 진행시켜 왔다.

동충하초의 분류와 명칭에 대해서는, 종래부터 전통적으로 형태를 중심으로 해서 교배능, 생태, 병원성, 화학분류 등의 표현을 지표로 하여, 종합적으로 계통관계가 논의되고, 명명되어 왔다. 현재에는 유전자형을 지표로 한 분자계통분류에 의해, Cordyceps속과 맥각균과에 있어서의 계통관계를 다시 보고, 형태적 특징도 가미해서 새로운 분류체계가 구축, 제창되고 있다. 여기에서, 이하의 설명에 있어서는, 동충하초 생태도감(2014년, 세이분도 신코샤 간행)의 기재에 의거한 동충하초의 일본명을 기재하고, 첫 출현의 것에 대해서는 괄호 내에는 종래 종명과, 신분류 종명을 병기한다.

이러한 동충하초는 곤충에 의지한 곤충 병원균류의 하나이며, 협의의 해석에서는 곤충강(Insecta), 나비목(Lepidoptera), 박쥐나방상과(Hepialoidea), 박쥐나방과(Hepialidiae)에 속하는 박쥐나방을 숙주로 한 중국의 티베트 자치구, 퀑하이성, 쓰촨성, 구이저우성, 간쑤성, 윈난성을 비롯해, 네팔이나 부탄의 표고 3,000에서 4,000미터의 고산지대에 서식하는 시넨시스 동충하초(Cordyceps sinennsis, Ophiocordyceps sinennsis라고도 함)를 말한다. 숙주곤충의 종류도 다종 다양해서, 노린재목(Hemiptera), 나비목(Lepidoptera), 딱정벌레목(Coleoptera), 벌목(Hymenoptera), 메뚜기목(Orthoptera), 잠자리목(Odonata), 파리목(Diptera) 등 다방면에 걸친다.

한편, 광의의 해석에서는 이러한 곤충의 성충이나 유충에 기생하는 균 전체가 동충하초라고 불리고도 있다.

그리고, 동충하초에 대해서 한방약의 재료나 건강보조식품 소재로서의 과학적 지견은 아직 적은 단계이지만, 지금까지의 동충하초의 생리활성에 관한 연구예 로서, 시넨시스 동충하초와 그 생산물이 당뇨병, 심혈관질환이나 암이나 대사병을 방지하거나, 또는 그것들의 질병의 진행을 지연시키는데 유효한 영양제로서 널리 이용되고 있다(비특허문헌 1). 이 외에도, 번데기동충하초(Cordyceps militaris)의 물 추출물에 의한 항산화 작용(비특허문헌 2), 면역조절 작용(비특허문헌 3), in vivo에서의 인슐린 저항성의 감소와 인슐린 분비물의 증가 작용(비특허문헌 4), 티베트산의 동충하초인 시넨시스 동충하초의 열수 추출에 의한 항고지혈증 효과(비특허문헌 5), 항종양 활성(비특허문헌 6), 항염증 작용(비특허문헌 7) 등이 보고되어 있다. 또한, 극히 최근에 있어서도 시넨시스 동충하초로부터 단리된 코르디세핀 등의 생리활성물질에 대해서, 종래 보고되고 있지 않았던 신규의 생리활성을 갖는 것 등이 보고되어 있다(비특허문헌 8∼10) 그리고, 이러한 동충하초의 지명도가 높아짐에 의한 급격한 수요 증가에 의한 남획 등에 의해, 티베트산의 시넨시스 동충하초는 고가여서 입수가 곤란하게 되어 있다.

또한, 광의의 해석으로서의 동충하초의 1종인 눈꽃동충하초(Paecilomyces tenuipes, Isaria japonica Yasuda라고도 함)는 자낭균류의 코르디셉스과의 Cordyceps속에 속하고, 누에(Bombyx mori, 이하 B. mori로 기재함)의 유충이나 번데기에 기생하는 균이기 때문에, 누에 번데기와의 조합에 의한 동충하초의 인공재배가 최근 일본에서 상업화되어 있다. 그러나, 시판되고 있는 Cordyceps속이나 Paecilomyces속 및 Isaria속의 동충하초의 많은 상품은 무성종의 균사배양으로부터 조제된 것이 많고, 또한 눈꽃동충하초의 약리효과에 관한 연구 보고는 시넨시스 동충하초에 비해 압도적으로 적다.

지금까지, 눈꽃동충하초의 생리활성 성분으로서는, 곡류, 또는 곡류 및 효모 또는 그 추출물을 첨가한 배지에서 재배한 눈꽃동충하초의 자실체를 건조분말화하고, 70% 메탄올 추출, 아세트산 에틸-물에서 분배, 수상을 n-부탄올-물에서 분배, n-부탄올상을 실리카 겔 크로마토그래피에 붙이고, 아세트산 에틸로 용출해서 얻어지는 스피로테누이페신(spirotenuipesine) A, B가 알려져 있다(특허문헌 1). 또한, 숙주(누에 번데기)와 자실체의 혼합 분말의 아세트산 에틸 추출물 중에서 단리된 환상 헥사뎁시펩티드 뷰베리신(Beauvericin)이 래트 간암세포 증식 억제효과를 갖는 것(비특허문헌 11)이나, 숙주(누에 번데기)부터 분리된 자실체를 재료로 해서 60% 에탄올 추출, 5% 메탄올 추출, 열수 추출의 과정을 거쳐서 얻어진 하나사나긴(3,4-디구아니디노부타노일-DOPA)이, 프리라디칼(DPPH) 소거활성이나 슈퍼옥시드 음이온 소거능을 갖는 것(비특허문헌 12, 13) 등이 알려져 있다.

그리고, 본 발명자들은 시넨시스 동충하초에 비해서 입수가 용이하고, 비용면, 안정 공급의 면에서 뛰어나고 있는 눈꽃동충하초에 관한 연구를 진행하는 중에, 눈꽃동충하초 분말에 유래하는 추출 획분에 포유동물의 뇌기능 개선 효과나, 현저한 아스트로사이트 증식 촉진 활성이 있는 것을 찾아내고 있다(특허문헌 2, 3). 그래서, 본 발명자들은 계속해서 아스트로사이트 증식 활성과 눈꽃동충하초의 관련성에 대해서 예의 연구를 더 진행시켜 왔다.

신경아교세포의 일종인 아스트로사이트(성상교세포)는, 뇌의 전체 세포의 약 반수를 차지한다. 종래는 정보처리기능은 신경세포가 담당한다고 하는 관점으로부터, 신경세포의 주위에 존재하는 아스트로사이트의 기능으로서는 신경세포의 지지·보호·영양공급 등이 생각되어 왔다.

한편, 최근 아스트로사이트는 신경회로형성 기능(비특허문헌 14-17), 전달물질 농도조절 기능(비특허문헌 18, 19)이라고 하는 간접적인 신경회로형성 보조기구 뿐만 아니라, 신경세포로부터의 입력과 그것에 계속되는 아스트로사이트간에 있어서의 칼슘 전파(비특허문헌 20-22), 시냅스 소포상 소포를 포함하고 신경세포에 출력할 수 있는 것(비특허문헌 23, 24) 등이 보고되기 시작하고, 아스트로사이트 자신이 세포 정보처리의 일익을 담당하는 것이 시사되어 있다.

또한, 기억의 형성에 대한 아스트로사이트의 역할에 관한 연구도 행하여지기 시작하고 있고, 기억 등의 뇌의 고차 기능은 뉴런과 아스트로사이트 사이의 상호작용을 통해서 제어되고 있는 것은 아닐까라고 여겨지고 있다. 예를 들면, 기억 형성의 후에 해마에 있어서 아스트로사이트 수가 증가하는 것이나(비특허문헌 25), 아스트로사이트의 기능을 억제하면 기억 형성이 저해되는 것(비특허문헌 26) 등이 보고되어 있다.

또한 종래, 통합실조증이나 쌍극성 장해, 우울증 등의 정신질환에 있어서 뇌신경 해부학적으로 공통적으로 보여지는 이상으로서, 거시적인 레벨에서는 뇌실비대, 해마, 대뇌피질 사이즈의 축소가 보여지고, 미시적인 레벨에서는 신경세포체 사이즈의 축소, 수상돌기 spine 밀도의 감소, 수상돌기 길이의 단축, 시냅스 관련 단백질량의 감소 등이 알려져 있었다. 이것들은 신경세포의 직접적인 이상으로 생각되어 왔다. 그러나, 최근에는 아스트로사이트 수의 감소도 공통되게 보여지는 것이 보고되고 있고, 아스트로사이트 수의 감소에 의거한 간접적인 신경세포 상태의 이상의 가능성도 검토되고 있다(비특허문헌 27).

일본 특허공개 2003-252876호 공보 일본 특허공개 2012-56867호 공보 일본 특허공개 2013-184923호 공보

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그러나, 상기 특허문헌 2, 3 이후에 있어서도, 그 생리활성이 주목받는 포유 동물의 뇌기능 개선 효과나 아스트로사이트의 증식 활성의 본체인 화합물을 눈꽃동충하초로부터 단리, 동정하는 것에는 이르고 있지 않았다.

본 발명은 이상과 같은 사정을 고려하여 이루어진 것으로, 아스트로사이트 증식 활성을 갖는 신규인 화합물과 그 제조 방법 및 조성물을 제공하는 것을 과제로 하고 있다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 진행시킨 결과, 눈꽃동충하초 건조분말의 열수 추출물의 2상 분배, 플래시 칼럼 크로마토그래피, 역상 HPLC에 의한 정제의 결과, 신규한 환상 펩티드 유도체의 단리 정제에 성공하여 그 화학구조를 특정함과 아울러, 또한 이 화합물이 초대배양 및 계대배양한 신생 마우스 유래의 아스트로사이트에 대하여 현저한 증식 활성을 갖는 것을 찾아내고, 이것들의 지견을 바탕으로 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 신규 화합물은 다음의 일반식(1)으로 나타내어지는 환상 펩티드 유도체인 것을 특징으로 하고 있다.

(식 중, m은 0∼3, n≥1이며, R₁∼R₆은 수소원자, 또는 탄화수소기, R₇, R₈은 카르복실기 또는 그 염, 또는 알콕시카르보닐기, R₉는 탄화수소기, 히드록실기, 알콕시기, 또는 알킬카르보닐옥시기, R₁₀, R₁₁은 수소원자, 탄화수소기, 또는 알킬카르보닐옥시기, R₁₂∼R₁₆은 수소원자, 또는 탄화수소기이다.)

상기 환상 펩티드 유도체로서는 상기 일반식(1)에 있어서, R₁, R₂, R₃, R₄가 알킬기이며, n=2∼4, R₅, R₆이 수소원자, R₇, R₈이 카르복실기인 것 등이 바람직하다.

본 발명의 환상 펩티드 유도체의 제조 방법에 있어서는 눈꽃동충하초로부터 채취하는 것이 바람직하게 고려된다.

그리고, 눈꽃동충하초가 누에의 번데기를 배지로 해서 인공배양된 것이나, 눈꽃동충하초 분말의 열수 추출 공정을 포함하는 것도 바람직하게 고려된다.

또한, 본 발명의 환상 펩티드 유도체의 제조 방법에 있어서는 환상 펩티드 유도체를 화학 합성하는 것도 고려된다.

본 발명의 의약 조성물은 환상 펩티드 유도체 또는 그 염을 유효성분으로 하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 의약품 조성물에서는 아스트로사이트 증식 활성을 갖는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 의약 품조성물에서는 NGF 유전자 및 VGF 유전자의 발현량을 증가시키는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 의약품 조성물에서는 뇌기능 개선 활성을 갖는 것이 바람직하다.

그리고 또한, 본 발명의 의약품 조성물에서는 모질 개선 활성을 갖는 것이 바람직하다.

본 발명의 식품 조성물은 환상 펩티드 유도체 또는 그 염을 포함하는 것이 바람직하다.

(발명의 효과)

본 발명에 의하면, 뛰어난 아스트로사이트 증식 활성을 비롯한 생리활성기능을 갖는 것에 있어서 유용한 신규 환상 펩티드 유도체가 제공된다. 그리고 그 제조 방법에 있어서는, 입수가 용이하고, 비용면, 안정공급의 면에서 뛰어난 눈꽃동충하초를 원료로 할 수도 있다.

