KR20170021378A

KR20170021378A - 모노클론 항체의 길항 활성을 조절하는 방법

Info

Publication number: KR20170021378A
Application number: KR1020177004586A
Authority: KR
Inventors: 릴리앙 고뜨쉬; 띠에리 위르쉬
Original assignee: 피에르 파브르 메디카먼트
Priority date: 2008-12-02
Filing date: 2009-12-02
Publication date: 2017-02-27
Also published as: BRPI0923228A2; EP2370464B1; AU2009324145B2; EP3048113A1; SA109300723B1; AR074438A1; US9676839B2; MA32838B1; KR20110091519A; KR101971806B1; US20110263830A1; BRPI0923228B1; WO2010063746A1; HK1163704A1; JP2012510281A; TW201024734A; CN105820241A; NZ592830A; CA2744065C; AU2009324145A1

Abstract

본 발명은 항체 공학 분야에 관한 것이고, 보다 상세하게는 항체를 검색하는 및/또는 항체의 작동 (agonistic)/길항 (antagonistic) 활성을 조절하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 상기 항체는 특이 표적 분자의 생물학적 활성의 하나 이상을 저해할 수 있고, 상기 방법은 적어도 하나의 아미노산 결실, 부가 또는 치환에 의해 힌지 부위 (hinge region)의 아미노산 서열을 변형시키는 것으로 이루어지는 상기 힌지 부위의 입체 재형성 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 특이 표적 분자에게로 유도되는 모노클론 항체, 또는 그의 이가 (divalent) 기능적 단편 또는 유도체의 길항 활성을 개선시키는 방법에 관한 것이다.

Description

모노클론 항체의 길항 활성을 조절하는 방법 {Process for the modulation of the antagonistic activity of a monoclonal antibody}

본 발명은 항체 공학 분야에 관한 것이고, 보다 상세하게는 항체를 검색하는 및/또는 항체의 작동 (agonistic)/길항 (antagonistic) 활성을 조절하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 유전공학 (genetic engineering)에 의해 모노클론 항체, 또는 그의 이가 (divalent) 기능적 단편 또는 유도체의 길항 활성을 조절하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이러한 조절 방법에 유용한 폴리펩타이드 및 이로 획득된 항체에 관한 것이다.

용어 표현 "항체 (antibody)", "항체들 (antibodies)" 또는 "면역글로불린 (immunoglobilin)"은 가장 광범위한 의미에서 상호교환적으로 사용되고, 모노클론 항체 [예로, 전장 (full-length) 또는 자연 그대로의 (intact) 모노클론 항체], 폴리클론 항체, 다가 (multivalent) 항체 또는 다중특이적 (multispecific) 항체 [예로, 원하는 생물학적 활성을 나타내면서도 이중특이적 (bispecific)인 항체]를 포함한다.

보다 상세하게, 이러한 분자는 디설파이드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 두 개의 중쇄 (H, heavy chains) 및 두 개의 경쇄 (L, light chains)를 포함하는 당단백질 (glycoprotein)로 이루어진다. 각 중쇄는 중쇄 가변 부위 (또는 도메인)(본 명세서에서는 HCVR 또는 VH 라고 약칭됨) 및 중쇄 불변 부위를 포함한다. 중쇄 불변 부위 (heavy chain constant region)는 세 가지 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각 경쇄는 경쇄 가변 부위 (본 명세서에서 LCVR 또는 VL 이라고 약칭됨) 및 경쇄 불변 부위를 포함한다. 경쇄 불변 부위 (light chain constant region)는 한 가지 도메인, CL을 포함한다. VH 및 VL 부위는 더 나아가 구조틀 부위 (framework regions, FR)이라고 명명되는 더욱 보존되는 부위로 서로 나뉘어진 (interspersed) 상보성 결정 부위 (complementarity determining regions, CDR)라고 명명되는 과다가변 부위 (region of hypervariability)로 다시 분류될 수 있다. 각 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 하기 순서로 배열된 세 가지의 CDRs 및 네 가지의 FRs로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 부위는 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 부위는 면역글로불린이 면역 시스템의 다양한 세포 (예로, 효과기 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 첫 번째 성분 (Clq)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자 (factors)에 결합하는 것을 매개할 수 있다.

