KR101135173B1 - Ｓｈ３ｒｆ２ 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Ｓｈ３ｒｆ２ 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 SH3RF2(SH3 domain containing ring finger 2)의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 다양한 암 조직에서 발현량이 증가하는 SH3RF2 단백질은 암 관련 유전자인 PAK4와 결합하여 SH3RF2의 RING 도메인의 유비퀴틴화 활성에 의해 PAK4 단백질의 세포사멸 억제기능을 조절함으로써, SH3RF2가 발현억제된 암세포는 세포사멸 유도에 민감하게 반응하여 세포사멸이 촉진되고 생체 내 종양 형성능이 감소하므로, SH3RF2의 발현 또는 활성 억제제는 암의 예방 또는 치료를 위한 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＳＨ３ＲＦ２ 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물{Composition comprising expression or activity inhibitors of SH3RF2 for the prevention or treatment of cancer}
본 발명은 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
암은 인류의 건강을 위협하는 최대의 질병 중의 하나로서, 세포가 일련의 돌연변이 과정을 거쳐, 무제한적이고 비조절적인 방식으로 증식하고 불사화 되어 발생하는 질병이다. 암 발생의 원인으로는 화학물질, 바이러스, 세균, 전리방사선 등의 환경적 또는 외적 요인과 선천성 유전자 변이 등의 내적 요인을 들 수 있다(Klaunig & Kamendulis, Annu Rev Pharmacol Toxicol ., 44:239-267, 2004).
초기에 발견된 암일 경우 수술, 방사선 치료, 화학적 요법 등의 치료법이 있으나 그 부작용 또한 큰 문제로 대두되고 있으며, 말기 암이나 전이된 암의 경우 특별한 치료법 없이 시한부 인생으로 삶을 마감하는 상황이다. 또한, 암과 관련된 다양한 생화학적 기전이 규명되고 그에 따른 치료제가 개발되어 오고 있으나, 아직까지 암에 대한 근본적인 치료방법은 제시되지 않고 있다. 이에 따라, 암과 관련된 다양한 생체 내 분자를 동정하고 이를 표적으로 하는 약물을 개발하는 노력이 경주되고 있으며, 이러한 약물 중 일부를 조합하여 암 치료 효과를 증진시키려는 노력 역시 시도되고 있다. 따라서 암과 관련된 표적 분자를 추가적으로 발굴하는 노력은 매우 중요한 일이라고 할 수 있다.
SH3 도메인 함유 링 핑거 2(SH3 domain containing ring finger 2, SH3RF2) 유전자는 정소, 뇌, 직장, 수질(medulla), 심장, 폐, 간 또는 비장 등의 조직에서 발현되고, 이 단백질은 729개의 아미노산으로 구성되어 있으며, src 호몰로그-3(src homology-3), SH3, 징크 핑거(zinc finger), 링-형태(RING-type, Pfam) 및 프레닐화(prenylation) 도메인을 포함하고, N-말단 부위의 RING 도메인은 유비퀴틴 리가아제 활성을 지닐 것으로 추정되며 다른 단백질과 결합하는 도메인인 SH3 도메인을 3개 가지고 있다. SH3RF2 단백질은 미토콘드리아 또는 핵과 같은 다양한 세포소기관에 존재하며, 리가아제 활성, 금속이온결합, 단백질 결합 또는 zinc 이온 결합과 같은 분자적 기능을 수행하는 것으로 여겨진다. 그러나 아직 SH3RF2의 기능은 명확히 알려져 있지 않은 실정이다.
이에, 본 발명자들은 암과 관련된 새로운 표적 분자를 발굴하여 이를 항암용 물질로서 확립하고자 예의 노력한 결과, SH3RF2가 사람의 다양한 종양조직에서 발현이 증가하고, 암 유전자인 p21 활성 키나제 4(p21 activated kinase 4, PAK4)에 결합하여 SH3RF2의 유비퀴틴화 활성을 통해 PAK4 단백질의 세포사멸 억제기능을 조절하고, 상기 SH3RF2의 발현을 억제시킨 경우에는 암의 성장을 억제할 수 있음을 확인하여 SF3RF2 억제제를 항암제 또는 항암 보조제로 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 SH3RF2의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물 또는 항암 보조제를 제공하는 것이다.
또 다른 목적은 SH3RF2의 발현 또는 활성 정도를 이용하여 항암제 또는 항암 보조제를 스크리닝하거나, 암의 모니터링 및 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SH3RF2 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 SH3RF2 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 항암 보조제를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) SH3RF2 단백질의 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 세포주의 SH3RF2 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
3) 상기 SH3RF2 단백질의 발현 또는 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 항암제 또는 항암 보조제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 피검물질 존재하에 SH3RF2 단백질과 PAK4 단백질을 접촉시키는 단계;
2) 상기 SH3RF2와 PAK4 단백질의 결합 정도를 측정하는 단계; 및
3) 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 SH3RF2와 PAK4의 결합 정도를 감소시킨 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 항암제 또는 항암 보조제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) SH3RF2 및 유비퀴틴(ubiquitin) 단백질 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 세포주의 SH3RF2 단백질의 유비퀴틴화 활성 정도를 측정하는 단계; 및
3) 상기 SH3RF2 단백질의 유비퀴틴화 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 항암제 또는 항암 보조제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 SH3RF2와 반응하는 항체 또는 SH3RF2 유전자에 상보적인 핵산 중 어느 하나 이상을 이용하여 암세포에서의 SH3RF2 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 진단, 치료 결과 확인 또는 예후를 평가하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 SH3RF2와 반응하는 항체 또는 SH3RF2 유전자에 상보적인 핵산 중 어느 하나 이상을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 SH3RF2 발현 또는 활성 억제제는, 다양한 종양조직에서 발현이 증가하고 이러한 발현 증가가 임상적으로 암의 성장 및 전이와 유의성이 있으며, 또한, 암 유전자인 PAK4에 결합하여 유비퀴틴화 활성을 통해 PAK4 단백질의 세포사멸 억제기능에 관여하는 SH3RF2의 발현 또는 활성을 저해함으로써, SF3RF2 억제에 의해 암의 성장 및 전이를 억제할 수 있으므로 항암제 또는 항암 보조제의 유효성분으로서 유용하게 사용할 수 있고, 항암제 또는 항암 보조제 후보물질의 스크리닝 또는 암의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 대장암 조직의 DNA 칩 분석을 나타낸 그림이다:
A: 66례의 대장암 조직의 종양조직 또는 정상조직에서의 SH3RF2 mRNA 발현;
B: 66례 중 무작위로 선정된 22례의 대장암 조직의 종양조직 또는 정상조직에서의 SH3RF2 mRNA 발현; 및
C: 다양한 암세포주에서의 SH3RF2 단백질의 발현.
도 2는 SH3RF2의 유비퀴틴화 활성을 나타낸 그림이다:
A: SH3RF2 유전자 도메인 및 이의 변이체 모식도;
B: SH3RF2의 유비퀴틴 리가아제 활성; 및
C: SH3RF2 단백질의 자신에 대한 셀프-유비퀴틴화 활성.
도 3은 SH3RF2와 PAK4 단백질의 결합을 나타낸 그림이다:
A: 세포 내에서 SH3RF2와 PAK4 단백질의 결합; 및
B: PAK4가 결합하는 SH3RF2 도메인.
도 4는 SH3RF2 발현억제가 세포사멸 유도에 미치는 영향을 나타낸 그림이다:
A: 헬라(HeLa) 세포주에서 Hoechst 염색을 통한 DNA 응축;
B: 헬라(HeLa) 세포주에서 Hoechst 염색되는 세포수의 백분율 수치화;
C: Huh7 간암 세포주에서 Hoechst 염색을 통한 DNA 응축; 및
D: Huh7 간암 세포주에서 Hoechst 염색되는 세포수의 백분율 수치화.
도 5는 SH3RF2 발현량 변화에 따른 세포사멸표지인자 발현량의 변화를 나타낸 그림이다:
A: SH3RF2 발현억제 세포주에서의 세포사멸표지인자 단백질의 발현;
B: SH3RF2 과발현 세포주에서의 세포사멸표지인자 단백질의 발현;
C: SH3RF2 발현억제 세포주에서의 JNK를 통한 AP1 전사조절자 활성; 및
D: SH3RF2 과발현 세포주에서의 JNK를 통한 AP1 전사조절자 활성.