도 1은 본 발명의 환상 펩티드 유도체의 단리 정제 공정의 개요를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시예에서의 눈꽃동충하초로부터의 단리 정제 공정을 나타낸 도면이다.
도 3은 HILIC 칼럼을 사용한 HPLC에 의한 환상 펩티드 유도체의 분리 결과를 예시한 도면이다.
도 4는 본 발명의 환상 펩티드 유도체의 ¹H-NMR에 의한 HMBC 분석의 결과를 예시한 도면이다.
도 5는 본 발명의 환상 펩티드 유도체의 ¹H-NMR의 스펙트럼을 나타내고 있다.
도 6는 환상 펩티드 유도체에 의한 아스트로사이트 증식 활성의 농도 의존성을 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 환상 펩티드 유도체, 조니사미드를 배양한 아스트로사이트에 첨가했을 경우의 아스트로사이트 증식 활성을 나타내는 도면이다.
도 8은 환상 펩티드 유도체 및 기존 의약품을 배양한 아스트로사이트에 첨가했을 경우의 아스트로사이트 증식 활성을 나타내는 도면이다.
도 9는 환상 펩티드 유도체 및 기존 의약품을 배양한 아스트로사이트에 첨가했을 경우의 아스트로사이트 증식 활성을 나타내는 도면이다. 세로축에 아스트로사이트에 도입된 BrdU 농도를 나타내고 있다.
도 10은 환상 펩티드 유도체를, 배양한 인간 피부 섬유아세포(NHDF), 인간 간암세포(HepG2) 및 인간 백혈병세포(K562)에 첨가했을 경우의 세포 증식 활성을 나타내는 도면이다.
도 11은 환상 펩티드 유도체 및 염산 도네페질을 첨가했을 경우의 아세틸콜린에스테라아제(AChE) 저해 활성을 나타내는 도면이다.
도 12는 환상 펩티드 유도체를 첨가한 배양 아스트로사이트에 있어서의 신경영양인자 관련 유전자의 발현해석의 결과를 나타내는 그래프이다. 어느 처리구의 세포에서도 발현이 일정하게 생각되고 있는 GAPDH 유전자(하우스키핑 유전자, 내부표준)에 대해서도 정량을 행하고, 그것을 바탕으로 조사하고 싶은 타깃 유전자의 정량 결과를 보정했다. 하단은 아무것도 첨가하고 있지 않은 배양 아스트로사이트에 있어서의 유전자의 발현량을 나타내고 있다. 상단은 환상 펩티드 유도체 첨가 후의 배양 아스트로사이트에 있어서의 유전자의 발현량을 나타내고 있다.
도 13은 환상 펩티드 유도체를 투여한 정상 노화 마우스 및 노화촉진 모델 마우스의 스텝스루형 수동적 회피실험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14는 환상 펩티드 유도체를 투여한 정상 노화 마우스 및 노화촉진 모델 마우스의 모리스 수중미로실험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 15는 환상 펩티드 유도체를 투여한 정상 노화 마우스 및 노화촉진 모델 마우스의 체모의 마찰계수 및 손상면적비를 나타낸 그래프이다.
도 16의 A∼F는 각각, 산지, 종류, 배양 방법이 다른 동충하초 및 숙주인 누에 번데기 추출물에 의한 아스트로사이트 증식 활성의 결과를 나타내는 도면이다.

상기와 같이 본 발명의 환상 펩티드 유도체는 다음의 일반식(1)으로 나타내어진다.

(식 중, m은 0∼3, n≥1이며, R₁∼R₆은 수소원자, 또는 탄화수소기, R₇, R₈은 카르복실기 또는 그 염, 또는 알콕시카르보닐기, R₉는 탄화수소기, 히드록실기, 알콕시기, 또는 알킬카르보닐옥시기, R₁₀, R₁₁은 수소원자, 탄화수소기, 또는 알킬카르보닐옥시기, R₁₂∼R₁₆은 수소원자, 또는 탄화수소기이다.)

여기에서, 탄화수소기로서는 직쇄상 또는 분기쇄상의 포화 또는 불포화, 또는 지환식의 것이고, 바람직하게는 탄소수 1∼6, 보다 바람직하게는 탄소수 1∼4의 것을 나타내고 있다. 알콕시기, 알콕시카르보닐기, 알킬카르보닐옥시기에 있어서의 탄화수소 부분도 같다.

바람직한 예로서는, 탄화수소기, 탄화수소 부분은 탄소수 1∼4의 알킬기인 것이 고려된다.

R₇, R₈이 카르복실기의 염으로서는, 예를 들면 알칼리 금속염, 알칼리 토류금속염 등의 금속염이나 암모늄염, 아민염 등이 예시된다.

상기 일반식(1)에 있어서는, 예를 들면 R₁, R₂, R₃, R₄가 알킬기, 특히 메틸기 및 에틸기 중 어느 하나이며, n=2∼4이고, R₅, R₆이 수소원자, R₇, R₈이 카르복실기, m=0이고, R₁₀, R₁₁이 수소원자, R₁₂, R₁₃이 수소원자, R₁₄, R₁₅가 수소원자 및 알킬기, 특히 메틸기 중 어느 하나인 것 등이 구체적으로 예시된다.

본 발명의 환상 펩티드 유도체의 제조에 있어서는 눈꽃동충하초로부터 각종의 추출, 분리 방법을 이용하여 채취하는 것이 바람직하다.

또한, 환상 펩티드 유도체의 제조 방법에 있어서는 눈꽃동충하초가 누에의 번데기를 배지로 해서 인공배양된 것이 바람직하다. 누에 번데기는 생번데기이여도 좋고, 건조번데기이여도 좋다. 건조번데기를 사용할 때에는 번데기로서의 형상을 유지한 채 사용해도 좋고, 건조번데기를 분말화해서 얻어지는 번데기 분말을 버섯류의 공지의 인공재배용 배지에 첨가해서 사용하는 것도 가능하다.

또한, 환상 펩티드 유도체의 제조 방법에 있어서는 눈꽃동충하초로부터 채취할 뿐만 아니라, 펩티드 합성 등의 각종의 공지의 화학 합성 방법을 조합함으로써 제작하는 것도 가능하다.

또한 환상 펩티드의 유도체화는 유도체 펩티드 합성, 그 밖의 공지의 방법으로 제작할 수 있다. 환상 펩티드의 유도체화에는 공지의 효소법이나 화학적 방법을 적용할 수 있다.

이어서, 도 1에 따라 일반식(1)에 기재한 본 발명의 환상 펩티드 유도체를 눈꽃동충하초로부터 채취하는 방법에 대하여 설명한다.

본 발명의 환상 펩티드 유도체는, 이하의 공정:

(1) 눈꽃동충하초 분말의 열수 추출액을 건조시켜서 열수 추출물을 얻는 공정;

(2) 상기 공정 (1)에서 얻어진 열수 추출물을 포함하는 수용액과 유기용매에 의한 2상 분배를 행해서 물 추출 획분과 유기용매 추출 획분으로 분리시켜, 물 추출 획분의 건조체를 얻는 공정;

(3) 상기 공정 (2)에서 얻어진 물 추출 획분의 건조체를 포함하는 용액을 담체에 챠지한 후, 이 담체에 물과 유기용매의 혼합액을 접촉시켜서 고상 추출하고, 추출액을 건조시켜서 고상 추출물을 얻는 공정;

(4) 상기 공정 (3)에서 얻어진 고상 추출물을 포함하는 용액을, 역상 칼럼을 사용한 고속 액체 크로마토그래피에 의해 분리하고, 환상 펩티드 유도체를 단리 정제하는 공정

을 포함하는 제조 방법에 의해 단리 정제된다.

이하, 각 공정에 대해서 더욱 설명한다. 또한, 이하의 각 공정에서는 얻어진 각 획분에 대해서 후술의 실시예에 기재된 바와 같은 방법으로 아스트로사이트 증식 활성시험을 행하고, 아스트로사이트 증식 활성을 갖는 성분이 얻어진 획분 중 어느 하나에 함유되어 있는 것을 확인하면서 단리 정제를 진행시킬 수 있다.

공정 (1)에서는 눈꽃동충하초의 열수 추출액을 건조시켜서 열수 추출물을 얻는다.

눈꽃동충하초는 일본, 대만, 중국, 네팔 등에 널리 분포되고, 나방의 번데기, 유충, 누에 번데기, 유충 등에 기생하여 양분을 섭취해서 증식하여 벌레의 시체로부터 담황색의 자실체를 발생한다. 본 발명의 환상 펩티드 유도체의 재료로서 사용되는 눈꽃동충하초는, 자생하는 것이라도 좋지만, 바람직하게는 숙주를 누에로 해서 인공재배된 것이다. 눈꽃동충하초는 시넨시스 동충하초와 비교해서 입수가 용이하기 때문에 제조 비용을 억제할수 있음과 아울러, 안정되게 환상 펩티드 유도체를 공급할 수 있다.

또한, 눈꽃동충하초의 숙주는 누에 번데기이여도 좋고, 누에 유충이여도 좋다. 또한, 누에 번데기는 생번데기이여도 좋고, 건조번데기여도 좋다. 건조번데기를 사용할 때에는 번데기로서의 형상을 유지한 채 사용해도 좋고, 건조번데기를 분말화해서 얻어지는 번데기 분말을 버섯류의 공지의 인공재배용 배지에 첨가해서 사용하는 것도 가능하다. 눈꽃동충하초의 추출물은 숙주로서 생번데기와 건조번데기를 사용했을 경우 중 어느 것에 있어서나, 후술의 실시예에 있어서의 아스트로사이트 증식 활성시험에 있어서 동등의 생리활성이 확인된다.

동충하초의 인공재배 방법은 여러가지 방법이 제안되어 있지만, 예를 들면 일본 특허 제3865735호에 기재된 방법, 즉 고치를 형성하기 전의 누에의 유충을 펄펄 끓이고나서 건조시키고, 이 누에 유충 건조분말 50∼90질량 퍼센트, 잔부가 콩류, 곡류, 해초류 또는 버섯류의 건조분말의 1종 또는 2종 이상으로 이루어지는 음식물 건조분말을 혼합하여 이것에 배양액을 첨가해서 혼련하고, 이것을 육성 상자의 저부에 깔아서 배지를 작성하고, 이 배지를 식균 주머니에 봉입하여 가열 멸균 처리한 후, 배지에 동충하초의 균을 접종하여 육성하는 방법을 예시할 수 있다.

그리고, 본 발명에서는, 예를 들면 상기 방법으로 재배된 눈꽃동충하초를 동결건조시킨 후, 분쇄해서 얻은 눈꽃동충하초 분말을 사용하는 것이 바람직하다. 여기에서, 본 발명에 사용되는 눈꽃동충하초 분말은 눈꽃동충하초의 자실체만을 분말화한 것이라도 좋지만, 바람직하게는 자실체 및 숙주(예를 들면 누에)를 포함해서 분말화한 것이다.

또한, 이 눈꽃동충하초 분말의 열수 추출 방법은 특별하게 한정되지 않지만, 예를 들면 이 눈꽃동충하초 분말에 물을 첨가하고, 오토클레이브 등에서 가열하는 고액 추출에 의해 열수 추출액을 얻을 수 있다. 가열 조건은 적당하게 설계할 수 있지만, 예를 들면 80∼120℃에서 약 60분 정도 가열함으로써 눈꽃동충하초 분말의 열수 추출액을 얻을 수 있다. 또한, 이 열수 추출액을 원심분리하고, 상청을 여과해서 여과액을 회수하고, 상기 추출 공정을 반복하여 행함으로써 눈꽃동충하초 분말로부터의 열수 추출액을 보다 높은 수량으로 얻을 수 있다. 그리고, 이 눈꽃동충하초 분말의 열수 추출액의 상청의 여과액을 회수하고, 동결건조함으로써 눈꽃동충하초 분말의 열수 추출물(PTE)을 얻을 수 있다.

공정 (2)에서는, 도 1에 나타내는 바와 같이, 상기 공정 (1)에서 얻어진 열수 추출물을 포함하는 수용액과 유기용매에 의한 2상 분배를 행해서 물 추출 획분과 유기용매 추출 획분으로 분리시켜 물 추출 획분의 건조체를 얻는다.

