KR101967826B1

KR101967826B1 - 페리오스틴을 이용한 아이소사이아네이트 직업성 천식의 진단방법

Info

Publication number: KR101967826B1
Application number: KR1020170083618A
Authority: KR
Inventors: 박해심; 이지호; 최영우; 이주하라 겐지
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2017-06-30
Publication date: 2019-04-11
Also published as: WO2019004748A3; WO2019004748A9; KR20190003117A; WO2019004748A2

Abstract

본 발명은 페리오스틴(periostin)을 이용한 직업성 천식의 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 TDI에 노출된 집단의 혈액 내 페리오스틴 농도를 측정하는 단계를 포함하는 직업성 천식의 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 혈액 내 페리오스틴 농도 측정을 통해 직업성 천식을 조기에 진단하고 치료함으로써 직업성 천식 환자의 예후를 향상시킬 수 있다.

Description

페리오스틴을 이용한 아이소사이아네이트 직업성 천식의 진단방법{Method for Diagnosing Isocyanate Occupational Asthma Using Periostin}

본 발명은 페리오스틴(periostin)을 이용한 직업성 천식의 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 혈액 내 페리오스틴 농도를 측정하는 단계를 포함하는 직업성 천식의 조기 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다.

직업성 천식은 직업상 취급하는 물질이나 작업 과정 중에 생산되는 중간 물질 또는 최종 산물이 원인으로 관여하는, 즉 직업으로 인해 발생하는 천식을 의미한다. 산업화된 국가에서의 직업성 호흡기 질환 중 가장 흔한 질환으로서, 성인에서 발현되는 천식의 약 9~15%에 해당한다. 세계적으로 연간 발병률은 근로자 100만 명당 12~170명으로 알려져 있다. 직업성 천식이 발병하기 쉬운 직업으로는 페인트 분무자, 제빵제과업자, 화학공장 및 화학물 취급자, 동물 실험자, 용접공, 식품공장 및 제약공장 종사자, 간호사 등이 있다.

직업성 천식은 질병의 특성으로 인해 특수건강검진을 통해 발견되어 보고 되는 경우가 많지 않아, 국내에서는 수시건강진단제도를 도입하게 된 배경이 되었으며, 이에 대한 감시체계 활동도 비교적 활발히 이루어지고 있는 상황이다. 국내 감시체계를 통해 파악한 질병의 규모를 보면, 인천지역 감시체계를 통해 5년간 121건이 보고 되었고, 구미지역 감시체계에서는 16개월 동안 16건, 부산, 울산, 경남지역에서 2년간 33건이 보고 되었다(Korean J Occup Environ Med, 2004;16(2):191-199, The Prevalence of Occupational Asthma in TDI-Exposed Workers). 직업성 천식으로 진단되면, 근로자의 작업 위치를 변경해야 하므로 근로자뿐만 아니라 고용주 및 의료 시스템에 심각한 사회 경제적 결과를 초래한다(de Groene GJ, Pal TM, Beach J, Tarlo SM, Spreeuwers D, Frings-Dresen MHW, Mattioli S, Verbeek JH. (2011) Workplace interventions for treatment of occupational asthma).

직업성 천식을 유발하는 것으로 가장 잘 알려진 물질로는 디이소시아네이트(diisocyanate)가 있으며, TDI(toluene diisocyanate), MDI(diphenyl-methane diisocyanate), HDI(hexamethylene diisocyanate)로 나뉘어 진다. 차량시트, 소파, 침대, 접착제, 폴리우레탄 도료, 단열재, 자동차부품공장 등에서 사용되는 것으로 알려져 있다. 이러한 물질에 노출되면 기도상피세포에서는 활성 산소뿐만 아니라 여러 가지 싸이토카인을 분비하여 다양한 염증반응세포들을 기도로 이동시킴으로써 천식을 유발하게 된다(Shin YS, Kim MA, Pham LD, Park HS. Cells and mediators in diisocyanate-induced occupational asthma. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2013;13(2):125-31). 천식의 증상이 발생하기 전에도 기도 내에서는 다양한 정도의 염증 반응이 진행된다. 천식의 증상 발현 이전에 기도의 염증을 확인하기 위해서는 조직검사 등의 침습적인 방법이 보다 정확하지만, 검사의 위험성과 유용성 측면에서 모든 환자에게 적용하기에 제한점이 있다. 따라서, 천식의 조기 발견, 치료와 예후 예측을 위한 수단으로서 바이오마커의 중요성이 날로 커지고 있으며, 바이오마커를 발굴하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있으나, 아직까지 연구자들 간에 합의를 도출하여 임상에서 널리 쓰이는 것은 거의 없다(Allergy Asthma Respir Dis 4(1):4-13, January 2016, Biomarkers of adult asthma and personalized medicine).