도 6은 SH3RF2 발현량 변화에 따른 PAK4 발현량의 변화를 나타낸 그림이다:
A: PAK4 단백질의 발현;
B: 일시적 또는 지속적으로 SH3RF2이 과발현되는 세포주에서의 PAK4 단백질 발현; 및
C: PAK4 mRNA의 발현.
도 7은 마우스 동물모델을 사용한 생체 내에서의 SH3RF2 발현억제 또는 과발현 세포주의 종양 형성능을 나타낸 그림이다:
A: SH3RF2 발현억제 간암 세포주에서의 SH3RF2 발현량 확인;
B: SH3RF2 발현억제 간암 세포주의 누드마우스 내에서의 종양 형성능;
C: SH3RF2 과발현 간암 세포주에서의 SH3RF2 발현량 확인; 및
D: SH3RF2 과발현 간암 세포주에서의 누드마우스 내에서의 종양 형성능.
도 8은 감암 환자와 SH3RF2 발현과의 상관관계를 나타낸 그림이다:
A: 조직 마이크로어레이를 이용한 간암 임상조직에서의 SH3RF2 단백질의 발현 확인;
B: SH3RF2 발현과 간암 환자의 임상자료의 상관관계; 및
C: SH3RF2 발현과 간암 환자의 생존도의 관계.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 SH3RF2 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 SH3RF2 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 SH3RF2 단백질의 발현 억제제는 서열번호 2로 기재되는 SH3RF2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 SH3RF2 단백질의 활성 억제제는 SH3RF2 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 암은 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고 간암, 대장암, 자궁경부암 또는 신장암인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않으며, SH3RF2의 과도한 발현 또는 활성에 의해 유발되는 암은 모두 포함된다.
본 발명자들은 다양한 암(간암, 대장암, 자궁경부암 또는 신장암) 조직에서의 SH3RF2 발현량을 확인하기 위하여, DNA 칩, RT-PCR 또는 웨스턴 블랏(Western blot) 분석을 통하여 SH3RF2 유전자 또는 단백질의 발현량을 확인하였다. 그 결과, SH3RF2는 정상세포주와 비교하여 대부분의 암세포주에서 현저히 높게 발현되는 것으로 나타났다(도 1 참조).
본 발명자들은 SH3RF2의 유비퀴틴화(ubiquitination) 활성을 확인하기 위하여, 유비퀴틴 리가아제(ligase) 활성을 지닐 것으로 추정되는 RING 도메인, 또는 단백질 결합에 관여하는 도메인인 3개의 SH3 도메인의 변이체를 제작하여(도 2의 A 참조), 이를 유비퀴틴 단백질 발현벡터와 공이식한 후 웨스턴 블랏을 통해 유비퀴틴화 활성을 알아보았다. 그 결과, 전장의 SH3RF2가 이식된 세포에서 높은 분자량의 유비퀴틴화 된 SH3RF2를 확인할 수 있었고, RING 도메인이 없는 변이체를 이식한 세포에서도 SH3RF2가 유비퀴틴화 된 것이 확인 되었다. 이는 세포 내에 존재하는 기존의 SH3RF2 또는 SH3RF2 특이적인 다른 E3 리가아제에 의한 유비퀴틴화인 것으로 추정할 수 있다. 그러나 RING 도메인만을 이식한 세포에서는 유비퀴틴화를 확인할 수 없거나 또는 매우 약하게 나타났는데, 이는 짧은 N-말단 RING 도메인에 유비퀴틴화 되는 자리가 없거나 그 자리수가 적기 때문으로 추정된다(도 2의 B 참조). 또한, RING 도메인을 가진 전장의 SH3RF2(GST-SH3RF2)는 E3 활성을 보였으며, RING 부위가 제거된 SH3RF2(GST-ΔRING)는 자신을 유비퀴틴화 시키지 못하였다. 이때 사용한 UBCH5a 및 UBCH13/Mms E2 효소는 각각 유비퀴틴의 48번 및 63번의 라이신 잔기에 다른 유비퀴틴을 결합시키는 효소이다. 따라서 SH3RF2가 단백질 분해 신호인 K48-유비퀴틴화 활성과 신호전달을 유지 또는 증폭시키는 것에 관여하는 K63-유비퀴틴 활성을 모두 가짐을 알 수 있다.
본 발명자들은 암에서 발현이 증가되어 있고 세포사멸 억제 및 세포이동 촉진에 관여하는 것으로 알려진 암유전자 p21 활성 키나제 4(p21-activated kinase 4, PAK4) 단백질과 SH3RF2 단백질이 서로 결합하는지 확인하기 위하여, PAK4 또는 SH3RF2 발현벡터를 공이식한 후 웨스턴 블랏을 수행하였다. 그 결과, PAK4 또는 SH3RF2 단백질이 세포 내에서 서로 결합함을 확인하였고(도 3의 A 참조), SH3RF2의 두 번째 도메인에 PAK4가 결합하는 것으로 나타났다(도 3의 B 참조).
기존에 보고된 논문에서 PAK4의 발현이 암 세포사멸에 관여하며, 특히 Li X.와 Minden A.는 PAK4가 발현억제된 암 세포에 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α) 및 사이클로헥사마이드를 동시에 처리할 경우, 세포사멸이 촉진됨을 보고 하였다(Li X. & Minden A., J Biol Chem. 2005, 280, 41192-41200). 본 발명자들은 SH3RF2가 PAK4와 결합하는 것을 확인하였고 SH3RF2에 의해 PAK4 수준이 조절되므로 SH3RF2 발현억제의 세포사멸 유도에 대한 영향을 확인하기 위하여, SH3RF2를 발현억제시킨 암세포주에 TNF-α 및 사이클로헥사마이드를 동시에 처리하여 세포사멸을 유도하였다. 그 결과, SH3RF2의 발현이 억제된 암세포주는 대조군에 비해 세포사멸에 민감하게 반응하여 세포사멸이 촉진되는 것으로 나타났고(도 4 참조), SH3RF2를 과발현시킨 암세포주에서는 세포사멸표지인자의 발현이 감소한 반면에, SH3RF2 발현억제 세포주에서는 증가하였다(도 5의 A 및 B 참조).
상기 PAK4는 MAP 키나제 전달경로(kinase pathway) 중 JNK의 상위 조절자로서 TNF-α에 의한 신호를 증가시킨다는 보고가 있다(Gnesutta, N & Minden, A 2003). 스트레스에 대한 세포반응으로 MAPK 키나제(MAPK kinase, MAPKK)에 의해 활성화되는 MAPK 중 하나인 c-Jun N-말단 키나제(c-Jun N-terminal kinases, JNK)는 c-Jun의 N-말단 부위를 인산화시킴으로써 전사인자인 활성 단백질 1(activating protein 1, AP-1)의 활성을 조절한다. 이때 JNK1의 활성에 의해 세포사멸이 촉진되는데, 이러한 세포사멸 기작이 JNK2의 활성에 의해 억제됨이 보고되었다(Shafiq Uddin Ahmed & Jo Milner, PLoS ONE, 2009, Vol. 4, e7305). 따라서 PAK4의 활성을 통한 세포사멸 조절에 관여하는 SH3RF2의 발현량 변화에 의한 JNK 활성 변화를 확인하였다. 그 결과, SH3RF2 발현억제에 의해 JNK2의 인산화가 감소하고 이에 따라 하부 c-Jun의 인산화가 감소하여, c-Jun 및 c-fos의 이중체로 구성된 AP-1의 활성이 SH3RF2의 발현 변화에 의해 조절될 수 있다는 사실을 알 수 있었다(도 5의 C 및 D 참조). 상기의 결과를 통해, 암 세포주에서 SH3RF2가 발현억제되면 TNF-α 및 사이클로헥사마이드 처리에 의한 세포사멸이 촉진됨을 알 수 있다. 이는 SH3RF2가 PAK4 단백질에 직접 결합하여 PAK4 단백질의 세포사멸 억제기능을 조절하고 있음을 제시하고 있다.
