KR101366612B1 - 시스타틴 ｃ를 유효성분으로 함유하는 천식 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

시스타틴 ｃ를 유효성분으로 함유하는 천식 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 시스타틴 C(Cystatin C)를 유효성분으로 함유하는 천식 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, 인체 및 마우스 유래의 시스타틴 C를 대량 분비생산하고, 생산된 시스타틴 C를 난백 알부민으로 감작된 천식 유도 동물모델에 직접 주입하여 기도과민성 억제, 기관지 폐포 세척액내 호산구 및 염증세포의 감소, 기관지 폐포 세척액내 염증매개물질의 감소, 기도 점막내 염증세포 침윤 억제 등의 효과를 나타냄을 확인하였으므로, 본 발명의 시스타틴 C 단백질은 천식의 예방 및 치료용 조성물에 유용하게 이용할 수 있을 뿐 아니라, 이를 이용한 천식 진단 또는 천식 치료제 후보물질의 스크리닝 방법에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

시스타틴 Ｃ를 유효성분으로 함유하는 천식 예방 및 치료용 조성물{Composition containing a Cystatin C protein for the prevention and treatment of asthma}
본 발명은 시스타틴 C(Cystatin C)를 유효성분으로 함유하는 천식 예방 및 치료용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
전 세계적으로 그 발병률이 증가하고 있는 알러지성 질환에는 과민증(anaphylaxis), 알러지성 비염(allergic rhinitis), 및 천식(asthma), 아토피성 피부염(atopic dermatitis) 및 두드러기(urticaria)가 있다(Wuthrich B. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 90, pp3-10, 1989). 이러한 알러지성 질환 중 천식(asthma)은 여러 가지 자극에 대한 기도의 과민반응성(bronchial hyperresponsiveness)을 그 특징으로 하는 질환으로 만성 기도염증(chronic airway inflammation)을 일으키며 기도의 광범위한 협착에 의해 발생하는 천명(喘鳴), 호흡곤란, 기침 등의 임상 증세들이 나타나는데 이는 자연히 혹은 치료에 의해 가역적으로 호전될 수 있다(Minoguchi K and Adachi M. Pathophysiology of asthma. In: Cherniack NS, Altose MD, Homma I, editors. Rehabilitation of the patient with respiratory disease. New York: McGraw - Hill, pp97-104, 1999).
일반적으로 천식은 TH2 타입 면역세포가 생성하는 인터루킨-4, 5, 13에 의해 염증세포가 증식, 분화 및 활성화되어 기도 및 기도주변 조직으로 이동, 침윤하여 나타나는 만성 염증질환으로 인식되고 있다(Elias JA, et al., J. Clin . Invest ., 111, pp291-297, 2003). 이 경우 활성화된 호산구, 비만세포, 폐포 대식세포 등의 염증세포가 다양한 염증매개인자들(시스테인 류코트리엔, 프로스타글란딘 등)을 분비하면서 강력한 기관지 수축작용이 과정에서 중요한 역할을 한다(Maggi E., Immunotechnology, 3, pp233-244, 1998; Pawankar R., Curr . Opin . Allergy Clin . Immunol., 1, pp3-6, 2001; Barnes PJ, et al., Pharmacol Rev ., 50, pp515-596, 1998).
따라서 염증세포 활성화에 관여하는 IL-4, IL-5, IL-13 등 사이토카인 및 면역글로불린 E의 생산과 이들의 작용으로 호산구 등 염증세포에서 분비되는 시스테인 류코트리엔 생합성 등은 염증 및 알러지 반응과 이로 인한 천식을 유발하는 주요 원인이므로 이들의 생산을 억제하기 위한 약물을 개발하고자 많은 연구가 진행되고 있다. 특히, 천식 및 비결막염을 비롯한 알레르기성 질병에 대한 이해는 동물모델을 사용한 연구로부터 많이 얻어지고 있다. 동물모델을 사용한 연구를 통해 알레르기의 바탕인 면역학적 기전에 대한 이해가 가능하게 되었을 뿐만 아니라, 개발중인 치료제의 평가도 가능하게 되었다.
지금껏 일류가 개발한 약제 중 가장 강력한 항염작용을 지니고 있는 약제는 스테로이드 제제이다. 그러나 장기적으로 사용할 때 반드시 부작용을 수반하게 된다. 따라서 천식 치료에 있어 스테로이드제는 처음 사용할 때 놀라울 정도의 효과를 발휘하여 증상을 완전 소실시켜버리지만 이는 잠시일 뿐이고, 증상은 스테로이드 사용을 중지함과 함께 다시 나타나며 반복사용과 함께 증상은 더욱 심해져 간다. 스테로이드제는 둥근 다혈성의 얼굴, 체액의 저류, 부신억제, 감염에 대한 감수성의 증가와 기타 정신병, 백내장, 녹내장, 소화성 궤양, 창상 치유 지연, 초기 감염의 재활성화 등의 많은 부작용이 있어, 천식 치료에 효과적이면서도 부작용을 줄일 수 있는 안전한 약제의 개발이 시급한 실정이다.
인체 시스타틴 C(Cystatin C)는 대부분의 인체 조직과 혈액에 존재하는 카텝신(cathepsin) 등을 포함하는 시스테인-프로테아제(cysteine-protease) 저해제로서 ca결합조직(connective tissue)의 분해와 관련된 단백질 분해효소의 활성을 조절하는 기능을 한다(Abrahamson M 등, J Biol Chem 1986, 261, 11282). 인체 시스타틴 C는 120개의 아미노산으로 구성된 단백질로 분자량 13.4 Kd이며 2개의 이황화 결합으로 안정화되어 있다.