이 공정에서는, 물과 유기용매를 사용한 2상 분배(액액 추출)를 행함으로써 눈꽃동충하초 분말의 열수 추출물(PTE)을 물 추출 획분과 유기용매 추출 획분으로 분리시킬 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 눈꽃동충하초 분말의 열수 추출물을 물에 용해하고, 이 용액과 유기용매를 분액 깔대기에 넣어서 진탕시킴으로써 2개의 액의 계면에 있어서 물질교환을 발생시켜 수층에 포함되는 유기물 등을 제거할 수 있다. 이 경우, 유기용매로서는, 예를 들면 n-헥산, 아세트산 에틸, 아세톤 등의 유기용매를 예시할 수 있고, 그 중에서도 아세트산 에틸을 사용하는 것이 바람직하다.

그리고, 이러한 방법으로 얻어진 물 추출 획분을, 예를 들면 질소 풍건 처리나, 동결 건조 처리 등 행함으로써, 물 추출 획분의 건조체를 얻을 수 있다.

공정 (3)에서는, (3) 상기 공정 (2)에서 얻어진 물 추출 획분의 건조체를 포함하는 용액을 담체에 챠지한 후, 이 담체에 물과 유기용매의 혼합액을 접촉시켜서 고상 추출하고, 추출액을 건조시켜서 고상 추출물을 얻는다.

이 공정에서는, 종래 공지의 정제 방법을 채용할 수 있다. 예를 들면, 칼럼(실리카 겔) 크로마토그래피를 예시할 수 있고, 그 중에서도 역상 플래시 칼럼 크로마토그래피를 바람직하게 예시할 수 있다. 역상 플래시 칼럼 크로마토그래피는 눈이 가는 칼럼(실리카 겔)을 사용하고, 칼럼 내부에 압력을 가해서 전개를 행하기 때문에 정제능이 우수하다.

바람직한 형태로서는, 예를 들면 상기 공정 (2)에서 얻어진 물 추출 획분의 건조체를 포함하는 용액이 챠지(첨가)된 담체에, 물(초순수)을 흘려서 고상 추출하여 추출액을 얻고, 그 후에 물과 유기용매의 혼합액의 농도를 순차적으로 높이면서 복수회 추출하는 축차 추출을 행하는 방법을 예시할 수 있다. 상기 공정 (2)에서 얻어진 물 추출 획분의 건조체를 포함하는 용액이 챠지(첨가)된 담체에, 물(초순수)을 흘려서 고상 추출함으로써 물 추출 획분 중에 포함되는 당을 용출시킬 수 있고, 그 후의 물과 유기용매의 혼합액에 의한 고상 추출에 의한 유효성분의 추출을 보다 확실하게 행할 수 있다.

공정 (3)에 있어서, 혼합액 중의 유기용매의 농도는 20%∼80%인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 40%∼70%, 특히 바람직하게는 60% 정도이다. 혼합 용액 중의 유기용매의 농도가 이러한 범위임으로써 아스트로사이트 증식 활성을 갖는 성분을 확실하게 정제할 수 있다. 또한, 축차 추출을 행할 경우에는 물(초순수)을 흘려서 고상 추출한 후, 예를 들면 혼합액 중의 유기용매의 농도를 10%, 20%, 40%, 60% …로 순차적으로 높이면서 추출을 행함으로써 확실하게 유효성분을 추출할 수 있다. 이 경우, 혼합액 중의 유기용매의 농도가 40%∼70%, 특히 60% 정도의 추출액에 아스트로사이트 증식 활성을 갖는 성분이 포함된다.

또한, 공정 (3)에서 사용하는 유기용매는 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴, 아세톤, 디옥산, 테트라히드로푸란, 이소프로필알콜 등을 예시할 수 있고, 그 중에서도 메탄올, 에탄올을 바람직하게 사용할 수 있다. 메탄올, 에탄올을 사용함으로써 확실하게 유효성분을 추출할 수 있다.

또한, 공정 (3)을 거쳐서 얻어진 추출액은 적당하게 동결, 건조 등의 처리를 행해서 농축 건조시키고, 고형의 추출물로 하는 것이 가능하다. 이러한 고형의 추출물은 그대로도 이용하는 것이 가능하지만, 다음의 정제 공정에 제공함으로써 단일의 환상 펩티드 유도체 또는 그 염까지 정제하는 것이 가능하다.

공정 (4)에서는 상기 공정 (3)에서 얻어진 고상 추출물을 포함하는 용액을, 역상 칼럼을 사용한 고속 액체 크로마토그래피에 의해 분리하고, 환상 펩티드 유도체를 단리 정제한다.

이 공정에서는 종래 공지의 정제 방법을 채용할 수 있고, 사용하는 역상 칼럼으로서는 C₁₈, C₃₀ 칼럼 등을 예시할 수 있고, 그 중에서도 C₃₀ 칼럼을 바람직하게 예시할 수 있다. C₃₀ 칼럼은 담체의 표면에 탄소수 30의 수식기가 설치되어 있고, 담체의 극성이 낮기 때문에 저극성의 화합물의 분리능이 우수하다.

공정 (4)에서 사용하는 유기용매로서는, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴, 아세톤, 디옥산, 테트라히드로푸란, 이소프로필알콜 등을 예시할 수 있고, 그 중에서도, 고극성 용매인 메탄올, 에탄올을 바람직하게 사용할 수 있다. 메탄올, 아세토니트릴을 사용함으로써 확실하게 유효성분을 추출할 수 있다.

또한, 공정 (4)에서 사용하는 수계의 용리액으로서는 MQ, 2탄산 디에틸 완충액 등을 예시할 수 있다.

도 2는 후술의 본 발명의 실시예에서의 눈꽃동충하초로부터의 단리 정제 공정을 나타낸 도면이다. 도 2에 나타내는 바와 같이, 공정 (1)에서 (4)를 거침으로써, 예를 들면 도 3에 나타내는 바와 같은 후술의 실시예에 있어서 얻어진 본 발명의 환상 펩티드 유도체를 함유하는 피크(F-3-10-4-5-3)를 분취할 수 있다.

실시예에서의, 이 F-3-10-4-5-3 획분에 대해서는, 후술의 실시예에 기재된 바와 같은 방법으로 NMR 및 MS 해석을 행한 결과, 얻어진 환상 펩티드 유도체의 구조는 다음의 식(2)로 나타내어지는 것으로 결정된다.

이 환상 펩티드 유도체는, 다음 식(3)으로 나타내어지는 N-메틸-β히드록시 도파, 발린, β-히드록시류신, 글루탐산의 4종의 아미노산으로 이루어지는 펩티드가 환상 구조를 취하고 있다.

NMR 해석과 MS 해석의 결과, 이 환상 펩티드 유도체는 분자량이 566.2588에서 수용성의 환상 펩티드 유도체인 것이 밝혀지고 있다. 또한, 이 환상 펩티드 유도체의 구조에 대해서 화학물질의 화학구조 데이터베이스인 Scifinder를 이용하여 검색을 행한 결과 신규화합물인 것이 확인되어 있다.

본 발명의 환상 펩티드 유도체 또는 그 염은 의약 조성물의 유효성분으로서 사용하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명의 환상 펩티드 유도체 또는 그 염은 식품 조성물에 함유시키는 것이 가능하다.

in vivo 또는 in vitro에 있어서, 본 발명의 환상 펩티드 유도체 또는 그 염을 뇌세포에 작용시킴으로써 아스트로사이트를 증식시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 환상 펩티드 유도체 또는 그 염은, 각종의 질환이나 장해의 치료, 예방 등에 이용할 수 있다.

아스트로사이트는 인간의 뇌의 전체 세포의 약 반수를 차지하기 때문에 본 발명의 환상 펩티드 유도체 또는 그 염은, 예를 들면 뇌좌상 등의 치료약으로서 이용할 수 있다. 또한, 아스트로사이트는 신경회로 형성 기능 등을 갖기 때문에, 본 발명의 환상 펩티드 유도체 또는 그 염은 인지기능 장해를 야기하는 뇌질환, 예를 들면 알츠하이머병, 파킨슨병 등의 치료약으로서 이용할 수 있다. 또한, 아스트로사이트는 기억 형성에 관여하고 있기 때문에, 본 발명의 환상 펩티드 유도체 또는 그 염은 공간 패턴이나 정보의 보충 등의 기억 능력이나 학습 능력의 향상을 위해서 이용할 수 있다. 그리고 또한 통합실조증이나 쌍극성장해, 우울증 등의 정신질환에 있어서 아스트로사이트 수의 감소가 공통되어서 보여지는 것으로부터(비특허문헌 28), 본 발명의 환상 펩티드 유도체 또는 그 염은 이들 정신질환의 치료약으로서도 이용할 수 있다.

본 발명의 환상 펩티드 유도체 또는 그 염은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다.

경구 투여의 경우, 예를 들면 정제, 환제, 분제, 트로키제, 분포포장, 오블라트제, 엘릭시르제, 현탁제, 유제, 액제, 시럽, 에어로졸제, 및 무균포장 분제 등의 형태를 취할 수 있다. 이 경우, 첨가제로서 관용의 부형제, 습윤제, 유화제, 분산제, 보존제, 감미제, 방향제 등도 적당하게 첨가할 수 있다. 예를 들면 유당, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨 전분, 아라비아 고무, 인산 칼슘, 알긴산염, 트래거캔스, 젤라틴, 규산 칼슘, 미정 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 및 메틸셀룰로오스 등이 예시된다. 경구 투여할 경우, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 투여 대상자의 연령, 체중 등을 고려해서 적당하게 결정할 수 있다. 또한, 본 발명의 환상 펩티드 유도체는 의약품 뿐만 아니라 건강보조 식품 등에 이용할 수도 있다.

또한, 비경구투여의 경우에는 정맥내 투여, 피하 투여, 경피 흡수 등 외에, 뇌 내로의 직접 투여가 가능하다. 뇌 내로의 직접 투여의 경우, 치료, 개선해야 할 증상 등에 따라서 뇌 내의 영역을 적당하게 선택할 수 있다.

또한, 본 발명의 환상 펩티드 유도체 또는 그 염은 인간 뿐만 아니라 각종의 동물 등에도 투여할 수 있다. 또한, 여기에서 말하는 동물에는 인간을 포함하는 포유류 동물, 가금 등 식육으로 되는 조류 등이 포함된다. 포유 동물로서는 인간 이외에, 예를 들면 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 염소, 양 등의 실험동물, 돼지, 소, 말 등의 가축, 개, 고양이 등의 반려동물 등이 예시된다. 또한, 조류로서는, 예를 들면 닭, 메추리 등이 예시된다.

본 발명의 환상 펩티드 유도체는 in vitro의 실험계에 있어서 아스트로사이트 증식 활성을 나타내는 농도로서, 예를 들면 0.1μM 이상 50μM 이하, 바람직하게는 1μM 이상 50μM 이하, 보다 바람직하게는 1μM 이상 25μM 이하의 범위의 농도가 예시된다. 또한, in vivo에 있어서의 본 발명의 환상 펩티드 유도체의 아스트로사이트 증식제로서의 경구 섭취 농도로서는, 예를 들면 인간을 포함하는 포유 동물에 대하여 1일당 0.1μg/kg 이상 50μg/kg 이하, 바람직하게는 1μM 이상 50μM 이하의 범위, 보다 바람직하게는 1μM 이상 25μM 이하의 범위가 예시된다.

또한, 본 발명의 환상 펩티드 유도체 또는 그 염은 NGF 유전자 및 VGF 유전자의 발현량을 증가시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 환상 펩티드 유도체 또는 그 염은 뇌기능 개선제로서 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 환상 펩티드 유도체 또는 그 염은 모질 개선제로서 사용할 수 있다.

본 발명의 환상 펩티드 유도체 또는 그 염은 뛰어난 아스트로사이트 증식 효과를 갖고, 상기와 같은 각종의 용도에 유효 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 환상 펩티드 유도체 또는 그 염은 시넨시스 동충하초에 비해서 입수가 용이한 눈꽃동충하초를 재료로 하고 있기 때문에 비용면, 안정공급의 면에서 뛰어나다.

