KR20170063996A - 천식을 치료 및 진단하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본원에는 천식 환자의 아유형을 치료 및 진단하기 위한 조성물, 키트 및 방법이 제공된다. 또한, 유효한 천식 치료제를 확인하는 방법 및 천식 치료제에 대한 반응성을 예측하는 방법이 제공된다.

Description

천식을 치료 및 진단하기 위한 조성물 및 방법 {Compositions and methods for treating and diagnosing asthma}

관련 출원에 대한 참고

본 출원은 2008년 3월 31일자로 출원된 미국 가특허원 제61/072,572호, 2008년 4월 1일자로 출원된 미국 가특허원 제61/041,480호, 2008년 5월 20일자로 출원된 미국 가특허원 제61/128,383호 및 2009년 1월 16일자로 출원된 미국 가특허원 제61/205,392호의 이권을 청구하고 있다.

본원에는 천식 환자의 아유형을 치료 및 진단하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 또한, 유효한 천식 치료제를 확인하는 방법 및 천식 치료제에 대한 반응성을 예측하는 방법이 제공된다.

천식은 전통적으로, T-헬퍼 유형 2 (Th2) 공정에 의해 구동되고 인터루킨 (IL)-4, IL-5 및 IL-13을 포함한 사이토킨에 의해 매개되는 공기 알레르겐 (aeroallergen)-유도형 염증으로부터 발생되는 것으로 여겨지고 있다. IL-13은 활성화 T 세포, 호염기구, 호산구 및 비만 세포에 의해 생성되는 다형질성 Th2 사이토킨이고, 전임상 모델에서 천식의 발병 기전에 강력한 영향을 끼쳐 왔다 [2]. 인간 천식 환자의 기도에서 상승된 수준의 IL-13이 탐지되었지만, 이러한 상승은 일부 천식 환자에서만 관찰되고 있다 [3-6]. 최근의 조사는 Th2 사이토킨이 천식-유사 병리상태와 생리상태를 어떻게 야기시키는지에 관한 이해에 관심을 두었다 [49, 50].

천식이 종종 기도의 호산구성 침윤을 특징으로 나타내긴 하지만, 이러한 질병의 기타 아유형은 또 다른 형태의 염증에 의해 구동된다는 명백한 증거가 늘어나고 있다 [1, 39, 48]. 예를 들어, 천식에서 기도 염증의 세포성 성분을 연구한 결과, 천식의 별개의 호산구성 및 비-호산구성 표현형에 대한 명백한 증거가 제공되었다 [1, 39, 48]. 이들 임상 및 세포성 천식 표현형의 기초가 되는 분자 기전이 상이한지의 여부는 공지되어 있지 않다. 천식의 별개의 분자성 표현형에 대한 바이오마커의 확인과 개발은 기본 조사의 방향을 안내해줄 것이고, 폐에서 Th2 반응을 특이적으로 표적으로 하는 최근의 천식 요법의 임상적 적용을 안내해 줄 것이다.

페리오스틴 (Periostin)은 섬유증과 관련하여 분비되는 단백질인데, 그의 발현은 기관지 상피 세포 [7, 8] 및 기관지 섬유아세포 [9]에서 재조합 IL-4 및 IL-13에 의해 상향 조절된다. 이는 인간 천식 환자의 기관지 상피 세포 [8] 및 상피하 기관지 층 [9] 뿐만 아니라 마우스 천식 모델 [10]에서 생체내 상승된 수준으로 발현된다. 이는 또한, IL-13 의존적 방식으로 호산구성 식도염 환자의 식도 상피에서 상승된 수준으로 발현된다 [11]. 페리오스틴의 발현 상승은 몇 가지 유형의 상피 유래 암에서 관찰되었고 [64-67], 상승된 수준의 가용성 페리오스틴은 몇몇 암 환자의 혈청에서 관찰되었다 [64, 68-70].

42명의 경증 내지 중간 정도의, 스테로이드-투약 받은 적이 없는 천식 환자와 28명의 건강한 대조군 대상체로부터의 기관지 상피 세포를 대상으로 하여, 게놈 규모에서의 발현 마이크로어레이 분석을 수행하였다 [8]. 이들 연구에서는, 모든 천식 환자와 모든 건강한 대조군 간에 가장 차별적으로 발현된 상피 유전자 중의 3개는 페리오스틴, CLCA1, 및 세르핀 (serpin)B2였다 [8]. 추가로, 이들 유전자는 흡입 코르티코스테로이드 (ICS) 치료 7일 후에 천식 환자의 기관지 상피 세포에서 상당히 하향 조절되었다 [8]. 이들 유전자 3개는 모두, 시험관 내에서의 재조합 IL-13 처리에 의해 기관지 상피 세포에서 유도되고, 그들의 발현은 코르티코스테로이드를 세포 배양 배지에 부가함으로써 현저하게 약화된다 [8].

현재까지는, 이와 같이 게놈 규모에서의 발현 분석으로, 개개의 천식 환자에 대한 치료에 대한 치료적 반응을 예상하거나 예측하는 유전적 바이오마커를 확인하지 못하였을 뿐만 아니라 천식 환자의 아유형을 구별시켜 주는 유전적 바이오마커도 확인하지 못하였다. 또한, 치료적 처치에 대해 예상되거나 예측되는 반응에 관한 광범위한 임상 적용성을 나타내거나, 또는 천식 아유형을 진단해 주는 신뢰할 만한 비-유전적 바이오마커도 확인하지 못하였다. 따라서, 천식 환자에 대한 치료법을 찾는 과정에서, 특별한 환자에 유효한 치료제(들)에 관한 조사와 관련된 상당한 시행 착오가 있었다. 이러한 시행 착오는 종종, 가장 효과적인 요법을 찾기 위해 환자에게 불쾌감을 주고 상당히 위험하기도 하다.

따라서, 환자가 해당 치료에 반응하게 될 것인지를 결정하고, 이러한 결정을 천식 환자에 보다 유효한 치료 섭생 내로 혼입시키는 데 보다 유효한 수단이 요구된다.

본 발명은 상기 언급된 요구를 충족시켜 주고 기타 이득을 제공해준다.

<발명의 요약>

기관지 상피에서의 유전자 발현 시그네처 (signature)를 이용하여, 본 발명자들은 천식의 별개의 분자성 아유형을 규정하였다. 놀랍게도, 그의 발현이 IL-4 또는 IL-13 자극에 의해 상향 조절되는 것으로 공지된 유전자와 고도로 상관이 있었던 유전자 세트에 기초한 데이터 클러스터링을 감독한 결과, 1개도 아닌 무려 2개의 별개 클러스터 천식 환자가 밝혀졌다. 추가로, 이들 양분된 천식 환자 서브세트를 분석한 결과, "IL-4/13 시그네처" 상태와 혈청 총 IgE 수준, 혈청 CEA 수준, 혈청 페리오스틴 수준, 말초혈 호산구증, (기관지폐포성 세정) BAL 호산구증 및 흡입 코르티코스테로이드에 대한 반응성 (각각 p<0.05; 윌콕슨 (Wilcoxon) 랭크 합 시험에 의함) 간에는 상당한 연관이 있다는 사실이 밝혀졌다.

따라서, 본 발명은 POSTN, CST1, CCL26, CLCA1, CST2, PRR4, SERPINB2, CEACAM5, iNOS, SERPINB4, CST4, PRB4, TPSD1, TPSG1, MFSD2, CPA3, GPR105, CDH26, GSN, C2ORF32, TRACH2000196 (TMEM71), DNAJC12, RGS13, SLC18A2, SERPINB10, SH3RF2, FCER1B, RUNX2, PTGS1 및 ALOX15 중에서 선택된 유전자 중 어느 하나 또는 조합물의 유전자 발현을 측정하는 것을 포함하는, 천식 환자 아집단을 진단하는 방법에 관한 것이다. 한 양태에서는, POSTN, CST1, CST2, CCL26, CLCA1, PRR4, PRB4, SERPINB2, CEACAM5, iNOS, SERPINB4, CST4 및 SERPINB10으로 이루어진 군 중에서 선택된 유전자 중 어느 하나 또는 조합물의 유전자 발현을 측정한다. 한 양태에 따르면, 유전자 발현은 마이크로어레이에 의해 측정한다. 또 다른 양태에 따르면, 유전자 발현은 전술된 유전자의 단백질 발현 수준을 관찰함으로써 측정한다. 또 다른 양태에 따르면, 관심있는 유전자의 상대적 mRNA 수준이 대조군 유전자 mRNA의 수준의 2.5배 초과인 경우에는 유전자 발현이 건강한 대조군과 비교해서 상당히 상승된다. 또 다른 양태에 따르면, 관심있는 유전자의 상대적 mRNA 수준이 건강한 대조군 유전자 발현 수준과 비교해서 3배, 5배, 10배, 15배, 25배 또는 30배 초과이다. 한 양태에 따르면, 유전자 발현은 PCR 방법, 마이크로어레이 방법 또는 면역검정 방법으로 이루어진 군 중에서 선택된 방법에 의해 측정한다. 한 양태에서는, 마이크로어레이 방법이 상기 언급된 유전자를 암호화하는 핵산 분자와 엄격한 조건 하에 혼성화할 수 있는 하나 이상의 핵산 분자를 갖거나 또는 상기 언급된 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질과 결합할 수 있는 하나 이상의 폴리펩티드 (예: 펩티드 또는 항체)를 갖는 마이크로어레이 칩의 사용을 포함한다. 한 양태에서는, PCR 방법이 qPCR이다. 한 양태에 따르면, 면역검정 방법이 상기 언급된 환자 샘플 중에서 상기 언급된 유전자로부터 발현된 단백질에 항체를 결합시키는 단계; 및 이러한 환자 샘플로부터의 단백질 수준이 상승하는 지를 결정하는 단계를 포함한다. 한 양태에 따르면, 대조군 유전자가 액틴 (actin), GAPDH, GASB 및 GUSB로 이루어진 군 중에서 선택된 하우스키핑 (housekeeping) 유전자이다.

본 발명은 다음 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 마이크로어레이 칩을 제공한다: POSTN, CST1, CST2, CCL26, CLCA1, PRR4, SERPINB2, CEACAM5, iNOS, SERPINB4, CST4 및 SERPINB10 또는 그의 단편. 본 발명은 다음 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 마이크로어레이 칩을 제공한다: POSTN, CST1, CCL26, CLCA1, CST2, PRR4, SERPINB2, CEACAM5, iNOS, SERPINB4, CST4, PRB4, TPSD1, TPSG1, MFSD2, CPA3, GPR105, CDH26, GSN, C2ORF32, TRACH2000196 (TMEM71), DNAJC12, RGS13, SLC18A2, SERPINB10, SH3RF2, FCER1B, RUNX2, PTGS1, 및 ALOX1, 또는 그의 단편.

본 발명은 본 발명의 치료제를 이용하여 치료할 천식 환자 아집단을 제공하는데, 천식 환자의 기도 상피 세포 내에서의 Muc5AC:MUC5B 단백질 또는 mRNA 수준의 비는 25 초과이다.

본 발명은 또한, 혈청 CEA 수준, 혈청 IgE 수준, 혈청 페리오스틴 수준, 말초혈 호산구 계수치 및 기관지폐포성 세정 유체 (BAL) 중의 호산구 비율 중에서 선택된 전신 바이오마커 측정값 중의 하나 또는 조합을 취함으로써 천식 환자 아집단을 진단하는 방법에 관한 것이다. 전신 바이오마커는 전형적으로, 비-유전적 바이오마커이고, 전형적으로 비침습성 과정에 의해 수득된 샘플, 비제한적으로 예를 들어 혈액 또는 혈액 성분 (예: 혈청 또는 혈장) 컬렉션에서 측정한다. 한 양태에 따르면, 100 IU/ml 초과 IgE 수준 및/또는 0.14 x 10e9/L 초과 호산구가 본 발명의 치료제로 치료될 환자 집단을 예측한다.

본 발명은 POSTN, CST1, CCL26, CLCA1, CST2, PRR4, SERPINB2, CEACAM5, iNOS, SERPINB4, CST4, PRB4, TPSD1, TPSG1, MFSD2, CPA3, GPR105, CDH26, GSN, C2ORF32, TRACH2000196 (TMEM71), DNAJC12, RGS13, SLC18A2, SERPINB10, SH3RF2, FCER1B, RUNX2, PTGS1, ALOX15 중에서 선택된 유전자 중 어느 하나 또는 조합물의 상승된 수준을 발현하는 환자에게 치료제를 투여하는 것을 포함하는, 천식의 치료 방법에 관한 것이다. 한 양태에 따르면, 환자는 페리오스틴, CST1, CST2, CCL26, CLCA1, PRR4, 세르핀B2, CEACAM5, iNOS, PRB4, 세르핀B4, 세르핀B10 및 CST4로 이루어진 군 중에서 선택된 유전자 중 어느 하나 또는 조합물의 상승된 수준을 발현한다. 한 양태에 따르면, 치료하고자 하는 환자가 경증 내지 중간 정도의, 스테로이드-투약 받은 적이 없는 (스테로이드로 치료 받은 적이 없다) 천식 환자이다. 또 다른 양태에 따르면, 치료하고자 하는 환자가 중간 정도 내지 중증의, 스테로이드-내성 (스테로이드에 대해 반응성이지 않다) 천식 환자이다. 이러한 환자는 치료상 유효량의 치료제를 이용하여 치료한다. 한 양태에서는, 환자가 TH2 경로에 의해 유도된 천식이 있다.

한 양태에 따르면, 치료제는 항-IL-13/IL-4 경로 억제제이다. 또 다른 양태에 따르면, 치료제는 TH2 유도된 천식 경로를 표적으로 한다. 예시되는 표적에는 사이토킨 또는 리간드, 예를 들어 IL-9, IL-5, IL-13, IL-4, OX40L, TSLP, IL-25, IL-33 및 IgE; 및 수용체, 예를 들어 IL-9 수용체, IL-5 수용체, IL-4 수용체알파, IL-13 수용체알파1 및 IL-13 수용체알파2, OX40, TSLP-R, IL-7R알파 (TSLP에 대한 공-수용체), IL-17RB (IL-25에 대한 수용체), ST2 (IL-33에 대한 수용체), CCR3, CCR4, CRTH2, Fc엡실론RI 및 Fc엡실론RII/CD23 (IgE에 대한 수용체)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명에 따르는 치료제에는 상기 표적과 결합할 수 있는 작용제, 예를 들어 폴리펩티드(들) [예: 항체, 면역부착인자 또는 펩티보디 (peptibody)], 앱타머 (aptamer) 또는 소분자가 포함된다.

한 양태에 따르면, 치료제는 항-IL-13 항체이다. 또 다른 양태에 따르면, 항-IL-13 항체는 서열 193을 포함하는 VH 서열과 서열 194를 포함하는 VL 서열을 포함한다. 또 다른 양태에 따르면, 항-IL-13 항체는 (a) 아미노산 서열 RASKSVDSYGNSFMH (서열 195)을 포함하는 HVR-L1; (b) 아미노산 서열 LASNLES (서열 196)을 포함하는 HVR-L2; (c) 아미노산 서열 QQNNEDPRT (서열 197)을 포함하는 HVR-L3; (d) 아미노산 서열 AYSVN (서열 198)을 포함하는 HVR-H1; (e) 아미노산 서열 MIWGDGKIVYNSALKS (서열 199)을 포함하는 HVR-H2; 및 (f) 아미노산 서열 DGYYPYAMDN (서열 200)을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 양태에 따르면, 치료제가 항-OX40 리간드 (OX40L) 항체이다. 또 다른 양태에 따르면, 치료제가 항-IL-13/항-IL-4 이중-특이적 항체이다. 또 다른 양태에 따르면, 치료제가 항-IgE 항체이다. 또 다른 양태에 따르면, 치료제가 B 세포 상의 표면 발현된 IgE의 막 근접한 M1' 영역에 대항하여 유도된 항체이다. 또 다른 양태에 따르면, 치료제가 흡입 코르티코스테로이드이다. 특정 양태에서는, 흡입 코르티코스테로이드가 베클로메타손 디프로피오네이트, 부데소니드, 플루니솔리드, 플루티카손 프로피오네이트, 모메타손, 및 트리암시놀론 아세토니드 중에서 선택된다.

한 양태에 따르면, 항-OX40L 항체는 (a) 서열 RSSQSPVHSNGNTYLH (서열 201)을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 KVSNRFS (서열 202)을 포함하는 HVR-L2; (c) 서열 SQSTHIPWT (서열 203)을 포함하는 HVR-L3; (d) 서열 SYWMH (서열 204)을 포함하는 HVR-H1; (e) 서열 EIDPSNGRTNYNEKFKS (서열 205)을 포함하는 HVR-H2; 및 (f) 서열 ERSPRYFDV (서열 206)을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 양태에 따르면, 항-OX40L 항체는 (a) 서열 RSSQSIVHGNGNTYLE (서열 207)을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 RVSNRFS (서열 208)을 포함하는 HVR-L2; (c) 서열 FQGSHVPYT (서열 209)을 포함하는 HVR-L3; (d) 서열 SYWLN (서열 210)을 포함하는 HVR-H1; (e) 서열 MIDPSDSETHYNQVFKD (서열 211)을 포함하는 HVR-H2; 및 (f) 서열 GRGNFYGGSHAMEY (서열 212)을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 양태에 따르면, 항-OX40L 항체는 (a) 서열 SYTMH (서열 215), SYAMS (서열 216), NFGMH (서열 217), 또는 NYGMH (서열 218)을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 IISGSGGFTYYADSVKG (서열 219), AIWYDGHDKYYSYYVKG (서열 220), AIWYDGHDKYYAYYVKG (서열 221), VIWYDGSNKYYVDSVKG (서열 222), 또는 VIWNDGSNKYYVDSVKG (서열 223)을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 DSSSWYRYFDY (서열 224), DRLVAPGTFDY (서열 225), KNWSFDF (서열 226), 또는 DRMGIYYYGMDV (서열 227)을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 RASQGISSWLA (서열 228), RASQSVSSSYLA (서열 229), RASQSVSSNYLA (서열 230), RASQGVSRYLA (서열 231), 또는 RASQSVSSYLA (서열 232)을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 GASSRAT (서열 233), AASSLQS (서열 234), MPPVWKV (서열 235), DASNRAT (서열 236), 또는 LHPLCKV (서열 237)을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 NSLIVTLT (서열 238), QQYNSYPYT (서열 239), QQYGSSFT (서열 240), QQRSNWQYT (서열 241), QQRSNWT (서열 242), 또는 NSIIVSLT (서열 243)을 포함하는 HVR-L3을 포함하는데, 항-OX40L 항체는 OX40L과 결합한다. 한 양태에 따르면, 항-IgE 항체는 서열 213을 포함하는 VL 서열과 서열 214를 포함하는 VH 서열을 포함한다. 또 다른 양태에 따르면, 항-IgE 항체는 (a) 서열 RSSQSLVHNNANTYLH (서열 244)을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 KVSNRFS (서열 245)을 포함하는 HVR-L2; (c) 서열 SQNTLVPWT (서열 246)을 포함하는 HVR-L3; (d) 서열 GFTFSDYGIA (서열 247)을 포함하는 HVR-H1; (e) 서열 AFISDLAYTIYYADTVTG (서열 248)을 포함하는 HVR-H2; 및 (f) 서열 ARDNWDAMDY (서열 249)을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 한 양태에 따르면, 항-IgE 항체는 서열 250을 포함하는 VH 서열과 서열 251을 포함하는 VL 서열을 포함한다. 한 양태에 따르면, 항-IgE 항체는 서열 252를 포함하는 VH 서열과 서열 253을 포함하는 VL 서열을 포함한다. 또 다른 양태에 따르면, 항-IgE 항체는 (a) 서열 RSSQDISNSLN (서열 254)을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 STSRLHS (서열 255)을 포함하는 HVR-L2; (c) 서열 QQGHTLPWT (서열 256)을 포함하는 HVR-L3; (d) 서열 GYTFTDYYMM (서열 257)을 포함하는 HVR-H1; (e) 서열 GDNIDPNNYDTSYNQKFKG (서열 258)을 포함하는 HVR-H2; 및 (f) 서열 ASKAY (서열 259)을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 양태에 따르면, 항-IgE 항체는 (a) 서열 RSSQDISNALN (서열 260)을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 STSRLHS (서열 255)을 포함하는 HVR-L2; (c) 서열 QQGHTLPWT (서열 256)을 포함하는 HVR-L3; (d) 서열 GYTFTDYYMM (서열 257)을 포함하는 HVR-H1; (e) 서열 GDNIDPNNYDTSYNQKFKG (서열 258)을 포함하는 HVR-H2; 및 (f) 서열 ASKAY (서열 259)을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 양태에 따르면, 항-IgE 항체는 (a) 서열 RSSQDISNALN (서열 260)을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 STSRLHS (서열 255)을 포함하는 HVR-L2; (c) 서열 QQGHTLPWT (서열 256)을 포함하는 HVR-L3; (d) 서열 GYTFTDYYIM (서열 261)을 포함하는 HVR-H1; (e) 서열 GDNIDPNNYDTSYNQKFKG (서열 258)을 포함하는 HVR-H2; 및 (f) 서열 ASKAY (서열 259)을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.