본 발명자들은 SH3RF2의 발현변화에 따른 PAK4 발현량을 확인하기 위하여, SH3RF2 발현억제 또는 과발현 암세포주에서 PAK4의 단백질 또는 유전자 발현량을 알아보았다. 그 결과, 지속적으로 SH3RF2가 발현될 경우, SH3RF2와 PAK4의 발현량은 서로 비례하였다. 또한, RING 도메인이 제거된 SH3RF2의 과발현 암세포에서는 PAK4 발현량의 증가가 나타나지 않았으므로, PAK4의 발현량 조절에 SH3RF2의 유비퀴틴화 활성이 요구됨을 알 수 있고, PAK4 조절을 통한 암 또는 과증식성 질환의 치료표적으로써 SH3RF2의 유비퀴틴화 활성억제가 중요함을 제시할 수 있다.
본 발명자들은 SH3RF2 발현변화에 따른 생체 내에서의 종양 형성능을 확인하기 위하여, SH3RF2가 발현억제 또는 과발현되는 암세포주를 각각 누드마우스에 주입하여 종양 형성을 측정하였다. 그 결과, SH3RF2는 발암 유전자로서 결핍되면 종양 형성이 감소하였고, 과발현되면 종양 형성이 증가하므로, SH3RF2의 과발현이 사멸되는 세포를 보호하여 종양 형성능에 영향을 주는 것을 알 수 있다(도 7 참조).
본 발명자들은 암 환자에서 SH3RF2 발현변화의 영향을 확인하기 위하여, 간암 환자의 종양조직 또는 정상조직의 SH3RF2 단백질 발현을 조직 마이크로어레이(tissue microarray, TMA)를 통해 알아보았다. 그 결과, 정상조직에서는 발현이 검출되지 않았으나 종양조직에서는 발현이 확인되었다. 또한, 간암 환자의 임상자료와 SH3RF2 발현을 비교분석한 결과, SH3RF2의 발현은 암의 진행단계, 전이형태, 재발 또는 생존율과 유의성이 있음을 알 수 있었다(도 8 참조).
따라서, SH3RF2는 PAK4 단백질과 결합하여 유비퀴틴화 활성에 의해 세포사멸을 조절함으로써 SH3RF2 발현억제에 의해 세포사멸이 촉진되고 종양 형성능이 감소하므로 SH3RF2 발현 또는 활성 억제제는 항암용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.
상기 조성물은 SH3RF2 단백질의 발현 또는 활성 억제제에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있다.
상기 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
상기 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
상기 조성물의 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하나 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 SH3RF2 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 항암 보조제를 제공한다.
상기 SH3RF2 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 SH3RF2 단백질의 발현 억제제는 SH3RF2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 SH3RF2 단백질의 활성 억제제는 SH3RF2 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 암은 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고 간암, 대장암, 자궁경부암 또는 신장암인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않으며, SH3RF2의 과도한 발현 또는 활성에 의해 유발되는 암은 모두 포함된다.
SH3RF2는 다양한 암 조직에서 발현량이 증가하고 암 관련 유전자인 PAK4와 직접 결합하여 SH3RF2 RING 도메인의 유비퀴틴화 활성에 의해 PAK4 단백질의 세포사멸 억제기능을 조절함으로써, SH3RF2가 발현억제된 암세포는 세포사멸 유도제로 보고된 TNF-α 및 사이클로헥사마이드의 동시 처리에 의한 세포사멸 유도에 민감하게 반응하여 세포사멸이 촉진되고 생체 내 종양 형성능이 감소하므로, SH3RF2의 발현 또는 활성 억제제는 항암 보조제의 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 SH3RF2 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 SH3RF2 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.
상기 약학적으로 유효한 양이란 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여량은 특정 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여기간, 투여방법, 제거율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
상기 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
상기 암은 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고 간암, 대장암, 자궁경부암 또는 신장암인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않으며, SH3RF2의 과도한 발현 또는 활성에 의해 유발되는 암은 모두 포함된다.
상기 개체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 그보다 바람직하게는 쥐, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다.
SH3RF2는 다양한 암 조직에서 발현량이 증가하고 암 관련 유전자인 PAK4와 직접 결합하여 SH3RF2 RING 도메인의 유비퀴틴화 활성에 의해 PAK4 단백질의 세포사멸 억제기능을 조절함으로써, SH3RF2가 발현억제된 암세포는 세포사멸 유도에 민감하게 반응하여 세포사멸이 촉진되고 생체 내 종양 형성능이 감소하므로, SH3RF2 발현 또는 활성 억제제는 암 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 항암제 또는 항암 보조제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 스크리닝 방법은
1) SH3RF2 단백질의 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 세포주의 SH3RF2 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
3) 상기 SH3RF2 단백질의 발현 또는 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 단백질의 발현 정도는 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블롯(Western Blot) 및 RT-PCR로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하고, 단백질의 활성 정도는 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 스크리닝 방법은 SH3RF2와 PAK4 간의 결합 수준을 이용할 수 있다.
구체적으로,
1) 피검물질 존재하에 SH3RF2 단백질과 PAK4 단백질을 접촉시키는 단계;
2) 상기 SH3RF2와 PAK4 단백질의 결합 정도를 측정하는 단계; 및
3) 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 SH3RF2와 PAK4의 결합 정도를 감소시킨 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 SH3RF2와 PAK4가 직접적으로 상호결합하고, 이때 SH3RF2의 첫 번째 또는 두 번째 SH3 도메인과 부위에 결합한다는 것을 확인하였다. 따라서, SH3RF2와 PAK4 간의 결합을 저해하는 물질은 PAK4의 발현 조절을 방해하여 항암 활성을 가지는 물질이 될 수 있음을 알 수 있다.
상기 결합 정도는 면역침강(immunoprecipitation) 방법에 의해 측정될 수 있다. 면역침강은 이전 문헌에 있는 방법에 의해 수행될 수 있다(Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York, 1988). SDS-PAGE는 면역침강된 단백질들의 분석에 일반적으로 사용되고, 결합된 단백질은 적합한 농도의 겔(gel)을 이용하여 단백질의 분자량에 의해 분석될 수 있다. 또한, 세포들을 이용하는 투-하이브리드 시스템(two-hybrid system)이 이용될 수 있고("MATCHMAKER Two-Hybrid system", "MATCHMAKER Mammalian Two-Hybrid Assay Kit", "MATCHMAKER one-Hybrid system"(Clontech); "HybriZAP Two-Hybrid Vector System"(Stratagene); 참고문헌 Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612, 1992; Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92, 1994), 표면 플라즈몬 공명 현상(surface plasmon resonance phenomenon)을 이용한 바이오센서(biosensor)는 결합된 물질들을 탐지 또는 정량하기 위한 수단으로 사용될 수 있다. 상기 바이오센서가 사용될 때, 상기 결합에 의한 상호작용은 표면 플라즈몬 공명 시그날(signal)로서 실시간 관찰될 수 있다.
또한, 상기 스크리닝 방법은
1) SH3RF2 및 유비퀴틴(ubiquitin) 단백질 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 세포주의 SH3RF2 단백질의 유비퀴틴화 활성 정도를 측정하는 단계; 및
3) 상기 SH3RF2 단백질의 유비퀴틴화 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, SH3RF2 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 후보물질은 핵산, 단백질, 기타 추출물 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
SH3RF2는 다양한 암 조직에서 발현량이 증가하고 암 관련 유전자인 PAK4와 직접 결합하여 SH3RF2 RING 도메인의 유비퀴틴화 활성에 의해 PAK4 단백질의 세포사멸 억제기능을 조절함으로써, SH3RF2가 발현억제된 암세포는 세포사멸 유도에 민감하게 반응하여 세포사멸이 촉진되고 생체 내 종양 형성능이 감소하므로, SH3RF2의 발현 또는 활성을 감소시키는 피검물질, SH3RF2와 PAK4의 결합을 억제하는 피검물질 또는 SH3RF2의 유비퀴틴화를 억제하는 피검물질을 선별함으로써 항암제 또는 항암 보조제 후보물질의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 SH3RF2 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 과증식성 세포에 처리하는 단계를 포함하는 세포사멸 촉진 방법을 제공한다.