아스트로사이트를 포함하는 신경아교세포의 기능을 제어하거나, 신경아교세포에 강하게 발현되고 있는 분자군을 표적으로 하는 「글리아 신약개발」은, 금후의 신약개발 연구상 중요한 것이 시사되어 있다(비특허문헌 29). 본원 발명의 환상 펩티드 유도체 또는 그 염은 「글리아 신약개발」의 하나의 좋은 예가 될 가능성이 있다.

(실시예)

이하, 본 발명의 실시예에 대하여 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

I. 아스트로사이트 증식 활성을 갖는 성분의 단리 정제

<1> 단리 정제의 공정

도 2는 본 발명의 실시예에서의 눈꽃동충하초로부터의 단리 정제 공정을 나타낸 도면이다. 환상 펩티드 유도체의 단리 정제 공정은, (1) 눈꽃동충하초로부터의 열수 추출 공정, (2) 열수 추출물(PTE)의 2상 분배에 의한 분획 공정, (3) 역상 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의한 분획 공정, (4) 역상 고속 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의한 정제 공정의 4공정을 포함한다. 이들 (1)∼(4)의 각 공정은, 도 1의 개요도에 나타낸 공정 (1)∼(4)와 각각 대응하는 것이다.

〔A〕방법

이하에, 도 2에 따라 (1)∼(4)의 각 공정에 있어서의 조작을 상세히 설명한다.

(1) 눈꽃동충하초 분말로부터의 열수 추출

아스트로사이트 증식 활성을 갖는 화합물의 단리 정제와 구조결정에 사용한 누에 동충하초 눈꽃동충하초 분말은, 후쿠시마현의 토하쿠노산 기업조합으로부터 제공된 것을 사용했다.

눈꽃동충하초 분말(42g)에 10배량(w/v)(420ml)의 증류수(이하, MQ라 기재한다)를 첨가하고, 120℃, 20분간 오토클레이브에서 가열함으로써 열수 추출물을 얻었다. 그 후에 열수 추출물을 정성 여과지(No.2 ADVANTEC)로 여과해 회수(A액), 여과 후의 잔사에 다시 10배량(420ml)의 MQ를 첨가하고, 동 조건에서 2회째의 추출, 여과를 행했다(B액). A액과 B액은 혼합한 후에 다시 여과하고, 동결건조기(EYELA FDU-2100, 토쿄리카키키)로 동결건조하고, 얻은 분말을 눈꽃동충하초 열수 추출물(이하, PTE로 기재한다)로 하고, 사용할 때까지 -80℃의 초저온조에서 보존했다.

얻어진 PTE에 대해서는, 후술의 아스트로사이트 증식 활성시험에 의해 생리활성을 확인하고, PTE 속에 아스트로사이트 증식 활성을 갖는 성분이 함유되어 있는 것을 확인했다.

(2) PTE의 2상 분배에 의한 분획

상기 공정 (1)에서 얻어진 PTE 분말 6g에 50배량의 (w/v)(300ml)의 MQ를 첨가해 용해하고, 분액 깔대기 중에 옮겼다. 분액 깔대기를 진탕함으로써 PTE의 농도구배를 균일하게 하고, 거기에 아세트산 에틸 300ml를 첨가했다. 그 후에 진탕과 가스 제거를 10분간 반복한 후, 분액 깔대기를 60분간 정치하고, 2층으로 분리시켰다. 하층의 MQ층(MQ-1)을 회수하고, 아세트산 에틸층이 남은 분액 깔대기 중에 새롭게 증류수를 300ml 첨가하고, 같은 조작을 반복했다. 하층의 수층(MQ-2)과 상층의 아세트산 에틸층(EA-1)을 회수하고, 분액 깔대기에 첫번째에 회수한 MQ-1과 아세트산 에틸 300ml를 넣고, 다시 같은 조작을 반복했다. 하층의 MQ층(MQ-1)과 상층의 아세트산 에틸층(EA-2)을 회수했다. MQ-1과 MQ-2를 혼합해 2상 분배의 MQ 획분, EA-1과 EA-2를 혼합한 것을 2상 분배의 아세트산 에틸 획분으로 했다. 각각의 획분을 로터리 이배퍼레이터 일식(CCA-1100, DPE-1220, SB-1000, N-1000, EYELA DTU-20, ULVAC)과 동결건조기(EYELA FDU-2100)를 이용하여 농축 건조하고, 얻어진 분말을 2상 분배 MQ층 추출물 및 2상 분배 아세트산 에틸층 추출물로 하고, 사용할 때까지 -80℃의 초저온조에서 보존했다.

얻어진 2상 분배 MQ층 추출물 및 2상 분배 아세트산 에틸층 추출물에 대해서는, 후술의 아스트로사이트 증식 활성시험에 의해 생리활성을 확인하고, 2상 분배MQ층 추출물 중에 아스트로사이트 증식 활성을 갖는 성분이 함유되어 있는 것을 확인했다.

(3) 역상 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의한 분획

1) 역상 플래시 칼럼의 제작

상기 공정 (2)에서 얻어진 2상 분배 MQ층 추출물을 더욱 정제하기 위해서, 역상 플래시 칼럼 크로마토그래피를 행했다. 칼럼은 건식 충전법에 의해 제작했다. 담체인 실리카 겔(Wakosil 40C18, 와코쥰야쿠고교)을, 칼럼 체적이 160㎤로 되도록 플래시 크로마트관에 넣고, 메탄올에 의해 팽윤시킨 후, 최초의 전개 용매인 MQ를 500ml 크로마트관 상부까지 넣어, 펌프(HIBLOW AIR POMP, 형식 SPP-6EBS, 테크노 타카노리 가부시키가이샤) 가압에 의해 용매와 담체 내의 기포를 압출하여 치환했다.

2) 역상 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의한 분획

2상 분배 MQ층 추출물 3.5mg을 14ml의 MQ에 녹이고, 제작한 칼럼의 담체 표면에 챠지했다. 펌프 가압하면서 MQ를 500ml, 10% 메탄올(메탄올/MQ(1/9, v/v)), 20% 메탄올(메탄올/MQ(1/4, v/v)), 40% 메탄올(메탄올/MQ(2/3, v/v)), 60% 메탄올(메탄올/MQ(3/2, v/v)), 80% 메탄올(메탄올/MQ (4/1, v/v)), 100% 메탄올을 300ml순차적으로 흘렸다. 용출한 각각의 획분은 로터리 이배퍼레이터 일식(CCA-1100, DPE-1220, SB-1000, N-1000, EYELA DTU-20, ULVAC)과 동결건조기(EYELA FDU-2100) 를 이용하여 농축 건조했다. 얻어진 각 획분을, F1: MQ 추출 획분, F2: 10% 메탄올 추출 획분, F3: 20% 메탄올 추출 획분, F4: 40% 메탄올 추출 획분, F5: 60% 메탄올 추출 획분, F6: 80% 메탄올 추출 획분, F7: 100% 메탄올 추출 획분으로 하고, 사용할 때까지 -80℃의 초저온조에서 보존했다.

얻어진 F1부터 F7의 각 획분에 대해서는, 후술의 아스트로사이트 증식 활성시험에 의해 생리활성을 확인하고, F3 획분에 아스트로사이트 증식 활성을 갖는 성분이 함유되어 있는 것을 확인했다.

(4) 역상 고속 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의한 정제

상기 공정 (3)에서 얻어진 F3 획분에 대해서 역상 고속 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 사용하고, Develosil 칼럼을 사용한 Step 1∼3의 3단계의 정제와, HILIC 칼럼을 사용한 정제의 합계 4단계로 정제를 행했다.

1) 분석 조건

Step 1∼3에서 사용한 Develosil 칼럼에 의한 정제는 이하의 분석 조건에서 행했다.

(Step 1) 칼럼: Develosil RPAQUEOUS(20.0 ID×250㎜)(노무라 카가쿠), 칼럼 온도: 40℃, 이동상: MQ, 메탄올, 유속: 시간에 따라 변화, 타임 프로그램(%는 이동층 중의 메탄올의 비율을 나타낸다): (0min-60min) 1.0%, 5.0ml/min, isocratic→(60min-180min) 1.0%-30.4%, 2.0ml/min, gradient→(180min-212min) 30.4%-100.0%, 5.0ml/min, gradient→(212min-292min) 100.0%, 5.0ml/min, isocratic, 종료, 검출 파장: 254㎚.

(Step 2 및 3) 칼럼: Develosil RPAQUEOUS(20.0 ID×250㎜)(노무라 카가쿠), 칼럼 온도: 40℃, 이동상: 0.01% 아세트산을 포함하는 MQ, 0.01% 아세트산을 포함하는 메탄올, 유속: 5.0ml/min, 타임 프로그램(%는 이동층 중의 0.01% 아세트산을 포함하는 메탄올의 비율을 나타낸다): (0min-30min) 1.0%, isocratic→(30min-70min) 1.0%-40.0%, gradient→(70min-100min) 100.0%, isocratic, 종료, 검출 파장: 254㎚.

(HILIC) 칼럼: HILIC(4.6ID×250㎜)(COSMOSIL), 칼럼 온도: 28℃, 이동상A: 20mM Et₂NH-CO₂buffer(pH 7.0), 이동층B: CH₃CN(A:B=90:10) isocratic, 유속: 1.0ml/min, 검출 파장: 210㎚.

2) 분취 회수

상기 각 분석 조건에 의한 분리 정제에서는 크로마토그램의 파형을 확인하고, 피크마다 분취해서 회수했다. Step 1에서는 상기 공정 (3)에서 얻어진 F3 획분에 대해서, F-3-1로부터 F3-10까지 10개의 부분으로 분획하고, 후술의 아스트로사이트 증식 활성시험에 의해 생리활성을 확인하고, 아스트로사이트 증식 활성을 갖는 성분이 함유되어 있는 F-3-10 획분을 분취해서 회수했다. Step2에서는 상기 Step1에서 얻어진 F-3-10 획분에 대해서, F-3-10-1로부터 F3-10-4까지 4개의 부분으로 분획하고, 후술의 아스트로사이트 증식 활성시험에 의해 생리활성을 확인하고, 아스트로사이트 증식 활성을 갖는 성분이 함유되어 있는 F-3-10-4 획분을 분취해서 회수했다. Step3에서는 상기 Step2에서 얻어진 F-3-10-4 획분에 대해서, F-3-10-4-1부터 획분으로 F-3-10-4-9까지 9개 부분으로 분획해 후술의 아스트로사이트 증식 활성시험에 의해 생리활성을 확인하고, 아스트로사이트 증식 활성을 갖는 성분이 함유되어 있는 F-3-10-4-5 획분을 분취해서 회수했다. HILIC에서는 상기 Step3에서 얻어진 F-3-10-4-5 획분에 대해서 F-3-10-4-5-1부터 F-3-10-4-5-3까지 3개 부분으로 분획하고, 후술의 아스트로사이트 증식 활성시험에 의해 생리활성을 확인하고, 아스트로사이트 증식 활성을 갖는 성분이 함유되어 있는 F-3-10-4-5-3 획분을 분취해서 회수했다. 회수한 각 획분은 로터리 이배퍼레이터 일식(CCA-1100, DPE-1220, SB-1000, N-1000, EYELA DTU-20, ULVAC)과 동결건조기(EYELA FDU-2100)를 이용하여 농축 건조하고, 최종 정제물을 디에틸아민염으로서 얻었다.

얻어진 최종 정제물에 대해서는, 후술의 아스트로사이트 증식 활성시험에 의해 생리활성을 확인하고, 최종 정제물 중의 도 3에 나타낸 F3-10-4-5-3 획분에 아스트로사이트 증식 활성을 갖는 성분이 함유되어 있는 것을 확인했다.

〔B〕 결과

이상 상세하게 설명한 바와 같이, 누에 동충하초 눈꽃동충하초 건조분말 42g을 추출 재료로 해서 7단계의 공정(열수 추출, 2상 분배, 역상 플래시 크로마토그래피, C30RPAQUEOUS 칼럼을 사용한 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)의 3회의 반복(Step 1∼3), HILIC 칼럼을 사용한 HPLC)을 거친 결과, 상기와 같이 도 3에 나타낸 바와 같이 최종 단계의 HPLC에서 분리한 F3-10-4-5-1부터 F3-10-4-5-3의 3개의 획분 중, 현저한 아스트로사이트 증식 활성을 갖는 성분으로서 F3-10-4-5-3 획분이 얻어졌다. 상기 7단계의 각 정제 공정에 있어서의 추출물의 수율(%)을 표 1에 나타낸다.