한 양태에 따르면, 환자는 TH2 경로와 관련이 없는 천식 (비-TH2 천식)을 갖고 있다. 한 양태에서, 치료제는 비-TH2 천식을 표적으로 한다. 한 양태에 따르면, 치료제가 IL-17 경로 억제제이다. 한 양태에서는, 치료제가 항-IL-17 항체이다. 한 양태에서는, 치료제가 IL-17A 및 IL-17F 둘 다와 교차-반응성인 항체이다. 한 양태에서는, 치료제가 IL-17A 및 IL-17F 둘 다와 결합할 수 있는 이중-특이적 항체이다. 한 양태에서는, 치료제가 항-IL-17A/F 항체이다.

본 발명은 (1) POSTN, CST1, CST2, CCL26, CLCA1, PRR4, PRB4, SERPINB2, CEACAM5, iNOS, SERPINB4, CST4 및 SERPINB10으로 이루어진 군 중에서 선택되는 유전자와 혼성화하는 하나 이상의 핵산 분자; 및 (2) 천식 환자 샘플로부터의 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 지시 사항을 포함하고, 여기서 상기 유전자 중 어느 하나, 조합물 또는 모두의 발현 수준이 상승하는 것이 천식 아유형의 지표인, 환자에서 천식 아유형을 진단하기 위한 키트를 제공한다. 한 양태에 따르면, 상기 키트는 PRB4, TPSD1, TPSG1, MFSD2, CPA3, GPR105, CDH26, GSN, C2ORF32, TRACH2000196 (TMEM71), DNAJC12, RGS13, SLC18A2, SH3RF2, FCER1B, RUNX2, PTGS1 및 ALOX15로 이루어진 군 중에서 선택된 유전자를 더 포함한다. 한 가지 추가 양태에서는, 유전자 발현 수준을 mRNA 수준에 관하여 검정함으로써 측정한다. 또 다른 추가 양태에서는, 상기 검정이 PCR 방법 또는 마이크로어레이 칩의 사용을 포함한다. 추가의 양태에서는, PCR 방법이 qPCR이다. 한 양태에서는, 관심있는 유전자의 mRNA 수준이 대조군 유전자 mRNA 수준과 비교해서 2.5배 초과하는 것이 천식 아유형의 지표이다.

본 발명은 (1) POSTN, CST1, CST2, CCL26, CLCA1, PRR4, PRB4, SERPINB2, CEACAM5, iNOS, SERPINB4, CST4 및 SERPINB10으로 이루어진 군 중에서 선택된 단백질과 결합하는 하나 이상의 단백질 분자; 및 (2) 환자 샘플로부터의 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 지시 사항을 포함하고, 여기서 상기 단백질 중 어느 하나, 조합물 또는 모두의 발현 수준이 상승하는 것은 천식 아유형의 지표인, 환자에서 천식 아유형을 진단하기 위한 키트를 제공한다. 한 양태에서는, 이러한 키트가 PRB4, TPSD1, TPSG1, MFSD2, CPA3, GPR105, CDH26, GSN, C2ORF32, TRACH2000196 (TMEM71), DNAJC12, RGS13, SLC18A2, SH3RF2, FCER1B, RUNX2, PTGS1 및 ALOX15로 이루어진 군 중에서 선택된 단백질과 결합하는 단백질 분자를 더 포함한다. 한 양태에서는, 단백질 분자가 항체, 펩티드 또는 펩티보디이다. 추가의 양태에서는, 키트가 상기 단백질 분자(들)를 포함하는 마이크로어레이 칩을 포함한다.

본 발명은 혈청 총 IgE 수준, 혈청 CEA 수준, 혈청 페리오스틴 수준, 말초혈 호산구 및 기관지폐포성 세정 (BAL) 호산구로 이루어진 군 중에서 선택된 환자 샘플로부터의 바이오마커 중 어느 하나를 측정하기 위한 지시 사항 (CEA, 혈청 페리오스틴, 말초혈 호산구 및 기관지폐포성 세정 (BAL) 호산구의 수준이 상승하는 것이 천식 아유형의 지표인, 환자에서 천식 아유형을 진단하기 위한 키트를 제공한다. 한 양태에 따르면, 이러한 키트는 100 IU/ml 초과의 IgE 수준이 천식 아유형의 지표라는 지시 사항을 제공한다. 또 다른 양태에 따르면, 상기 키트는 0.14 x 10e9/L 초과의 말초혈 호산구 수준이 천식 아유형의 지표라는 지시 사항을 제공한다.

본 발명은 천식 환자 샘플로부터 Muc5AC:MUC5B mRNA 또는 단백질의 비를 측정하기 위한 지시 사항 (25 초과 비가 천식 아유형의 지표인, 환자에서 천식 아유형을 진단하기 위한 키트를 제공한다. 한 양태에서는, 샘플을 상피 브러싱 (brushing)으로부터 수득한다. 또 다른 양태에서는, 샘플이 기도 상피 세포를 포함한다. 한 양태에서는, 상기 키트가 엄격한 조건 하에 Muc5AC와 혼성화하는 핵산 분자 및 엄격한 조건 하에 MUC5B와 혼성화하는 핵산 분자를 제공한다. 한 양태에서는, 키트가 Muc5AC와 결합하는 단백질 분자 및 MUC5B와 결합하는 단백질 분자를 제공한다. 한 양태에서는, 단백질 분자가 항체이다.

도 1은 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같은 기도 상피에서의 유전자 발현 수준을 도시한 것이다. (a) 건강한 대조군 (N=27) 및 천식 환자 (N=42)에서 페리오스틴 (좌측 패널), CLCA1 (중앙 패널), 및 세르핀B2 (우측 패널)의 상대적 발현 수준이 도시되어 있다. 표준화 형광 단위가 각 플롯의 좌측 축 위에 표시된다. (b) 42명의 천식 환자에서 페리오스틴과 CLCA1의 2-방식 발현 수준 비교 (좌측 패널), 페리오스틴과 세르핀B2의 2-방식 발현 수준 비교 (중앙 패널), 및 CLCA1과 세르핀B2의 2-방식 발현 수준 비교 (우측 패널)가 도시되어 있다. 스페아르만 (Spearman's) 랭크 순서 상관 관계 (ρ) 및 p-값이 각 패널에 표시된다. (c) 페리오스틴 및 공동-조절된 유전자의 발현 수준을 확인하는 건강한 대조군 및 천식 환자에 대한 유전자 발현 마이크로어레이 분석; IL-4/13 시그네처 고 클러스터 (클러스터 1); IL-4/13 시그네처 저 클러스터 (클러스터 2); 건강한 대조군. (d) 기준선에서 모든 대상체 전체에 걸쳐 기관지 상피에서 페리오틴, CLCA1 및 세르핀B2 발현 수준의 감독되지 않은 계층적 클러스터링 (완벽한 유클리드)을 도시하는 히트맵 (heatmap). (e) 도 1a-d에 도시된 대상체 서브세트로부터 기관지 브러싱과 동시에 수득한 기관지 생검 균질물에서 IL-4, IL-5 및 IL-13의 평균 (±SEM) 발현 수준 (클러스터 1: 18명의 "IL-13 고" 천식 환자; 클러스터 2: 16명의 건강한 대조군 및 14명의 "IL-13 저" 천식 환자). 모든 대상체 전체에 걸쳐 IL-4, IL-5 및 IL-13 간의 2-방식 상관 관계가 우측에 표시된다 (스페아르만 랭크 순서 상관 관계, ρ, 및 p-값).
도 2는 실시예 3에 기재된 바와 같은 유전자의 발현 수준, 및 세르핀, 시스타틴 및 PRR에 대한 유전자 계열을 도시한 것이다. (a) 캘리포니아 산타 크루즈 대학 게놈 브로셔 (참고: http://genome.ucsc.edu)에 전시된 바와 같은 세르핀 (상단), 시스타틴 (중앙) 및 PRR (하단) 게놈 유전자 자리 및 구성. (b) 패널 A에 도시된 바와 같은 시스타틴 및 세르핀 유전자를 암호화하는 모든 프로브의 계층적 클러스터링. (c) 건강한 대조군 (N=27) 및 천식 환자 (N=42)에서 PRR4 (좌측 패널), PRB4 (중앙 패널), 및 CEACAM5 (우측 패널)의 기도 상피에서의 상대적 유전자 발현 수준이 도시되어 있다. 표준화 형광 단위가 각 플롯의 좌측 축 위에 표시된다.
도 3은 실시예 6에 기재된 바와 같이 흡입 플루티카손 프로피오네이트 (ICS) 치료 1주 후 및 기준선에서 기관지 상피 브러싱의 마이크로어레이 분석을 도시한 것이다. (a) 페리오스틴 발현; (b) PRR4 발현; (c) RUNX2 발현.
도 4는 실시예 7 및 9에 기재된 바와 같이 천식 환자에서 혈청 IgE 및 말초혈 호산구의 합성 그래프를 도시한 것이다.
도 5는 실시예 8에 기재된 바와 같이 천식의 IL-13 고 및 IL-13 저 아표현형의 각종 임상 특징을 도시한 것이다. (a) 기도 폐쇄의 측정 기준인, 처음 1초 동안 강제 호기시 흡입된 공기 용적 (FEV₁). (b) 알부테롤 4 퍼프 (360 ㎍) 후 FEV₁ 상의 개선 (기관지확장기 가역성 시험). (c) 기도 과반응성의 측정 기준인, FEV₁ 상의 20％ 감소를 유도시키는 데 요구되는 메타콜린의 도발적 농도 (PC₂₀).
도 6은 실시예 8에 기재된 바와 같이 천식의 IL-13-고 및 IL-13-저 아표현형의 알레르기, 호산구성 염증 및 기도 재형성의 각종 마커를 도시한 것이다. (a) 12개 공기 알레르겐 패널을 이용한 알레르겐 피부 찌르기 시험 (SPT) 결과. (b) 혈청 IgE 농도. (c) 말초혈 호산구 계수치. (d) 총 기관지폐포성 세정 유체 (BAL) 세포의 비율로서의 호산구. (e) 상피하 섬유증의 측정 기준인, 내기관지 생검 상의 망상 기저막 (RBM) 두께의 입체적 측정. (f) qPCR에 의해 결정된 바와 같은 상피 브러싱에서 MUC5AC 대 MUC5B 발현 비.
도 7은 실시예 8에 기재된 바와 같이 천식의 IL-13 고 및 IL-13 저 아표현형의 각종 임상 특징을 도시한 것이다. (a) 바닥 축을 따라 표시된 바와 같은 특이적 공기 알레르겐에 대해 반응하는 대상체의 비율 (％). "IL-13 저" 천식 아표현형; "IL-13 고" 천식 아유형 (*, p<0.05). (b) 양성 SPT 반응 수 대 BAL 호산구 비율; 표시된 바와 같은 IL-13 천식 아표현형 (고, 흰색 사각형; 저, 검은색 환). (c) 양성 SPT 반응 수 대 혈청 IgE; 표시된 바와 같은 IL-13 천식 아표현형 (고, 흰색 사각형; 저, 검은색 환). (d) 양성 SPT 반응 수 대 말초혈 호산구 계수치; 표시된 바와 같은 IL-13 천식 아표현형 (고, 흰색 사각형; 저, 검은색 환). 스페아르만 랭크 순서 상관 관계 (ρ) 및 p-값이 B 내지 D에 대한 각 플롯에 표시되어 있다.
도 8은 실시예 8에 기재된 바와 같이 IL-13 고 및 IL-13 저 천식 아표현형을 나타내는 대상체 및 건강한 대조군에서의 기도 상피 점액소 (mucin) 함량 및 조성을 도시한 것이다. (a) 기도 상피 점액소 함량의 측정 기준인, 상피 용적당 점액소 용적. (b) qPCR에 의해 결정된 바와 같은 점액소 MUC2의 발현. (c) qPCR에 의해 결정된 바와 같은 점액소 MUC5AC의 발현. (d) qPCR에 의해 결정된 바와 같은 점액소 MUC5B의 발현.
도 9는 IL-13 고 및 IL-13 저 천식 아표현형을 나타내는 대상체의 흡입 코르티코스테로이드에 대한 반응을 도시한 것이다. (a) 기준선 (0주), 플루티카손을 매일 투여한지 4주 및 8주 후, 및 플루티카손을 중지한지 1주 후 (9주째)에 측정한 FEV₁. (*): 각 군에서 대상체의 수 및 p-값 대한 표 5 참고. (b) 플루티카손 (N=19) 또는 플라시보 치료 (N=13)를 개시한지 1주 후 천식 환자의 기관지 상피에서 페리오틴, CLCA1 및 세르핀B2 (도 1d에서와 같음)의 감독되지 않은 계층적 클러스터링을 도시하는 히트맵. 개개 대상체에 대한 기준선 및 치료에서 클러스터 확인이 히트맵 아래에 표시된다 (클러스터 1: "IL-13 고" 천식 환자; 클러스터 2: "IL-13 저" 천식 환자).
도 10은 실시예 8에 기재된 바와 같이 천식의 IL-13 고 및 IL-13 저 아표현형을 나타내는 대상체에게서의 폐포성 대식 세포 유전자 발현을 도시한 것이다. 건강한 대조군 (N= 15); 천식의 IL-13 저 아표현형 (N=5); 천식의 IL-13 고 아표현형 (N=9)이 표시된다. 본 도면은 qPCR에 의해 결정된 바와 같이 15-리폭시게나제 (ALOX15) 및 종양 괴사 인자-α (TNF-α)의 평균 (±SEM) 발현 수준을 도시한 것이다. (*): p < 0.03.
도 11은 실시예 9에 기재된 바와 같이 건강한 대조군 및 천식 환자로부터의 샘플의 28개 유전자를 커버하는 35개 프로브를 이용하는 유전자 발현 마이크로어레이 분석을 도시한 것이다.
도 12는 실시예 9에 기재된 바와 같이 페리오스틴 및 CEACAM5에 대한 유전자 발현 마이크로어레이 분석 및 qPCR 분석을 도시한 것이다. (a) 건강한 대조군, 클러스터 2 천식 환자 ("IL-13 저") 및 클러스터 1 천식 환자 ("IL-13 고")에서의 페리오스틴 발현; (b) 건강한 대조군, 클러스터 2 천식 환자 ("IL-13 저") 및 클러스터 1 천식 환자 ("IL-13 고")에서의 CEACAM5 발현; (c) "IL-13 고" 천식 환자 (사각형) 및 "IL-13 저" 천식 환자 (환)에서 CEACAM5 및 페리오스틴의 합성 그래프; (d) 건강한 대조군, "IL-13 고" 천식 환자 및 "IL-13 저" 천식 환자에 대한 민감도와 특이도를 보여주는 페리오스틴 및 CEACAM5의 qPCR-의거 발현 수준에 대한 최적화 알고리즘의 수신자 동작 특성 (ROC) 분석.
도 13은 실시예 9에 기재된 바와 같이 천식 환자 및 건강한 대조군에서 혈청 단백질의 혈청 수준을 도시한 것이다. (a) IgE의 혈청 수준; (b) 페리오스틴의 혈청 수준; (c) CEA의 혈청 수준; (d) YKL-40의 혈청 수준; (e) 흡입 코르티코스테로이드제 (ICS)로 치료하였거나 (+) 그렇치 않은 (-) 천식 환자에서 IgE의 혈청 수준; (f) 흡입 코르티코스테로이드제 (ICS)로 치료하였거나 (+) 그렇치 않은 (-) 천식 환자에서 페리오스틴의 혈청 수준; (g) 흡입 코르티코스테로이드제 (ICS)로 치료하였거나 (+) 그렇치 않은 (-) 천식 환자에서 CEA의 혈청 수준; (h) 흡입 코르티코스테로이드제 (ICS)로 치료하였거나 (+) 그렇치 않은 (-) 천식 환자에서 YKL-40의 혈청 수준; (i) < 100 IU/ml 혈청 IgE (<100)을 갖는 천식 환자 및 ≥ 100 IU/ml 혈청 IgE (≥100)을 갖는 천식 환자에서 페리오스틴의 혈청 수준의 합성 그래프; (j) < 100 IU/ml 혈청 IgE (<100)을 갖는 천식 환자 및 ≥ 100 IU/ml 혈청 IgE (≥100)을 갖는 천식 환자에서 CEA의 혈청 수준의 합성 그래프; (k) < 100 IU/ml 혈청 IgE (<100)을 갖는 천식 환자 및 ≥ 100 IU/ml 혈청 IgE (≥100)을 갖는 천식 환자에서 YKL-40의 혈청 수준의 합성 그래프; (l) < 100 IU/ml 혈청 IgE을 갖는 천식 환자 (환) 및 ≥ 100 IU/ml 혈청 IgE을 갖는 천식 환자 (사각형)에서 페리오스틴 및 CEA의 혈청 수준의 합성 그래프.

<상세한 설명>

정의

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 분야 용어, 표기 및 기타 과학적 방법론은 본 발명이 속하는 분야에서의 당업자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 갖는다. 몇몇 경우에, 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 용어가 그 의미를 명료하게 하고/하거나 즉시 참고하기 위해 본원에서 정의되고, 이러한 정의를 본원에 포함시키는 것이 당해 분야에서 일반적으로 이해되고 있는 것에 비해 상당한 차이를 나타내는 것으로 반드시 간주되서는 않된다. 본원에 기재되거나 참고된 기술 및 과정은 일반적으로, 널리 이해되고 있고, 당업자가 통상적인 방법론, 예를 들어 다음 문헌에 기재된 광범위하게 활용되고 있는 분자 클로닝 방법론을 사용하여 흔히 이용하고 있다 [참고: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]. 적당하다면, 시판용 키트 및 시약의 사용을 포함하는 과정은 일반적으로, 달리 언급되지 않는 한 제조업자가 규정하는 프로토콜 및/또는 파라미터에 따라서 수행한다.

"IL-4/IL-13 유전자 시그네처", "IL-4/IL-13 시그네처", "IL-13 유전자 시그네처" 및 "IL-13 시그네처"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 표 4에 제시된 바와 같은 30개 유전자의 조합, 또는 표 9에 제시된 바와 같은 이들 30개 유전자의 아조합을 지칭하는데, 그의 유전자 발현 패턴은 특정의 천식 환자와 상관이 있다. 30개 유전자에는 POSTN, CST1, CCL26, CLCA1, CST2, PRR4, SERPINB2, CEACAM5, iNOS, SERPINB4, CST4, PRB4, TPSD1, TPSG1, MFSD2, CPA3, GPR105, CDH26, GSN, C2ORF32, TRACH2000196 (TMEM71), DNAJC12, RGS13, SLC18A2, SERPINB10, SH3RF2, FCER1B, RUNX2, PTGS1, ALOX15가 포함된다. IL-4/IL-13 유전자 시그네처의 폴리펩티드는 본 발명의 "표적화 폴리펩티드"이다.

본원에서 사용되는 경우 용어 "표적화 폴리펩티드"는 "천연 서열" 폴리펩티드 및 변이체 (이는 본원에서 추가로 정의된다)를 지칭한다.

"천연 서열" 폴리펩티드는 천연으로부터 유래된 상응하는 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 용어 "천연 서열 폴리펩티드"에는 폴리펩티드의 천연 발생적 절단된, 증가된 및 프레임시프트된 형태가 포함되고, 이에는 대체 스플라이싱된 형태, 이소형 및 다형태가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.

"천연 발생적 변이체"는 기준 폴리펩티드와의 아미노산 서열 동일률이 약 60％ 이상이고 천연 발생적 기준 폴리펩티드의 한 가지 이상의 생물학적 활성을 보유하고 있는 폴리펩티드를 의미한다. 천연 발생적 변이체에는 기준 폴리펩티드와의 아미노산 서열 동일률이 약 65％ 이상, 약 70％ 이상, 약 75％ 이상, 약 80％ 이상, 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 약 98％ 이상, 또는 약 99％ 이상인 변이체 폴리펩티드가 포함될 수 있다.