상기 SH3RF2 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 SH3RF2 단백질의 발현 억제제는 SH3RF2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 SH3RF2 단백질의 활성 억제제는 SH3RF2 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
SH3RF2는 다양한 암 조직에서 발현량이 증가하고 암 관련 유전자인 PAK4와 직접 결합하여 SH3RF2 RING 도메인의 유비퀴틴화 활성에 의해 PAK4 단백질의 세포사멸 억제기능을 조절함으로써, SH3RF2가 발현억제된 암세포는 세포사멸 유도에 민감하게 반응하여 세포사멸이 촉진되고 생체 내 종양 형성능이 감소하므로, SH3RF2 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 과증식성 세포의 세포사멸 촉진을 위해 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 SH3RF2의 발현 또는 활성 억제를 통하여 PAK4의 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.
상기 SH3RF2 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 SH3RF2 단백질의 발현은 SH3RF2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 이용하여 억제하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 SH3RF2 단백질의 활성은 SH3RF2 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 이용하여 억제하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 SH3RF2 활성은 유비퀴틴화 활성을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
SH3RF2는 다양한 암 조직에서 발현량이 증가하고 암 관련 유전자인 PAK4와 직접 결합하여 SH3RF2 RING 도메인의 유비퀴틴화 활성에 의해 PAK4 단백질의 발현 및 세포사멸 억제기능을 조절함으로써, SH3RF2가 발현억제된 암세포는 세포사멸 유도에 민감하게 반응하여 세포사멸이 촉진되고 생체 내 종양 형성능이 감소하므로, SH3RF2 단백질의 발현 또는 활성 억제는 암유전자인 PAK4의 발현 및 활성 감소에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 SH3RF2와 반응하는 항체 또는 SH3RF2 유전자에 상보적인 핵산 중 어느 하나 이상을 이용하여 암세포에서의 SH3RF2 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 진단, 치료 결과 확인 또는 예후를 평가하는 방법을 제공한다.
상기 암은 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고 간암, 대장암, 자궁경부암 또는 신장암인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않으며, SH3RF2의 과도한 발현 또는 활성에 의해 유발되는 암은 모두 포함된다.
상기 암 진단 방법에 있어서, 정상 이상으로 상승된 SH3RF2의 발현 검출은 환자가 암에 걸렸음을 의미한다. 또한, 암으로 치료를 받았거나 받고 있는 개체의 진단시료에서 SH3RF2의 정상적인 발현 검출은 암 치료가 성공적임을 의미하고, 상기 진단시료에서 정상 이상으로 상승된 SH3RF2의 검출은 치료를 계속해야 한다는 것을 의미한다. 아울러, 암에 걸린 개체의 진단시료에서 SH3RF2의 정상적인 발현 검출은 예후가 좋다는 것을 의미하고, 상기 진단시료에서 정상 이상으로 상승된 SH3RF2의 검출은 예후가 좋지 않다는 것을 의미한다.
아울러, 본 발명은 SH3RF2와 반응하는 항체 또는 SH3RF2 유전자에 상보적인 핵산 중 어느 하나 이상을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
상기 암 진단용 키트는 SH3RF2와 반응하는 하나 이상의 물질 및 반응 생성물 검출용 시약과 이에 대한 지시 사항을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, SH3RF2와 반응하는 하나 이상의 물질은 SH3RF2의 RNA 또는 DNA에 상보적인 RNA 또는 DNA, 및 SH3RF2 단백질에 결합하는 항체일 수 있고 반응 생성물 검출용 시약은 핵산 또는 단백질 표지 및 발색시약일 수 있다.
SH3RF2는 다양한 암 조직에서 발현량이 증가하고 암 관련 유전자인 PAK4와 직접 결합하여 SH3RF2 RING 도메인의 유비퀴틴화 활성에 의해 PAK4 단백질의 발현 및 세포사멸 억제기능을 조절함으로써, SH3RF2가 발현억제된 암세포는 세포사멸 유도에 민감하게 반응하여 세포사멸이 촉진되고 생체 내 종양 형성능이 감소하므로, 암 진단 및 진단용 키트에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.
종양조직에서 SH3RF2 발현량의 확인
<1-1> DNA 칩( chip ) 분석을 이용한 SH3RF2 유전자 발현량의 확인
66례의 대장암 환자의 대장암 조직(서울 삼성의료원으로부터 입수)의 종양조직 또는 정상조직에서의 SH3RF2 mRNA의 발현량을 Sentrix BeadChip Array Human-6_V2 48K(Illumina, Inc.) DNA 칩(chip)을 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 1의 A에 나타낸 바와 같이, 66례의 대장암 조직 중 22례의 종양조직에서 정상조직과 비교하여 약 1.5배 이상 SH3RF2 발현이 증가하는 것으로 나타났다.
<1-2> 역전사 중합효소연쇄반응( Reverse transcription - polymerase chain reaction, RT - PCR )을 이용한 SH3RF2 유전자 발현량의 확인
상기 실시예 <1-1>의 총 66례의 대장암 조직 중 무작위로 20례의 종양조직 또는 정상조직을 선정하여 RT-PCR을 수행하여 SH3RF2 mRNA의 발현량을 확인하였다. RT-PCR은 각 조직을 분쇄한 후 TRIZOL 용액을 이용하여 추출한 총 RNA로부터 합성한 cDNA를 사용하여 수행하였다. 5 ㎍의 상기 cDNA, SH3RF2 mRNA에 대한 정방향 프라이머(서열번호 3: 5'-GGTCCAAGCCTGCCCTCAC-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 4: 5'-GGGTGGCTGGCTGTTCAGG-3')를 사용하였다. 상기 각각의 프라이머(50 p㏖/㎕)를 0.5 ㎕씩 넣어주고, 2× PCR PreMix(Bioneer, Inc., 대한민국) 10 ㎕ 및 조직 cDNA 3 ㎕를 혼합한 후, 총 50 ㎕의 부피가 되도록 증류수를 넣어 반응 혼합액을 만들었다. 이를 94℃에서 4분 동안 1회 반응시킨 후, 95℃ 30초, 58℃ 30초 및 72℃ 30초의 조건에서 순차적으로 25회를 반복하였고, 마지막 단계에서 94℃에서 30초, 58℃에서 30초 및 72℃에서 5분의 조건으로 PCR을 수행한 후, 1% 아가로즈 겔(agarose gel)에 10 ㎕씩을 로딩(loading)하였다.
그 결과, 도 1의 B에 나타낸 바와 같이, 무작위로 선정된 20례 중 12례의 종양조직이 정상조직에 비해 SH3RF2 발현이 증가하는 것으로 나타났다.
<1-3> 웨스턴 블랏(Western blot)을 이용한 SH3RF2 단백질 발현량의 확인
정상세포주인 사람 배아 폐섬유아세포주 IMR-90, 및 사람의 간암 세포주 Hep3B, HepG2, PLC/PRF/5 및 SK-Hep-1, 대장암 세포주 SW620, SW480 및 HT29, 자궁경부암 세포주 HeLa, 및 신장 세포주 293T와 같은 다양한 암 세포주에서 SH3RF2 단백질의 발현량을 웨스턴 블랏을 실시하여 확인하였다. 구체적으로, 상기 암세포주를 1× RIPA 용액{20 mM Tris-HCl[pH 7.5], 150 mM sodium chloride, 1mM EDTA, 1% NP-40 및 1× conc. protease inhibitor cocktail(Roche Inc., 대한민국), 1× phosphatase inhibitor cocktal(Roche Inc., 대한민국)}을 사용하여 분해시킨 다음, 원심분리하여 침전물을 제거하고 얻은 라이세이트(lysate)를 각각 동일한 양으로 정량하여 10% SDS-폴리아미드 겔에 전기영동(SDS-polyamide gel electrophoresis)하여 하였다. SDS-폴리아미드 겔을 니트로셀룰로즈 막{Nitrocellulose Transfer Membrane(Whatman, Germany)}에 전기적으로 이동시킨 후, 5% 탈지유(skim milk)에 30분간 블로킹(blocking) 반응시켰다. 블로킹 반응이 끝난 다음, 1:1000으로 희석한 항 SH3RF2 단일클론 항체(Abnova Cop., Taipei)를 16시간 반응시켰다. 상기 막을 1× PBST로 30분간 세척하였고, 1:4000으로 희석한 2차 항체 마우스(Abnova Cop., Taipei)와 1시간 동안 반응시키고 화학발광 검출 시스템(chemiluminescence detection system, Thermo scienfic)을 사용하여 단백질을 확인하였다.