단리 정제물의 수량(收量)은 1.2mg이며, 그 수율은 0.03%이었다. 또한, 각 공정에 있어서의 생물활성 검정에 있어서는 이하의 아스트로사이트 증식 활성을 지표로 해서 행했다.

<2> 아스트로사이트 증식 활성시험

1) 공시 재료

임신 ICR ♀마우스를 니혼 SLC 가부시키가이샤로부터 구입하고, 생후 24∼48시간의 신생아를 실험에 사용했다.

2) 신생아 마우스 대뇌신경세포 초대배양

ICR 마우스 신생아(생후 24∼48시간)를 70% 에탄올에서 충분하게 소독한 후, 세포배양용 100㎜ dish(직경 100㎜, Orange Scientific) 내의 PBS(-) 30ml에 담그고, 클린벤치 내에 운반하여 넣었다. 이 마우스 신생아를 핀셋을 이용하여 경추탈구하고, 안락사시켰다. 마우스 신생아를 개두하여 뇌 전체를 적출하고, 얻어진 뇌를 고글루코오스 둘베코변법 이글배지(HG-D-MEM, 와코쥰야쿠) 15ml가 들어간 세포배양용 100㎜ dish에 옮기고, 핀셋을 이용하여 배지 중에서 후구, 정중융기, 수막을 제거해 해마를 포함하는 대뇌만으로 했다. 이어서, 얻어진 대뇌를 10ml의 HG-D-MEM이 들어간 세포배양용 100㎜ dish에 옮기고, 메스를 이용하여 1㎟ 이하로 되도록 잘게 잘랐다. 자른 대뇌를 배지와 함께 50ml 코니칼 튜브(TPP)에 옮기고, 2분간 정치한 후 상청을 제거했다. 이어서, 자른 대뇌에 4ml의 새로운 HG-D-MEM을 첨가하고, 또한 2.5% 트립신(SIGMA) 400μl, 1% DNase I(SIGMA) 40μl를 첨가한 후에 37℃ 워터 배스에서, 때때로 교반하면서 10분간 인큐베이트했다. 이어서, 자른 대뇌에 HG-D-MEM(10% FBS)을 10ml 첨가하고, 트립신의 반응을 정지시킨 후에 원심분리기(H-9R, 코쿠산)로 1,000×g으로 3분간 원심분리했다. 전동 피펫터로 상청을 빨아들이고, 침전되어 있는 세포덩어리에 HG-D-MEM(10% FBS)을 10ml 첨가하여 멸균 피펫으로 세포덩어리가 보이지 않아질 때까지 수회 피펫팅했다. 이 세포 분산액으로부터 여분인 세포덩어리를 제거하기 위해서, 세포 분산액을 셀 스트레이너(구멍지름 100㎛, BD Falcon^TM)에 통과시킨 후, 세포 계수판으로 셀 스트레이너를 통과한 세포 분산액 중의 세포수를 계수하고, 세포수가 6.0×10⁵cells/ml로 되도록 HG-D-MEM(10% FBS)로 조정했다. 세포수를 조정 후, Poly-D-Lysine Cellware 100㎜ Dish(PDL 100㎜ dish, BD Falcon^TM)에 7ml씩 세포 분산액을 뿌렸다. 파종 후 96시간 후에 아스피레이터로 배지를 한번 제거하고, PBS(-) 10ml로 PDL 100㎜ dish 내를 가볍게 세정하고, 7ml 의 HG-D-MEM을 새롭게 첨가하여 배지의 교환을 행했다. 이상의 방법과 이하의 아스트로사이트의 조정은 McCarthy and de Vellis(1980, 비특허문헌 30)의 방법에 준해서 행했다.

3) 아스트로사이트의 조정

배지 교환으로부터 72시간 후에 세포액을 파종한 PDL 100㎜ dish를 인큐베이터 내에서 꺼내고, 파라 필름을 이용하여 뚜껑을 밀폐하고, 3∼4dish를 겹쳐서 고정했다. 이것을 37℃, 100rpm, 20시간의 조건에서 바이오 셰이커(MULTI SHAKER MMS, INCUBATOR FMS/EYELA)에서 진탕 배양하고, 신경세포나 세포편, 죽은 세포 등을 유리시켰다. 이 때 PDL 100㎜ dish 내에는 뉴런 이외의 중추신경계에 있어서의 신경아교세포인 아스트로사이트만이 접착하고 있다(이하, 배양 아스트로사이트로 기재한다). 진탕 후, PDL 100㎜ dish를 클린벤치 내에 옮기고, 아스피레이터로 상청을 제거하고, PBS(-) 10ml로 세정하고, 파스퇴르 피펫으로 2.5% 트립신(SIGMA)을 1 ml 첨가해 인큐베이터 내에서 10분간 정치했다. PDL 100㎜ dish를 다시 클린벤치 내로 되돌리고, 둘베코변법 이글배지(D-MEM, 와코쥰야쿠)(10% FBS)를 10ml 첨가해, 트립신의 반응을 멈추고 세포액을 50ml 코니칼 튜브에 모았다. 그 후, 세포 계수판으로 세포수를 계수하고, 1.5×10⁵cells/ml로 되도록 D-MEM(10% FBS)으로 조정하고, 이 아스트로사이트 세포액을 PDL 100㎜ dish에 7ml씩 파종했다.

4) 배양 아스트로사이트의 계대

상기 3)에서 조정한 배양 아스트로사이트는 파종 후 72∼96시간마다 배지교환을 행해 2주간 배양했다. 조작은 상기의 실험에서의 배지교환과 같지만, 배지로서 D-MEM(10% FBS)을 사용했다. 14일 후, 바이오 셰이커에 의한 진탕배양은 행하지 않고, 그 후는 상기 3)의 조정 방법에 따라서 배양 아스트로사이트의 세포수를 조정하고, 계대를 행했다.

5) 활성시험

이와 같이 하여 얻어진 계대 후의 배양 아스트로사이트(2계대째)를 사용하여 상기와 같은 아스트로사이트 증식 활성시험을 행했다. 그 결과, 상기와 같이, 도 3에 나타내는 바와 같이 F3-10-4-5-3 획분이 아스트로사이트 증식 활성을 나타내는 성분을 함유하고 있는 것이 확인되었다.

6) 초대배양 아스트로사이트의 식별 시험과 얻어진 세포의 특성의 검토

초대배양 아스트로사이트 또는 2계대 아스트로사이트에 있어서, 신경세포 또는 신경아교세포 유래의 미크로글리아나 올리고덴드로사이트의 콘터미네이션의 가능성을 배제하기 위해서, 상기 각각의 세포에 특이적인 항체를 사용해서 면역조직 화학적인 해석을 행했다.

즉, 우선 2계대째 아스트로사이트를 사용하고, 상기 3)과 같은 순서로 세포농도가 3×10⁴cells/ml로 되도록 세포 현탁액을 조정했다. 배지로서는 LG-D-MEM(10% FBS)을 사용했다. 라미닌(SIGMA-Aldrich, 1μg/㎠ 배양 면적)과 피브로넥틴(SIGMA-Aldrich, 3μg/㎠ 배양 면적)으로 배양면을 코팅한 35㎜ 디시(BD Falcon)에, 조정한 배양 아스트로사이트의 세포 현탁액을 2ml/dish 파종하고, 37℃, 5.0% CO₂의 조건 하에서 인큐베이트해서 배양했다. 배양 개시부터 24시간 후, 아스트로사이트의 세포증식을 억제하기 위해서, 디시 내의 배지를 LG-D-MEM(0% FBS)으로 치환했다. 또한, 37℃, 5.0% CO₂의 조건 하에서 24시간 배양 후, 디시 내의 배지를 미리 환상 펩티드 유도체 농도가 25㎛로 되도록, 상기와 같은 단리 정제되어서 구조결정된 환상 펩티드 유도체를 용해한 LG-D-MEM(0% FBS)으로 치환하고, 아스트로사이트를 37℃, 5.0% CO₂의 조건 하에서 0시간 및 24시간 환상 펩티드 유도체에 폭로했다. 대조군으로서는 환상 펩티드 유도체를 첨가하고 있지 않은 LG-D-MEM(0% FBS)을 사용했다.

각 처리구의 디시로부터 모든 배지를 흡인 제거하고, 4% 파라포름알데히드(Wako)를 포함하는 PBS 용액을 첨가하고, 15분간 실온 진탕해서 세포를 고정했다. 이어서, 0.1% Triton(R) X-100(SIGMA-Aldrich)을 포함하는 PBS 용액을 첨가하고, 5분간 진탕해 침투 처리를 했다. 침투 처리 후에 Image-iT FX Signal Enhancer(life technologies)를 첨가하고, 1시간 실온에서 진탕해 블록킹 처리를 행했다.

이어서, 세포를 식별하기 위해서 블록킹 처리한 세포에 표 2에 나타내는 각각의 항체를 1차 항체로서 첨가하고, 1시간 실온에서 진탕했다. 1차 항체의 검출에는 형광색소로서 Alexa Fluor 488- 또는 Alexa Fluor 546-을 결합시킨 2차 항체(Invitrogen)를 사용하고, 2차 항체의 첨가 후 30분간 실온에서 진탕했다. 형광화상은 형광 현미경 IX71(Olympus)을 이용하여 관찰, 촬영했다. 관찰 결과를 표 3에 나타낸다.

표 3에 나타내는 바와 같이, 실시예에서 사용한 아스트로사이트는 미크로글리아 세포에 특이적인 Anti-NG2, 올리고덴드로사이트 세포에 특이적인 Anti-MBP, 그리고 신경세포에 특이적인 Anti-MAP2에는 네거티브한 반응이며, 글리아형 글루탐산 트랜스포터(EAAT2, 또는 GLT-1이라고 부르고 있다)에 대하여만 포지티브한 반응을 나타냈다. EAAT2는 중추신경계의 세포 중에서 아스트로사이트에만 발현되기 때문에, 뇌 유래의 배양 아스트로사이트는 99% 이상의 순도의 아스트로사이트로 구성되어 있는 것이 확인되었다.

II. 아스트로사이트 증식 활성을 갖는 성분의 화학구조의 결정

〔A〕방법

상기 아스트로사이트 증식 활성을 갖는 성분의 단리 정제 공정(4)에 있어서 최종적으로 단리 정제한 F3-10-4-5-3 획분을 분취해서 동결건조한 샘플을 사용하고, F3-10-4-5-3 획분의 화학구조를 NMR 및 MS 해석에 의해 결정했다. NMR 해석에는 Brucker Avance 600을 사용했다. MS 해석에는 JEOL JMS-AX500을 이용했다. 선광도는 JASCO P-1030 polarimeter with a sodium lamp(D line)를 이용하여 측정되었다.

〔B〕 결과

해석에 의해 상기 식(2)로 나타내어지는 환상 펩티드 유도체인 것이 동정 되었다. 그 ¹H-NMR에 의한 HMBC 해석의 결과를 도 4에 예시한다. 또한, 이 환상 펩티드 유도체의 ¹H-NMR의 스펙트럼을 도 5에 예시한다. 또한, 이 환상 펩티드 유도체의 ¹H-NMR의 각 피크의 화학 시프트에 관해서는, 표 4와 같고, ¹³C-NMR의 각 피크의 화학 시프트에 관해서는 표 5와 같다.

또한, MS 해석으로서 FAB-MS에 의한 해석을 행했다. 해석 조건 및 해석 결과는 이하와 같다.

MS: FAB negative, matrix: glycerol, HRMS(FAB)m/z(M-H)^-, calcd for [C₂₆H₃₇N₄O₁₀-H]^-565.2510, found 565.2512.

[α]^17.4 _D=-21.6^o(c=0.18, H₂O)

NMR 해석과 MS 해석의 결과, 본 발명의 아스트로사이트 증식 활성을 갖는 환상 펩티드 유도체는, 분자량이 566.2588에서 수용성의 신규의 환상 펩티드 유도체인 것이 밝혀졌다. 이 환상 펩티드 유도체의 구조에 대해서, 화학물질의 화학구조 데이터베이스인 Scifinder를 이용하여 검색을 행한 결과 신규화합물인 것을 알 수 있었다.