POSTN의 예에는 서열 1을 포함하는 폴리펩티드 및 기타 POSTN 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 31 및/또는 32와 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

CST1의 예에는 서열 2를 포함하는 폴리펩티드 및 기타 CST1 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 33과 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

CCL26의 예에는 서열 3을 포함하는 폴리펩티드 및 기타 CCL26 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 34와 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

CLCA1의 예에는 서열 4를 포함하는 폴리펩티드 및 기타 CLCA1 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 35와 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

CST2의 예에는 서열 5를 포함하는 폴리펩티드 및 기타 CST2 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 36과 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

PRR4의 예에는 서열 6을 포함하는 폴리펩티드 및 기타 PRR4 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 37과 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

SERPINB2의 예에는 서열 7을 포함하는 폴리펩티드 및 기타 SERPINB2 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 38과 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

CEACAM5의 예에는 서열 8을 포함하는 폴리펩티드 및 기타 CEACAM5 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 39와 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

iNOS의 예에는 서열 9를 포함하는 폴리펩티드 및 기타 iNOS 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 40과 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

SERPINB4의 예에는 서열 10을 포함하는 폴리펩티드 및 기타 SERPINB4 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 41 및/또는 42와 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

CST4의 예에는 서열 11을 포함하는 폴리펩티드 및 기타 CST4 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 43과 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

PRB4의 예에는 서열 12를 포함하는 폴리펩티드 및 기타 PRB4 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 44와 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

TPSD1의 예에는 서열 13을 포함하는 폴리펩티드 및 기타 TPSD1 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 45 내지 51로 이루어진 군 중에서 선택된 서열과 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

TPSG1의 예에는 서열 14를 포함하는 폴리펩티드 및 기타 TPSG1 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 52 내지 55로 이루어진 군 중에서 선택된 서열과 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

MFSD2의 예에는 서열 15를 포함하는 폴리펩티드 및 기타 MFSD2 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 56과 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

CPA3의 예에는 서열 16을 포함하는 폴리펩티드 및 기타 CPA3 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 57과 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

GPR105의 예에는 서열 17을 포함하는 폴리펩티드 및 기타 GPR105 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 58과 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

CDH26의 예에는 서열 18을 포함하는 폴리펩티드 및 기타 CDH26 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 59와 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

GSN의 예에는 서열 19를 포함하는 폴리펩티드 및 기타 GSN 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 60과 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

C2ORF32의 예에는 서열 20을 포함하는 폴리펩티드 및 기타 C2ORF32 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 61과 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

TRACH2000196 (TMEM71)의 예에는 서열 21을 포함하는 폴리펩티드 및 기타 TRACH2000196 (TMEM71) 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 62와 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

DNAJC12의 예에는 서열 22를 포함하는 폴리펩티드 및 기타 DNAJC12 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 63과 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

RGS13의 예에는 서열 23을 포함하는 폴리펩티드 및 기타 RGS13 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 64와 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

SLC18A2의 예에는 서열 24를 포함하는 폴리펩티드 및 기타 SLC18A2 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 65와 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

SERPINB10의 예에는 서열 25를 포함하는 폴리펩티드 및 기타 SERPINB10 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 66과 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

SH3RF2의 예에는 서열 26을 포함하는 폴리펩티드 및 기타 SH3RF2 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 67과 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

FCER1B의 예에는 서열 27을 포함하는 폴리펩티드 및 기타 FCER1B 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 68과 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

RUNX2의 예에는 서열 28을 포함하는 폴리펩티드 및 기타 RUNX2 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 69와 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

PTGS1의 예에는 서열 29를 포함하는 폴리펩티드 및 기타 PTGS1 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 70과 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

ALOX15의 예에는 서열 30을 포함하는 폴리펩티드 및 기타 ALOX15 천연 서열 폴리펩티드, 예를 들어 엄격한 조건 하에 서열 71과 혼성화할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된 천연 서열 폴리펩티드 및 천연 발생적 변이체가 포함된다.

"항-IL-13/IL-4 경로 억제제"는 IL-13 및/또는 IL-4 신호 전달을 차단시키는 작용제를 지칭한다. 항-IL-13, 항-IL-4 또는 항-IL-13/IL-4 억제제의 예에는 항-IL-13 결합성 작용제, 항-IL-4 결합성 작용제, 항-IL-4 수용체알파 결합성 작용제, 항-IL-13 수용체알파1 결합성 작용제 및 항-IL-13 수용체알파2 결합성 작용제가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. IL-13, IL-4, IL-13R알파1, IL-13R알파2 또는 IL-4R알파와 결합할 수 있는 단일 도메인 항체는 억제제로서 구체적으로 포함된다. 하나 초과의 표적과 결합할 수 있는 분자가 포함된다는 것을 이해해야 한다.

"항-IL-4 결합성 작용제"는 인간 IL-4와 특이적으로 결합하는 작용제를 지칭한다. 이러한 결합성 작용제에는 소분자, 앱타머 또는 폴리펩티드가 포함될 수 있다. 이러한 폴리펩티드에는 면역부착인자, 항체, 펩티보디 및 펩티드로 이루어진 군 중에서 선택된 폴리펩티드(들)가 포함될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 한 양태에 따르면, 결합성 작용제는 1 uM 내지 1 pM의 친화도로 인간 IL-4 서열과 결합한다. 항-IL-4 결합성 작용제의 구체적인 예에는 가용성 IL-4 수용체알파 (예를 들어, 인간 Fc 영역과 융합된 IL-4 수용체의 세포외 도메인), 항-IL-4 항체, 및 가용성 IL-13 수용체알파1 (예를 들어, 인간 Fc 영역과 융합된 IL-13 수용체알파1의 세포외 도메인)이 포함될 수 있다.

"항-IL-4 수용체알파 결합성 작용제"는 인간 IL-4 수용체알파와 특이적으로 결합하는 작용제를 지칭한다. 이러한 결합성 작용제에는 소분자, 앱타머 또는 폴리펩티드가 포함될 수 있다. 이러한 폴리펩티드에는 면역부착인자, 항체, 펩티보디 및 펩티드로 이루어진 군 중에서 선택된 폴리펩티드(들)가 포함될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 한 양태에 따르면, 결합성 작용제는 1 uM 내지 1 pM의 친화도로 인간 IL-4 수용체알파 서열과 결합한다. 항-IL-4 수용체알파 결합성 작용제의 구체적인 예에는 항-IL-4 수용체알파 항체가 포함될 수 있다.

"항-IL-13 결합성 작용제"는 인간 IL-13과 특이적으로 결합하는 작용제를 지칭한다. 이러한 결합성 작용제에는 소분자, 앱타머 또는 폴리펩티드가 포함될 수 있다. 이러한 폴리펩티드에는 면역부착인자, 항체, 펩티보디 및 펩티드로 이루어진 군 중에서 선택된 폴리펩티드(들)가 포함될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 한 양태에 따르면, 결합성 작용제는 1 uM 내지 1 pM의 친화도로 인간 IL-13 서열과 결합한다. 항-IL-13 결합성 작용제의 구체적인 예에는 항-IL-13 항체, 인간 Fc 영역과 융합된 가용성 IL-13 수용체알파2, 인간 Fc 영역과 융합된 가용성 IL-13 수용체알파가 포함될 수 있다. 한 양태에 따르면, 항-IL-13 항체는 TNX-650 항체의 가변 도메인을 포함한다 [참고: WO2005/062972]. TNX-650 항체의 가변 도메인은

(1)

을 포함하는 VH; 및

(2)

을 포함하는 VL을 포함한다. 항-IL-13 항체의 기타 예는 WO2008/083695 (예: IMA-638 및 IMA-026), US2008/0267959, US2008/0044420 및 US2008/0248048에 기재되어 있다.

"항-IL-13 수용체알파1 결합성 작용제"는 인간 IL-13 수용체알파1과 특이적으로 결합하는 작용제를 지칭한다. 이러한 결합성 작용제에는 소분자, 앱타머 또는 폴리펩티드가 포함될 수 있다. 이러한 폴리펩티드에는 면역부착인자, 항체, 펩티보디 및 펩티드로 이루어진 군 중에서 선택된 폴리펩티드(들)가 포함될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 한 양태에 따르면, 결합성 작용제는 1 uM 내지 1 pM의 친화도로 인간 IL-13 수용체알파1 서열과 결합한다. 항-IL-13 수용체알파1 결합성 작용제의 구체적인 예에는 항-IL-13 수용체알파1 항체가 포함될 수 있다.

"항-IL-13 수용체알파2 결합성 작용제"는 인간 IL-13 수용체알파2와 특이적으로 결합하는 작용제를 지칭한다. 이러한 결합성 작용제에는 소분자, 앱타머 또는 폴리펩티드가 포함될 수 있다. 이러한 폴리펩티드에는 면역부착인자, 항체, 펩티보디 및 펩티드로 이루어진 군 중에서 선택된 폴리펩티드(들)가 포함될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 한 양태에 따르면, 결합성 작용제는 1 uM 내지 1 pM의 친화도로 인간 IL-13 수용체알파2 서열과 결합한다. 항-IL-13 수용체알파2 결합성 작용제의 구체적인 예에는 항-IL-13 수용체알파2 항체가 포함될 수 있다.

"항-IgE 결합성 작용제"는 인간 IgE와 특이적으로 결합하는 작용제를 지칭한다. 이러한 결합성 작용제에는 소분자, 앱타머 또는 폴리펩티드가 포함될 수 있다. 이러한 폴리펩티드에는 면역부착인자, 항체, 펩티보디 및 펩티드로 이루어진 군 중에서 선택된 폴리펩티드(들)가 포함될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 한 양태에 따르면, 항-IgE 항체는

을 포함하는 VL 서열과,

을 포함하는 VH 서열을 포함한다.

"항-M1' 결합성 작용제"는 B 세포 상의 표면 발현된 IgE의 막 근접한 M1' 영역과 특이적으로 결합하는 작용제를 지칭한다. 이러한 결합성 작용제에는 소분자, 앱타머 또는 폴리펩티드가 포함될 수 있다. 이러한 폴리펩티드에는 면역부착인자, 항체, 펩티보디 및 펩티드로 이루어진 군 중에서 선택된 폴리펩티드(들)가 포함될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 한 양태에 따르면, 항-IgE 항체는 WO2008/116149에 기재된 항체 또는 그의 변이체를 포함한다.

용어 "소분자"는 분자량이 50 달톤 내지 2500 달톤인 유기 분자를 지칭한다.

용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고 있고, 이에는 구체적으로, 예를 들어 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다가-에피토프 특이성을 지닌 항체, 단일 쇄 항체, 다중-특이적 항체 및 항체의 단편이 포함된다. 이러한 항체는 키메라, 인간화, 인간 및 합성일 수 있다. 이러한 항체 및 이의 생성 방법은 다음에 보다 상세히 기재되어 있다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 절편이 항체들 간의 서열에 있어 광범위하게 상이하다는 사실을 지칭한다. V 영역은 항원 결합성을 매개하고, 그의 특별한 항원에 대한 특별한 항체의 특이성을 규정한다. 그러나, 가변성이 가변 도메인의 110개 아미노산 전반에 걸쳐 균등한 수준으로 분포되지는 않는다. 대신, V 도메인은 각각 9 내지 12개 아미노산 길이인 "초가변 영역"으로 불리우는 보다 짧은 극도의 가변성 영역에 의해 분리된 15 내지 30개 아미노산의 프레임워크 영역 (FR)으로 지칭된 비교적 불변인 연장물로 이루어진다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR을 포함하는데, 이는 베타-시트 구조를 연결하고 몇몇 경우에는 이러한 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는, 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 베타-시트 입체 배치를 상당 부분 채택하고 있다. 각 쇄 내의 초가변 영역은 상기 FR에 의해 아주 근접하게 함께 결합되어 있고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역은 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다 [참고: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]. 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 각종의 효과기 기능, 예를 들어 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)에 있어서의 항체 참여를 나타낸다.

본원에 사용된 경우의 용어 "초가변 영역" (또는 "HVR")은 항원-결합성에 책임이 있는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 일반적으로, "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 [예를 들어, VL 내의 잔기 약 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3); 및 VH 내의 잔기 약 31-35B (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); 참고: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 및/또는 "초가변 루프"로부터의 아미노산 잔기 [예를 들어, VL 내의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3); 및 VH 내의 잔기 26-32 (H1), 52A-55 (H2) 및 96-101 (H3); 참고: Chothia and Lesk, J. Mol. Biol, 196: 901-917 (1987)]를 포함한다.

초가변 영역은 다음과 같은 "연장된 초가변 영역"을 포함할 수 있다: VL 내의 24-36 (L1), 46-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 VH 내의 26-35B (H1), 47-65 (H2) 및 93-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 이들 정의 각각에 대해 문헌 [Kabat et al., 상기 참고]에 따라서 넘버링된다.

"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 규정된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 예를 들어, 경쇄 프레임워크 1 (LC-FR1), 프레임워크 2 (LC-FR2), 프레임워크 3 (LC-FR3) 및 프레임워크 4 (LC-FR4) 영역은 항체의 잔기 1-23, 35-49, 57-88 및 98-107 (카바트 넘버링 시스템)을 각각 포함한다. 또 다른 예에서, 중쇄 프레임워크 1 (HC-FR1), 중쇄 프레임워크 2 (HC-FR2), 중쇄 프레임워크 3 (HC-FR3) 및 중쇄 프레임워크 4 (HC-FR4) 영역은 항체의 잔기 1-25, 36-48, 66-92 및 103-113 (카바트 넘버링 시스템)을 각각 포함한다.

본원에 지칭된 바와 같은 "컨센서스 서열" 또는 컨센서스 V 도메인 서열은 공지된 인간 면역글로불린 가변 영역 서열의 아미노산 서열들을 비교함으로써 유래된 인공 서열이다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질적 항체 집단, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가, 모노클로날 항체 생성 동안 유발될 수도 있는 가능한 변이체 (이러한 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다)를 제외하고는 동일하고/하거나 동일한 에피토프(들)과 결합하는 집단으로부터 수득한 항체를 지칭한다. 이러한 모노클로날 항체에는 전형적으로, 표적과 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체가 포함되는데, 표적-결합성 폴리펩티드 서열은 복수 개의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합성 폴리펩티드 서열을 선별하는 것을 포함하는 공정에 의해 수득하였다. 예를 들어, 이러한 선별 공정은 복수 개의 클론, 예를 들어 하이브리도마 클론, 파아지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀 (pool)로부터 독특한 클론을 선별하는 것일 수 있다. 이와 같이 선별된 표적 결합성 서열을 추가로 변경시켜, 예를 들어 표적에 대한 친화도를 개선시키고, 표적 결합성 서열을 인간화시키며, 세포 배양액 중에서의 그의 생성을 개선시키며, 생체 내에서의 그의 면역원성을 저하시키고, 다중-특이적 항체를 창출시킬 수 있으며, 상기와 같이 변경된 표적 결합성 서열을 포함하는 항체 또한 본 발명의 모노클로날 항체이기도 하다는 것을 인지해야 한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대항하여 유도된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 모노클로날 항체 제제의 각 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대항하여 유도된다. 모노클로날 항체 제제는 그의 특이성 이외에도, 전형적으로 기타 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 채로 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득되는 바와 같은 항체의 형질을 표시하고, 어떠한 특별한 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 추론되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용하고자 하는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법 [참고: 예를 들어, Kohler et al., Nature, 256:495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981], 재조합 DNA 방법 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호], 파아지 디스플레이 기술 [참고: 예를 들어, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol . Biol ., 222:581-597 (1991); Sidhu et al., J. Mol . Biol . 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J. Mol . Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc . Nat. Acad . Sci . USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al. J. Immunol . Methods 284(1-2): 119-132 (2004)]을 포함한 각종 기술, 및 인간 면역글로불린 서열을 암호화하는 유전자 또는 인간 면역글로불린 유전자 자리의 일부 또는 전부를 갖는 동물로부터 인간 또는 인간-유사 항체를 생성시키는 기술 [참고: 예를 들어, WO 98/24893, WO/ 9634096, WO/ 9633735, 및 WO/ 91 10741, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); 미국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,591,669호 (GenPharm); 제5,545,807호; WO 97/17852, 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호, 및 Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol ., 13: 65-93 (1995)]에 의해 만들 수 있다.

본원에서의 모노클로날 항체에는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린) 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다 [참고: 미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)]. 키메라 항체의 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.

"인간화" 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예: Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 기타 항원-결합성 아서열)이다. 몇몇 양태에서, 인간화 항체는, 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 몇몇 경우에는, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체시킨다. 더우기, 인간화 항체는 수용자 항체, 또는 유입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 일반적으로, 항체 성능을 추가로 정련시키고 최대화하기 위해 만들어진다. 전형적으로, 인간화 항체는 1개 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래되고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열로부터 유래되지만, FR 영역에는, 예를 들어 결합 친화성을 개선시키기 위한 하나 이상의 아미노산 치환물이 포함될 수도 있다. 한 가지 바람직한 양태에서, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로는 인간 면역글로불린의 불변 영역 또는 인간 컨센서스 불변 서열의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 상세 내역에 대해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); 및 Presta, Curr . Op. Struct . Biol., 2: 593-596 (1992)]. 인간화 항체에는 항체의 항원-결합성 영역이, 예를 들어 짧은 꼬리 원숭이 (macaque)를 관심있는 항원으로 면역시킴으로써 생성된 항체로부터 유래되는 PRIMATIZED^® 항체가 포함된다. 인간화 항체의 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.

인간 항체는 파아지-디스플레이 라이브러리를 포함한, 당해 분야에 공지된 각종 기술을 사용하여 생성시킬 수도 있다 [참고: Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol . Biol., 222: 581 (1991)]. 다음 문헌에 기재된 기술 또한, 인간 모노클로날 항체를 제조하기 위해 이용 가능하다 [참고: Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)]. 또한 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Lonberg and Huszar, Int . Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). PCT 공개공보 WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; 유럽 특허 제0 598 877호; 미국 특허 제5,413,923호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,569,825호; 제5,661,016호; 제5,545,806호; 제5,814,318호; 제5,885,793호; 제5,916,771호; 및 제5,939,598호].

"항체 단편"은 완전한 길이 항체의 일부, 일반적으로 그의 항원 결합성 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아보디; 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자; 및 항체 단편들로부터 형성된 다중-특이적 항체가 포함된다.

"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이러한 단편은 1개의 중쇄 가변 영역 도메인과 1개의 경쇄 가변 영역 도메인이 단단하게 비공유적으로 연합된 이량체로 이루어진다. 이들 2개 도메인을 폴딩하면, 항원 결합을 위한 아미노산 잔기에 기여하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여해 주는 6개의 초가변 루프 (H 및 L 쇄로부터 각각 3개의 루프)가 생성된다. 그러나, 전체 결합 부위 보다는 낮은 친화도이긴 하지만, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 특정 항원에 대해 특이적인 3개의 CDR 만을 포함하는 Fv의 절반)도 항원을 인식하고 결합할 수 있는 능력을 지닐 수 있다.

본 발명의 항체의 "기능적 단편"은 이들이 유래되는 본래의 완전한 쇄 분자와 실질적으로 동일한 친화도로 폴리펩티드와의 결합성을 유지하고 있고, 한 가지 이상 검정에서 활성인 (예를 들어, 마우스 모델에서와 같은 TH2-유도된 천식 경로의 억제 또는 시험관 내에서 항체 단편과 결합하는 항원의 생물학적 활성의 억제) 단편이다.

항체 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하는데, 이는 항체 이소형에 따라서 다양하다. 항체 효과기 기능의 예에는 C1q 결합성 및 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합성; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예: B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화가 포함된다. "천연 서열 Fc 영역"은 자연계에서 발견된 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

본원에서 확인된 폴리펩티드 및 항체 서열과 관련한 "아미노산 서열 동일률 (％)" 또는 "상동률"은 서열 동일성의 일부로서의 모든 보존적 치환을 고려하여 서열을 정렬시킨 후, 비교되는 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 중의 아미노산 잔기의 비율 (％)로서 정의된다. 아미노산 서열 동일률을 결정하기 위한 정렬은 당해 분야의 기술 수준 내의 각종 방식으로 달성할 수 있는데, 예를 들어 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈리안 (Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 사용한다. 당업자는 정렬을 측정하기에 적당한 파라미터를 결정할 수 있으며, 이에는 비교되는 완전한 길이의 서열 전반에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 알고리즘이 포함된다. 그러나, 본원의 목적상, 아미노산 서열 동일률 (％) 값은 서열 비교용 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성시킨다. ALIGN-2 서열 비교용 컴퓨터 프로그램은 제넨텍, 인코포레이티드 (Genentech, Inc.)사에 의해 창시되었고, 원시 코드는 미국 저작권국 (Washington D.C., 20559)에 사용자 문서 제출함으로써 출원하였으며, 이는 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 공급처 [Genentech, Inc., South San Francisco, California]를 통하여 공개적으로 입수 가능하다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작동 시스템, 바람직하게는 디지털 UNIX V4.0D 상에서 사용하도록 편집되어야 한다. 모든 서열 비교용 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변하지 않는다.

용어 "Fc 영역-포함 폴리펩티드"는 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어 항체 또는 면역부착인자 (하기 정의 참고)를 지칭한다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따르는 잔기 447)은, 예를 들어 폴리펩티의 정제 동안 또는 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 재조합적으로 공학 처리함으로써 제거할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르는 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드 (항체 포함)를 포함하는 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 폴리펩티드 집단, K447 잔기가 전혀 제거되지 않은 폴리펩티드 집단, 또는 K447 잔기를 수반한 폴리펩티드와 K447 잔기를 수반하지 않는 폴리펩티드의 혼합물을 갖는 폴리펩티드 집단을 포함할 수 있다.