그 결과, 도 1의 C에 나타낸 바와 같이, SH3RF2 단백질은 정상세포주(IMR-90)에서는 낮게 발현되었으나 간암 세포주를 제외한 대부분의 암 세포주에서는 현저히 높은 발현량을 나타냈다.
SH3RF2 의 유비퀴틴 리가아제 ( ubiquitin ligase ) 활성 도메인의 확인
<2-1> SH3RF2 변이체의 제작
GST 또는 Myc-에피토프(epitope)를 각각 SH3RF2의 N-말단 또는 C-말단 부위에 붙인 SH3RF2 변이체(mutant)를 제작하였다. 전장 형태(full-length form) SH3RF2 유전자는 상기 정상 간조직에서 분리하여 제작한 cDNA를 주형으로 하고 정방향 프라이머(서열번호 5: 5'-TTTTCTAGAATGGATGATTTGACGTTACTTG-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 6: 5'-TTTGAATTCGTTTGCTGGGAAACACGGTCTGC-3')를 이용하여 PCR을 수행하여 수득하였다. PCR은 상기 프라이머(50 p㏖/㎕) 각각을 0.5 ㎕씩 넣고, PCR Taq 중합효소(polymerase)(Elpis biotech Inc., 대한민국) 1 ㎕와 반응 버퍼(10×) 10 ㎕, 2.5 mM dNTP 8 ㎕를 주형 cDNA 3 ㎕와 혼합하여, 총 50 ㎕가 되도록 증류수를 넣어준 후, 94℃에서 4분 동안 1회, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 및 72℃ 1분 30초의 조건에서 순차적으로 30회를 반복하였고, 마지막 단계에서는 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 및 72℃에서 5분의 조건으로 PCR을 수행하였다. PCR 산물과 pcDNA3.1(-)/myc-His A 벡터(myc-his-태그를 갖는 Invitrogen의 pcDNA 3 벡터)를 XbaI/EcoRI 으로 절단한 후, T4 DNA 리가아제(ligase)(Fermentas Inc., USA)를 사용하여 16℃에서 2시간 동안 리게이션(ligation) 반응을 진행시켜 서브클로닝 하였다. 각각의 SH3RF2 변이체 유전자 발현벡터들은 상기 전장형태 SH3RF2 유전자 발현벡터를 주형으로 하여 수득하였고 상기 방법과 같이 서브클로닝 하였다. 이때 사용한 프라이머는 하기와 같았다. RING 도메인만을 가진 변이체(SH3RF2ㅿ1,2,3 SH3)에 대한 프라이머로는 5'-TTTTCTAGAATGGATGATTTGACGTTACTTG-3'(서열번호 7) 및 5'-TTTGAATTCGGCATTCGGGGCACCGCAGC-3'(서열번호 8)을, RING 도메인이 없는 변이체(SH3RF2ㅿRING)에 대한 프라이머로는 5'-TTTTCTAGAATGCGAGCAAAGGCCTTATGC-3'(서열번호 9) 및 5'-TTTGAATTCGTTTGCTGGGAAACACGGTCTGC-3'(서열번호 10)을 사용하였다. Myc-에피토프(epitope)를 가지는 SH3RF2 변이체 발현벡터들은 주형벡터 pBS-9myc 카세트 벡터(cassette vector)(서울대학교로부터 입수)와 정방향 프라이머(서열번호 11: 5'-TTTAAGCTTGGTGAACAAAAGTTGATTTCTGAAG-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 12: 5'-TTTAAGCTTTGGATCCGTTCAAGTCTTCTTCTGAG-3')로 PCR을 수행하여 수득한 6myc 크기의 PCR 산물을 SH3RF2 유전자 발현벡터들의 HindIII 부위에 각각 삽입시켜 제작하였다.
<2-2> SH3RF2 변이체 재조합 단백질 제작
글루타티온 S-전달효소(Glutathione S-transferase, GST)가 융합된 SH3RF2 변이체 재조합 단백질을 제조하기 위하여, 상기 SH3RF2 전장유전자 벡터를 주형으로 하고 각 변이체들에 대한 각각의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행하였다. 이때 사용한 프라이머는 전장유전자 증폭을 위해서 5'-TTGAATTCAAATGGATGATTTGACGTTACTTG-3'(서열번호 13) 및 5'-TTGTCGACTCATTTGCTGGGAAACAC-3'(서열번호 14)을, RING 부위가 제거된 변이체(SH3RF2ㅿRING) 유전자 증폭을 위해서 5'-TTGAATTCCCAACATTGAGGCGCTGC-3'(서열번호 15) 및 5'-TTGTCGACTCATTTGCTGGGAAACAC-3'(서열번호 16)을, 첫 번째와 두 번째 SH3 부위로 구성된 변이체(SH3RF2ㅿRING 3 SH3) 유전자 증폭을 위해서 5'-TTGAATTCCCAACATTGAGGCGCTGC-3'(서열번호 17)와 5'-TTGTCGACTCAGAGCCAGGCAGACT-3'(서열번호 18)을, 첫 번째 SH3 부위로 구성된 변이체(SH3RF2ㅿRING 2,3 SH3) 유전자 증폭을 위해서 5'-TTGAATTCTCCACATGGATGGGGTGCCTCG-3'(서열번호 19) 및 5'-TTGTCGACTCACTGGGGCAGCTGCTTGAT-3'(서열번호 20)을, 두 번째 SH3 부위로 구성된 변이체(SH3RF2ㅿRING 1,3 SH3) 유전자 증폭을 위해서 5'-TTGAATTCTCAAGCAGCTGCCCCAGCCG-3'(서열번호 21) 및 5'-TTGTCGACTCAAAGGTGTCTTGCGGTGAG-3'(서열번호 22)을, 세 번째 SH3 부위로 구성된 변이체(SH3RF2ㅿRING 1,2 SH3) 유전자 증폭을 위해서 5'-TTGAATTCCCGTGGTCAGTCTGCCTGG-3'(서열번호 23) 및 5'-TTGTCGACTCATTTGCTGGGAAACAC-3'(서열번호 24)을, 그리고 RING 부위로 구성된 변이체(SH3RF2ㅿ1,2,3 SH3)유전자 증폭을 위해서 5'-TTGAATTCAAATGGATGATTTGACGTTACTTG-3'(서열번호 25) 및 5'-TTGTCGACTCAGCAGCGCCTCA-3'(서열번호 26)을 사용하였다. 증폭한 각 단편을 다중 클로닝 부위의 앞부위에 발현 단백질인 GST가 삽입되어 있는 벡터 pGEX-4T-2(Invitrogen Inc., USA)의 EcoRI/SalI 부위에 클로닝하여 각각의 DNA에 대한 발현벡터를 제조하였다. 상기 발현벡터 각각을 대장균 BL21(DE3)에 형질전환시킨 후, 암피실린을 첨가한 LB 배지 5㎖에 12시간 동안 배양한 후, 암피실린을 첨가한 LB 배지 200㎖에 다시 접종하여 흡광도값(Optical Density)이 분광광도계(spectrophotometer) 600 ㎚ 파장에서 0.5가 되도록 배양한 다음, 0.2 mM IPTG를 첨가하여 6시간 동안 배양하여 각 DNA 단편에 대한 재조합 단백질의 발현을 유도시킨 후, 원심분리로 배양액을 제거하였다. 배양액이 제거된 각각의 유도체에 대한 형질전환체 균체를 1× RIPA 용액{20 mM Tris-HCl[pH 7.5], 150 mM sodium chloride, 1mM EDTA, 1% NP-40 및 1× protease inhibitor cocktail(Roche Inc., 대한민국), 1× phosphatase inhibitor cocktal(Roche Inc., 대한민국)}에 현탁한 후 1분간 초음파 처리를 하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄과정을 2회 반복한 후 원심분리하여 침전물과 분리하였다. SH3RF2 GST-융합 재조합 단백질은 상등액을 글루타치온-세파로스 4B(glutathione sepharose 4B)(GE Healthcare Life Science, USA)를 사용하여 분리 및 정제하였다.