인체 시스타틴 C는 박테리아나 바이러스 감염에 대한 억제 효과(Bjorck 등, Nature, 1989, 337, 385, Bjorck 등, J Virol 1990, 62, 941)가 있음이 알려져 있다. 또한 인체 정상조직에서는 시스테인 프로테아제인 카텝신(cathepsin) B와 시스타틴 C의 활성이 정교하게 조절되고 있는 반면 암환자 조직에서는 카텝신(cathepsin) B의 활성이 증가되는 불균형이 관찰되었으며(Kos 등, Int J Biol Markers 2000, 15, 84) 시스타틴 C가 과발현된 흑색종 세포의 전이가 지속적으로 감소(Cox 등, 1999, 9, 369)되는 등의 항암기능이 알려져 있어 항암 단백질로서 가능성이 매우 높다. 알츠하이머 질환 환자에서 시스타틴 C 수치는 증가하는 경향을 보이지만(Chuo 등, 2007, 23, 251) 시스타틴 C 는 아밀로이드 베타(amyloid β)와 결합하여 이의 집적과 침착을 억제한다고 알려져 있다(Mi 등, 2007, Nat Genet, 39, 1440, Kaeser 등, 2007, Nat Genet, 39, 1437). 또한 동맥경화나 동맥류에서 시스테인 프로테아제인 카텝신 S와 K가 과발현되는 반면 시스타틴 C의 발현은 억제되고 있어 시스타틴 C의 결핍은 다양한 혈관질환도 유발하는 것으로 여겨지고 있다(Shi 등, J Clin Invest, 1999, 104, 1191; Chapman 등, Am Rev Respir Dis., 1990, 141, 698; Abisi 등, 2007, J Vasc Surg, 46, 1260; Abdul-Hussien 등, 2007, Am J Pathol, 170, 809).
또한, 재조합 대장균을 이용하여 인체 시스타틴 C, 마우스 및 랫트(rat)의 시스타틴 C를 재조합 대량생산한 보고는 있으나(Dalboge 등, Gene, 1989, 79, 325, Berti 등, Protein Expression and Purification, 1997, 11, 111, Hakansson 등, Comp. Biochem. Physiol. 1996. 114B, 303), 주로 세포 내 발현이며 불용성 단백질의 형성 등으로 인해 활성 단백질의 정제비용이 많이 드는 단점이 있었다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 효모 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 이용하여 인체 시스타틴 C를 분비생산한 예도 보고되었으나(David 등, Enzyme and Microbial Technology, 2001, 29, 335), 그 발현 양이 미미하였다.
이에, 본 발명자들은 천식을 유발한 동물의 폐조직내 시스타틴 C의 발현이 정상 조직에 비해 억제되어 있음을 확인하고, 인체에 무해한 GRAS 효모인 사카로마이세스 세레비지에( Saccharomyces cerevisiae)를 이용하여 인체 및 마우스 유래의 시스타틴 C를 대량 분비생산할 수 있고, 생산된 시스타틴 C를 난백 알부민으로 감작된 천식 유도 동물모델에 직접 주입하여 기도과민성 억제, 기관지폐포 세척액내 호산구 및 염증세포의 감소, 기관지 폐포 세척액내 염증매개물질의 감소, 기도점막내 염증세포 침윤 억제 등의 효과를 확인하여 시스타틴 C가 새로운 천식 치료제로서 활용 가능함을 최초로 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 시스타틴 C(Cystatin C) 단백질을 유효성분으로 함유하는 천식 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 시스타틴 C의 발현 또는 활성 유도제를 유효성분으로 함유하는 천식 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 시스타틴 C 유전자를 마커로 이용하여 천식을 진단 또는 모니터링하는 방법을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 시스타틴 C 유전자 발현 또는 시스타틴 C 단백질의 활성 측정을 통한 천식 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시스타틴 C(Cystatin C) 단백질을 유효성분으로 함유하는 천식 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 시스타틴 C의 발현 또는 활성 유도제를 유효성분으로 함유하는 천식 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 천식 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다:
1) 실험군으로서 피검체 유래 시료에서 시스타틴 C의 발현량을 측정하는 단계;
2) 단계 1)의 시스타틴 C의 발현량과 대조군으로서 정상 개체 유래 시료의 시스타틴 C의 발현량을 비교하는 단계; 및
3) 시스타틴 C 발현량이 대조군에 비해 감소하는 경우 천식에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 천식 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다:
1) 피검 화합물 또는 조성물을 시스타틴 C를 발현하는 세포주에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 시스타틴 C의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 시스타틴 C 발현량이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 대조군 세포주와 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계.
아울러, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 천식 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다:
1) 피검 화합물 또는 조성물을 시스타틴 C 단백질에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 시스타틴 C 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 시스타틴 C 단백질의 활성이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 시스타틴 C 단백질의 활성과 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계.
본 발명의 시스타틴 C 단백질은 천식 마우스에서 기도과민성 및 기관지 폐포 세척액 내 염증 세포를 억제하고, 혈청 또는 기관지 폐포 세척액 내 IgE 및 싸이토카인을 억제할 뿐 아니라, 폐 조직 내 염증을 효과적으로 억제할 수 있다.
도 1은 인체 및 마우스 시스타틴 C 유전자의 효모 TFP 벡터 도입을 위한 PCR 및 생체네 재조합(in vivo recombination) 과정을 설명한 그림이다.
도 2는 효모 유래의 24개 TFP 벡터에 인체 시스타틴 C가 도입되어 형성된 형질 전환체를 각각 배양하고, 얻어진 배양 상등액을 SDS-PAGE(A) 및 웨스턴 블랏(western blot)(B) 분석한 결과이다.