본 명세서와 특허청구범위 전반에 걸쳐, 카바트 넘버링 시스템은 일반적으로, 가변 도메인 내의 잔기 (대략적으로, 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 지칭하는 경우에 사용된다 [참고: 예를 들어, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]. "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 인덱스"는 일반적으로, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 지칭하는 경우에 사용된다 (예를 들어, 본원에 참고로 도입된 문헌 [참고: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 보고된 EU 인덱스). 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 항체의 가변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 카바트 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 항체의 불변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 EU 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다 [참고: 예를 들어, 미국 가특허원 제60/640,323호, EU 넘버링에 대한 도면].

혼성화 반응의 "엄격도"는 당업자에 의해 용이하게 결정할 수 있는데, 이는 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라서 실험적으로 계산한다. 일반적으로, 보다 긴 프로브는 적당한 어닐링을 위해 보다 고온을 필요로 하는 반면, 보다 짧은 프로브는 보다 저온을 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로, 상보적 가닥이 그들의 융점 아래 환경 하에 존재하는 경우에 변성 DNA가 재어닐링될 수 있는 능력에 좌우된다. 프로브와 혼성화 가능한 서열 간의 목적하는 상동률이 보다 높을 수록, 보다 높은 상대 온도를 사용할 수 있다. 그 결과, 보다 고온의 상대 온도는 반응 조건을 보다 엄격하게 하는 경향이 있는 반면, 보다 저온은 이러한 경향을 감소시킨다. 혼성화 반응 엄격도에 관한 부가의 상세 내역과 설명은 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)].

본원에서 정의된 바와 같은 "엄격한 조건" 또는 "고도로 엄격한 조건"은 (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도와 고온, 예를 들어 50℃ 하에 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 나트륨 시트레이트/0.1％ 나트륨 도데실 설페이트를 이용하는 조건; (2) 혼성화 동안 변성제, 예를 들면 42℃ 하에 750 mM 염화나트륨, 75 mM 나트륨 시트레이트를 수반한 0.1％ 소 혈청 알부민/0.1％ 피콜/0.1％ 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)을 수반한 50％ (v/v) 포름아미드를 이용하는 조건; 또는 (3) 42℃ 하에 50％ 포름아미드, 5xSSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 나트륨 시트레이트), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1％ 피로인산나트륨, 5x 덴하르츠 (Denhardt) 용액, 초음파 처리시킨 연어 정액 DNA (50 ㎍/ml), 0.1％ SDS, 및 10％ 덱스트란 설페이트를 이용하는 용액 중에서 밤새 혼성화하고, 42℃ 하에 0.2xSSC (염화나트륨/나트륨 시트레이트)에서 10분간 세척한 다음, 55℃ 하에 EDTA를 함유하는 0.1xSSC로 이루어진 고도로 엄격한 세척을 10분간 수행하는 조건에 의해 확인될 수 있다.

"적당한 수준으로 엄격한 조건"은 문헌 [참고: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기재된 바와 같이 확인할 수 있고, 이에는 상기 언급된 것 보다 덜 엄격한 혼성화 조건 (예: 온도, 이온 강도 및 ％ SDS) 및 세척 용액을 사용하는 것이 포함된다. 적당한 수준으로 엄격한 조건의 예는 20％ 포름아미드, 5xSSC (150 mM NaCl, 15 mM 삼나트륨 시트레이트), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5x 덴하르츠 용액, 10％ 덱스트란 설페이트, 및 20 mg/ml 변성 전단된 연어 정액 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃ 하에 밤새 항온 배양한 다음, 약 37 내지 50℃ 하에 1xSSC 중에서 필터를 세척하는 것이 포함된다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 요인들을 수용하기에 필요한 정도로 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 인지하고 있을 것이다.

본원에 사용된 바와 같은, 치료하고자 하는 대상체는 포유류 (예: 인간, 비-인간 영장류, 랫트, 마우스, 암소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 등)이다. 대상체는 임상 환자, 임상 시험 자원자, 실험용 동물 등일 수 있다. 대상체는 천식이 있거나 이러한 천식에 걸릴 위험이 있는 것으로 추정될 수 있거나, 또는 천식이 있는 것으로 진단될 수 있다. 한 가지 바람직한 양태에 따르면, 본 발명에 따라서 치료하고자 하는 대상체는 인간이다.

"치료하는", "치료 (처치)" 또는 "완화"는 그의 목적이 표적화된 병적 상태 또는 장애를 예방하거나 느리게 진행 (경감)시키거나, 또는 이러한 장애 증상 일부를 경감시키는 것인 조치를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 대상체에는 이미 장애가 있는 대상체 뿐만 아니라 이러한 장애를 지니기 쉬운 대상체, 또는 해당 장애를 예방시키고자 하는 대상체가 포함될 수 있다. 본 발명의 치료제를 투여한 후에, 환자가 다음 중의 한 가지 이상이 부재하거나 또는 관찰 가능하고/하거나 측정 가능한 수준으로 저하된 경우에, 이러한 대상체 또는 포유류는 천식에 대해 성공적으로 "치료"된 것이다: 재발되는 쌕쌕거림, 기침, 호흡 곤란, 흉부 압박감, 밤에 발생하거나 악화되는 증상, 찬 공기, 운동 또는 알레르겐에 대한 노출에 의해 촉발되는 증상.

용어 "치료상 유효량"은 대상체에게서 질병 또는 장애를 "완화" 또는 "치료"하는데 유효한 본 발명의 폴리펩티드의 양을 지칭한다.

"만성" 투여는 작용제(들)를 급성 방식과는 달리 지속적인 방식으로 투여하여, 초기 치료 효과 (활성)가 장기간 유지되도록 하는 것을 지칭한다. "간헐적" 투여는 중단없이 연속적으로 수행하지는 않지만, 사실상 순환식 치료이다.

"강제 호기 용적 (FEV1)"은 강제 호기 처음 1초 내에 배출된 공기의 용적을 측정하는 표준 시험을 지칭한다. FEV1은 결과를 기록하고 이러한 결과를 그래프 상에 표시해 주는 기계와 접속한 1회용 튜빙과 마우스피스로 이루어진 폐활량계에 의해 측정한다. 폐활량 측정을 수행하기 위해, 깊게 호흡하고, 튜브 주변에 입을 밀착해서 붙인 다음, 튜빙을 통하여 숨을 내쉬어 측정치를 취한다. 배출된 공기 용적, 및 매번 한숨 간격을 기록하고 분석한다. 폐활량 측정 결과를 비율 (％)로서 표현한다. 정상적인 폐활량 측정 결과의 예에는 1초 후 폐활량의 75％ FEV1이 포함된다. 비정상적인 폐활량 측정 결과의 예에는 정상적인 예측 값의 80％ 미만 판독치가 포함된다. 비정상적인 결과는 통상적으로, 어느 정도의 폐쇄성 폐 질환, 예를 들어 천식, 폐기종 또는 만성 기관지염이 존재하거나, 또는 제한적 폐 질환, 예를 들어 폐 섬유증이 존재한다는 것을 나타낸다. 예를 들어, FEV1 값 (예측치의 비율)을 이용하여 천식과 기타 폐쇄성 폐 질환 (예: 폐기종 또는 만성 기관지염)과 함께 발생할 수 있는 폐쇄증을 분류할 수 있다: FEV1 65％ 내지 79％ 예측 = 경증의 폐쇄증, FEV1 40％ 내지 59％ 예측 = 중간 정도의 폐쇄증, 및 FEV1 40％ 미만 예측 = 중증의 폐쇄증.

본원에 기재된 단백질을 확인하기 위해 사용될 수 있는 (예를 들어, 마이크로어레이 분석에 의함) 핵산 프로브의 예에는 표 4에 기재된 프로브가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.

"상승된 발현 수준" 또는 "상승된 수준"은 대조군, 예를 들어 천식으로 인해 고통받지 않는 개체(들)와 비교해서 환자에서 mRNA 또는 단백질의 발현이 증가되는 것을 지칭한다.

본원에서 인용된 모든 공개 문헌 (특허 및 특허원 포함)은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.

본 명세서와 특허청구범위 전반에 걸쳐 사용된 단어 "포함", "포함하는" 및 "포함되는"이란, 언급된 정수 또는 정수 군의 포함을 명시하는 것이지만, 기타 정수 또는 정수 군를 배제하지 않는다.

전술된 설명은 당업자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분한 것으로 간주된다. 다음 실시예는 단지 예시 목적을 위해 제공된 것이며, 이로써 본 발명의 범위가 어떠한 방식으로든 제한되지 않는다. 실제로, 본원에 기재되고 제시된 것 이외의 본 발명의 각종 변형이 전술된 설명으로부터 당업자에게는 명백할 것이며, 이 또한 첨부된 특허청구범위에 속한다.

참고 문헌의 부분 목록:

본원에서 인용된 모든 참고 문헌 (특허원 및 공개 공보 포함)은 어떠한 목적으로든지 그의 전문이 본원에 참고로 도입된다. 또한, 미국 가특허원 제61/072,572호 (2008년 3월 31일자로 출원됨), 미국 가특허원 제61/041,480호 (2008년 4월 1일자로 출원됨), 미국 가특허원 제61/128,383호 (2008년 5월 20일자로 출원됨), 미국 가특허원 제61/205,392호 (2009년 1월 16일자로 출원됨)는 그들의 전문이 본원에 참고로 도입된다. 또한, 구체적으로 PCT 공개공보 WO2005/062972 및 WO2008/116149는 그들의 전문이 본원에 참고로 도입된다.

<실시예>

실시예 1 - 방법

기도 조직 은행

본 발명자들은 건강한 지원자와 천식 환자 지원자에게서 조사 목적으로 수행한 기관지경술 동안 수집한 기도 조직 은행 [소재지: the University of California, San Francisco (UCSF)]에 저장한 생물학적 샘플을 연구하였다. 조사용 기관지경술은 기존에 보고된 구체적인 방법을 이용하여 상피 브러싱, 기관지폐포성 세정 (BAL) 및 기관지 생검을 수집하는 것을 포함하였다 [8, 46]. BAL 세포 계수 및 미분을 수행하고 데이터베이스화하며, 유동 세포계수법을 이용하여 BAL 유체로부터 대식 세포를 분류하였다 [51]. 2차 내지 5차 용골 돌기 (브러싱 위치에 대해 반대측)로부터 4 내지 6개 기관지 생검을 수득하고, 포르말린 고정시킨 다음, 등방성 균일 무작위 배향으로 파라핀-봉매시켜 [31], 디자인에 의거한 입체학 방법을 이용하여 재형성 및 염증의 정량적 측정을 가능케 하였다 [52]. 부가의 2개 기관지 생검을 균질화시키고, 퀴아젠 (Qiagen) RNeasy 미니키트 (공급처: Qiagen Inc., Valencia, CA)를 이용하여 RNA에 대해 프로세싱하였다. 상피 브러싱, 기관지 생검 균질화물 및 세정 대식세포로부터 추출한 RNA의 품질을 보장하였고, 추가의 마이크로어레이- 및 PCR에 의거한 유전자 프로파일링을 위해 등분하였다. 모든 조사용 기관지경술 연구는 인간 조사에 관한 UCSF 위원회 [UCSF Committee on Human Research (CHR)]에 의해 승인되었고, 모든 대상체로부터 동의서를 얻었으며, 모든 연구는 헬싱키 선언에 나타낸 원칙에 따라서 수행하였다. 기도 조직 은행 과정은 또한, UCSF의 CHR에 의해 고찰되고 승인되었다. 이러한 조직 은행으로부터의 상피 브러싱 및 대식 세포 샘플을 기존에 보고된 연구에 사용하였다 [8, 14, 46, 51, 53]. 가장 최근에는, 천식 대상체에게서 상피 브러싱에서 시차적으로 발현된 유전자의 마이크로어레이 분석이 본 발명자들에 의해 보고되었다 [8].

천식 환자 기도 염증의 기초가 되는 분자 기전, 및 천식 환자 서브세트의 특징적인 별개 염증성, 병리학적 및 임상적 표현형과 관련하여 상이한 천식 환자 서브세트를 확인할 목적으로, 본 발명자들은 먼저, 본 발명자들이 기존에 만들어 낸 상피 세포 마이크로어레이 데이터에 관한 새로운 분석을 수행하였고, 그 다음에 이들 새로운 분석 결과에, 이들 동일한 대상체로부터 부가의 상세한 임상적 성상 확인 데이터 (기관지확장기 가역성 및 알레르겐 피부 시험 반응성에 관한 데이터 포함) 및 새로이 만들어 낸 데이터를 보충시켰는데, 이러한 데이터에는 다음이 포함된다: (i) 기관지 생검 및 폐포성 대식 세포의 균질화물 내에서의 유전자 발현 프로파일; (ii) 기관지 생검에서 기도 상피 점액소 및 상피하 콜라겐의 정량적 측정치; (iii) BAL에서 총 및 미분 세포 계수치.

인간 대상체 및 샘플

천식이 있는 대상체 (N=42)는 기존에 의사가 천식이 있다고 진단하였고, 연구 의사에 의해 확인된 천식과 일치하는 증상이 있으며, 기도 과반응성 (<8 mg/mL의 메타콜린 흡입시 처음 1초 동안 강제 호기 용적 (FEV₁) 상의 20％ 이상 감소 [PC₂₀ 메타콜린]로서 정의됨)이 있고, 다음 중 어느 한 가지가 있다: 1) 주당 2일 이상 동안 증상, 2) 주당 2일 이상 동안 β-효능제 사용, 또는 3) FEV₁ <85％ 예측. 이들은 본 연구에 참여하기 전 4주 동안 흡입 또는 경구 코르티코스테로이드를 복용하지 않았다. 건강한 대조군 (N=27)은 폐질환 병력이 없고 기도 과반응성이 없었다 (PC₂₀ 메타콜린 >16 mg/mL). 특정의 연구에서는 천식이 없는 흡연자를 포함시켰다 (N=16). 모든 대상체에 대한 시험 배제 기준으로는 이전 4주 내에 상기도 감염이 있었거나, 6주 이내의 천식이 악화되었거나, 현재 살메테롤 (salmeterol), 아스테미졸 (astemizole), 네도크로밀 (nedocromil) 나트륨, 나트륨 크로모글리케이트 (cromoglycate), 메틸크산틴 (methlyxanthines), 몬텔루카스트 (montelukast) 또는 자피르루카스트 (zafirlukast)를 사용하고 있는 것이다. 대상체에 대해 연구 의사는 기준선 평가를 진행하였다 (기존에 보고된 바와 같은 폐활량 측정 및 메타콜린 챌린지 시험 포함 [8]). 대상체에 대해 또한, 12개의 공기 알레르겐 패널, 양성 대조군 및 음성 대조군을 이용한 알레르겐 피부 찌르기 시험 (ASPT)을 진행하였다 (표 6).

천식이 있는 32명 대상체를 또한, 흡입 플루티카손 (500 ㎍, 1일 2회, N=19) 또는 매칭된 플라시보 (N=13)의 이중-맹검 무작위 제어 임상 시험에 참여시켰다 (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT00187499). 이 시험은 기도 유전자 발현에 대한 흡입 스테로이드 (플루티카손)의 효과를 결정하고, 폐 기능 상의 개선에 대한 유전자 발현 변화와 관련이 있도록 설계하였다. 이러한 임상 시험에서는 천식 환자를 대상으로 하여 기준선 기관지경술을 진행하였고, 연구 약물을 투여한지 1주 후에 기관지경술을 반복하기 전에 연구 약물을 무작위로 투여하였다. 천식 대상체에게는 총 8주 동안 연구 약물 투여를 지속하였다. 건강한 대조군 대상체와 흡연자는 3가지 단면 연구 중의 한 가지에 참여하였고, 이는 각각 2회 방문으로 구성되는데, 첫 번째 방문은 성상 확인을 위한 것이고, 두 번째 방문은 1주 후에 기관지경술을 위한 것이다. 35명 대상체를 대상으로 하여 적당한 기준선 기관지경술을 수행하였고, 그중 32명은 양 기관지경술에서 상피 브러싱으로부터 입수 가능한 RNA를 갖고 있었다. 시험 약물 투여 4주 및 8주 후에 폐 기능을 측정하였고 (폐활량 측정에 의함), 1주 런아웃 후에 최종 폐활량 측정을 완료하였다. 기관지경술, 상피 브러싱, 기관지폐포성 세정, 폐활량 측정 및 샘플 조작 방법은 모든 연구 전반에 걸쳐 동일하였다.

기관지폐포성 세정 (BAL)은 50 ml의 멸균성 식염수 4개 분취액을 서혜부 또는 우측 중앙엽 내로 점적 주입함으로써 (흡인에 의해 일부 회수하면서) 수행하였다. 혈구계 및 터크스 (Turks) 용액 (증류수 중의 1％ 빙초산 및 0.01％ 젠티안 바이올렛)을 이용하여 세포 계수를 수행하였다. 이어서, 스테인 키트 (Shandon Kwik-Diff stain kit; 공급처: Thermo Fisher Scientific, Waltham MA)를 이용하여 세포원심분리된 제제 상에서 BAL 세포 미분을 수행하였다. 천식이 있는 32명 대상체를 또한, 흡입 플루티카손 (500 mcg BID) 또는 매칭된 플라시보의 이중-맹검 무작위 제어 임상 시험에 참여시켰다. 상기 시험 대상 환자 기준 이외에도, 이들 대상체는 또한, 주당 2일 이상 동안의 천식 증상이 있거나, 주당 2일 이상 동안 β-효능제을 사용하거나, 또는 FEV₁가 예측치의 <85％여야 한다. 상기 언급된 바와 같은 기준선 방문과 기준선 기관지경술을 진행시킨 임상 시험에서 대상체에게 연구 약물을 무작위로 투여하였고, 1주 후에 기관지경술을 반복해서 진행시켰다. 이어서, 이들은 총 8주 동안 연구 약물 투여를 지속하였는데, 계획된 폐활량 측정 재평가 및 메타콜린 챌린지 시험을 수반하였다. 모든 임상 연구는 인간 조사에 관한 UCSF 위원회 [the University of California, San Francisco Committee on Human Research]에 의해 승인되었고, 모든 대상체로부터 동의서를 얻었으며, 모든 연구는 헬싱키 선언에 나타낸 원칙에 따라서 수행하였다.

마이크로어레이 분석 및 형태계측

경증 내지 중간 정도의 비흡연 천식 환자 및 건강한 비흡연 대상체로부터의 마이크로어레이 데이터를 기존에 보고된 바와 같은 연구로부터 수득하였다 [8]. 방법론적 상세 내역과 마이크로어레이 데이터는 또한, 생물공학 정보 국립 센터 (the National Center for Biotechnology Information) 온라인으로 접근할 수 있는 (승인 번호 GSE4302) 유전자 발현 옴니부스 공개 데이터베이스로부터 입수 가능하다. 마이크로어레이 데이터를 본 연구에서 분석하여 유전자가 천식 환자 군 내에서 차등적으로 조절되었는 지를 결정하였다. 또한, 마이크로어레이 데이터를 분석하여 기타 유전자가 상부 천식-관련 IL-13 유도 유전자와 공동-조절되었는 지를 결정하였다. 표 1에서의 프라이머 및 프로브를 이용하여, 2 단계 실시간 PCR (qPCR) (즉, 다중체 PCR에 이어 cDNA 생성된 생성물 상에서의 실시간 PCR)을 기존에 보고된 바와 같이 수행하였다 [45].

형태계측적 분석은 기존에 보고된 바와 같이 각 대상체로부터 4 내지 6개 내기관지 생검에 디자인-의거 입체학을 적용함으로써 수행하였다. 구체적으로 언급하면, 직교 절편 방법을 이용하여 망상 기저막 두께 분석을 삼색 3 ㎛ 박편에서 측정하였다 [31]. 점 및 선 교차 계수 방법을 이용하여, 기도 점액소 함량을 알리시안 블루 (Alcian blue)/과요오드산 쉬프 (Schiff) 3 ㎛ 박편에서 측정하였다 [46].

통계적 방법

R 통계적 환경 하에 바이오컨덕터 오픈 소스 소프트웨어 (Bioconductor open source software) [47]를 이용하는 RMA를 사용하여 마이크로어레이 전처리를 수행하였다. 완전 연관되는 유클리드식 계측법을 이용하여 감독되지 않은 계층적 클러스터링을 수행하였다. JMP 통계적 분석 소프트웨어 패키지 (공급처: SAS Institute, Cary, NC)를 이용하여, 포함되는 기타 모든 통계적 분석을 수행하였다. 값은 달리 명시되지 않는 한, 평균 ± 표준 편차 또는 중앙값 (범위)으로서 제시된다. 스페아르만 랭크 순서 상관 관계를 이용하여 상관 관계를 수행하였다. PC₂₀ 및 혈청 IgE 수준의 유의적 시험을 위해, 데이터를 정상치에 대해 log 변환시켰다. p<0.05가 통계상 유의적인 것으로 간주되었고, ANOVA에 의해 초기 3-군 비교 후에, 다중 비교를 위한 시닥 (sidak) 교정을 이용하였다.