<2-3> SH3RF2 변이체의 유비퀴틴 리가아제 활성 측정
헬라(HeLa) 세포주에 pcDNA-Ub-HA 벡터 및 pcDNA-SH3RF2-myc 변이체를 공이식한 후 항 c-myc 단일클론 항체(Santa cruz biotechnology INC., USA)로 면역침강하여 유비퀴틴 단백질을 확인하기 위해 항 HA 단일클론 항체(Covance Research Products Inc., USA)로 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, Myc로 표지된 SF3RF2 단백질의 이식을 항-Myc 항체로 확인하였고, 웨스턴 블랏 막을 폰슈 염색액으로 염색하여 면역침강에 사용한 단백질 양이 동일하였음을 확인하였다. 전장의 SH3RF2 및 pcDNA-Ub-HA가 공이식된 시료에서 항-HA 항체가 결합된 높은 분자량의 유비퀴틴화(ubiquitination) 된 SH3RF2를 확인할 수 있었다. RING 도메인이 없는 SH3RF2 변이체를 공이식한 시료에서도 SH3RF2가 유비퀴틴화 된 것이 확인되었다. 반면에, RING 도메인만을 공이식한 시료에서는 유비퀴틴화가 확인되지 않거나 매우 약하게 확인되었다.
<2-4> SH3RF2 변이체의 셀프 - 유비퀴틴화 ( ubiquitination ) 활성 측정
SH3RF2 단백질의 자신에 대한 셀프-유비퀴틴화 활성을 시험관 내에서 확인하였다. 기존에 RING 도메인을 가진 E3 리가아제들에 대한 E2 conjugating enzyme으로 주로 작용하는 것으로 알려진 UBCH5a 및 UBCH13/Mms를 사용하였다. 유비퀴틴 반응 상충용액{40 mM Tris-Hcl pH7.5, 1 mM DTT, 2 mM ATP, 5 mM MgCl2, 0.005%(v/v) Tween-20, Flag-Ubiquitin 1 ㎍/㎕(Sigma, USA)}에 0.3 μM의 E2 enzyme UbcH5a conjugating Enzyme(upstate, USA), 50 nM의 Ubiquitin activating Enzyme E1(upstate, USA)을 혼합한 다음, SH3RF2 단백질 전장형태 및 SH3RF2ㅿRing 단백질과 30℃에서 30분간 반응을 시킨 후 웨스턴 블랏을 실시하였다. 또한, UbcH13/Mms2 conjugating Enzyme(upstate, USA)을 이용한 유비퀴틴화 활성을 확인하기 위하여, 상기의 방법에 따라 유비퀴틴 반응 상충용액을 사용하여 SH3RF2 단백질 전장형태 및 SH3RF2ㅿRing 단백질과 반응시켰다.
그 결과, RING 도메인을 가진 전장 SH3RF2(GST-SH3RF2)는 상기 UBCH5a 또는 UBCH13/Mms E2 모두에 대해 E3 활성을 보였으며, RING 부위가 제거된 SH3RF2 변이체(GST-ㅿRING)는 자신을 유비퀴틴화 시키지 못하였다. 이에, SH3RF2는 자신을 유비퀴틴화시키는 RING 도메인을 가진 E3 리가아제임을 확인하였다.
p21 활성 키나제 4( p21 - activated kinase 4, PAK4 )와 SH3RF2 단백질의 상호작용 확인
<3-1> PAK4 와 SH3RF2 단백질의 결합 확인
암에서 발현이 증가하고 세포사멸 억제와 세포이동 촉진에 관여하는 것으로 보고되어 있는 암유전자 PAK4 단백질, 및 SH3RF2 단백질이 서로 결합하는지를 확인하기 위하여 myc가 표지된 SH3RF2 유전자 발현벡터 pcDNA-SH3RF2-myc을 pcDNA-PAK4-flag 벡터와 함께 HEK293T 세포주(American Type Culture Collection, USA)에 동시에 함께 주입시키고 48시간 후 세포질 분획을 추출하여, 항 Flag 마우스 단일클론 항체(SIGMA, USA)로 면역침강 시킨 후, 마우스 항 c-myc 단일클론 항체(Santa cruz biotechnology INC., USA)로 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 3의 A에 나타낸 바와 같이, SH3RF2 단백질과 PAK4 단백질이 세포 내에서 서로 결합하고 있음을 확인하였다.
<3-2> PAK4 와 SH3RF2 단백질의 확인
상시 실시예 <3-1>에서 확인한 바와 같이, PAK4 단백질과 SH3RF2 단백질이 동물세포 내에서 서로 결합하므로 이들의 결합이 직접적인 결합인지 간접적인 결합인지를 확인하고, SH3RF2의 어느 도메인에 PAK4 단백질이 결합하는지 알아보았다. 이를 위해 pET28a-PAK4-His 벡터 또는 SH3RF2 변이체의 유전자가 클로닝된 pGEX2T-SH3RF2 변이체 벡터를 BL21(DE3)(Stratagene, USA) 대장균 세포주에 주입하여 PAK4-His 융합 재조합 단백질 및 GST-SH3RF2 융합 재조합 단백질을 각각 제조하였다. SH3RF2 변이체와 PAK4 사이의 시험관 내 결합 반응 후 글루타치온-아가로스 비드를 이용하여 GST pull down 하고, 이를 항 PAK4 다클론 항체(Cell Signaling technology, USA)를 사용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 3의 B에 나타낸 바와 같이, SH3RF2의 첫 번째 SH3 및 두 번째 SH3 도메인 모두에서 PAK4 His-융합 재조합 단백질이 결합함을 확인하였다.
SH3RF2 발현억제의 세포사멸에 대한 영향 확인
<4-1> SH3RF2 의 발현이 억제된 헬라( HeLa ) 세포주에서의 세포사멸 유도
기존에 보고된 문헌에서 PAK4의 발현이 암세포사멸에 관여하며, 특히 PAK4 발현이 억제된 암세포에 TNF-a 및 사이클로헥사마이드를 동시에 처리할 경우 세포사멸이 촉진되는 것으로 보고되었다(Li X. et al., J Biol Chem. 2005, 280, 41192-41200).
이에, 상기 <실시예 3>에서 SH3RF2 단백질과 암유전자 PAK4 단백질이 결합하는 것을 확인하였으므로, SH3RF2의 발현이 TNF-a 및 사이클로헥사마이드의 동시처리에 의해 유발되는 세포사멸과 관련되어 있음을 하기와 같은 실험을 수행하여 확인하였다. SH3RF2를 녹다운(knock-down) 시킨 헬라(HeLa) 세포주{HeLa/shSH3RF2(#1) 또는 HeLa/ shSH3RF2(#3)}(American Type Culture Collection, USA) 또는 대조군(HeLa/shGFP)에 TNF-a 및 사이클로헥사마이드를 동시에 처리하여 세포사멸(apoptosis)을 유도하였다. 세포사멸 유도한 뒤 4시간 후 Hoechst 염색을 통해 세포핵을 관찰하여 염색된 세포수를 측정하여 이를 백분률로 수치화하였다.
그 결과, 도 4의 A 및 B에 나타낸 바와 같이, SH3RF2가 발현억제된 세포(shSH3RF2 #1 또는 shSH3RF2 #3)에서, 세포사멸시 발생하는 DNA 응축에 의해 핵이 밝게 Hoechst 염색되는 세포수가 대조군(HeLa/shGFP)보다 현저히 많았다.
<4-2> SH3RF2 의 발현이 억제된 간암 세포주에서의 세포사멸 유도
상기 실시예 <4-1>의 방법에 따라 헬라 세포주 대신에 Huh7 간암 세포주(American Type Culture Collection, USA)를 사용하여 SH3RF2 발현억제에 의한 세포사멸 효과를 확인하였다. shSH3RF2 벡터를 이용하여 SH3RF2 녹다운(knock-down)시킨 Huh-7 세포주를 제작하였고, 상기 세포에(shSH3RF2 #G6-7) TNF-a 및 사이클로헥사마이드를 동시에 처리하여 세포사멸을 유도시켰다. 세포사멸 유도 후 4시간째 Hoechst로 염색하였고, DNA 응축에 의해 Hoechst가 밝게 염색된 세포수를 전체 세포 수 대비 백분율 그래프로 나타냈다.