도 3은 효모 유래의 24개 TFP 벡터에 마우스 시스타틴 C가 도입되어 형성된 형질 전환체를 각각 배양하고, 얻어진 배양 상등액을 SDS-PAGE(A) 및 웨스턴 블랏(western blot)(B) 분석한 결과이다.
도 4는 인체 시스타틴 C를 발현하는 효모 균주 Y2805(pYT6-hCST3) 균주를 5L 발효조에서 유가식 배양한 결과로서, 세포 성장 곡선(A) 및 배양 시간별로 배양 상등액을 SDS-PAGE 분석(B)한 결과이다.
도 5는 마우스 시스타틴 C를 발현하는 효모 균주 Y2805(pYT6-mCST3) 균주를 5L 발효조에서 유가식 배양한 결과로서, 세포 성장 곡선(A) 및 배양 시간별로 배양 상등액을 SDS-PAGE 분석(B)한 결과이다.
도 6은 효모 유래의 재조합 인체 시스타틴 C 정제를 위한 이온교환크로마토그라피(A) 및 수획별 SDS-PAGE 분석(B)한 결과이다.
도 7은 효모 유래의 재조합 인체 시스타틴 C 의 HIS tag을 이용한 정제 크로마토그라피(A) 및 수획별 SDS-PAGE 분석(B) 및 웨스턴 블랏(Western blot)(C) 분석한 결과이다.
도 8은 효모 유래의 재조합 마우스 시스타틴 C 정제를 위한 이온교환크로마토그라피(A) 및 수획별 SDS-PAGE 분석(B)한 결과이다.
도 9는 효모 유래의 재조합 마우스 시스타틴 C 의 HIS tag을 이용한 정제 크로마토그라피(A) 및 수획별 SDS-PAGE 분석(B) 및 웨스턴 블랏(Western blot)(C) 분석한 결과이다.
도 10은 천식 마우스에서 시스타틴 C의 기도과민성 억제 효과를 기도 과민성 지표인 Pehn(Enhanced Pause)값을 측정하여 평가한 결과이다:
* : 정상 대조군(NC)과 비교하여 통계적 유의성이 인정된 경우(p<0.05), 및
# : 천식 유발군(OVA)과 비교하여 통계적 유의성이 인정된 경우(p<0.05).
도 11은 천식 마우스에서 시스타틴 C의 기관지 폐포 세척액내 염증 세포 억제 효과를 호산구 및 이외 세포의 수의 변화를 통해 나타낸 결과이다:
* : 정상 대조군(NC)과 비교하여 통계적 유의성이 인정된 경우(p<0.05), 및
# : 천식 유발군(OVA)과 비교하여 통계적 유의성이 인정된 경우(p<0.05).
도 12는 천식 마우스에서 시스타틴 C의 혈청과 기관지 폐포 세척액내 난알부민 특이 IgE의 억제 효과를 확인한 결과이다:
* : 정상 대조군(NC)과 비교하여 통계적 유의성이 인정된 경우(p<0.05), 및
# : 천식 유발군(OVA)과 비교하여 통계적 유의성이 인정된 경우(p<0.05).
도 13은 천식 마우스에서 시스타틴 C의 기관지 폐포 세척액내 싸이토카인 억제 효과를 확인한 결과이다:
* : 정상 대조군(NC)과 비교하여 통계적 유의성이 인정된 경우(p<0.05), 및
# : 천식 유발군(OVA)과 비교하여 통계적 유의성이 인정된 경우(p<0.05).
도 14는 천식 마우스에서 시스타틴 C의 폐조직 내 염증 억제 효과를 조직 염색으로 확인한 사진이다.
도 15는 천식 마우스에서 시스타틴 C의 폐조직 내 염증 억제 효과를 염증 수치로 환산하여 비교한 표이다:
* : 정상 대조군(NC)과 비교하여 통계적 유의성이 인정된 경우(p<0.05), 및
# : 천식 유발군(OVA)과 비교하여 통계적 유의성이 인정된 경우(p<0.05).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 시스타틴 C(Cystatin C) 단백질을 유효성분으로 함유하는 천식 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
상기 시스타틴 C 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 시스타틴 C의 발현 또는 활성 유도제를 유효성분으로 함유하는 천식 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 인체 및 마우스 유래의 시스타틴 C 발현 효모 벡터를 제작하였고(도 1 참조), 이를 포함하는 형질전환체로 각 시스타틴 C가 분비생산됨을 확인하였으며(도 2 및 도 3 참조), 이후 각 단백질을 가장 많이 분비생산하는 효무 균주를 선별하였다. 또한, 선별된 인체 및 마우스 시스타틴 C를 생산하는 균주를 유가식 발효 배양을 수행하여, 단백질을 대량 생산하였고(도 4 및 도 5 참조), 이를 정제하여(도 6 내지 도 9 참조), 그 단백질 활성을 확인하였다(표 1).
이후, 상기 얻어진 인체 및 마우스 시스타틴 C를 난백알부민 감작으로 제조된 천식 마우스 모델에 직접 투여하여, 그 기도과민성(도 10 참조) 및 기관지 폐포 세척액 내 염증 세포 억제(도 11 참조) 효과를 확인하였다. 또한, 시스타틴 C가 천식 마우스에서 혈청 또는 기관지 폐포 세척액 내 난알부민 특이 IgE(도 12 참조)및 싸이토카인(도 13 참조)의 억제 효과를 나타내고, 폐조직 내 염증 억제 효과(도 14 및 도 15 참조)가 있음을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 시스타틴 C가 천식 마우스에서 직접적인 항천식 효과를 나타냄을 확인하였고, 따라서, 시스타틴 C 단백질은 천식 예방 및 치료용 조성물에 유용하게 이용할 수 있다.