페리오스틴 및 CEACAM5에 대한 qPCR의 경우, 기준선 기관지 상피 브러싱 샘플에서 페리오스틴 및 CEACAM5 발현에 대한 상대적 카피 수를 기존에 언급된 방법 [45]에 따라서 수득하고, log₁₀ 변환시켰다. 실시예 9에 기재된 35-프로브 IL-13 시그네처 (도 11 참고)를 반응 계측으로서 사용하였다. 모든 모델은 JMP 7.0의 피트 모델 플랫폼을 이용하여 반복적으로 유도시켰다. 서수 로지스틱 회귀를 수행하여 수준 (건강한 대조군; HC) < (IL-13 저) < (IL-13 고)을 갖는 반응 (35 프로브 IL-13 상태)를 예측하였다. 각 수준에 대한 확률에 대해 일반화된 예측 모델은 다음과 같이 기재된다:

다음 모델에 대해 서수 로지스틱 회귀를 수행하였다: (35 프로브 IL-13 상태) ~ (POSTN) + (CEACAM5). 완전 모델 p-값 <0.0001은 반복적인 피트에 기초한 데이터세트로부터 유래되었다.

IL-13 반응성 유전자

페리오스틴 (조골 세포 특이적 인자로서 공지되기도 함) (POSTN: 210809_s_at), CLCA1 (클로라이드 채널, 칼슘 활성화, 계열 구성원 1로서 공지되기도 함) (CLCA1: 210107_at), 및 SERPINB2 [세르핀 펩티다제 억제제, 클라드 B (오브알부민), 구성원 2로서 공지되기도 함] (SERPINB2: 204614_at) 발현 수준 간의 관계는 윌콕슨 (Wilcoxon) 랭크 합 시험을 이용하여 확인하였다. POSTN 발현 수준을 이용하여 기준선 천식 샘플을 분류하였다. 컷오프 (cutoff)치 800 단위를 사용하였는데, 이로써 21개 천식 기준선 천식 샘플이 "IL-13 저" (POSTN < 800 단위)로서 분류되었고, 나머지 21개 샘플은 "IL-13 고" (POSTN > 800 단위)로서 분류되었다. 윌콕슨 랭크 합 시험에 이은 가성 발견률 분석 (q값 < 0.05) [24]은 상기 2개 군 중에서 시차적으로 발현된 35개 프로브를 확인하였다. 이들 프로브를 이용한 계층적 클러스터링을 진행하였다. 차별적으로 조절된 프로브 목록에 많은 시스타틴 및 세르핀 계열 유전자가 존재하기 때문에, 부가의 시스타틴 및 세르핀 계열 프로브를 확인하였고, 이를 부가의 클러스터 분석에 사용하였다. R을 이용하여 모든 통계적 분석을 수행하였다. 클러스터를 이용하여 마이크로어레이 클러스터 분석을 수행하였고 자바 트리뷰 (Java Treeview)를 이용하여 가시화하였다 [25, 26].

혈청 분석물 검정

혈청 IgE는 UCSF 임상 실험실에 의해 측정하거나 또는 제조업자 (Bethyl Laboratories) 지시에 따라서 인간 혈청 IgE ELISA 키트를 이용하여 ELISA함으로써 측정하였다. 혈청 CEA는 제조업자 (Alpco Diagnostics)의 지시에 따라서 인간 혈청 CEA ELISA 키트를 이용하여 측정하였다. 본 발명자들은 항-페리오스틴 항체 (공급처: R&D systems)를 이용하여 혈청 페리오스틴을 측정하기 위한 전기화학발광성 검정 (ECLA)을 개발하였다. 간략하게 언급하면, 모노클로날 항-페리오스틴을 4℃ 하에 밤새 탄산나트륨 완충액 (pH 9.6) 중의 1.5 마이크로그램/ml로 판 위로 코팅하였다. 판을 실온 하에 2시간 동안 검정 완충액 (1X PBS pH 7.4, 0.35 M NaCl, 0.5％ BSA, 0.05％ Tween 20, 0.25％ CHAPS, 5 mM EDTA, 15 PPM 프로클린) + 3％ BSA에서 차단시킨 다음, TBST (트리스-완충 식염수 + 0.1％ Tween-20)로 4회 세척하였다. 혈청을 검정 완충액에서 1:5로 희석시키고, 실온 하에 2시간 동안 진탕시키면서 항온 배양한 다음, TBST로 4회 세척하였다. 재조합 페리오스틴 (공급처: R&D Systems)을 사용하여 표준 범위를 확립시켰다. 바이오티닐화 폴리클로날 항-인간 페리오스틴 (1.5 마이크로그램/ml) (공급처: R&D Systems; 당해 분야에 공지된 표준 방법에 따라서 시험관 내에서 바이오티닐화됨) 및 루테늄-스트렙타비딘 (0.75 마이크로그램/ml) (공급처: Meso Scale Devices)를 검정 완충액 + 5％ 염소 혈청에 가하고, 실온 하에 90분 동안 항온 배양하였다. 판독 완충액 (공급처: Meso Scale Devices)을 가하고, 전기화학발광을 판독하였다 (공급처: Meso Scale Devices). 동력학적 범위는 5 내지 2000 ng/ml였다.

실시예 2 - 천식 환자의 IL-4/13 시그네처 및 서브세트

3개의 IL-13 유도된 유전자 (페리오스틴, CLCA1, 및 세르핀B2)가 천식 환자 기도 상피에서의 보다 광범위한 유전자 발현 패턴에 영향을 미치는 지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 그들의 발현이 연구된 42명 천식 환자 중 개개의 대상체 내에서의 기준선에서 공동-조절되었는지를 조사하였다. 쌍을 이룬 비교에서는, 페리오스틴, CLCA1 및 세르핀B2의 발현 수준이 개개의 천식 환자 내에서 상당히 상관이 있었다. 더우기, 이들 유전자는 전부는 아니지만 몇몇 천식 대상체에게서 고도로 발현되었다 (도 1a 및 1b). 또한, 이들 3가지 유전자의 발현 수준은 개개의 천식 대상체 내에서 고도로 상관이 있었다 (도 1b). 이들 데이터는 특정의 IL-13 마커가 특이적 천식 환자 서브세트에서 과발현되었다는 것을 제안하고 있다. 추가의 실험에서, 본 발명자들은 IL-13에 의해 직접 또는 간접적으로 조절될 수도 있는 부가의 유전자 또는 마커를 확인하고자 하였고, IL-13 마커의 발현에 기초하여 천식 환자 서브세트를 명확히 규명하고자 하였다.

천식 환자 기도 상피에서 IL-13에 의해 잠재적으로, 직접 또는 간접적으로 조절될 수 있었던 기타 유전자 또는 마커를 확인하기 위해, 본 발명자들은 그의 발현이 페리오스틴과 상당히 상관이 있었던 유전자에 대한 42명 천식 환자 대상체 전반에 걸친 전체 마이크로어레이 데이터세트를 조사하였다. 본 발명자들은 그의 발현이 0.05의 역치 q-값 아래인 개개 대상체에게서 페리오스틴과 공동-조절되었던 653개 프로브 클러스터를 확인하였다. 이러한 653개 프로브의 발현 수준을 기준으로 하여 건강한 대조군 및 천식 환자를 포함한 모든 대상체를 감독되지 않은 클러스터링한 결과, 2개의 주요 클러스터, 즉 고 발현 수준의 페리오스틴 및 공동-조절된 유전자를 수반한 클러스터, 및 저 발현 수준의 페리오스틴 및 공동-조절된 유전자를 수반한 클러스터를 밝혀내었다. 이러한 유전자 클러스터의 코어 (도 1c, 우측 패널)은 도 13에 도시된 유전자를 나타내는 35개 프로브의 서브세트를 포함하고, 본 발명자들은 본원에서 "IL-4/13 시그네처", "IL-4/13 유전자 시그네처", "IL-13 시그네처" 또는 "IL-13 유전자 시그네처"로서 지칭하였다. 앞서 표시된 바와 같이, 이들 용어는 본원에서 동의어로 사용된다. 고 발현 수준의 페리오스틴 및 공동-조절된 유전자를 수반한 클러스터는 21명 천식 대상체에 포함되었고 건강한 대조군에서는 전혀 포함되지 않은 반면 (도 1c, 우측 패널, "IL-4/13 시그네처 고"로 표지됨), 저 발현 수준의 페리오스틴 및 공동-조절된 유전자를 수반한 클러스터는 나머지 21명 천식 대상체에 포함되었고 (도 1c, 우측 패널, "IL-4/13 시그네처 저"로 표지됨), 건강한 대조군 27명 모두에게 산재되어 있다 (도 1c, 우측 패널).

클러스터 1 ("IL-4/13 시그네처 고")은 페리오스틴, CST1, CST2, CST4, CCL26, CLCA1, CDH26, PRR4, 세르핀B2, 세르핀B10, CEACAM5, iNOS, C2ORF32, PTGS1, P2RY14, RUNX2, SH3RF2, WLRW300, DNAJC12, ALOX15, GSN, RGS13, TGSAB1, PTSG1, FCER1B, 및 CPA3에 대한 프로브에 상응하는 유전자의 고 발현 수준을 특징으로 하고, 본 연구에서 천식 환자의 대략 절반 (42명 천식 환자 중의 23명)과 건강한 대조군 총 27명 중에서 1명으로 이루어진다. 클러스터 2 (건강한 대조군 및 "IL-4/13 시그네처 저")는 상기 표시된 프로브에 상응하는 유전자의 저 발현 수준을 특징으로 하고, 나머지 19명의 천식 환자 및 27명의 건강한 대조군 중의 26명으로 이루어진다. RGS13, TPSG1, TPSAB1, FCER1B, CPA3, 및 SLC18A2를 포함한, 비만 세포에서 주로 발현된 유전자에 상응하는 프로브는 표 2에 블루로 표시되고, P2RY14 및 ALOX15를 포함한, 호산구에서 주로 발현된 유전자에 상응하는 프로브는 오렌지색으로 표시된다. 상피 브러싱이 주로 상피 세포와 배상 세포로 이루어지긴 하였지만 (평균 97％, 중앙 98％, 최소 91％), 소수의 침윤성 비만 세포 및 호산구가 클러스터 1 천식 환자로부터의 브러싱에서 관찰되었고, 시그네처에 비만 세포 및 호산구 유전자가 존재한다는 것은 이러한 침윤을 반영하는 것으로 예상된다.

IL-13 마커의 발현을 기준으로 하여 천식 대상체 서브세트를 명확히 규명하기 위해, 본 발명자들은 페리오스틴, CLCA1 및 세르핀B2의 마이크로어레이 발현 수준을 기준으로 하여 모든 70명 대상체 (42명의 천식 환자 및 27명의 건강한 대조군)의 감독되지 않은 계층적 클러스터링을 수행하였다 (도 1d). 이러한 분석에서는, 천식 대상체의 대략 절반 (N=22)이 지속적으로 높은 발현 수준의 IL-13-유도된 유전자를 나타내었고, 이를 클러스터 덴드로그램 (dendrogram)의 하나의 주요 분지에 함께 모았다 (클러스터 1, "IL-13 고" 서브세트). 현저하게도, 페리오스틴, CLCA1 및 세르핀B2가, 42명 모든 천식 환자를 27명 모든 건강한 대조군과 비교한 경우에 상당히 과발현되었지만 [8], 본 연구에서 조사된 천식 환자의 거의 절반 (N=20)은 이들 3가지 유전자의 발현을 기준으로 하여 건강한 대조군과 구별 가능하지 않았다. 이러한 천식 환자 서브세트 ("IL-13 저" 서브세트) 및 모든 건강한 대조군을 덴드로그램의 두 번째 주요 분지에 함께 모았다 (도 1d, 클러스터 2). 따라서, 상피 유전자 발현에 기초한 계층적 클러스터링은 2개의 별개의 천식 환자 서브세트 (본원에서 "IL-13 고" 서브세트 및 "IL-13 저" 서브세트로서 지칭된다)를 확인하였다.

상피 세포에서의 IL-13 유도성 마커 발현을 이용하여 확인된 이들 천식 환자 서브세트의 정당성을 확인하기 위해, 본 발명자들은 대상체 48명 (14명의 건강한 대조군, 18명의 클러스터 1 천식 환자, 및 16명의 클러스터 2 천식 환자)으로부터 동시에 수득한 기관지 생검에서 IL-13 및 특정의 기타 Th2 사이토킨 (즉, IL-4 및 IL-5)의 발현 수준을 측정하였다. qPCR을 이용하여, 본 발명자들은 IL-13, IL-5 및 IL-4 발현이 기관지 생검의 균질물에서 탐지 가능하였다는 것을 발견하였다. 특히, IL-13 및 IL-5 발현은 클러스터 2 천식 환자 또는 건강한 대조군과 비교해서 클러스터 1 천식 환자에서 상당히 더 높았지만 (도 1e, *, p < 0.002), IL-4 발현은 그렇치 못하였다. 그러나, 클러스터 2 천식 환자와 건강한 대조군 간에는 IL-4, IL-5, 또는 IL-13 발현에 있어서 상당한 차이가 없었다 (도 1e). 또한, 본 발명자들은 IL-13 및 IL-5의 발현 수준이 모든 천식 대상체 전반에 걸쳐 고도로 상관이 있었다는 사실을 밝혀내었다 (스페아르만 랭크 순서 상관 관계 ρ=0.58, p<0.0001; 도 1e). IL-4는 IL-13과 우성 신호 전달 경로를 공유하고 있고, IL-13과 유사하게 페리오스틴 [7,9] 및 CLCA1 [12] 발현을 유도시키는 것으로 밝혀졌다. 상승된 수준의 IL-4 발현성 T 세포가 천식 환자로부터의 기관지폐포성 세정 (BAL) 유체에서 보고되었고 [79] 본 발명자들은 본 연구에서 BAL T 세포에서의 사이토킨 유전자 발현 또는 BAL 또는 기관지 조직에서의 사이토킨 단백질 수준을 구체적으로 조사하지 않았기 때문에, 본 발명자들은 관찰된 페리오스틴, CLCA1 및 세르핀B2의 유도가 부분적으로는 IL-4 뿐만 아니라 IL-13에 기인한다는 가능성을 배제할 수 없다. 본원에 제시된 데이터를 기준으로 하여, 본 발명자들은 기관지 IL-13 발현과 상피 페리오스틴, CLCA1 및 세르핀B2 발현 간의 상관 관계를 자신있게 식별할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 클러스터 1 천식 환자를 지칭하기 위해 용어 "IL-4/ 13 고" 및 "IL-13 고"를 동의어로 사용하고, 클러스터 2 천식 환자를 지칭하기 위해 용어 "IL-4/13 저" 및 "IL-13 저"를 동의어로 사용하였다. 용어 "IL-13 고" 및 "IL-13 저"를 사용하는 경우, IL-4 및/또는 아직까지 확인되지 않은 기타 인자들 역시 부분적으로, 관찰된 유전자 발현 패턴에 기여할 수 있다는 것을 인지해야 한다.

실시예 3 - IL-4/13 시그네처의 구성분 유전자

IL-4/13 시그네처 내에는 2가지 주요 유전자 군: 상피 또는 배상 세포 발현된 유전자 및 비만 세포 발현된 유전자가 있다. 각 기관지 브러싱 샘플 내의 90％ 초과 세포가 기관지 상피 세포 또는 배상 세포였다 (평균 97％, 중앙 98％, 최소 91％). 다음 상피 또는 배상 세포 유전자에 상응하는 프로브의 발현 수준은 페리오스틴의 발현 수준과 상당히 공동-조절되었다: CST1, CST2, CCL26, CLCA1, PRR4, 세르핀B2, CEACAM5, 및 iNOS (표 2, 별표로 표시됨; IL-4/13 시그네처 저 대상체에 비해 IL-4/13 시그네처 고 대상체에서 > 3배 더 높게 발현됨). CLCA1의 마우스 오르토로그인 mCLCA3 (gob-5로서 공지되기도 함)이 기도 상피의 배상 세포 화생 및 점액 생성과 연관된 유전자로서 기존에 확인되었고, 둘 다는 IL-9 및 IL-13을 포함한 Th2 사이토킨에 의해 유도된다 [12-14].

세르핀B2는 염색체 18q21 상의 유전자 클러스터에 암호화된 세린 프로테아제 억제제 대형 계열의 구성원이다 (도 2a, 상부; UCSC 게놈 브로셔로부터 스크린 포착; http://genome.ucsc.edu). 세르핀 B2 [8], B3, 및 B4의 발현 수준은 재조합 IL-4 및 IL-13에 의한 자극시 기도 상피 세포에서 유도된다 [7, 15].

시스타틴 (CST) 1 및 2는 염색체 20p11 상의 유전자 클러스터에 암호화된 시스테인 프로테아제 억제제 대형 계열의 구성원이다 (도 2a, 중앙; UCSC 게놈 브로셔로부터의 스크린 포착; http://genome.ucsc.edu). 몇 가지 시스타틴이 기관지 상피에서 발현되는데 [16]; CST4는 천식 환자의 기관지폐포성 세정 유체 (BAL)에서 상승된 수준으로 확인되었고 [17]; 혈청 CST3은 건강한 대조군과 비교해서 천식 환자에서 상승되고, 그의 수준은 ICS 치료에 의해 감소된다 [18]. 세르핀 및 CST 유전자 계열은 각각 염색체 상에 공동-국재하기 때문에, 본 발명자들은 세르핀 및 시스타틴 유전자 계열의 어떠한 부가의 구성원도 이미 확인된 것과 공동-조절되는 지를 탐구하였다. 본 발명자들은 세르핀 및 시스타틴 유전자 계열에 한정된, 마이크로어레이 데이터의 감독되지 않은 클러스터 분석을 수행하였다. 본 발명자들은 세르핀 B2, B4, 및 B10; 및 시스타틴 1, 2, 및 4가 상당히 공동-조절되었는데, "IL-4/13 시그네처"에 대해 양성인 천식 환자에서 가장 높은 발현 수준이 존재한다는 사실을 밝혀내었다 (도 2b).

PRR4는 염색체 12p13 상의 유전자 클러스터에 암호화된 단백질 대형 계열의 구성원이다 (도 2a, 하부; UCSC 게놈 브로셔로부터의 스크린 포착; http://genome.ucsc.edu). 이들 프롤린-풍부 단백질은 타액 및 눈물을 포함한 점액성 분비물에서 발견된다. 관련되긴 하지만, 오르토로그가 아닌 단백질 SPRR1a, 2a, 및 2b가 천식 마우스 모델에서 기관지 상피에서 확인되었고, 이는 IL-13에 의해 유도된다 [19, 20]. PRR/PRB 계열로부터의 프롤린-풍부 단백질을 기관지 분비물에서 확인하였고 [21], 그들의 발현은 기관지 상피에서 확인되었다 [16]. PRR/PRB 계열 중에서, PRR4 및 PRB4가 고 발현의 IL-4/13 유전자 시그네처를 나타내는 천식 환자에서 상당히 상향 조절되었다 (도 2c, 좌측 및 중앙).

CCL26 (Eotaxin-3)은 천식 환자 기도 상피 중의 IL-4 및 IL-13 유도성 케모카인이다.

CEACAM5는 많은 상피 조직 및 상승된 혈청에서 발견되는 세포-표면 당단백질을 암호화한다. CEACAM5 (암배아성 항원; CEA)는 상피 악성 종양 및 전이성 질병의 널리-확인된 전신 바이오마커이다. 상승된 CEA 수준이 천식 환자 서브세트에서 보고되었는데, 특히 높은 혈청 수준이 점액 막힘 천식 환자에서 관찰되었다 [22]. CEACAM5는 IL-4/13 시그네처 저 및 건강한 대조군 기도 상피와 비교해서 IL-4/13 시그네처 고 천식 기도 상피에서 상당히 상향 조절되는데 (도 2c, 우측), 이는 혈청 CEA 수준을 이용하여 이들 두 천식 환자 아표현형을 구별할 수 있다는 것을 제안한다.

유도성 산화질소 합성효소 (iNOS)는 기도 염증과 연관이 있고, 인간 일차 기관지 상피 세포 배양에서 IL-13에 의해 유도된다 [23]. iNOS 효소적 활성 생성물인 배출 산화 질소 (eNO)의 측정이 천식의 진단과 모니터링에 흔히 사용되고 있다.

실시예 4 - 비만 세포

본 연구에 사용된 기도 브러싱이 주로 상피 세포와 배상 세포를 포함하긴 하였지만, 많은 샘플에는 작긴 하지만 유의적 비율의 침윤성 백혈구가 존재하였다. 그의 발현이 비만 세포에 대해 특이적인 유전자 [이에는 트립타제 (TPSD1, TPSG1), 카복시펩티다제 A3 (CPA3), 및 Fc엡실론RI베타가 포함된다]는 IL-4/13 유전자 시그네처와 상당한 상관 관계가 있었다 (표 2 및 표 4; 표 4에서 이중 별표가 마크된 비만 세포 유전자). 알레르기 질환에 있어서의 조직-상주 비만 세포의 유의적 역할과, IL-13 발현성 비만 세포가 천식 환자 내기관지 생검 표본에 존재한다는 것이 객담에서 탐지 가능한 수준의 IL-13과 분명한 상관 관계가 있다는 최근의 발견을 고려해 볼때 [6], 비만 세포-특이적 유전자와 IL-4/13 시그네처 간의 고도의 상관 관계는 다음을 제안하고 있다: 1) 비만 세포는 기도 상피 중의 IL-13의 유의적 공급원일 수 있고; 2) 기도 상피 내로의 비만 세포 침윤이 천식 환자의 IL-4/13 시그네처 고 서브세트의 독특한 특징일 수 있다.