면역글로불린의 중쇄는 세 가지 기능적 부위로 나뉠 수 있다: Fd 부위, 힌지 부위, 유연한 (flexible) 힌지 부위에 의해 연결된 Fc 부위 (결정화가능한 단편). Fc 부위는 VH 및 CH1 도메인을 포함하고 경쇄와 조합하여 Fab - 항원-결합 단편을 형성한다. Fc 단편은 면역글로불린의 효과기 기능을 부여하고, 이는 예를 들어 보체 고정 및 효과기 세포의 인지체 (cognate) Fc 수용체에 대한 결합을 포함한다. IgG, IgA, 및 IgD 면역글로불린 부류 (classes)에서 발견되는 힌지 부위는 Fab 부분 (portion)이 Fc 부위와는 달리 공간에서 자유롭게 움직이도록 하는 유연한 간격자 (spacer)로서 작용한다. 불변 부위와는 대조적으로 힌지 도메인은 구조적으로 다양하여, 면역글로불린 부류 및 소부류 중에서 서열 및 길이 둘 다가 변화된다.

결정화분석 연구 (crystallographic studies)에 따르면, 면역글로불린의 힌지 부위는 더 나아가 구조적으로 또한 기능적으로 세 가지 부위로 다시 나뉠 수 있다: 상부 힌지 (upper hinge), 중심 (core), 및 하부 힌지 (lower hinge) (Shin et al., Immunological Reviews 130: 87, 1992). 상부 힌지는 CH1의 카복시 말단으로부터 운동을 제한하는 힌지에서 첫 번째 잔기, 일반적으로 두 개의 중쇄 사이에 사슬간 (interchain) 디설파이드 결합을 형성하는 첫 번째 시스테인 잔기까지의 아미노산을 포함한다. 상부 힌지 부위의 길이는 항체의 분절적 유연성 (segmental flexibility)과 상호관련이 있다. 인간 IgG1의 중심 힌지 부위는 디설파이드 결합의 형성에 의해 이중머화 될 때, 축 (pivot)으로 작용하여 유연성을 부여하는 것으로 여겨지는 환상의 옥타펩타이드 (cyclic octapeptide)를 유도하는 Cys-Pro-Pro-Cys 서열을 포함한다. 면역글로불린 힌지 부위의 폴리펩타이드 서열의 구조 및 유연성에 의해 허용되는 입체형태적 변화는 항체의 Fc 부분의 효과기 기능에 영향을 줄 수 있다.

일반적으로, 마우스 기원의 모노클론 항체 또는 그들의 기능적 단편의 제조를 위해, 상세하게는 매뉴얼 "항체들"에 기술되어 있는 기법 [할로우 및 레인 (Harlow and Lane), 항체들 (Antibodies): 실험실 매뉴얼, 콜드 스프링 하버 연구소, 콜드 스피링 하버 NY, pp. 726, 1988] 또는 코흘러 및 밀스타인 (Kohler and Milstein)에 의해 기술된 하이브리도마로부터 제조의 기법 (Nature, 256: 495-497, 1975)을 참조하는 것이 가능하다. 그 다음 모노클론 항체는, 예를 들어 흥미있는 수용체 또는 상기 모노클론 항체에 의해 특이적으로 인식되는 에피토프를 포함하는 그의 단편이 미리 고정되어 있었던 친화 컬럼 상에서 정제될 수 있다. 보다 상세하게, 상기 모노클론 항체는 프로테인 A 및/또는 G 상의 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있고, 다시 잔존하는 단백질 오염물뿐만 아니라 DNA 및 LPS도 제거할 목적으로 이온-교환 크로마토그래피 (ion-exchange chromatography)에 의해 이어질 수도 있으며, 자체적으로 이중머 (dimers)의 존재 또는 기타 다중머 (multimers)의 존재로 인한 잠재적인 응집물을 제거하기 위하여 세파로스 젤 상에서 배제 크로마토그래피 (exclusion chromatography)도 이어서 실시될 수 있다. 훨씬 더 바람직한 방식으로는, 이들 기법 전체가 동시적으로 또는 연속적으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 항체의 기능적 단편에 의해, 상세하게는 Fv, scFv [단일 사슬 (single chain)에 대한 sc], Fab, F(ab')₂, Fab', scFv-Fc 단편 또는 다이아바디 (diabodies), 또는 폴리(에틸렌)글리콜 ["PEG화 (PEGylation)"] (Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')₂-PEG, Fab'-PEG로 불리는 PEG화된 단편)과 같은 폴리(알킬렌)글리콜의 첨가와 같은 화학적 변형에 의해, 또는 리포좀 내의 도입에 의해 반감기가 연장되었던 단편이라면 모두를 가르키도록 의도하고, 상기 단편은 고유 (original) 항체의 특징적인 CDRs의 적어도 하나를 가진다.