본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%를 포함한다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 천식 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다:
1) 실험군으로서 피검체 유래 시료에서 시스타틴 C의 발현량을 측정하는 단계;
2) 단계 1)의 시스타틴 C의 발현량과 대조군으로서 정상 개체 유래 시료의 시스타틴 C의 발현량을 비교하는 단계; 및
3) 시스타틴 C 발현량이 대조군에 비해 감소하는 경우 천식에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계.
천식 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 눈물, 침, 객담, 비분비물, 기관지 분비물, 기관지 세척액, 폐분비물, 및 폐포 세척액으로 구성된 군에서 선택된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 천식 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법에 있어서, 단계 1)의 NRP1의 발현량은 웨스턴 블랏(Western blotting), 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역 조직 화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 검출하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 천식 조직에서 시스타틴 C가 정상 조직에 비해 발현이 저하됨을 토대로, 인체 및 마우스 시스타틴을 효모 균주에서 재조합 대량 생산하였고, 재조합 인체 및 마우스 시스타틴 C를 천식 마우스 모델에 직접적으로 투여시, 천식 마우스의 기도과민성이 억제되고, 기관지 폐포 세척액내 염증 세포가 억제되며, 혈청 또는 기관지폐포세척액내 난알부민 특이 IgE 및 싸이토카인이 억제될 뿐 아니라, 및 폐조직 내 염증이 억제됨을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 시스타틴 C가 천식 조직에서 정상 대조군에 비해 저발현되고, 항천식 활성을 나타내므로, 천식 진단의 정보를 제공하기 위해서, 시스타틴 C의 발현량을 피검체 유래 시료와 대조군 정상 개체와 비교하여, 그 발현량에 따라 천식의 위험성 정도를 판단하는 단백질 검출 방법에 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 천식 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다:
1) 피검 화합물 또는 조성물을 시스타틴 C를 발현하는 세포주에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 시스타틴 C의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 시스타틴 C 발현량이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 대조군 세포주와 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 천식 조직에서 시스타틴 C가 정상 조직에 비해 발현이 저하됨을 토대로, 인체 및 마우스 시스타틴을 효모 균주에서 재조합 대량 생산하였고, 재조합 인체 및 마우스 시스타틴 C를 천식 마우스 모델에 직접적으로 투여시, 천식 마우스의 기도과민성이 억제되고, 기관지 폐포 세척액내 염증 세포가 억제되며, 혈청 또는 기관지폐포세척액내 난알부민 특이 IgE 및 싸이토카인의 양이 줄어들 뿐 아니라, 폐조직 내 염증이 억제됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 시스타틴 C가 천식조직에서 정상 대조군에 비해 저발현되고, 항천식 활성을 가지므로, 시스타틴 C 유전자를 천식 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법에 유용하게 사용할 수 있다.
아울러, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 천식 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다:
1) 피검 화합물 또는 조성물을 시스타틴 C 단백질에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 시스타틴 C 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 시스타틴 C 단백질의 활성이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 시스타틴 C 단백질의 활성과 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 천식 조직에서 시스타틴 C가 정상 조직에 비해 발현이 저하됨을 토대로, 인체 및 마우스 시스타틴을 효모 균주에서 재조합 대량 생산하였고, 재조합 인체 및 마우스 시스타틴 C를 천식 마우스 모델에 직접적으로 투여시, 천식 마우스의 기도과민성이 억제되고, 기관지 폐포 세척액내 염증 세포가 억제되며, 혈청 또는 기관지 폐포 세척액내 난알부민 특이 IgE 및 싸이토카인의 양이 줄어들 뿐 아니라, 폐조직 내 염증이 억제됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 시스타틴 C가 천식조직에서 정상 대조군에 비해 저발현되고, 항천식 활성을 가지므로, 시스타틴 C 단백질을 천식 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법에 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 인체 및 마우스 유래 시스타틴 C 발현 효모 벡터의 제작
인체 및 마우스의 시스타틴 C(Cystatin C, CST3) 발현 벡터를 제작하기 위하여, 시스타틴 C 유전자를 확보하고, 이를 각 효모 벡터에 삽입하여 재조합 효모 벡터를 제작하였다.
구체적으로, 인간유전체사업단(한국생명공학연구원, 대전)에서 인체 및 마우스의 시스타틴 C 유전자를 포함하고 있는 벡터 pCMV-SPORT6-hCST3와 pCMV-SPORT6-mCST3를 함유하는 대장균 균주를 분양받아 항생제 앰피실린(ampicillin)이 포함된 LB배지(조성)에 배양하여 배양된 세포로부터 플라스미드(plasmid) 분리정제 키트(바이오니아, 한국)를 이용하여 각각의 플라스미드를 확보하였다.
각 플라스미드를 주형으로 하여 CST3 단백질을 암호화하는 유전자를 얻기 위해 4종의 프라이머(SJ10(서열번호 3), SJ11(서열번호 4), SJ12(서열번호 5), SJ13(서열번호 6)를 제작하였다. 정방향 프라이머인 SJ10과 SJ11은 LNK39(서열번호 5)와 상보성을 갖는 18개 염기와 인체 및 마우스의 시스타틴 C 유전자의 분비시그널을 제외한 아미노말단 서열 18개 염기로 제작하였고, 역방향 프라이머 SJ12와 SJ13은 6개의 히스티틴 태그(tag)를 코딩하는 18개 염기와 cystatin C의 종결코돈을 제외한 3' 말단의 18개 염기로 제작하였다.