실시예 5 - IL-4/13 시그네처를 예측하는 조합물

IL-4/13 시그네처에서 개개 유전자의 발현 수준은 개개 대상체의 IL-4/13 시그네처 상태를 가변적 정확도로 예측할 수 있지만, 이들 유전자의 조합물을 이용하여 증가된 민감도 및 특이도로 개개 대상체를 IL-4/13 시그네처 고 또는 저 범주로 배정할 수 있다.

실시예 6 - 스테로이드 효과

대증 요법 (즉, 베타-아드레날린작동성 작동제)시 잘 제어되지 않는 기관지 천식에 대한 주의 기준은 흡입 코르티코스테로이드 (ICS)이다. 기도에서의 IL-13 수준이 상승된 경증 내지 중간 정도의 천식 환자 [6], 및 식도 조직에서의 IL-13 발현 수준이 상승된 호산구성 식도염 환자에서는 [11], ICS 치료가 병든 조직에서 IL-13 및 IL-13-유도된 유전자의 수준을 상당히 감소시킨다. ICS 치료 1주 후 천식 환자의 기도 상피 및 배양된 기관지 상피 세포에서, 본 발명자들은 코르티코스테로이드 치료가 페리오스틴, 세르핀B2 및 CLCA1의 IL-13-유도된 발현 수준을 상당히 저하시킨다는 사실을 밝혀내었다 [8]. 표 2에 열거된 유전자를 추가로 조사한 결과, 두 번째 기관지경술 이전에 1주 ICS 치료를 받은 본 연구의 19명 대상체에게서는, 대다수의 IL-4/13 시그네처 유전자가 천식 환자 기관지 기도 상피에서 ICS 치료에 의해 상당히 하향 조절되었다 (페리오스틴이 한 예로서 제시된다, 도 3a). 이러한 하향 조절은 ICS-매개된 IL-13 수준 감소, ICS-매개된 표적 유전자 발현 저하, 또는 이 둘의 조합에 따른 결과일 수 있다. 그러나, IL-4/13 시그네처에서의 2개 유전자 PRR4 (도 3b) 및 RUNX2 (도 3c)는 ICS 치료 1주 후에 개개 대상체에게서 상당히 하향 조절되지 않았다. 이는 PRR4 및 RUNX2가 천식 환자 기도 상피에서 IL-4/13 시그네처의 스테로이드-불감성 마커일 수 있다는 것을 제안하고 있다. 또 다른 가능성은 PRR4 및 RUNX2가 IL-4 및/또는 IL-13에 의해서 단지 간접적으로 조절된다는 것인데, 예를 들어 PRR4가 많은 분비물에서 발견되기 때문에, 이는 배상 세포-특이적 유전자일 수 있다. 상피 세포로부터의 배상 세포 분화가 IL-13에 의해 유도되기 때문에, ICS-매개된 IL-13의 억제 및 IL-13 의존성 공정은 단지 치료 7일 후에는 배상 세포 수에 상당히 강한 영향을 끼지지 않을 수 있지만, 보다 장기간의 ICS 치료 후에는 배상 세포 수 (그리고, 이에 따른 내기관지 브러싱에서의 PRR4 발현)가 감소하는 것으로 예상할 수 있다. ICS 치료에 대해 불응성인 중증의 천식 환자에서는, 유사한 분획의 대상체 (대략 40％)가 탐지 가능한 객담 IL-13 수준 내지 ICS-투약하지 않은 경증의 천식 환자에서 관찰된 수준을 갖는 것으로 밝혀졌는데[6], 이는 본 연구에서 관찰된 IL-4/13 시그네처를 나타내는 대상체 분획과 일치한다. 이러한 관찰 결과는, IL-4/13 시그네처가 본 연구에서 조사된 경증-중간 정도의 ICS-반응성 천식 환자에서 ICS 치료에 의해 상당히 하향 조절되긴 하지만, 중증의 스테로이드-내성 천식 환자에게 여전히 존재할 수도 있다는 것을 제안하고 있다.

실시예 7 - IL-4/13 시그네처와 임상적 특징 및 기타 바이오마커와의 관계

● 인구 통계

기도 호산구의 수준 상승으로써 정의된 바와 같은 호산구성 천식은 아토피와 연관이 있고, 남성과 여성 간에 대략 동등한 비율로 발생하지만, 기도에서 호산구의 상대적 부재로써 정의되는 바와 같고 아토피의 결여와 연관이 있는 비-호산구성 표현형은 여성에게서 상당한 우위를 나타낸다 [1]. 기도 상피 IL-4/13 유전자 시그네처에 따라서 분류된 대상체 중에서, 21명의 IL-4/13 시그네처 고 대상체 중의 10명 (48％)이 여성인 반면, 21명의 IL-4/13 시그네처 저 대상체 중의 15명 (71％)이 여성이었다 (표 3). IL-4/13 시그네처 저 군과 IL-4/13 시그네처 고 군 간에는 자체 보고된 민족성에 의한 상당한 편중화가 없었다.

IL-4/13 시그네처의 성 분포도, N (％)

● FEV₁ 및 메타콜린 반응성

IL-4/13 저 군과 IL-4/13 고 군 간의 성 편중화가, 천식 환자 기도 상피에서 관찰된 유전자 발현 패턴이 안정적인 근원적 표현형을 반영한다는 것을 제안하긴 하지만, 관찰된 유전자 발현 패턴이 단지, 기관지경술 시점에 질병 중증도 또는 활성을 반영한다는 것이 가능하다. IL-4/13 시그네처가 천식 중증도와 상관이 있었는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 군들 간의 1초 동안의 강제 호기 용적 (FEV₁, 기관지경술을 수행하기 1주 전에 스크리닝 방문시 측정한 환자 체중으로부터 예측된 비율로서 정의됨)을 비교한 결과, IL-4/13 시그네처 고 군과 IL-4/13 시그네처 저 군 둘 다가 건강한 대조군 보다 상당히 더 낮은 FEV₁을 갖고 있긴 하지만, 이들 군 간에는 통계상 유의적 차이가 없었다는 사실을 밝혀냈지만 (도 5a 참고), IL-4/13 시그네처 저 군에서 보다 IL-4/13 시그네처 고 군에서 "중간 정도" (즉, FEV₁이 예측치의 60 내지 80％이다)로서 분류될 수도 있는 대상체가 더 많았다. 20％의 FEV₁ 상의 감소를 유도시키는 데 요구되는 메타콜린의 최소 농도 (mg/ml) (PC₂₀, 기관지경술을 수행하기 1주 전에 스크리닝 방문시 측정함)는 기관지 과반응성의 측정 기준이다. 이는 기관지 과민성 (BHR)의 측정 기준이다. IL-4/13 시그네처 고 군과 IL-4/13 시그네처 저 군 둘 다는 건강한 대조군 보다 상당히 더 낮은 PC₂₀ 값을 갖고 있었는데, IL-4/13 시그네처 저 군에서 보다 IL-4/13 시그네처 고 군에서의 PC₂₀ 값이 더 낮은 경향이 있긴 하지만, 그 차이는 통계적 유의성에 도달하지 못하였다 (도 5c 참고).

● IgE 및 호산구 (말초 및 기도)

개개 대상체의 IL-4/13 시그네처 상태가 아토피의 표준 측정 기준에 의해 예측할 수 있었는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 기관지경술 시점에 수득한 표준 임상 실험실 시험을 이용하여, 혈청 IgE의 수준 (1 밀리리터당 국제 단위; 1 IU = 2.4 ng), 말초혈 호산구 계수치 (혈액 1 리터당 호산구의 절대 수 x 10＾9), 및 기관지폐포성 세정 유체 (BAL) 중의 호산구 비율 (기관지폐포성 세정 유체 중의 비-편평 세포의 총 수와 비교한 호산구 비율)을 조사하였다. 대상체를 IL-4/13 시그네처 상태에 대해 계층화한 경우에는, 혈청 IgE (도 6b 참고), 말초혈 호산구 계수치 (도 6c 참고), 및 BAL 호산구 비율 (도 6d 참고)에 있어서 유의적 차이가 있었는데, 각 분석물에 대해 상당히 더 높은 값은 IL-4/13 시그네처 저 군과 비교해서 IL-4/13 시그네처 고 군에서 관찰되었다. 개별적으로 보면, IgE 수준이나 말초혈 호산구 계수치 어느 것도 개개의 모든 대상체의 기도 상피 IL-4/13 시그네처 상태를 고 민감도 및 특이도로 동시에 예측하지 못한다. 그러나, 개개의 천식 환자 간에는 IgE 수준과 말초혈 호산구 계수치가 약한 수준이긴 하지만, 상당히 상관이 있다 (rho=0.44, p=3.4x10^{- 3}). 복합적으로 고려한 경우에는, 실험적으로 유래된 100 IU/ml IgE와 0.14 x 10⁹/L 호산구 둘 다의 컷오프 값은 개개 대상체의 기도 상피 IL-4/13 시그네처 상태를 고 민감도 및 특이도로 예측해준다 (도 4; 저 IL-4/13 시그네처와 고 IL-4/13 시그네처 둘 다에 대해 21명 중 18명이 정확하다; 민감도 = 86％, 특이도 = 86％).

실시예 8 - 천식의 "IL-13 고" 및 "IL-13 저" 아표현형과 임상적 특징과의 관계

천식 환자 대상체를 대상으로 하여, 실시예 7에 기재된 바와 같이 부가의 인구학적 특징과 임상적 특징에 관하여 추가로 분석하였다. 그 결과가 표 5 및 도 5 및 6에 제시되어 있다. "IL-13 고" 천식 아표현형을 나타내는 대상체가 인구학적 특징, 폐 기능 또는 기관지확장기 반응성 (알부테롤을 이용한 경우의 델타 FEV1)을 기준으로 하여 "IL-13 저" 천식 아표현형을 나타내는 대상체와 구별할 없었지만 (표 5, 도 5a-b), 이들 군은 기도 과반응성 정도 (AHR; 호기 유량 상의 20％ 감소를 유도시키는 데 요구되는 메타콜린의 최소 농도로서 정의된, 메타콜린에 대한 PC₂₀, 도 5c)와 관련해서는 상당히 상이하였다. 이러한 AHR 상의 차이는 모든 천식 환자가 유의적 AHR을 갖도로 요구되는 시험 대상 환자 기준에도 불구하고 명백하였다 (모든 천식 환자 < 8 mg/ml, 모든 건강한 대조군 > 20 mg/ml).

정상적으로 분포된 데이터의 경우, 그 값은 평균±표준 편차로서 제시되고 스튜던츠 t-시험을 수행하였으며; 정상적으로 분포되지 않은 데이터의 경우에는, 그 값이 중앙값 (범위)로서 제시되고 윌콕슨 랭크 합 시험을 수행하였다. 생략된 데이터의 경우에는, 그에 대한 데이터가 존재하는 대상체의 수가 기록되었다. 건강한 대조군과 비교한 p-값이 또한 도 5 및 6에 도시되어 있다. PC₂₀은 FEV₁ 상의 20％ 감소를 유발시키는 데 요구되는 도발적인 농도를 의미하고; BAL은 기관지폐포성 세정을 의미하며; RBM은 망상 기저막을 의미한다.

개개 대상체의 IL-13 아표현형이 알레르기성 염증의 측정 기준과 상관이 있었는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 12개의 공기 알레르겐 패널 (표 6)에 대한 피부 찌르기 시험 (SPT), 혈청 IgE 수준, 말초혈 호산구 계수치 및 기관지폐포성 세정 유체 (BAL) 중의 호산구 비율 결과를 조사하였다. 그 결과가 도 6a-d 및 7a-b에 도시되어 있다. IL-13 고 천식 아표현형과 IL-13 저 천식 아표현형 둘 다가 건강한 대조군과 비교해서 공기 알레르겐에 대한 SPT 민감도가 증가하였지만 (도 6a), IL-13 저 천식 아표현형은 IL-13 고 천식 아표현형 보다 더 적은 수의 양성 피부 시험을 나타내는 경향이 있고, 개 및 집먼지 진드기와 같은 공기 알레르겐에 대해 덜 자주 민감화되는 경향이 있다 (도 7a). IL-13 고 천식 아표현형을 나타내는 대상체는 IL-13 저 천식 아표현형을 나타내는 대상체 보다 더 높은 혈청 IgE 수준을 갖고 있고 더 많은 말초혈 호산구 계수치를 나타냈지만, IL-13 저 천식 아표현형은 알레르기성 염증 특징과 관련해서는 건강한 대조군과 상이하였다 (도 6b-c). 또한, IL-13 고 천식 아표현형을 나타내는 대상체는 BAL에 의해 평가된 바와 같이 폐에서의 호산구 수가 증가한 반면 (도 6d), IL-13 저 천식 환자는 BAL 호산구 비율 면에서 건강한 대조군과 상이하지 않았다. 이들 데이터는 IL-13 고 천식 아표현형을 나타내는 대상체에서는 AHR, IgE 수준 및 호산구성 염증이 강화되었다는 것을 입증하고 있지만, 공기 알레르겐에 대한 SPT 민감도는 이러한 아군에 제한되지 않았다. 따라서, 공기 알레르겐에 대한 감작화에 대한 대체 비-Th2 기전이, IL-13 저 천식 아표현형을 나타내는 대상체에게서 작동하는 것으로 예상된다.

IL-13 고 천식 아표현형이 알레르겐에 대한 최근 노출로 인한 Th2-구동 염증의 영구적 또는 일시적 징후인지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 동일한 대상체로부터의 기관지 생검에서 병리학적 변화를 측정하였다. 본 발명자들 및 다른 이들은 기존에, 천식이 기도 재형성으로서 공지된 병리학적 변화와 연관이 있고 오래 지속되어 온 염증 또는 시간 경과에 따른 손상 및 복구 효과를 반영하고 있다는 사실을 입증하였다 [28, 29]. 천식에서 2가지 특이적 재형성 성과는 상피하 망상 기저막 (RBM)이 두꺼워지는 징후를 보이는 기도 섬유증 [30, 31], 및 기도 상피에 점액소 저장고가 증가하는 것이다 [32]. 본 발명자들은 RBM 두께가 IL-13 저 천식 아표현형을 나타내는 대상체 또는 건강한 대조군에서 보다 IL-13 고 천식 아표현형을 나타내는 대상체에서 더 컸다는 사실과, RBM 두께가 IL-13 저 천식 아표현형에서 정상이었다는 사실을 발견하였다 (도 6e). 또한, 본 발명자들이 천식 대상체의 양 아표현형에서 상피 점액소 저장고가 증가하는 경향이 있다는 사실을 관찰하였지만, 이러한 증가는 단지 IL-13 고 천식 아표현형을 나타내는 대상체에게서만 유의적이었다 (도 8a). 총 점액소 저장고 상의 이들 차이가 그리 대단하지는 않은 것이었지만, qPCR 결과, IL-13 고 천식 아표현형에서 기도 상피 세포 내의 주요 젤-형성 점액소의 발현 수준은 IL-13 저 천식 아표현형 및 건강한 대조군 둘 다와 비교해서 현저한 차이가 있는 것으로 밝혀졌다 (도 8b-d). 구체적으로 언급하면, IL-13 고 천식 아표현형은 MUC5AC 및 MUC2 발현 유도와 MUC5B 발현 억제 측면에서 IL-13 저 천식 아표현형 및 건강한 대조군과 구별되었다. 이와 같이 IL-13 고 천식 아표현형에서 특이적 점액소 유전자의 발현이 변경되는 것은 MUC5AC 대 MUC5B 발현 비에서 가장 명백하다 (도 6f). 특정 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 본 발명자들은 특이적 젤-형성 점액소의 유도와 억제가 동시에 일어나는 것이, IL-13 저 천식 아표현형 및 건강한 대조군과 비교해서 IL-13 고 천식 아표현형에서 상피 점액소 저장고가 비교적 보통 수준으로 증가하는 것을 설명할 수 있다고 추측하고 있다. 취합해 보면, 이들 발견은 IL-13 고 천식 아표현형이, 시간 경과에 따라 이러한 아표현형을 영구적인 것으로 확인시켜 주는 기도 상의 재형성 변화와 연관이 있다는 것을 나타낸다. 이들 결과는 또한, 인간 대상체에서 기도 재형성에 대한 IL-13 경로의 중요성을 입증해준다.

폐포성 대식 세포는 IL-13 [54] 및 류코트리엔 또는 에이코사노이드 지질 [55, 56]의 공급원으로서 천식에서 알레르기성 기도 염증을 조정할 수 있거나 또는 IL-13의 영향력 하에 "대체 활성화"를 통하여 [57] 알레르기성 기도 염증을 조정할 수 있다. "IL-13 고" 천식을 나타내는 대상체로부터의 폐포성 대식 세포가 이들 발견 중 어느 것을 나타내는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 14명의 천식 대상체와 15명의 건강한 대조군에게서 qPCR을 이용하여 관련 유전자의 발현을 측정하였다 (표 7). 본 발명자들은 일반적으로는 천식에서 또는 구체적으로는 "IL-13 고" 아군에서 대체 활성화 마커의 유도 또는 Th2 사이토킨의 유도에 대한 명백한 증거를 발견하지 못하였다. IL-13의 발현 수준은 상기 29명의 대상체 중의 26명에게서 탐지 한계치 아래였고 (주기 역치 >40), IL-4는 29명의 대상체 중의 20명에게서 탐지 한계치 아래였다 (어느 한 사이토킨에 대한 3개 군 간의 차이는 없었다, 모두 p>0.35). 기타 유전자 모두는 샘플 전반에 걸쳐 탐지 한계치 이내였다. 이들 분석에서, 본 발명자들은 "IL-13 고" 천식에서 15-리폭시게나제의 발현이 증가하였다는 것을 발견하였는데 (도 10, 표 8), 이는 중증의 호산구성 천식에서 기도 내에 15-리폭시게나제 생성물이 증가하였다는 기존의 발견과 일치한다 [56]. 본 발명자들은 또한, "IL-13 고" 아군에 제한된 TNFα의 발현이 증가하였다는 것을 발견하였다 (도 10, 표 8).

단지 일부 천식 환자 만이 흡입 코르티코스테로이드 (ICS)로 치료한 경우에 폐 기능 상의 개선을 나타내었다 [33]. 코르티코스테로이드 반응성의 유전자 발현 마커를 확인하기 위해, 본 발명자들은 기존에 보고된 바와 같이 흡입 플루티카손 또는 플라시보의 8주 무작위 제어 시험 동안 본 발명자들의 천식 대상체 일부에게서 FEV₁을 측정하였다 [8]. 본 발명자들이 IL-13 아표현형에 의해 대상체를 계층화하면서 상기 데이터를 재분석한 경우, 본 발명자들은 FEV₁ 상의 개선이 IL-13 고 아표현형을 나타내는 대상체로 제한되었다는 사실을 발견하였다. 구체적으로 언급하면, 흡입 플루티카손으로 치료한, IL-13 고 천식 아표현형을 나타내는 대상체는 플라시보로 치료한 대상체와 비교해서 4주 및 8주째 둘 다에서 FEV₁ 상의 상당한 개선을 나타낸 반면, IL-13 저 천식 아표현형을 나타내는 대상체는 그렇치 못하였다 (도 9a). 이러한 IL-13 고 군에서 FEV₁ 상의 개선은 약물 투여를 중단한 1주 후에 상실되었다. 어느 한 군에서 어느 시점에서도 플라시보에 대한 반응에서는 FEV₁ 상의 상당한 변화가 전혀 없었다 (데이터는 도시되지 않음, N=5 "IL-13 고", N=6 "IL-13 저"). 기존에 보고된 바와 같이 [8], 본 발명자들은 치료를 개시한지 1주 후에 두 번째 기관지경술을 수행하였고, 기준선으로서 마이크로어레이에 의해 기관지 상피에서의 유전자 분석을 수행하였다. 이들 데이터의 재분석에서, IL-13 아표현형에 의해 대상체를 계층화하면서, 기준선에서 IL-13 고 천식을 나타내는 대상체는 플라시보 치료 1주 후에 강력한 IL-13 아표현형을 지속적으로 나타내었는데, 이는 이러한 아표현형이 치료 부재 하에 단기간 안정성을 나타낸다는 것을 입증해준다. 그러나, 플루티카손 치료 1주 후에는, IL-13 고 천식을 나타내는 대상체를 치료에 상관없이 기준선에서 IL-13 저 천식을 나타낸 대상체와 클러스터링하였다 (도 9b). 따라서, 본원에 기재된 IL-13 시그네처를 기준으로 하여 천식을 표현형별 계층화하는 것은 ICS에 대한 반응을 예측해 준다. 이들 데이터는 천식에 대한 ICS 치료의 포괄적인 이득이 IL-13 고 아표현형에 기인한다는 것을 제안하고 있다.