III. 신규 환상 펩티드 유도체의 기능 해석

<1> 배양 아스트로사이트 증식 활성의 기능 해석

1. 배양 아스트로사이트 증식 촉진 활성

〔A〕방법

2계대째 아스트로사이트를 사용하고, 아스트로사이트 증식 활성을 갖는 성분의 단리 정제 공정(4)과 같은 순서로, 세포농도 2.0×10⁵cells/ml가 되도록 세포 현탁액을 조정했다. 그 때, 배지는 D-MEM(10% FBS)을 사용했다. 조정한 배양 아스트로사이트의 세포 현탁액은 멀티피펫(Eppendorf)을 이용하여 세포배양용 96well 마이크로플레이트(Tissue Culture Treated Polystyrene/IWAKI)에, 100μl/well 파종하고, 37℃, 5.0% CO₂의 조건 하에서 인큐베이트했다. 24시간 후, 아스트로사이트의 세포증식을 억제하기 위해서 웰 내의 배지를 D-MEM(0% FBS)으로 치환했다. 또한, 24시간 후, 웰 내의 배지를 미리 각종 샘플을 용해시켜 둔 D-MEM(0% FBS)으로 치환하고, 아스트로사이트를 샘플에 24시간 폭로했다. 이 때, 컨트롤군에는 샘플을 첨가하고 있지 않은 D-MEM(0% FBS)을 사용했다. 샘플 폭로 후, 세포증식 ELISA, BrdU 발색 키트(Roche)를 사용하고, 키트의 프로토콜에 준해서 조작을 행하고, 흡광도의 측정에는 마이크로플레이트 리더(Multi-Detection Microplate Reader/DAINIPPON SUMITOMO PHARMA)를 이용하여 증식 촉진 활성 비교시험을 행했다. 또한, 본 실험에 있어서는 BrdU 표식 용액의 반응시간을 4시간, POD 표식 항BrdU 항체 반응액의 반응시간을 2시간, 기질액의 반응시간은 반응 정지액을 사용하지 않고 30분간으로 설정했다. 또한, 실험 전체를 통해서 각 순서에 있어서의 세포의 탈락을 막기 위해서 태핑은 행하지 않고, 배지나 시약의 제거는 전부 멀티피펫 을 이용하여 행했다.

〔B〕 결과

도 6에 나타내는 바와 같이, 환상 펩티드 유도체의 첨가 농도를 0.1, 1, 5, 10, 25 및 50μM로 변화시킨 결과, 아스트로사이트 증식 촉진 활성에는 농도의존성이 확인되었다.

2. 기존약과의 아스트로사이트 증식 활성의 비교 검토 시험

포지티브 컨트롤로서 사용한 조니사미드(Zonisamide)는 파킨슨병의 치료약으로서 사용되고 있다. 조니사미드의 기능의 하나로서 아스트로사이트 증식 활성이 나타내어져 있다(비특허문헌 34). 그래서, 환상 펩티드 유도체와 조니사미드의 아스트로사이트 증식 활성을 비교 검토했다. 또한, 기지의 인지증 치료약이며, 지금까지 아스트로사이트의 증식 활성이 보고되어 있지 않은, 염산 도네페질, 에세린 및 갈란타민에 대해서 아스트로사이트 증식 활성시험을 행하고, 본 발명의 환상 펩티드 유도체의 활성과의 비교를 행했다.

〔A〕방법

2계대째 아스트로사이트를 사용하고, 상기 1.의 아스트로사이트 증식 촉진 활성시험과 같은 순서로, 기존약의 아스트로사이트 증식 활성시험을 행했다. 조니사미드(Wako)는 MQ에 용해해서 100μM로 조제하고, 아리셉트(등록상표)(염산 도네페질, abcam), 에세린(SIGMA) 및 갈란타민(abcam)은 MQ에 용해해서 25μM로 조제해서 시험을 행했다.

〔B〕 결과

도 7에 나타내는 바와 같이, 대조구 및 100μM의 조니사미드 첨가구에 있어서는 아스트로사이트의 증식은 거의 확인되지 않았다. 한편, 25μM의 환상 펩티드 유도체 첨가구에 있어서는 대조구와 비교해서 약 12배의 아스트로사이트 증식이 확인되었다. 이 것으로부터, 환상 펩티드 유도체의 아스트로사이트 증식 활성은 조니사미드에 의한 아스트로사이트 증식 활성보다 현저한 것을 알 수 있다.

또한, 도 8 및 도 9에 나타내는 바와 같이, 현재 임상에 있어서 이용되고 있는 알츠하이머증 치료약인 염산 도네페질이나, 에세린 및 갈란타민을 아스트로사이트에 첨가해도, 현저한 아스트로사이트 증식 활성이 확인되지 않기 때문에 종래형의 알츠하이머증 치료약은 아스트로사이트의 증식에는 조금도 영향을 미치지 않는다고 생각된다. 그리고, 아스트로사이트 증식 활성은 환상 펩티드 유도체의 특이적인 기능으로 생각된다.

3. 환상 펩티드 유도체에 의한 아스트로사이트 특이적인 증식 활성의 확인 시험

환상 펩티드 유도체에 의한 아스트로사이트의 증식 촉진 활성이, 아스트로사이트만에 한정되는 특이적인 증식 활성인 것인지, 보편적인 세포 증식 활성에 의한 것인지의 여부에 대해서, 인간 피부 섬유아세포(NHDF), 인간 간암세포(HepG2)와 인간 백혈병세포(K562)를 이용하여 검토했다.

〔A〕방법

인간 피부 섬유아세포(NHDF), 인간 암세포(HepG2)와 인간 백혈병세포(K562),의 증식에 미치는 영향은 Yang 등(2007, 비특허문헌 33)의 방법에 준해서 측정했다. 96웰 플레이트에의 각 세포의 파종은, 인간 피부 섬유아세포는 2.5×10⁴cells/ml로, 인간 암세포와 인간 백혈병세포는 5×10⁴cells/ml로 조정한 세포 현탁액을 100μl 첨가함으로써 행했다. 상기 환상 펩티드 유도체는 PBS(-)에 녹여서 첨가하기 때문에 컨트롤로서 PBS(-)만을 첨가했다.

〔B〕 결과

도 10에 나타내는 바와 같이, 2.5μM과 25μM의 어느 농도에서도 환상 펩티드 유도체의 첨가에 의해 강한 세포증식 억제 활성이 확인되었다. 한편, NHDF 세포에 있어서는 25μM의 환상 펩티드 유도체를 첨가했을 경우에는 무첨가의 군보다 유의하게 증식이 억제되지만, 세포증식율은 80% 정도를 유지하고 있고, 정상세포에 대한 세포독성은 낮다고 생각된다. 따라서, 환상 펩티드 유도체에 의한 아스트로사이트 증식 작용은 보편적인 세포 증식 활성에 기인하는 것은 아니고, 아스트로사이트에 대한 특이적인 증식 활성인 것을 알 수 있었다.

<2> 아세틸콜린에스테라아제 저해 활성시험

기존의 알츠하이머증 치료약의 대부분은 신경전달물질인 아세틸콜린의 분해효소인 아세틸콜린에스테라아제의 저해 활성을 표적기구로 하고 있다. 즉, 알츠하이머증 치료약은 아세틸콜린에스테라아제를 저해함으로써 체내의 아세틸콜린 농도를 증가시킨다. 그래서, 대표적인 아세틸콜린에스테라아제(AChE) 저해제인 염산 도네페질(비특허문헌 31)과 본 발명의 환상 펩티드 유도체의 AChE 저해 활성의 비교 검토를 행했다.

〔A〕방법

아세틸콜린에스테라아제(AChE) 저해 활성은 Nair 등(비특허문헌 31)의 방법에 준해서 측정하고, 비교로서 사용한 염산 도네페질(abcam)의 농도는 Sugimoto 등(비특허문헌 32)을 참고로 결정했다.

〔B〕 결과

도 11에 나타내는 바와 같이, 10nM의 염산 도네페질에서는 40% 정도의 AChE 저해 활성이 확인되지만, 1000nM 농도의 환상 펩티드 유도체에서는 AChE 저해 활성이 전혀 확인되지 않았다.

이 결과로부터, 기존의 알츠하이머증 치료약인 염산 도네페질에는 AChE 저해 활성이 있지만, 아스트로사이트 증식 활성을 갖고 있지는 않은 것이 확인되었다. 한편, 본 발명의 환상 펩티드 유도체는 아스트로사이트 증식 활성을 갖지만, AChE 저해 활성은 갖지 않고 있는 것이 확인되었다. 따라서, 아스트로사이트 증식과 AChE 저해의 작용기서의 사이에는 동일한 작용기서는 존재하지 않고, 환상 펩티드 유도체는 아스트로사이트 증식이라고 하는 특이적인 작용을 발휘하고 있다고 생각된다.

<3> 환상 펩티드 유도체 첨가에 의한 아스트로사이트의 유전자 발현 활성화 작용의 해석

2계대째 아스트로사이트에 25μM의 환상 펩티드 유도체를 첨가하여, 대표적인 신경영양인자 NGF, GDNF, VFGF-A, BDNF, VGF의 유전자 발현에 미치는 영향을 경시적으로 검토했다.

〔A〕방법

2계대째 아스트로사이트의 세포 현탁액을, 세포농도가 3×10⁵cells/ml가 되도록 조정하고, 아스트로사이트를 25μM의 상기 환상 펩티드 유도체에 폭로하는 시간을 0, 1, 2, 4, 8, 12 및 24시간으로 한 것 이외에는, <6>과 같은 순서로 아스트로사이트를 배양했다. 대조군으로서는 환상 펩티드 유도체를 첨가하고 있지 않은 LG-D-MEM(0% FBS)을 사용했다.

상기 각 시간 환상 펩티드 유도체에 폭로한 아스트로사이트를 각각 회수하고, RNeasy Mini Kit(QIAGEN)를 이용하여 토털 RNA의 추출 및 정제를 행했다. 추출된 토털 RNA는 Nano Photometer(IMPLEN)를 이용하여 정량했다. 역전사 반응에는 GeneAmp PCR System 9600(PERKIN ELMER)을 사용하고, 500ng의 토털 RNA와 PrimeScript RT Master Mix(TaKaRa)를 37℃, 15분간 반응시켜서cDNA를 합성하고, 85℃, 5초간의 가열에 의해 반응을 정지했다.

합성한 cDNA를 주형으로 하고, 표 6에 기재된 시판의 각종 프라이머(TaKaRa)를 각각 사용하여 SYBR premix Ex TaqI(TaKaRa) 및 리얼타임 PCR 장치 Thermal Cycler Dice TP800(TaKaRa)에 의해 발현해석을 행했다.

표 6에 기재된 구체적인 시판의 프라이머로서는 이하의 것을 사용했다. NGF 유전자용의 프라이머로서 Mus musculus nerve growth factor(Ngf), transcript variant 1, mRNA(MA075785, TaKaRa)를 사용했다. GDNF 유전자용의 프라이머로서는 Mus musculus glial cell line derived neurotropphic factor(Gdnf), mRNA(MA102345, TaKaRa)를 사용했다. VEGF-A 유전자용의 프라이머로서는 Mus musculus vascular endothelial growth factor(Vegfa), transcript variant 1, mRNA(MA128545, TaKaRa)를 사용했다. BDNF 유전자용 프라이머로서는 Mus musculus brain derived neurotrophic factorfactor(Bdnf), transcript variant 2, mRNA(MA138332, TaKaRa)를 사용했다. VGF 유전자용의 프라이머로서는 Mus musculus VGF nerve growth factor inducible(Vgf), mRNA(MA157656, TaKaRa)를 사용했다.

각 타깃 유전자의 발현 레벨은 하우스키핑 유전자의 하나인 GAPDH를 내부표준으로 해서 보정한 후에 비교했다.

〔B〕 결과

그 결과는 도 12에 나타내는 바와 같이, NGF와 VGF의 유전자 발현이 환상 펩티드 유도체의 첨가 후 8시간에서 24시간까지 증가하고, 환상 펩티드 유도체의 첨가 전과 비교하여 통계상의 유의한 차(p<0.05)가 확인되었다.