인체 및 마우스 CST3 유전자로부터 분비시그널을 제외한 성숙단백질(mature protein)을 코딩하는 서열과 각 단백질의 카르복시 말단에 6개의 히스티딘 태그(tag)를 붙이기 위하여 인체 정방향 프라이머 SJ10과 역방향 프라이머 SJ12, 마우스 정방향 프라이머 SJ11과 역방향 프라이머를 이용하여 1차적으로 PCR을 수행하였다(94℃ 5분 1회; 94℃ 30초 55℃ 30초 72℃ 30초 25회; 72℃ 7분 1회). 상기 1차 PCR 수행 후, 얻어진 유전자를 주형으로 LNK39(서열번호 7)와 HisGT50R(서열번호 8)을 이용하여 2차 PCR을 수행하여 효모 벡터의 말단과 상보적인 서열이 도입된 유전자를 확보하였다(도 1).
대한민국 등록특허 제0975596호에서 기재된 효모 사카로마이세스 세레비지에 유래의 24종의 단백질 분비융합인자를 포함하는 24개 선형의 TFP 벡터와 인체 시스타틴 C(hCST3) 및 마우스 시스타틴 C(mCST3) 유전자를 포함하는 2차 PCR 결과물을 동시에 효모 Y2805에 형질전환하여 세포 내에서 재조합(in vivo recombination)을 유도하였고, 그 결과, 인체 시스타틴 C 및 마우스 시스타틴을 발현하는 효모 벡터를 제작하였다.
< 실시예2 > 인체 및 마우스 시스타틴 C 발현 확인
상기 <실시예 1>에서 제작된 인체 및 마우스 시스타틴 C(cystatin C) 발현 벡터를 이용하여 효모에서 각 시스타틴 C 단백질을 발현하였다.
24개의 TFP를 포함하는 효모 발현 벡터와 시스타틴 C 유전자가 세포내로 도입되어 세포내 재조합을 통해 플라스미드가 만들어지면, 벡터에 포함된 URA3 유전자가 활성화되고 우라실(uracil) 요구성 균주인 효모 Y2805가 우라실(uracil)이 없는 배지에서도 성장하게 된다. 따라서, 재조합이 일어난 형질전환체만이 우라실이 없는 UD배지(yeast nitrogen base without amino acid 0.67%, 혼합 아미노산, 글루코스 2%)에서 성장하게 되므로, UD 배지에서 콜로니를 형성한 형질전환체만을 선별하고, 이들 각각의 TFP벡터 및 시스타틴 C 유전자를 포함하는 형질전환체를 YPDG 액체 배지(1% 효모추출물, 2% 펩톤, 1% 글루코스, 1% 갈락토즈)에 접종한 후 30도에서 40시간 진탕배양하였다. 배양이 종료된 후 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고 남은 배양 상등액 0.6 ml을 취하여 0.4 ml의 아세톤을 첨가하여 -20℃ 냉동고에서 1시간 방치한 후 원심분리하여 단백질을 농축하였고, 이를 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.
구체적으로, 웨스턴 블랏 분석은 SDS-PAGE 겔로 전개된 단백질을 PVDF 막으로 이동시키기 위해 전기이전 키트(electrotransfer kit)(Bio-rad)를 이용하여 300 mA에서 45분간 전이한 후, 막을 TBST 완충용액(10mM Tris-HCl pH8.0, 0.15M NaCl, tween20 0.1ml/L)으로 헹군 뒤 상온에서 1시간 동안 3% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)을 함유한 TBST 완충용액으로 블락킹(blocking)하였다. 이 후 TBST 완충용액으로 3회, 5분씩 상온에서 세척하였다. 세척이 완료된 막을 0.5% BSA를 함유한 TBST 완충용액으로 1차 마우스 유래의 His 항체(Qiagen)를 3000배 희석하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, TBST 완충 용액으로 5분 간격으로 3번 반복 세척하여 비특이적인 항체결합을 제거하였다. 이후 2차 항체로 마우스 IgG 항체(Sigma)를 다시 3000배 희석하여 상온에서 1시간 반응시킨 다음, TBST 완충용액으로 5분 간격으로 3번 세척하였다. 이후 막에 BCIP+NBP 용액(Sigma)을 도말하여 인체 및 마우스 시스타틴 C 발현을 확인하였다.
그 결과, 인체 시스타틴 C는 크기 15kd 위치에서 거의 모든 TFP에 의해 분비생산되고, 마우스 시스타틴 C는 크기 25kd 위치에서 몇 종의 TFP에 의해서만 분비생산됨을 확인하였다(도 2 및 도 3). 이후, 각 단백질을 가장 많이 분비생산하는 효모 균주로서 인체 시스타틴 C에 대해서는 Y2805(pYT6-hCST3)을, 마우스 시스타틴 C에 대해서는 Y2805(pYT16-mCST3)을 선택하고, 재배양을 통해 최종 균주를 선별하였다.
< 실시예 3> 시스타틴 C 단백질의 발효를 통한 대량 생산
상기 <실시예 2>에서 선별된 인체 및 마우스의 시스타틴 C를 생산하는 2종의 균주, Y2805(pYT6-hCST3) 및 Y2805(pYT16-mCST3)로부터 각 단백질의 생산성을 확인하기 위하여 각각의 균주를 사용하여 유가식 발효 배양을 수행하였다.
구체적으로, 200 ml의 최소 배지에서 배양한 균주를 1.8 L 발효 배지(2% 포도당, 4% 효모추출물, 1% 펩톤)가 포함된 5L 규모의 발효기에 접종하였고, 포도당이 완전히 소모되면 공급 배지(30% 포도당, 30% 갈락토스, 15% 효모추출물)를 균체의 성장에 따라 시간당 2 g/L에서 20 g/L로 점차로 추가하면서 50시간 동안 발효를 진행하였다.