본 발명자들의 결과는 천식에서 임상적 불균질성의 기초가 되는 분자성 기전을 새로이 고찰하게 해준다. 기본 조사는 기존에, 천식과 연관된 많은 병리생리학적 변화와 알레르기성 염증의 중추적 조절인자로서 IL-13 및 관련 Th2 사이토킨을 확립시켰다 [35, 36]. 본원에서는 유전자 발현 프로파일링을 이용하여, 본 발명자들은 천식 환자에서 "IL-13 고" 아표현형을 확인하였다. 엄격한 임상 기준과 메타콜린 챌린지 시험을 이용하여, 본 발명자들은 이러한 아표현형이 천식으로 진단된 환자의 약 50％ 만을 차지한다는 사실을 밝혀내었다. 이러한 "IL-13 고" 아표현형은 또한, 증가 수준의 IL-5 발현을 표시하였고, "IL-13 저" 아표현형 및 건강한 대조군과 비교해서 증강된 기도 과반응성, 증가된 혈청 IgE 수준 및 호산구성 염증, 상피하 섬유증 및 변경된 젤-형성 점액소 발현을 포함한, 특정의 두드러진 임상적 특징을 보여주었다.

본 발명자들의 연구 작업은 기도 상피 세포에서 IL-13 구동된 염증에 대한 유전자 시그네처가 단지 절반의 천식 환자에서만 현저하고, 따라서 비-IL-13 구동된 기전이 나머지 절반에서 작동해야만 한다는 사실을 밝혀냄으로써 천식 발병 기전에 관한 특정의 현 개념에 이의를 제기하고 있다. 본원에서 논의된 발견으로 인해, 본 발명자들은 천식을 각종 분자성 아표현형, 예를 들어 본원에서 지칭한 "IL-13 고" 및 "IL-13 저" 아표현형으로 나눌 수 있다고 제안하였다. 본 발명자들은 기관지 생검에서 유전자 발현의 확증적 분석, 반복 조사시 재현 가능성에 관한 분석, 및 이들 두 분자성 천식 아표현형의 별개의 임상적, 염증성, 병리학적 및 치료 관련 특징에 관한 포괄적인 성상 확인을 통하여 IL-13 고/IL-13 저 분류화 도식을 검증하였다. 이러한 발견은 천식이 복잡하고도 불균질한 질병이라는 최근의 임상적 관찰 결과에 대한 기전적 프레임워크를 제공해 준다 [58].

Th2 염증을 기준으로 한 천식의 분자성 표현형별 검사는 중요한 치료적 영향력을 지니고 있다. 첫째, "IL-13 고" 아표현형에서의 기도 폐쇄는 흡입 스테로이드를 이용하며 개선되는 반면, "IL-13 저" 아표현형은 개선을 거의 내지는 전혀 나타내지 않는다. 본 발명자들이 확인한 Th2 마커를 이용하여, 스테로이드-반응성 표현형의 대용 마커를 제공함으로써 스테로이드-반응성에 대한 임상 시험 개발을 유도할 수 있다. 둘째, IL-13 및 관련 Th2 사이토킨의 봉쇄는 천식에서의 치료 전략으로서 적극적인 임상 개발 중이다 [34]. 본 발명자들의 데이터는 이들 요법에 대한 임상적 반응이 "IL-13 고" 천식 환자의 특이적 아표현형에 제한될 수 있다고 제안하고 있다. 따라서, 이러한 분자성 표현형 마커는 임상 시험에 직접 적용된다.

유도된 객담 분석을 이용한 선행 연구는 "호산구성 천식"이 천식의 별개의 세포성 표현형이라고 제안하였지만, 이러한 세포성 표현형의 기초가 되는 분자성 기전은 규정되지 않았다. 본 발명자들의 데이터는 IL-13 구동된 염증이 "호산구성 천식"의 기초가 되는 분자성 기전이라는 것을 제안하고 있는데 [37], 이는 본 발명자들이 "IL-13 고 천식"에서 입증한 기도 호산구증 때문이다. 또한, 본 발명자들은 "호산구성 천식"과 "IL-13 고" 천식 둘 다가 상피하 섬유증[38, 39], 폐포성 대식 세포에 의한 ALOX15 생성 [55] 및 흡입 코르티코스테로이드에 대한 폐 기능 반응 [40, 41]을 특징으로 한다는 것을 입증하였다. 이와 같이 인식된 호산구성 천식의 특징들 이외에도, 본 발명자들은 "IL-13 고" 천식의 추가의 임상적 특징을 확인하였는데, 이러한 특징에는 Th2-사이토킨으로 간주되진 않지만 기존에는 중증 천식과 연관되었던 매개인자인 TNFα의 유도 및 기도 점액소 유전자 발현 변경이 포함된다 [59]. 본 발명자들은 이들 특징이 또한, 호산구성 천식에서도 발견될 것으로 추측한다. 또한, IL-5가, 본 발명자들이 "IL-13 고" 천식에서 관찰한 기도 및 전신 호산구증에 대한 주요 기여인자인 것으로 예상되는데, 이는 IL-5 발현이 IL-13 발현과 상당히 공동-조절되는 것으로 밝혀졌기 때문이다 (도 1e). IL-5는 호산구 분화, 동원, 활성화 및 생존의 주요 자극 요인이지만 [60], IL-13은 기도에서 CCL11, CCL22 및 CCL26과 같은 호산구 화학유인물질의 발현을 강력히 유도시킬 수 있으므로 [61], 기도에서 호산구 침윤, 활성화 및 생존을 증진시키기 위해 IL-5와 협력해서 작업할 수 있다. 따라서, 잔류 IL-13 활성은 천식에서 IL-5 봉쇄의 임상 시험시 관찰된 호산구의 불완전한 조직 고갈을 설명할 수 있다 [62, 63].

또한, 이들 데이터는 천식 환자의 상당 비율이 Th2-구동된 염증 부족에도 불구하고 기도 폐쇄, 기도 과반응성 및 기관지확장기 가역성과 같은 천식의 임상적 특징을 나타내는 "IL-13 저" 표현형을 갖고 있다는 것을 보여준다. "IL-13 저" 천식의 원인은 여전히 불명료한 채로 있지만, 그 가능성에는 호중구성 염증 [37], IL-17 구동 염증 [42], 장벽 기능에 있어서의 내재된 결함 [43] 및 비정형 세포내 세균에 의한 만성적 아임상 감염 [44]이 포함된다.

IL-13의 발현 수준은 상기 29명의 대상체 중의 26명에게서 탐지 한계치 아래였고 (주기 역치 >40), IL-4는 29명의 대상체 중의 20명에게서 탐지 한계치 아래였다 (어느 한 사이토킨에 대한 3개 군 간의 차이는 없었다, 모두 p>0.35). 기타 유전자 모두는 샘플 전반에 걸쳐 탐지 한계치 이내였다.

실시예 9 - 혈청 단백질 바이오마커에 대한 천식의 "IL-13 고" 및 "IL-13 저" 아표현형의 관계

추가의 마이크로어레이 분석으로 인해, 본 발명자들은 표 4에 열거된 유전자 및 프로브 세트로부터, 역치 가성 발견률 (FDR) (q값 < 0.05) 아래의 개개 대상체에게서 그의 발현이 페리오스틴과 공동-조절되는 28개 유전자를 나타내는 35개 프로브 세트를 확인하였다. 이들 유전자 및 프로브 및 관련 데이터가 표 9에 제시되어 있다. 건강한 대조군 및 천식 환자를 포함한 모든 대상체를 대상으로 하여 상기 프로브의 발현 수준을 기준으로 계층적 클러스터 분석한 결과, (1) 페리오스틴 및 공동-조절된 유전자의 고 발현 수준을 나타내는 클러스터 및 (2) 페리오스틴 및 공동-조절된 유전자의 저 발현 수준을 나타내는 클러스터의 상기 언급된 2가지 주요 클러스터를 확인하고 추가로 정의하였다 (도 11). 비만 세포 유전자에는 RGS13, TPSG1, TPSAB1, FCER1B, CPA3 및 SLC18A2가 포함된다. 호산구 유전자에는 P2RY14 및 ALOX15가 포함된다.

페리오스틴 및 공동-조절된 유전자의 고 발현을 나타내는 클러스터는 23명의 천식 대상체와 1명의 건강한 대조군에 포함되는 반면 (도 11, 클러스터 1, 레드로 표시됨), 페리오스틴 및 공동-조절된 유전자의 저 발현을 나타내는 클러스터는 나머지 19명의 천식 환자에 포함되었고, 건강한 대조군 26명에게 산재되어 있다 (도 11, 클러스터 2, 그린으로 표시됨). 실시예 8에서, 본 발명자들은 이들 프로브 3가지의 마이크로어레이-결정된 발현 수준을 기준으로 한 상기 데이터세트에서 대상체의 클러스터링을 기재하였다: 210809_s_at (페리오스틴), 210107_at (CLCA1), 및 204614_at (세르핀B2). 실시예 8에 기재된 3가지 프로브 시그네처는 이러한 완전한 35개 프로브 시그네처와 상관 관계가 큰데, 7명의 천식 환자와 1명의 건강한 대조군에 대해서는 상이하다 (도 11에서 * 표시된 모순된 콜).

3개-유전자 (페리오스틴, CLCA1 및 세르핀B2) IL-13 시그네처를 이용하여, 본 발명자들은 실시예 8에서, 혈청 IgE 및 말초혈 호산구 수준을 포함한 알레르기성 염증의 전신 마커가 "IL-13 저" 아표현형 천식 환자와 비교해서 "IL-13 고" 아표현형 천식 환자에서 상당히 상승하였다는 것을 나타내었다. 그러나, 개별적으로 취한 이들 계측치 각각에 대한 천식 환자 군 간에는 상당한 중복이 있었다. 또한, 혈청 IgE 수준이나 말초혈 호산구 수준 어느 것도 단독으로는, 기도 IL-13 시그네처 및 관련 "IL-13 고" 또는 "IL-13 저" 천식 아표현형을 동시에 고 민감도 및 특이도로 예측하기 위한 비-침습성 계측을 구성하지 않는다.

IgE 수준과 말초혈 호산구 수준의 교차점이 어느 한 계측치 단독 보다 더 큰 정밀도로 기도 염증 패턴을 예측할 수 있었는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 혈청 IgE 계수치와 말초혈 호산구 계수치를 함께, 기도 IL-13 시그네처 상태와 비교하여 평가하였다. 본 발명자들은 42명의 천식 환자 전반에 걸쳐, 혈청 IgE 계수치와 말초혈 호산구 계수치가 비록 약하긴 하지만 상관이 있었다는 사실을 발견하였다 (도 4; IL-4/13 시그네처에 대한 데이터가 도시됨; IL-13 시그네처에 대한 유사한 결과가 수득되었다 [표 10 참고]). IL-13 시그네처의 경우, "IL-13 고" 천식 환자 모두는 0.14 x 10⁹/L 초과의 호산구 계수치를 갖고 있었지만, 많은 "IL-13 저" 천식 환자는 보다 낮은 호산구 계수치를 갖고 있었다. "IL-13 고" 천식 환자 중 2명을 제외한 모두는 100 IU/ml 초과의 혈청 IgE 수준을 갖고 있었지만, 많은 "IL-13 저" 천식 환자는 그렇치 못하였다. (1) 혈청 IgE ≥ 100 IU/ml 및 (2) 호산구 계수치 ≥ 0.14 x 10⁹/L의 2가지 계측치를 합하면, 기도에서 IL-13 시그네처에 대한 민감도와 특이도가 개선되었다 (표 10). 따라서, 흔히 사용되고 있는 알레르기성 염증의 2가지 말초혈 계측치를 혼성하는 것이 기도 IL-13 구동된 염증에 대한 유효한 비침습성 바이오마커일 수 있다.

기관지 상피 IL-13 시그네처의 부가의 전신성 (비침습성) 후보 바이오마커를 확인하기 위해, 본 발명자들은 말초혈에서 탐지 가능할 수도 있는 세포외 또는 분비된 단백질을 암호화하는 유전자에 대한 시그네처를 조사하였다. 특별히 관심있는 3가지 후보는 CCL26, 페리오스틴 및 CEACAM5였다. CCL26은 기존에 기관지 상피에서 Th2 사이토킨-유도된 케모카인으로서 보고되었기 때문에 [71], 본 발명자들은 기존에 Th2 염증의 혈청 바이오마커로서 보고된 적이 없는 페리오스틴 및 CEACAM5의 성상 확인에 촛점을 맞추었다. CEACAM5는 상피-유래 암에서 예후 혈청 바이오마커로서 자주 사용되고 있는 암배아성 항원 (CEA)을 암호화한다. 페리오스틴은 또한, 제한된 수의 연구에서 특정 암에 대한 혈청 바이오마커로서 보고되었고, 흥미롭게도 대부분의 대상체에서 10s 내지 100s의 ng/ml 혈청 범위의 수준에서, 면역검정에 의해 용이하게 탐지될 혈청 마커에 대한 매력있는 특징들을 탐지할 수 있었다.

도 12a-b에 도시된 바와 같이, 페리오스틴 및 CEACAM5는 각각, IL-13 시그네처의 우수한 개별적 대표이고, "IL-13 저" 천식 환자 또는 건강한 대조군에서 보다 "IL-13 고" 천식 환자에서 상당히 더 높은 수준으로 발현된다. 개개의 천식 환자에서 페리오스틴과 CEACAM5의 마이크로어레이 발현 수준 간에는 강력한 상관 관계가 있었다 (도 12c). 이들 유전자 발현 패턴을 확인하고, 페리오스틴 및 CEACAM5 발현을, "IL-13 고" 천식 환자를 "IL-13 저" 천식 환자 및 건강한 대조군과 구별시켜 주는 알고리즘에 사용할 수 있었는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 마이크로어레이 분석에 사용된 동일한 기관지 상피 브러싱 샘플에서 qPCR에 의해 상기 두 유전자의 발현 수준을 분석하였다. 개개의 대상체에게서 마이크로어레이와 qPCR 값 사이에는 고 수준의 일치도가 존재하였다 (제시되지는 않음). 본 발명자들은 서수 로지스틱 회귀 분석을 이용하여, 페리오스틴 및 CEACAM5에 대한 qPCR 값을 이용하여 마이크로어레이-유래된 35-프로브 IL-13 상태에 대한 예측 모델을 생성시켰다. 이러한 모델의 예측 값은 고도로 유의적이었고 (p<0.0001), 페리오스틴 및 CEACAM5 파라미터 예상치 각각은 상기 모델에서 상당한 효과를 나타내었다 (CEACAM5의 경우 p<0.02; 페리오스틴의 경우 p<0.0001). 수신자 동작 특성 (ROC) 곡선 분석은 건강한 대조군에 대한 완벽한 예측도와, "IL-13 고" 및 "IL-13 저" 천식에 대한 극히 높은 민감도 및 특이도를 입증하였다 (도 12d). 취합해 보면, 이들 데이터는 페리오스틴 및 CEACAM5의 기관지 상피 발현 수준이 전반적인 IL-13 시그네처에 대한 우수한 대용물이라는 것을 보여준다.

가용성 페리오스틴 및 CEA 단백질의 수준 상승이 말초혈에서 탐지 가능하였는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 면역검정을 이용하여 100명의 천식 환자 및 48명의 건강한 대조군으로부터의 혈청에서 페리오스틴 및 CEA를 조사하였다. 또한, 본 발명자들은 몇몇 천식 환자에서 상승되는 것으로 기존에 보고된 혈청 마커인 YKL-40 및 IgE를 이들 동일한 혈청에서 측정하였다 [72]. 본 발명자들은 건강한 대조군과 비교해서 천식 환자에서 IgE, 페리오스틴, CEA, 및 YKL-40의 수준이 상당히 상승되었다는 것을 관찰하였다 (도 13a-d). 그러나 모든 경우에 있어서, 군들 간에는 각 바이오마커의 혈청 수준이 상당히 중복되었다. 실시예 8에 제시된 바와 같이, 흡입 코르티코스테로이드 (ICS) 치료는 기준선에서 상승된 페리오스틴을 갖고 있는 천식 환자에서 페리오스틴의 기관지 상피 발현을 저하시킨다 (또한 [8] 참고). 그의 혈청을 조사한 100명의 천식 환자 중에서 51명이 흡입 코르티코스테로이드 (ICS) 치료를 받았고, 49명은 그렇치 않았다. ICS 치료를 받지 않은 천식 환자와 ICS 치료를 받은 천식 환자를 비교해 보면, ICS 치료 받은 대상체는 IgE 및 CEA의 중앙 혈청 수준이 상당히 낮아졌고, 보다 낮은 페리오스틴 수준에 대한 경향을 보여주었지만, YKL-40 수준은 변하지 않았다 (도 13e-h). 그럼에도 불구하고, ICS 치료를 받은 천식 환자는 건강한 대조군 보다 더 높은 IgE, 페리오스틴 및 CEA 중앙 혈청 수준을 갖고 있었다 (표 13). 도 4 및 표 10에 제시된 바와 같이, 기관지 상피 IL-13 시그네처에 대해 양성인 ("IL-13 고") 23명의 천식 환자 중 21명은 100 IU/ml 초과의 혈청 IgE 수준을 갖고 있었지만, 일정 비율의 "IL-13 저" 천식 환자도 상승된 IgE를 갖고 있었다. 본 발명자들은 혈청 페리오스틴 수준이 보다 높아지는 경향이 있고, CEA 수준은 IgE < 100 IU/ml을 나타내는 천식 환자 (N=32)에서 보다 IgE ≥ 100 IU/ml을 나타내는 천식 환자 (N=68)에게서 상당히 더 높았다는 사실을 밝혀내었다 (도 13i-j). 그러나, 혈청 YKL-40 수준은 고 IgE 군에서 상당히 더 낮았다 (도 13k). 페리오스틴 및 CEACAM5의 기도 발현 수준이 "IL-13 고" 천식 환자에서 고도로 상관이 있었기 때문에, 본 발명자들은 모든 천식 환자 전반에 걸쳐 혈청 페리오스틴과 CEA 간의 상관 관계를 조사하였다 (도 13l). 본 발명자들은 혈청 페리오스틴 및 CEA 수준이 천식 환자 집단 전반에 걸쳐 서로 상당한 상관이 있었고, ICS 치료 받지 않은 천식 환자 또는 IgE ≥ 100 IU/ml을 나타내는 천식 환자 내에서도 상당한 상관이 있었지만, 건강한 대조군, ICS 치료 받은 천식 환자 또는 IgE < 100 IU/ml을 나타내는 천식 환자에서는 그렇치 않았다는 것을 발견하였다 (표 11). 취합해 보면, 이들 데이터는 페리오스틴 및 CEA가 천식 환자에서 기관지 상피 IL-13 유도된 유전자 시그네처의 혈청 바이오마커일 수 있다는 것을 제안하고 있다.

IL-13 시그네처 내에서, 본 발명자들은 기관지 상피 내로의 세포 침윤 및/또는 해부학적 국재화를 나타낼 수 있는, 비만 세포 및 호산구에서 발현된 유전자 및 프로테아제 억제제를 암호화하는 유전자를 포함한 다수 유전자의 몇 가지 기능성 군을 관찰하였다. 각 기관지 브러싱 샘플 중의 세포의 90％ 초과가 기관지 상피 세포 또는 배상 세포였지만 (평균 97％, 중앙 98％, 최소 91％), 세포-특이적 유전자 발현 패턴과 "동시에 발생하는" 극소수의 침윤성 세포가 마이크로어레이에서 탐지 가능하였다. 비만 세포 특이적 유전자에는 트립타제 (TPSAB1 [TPSD1] 및 TPSG1), CPA3, FCER1B, RGS13, 및 SLC18A2가 포함되었다 [73,74]. 또한, 비만 세포와 치밀하게 클러스터링 되는 것은 칸나비노이드 수용체-상호 작용성 GTPase인 CNRIP1 (C2ORF32)이었다. 비만 세포 기능 조절에 있어서의 칸나비노-유사작용제의 널리 확립된 역할을 고려해 보면 [75], CNRIP1이 또한 비만 세포-특이적 유전자를 나타내는 것으로 예상된다. 알레르기성 질환에 있어서의 조직-상주 비만 세포의 중요한 역할과, IL-13 발현성 비만 세포가 천식 환자 내기관지 생검 표본에 존재하는 것이 객담에서 탐지 가능한 수준의 IL-13과 실제적으로 상관이 있다는 최근의 관찰 결과를 고려해 보면 [6], 비만 세포-특이적 유전자와 IL-13 시그네처 간의 고도의 상관 관계는 1) 비만 세포가 기도 상피 내에서 IL-13의 중요한 공급원일 수 있고; 2) 기도 상피 내로의 비만 세포 침윤이 "IL-13 고" 천식 환자 서브세트의 독특한 특징일 수 있다고 제안하고 있다. 호산구 특이적 유전자에는 P2RY14 (GPR105) 및 ALOX15가 포함되긴 하지만, 실시예 8에서 본 발명자들은 천식 환자로부터의 폐포성 대식 세포에서의 ALOX15 발현을 기재하였다.