페리오스틴(periostin)은 POSTN 유전자에서 발현되는 90-kDa의 분자량을 갖는 단백질이다. 초기의 연구에서는 골모세포에서 페리오스틴이 발견되어 뼈의 성장과 관련된 연구가 진행되었으나 후속 연구를 통해서 다른 기관에서도 발현되는 것이 밝혀졌다. 천식 환자들에서는 정상인보다 POSTN 유전자 발현이 4배 증가되어있는 것이 밝혀졌으며, 기도 염증 반응에 관여하는 TGF-β, IL-4, IL-13에 의해서 기도상피와 섬유모세포에서 페리오스틴을 분비하게 된다(Izuhara K, Ohta S, Ono J. Using Periostin as a Biomarker in the Treatment of Asthma. Allergy Asthma Immunol Res. 2016;8(6):491-8). 페리오스틴은 다른 바이오마커(FeNO, serum IgE, blood eosinophil)와 비교하였을 때, 중증 천식에서 기도의 호산구 염증을 가장 잘 반영하는 지표로 확인되었으며, 아스피린 과민성 천식 환자에서도 유의하게 상승되어 있는 것이 확인되었다(arulekar AD, Atik MA, Hanania NA. Periostin, a novel biomarker of TH2-driven asthma. Curr Opin Pulm Med. 2014;20(1):60-5).

이에 본 발명자들은 직업성 천식, 더욱 구체적으로 TDI에 의해 유발된 직업성 천식의 조기 진단 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 혈액 내 페리오스틴 농도가 직업성 천식의 바이오마커임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 목적은 혈액 내 페리오스틴(periostin) 농도 측정을 통하여 직업성 천식의 진단을 위한 정보제공 방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 혈액 내 페리오스틴(periostin) 농도를 측정하는 단계 및 (b) 상기 측정된 페리오스틴 농도가 81.5 ng/mL 이상인 경우 직업성 천식으로 예측하는 단계를 포함하는 직업성 천식 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 혈액 내 페리오스틴(periostin) 농도를 측정함으로써, 천식의 증상 발현 이전에 기도의 염증 반응을 간접적으로 측정할 수 있으며, TDI에 의한 직업성 천식을 조기에 진단하고 치료함으로써, 환자의 예후를 향상시키는데 매우 유용하다.

도 1은 Sandwich ELISA 방법을 이용하여 혈액 내 페리오스틴(periostin) 농도를 측정하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 (A)는 TDI 천식 환자(TDI-OA), TDI에 노출되었으나 천식 증상은 없는 환자(AEC) 및 정상 대조군(NC)의 혈청 페리오스틴 농도를 비교한 그래프이며, (B)는 TDI에 노출된 집단(TDI-OA + AEC)과 정상 대조군(NC)의 혈청 페리오스틴 농도를 ROC curve를 이용하여 나타낸 그래프이다(AUC=0.848, 95%CI 0.803-0.893, P<0.001).
도 3은 TDI 천식에서 페리오스틴이 증가하는 메커니즘과 기도 염증 및 재형성에 관여하는 기전을 나타낸 모식도이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 구체적 실시예에서 직업성 천식의 바이오마커 후보군으로써 페리오스틴(periostin)을 선정하여, 혈액 내 페리오스틴 농도 측정을 통해 TDI(toluene diisocyanate)에 노출된 천식 환자의 혈액 내 페리오스틴 농도가 유의하게 증가하는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서 (a) 혈액 내 페리오스틴(periostin) 농도를 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 페리오스틴 농도가 81.5 ng/mL 이상인 경우 직업성 천식으로 예측하는 단계를 포함하는 직업성 천식의 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다.