그 결과, 인체 시스타틴 C의 경우, 48시간 배양하는 동안 세포 수 증가를 나타내는 흡광도 OD600nm의 값이 약 120까지 성장하였고(도 4(A)), 시간별로 농축하지 않은 발효 배양 샘플 10 ㎕를 이용하여 SDS-PAGE 분석을 수행한 결과 발효 종료시에 약 500 mg/L이상의 인체 시스타틴 C 단백질이 배지로 분비되는 것을 확인하였다(도 4(B)). 또한, 마우스 시스타틴 C의 경우, 48시간 배양하는 동안 세포 수 증가를 나타내는 흡광도 OD600nm의 값이 약 130까지 성장하였고(도 5(A)), 시간별로 농축하지 않은 발효 배양 샘플 10㎕를 직접 SDS-PAGE 분석한 결과 발효 종료시에 약 500 mg/L이상의 마우스 시스타틴 C 단백질이 배지로 분비되는 것을 확인하였다(도 5(B)).
< 실시예 4> 인체 및 마우스 시스타틴 C 단백질 정제
상기 <실시예 3>에서 발효 배지로 분비된 각 단백질을 HIS- 태그(tag)를 이용하여 정제하기 위하여, 각 발효 배지로부터 세포를 제거하고 70% 황산암모늄(ammonium sultate)을 이용하여 단백질을 농축한 후 겔 필트레이션(gel filtration)(sephacryl S-200)하여 분리된 수획물을 SDS-PAGE 분석을 통하여 수행하였다.
그 결과, SDS-PAGE상에서 인체 및 마우스의 시스타틴 C 단백질을 함유하고 있는 수획물을 확인하였으며(도 6(B) 및 도 8(B)), 이들을 모아서 Ni-NTA 컬럼을 이용하여 각 단백질을 순수정제하였다(도 7 및 도 9).
< 실시예 5> 정제한 인체 및 마우스 시스타틴 C의 단백질 활성 확인
정제한 인체 및 마우스 시스타틴 C의 활성을 측정하기 위하여 시스테인 프로테아제(cysteine protease)인 파파인(papain) 효소를 이용하여 분석하였다(Bai 등, 2006, J. Biotechnology. 125,231).
구체적으로, 대장균 유래의 재조합 마우스 시스타틴(biovendor, 체코)을 표준물질로 사용하여 표준활성 곡선을 그리고 본 발명에서 생산된 효모 유래의 재조합 인체 및 마우스 시스타틴 C의 활성을 측정하였다. 카제인을 5 ug/ul 농도가 되도록 buffer M(50mM Tris-HCl, pH 7.6, 2mM Cys-HCl, 0.1mM EDTA)에 녹여 50 ul를 취하여 기질로 사용하고 여기에 적정한 시스타틴 C 용액을 넣고 buffer M으로 전체 용액이 500 ul이 되도록 맞추었다. 혼합용액을 37℃에서 10분 반응시킨 뒤 30 ul의 파파인(papain) 용액(sigma, 5 ug/ml papain in bufferM)을 넣고 37℃에서 20분동안 반응시켰다. 반응 후 3 ml의 bradford working 용액(0.007% 쿠마시 블루 G, 8.8% H3PO4, 5% 메탄올)을 넣어 37℃에서 20분 반응시킨 뒤 OD595nm에서 흡광도를 측정하였으며, 파파인(Papain) 1 ug을 완전히 저해하는 마우스 시스타틴 C 표준물질의 양을 1 unit로 정의하였다.
그 결과, 하기 [표 1]과 같이, 정제된 인체 및 마우스 시스타틴 C가 시스테인 프로테아제인 파파인의 저해 활성을 나타냄을 확인하였다.
재조합 인체 및 마우스 시스타틴 C의 파파인(papain) 저해활성
시료 활성(unit/ug)
인체 시스타틴 C 1.9
마우스 시스타틴 C 2.7
< 실시예 6> 기관지 천식이 유도된 천식 마우스 모델 제조
상기 제조된 인체 및 마우스 시스타틴 C의 항천식 효과를 확인하기 위하여, 난백 알부민을 이용하여 기관지 천식이 유도된 천식 마우스 모델을 제조하였다.
구체적으로, 평균 체중 20 g 내외의 6주령 Balb/c 암컷 생쥐(코아텍)를 1 주간의 적응기간을 가진 후에 기본적인 신체검사상에서 이상이 관찰되지 않는 동물을 대상으로 하여, 2주 간격으로 2 mg의 수산화알루미늄(Sigma A8222)과 난백 알부민 20 μg(Sigma A5503)을 현탁한 인산완충용액(pH 7.4) 200 μl을 복강에 주입하여 감작시켰다. 첫 번째 난백 알부민 복강투여 후 28일부터 30일까지 1% 난백 알부민을 초음파분무기를 이용하여 30분간 흡입시켰다. 마지막 항원 투여 후 24 시간 뒤에 기도과민성을 측정하였고 48 시간 뒤에 치사량의 펜토바비탈(50 mg/kg, IP)(엔토발, 한림제약주식회사)을 투여한 뒤 기관지 절개를 실시하여 총 1.2 ml의 생리식염수로 기관지폐포세척을 실시한 뒤 검체를 수거하였다.
정상 대조군(NC)으로 난백 알부민을 투여, 흡입하지 않은 군, 천식 유발군(OVA)으로 난백 알부민을 투여, 흡입하여 기관지 천식을 유도한 군, 비교군(DEXA)으로 난백 알부민 흡입 1시간 전에 강력한 합성스테로이드인 덱사메타손(dexamethasone(2 mg/kg, IP)(Sigma D4902)을 투여한 군, 실험군(CST)으로 난백 알부민 흡입 1시간 전에 마우스 유래 CST 3 단백질을 투여한 군으로 나누어 실험을 진행하였으며 각 군당 5두의 흰 쥐를 사용하였다.