파킨슨병 치료약의 하나이며, 도파민 아고니스트인 Ropinirole을 마우스의 아스트로사이트에 첨가하면, 신경영양인자 NGF, GDNF, BDNF 유전자가 활성화되는 것이 알려져 있다(비특허문헌 35). 또한, N-methyl-D-aspartate(NMDA) 리셉터의 안타고니스트로서 알려져 있는 ifenprodil은 뇌경색의 후유증이나 뇌출혈의 후유증에 따르는 현기증의 개선약으로서 사용되고 있다. 이 ifenprodil에 의해 마우스 아스트로사이트의 NGF, BDNF, GDNF 유전자 활성화와 각각의 단백질 생산이 확인되어 있다(비특허문헌 36). 또한, 항우울제인 serotonin은 VGF를 활성화해 해마 뉴런에 있어서 시냅스 활동을 증대하고, 해마 치상회의 신경형성을 촉진하고 있는 것이 밝혀져 있다(비특허문헌 37).

따라서, 환상 펩티드 유도체는 아스트로사이트의 NGF와 VGF의 유전자 활성화를 유도하기 때문에 파킨슨병·뇌기능 장해에 의한 현기증약·항정신약을 포함한 각종의 뇌기능 질병의 치료약으로서 적용하는 것도 가능하다.

<4> 환상 펩티드 유도체의 경구투여에 의한 노화촉진 모델 마우스의 학습 기억능 개선시험

1) 마우스

환상 펩티드 유도체의 in vivo 시험에 사용하는 마우스로서, 노화에 따르는 초기의 알츠하이머병의 인지증 모델 동물로서 사용되는 노화촉진 모델 마우스 SAMP8을 선정하고, 그 컨트롤로서 정상 노화 마우스 SAMR1을 선정했다.

생후 19주령의 SAMR1 및 SAMP8 및 수컷 마우스를 니혼 SLC 가부시키가이샤로부터 구입하고, 정상 노화 마우스군(SAMR1), 노화촉진 모델 마우스군(SAMP8), 포지티브 컨트롤인 {P8+염산 도네페질 1250μg/kg/day}군, 시험구인 {P8+환상 펩티드 유도체 2.5μg/kg/day}군 및 {P8+환상 펩티드 유도체 25μg/kg/day}군의 5군으로 나누고, 환경 제어된 방{실온: 23±2℃, 명암 주기: 조명 12시간(조명 점등시간: 07:00∼19:00), 소등 12시간}에서 1케이지에 1마리씩 개별 사육했다. 실험은 항온항습실(기온 23±2℃, 습도 50±10%)에서 13:00부터 18:00의 시간대에 실시했다. 10일간의 순화기간의 후, 전시험 기간 동안 모든 마우스는 표준식(MEQ, 오리엔탈코우보사)을 주어서 매일 체중을 기록했다. 물과 먹이, 배설량(깔개의 중량)을 주에 2회 계측했다. 마우스의 개체 식별은, 케이지 번호에 의해 행했다. 본 연구는 동물애호법 및 실험동물의 케어 및 사용에 관한 가이드라인에 따름과 아울러, 이와테대학 동물실험 위원회의 인가를 받고, 행했다.

2) 마우스에의 환상 펩티드 및 약물의 경구투여

상기 5군으로 나눈 마우스에 대하여 이하의 처리를 행했다.

(1) 정상 노화 마우스군: 위 존데를 이용하여 0.9% 생리식염수를 5주간 투여했다.

(2) 노화촉진 모델 마우스군: 위 존데를 이용하여 0.9% 생리식염수를 5주간 투여했다. 또한, 모든 행동 실험이 끝날 때까지 경구투여를 계속하고, 전체 8주간, 경구투여를 행했다.

(3) {P8+염산 도네페질 1250μg/kg/day}군: 포지티브 컨트롤로서 염산 도네페질(가부시키가이샤 산요카가쿠 켄큐쇼)을 MQ에 용해하고, 농도 1250μg/kg(체중)으로 조제하여 SAMP8 마우스에 대하여 위 존데를 이용하여 5주간 경구투여했다. 이 농도는 매일 측정한 체중을 바탕으로 정확하게 산출했다. 또한, 모든 행동 실험이 끝날 때까지 경구투여를 계속하고, 전체 8주간 경구투여를 행했다.

(4) {P8+환상 펩티드 유도체 2.5μg/kg/day}군: 시험구로서 상기 환상 펩티드 유도체를 MQ에 용해하고, 농도 2.5μg/kg(체중)으로 조제하여 SAMP8 마우스에 대하여 위 존데를 이용하여 5주간 경구투여했다. 이 농도는 매일 측정한 체중을 바탕으로 정확하게 산출했다. 또한, 모든 행동 실험이 끝날 때까지 경구투여를 계속하고, 전체 8주간 경구투여를 행했다.

(5) {P8+환상 펩티드 유도체 25μg/kg/day}군: 시험구로서 상기 환상 펩티드 유도체를 MQ에 용해하고, 농도 25μg/kg(체중)으로 조제해서(비특허문헌 39), SAMP8 마우스에 대하여 위 존데를 이용하여 5주간 경구투여했다. 이 농도는 매일 측정한 체중을 바탕으로 정확하게 산출했다. 또한, 모든 행동 실험이 끝날 때까지 경구투여를 계속하고, 전체 8주간 경구투여를 행했다.

또한, 모든 행동 실험이 끝날 때까지 5군의 마우스 모두에 표준식과 물을 주었다.

3) 스텝스루형 수동적 회피실험

(1) 장치

장치(오하라이카산교 가부시키가이샤제)는 역사다리꼴형의 명실과 암실(명실: 상면 100×130㎜, 저면 42×130㎜, 높이 90㎜, 암실: 상면 100×160㎜, 저면 42×160㎜, 높이 90㎜)로 구성되어 있다. 양쪽 실의 바닥은，모두 직경 2.0㎜의 스테인레스 봉이 6.0㎜ 간격으로 늘어서 있고, 암실의 바닥만이 통전된다. 양쪽 실은 실험자가 상하로 자유롭게 개폐할 수 있는 칸막이판으로 칸막이되어 있다. 획득 시행에 있어서는, 백색형광등(15W, 400룩스)으로 비춘 명실에 마우스를 넣은 후에, 칸막이판을 열어서 시험을 개시했다. 또한, 암실 내의 입구의 좌우에는 마우스의 입실을 검지하기 위한 적외선 센서가 구비되고, 이 적외선 센서가 검출한 시그날을 입실 시간의 계측이나 전기자극 발생 트리거로서 사용했다.

(2) 순서

스텝스루형 수동적 회피실험의 순서에 대해서는, Tsushima et al.(비특허문헌 38)의 기재에 따라서 행했다. 본실험의 앞에 마우스의 이상개체를 선별하는 것을 목적으로 해서, 이전획득 시행을 행했다. 이전획득 시행에서는 칸막이 도어를 연 채 마우스를 명실에 넣고, 암실에 들어갈 때까지의 시간을 측정했다. 스텝스루형 수동적 회피실험은 밝은 장소보다 어두운 장소를 좋아한다고 하는 마우스의 부의 주행습성을 이용한 것이다. 이 때문에, 이전획득 시행에 있어서 명실에 넣어진 마우스가 60초 이상 명실에 체류하는 것 같으면 이상개체라고 판단하고, 이하의 실험에는 사용하지 않았다.

실험 1일째에 이전획득 시행을 행하고, 그 후에 획득 시행을 행했다. 획득 시행에 있어서는 칸막이 도어를 닫은 상태에서 마우스를 명실에 넣고, 30초 후에 칸막이 도어를 열고, 마우스가 암실에 들어갈 때까지의 시간(반응잠시)을 측정했다. 마우스의 뒷발이 암실에 들어간 시점, 또는 암실 내의 적외선 센서에 반응한 시점에서 칸막이 도어를 닫고, 마우스가 암실에 들어가고나서 2초 후에 0.3mA의 전기자극을 4초간 주었다.

실험 2일째(획득 시행으로부터 24시간 후)에는 재생 시행을 행했다. 재생 시행에서는 획득 시행과 달리 전기자극을 주지 않는 것 이외에는 획득 시행과 같은 조작을 행했다. 반응잠시는 최대 300초로 해서 계측했다.

(3) 결과

도 13에 나타내는 바와 같이, 수동적 회피실험에서는 재생 시행에 있어서 정상 노화 마우스(SAMR1)와 노화촉진 모델 마우스(SAMP8)의 반응잠시를 비교하면, 노화촉진 모델 마우스에서는 반응잠시가 유의하게 짧고, 문맥 학습능이 낮았다(p<0.05). 또한, 아무것도 투여하지 않은 노화촉진 모델 마우스와, 염산 도네페질을 투여한 노화촉진 모델 마우스의 반응잠시를 비교하면, 염산 도네페질을 투여한 노화촉진 모델 마우스에서는 아무것도 투여하지 않은 노화촉진 모델 마우스보다 반응잠시가 유의하게 짧고, 문맥 학습능이 낮았다(p<0.05). 한편, 환상 펩티드 유도체를 2.5μg/kg/day 및 25μg/kg/day 투여한 노화촉진 모델 마우스에서는 문맥 학습능이 정상 노화 마우스 레벨까지 회복하는 것이 확인되었다.

이상의 것으로부터, 노화촉진 모델 마우스에 본 발명의 환상 펩티드 유도체를 경구투여함으로써 기지의 인지증 치료약인 염산 도네페질보다 분명하게 문맥 학습능이 개선되는 것이 확인되었다.

4) 모리스 수중미로실험

(1) 장치 및 그 세팅

장치(오바라이카산교 가부시키가이샤제) 및 그 세팅은 이하에 기재하는 바와 같다. 우선, 원통형 풀(직경 100㎝, 깊이 30㎝)을 바닥 위 80㎝에 셋트했다. 이어서, 이 풀에 깊이 20㎝까지 물(수온 25±1℃)을 넣고, 투명한 플랫폼(직경 10㎝, 높이 19㎝)이 수면 아래 1㎝에 가라앉도록 셋트했다. 이어서, 플랫폼이 수영 중의 마우스에게 보이지 않도록, 시판의 백색 포스터 컬러로 풀의 물을 백탁시켜, 흑백 CCD 카메라를 풀의 대략 중앙의 수면의 바로 위 100㎝의 위치에 설치하고, 모든 사분면을 커버하는 사진을 흑백 CCD 카메라에 의해 자동촬영 및 자동기록했다. 카메라는 컴퓨터와 연동하고 있고, 마우스의 수영 궤적은 0.5초 간격으로 컴퓨터에 보존되었다. 수영 궤적의 기록과 화상해석은 NIH(The U.S. National Institute of Health)에 의해 개발되어 공개되어 있는 NIH Image를 바탕으로 한 소프트웨어, Image WMH 2.08과 Image WM 2.12(오바라이카산교 가부시키가이샤제)를 사용했다.

(2) 순서

모리스 수중미로실험의 순서에 대해서는 Tsushima et al.(비특허문헌 38)의 방법에 따랐다. 실험은 9일간, 매일 동 시각부터 개시했다. 1일째에는 마우스를 풀에 친숙해지게 하기 위해서 각각의 마우스를 1회씩 1분간 헤엄치게 했다. 그 후, 플랫폼에 높이 10㎝의 마크를 셋팅하고 마우스에 플랫폼의 존재를 인식시켰다. 또한, 마우스를 풀에 넣을 때, 컴퓨터에 지시된 마우스 투입 지점으로부터 풀의 벽방향으로 입수시켜, 실험자는 신속하게 마우스로부터 보이지 않는 위치로 퇴피했다. 마우스가 60초 이내에 플랫폼에 도달했을 경우, 마우스를 플랫폼 위에 15초간 안치한 후에 구출했다. 마우스가 60초간의 수영에서 플랫폼에 도달할 수 없었을 경우, 실험자의 손으로 마우스를 플랫폼 위로 이동시키고, 플랫폼 위에 15초간 안치한 후에 구출했다.