세린 및 시스테인 프로테아제 억제제에 상응하는 다수 프로브가 IL-13 시그네처에 존재하였는데, 이에는 세르핀 B2 및 B10, 및 시스타틴 (CST) 1, 2, 및 4가 포함된다. 세르핀B2는 염색체 18q21 상의 유전자 클러스터에 암호화된 세린 프로테아제 억제제 대형 계열의 구성원이다. 세르핀 B2 [8], B3, 및 B4의 발현 수준은 재조합 IL-4 및 IL-13에 의한 자극시 기도 상피 세포에서 유도된다 [7, 15]. 시스타틴 (CST) 1, 2 및 4는 염색체 20p11 상의 유전자 클러스터에 암호화된 시스테인 프로테아제 억제제 대형 계열의 구성원이다. 몇 가지 시스타틴이 기관지 상피에서 발현되고 [16]; CST4는 천식 환자의 기관지폐포성 세정 유체 (BAL)에서 상승된 수준으로 확인되었고 [17]; 혈청 CST3은 건강한 대조군과 비교해서 천식 환자에서 상승되고, 그의 수준은 ICS 치료에 의해 감소된다 [18]. 세르핀 및 CST 유전자 계열은 각각 염색체 상에 공동-국재하기 때문에, 본 발명자들은 세르핀 및 시스타틴 유전자 계열의 어떠한 부가의 구성원도 이미 확인된 것과 공동-조절되는 지를 탐구하였다. 본 발명자들은 세르핀 및 시스타틴 유전자 계열에 한정된, 모든 대상체 전반에 걸쳐 마이크로어레이 데이터의 감독되지 않은 클러스터링을 수행하였다. 본 발명자들은 어레이 상에 나타난 40개 넘는 프로테아제 억제제 유전자 중에서, 세르핀 B2, B4, 및 B10; 및 시스타틴 1, 2, 및 4 만이 상당히 공동-조절되었는데, "IL-13 고" 시그네처를 갖는 천식 환자에서 가장 높은 발현 수준이 존재한다는 사실을 밝혀내었다 (도 2b 및 표 12). 많은 공기 알레르겐이 프로테아제 활성을 보유하고 있고, 프로테아제-활성화된 수용체 (PAR)가 알레르기성 염증 케스케이드의 활성화와 연관이 있기 때문에 [76], Th2 사이토킨에 의한 프로테아제 억제제의 상향 조절은 프로테아제-함유 공기 알레르겐에 대한 대상성 반응을 나타낼 수 있다.

CLCA1의 마우스 오르토로그인 mCLCA3 (gob-5로서 공지되기도 함)이 기도 상피의 배상 세포 화생 및 점액 생성과 연관된 유전자로서 기존에 확인되었고, 둘 다는 IL-9 및 IL-13을 포함한 Th2 사이토킨에 의해 유도된다 [12-14]. PRR4는 염색체 12p13 상의 클러스터에 암호화된 대형 유전자 계열의 구성원이다. 이들 유전자는 타액 및 눈물을 포함한 점액성 분비물에서 발견되는 프롤린-풍부 단백질을 암호화한다. 관련되긴 하지만, 오르토로그가 아닌 단백질 SPRR1a, 2a, 및 2b가 천식 마우스 모델에서 기관지 상피에서 확인되었고, 이는 IL-13에 의해 유도된다 [19, 20]. PRR/PRB 계열로부터의 프롤린-풍부 단백질은 기관지 분비물에서 확인하였고 [21], 그들의 발현은 기관지 상피에서 확인되었다 [16]. CCL26 (Eotaxin-3)은 천식 환자 기도 상피 중의 널리 확인된 IL-4 및 IL-13 유도성 호산구 유인성 케모카인이다 [71]. CDH26은 호산구성 식도염의 마이크로어레이 분석에서 최근에 확인된 공지되지 않은 기능의 카드헤린-유사 분자이다 [11]. 이러한 연구는 본 발명자들의 기관지 상피 IL-13 시그네처와 중복되는 몇 가지 부가의 유전자를 확인하였는데, 이에는 페리오스틴, 세르핀B4 및 CCL26이 포함된다 [11]. CDH26은 에오탁신과 공동-조절되고, 호산구성 염증을 특징으로 하는 질병에서 과발현되기 때문에, CDH26이 점막 조직 내로의 호산구 침윤에 있어서 일정 역할을 한다고 추측할 수 밖에 없다. 유도성 산화질소 합성 효소 (iNOS)는 기도 염증과 연관이 있고, 인간 일차 기관지 상피 세포 배양에서 IL-13에 의해 유도된다 [23]. 배출 산화질소 (eNO)의 측정이 천식의 진단과 모니터링에 흔히 사용되고 있다. 함께 고려해 보면, IL-13 시그네처의 구성분으로서 본원에 기재된 많은 유전자는 Th2 염증의 시험관내 및 동물 모델과 고도로 일치하고, 인간 천식에서 Th2-구동된 병리 상태에 있어서 타당한 역할을 한다.

CEACAM5는 많은 상피 조직에서 발견되는 세포-표면 당단백질을 암호화하고, 상승된 혈청 CEACAM5 (암배아성 항원; CEA)는 상피 악성 종양 및 전이성 질병의 널리-확인된 전신 바이오마커이다. 상승된 CEA 수준이 일부 천식 환자에서 보고되었는데, 특히 높은 혈청 수준이 점액 막힘 천식 환자에서 관찰되었다 [75]. 흥미롭게도, 혈청 CEA에 대한 정상치의 상한치가 2.5 내지 3 ng/ml 범위 내이긴 하지만, 의심되는 악성 종양에 대한 하한치는 10 ng/ml이다. 본 발명자들의 분석에서, 본 발명자들은 건강한 대조군의 95％가 넘게 3 ng/ml 아래의 CEA 수준을 갖고 있는 반면, 천식 환자의 1/3은 3 내지 7.5 ng/ml의 CEA 수준을 갖고 있었으며, 이들 중에서 대다수는 100 IU/ml을 넘는 혈청 IgE 수준을 갖고 있다는 사실을 발견하였다. 이는 CEA에 대한 강건한 탐지 창이 Th2-구동 기도 염증을 수반한 천식 환자에게 존재할 수 있다는 것을 제안하고 있다. 페리오스틴은 침습성 및 세포외 매트릭스 변화와 연관이 있을 수 있고 [64-67], 그의 혈청 단백질 수준이 몇몇 암에서 탐지 가능하고 상승되는 [68-70] 상피-유래 암에서 상향 조절된 유전자로서 천식 환자 기도에서 IL-4 및 IL-13 유도성 유전자로서 보고되었다 [7-9, 77]. 이는 호산구성 식도염에서 호산구성 조직 침윤에 있어 일정 역할을 할 수 있기 때문에 [11, 77], 페리오스틴은 Th2-구동 천식과 같은 호산구성 질환의 중요한 인자이고, 이러한 질환의 바이오마커일 수 있었다.

대증 요법 (즉, β-작동제)시 잘 제어되지 않는 기관지 천식에 대한 주의 기준은 흡입 코르티코스테로이드 (ICS)이다. 기도에서의 IL-13 수준이 상승된 경증 또는 중간 정도의 천식 환자 [6], 및 식도 조직에서의 IL-13 발현 수준이 상승된 호산구성 식도염 환자에서는 [11], ICS 치료가 병든 조직에서 IL-13 및 IL-13-유도된 유전자의 수준을 실질적으로 감소시킨다. ICS 치료 1주 후 천식 환자의 기도 상피 및 배양된 기관지 상피 세포에서, 본 발명자들은 코르티코스테로이드 치료가 페리오스틴, 세르핀B2 및 CLCA1의 IL-13-유도된 발현 수준을 실질적으로 감소시킨다는 사실을 밝혀내었다 [8]. 표 9에 열거된 유전자를 추가로 조사한 결과, 두 번째 기관지경술 이전에 1주 ICS 치료를 받은 본 연구의 19명 대상체에게서는, 대다수의 IL-13 시그네처 유전자가 천식 환자 기관지 기도 상피에서 ICS 치료에 의해 상당히 하향 조절된 것으로 밝혀졌다. 이러한 하향 조절은 ICS-매개된 IL-13 수준 감소, ICS-매개된 표적 유전자 발현 저하, 또는 이 둘의 조합에 따른 결과일 수 있다. ICS 치료에 대해 불응성인 중증의 천식 환자에서는, 유사한 분획의 대상체 (대략 40％)가 탐지 가능한 객담 IL-13 수준 내지 ICS-투약하지 않은 경증의 천식 환자에서 관찰된 수준을 갖는 것으로 밝혀졌는데 [6], 이는 본 연구에서 관찰된 IL-13 시그네처를 나타내는 대상체 분획과 거의 동등한 수준이다. 이러한 관찰 결과는, IL-13 시그네처가 본 연구에서 조사된 경증-중간 정도의 ICS-반응성 천식 환자에서의 ICS 치료에 의해 상당히 하향 조절되긴 하지만, 중증의 스테로이드-내성 천식 환자에게 여전히 존재할 수도 있다는 것을 제안하고 있다. 유사한 관찰 결과는 기관지 생검의 호산구성 염증 [78] 및 스테로이드-치료 불응성 천식 환자의 BAL에서의 IL-4 및 IL-5 발현성 세포의 영속성 [79]에 대해 보고되었다. Th2 염증에서 IL-13 또는 관련 인자에 대항하여 유도된 임상 개발에 있어서의 다수의 생물학적 치료제가 현재 존재하는데 [50, 80], 이에는 본원에 기재된 것들이 비제한적으로 포함된다. 본 발명자들의 발견은 단지 일부 분획의 스테로이드-투약 받은 적이 없는 경증 내지 중간 정도의 천식 환자가 이러한 경로 활성을 지닐 수 있고, ICS 치료에 대한 그의 감수성을 고려해 보면, 보다 적은 분획의 중간 정도 내지 중증의, 스테로이드-불응성의 천식 환자가 이러한 경로 활성을 지니는 것으로 예상된다는 것을 제안하고 있다. 따라서, 그들의 기도에 IL-13 구동 염증을 갖고 있는 것으로 예상되는 천식 환자를 확인시켜 주는 바이오마커는 이들 실험적 표적화 요법에 대해 가장 잘 반응할 것으로 예상되는 대상체의 확인 및 선별을 도와줄 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA ARRON, Joseph R. FAHY, John V. MODREK, Barmak WOODRUFF, Prescott <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING AND DIAGNOSING ASTHMA <130> P4190R1 <140> <141> <150> 61/205,392 <151> 2009-01-16 <150> 61/128,383 <151> 2008-05-20 <150> 61/041,480 <151> 2008-04-01 <150> 61/072,572 <151> 2008-03-31 <160> 261 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 836 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ile Pro Phe Leu Pro Met Phe Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ile Val 1 5 10 15 Asn Pro Ile Asn Ala Asn Asn His Tyr Asp Lys Ile Leu Ala His Ser 20 25 30 Arg Ile Arg Gly Arg Asp Gln Gly Pro Asn Val Cys Ala Leu Gln Gln 35 40 45 Ile Leu Gly Thr Lys Lys Lys Tyr Phe Ser Thr Cys Lys Asn Trp Tyr 50 55 60 Lys Lys Ser Ile Cys Gly Gln Lys Thr Thr Val Leu Tyr Glu Cys Cys 65 70 75 80 Pro Gly Tyr Met Arg Met Glu Gly Met Lys Gly Cys Pro Ala Val Leu 85 90 95 Pro Ile Asp His Val Tyr Gly Thr Leu Gly Ile Val Gly Ala Thr Thr 100 105 110 Thr Gln Arg Tyr Ser Asp Ala Ser Lys Leu Arg Glu Glu Ile Glu Gly 115 120 125 Lys Gly Ser Phe Thr Tyr Phe Ala Pro Ser Asn Glu Ala 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tgacgcaaaa taccaccttg gcgcctacac gggagacgac gtccgcatcg tccgtgacga 60 catgctgtgt gccgggaaca cccggaggga ctcatgccag ggcgactccg gagggcccct 120 ggtgtgcaag gtgaatggca cctggctgca ggcgggcgtg gtcagctggg gcgagggctg 180 tgcccagccc aaccggcctg gcatctacac ccgtgtcacc tactacttgg actggatcca 240 ccactatgtc cccaaaaagc cgtgagtcag gcctgggttg gccacctggg tcactggagg 300 accaacccct gctgtccaaa acaccactgc ttcctaccca ggtggcgact gccccccaca 360 ccttccctgc cccgtcctga gtgccccttc ctgtcctaag ccccctgctc tcttctgagc 420 cccttcccct gtcctgagga cccttcccca tcctgagccc ccttccctgt cctaagcctg 480 acgcctgcac cgggccctcc ggccctcccc tgcccaggca gctggtggtg ggcgct 536 <210> 50 <211> 538 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 ccggtcagca ggatcatcgt gcacccacag ttctacatca tccagactgg agcggatatc 60 gccctgctgg agctggagga gcccgtgaac atctccagcc gcgtccacac ggtcatgctg 120 ccccctgcct cggagacctt ccccccgggg atgccgtgct gggtcactgg ctggggcgat 180 gtggacaatg atgagcccct cccaccgcca tttcccctga agcaggtgaa ggtccccata 240 atggaaaacc acatttgtga cgcaaaatac 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ctgatggcag gaatccaagt gcatttctta aataagttac tatttattcc gctccgcccc 480 ctccctctcc cttgagaagc tgagtcttct gcatcagatt 520 <210> 55 <211> 508 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 tgccacaagg tcgctgctta tgagggcgca aacttcttgg cttgtgctcg gacccttttc 60 tcgtactcca ctctgttttg gcagtaaatc gtgtaggcct ctgcttgagc tgggtcttgg 120 atatttggtt catttagaag ttcctgtatt cctaatagga tctgtttgat tgtgatggct 180 ggcctccagt ccttgtcctc ctctaagatg gacaggcaca ctgtccccga agggtacaca 240 ttcgggtgaa ataatggtgg ttcgaattta cattttggtg gcgaagatgg ataatcatct 300 ttgaaaagca tccgtagttt aaacaagcct ccttcccacg gagtcccttt ctttcctgga 360 atggcgcact cccagttcat gaggttcatc gtgccatcgg gattttttgt tgggacagcc 420 acgaaaccaa atgggtggtc tttcctccat gctttcctct cctgggcgag tctgctgagg 480 gcgatccccg acatgttcaa agtccctc 508 <210> 56 <211> 510 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 agagactttc agggcatacg tgggggcctt ggccttcctc actcgctcga tggcctcagt 60 gtgctcctca aggctggtgc caaacacctg ctggagatag ctgagcaggg cctcctcgtc 120 gtccacctgg tcagggccca tggtacccgc 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300 tatctataaa attttcctac tattatgttc attaacaaac ttctttatca catgtatctt 360 ctacgtgtaa aacatttctg atgatttttt aacaaaaaat atatgaattt cttcatttgc 420 tcttgcatct acattgctat aanggatata aaatgtggtt tctatatttt gagatgtttt 480 ttccttacaa tgtgaactca tcgtgatctt gg 512 <210> 66 <211> 551 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> modified_base <222> (114)..(114) <223> a, c, g, t, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (119)..(120) <223> a, c, g, t, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (127)..(127) <223> a, c, g, t, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (129)..(129) <223> a, c, g, t, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (149)..(149) <223> a, c, g, t, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (152)..(152) <223> a, c, g, t, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (163)..(163) <223> a, c, g, t, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (167)..(168) <223> a, c, g, t, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (189)..(189) <223> a, c, 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cagcctgctt atactactgc cagaagacat taatgggctg 60 gaacagctgg aaaaggccat cacctatgag aagctgaatg agtggaccag tgcagacatg 120 atggagttgt atgaagtgca gctacacctt cccaagttca agctggaaga cagttatgat 180 ctcaagtcaa ccctgagcag tatggggatg agtgatgcct tcagccaaag caaagctgat 240 ttctcaggaa tgtcttcagc aagaaaccta tttttgtcca atgttttcca taaggctttt 300 gtggaaataa atgaacaagg tactgaagct gcagctggca gtgggagtga gatagatata 360 cgaantagag tcccatccat tgaattcaat gcaaatcacc cattcctctt cttcatcagg 420 cacaataana accaacacca ttctttttta tggaagatta tgctccccct aatc 474 <210> 68 <211> 287 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 68 gattctgtgg tagactcagt gctttcagag tccagagctt gacttgggtt agtggcctta 60 atgaagtgct aaatttgctc tttaccgcga gactgatcag aagaagcaaa aggggaaagg 120 gggctagagg tccactcgca ccttttacat cagacaagag gaggactgtg ccagaaatct 180 gtgcatgaaa caccatctgc tcttcatgca gggaggggtc aaccgtgtga acgtgcagag 240 attactcgag ccttctttgc caaaaatatg cattcttccc agctgta 287 <210> 69 <211> 545 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 69 taatcacatc acttccatgg catggatgtt cacatacaga ctcttaaccc tggtttacca 60 ggacctctag gagtggatcc aatctatatc tttacagttg tatagtatat gatatctctt 120 ttatttcact caatttatat tttcatcatt gactacatat ttcttataca caacacacaa 180 tttatgaatt ttttctcaag atcattctga gagttgcccc accctacctg ccttttatag 240 tacgcccacc tcaggcagac acagagcaca atgctggggt tctcttcaca ctatcactgc 300 cccaaattgt ctttctaaat ttcaacttca atgtcatctt ctccatgaag accactgaat 360 gaacaccttt tcatccagcc ttaatttctt gctccataac tactctatcc cacgatgcag 420 tattgtatca ttaattatta gtgtgcttgt gacctcctta tgtattctca attacctgta 480 tttgtgcaat aaattggaat aatgtaactt gatttcttat ctgtgtttgt gttggcatgc 540 aagat 545 <210> 70 <211> 420 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 aagacacttc ttccaaacct tgaatttgtt gtttttagaa aacgaatgca tttaaaaata 60 ttttctatgt gagaattttt tagatgtgtg tttacttcat gtttacaaat aactgtttgc 120 tttttaatgc agtactttga aatatatcag ccaaaaccat aacttacaat aatttcttag 180 gtattctgaa taaaattcca tttcttttgg atatgcttta ccattcttag gtttctgtgg 240 aacaaaaata tttgtagcat tttgtgtaaa 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primer" <400> 86 gtgccaaggt ctctttcacc a 21 <210> 87 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe" <400> 87 ccccacagaa attcccacaa gtgca 25 <210> 88 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 88 actcctctac ctccatcaat aactcc 26 <210> 89 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 89 tggctctgca agagatgtta gct 23 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 90 gctggctgga ttctggaaaa 20 <210> 91 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 91 tggctctgca agagatgtta gc 22 <210> 92 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> 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primer" <400> 103 ccaaccacca aggatgcaa 19 <210> 104 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 104 tctgcccagc tgccaagt 18 <210> 105 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 105 ccaaccacca aggatgcaa 19 <210> 106 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 106 ggagagaagc ctggtggaag t 21 <210> 107 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe" <400> 107 cagtgtcgcc atcactgtct ccagc 25 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 108 acgtccacca gaccatcacc 20 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source 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primer" <400> 131 agattctgaa ggcttgcatc ttg 23 <210> 132 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe" <400> 132 tgccgaccct ctgggagaaa atcc 24 <210> 133 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 133 attcaaggat cttgctgcct tt 22 <210> 134 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 134 tgcagtcacg ggatgcat 18 <210> 135 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 135 caaggatctt gctgcctttg a 21 <210> 136 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 136 tgcttgcttt gtgctcttgg t 21 <210> 137 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 148 gggagcactg ctattctttc ca 22 <210> 149 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 149 caaacacatt ctccatctca tcca 24 <210> 150 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 150 gagcactgct attctttcca catg 24 <210> 151 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 151 tctccatctc atccaggata gaca 24 <210> 152 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe" <400> 152 ccacccgctc tctggcagcg 20 <210> 153 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 153 gcatggctcg cctacagact 20 <210> 154 <211> 23 <212> DNA 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Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 218 Asn Tyr Gly Met His 1 5 <210> 219 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 219 Ile Ile Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 220 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 220 Ala Ile Trp Tyr Asp Gly His Asp Lys Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 221 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 221 Ala Ile Trp Tyr Asp Gly His Asp Lys Tyr Tyr Ala Tyr Tyr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 222 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 222 Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 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Claims (1)

1. POSTN, CST1, CST2, CCL26, CLCA1, PRR4, PRB4, SERPINB2, CEACAM5, iNOS, SERPINB4, CST4 및 SERPINB10으로 이루어진 군 중에서 선택된 유전자 중 어느 하나 또는 조합물의 유전자 발현을 측정하는 것을 포함하고, 여기서 상기 유전자 중 어느 하나, 조합물 또는 모두의 발현 수준이 상승하는 것이 천식 아유형의 지표인, 환자에서 천식 아유형을 진단하는 방법.
   

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