< 실험예 1> 천식 마우스에서 시스타틴 C의 기도과민성 억제 효과
천식 마우스에서 인체 및 마우스 시스타틴 C의 천식 발생에 의한 기도과민성에 대한 효과를 확인하기 위하여, 기도 저항성을 측정하여 판단하였으며, 기도 저항의 정도는 동물용 기도저항측정기(one chamber plethysmography, All Medicus, 서울)를 이용하여 기도과민성(Airway hyperreactivity)의 지표인 Penh(Enhanced Pause) 값을 측정하여 평가하였다.
구체적으로, Penh 값의 측정은 정상 호흡 상태에서 기저값을 측정한 후 PBS를 초음파분무기를 이용하여 3분간 흡입시킨 후 3분간 측정하였다. 이후 메타콜린 (Sigma A2251)을 12, 25, 50 mg/ml의 농도로 점차 증가시키면서 흡입시킨 후 나타내는 Pehn 값을 측정하여 평가하였다. 여러 변수에 따른 평균값과 표준오차 (mean±S.E.)을 계산하였고 각 집단간의 비교는 SPSS 10.0을 이용하여 Mann-whitney U 검정을 수행하여 분석하였으며, 통계적으로 p 값이 0.05 미만인 경우에 유의적 차이가 있다고 판정하였다.
그 결과, 정상 대조군에서는 메타콜린 농도의 증가에 따라 Pehn 수치가 완만하게 증가한 데 반해, 천식 유도군에서는 유의성있게 급격한 Pehn 수치가 증가하였다. 또한, 비교군에서는 메타콜린 12.5 mg/ml의 농도에서부터 천식 유도군에 비해 유의성있게 감소된 Pehn 수치를 나타내었으며, CST 투여군에서는 메타콜린 50 mg/ml의 농도에서 천식 유도군에 비해 100.98±30.71%로 감소된 Pehn 수치를 나타내었다(도 10).
이를 통해, 시스타틴 C가 천식 마우스에서 현저한 기도과민성 억제 효과가 있음을 확인하였다.
< 실험예 2> 천식 마우스에서 시스타틴 C의 기관지 폐포 세척액내 염증 세포 억제 효과
천식 마우스에서 인체 및 마우스 시스타틴 C의 기관지 폐포 세척액내 염증 세포 억제 효과를 확인하기 위하여, 각 개체의 기관지폐포세척액(BALF)을 회수하고, 회수된 즉시 트리판 블루(Trypan blue)로 염색하여 죽은 세포를 제외한 총 세포수를 ㅎ혈구계(hemocytometer)를 이용하여 계산하였다. 이후, 사이토스핀(Cytospin) Ⅱ로 표본을 도말한 후, 디프-퀵(Diff-Quick) 염색(Sysmex, Switzerland)을 실시하여 호산구(eosinophil)와 그 외의 염증세포를 감별계산하였다. 여러 변수에 따른 평균값과 표준오차 (mean±S.E.)을 계산하였고 각 집단간의 비교는 SPSS 10.0을 이용하여 Mann-whitney U 검정을 수행하여 분석하였으며, 통계적으로 p 값이 0.05 미만인 경우에 유의적 차이가 있다고 판정하였다.
그 결과, 호산구의 수는 정상 대조군에서 0±0, 천식 유발군에서 88.35±12.36, 비교군에서 0.2±0.10, CST 투여군에서 7.12±0.69로 비교군과 CST 투여군에서 천식 유발군에 비해 그 수가 유의성있게 감소되었다(도 11). 또한, 그 외의 염증세포 수를 포함한 총 염증세포의 수는 정상 대조군에서 29.64±3.98, 천식 유발군에서 447.30±40.56, 비교군에서 112.52±13.80, CST 투여군에서 81.28±4.36 로 천식 유발군에 비해 비교군과 CST 투여군에서 유의성있게 감소되었다(도 11).
이를 통해, 시스타틴 C가 천식 마우스에서 기관지 폐포 세척액내 염증 세포에 대한 억제 효과가 있음을 확인하였다.
< 실험예 3> 천식 마우스에서 시스타틴 C의 혈청과 기관지폐포세척액내 난알부민 특이 IgE 억제 효과
천식 마우스에서 인체 및 마우스 시스타틴 C의 혈청과 기관지 폐포 세척액 내 난알부민 특이 IgE 양의 변화를 확인하기 위하여, 면역효소법을 이용하였다.
구체적으로, 96-웰(well) 플랫(flat) 바닥 ELISA 플레이트에 OVA(ovalbumin)을 20 μg/ml의 농도로 pH 8.3의 0.1 M NaHCO3 완충액에 녹여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅시킨 후 1% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)이 함유된 PBS로 비특이반응을 억제시켰고, 이후 혈청 검체를 1:50으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 플레이트는 잘 세척한 후 항-마우스 IgE 단일클론 항체를 300배 희석하여 2시간 반응시킨 후 퍼옥시다제(peroxidase)가 결합된 HRP-접합 염소 항-랫트 IgG 다클론 항체를 4000배 희석하여 실온에서 1시간 반응시킨 후 세척하였다. 발색은 3.3'5.5'-테트라메틸벤지딘(tetramethylbezidine) 기질(substrate)로 반응시킨 후 650nm에서 분광 흡광도를 측정하여 IgE를 정량분석하였다. 여러 변수에 따른 평균값과 표준오차 (mean±S.E.)을 계산하였고 각 집단간의 비교는 SPSS 10.0을 이용하여 Mann-whitney U 검정을 수행하여 분석하였으며, 통계적으로 p 값이 0.05 미만인 경우에 유의적 차이가 있다고 판정하였다.