그 결과, 도 4의 C 및 D에 나타낸 바와 같이, Huh7 세포주에서도 SH3RF2 발현이 억제될 경우, TNF-a 및 사이클로헥사마이드 동시처리에 의한 세포사멸에 더욱 민감하게 반응하였다.
<4-3> 세포사멸표지인자의 발현 변화 측정
SH3RF2 유전자 녹다운에 의한 세포사멸표지인자 단백질 발현의 변화를 웨스턴 블랏을 이용하여 측정하였다. 상기 실시예 <4-1>에서 SH3RF2를 녹다운시킨 헬라 세포주{HeLa/shSH3RF2(#1) 또는 HeLa/shSH3RF2(#3)}에 TNF-a 및 사이클로헥사마이드를 동시에 2, 3 또는 4시간 동안 처리한 후 세포사멸의 표지인자로 알려진 클리브드 카스파제-8(cleaved caspase-8) 및 PARP 단백질을 항 클리비지(Cleavage) PARP 다클론 항체(Millipore, USA) 또는 항 Caspase-8 단일클론 항체(assay design inc., USA)를 사용하여 웨스턴 블랏을 실시하여 확인하였다.
그 결과, 도 5의 A에 나타낸 바와 같이, SH3RF2 발현억제된 헬라 세포주에서 카스파제-8의 활성화된 형태인 클리브드 카스파제-8(p43, 43 kDa 단백질)의 발현 정도가 대조군보다 증가하였고, 클리브드(cleaved) PARP의 발현 정도 역시 증가하였다. 이에, SH3RF2가 발현억제되면 TNF-a 및 사이클로헥사마이드의 처리에 의한 세포사멸 유도에 세포는 더욱 민감하게 반응하여 신속하게 세포사멸이 진행된다는 것을 알 수 있었다.
<4-4> SH3RF2 과발현에 의한 세포사멸표지인자의 발현 변화 측정
SH3RF2 발현량이 낮은 SK-Hep1 암세포주(American Type Culture Collection, USA)에 SH3RF2를 과발현시켜 상기 실시예 <4-3>의 방법에 따라 클리브드(cleaved) PARP의 발현 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 5의 B에 나타낸 바와 같이, SH3RF2 과발현 세포주에서 TNF-a 및 사이클로헥사마이드에 의한 클리브드 PARP 발현의 변화는 상기 실시예 <4-2>의 SH3RF2 발현억제 세포주와는 반대로 대조군보다 감소하는 것으로 나타났다. 이는 SH3RF2의 과발현이 PAK4 단백질의 발현 또는 활성을 증가시켜 TNF-a 및 사이클로헥사마이드에 의해 유도되는 세포사멸에 저항성 가질 수 있게 해주어 클리브드 PARP가 대조군보다 감소되는 것으로 나타났다.
<4-5> SH3RF2 발현 변화에 의한 c- Jun N-말단 키나제(c- Jun N- terminal kinases, JNK ) 활성 변화 확인
상기 <실시예 3>의 PAK4는 MAP 키나제 전달경로(MAP kinase pathway) 중 c-Jun N-말단 키나제(c-Jun N-terminal kinases, JNK)의 상위 조절자로서 종양괴사인자-a(tumor necrosis factor-a, TNF-a)에 의한 신호를 증가시킨다는 보고가 있다(Gnesutta, N & Minden, A 2003). 스트레스에 대한 세포반응으로 MAPK 키나제(MAPK kinases, MAPKK)에 의해 활성화되는 MAP 키나제 중 하나인 JNK는 c-Jun의 N-말단 부위를 인산화시킴으로써 전사인자인 활성 단백질 1(activating protein 1, AP-1)의 활성을 조절한다. 이때 JNK1의 활성에 의해 세포사멸이 촉진되는데 이러한 세포사멸 기작이 JNK2의 활성에 의해 억제됨이 보고되어 있다(Shafiq Uddin Ahmed & Jo Milner, PLoS ONE, 2009, Vol. 4, e7305).
이에, PAK4의 발현량 조절을 통한 세포사멸의 조절에 관여하는 SH3RF2의 발현 변화의 JNK 활성에 대한 영향을 웨스턴 블랏을 이용하여 측정하였다. SH3RF2를 녹다운시킨 헬라 세포주{HeLa/shSH3RF2(#1) 또는 HeLa/shSH3RF2(#3)}에 TNF-a 및 사클로헥사마이드를 동시에 0, 15, 30 또는 60분 동안 처리하여 JNK의 인산화를 항-p-JNK 다클론 항체(Santa cruz biotechnology INC., USA)를 사용하여 웨스턴 블랏을 실시하였다.
그 결과, 도 5의 C에 나타낸 바와 같이, SH3RF2가 발현억제된 헬라 세포주에서 상기의 세포사멸을 유도하는 JNK1의 인산화는 거의 변화가 없었으나, 세포사멸을 유도하는 JNK1의 기전을 억제하는 JNK2의 인산화는 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 JNK2 인산화 감소는 하부의 c-jun의 인산화를 감소시켰다. 따라서, c-jun 및 c-fos의 이중체로 구성된 AP-1의 활성이 SH3RF2 발현량의 변화에 의해 조절될 수 있다는 것을 알 수 있었다.
<4-6> SH3RF2 발현 변화에 의한 JNK 활성 변화 확인
SH3RF2 발현량이 낮은 SK-Hep1 암세포주에 SH3RF2 과발현 벡터를 주입하여 제작한 안정화된 SH3RF2 과발현 세포주에 TNF-a 및 싸이클로헥사마이드를 동시에 10, 20 또는 30분 동안 처리하여 JNK의 인산화를 웨스턴 블랏으로 확인하였다.
그 결과, 도 5의 D에 나타낸 바와 같이, JNK1의 인산화는 변화가 없었고, JNK2의 인산화가 증가하는 것으로 나타났다. JNK2 인산화 증가는 하부의 c-jun의 인산화를 증가시켰다. 따라서, 상기 실시예 <4-5>의 결과와 마찬가지로 SH3RF2에 의해 JNK2 인산화가 조절되는 것을 알 수 있었다.
SH3RF2 발현량 변화에 따른 PAK4 발현의 영향 확인
<5-1> PAK4 단백질 발현량의 확인
상기 SH3RF2 과발현 세포주 또는 녹다운 세포주에서의 PAK4 단백질 발현량을 항 PAK4 다클론 항체(Cell Signaling technology, USA)를 사용하여 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 6의 A에 나타낸 바와 같이, SH3RF2 과발현 세포주에서 PAK4 단백질 양이 증가하였고, SH3RF2 발현억제 세포주에서는 반대로 PAK4 단백질 양이 감소하였다.
이러한 SH3RF2 과발현 세포주에서의 PAK4 단백질 양의 변화가 일시적인 SH3RF2 발현에 의해서 나타나는지를 확인하기 위하여, SH3RF2 발현벡터를 HEK293T 또는 헬라 세포주에 주입하고 48시간 후 세포 내에 존재하는 PAK4 단백질을 PAK4 항체로 확인하였다.
그 결과, 도 6의 B에 나타낸 바와 같이, PAK4 단백질의 양은 SH3RF2를 지속적으로 과발현하는 세포주에서 증가하는 것을 확인하였다. 그러나 RING 도메인이 제거된 유비퀴틴화 활성이 없는 SH3RF2 과발현 세포주에서는 PAK4 단백질의 변화가 나타나지 않았다. 이에, PAK4의 발현량 조절에 SH3RF2의 유비퀴틴화 활성이 요구됨을 확인하였다.
<5-2> PAK4 유전자 발현의 확인
상기 실시예 <5-1>과 같이, SH3RF2의 발현 변화에 의한 PAK4 발현조절이 유전자 전사(transcription) 조절에 의한 것인지 전사 후(post-transcription) 조절에 의한 것인지를 확인하기 위하여, PAK4 mRNA 발현을 RT-PCR로 확인하였다. 이때 사용한 프라이머는 정방향 프라이머가 5'-GAGCTGCTCTTCAACGAGGT-3'(서열번호 27), 역방향 프라이머가 5'-CTCCTCGTTCATCCTGGTGT-3'(서열번호 28)이었다.