본 발명은 (a) 혈액 내 페리오스틴 농도를 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 혈액은 아주대학교 의료원의 도움을 받아 채취하였다. 혈액을 이디티에이(EDTA) 튜브에 1000g 채취하여, 혈액 응고를 막기 위해 4℃에서 15분간 원심분리 후 분리된 상층액(plasma)을 이용하였다. 상기 EDTA 튜브는 EDTA로 코팅된 것으로서, EDTA가 칼슘 이온과 결합하여 혈액 내 칼슘 이온을 제거하므로, 혈액응고를 막는다. 채혈 장소는 팔, 손가락, 발, 귓볼로 이루어진 군에서 선택할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 페리오스틴 농도 측정은 Sandwich ELISA 방법으로 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

Sandwich ELISA 방법을 이용한 페리오스틴 농도 측정은 일본 Shino-test corporation에 의뢰하여 진행하였다. 농도 측정 방법은 하기의 단계에 의하여 이루어진다(도 1). 혈액 시료를 원심분리(3000rpm, 15 min)하여 혈청을 분리하고, 페리오스틴 농도 측정시까지 80℃에 냉동 보관한다. 페리오스틴 단일 항체(SS18A)를 well (loose MaxiSorp1 Nunc-Immuno1 Modules; Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, USA)에서 하루 동안 반응시킨다. Blocking buffer (0.5% casein in TBS, pH 8.0)를 넣고 4에서 하루 동안 보관한 후에 Washing buffer (0.05% Tween20 in PBS)로 씻어낸다. 100배 내지 200배 희석한 sample과 standard를 18시간 동안 상온에서 반응시키고 세척한다. 페리오스틴 단일 항체(SS17B)가 labeling되어 있는 peroxidase를 90분 동안 상온에서 반응시킨다. 세척한 후에 reaction solution(0.8 mM 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine, 2.5 mM H2O2)을 10분 동안 반응시키고, stop solution(0.7 N HCl)을 이용하여 반응을 정지시킨다. 550nm와 450nm 파장에서 reading한 후에 그 차이를 이용하여 농도를 확인한다(Okamoto et al. Periostin, a matrix protein, is a novel biomarker for idiopathic interstitial pneumonias. Eur Respir J. 2011 37:1119-27.).

본 발명은 (b) 상기 측정된 페리오스틴 농도가 81.5 ng/mL 이상인 경우 직업성 천식으로 예측하는 단계를 포함한다.

TDI에 노출된 집단(TDI에 의하여 발생한 천식 환자군 및 TDI에 노출은 되었으나 증상은 발현되지 않은 군)과 정상 대조군 사이에 페리오스틴을 이용해서 ROC curve를 구하면(도 2B), 정상 대조군에 비해 TDI에 노출된 집단에서 페리오스틴 농도가 유의하게 증가한다. AUC 값은 0.848이다. 통계 프로그램 SPSS를 이용하여 확인한 결과, 직업성 천식을 진단하는데 가장 높은 민감도와 특이도를 나타낸 페리오스틴 농도는 81.5 ng/mL이다.

ROC(Receiver Operating Characteristic) Curve는 진단 방법의 효율성을 판단하는 방법 중 널리 사용되는 것으로서, true positive(=sensitivity, 민감도)와 true negative(=specificity, 특이도)를 동시에 나타내는 그래프이다. ROC curve는 ROC curve 아래의 면적(AUC, Area Under the ROC Curve)이 커질수록, 즉, 1에 가까울수록 분류 성능이 우수하다.

본 발명에 있어서, 상기 측정된 페리오스틴 농도가 127 ng/mL 이상인 경우, 더욱 구체적으로 127.62 ng/mL 이상인 경우 직업성 천식으로 진단하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, TDI에 의하여 발생한 천식 환자군(TDI-OA), TDI에 노출되었으나 천식 증상은 발현되지 않은 군(AEC) 및 정상 대조군(NC)을 선정하여, 혈액 시료를 채취하였다. 정상 대조군은 TDI에 노출된 적이 없고, 천식의 증상 발현이 없는 건강한 그룹을 의미한다. 측정된 페리오스틴 농도의 평균값은 정상 대조군은 57.36 ng/mL, TDI에 노출되었으나 천식 증상은 발현되지 않은 군은 99.83 ng/mL 인 반면, TDI 천식 환자의 경우 127.62 ng/mL인바, 직업성 천식 환자의 혈액 내 페리오스틴 농도가 유의하게 상승하였다.