2∼8일째에는 마우스에 플랫폼의 위치를 기억시키는 트레이닝을 행했다. 트레이닝은 마우스 1마리에 대해 연속해서 1일에 4회 연속으로 행했다. 트레이닝의 방법은 1일째의 조작과 마찬가지로 행하고, 플랫폼에 도달한 시간을 기록했다. 또한, 마우스가 60초간의 수영에서 플랫폼에 도달할 수 없었을 경우, 실험자의 손으로 마우스를 플랫폼 위로 이동시키고, 플랫폼 위에 15초간 안치한 후에 구출하고, 도달 시간을 60초로서 기록했다.

9일째에는 프로브 테스트를 행했다. 프로브 테스트는 풀로부터 플랫폼을 제거하고, 마우스를 60초간 헤엄치게 하고, 각 사분면(원형의 풀의 사분원)의 각 도메인 내에서의 체재율(체재시간)을 측정했다. 또한, 프로브 테스트는 마우스 1마리에 대해 1회씩 행했다.

(3) 결과

도 14에 나타내는 바와 같이, 실험 2∼8일째에 플랫폼이 설치되어 있던 사분면 1에 있어서의 마우스 체재율(%)의 값으로부터, 본 발명의 환상 펩티드 유도체를 투여함으로써 공간 학습능이 현저하게 회복되는 것이 확인되었다. 즉, 정상 노화 마우스와 노화촉진 모델 마우스를 비교했을 경우, 노화촉진 모델 마우스에서는 사분면 1에 있어서의 마우스 체재율(%)의 값이 유의하게 낮았다(p<0.05). 한편, 노화촉진 모델 마우스와 환상 펩티드 유도체를 25μg/kg/day 투여한 노화촉진 모델 마우스를 비교하면, 환상 펩티드 유도체를 25μg/kg/day 투여한 노화촉진 모델 마우스에서는 공간 학습능이 유의하게 회복되어 있는 것을 알 수 있었다(p<0.05).

이상으로부터, 노화촉진 모델 마우스에 환상 펩티드 유도체를 경구투여함으로써 기지의 인지증 치료약인 염산 도네페질보다 공간 학습능이 분명하게 개선되는 것이 확인되었다.

<5> 환상 펩티드 유도체의 경구투여에 의한 노화촉진 모델 마우스의 모발 안티에이징 효과

아스트로사이트의 신경보호 작용으로서 신경세포에의 에너지 공급, 혈액뇌관문(BBB) 형성, 흥분성 아미노산의 도입능, 항산화 방어, 신경줄기세포에의 탈분화 등의 다기능성이 밝혀져 있다(비특허문헌 35, 36).

그래서, 환상 펩티드 유도체에 의한 아스트로사이트 증식이 인지기능의 개선이나, 학습 기억능의 개선 이외에도, in vivo 시험에 있어서의 효과의 다기능성을 기대할 수 있다. 특히, 아스트로사이트 유래의 시그널에 의해서 피부 진피 줄기세포로부터 뉴런 형성으로 유도할 수 있는 것이 알려져 있고(비특허문헌 37), 아스트로사이트와 진피 줄기세포의 사이에서 분자 시그널의 개재를 거친 상호작용이 생각된다.

발명자들은 지금까지 노화촉진 모델 마우스(SAMP8)를 사용해서 체모 및 모발의 안티에이징 효과에 대해서 해석해 왔기 때문에(비특허문헌 40), 환상 펩티드 유도체를 투여한 노화촉진 모델 마우스에 대해서도 정동마찰 측정기와 주사형 프로브 현미경(scanning probe microscope ; SPM)을 사용해서 체모 및 모발의 안티에이징 효과에 대해서 해석했다.

1) 마찰계수 측정시험

동물의 모발 및 체모의 마찰계수는 모발 및 체모의 표면에 존재하는 비늘상의 조직인 큐티클의 상태와 밀접한 관계에 있고, 모발 및 체모의 큐티클의 손상이 클수록 마찰계수(Coefficient of friction; COF)의 값도 크다고 생각할 수 있다(비특허문헌 40). 또한, 큐티클의 손상이 크면 모발 및 체모의 수분이나 영양분이 큐티클의 손상부로부터 유실되는 것이 알려져 있다.

(1) 장치

장치는 정동마찰 측정기 핸디 러브 테스터 TL701(가부시키가이샤 트리니티라보제)을 사용했다. 본기는 측정시에 동물이나 인간의 모발 및 체모를 절단해서 측정 샘플로 할 필요가 없고, 모발 및 체모가 피부로부터 나 있는 상태를 그대로 측정할 수 있는 정동마찰 측정기이다. 즉, 본 기계는 피부나 복잡한 곡면을 갖는 재료 표면의 마찰 측정도 가능하다.

(2) 방법

정동마찰 측정기의 접촉자를, 마우스의 이마 부분의 체모에 압박하여, 약 1N의 하중을 가한 채 약 10초간 걸쳐서 마우스의 이마로부터 양쪽 귀의 사이를 지나서 목부까지 이동시켜서 체모 표면의 마찰계수(COF)를 측정했다. 마찰계수(COF)는 마우스 1마리에 대해서 5∼10회 계측하고, 그 평균값을 산출했다.

2) 주사형 프로브 현미경에 의한 노화 마우스 체모의 관찰 시험

(1) 장치

장치는 태핑 모드 주사형 프로브 현미경(SPM: SPA400, 히타치 하이테크 사이언스)을 사용했다.

(2) 방법

시료로서 핀셋을 이용하여 마우스의 두경부의 체모를 근원으로부터 뽑아서 채취하고, 상기 태핑 모드 주사형 프로브 현미경을 사용하여 관찰했다.

3) 결과

도 15에 나타내는 바와 같이, 정동마찰 측정기를 이용하여 측정한 마우스 체모의 마찰계수(COF)를 X축, SPM을 이용하여 측정한 마우스 체모 표면의 손상면적비를 Y축에 취하고, 그것들의 상관관계를 평가했다. 노화촉진 모델 마우스 체모의 마찰계수(COF)와 손상면적비의 수치는 높고, 이들 2개의 지표는 정상 노화 마우스의 체모에서는 모두 낮았다. 이 것으로부터, 노화촉진 모델 마우스의 하나의 특성으로서 체모도 노화하고, 그 모질이 열화되어 있는 것이 생각된다. 한편, 기지의 인지증 치료약인 염산 도네페질을 경구투여한 노화촉진 모델 마우스에서는, 마우스 체모 표면의 손상면적비는 정상 노화 마우스와 같은 레벨이었지만, 마우스 체모의 마찰계수는 노화촉진 모델 마우스와 동 레벨인 채이며, 현저한 회복은 확인되지 않았다.

이것에 대하여, 노화촉진 모델 마우스에 2.5μg/kg/day 및 25μg/kg/day의 환상 펩티드 유도체를 경구투여하면, 마우스 체모 표면의 마찰계수(COF) 및 손상면적비의 양쪽이 정상 노화 마우스와 같은 레벨로까지 저하하고, 모질이 개선되는 것이 밝혀졌다.

이상의 것으로부터, 본원 발명의 환상 펩티드 유도체는 모발의 안티에이징에까지 효과를 발휘할 가능성이 생각된다.

<6> 누에 동충하초 눈꽃동충하초, 및 다른 동충하초나 배지로서 사용하고 있는 누에 번데기 그 자체에 있어서의 아스트로사이트 증식 활성의 비교

대표적인 동충하초인 티베트산 시넨시스 동충하초에 관해서는 많은 생리활성물질이 동정되어 있다(비특허문헌 1, 2). 또한, 한국, 중국에서는 누에 동충하초 눈꽃동충하초도 판매되고 있지만, 아스트로사이트 증식 활성에 관한 지견은 눈에 띄지 않으므로 다시 여기에서 비교를 행했다.

1) 재료

비교를 위한 재료로서 티베트산 시넨시스 동충하초 건조분말, 티베트산 시넨시스 동충하초의 탱크 배양액 건조분말, 한국산 누에 동충하초 눈꽃동충하초 건조분말, 배지가 되는 누에 건조번데기만의 4샘플과, 본 발명의 환상 펩티드 유도체를 함유하는 누에 동충하초 눈꽃동충하초 2샘플(본 실시예에서 사용한 누에 건조번데기를 숙주로 해서 배양한 누에 동충하초 눈꽃동충하초와, 누에 생번데기를 숙주로 해서 배양한 누에 동충하초 눈꽃동충하초)의 합계 6샘플을 사용했다.

2) 방법

이러한 6샘플에 대해서, 도 2에 나타낸 본 발명의 환상 펩티드 유도체의 단리 정제 공정에 있어서의 공정 (1)의 열수 추출에 의해, 열수 추출물 MQ층을 얻었다. 이어서, 얻어진 열수 추출물 MQ층을 공정 (2)의 역상 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의해 7개의 획분(F1∼F7)으로 용리했다. 얻어진 7개의 획분 모두에 대해서 농도 100μg/ml에 있어서의 아스트로사이트 증식 활성시험을 행하고, 그것들의 생리활성을 비교했다.

3) 결과

도 16의 E, F에 나타내는 바와 같이, 일본산의 누에 동충하초 눈꽃동충하초의 F3에 있어서의 현저한 활성 이외에서는, 도 16의 C의 한국산의 눈꽃동충하초의 F7에서 약간의 활성이 확인되지만, 도 16의 A, B, D의 어느 동충하초의 전체 획분에 있어서, 아스트로사이트 증식 활성은 거의 확인되지 않고, 환상 펩티드 유도체는 존재하지 않거나, 존재하한다고 해도 양적으로 약간의 레벨인 것을 알 수 있었다. 또한, 배지가 되는 누에 건조번데기만으로는 활성이 확인되지 않기 때문에, 누에 번데기에 기생하는 눈꽃동충하초의 대사산물로서 환상 펩티드 유도체가 합성되어 있다고 생각된다. 이 것으로부터, 눈꽃동충하초의 숙주로서 누에의 번데기를 사용하는 것이 환상 펩티드 유도체의 제조에는 바람직한 것이 확인되었다.

또한, 탱크 배양에 의해 생산된 눈꽃동충하초이여도, 배양액 중에 있어서의 누에 번데기 분말의 함량을 증가시킴으로써 환상 펩티드 유도체가 얻어진다고 생각된다.

(산업상의 이용 가능성)

뛰어난 아스트로사이트 증식 활성을 비롯한 생리활성기능을 갖는 것에 있어서 유용한 신규 환상 펩티드 유도체를 제공할 수 있다. 그리고 그 제조 방법에 있어서는, 입수가 용이하고, 비용면, 안정 공급의 면에서 뛰어난 눈꽃동충하초를 원료라고 할 수도 있다.

Claims (12)

1. 이하의 일반식(1)으로 나타내어지는 환상 펩티드 유도체.
   

   

   
   (식 중, m은 0∼3, n≥1이며, R₁∼R₆은 수소원자, 또는 탄화수소기, R₇, R₈은 카르복실기 또는 그 염, 또는 알콕시카르보닐기, R₉는 탄화수소기, 히드록실기, 알콕시기, 또는 알킬카르보닐옥시기, R₁₀, R₁₁은 수소원자, 탄화수소기, 또는 알킬카르보닐옥시기, R₁₂∼R₁₆은 수소원자, 또는 탄화수소기이다.)
2. 제 1 항에 있어서,
   일반식(1)에 있어서 R₁, R₂, R₃, R₄가 알킬기이며, n=2∼4, R₅, R₆이 수소원자, R₇, R₈이 카르복실기인 것을 특징으로 하는 환상 펩티드 유도체.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 환상 펩티드 유도체를 눈꽃동충하초로부터 채취하는 것을 특징으로 하는 환상 펩티드 유도체의 제조 방법.
4. 제 3 항에 있어서,
   상기 눈꽃동충하초가 누에의 번데기를 배지로 해서 인공배양된 것인 환상 펩티드 유도체의 제조 방법.
5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
   상기 눈꽃동충하초 분말의 열수 추출 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 환상 펩티드 유도체의 제조 방법.
6. 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 환상 펩티드 유도체를 화학 합성하는 것을 특징으로 하는 환상 펩티드 유도체의 제조 방법.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 환상 펩티드 유도체 또는 그 염을 유효성분으로 하는 의약 조성물.
8. 제 7 항에 있어서,
   아스트로사이트 증식 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
   NGF 유전자 및 VGF 유전자의 발현량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
10. 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    뇌기능 개선 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
11. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    모질 개선 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
12. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 환상 펩티드 유도체 또는 그 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.

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