그 결과, 도 6의 C에 나타낸 바와 같이, PAK4 mRNA 발현량에는 변화가 없었다.
생체 내( in vivo )에서의 SH3RF2 발현량에 따른 종양 형성능 확인
<6-1> SH3RF2 녹다운 세포주의 마우스에서의 종양 형성능 확인
Huh-7 간암 세포주에 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)를 이용하여 SH3RF2를 녹다운시킨 각각의 콜로니 세포주(sh SH3RF2 G6-2, G6-4, G6-5 또는 G6-7)로부터 세포분획을 추출하여 웨스턴 블랏을 실시한 결과, 도 7의 A에 나타낸 바와 같이, SH3RF2 단백질의 발현이 효과적으로 억제되었음을 확인하였다. 상기 SH3RF2 녹다운시킨 세포 중 shSH3RF2 G6-7 세포주 또는 대조군(shControl) 세포주를 누드마우스(athymic nu/nu on BALB/c background; 일본)에 각각 주입하고 23일 후 종양 형성능을 비교하였다.
그 결과, 도 7의 B에 나타낸 바와 같이, Huh-7 세포 또는 대조군(shControl) 세포주를 주입한 누드마우스에서 생긴 종양의 크기는 비슷하였으나, SH3RF2가 녹다운된 shSH3RF2 G6-7 세포주를 주입한 누드마우스에 생성된 종양의 크기는 대조군에 비해 현저히 작은 것을 확인하였다.
<6-2> SH3RF2 과발현 세포주의 마우스에서의 종양 형성능 확인
myc가 표지된 SH3RF2를 과발현하는 PLC/PRF/5 간암 세포주(American Type Culture Collection, USA)인 SH3RF2-myc #3 콜로니 세포, 또는 대조군(pcDNA) 세포에서 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏을 실시한 결과, 도 7의 C에 나타낸 바와 같이, SH3RF2 단백질의 발현이 효과적으로 과발현되었음을 확인하였다. 상기 SH3RF2-myc #3 콜로니 세포 또는 대조군(pcDNA) 세포를 누드마우스에 주입하여 45일 후 종양 형성능을 비교하였다.
그 결과, 도 7의 C에 나타낸 바와 같이, 대조군(pcDNA) 세포를 주입한 누드마우스에서는 종양이 생기지 않았으나, SH3RF2를 과발현시킨 SH3RF2-myc #3 콜로니 세포를 주입한 5마리 누드마우스 중 4마리에서 종양이 형성되었다. 따라서, SH3RF2는 발암 유전자로서, 결핍이 되면 종양의 형성이 감소하고 과발현되면 종양 형성능이 증가하는 것을 확인하였다.
간암조직 또는 정상 간조직에서의 SH3RF2 단백질 발현의 확인
임상조직에서의 SH3RF2 단백질 발현양상을 확인하기 위하여, 인제대학교 백병원에서 간암으로 판정된 환자 104례의 간암 임상조직 또는 24례의 정상 간조직으로 구성 제작된 조직 마이크로어레이(tissue microarray, TMA)를 이용하여 SH3RF2 단백질 발현을 확인하였다. 조직 마이크로어레이는 적출한 각 조직을 10% 포르말린으로 고정하여, 파라핀 블록{paraffin-embedded HCC(donor block)}을 제작하였고, 파라핀 블록으로부터 중심조직 생검편(core tissue biopsy; 직경 2 ㎜)을 취하여 트리핀 장치(trephine apparatus; Superbiochips Laboratories, Korea)를 이용하여 수령(recipient) 파라핀 블록(조직 어레이 블록: tissue array block)에 배열하여 제작하였다. 상기 조직 어레이 블록으로부터 면역조직화학적 실험을 수행하였다. 구체적으로, 파라핀 제거과정(Deparaffining)과 항원 회수과정(antigenic retrieval processes)을 거친 다음, 슬라이드를 항-SH3RF2 항체(1:100)로 라벨링하였으며, 라벨링된 SH3RF2는 아비딘-바이오틴 복합체(avidin-biotin complex; ABC)법에 의해 분석하였다. 이때, 색소원으로는 3,3'-다이아미노벤지딘(3,3'-Diaminobenzidine, DAB)을 사용하였다. 항체에 대한 음성대조군으로써 식염수를 사용하였으며, 조직영역에서 세포의 10% 이상이 균일하게 염색되면 양성으로 간주하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 정상 간조직에서 SH3RF2 단백질 발현은 확인되지 않았고 단지 혈관내피 근세포에서만 발현이 확인되었다. 그러나 간암조직의 경우 104례의 간암조직 중 43례에서 SH3RF2 발현이 확인되었고, 발현되는 SH3RF2 단백질의 대부분(40례)은 핵에 존재하였으며 세포질 발현이 2례, 나머지 1례는 세포막에 존재함이 확인되었다. 또한, 상기 TMA의 결과를 환자의 임상자료와 비교분석한 결과, SH3RF2의 발현은 환자의 나이, 암의 진행단계, 전이형태 또는 암 재발 등과 유의성(p<0.05)이 있음이 나타났으며, 환자의 생존과도 밀접한 상관관계(P = 0.0149)가 있었다.
< 제조예 1> 약학적 제제의 제조
<1-1> 산제의 제조
SH3RF2 발현 또는 활성 억제제 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<1-2> 정제의 제조
SH3RF2 발현 또는 활성 억제제 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<1-3> 캡슐제의 제조
SH3RF2 발현 또는 활성 억제제 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<1-4> 환의 제조
SH3RF2 발현 또는 활성 억제제 1 g
유당 1.5 g
글리세린 1 g
자일리톨 0.5 g
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
<1-5> 과립의 제조
SH3RF2 발현 또는 활성 억제제 150 ㎎
대두추출물 50 ㎎
포도당 200 ㎎
전분 600 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 30 % 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60 ℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
상기와 같이, SH3RF2 단백질의 발현 및 활성 억제제는 세포사멸을 촉진하고 종양 형성능을 감소키시므로 암 예방 또는 치료를 위한 항암용 조성물, 항암용 화합물에 대한 항암 보조제, 항암제 후보물질의 탐색 또는 SH3RF2 과발현에 의해 유발되는 암의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (13)

  1. SH3 도메인 함유 링 핑거 2(SH3 domain containing ring finger 2, SH3RF2) 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 SH3RF2 단백질 발현 억제제를 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, SH3RF2 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서, 상기 암은 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  6. SH3RF2 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 SH3RF2 단백질 발현 억제제를 함유하는 항암 보조제.
  7. 1) SH3RF2 단백질의 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
    2) 상기 세포주의 SH3RF2 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
    3) 상기 SH3RF2 단백질의 발현 또는 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 항암제 또는 항암 보조제 후보물질의 스크리닝 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 단계 2)의 단백질의 발현 정도는 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블롯(Western Blot) 및 RT-PCR로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  9. 제 7항에 있어서, 단계 2)의 단백질의 활성 정도는 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  10. 1) 피검물질 존재하에 SH3RF2 단백질과 PAK4 단백질을 접촉시키는 단계;
    2) 상기 SH3RF2와 PAK4 단백질의 결합 정도를 측정하는 단계; 및
    3) 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 SH3RF2와 PAK4의 결합 정도를 감소시킨 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 항암제 또는 항암 보조제 후보물질의 스크리닝 방법.
  11. 1) SH3RF2 및 유비퀴틴(ubiquitin) 단백질 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
    2) 상기 세포주의 SH3RF2 단백질의 유비퀴틴화 활성 정도를 측정하는 단계; 및
    3) 상기 SH3RF2 단백질의 유비퀴틴화 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 항암제 또는 항암 보조제 후보물질의 스크리닝 방법.
  12. 서열번호 1로 기재되는 SH3RF2 단백질과 반응하는 항체, 또는 서열번호 2로 기재되는 SH3RF2 유전자에 상보적이고 상기 유전자를 증폭할 수 있는 18 내지 30개의 핵산 서열로 구성된 프라이머쌍 중 어느 하나 이상을 포함하는 암 진단용 키트.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 프라이머쌍은 서열번호 3으로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트.
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