본 발명에 있어서, 상기 혈액은 TDI에 노출된 집단 유래인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서, 일반 천식 환자 중 중증이 아닌 환자의 혈액 내 페리오스틴 농도는 평균 77.72 ng/mL이고, 중증 천식 환자의 경우 91.56 ng/mL인 반면, TDI 천식 환자의 혈액 내 페리오스틴 농도는 평균 127.62 ng/mL로 측정되었는바, 일반 천식 환자보다 TDI 천식 환자의 혈액 내 페리오스틴 농도가 유의하게 상승하였다. 일반적인 천식은 TDI와 같은 특정 물질에 의해 유발된 직업성 천식이 아닌 경우를 의미한다. 일반 천식에서 Th2 염증 반응(IL-4, IL-13)에 의해서 페리오스틴 농도가 상승하는 것으로 알려져 있으나, TDI 천식에서는 기존에 알려진 호산구성 염증 반응 외에도, 활성 산소, 호중구, NET, EET 등에 의해서 더 많은 페리오스틴이 생성되는 것으로 판단된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 혈액 내 페리오스틴 농도 측정을 위한 TDI 천식 환자(TDI- OA ), TDI에 노출되었으나 천식 증상은 없는 환자(AEC) 및 정상 대조군(NC) 선정

혈액 내 페리오스틴 농도 측정을 위한 TDI 천식 환자(TDI-OA), TDI에 노출되었으나 천식 증상은 없는 환자(AEC) 및 정상 대조군(NC)의 수, 성별 비율, 나이에 대한 정보를 하기 표 1에 제시하였다.

TDI 천식 환자(TDI-OA), TDI에 노출되었으나 천식 증상은 없는 환자 (AEC) 및 정상 대조군(NC)의 수, 성별 비율, 나이

Group	N	Female %	Male %	Age
TDI-OA	151	33.1	66.9	42.7±10.2
AEC	190	26.3	73.7	41.2±8.3
NC	686	47.8	52.2	31.8±11.6

실시예 2: TDI 천식 환자(TDI- OA ), TDI에 노출되었으나 천식 증상은 없는 환자(AEC) 및 정상 대조군(NC)의 혈액 내 페리오스틴 농도 측정 및 비교

TDI 천식 환자(TDI-OA), TDI에 노출되었으나 천식 증상은 없는 환자(AEC) 및 정상 대조군(NC)의 혈액 내 페리오스틴 농도를 측정한 결과, TDI 천식 환자에서 유의하게 페리오스틴 농도 상승이 관찰되었다(도 2A). 하기 표 2에 제시된 바와 같이 TDI에 노출된 집단(TDI-OA + AEC)과 정상 대조군을 페리오스틴 농도 값을 통하여 구분하였다(AUC=0.848, 95%CI 0.803-0.893, P<0.001)(도 2B). AUC 분석에서 도출된 81.5의 cut-off value를 이용하여 SPSS의 로지스틱 회귀분석을 시행하였을 때, Odds ratio는 10.81이며, 95% 신뢰구간은 6.19-18.90이다.

TDI에 노출된 집단(TDI-OA + AEC)과 정상 대조군의 혈액 내 페리오스틴 농도 비교

Cut-Off	Odds ratio	95% CI
81.5 (ng/mL)	10.81	6.19-18.90

실시예 3: 일반 천식 환자, TDI 천식 환자 및 정상 대조군의 혈액 내 페리오스틴 농도 측정

하기 표 3에 제시된 바와 같이 TDI와 같은 특정 물질에 의해 유발된 직업성 천식이 아닌 일반 천식 환자군에 비하여 TDI 천식 환자군에서 혈액 내 페리오스틴 농도가 증가하는 것이 관찰되었다. 일반 천식에서 페리오스틴은 Th2 염증 반응(IL-4, IL-13)에 의해서 상승하는 것으로 알려져 있으나, TDI 천식에서는 TDI에 의해서 발생하는 다른 염증 반응 (활성 산소, 호중구, NET, EET)에 의해서 더 많은 페리오스틴이 생성되는 것으로 판단된다(도 3).

일반 천식 환자, TDI 천식 환자 및 정상 대조군의 혈액 내 페리오스틴 농도

Group		N	평균 (ng/mL)	Range (ng/mL)
일반 천식 환자군	중증이 아닌 환자	898	77.72 ± 38.56	5.0 - 318.0
일반 천식 환자군	중증 천식 환자	235	91.56 ± 41.21	14.0 - 218.0
TDI 천식 환자군		151	127.62 ± 79.54	29.0 - 450.0
정상 대조군		686	57.36 ± 29.65	2.0 - 139.0

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음 단계를 포함하는 TDI(toluene diisocyanate)에 의해 유발된 직업성 천식의 진단을 위한 정보제공 방법:
(a) 혈액 내 페리오스틴(periostin) 농도를 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정된 페리오스틴 농도가 81.5 ng/mL 이상인 경우 직업성 천식으로 예측하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 측정된 페리오스틴 농도가 127 ng/mL 이상인 경우 직업성 천식으로 진단하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 정보제공 방법.
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