그 결과, CST 투여군에서 혈청 내 난알부민 특이 IgE 수치는 천식 유발군에 비해 42.59±23.81% 정도로 현저히 감소하였으며, 기관지 폐포 세척액내 수치는 28.04±17.95% 감소하였다(도 12).
이를 통해, 시스타틴 C가 천식 마우스에서 난알부민 특이 IgE의 억제 효과가 있음을 확인하였다.
< 실험예 4> 천식 마우스에서 시스타틴 C의 기관지 폐포 세척액내 싸이토카인( cytokine ) 억제 효과
천식 마우스에서 인체 및 마우스 시스타틴 C의 기관지 폐포 세척액 내 IL-4, IL-5 및 IL-13의 수치를 측정하기 위하여, 각각의 싸이토카인(cytokine)에 특이적으로 반응하는 ELISA kit(BioSource International, Camarillo, CA)를 사용하여 각각의 싸이토카인을 정량분석하였다. 여러 변수에 따른 평균값과 표준오차 (mean±S.E.)을 계산하였고 각 집단간의 비교는 SPSS 10.0을 이용하여 Mann-whitney U 검정을 수행하여 분석하였으며, 통계적으로 p 값이 0.05 미만인 경우에 유의적 차이가 있다고 판정하였다.
그 결과, CST 투여군의 기관지 폐포 세척액내 IL-4, IL-5, Il-13 수치도 천식 유발군에 비해 감소되었으며(도 13), 이를 통해, 시스타틴 C가 천식 마우스에서 염증 매개물질인 싸이토카인의 억제 효과가 있음을 확인하였다.
< 실험예 5> 천식 마우스에서 시스타틴 C의 폐조직 내 염증 억제 효과
천식 마우스에서 인체 및 마우스 시스타틴 C의 폐조직 내 염증 억제 효과를확인하기 위하여, 폐장을 적출하고, 적출된 폐장은 통상적인 포르말린 고정과 파라핀 포매를 거쳐 4 μm 두께로 영구조직 절편을 제작한 다음, 각각의 절편에 대하여 H & E 염색(Hematoxylin and Eosin staining)을 수행하였다. 이후, 각 개체의 조직 절편당 무작위로 5개 부위의 염증지수를 측정하여 평균을 내었고, 염증지수 0 은 기관지 주변에 염증세포가 발견되지 않은 경우, 염증지수 1 은 간헐적으로 염증 세포가 관찰되는 경우, 염증지수 2는 대부분의 기관지 주변에 한 층에서 다섯 층사이의 얇은 염증세포층이 관찰되는 경우, 염증지수 3은 대부분의 기관지 주변에 다섯층 이상의 두꺼운 염증세포층이 관찰되는 경우로 평가하였다. 여러 변수에 따른 평균값과 표준오차 (mean±S.E.)을 계산하였고 각 집단간의 비교는 SPSS 10.0을 이용하여 Mann-whitney U 검정을 수행하여 분석하였으며, 통계적으로 p 값이 0.05 미만인 경우에 유의적 차이가 있다고 판정하였다.
그 결과, 천식 유발군에서는 세기관지 주변에 호산구를 비롯한 많은 염증세포가 침윤되어 있었으며 일부 손상된 상피 세포와 비후된 기관지 평활근이 나타난 반면, 비교군과 CST를 투여한 군에서는 호산구를 포함한 염증세포의 침윤이 현저하게 감소되어 있으며, 그 외의 이상 소견이 거의 확인되지 않았다(도 14). 또한, 염증 세포의 침윤도를 수치화시켰을 때 비교군과 CST 투여군 모두 천식 유발군에 비해 유의성있게 감소된 수치를 나타내었다(도 15).
이를 통해, 시스타틴 C가 천식 마우스에서 폐조직내 직접적인 염증 억제 효과가 있음을 확인하였다.
상기에서 보는 바와 같이, 본 발명의 시스타틴 C는 천식조직에서 저발현되고 항천식 효과를 나타내므로, 천식의 예방 및 치료용 조성물에 유용하게 이용할 수 있을 뿐 아니라, 천식의 진단 및 치료제 후보물질의 스크리닝을 위한 방법에 유용하게 이용할 수 있다.
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Claims (7)

  1. 시스타틴 C(Cystatin C) 단백질을 유효성분으로 함유하는 천식 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 시스타틴 C 단백질은 서열번호 1 또는 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 천식 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  3. 1) 실험군으로서 피검체 유래 시료에서 시스타틴 C의 발현량을 측정하는 단계;
    2) 단계 1)의 시스타틴 C의 발현량과 대조군으로서 정상 개체 유래 시료의 시스타틴 C의 발현량을 비교하는 단계; 및
    3) 시스타틴 C 발현량이 대조군에 비해 감소하는 경우 천식에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 천식 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 눈물, 침, 객담, 비분비물, 기관지 분비물, 기관지 세척액, 폐분비물, 및 폐포 세척액으로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 천식 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
  5. 제 3항에 있어서, 단계 1)의 시스타틴 C의 발현량은 웨스턴블랏(Western blotting), 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 검출하는 것을 특징으로 하는 단백질 검출 방법.
  6. 1) 피검 화합물 또는 조성물을 시스타틴 C를 발현하는 세포주에 처리하는 단계;
    2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 시스타틴 C의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 시스타틴 C 발현량이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 대조군 세포주와 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 천식 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
  7. 1) 피검 화합물 또는 조성물을 시스타틴 C 단백질에 처리하는 단계;
    2) 단계 1)의 시스타틴 C 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 시스타틴 C 단백질의 활성이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 시스타틴 C 단백질의 활성과 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 천식 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
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