바람직하게, 이들 기능적 단편은 Fv, scFv, Fab, F(ab')₂, Fab', scFv-Fc 단편 또는 다이아바디의 단편일 것이고, 이는 일반적으로 그들이 유래한 항체과 동일한 결합 특이성을 가진다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 항체 단편은 펩신 (pepsin) 또는 파파인 (papain)과 같은 효소에 의한 소화 (digestion) 및/또는 화학적 환원으로 의한 디설파이드 연결의 절단과 같은 방법에 의해 상기에 기술된 바와 같은 항체로부터 시작하여 획득될 수 있다. 또 다른 방식으로, 본 발명에 포함되는 항체 단편은 마찬가지로 당업자에게 잘 알려진 유전적 재조합의 기법에 의해 또는 그 외 예를 들어 애플라 (Applera)사 등이 공급하고 있는 것과 같은 자동화 펩타이드 합성기 (automatic peptide synthesizers)에 의한 펩타이드 합성에 의해 획득될 수 있다.

용어 표현 "길항제 (antagonist)"는 본 명세서에서 사용되는 바 세포외 (extracellular) 또는 막통과 (transmembrane) 수용체와 같은 표적 분자의 생물학적 활성의 하나 이상을 저해할 수 있는 분자를 말한다. 길항제는 리간드에 대한 수용체의 결합 또는 그 역으로 개입함에 의해, 수용체 인산화 (phosphorylation)를 감소함에 의해, 및/또는 리간드에 의해 활성화되었던 세포를 무능력화시킴 또는 사멸시킴에 의해 작용할 수 있다. 길항제는 수용체 - 리간드 상호작용을 완전히 단절시킬 수 있거나 경쟁, 입체 형태의 변화, 흘림 (shedding) 또는 저하조절 (down regulation)에 의해 이러한 상호작용을 실질적으로 감소시킬 수 있다.

용어 표현 "작동제 (agonist)는 본 명세서에서 사용되는 바 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 항체, 항체 단편, 결합체 (conjugate), 큰 분자, 작은 분자를 포함하는 표적 분자의 생물학적 활성 하나 이상을 활성화할 수 있는 화합물이라면 모두를 말한다.

치료적 항체의 연구에서, 종종 가능한 한 길항제인 항체를 가지는 것이 기대된다.

길항제 항체의 고전적인 예로는 허셉틴 (Herceptin), 퍼투주마브 (Pertuzumab), 세투시마브 (Cetuximab), 항-VEGFR 또는 항-IGF-1R 항체가 있다.

상세한 예로는, 다양한 모델에서 단독으로 첨가될 때 강력한 작동제로서 행동하는 제네테크사 (Genentech)가 생산한 항-c-Met 5D5 항체 [WO 96/38557]가 언급될 수 있다. 이 기술적 문제점을 해결하기 위하여, 본 항체는 길항 활성을 가지도록 Fab 단편으로서 또는 단가 (monovalent) 항체 (하나의 팔을 가진 5D5)로서 조작되어야 하였다. 그 결과, 이러한 항체는 항체가 아닌 단편으로서 고려될 수 있고, "완전한 항체 (full antibody)" 형식으로 인한 장점 모두를 나타내지는 못한다 (효과기 기능이 없고, 제거율 및 반감기가 감소됨 [2008년 10월 21 - 24일에 제네바에서 열린 20차 EORTC-NCI-AACR 심포지움에서 포스터 발표 411에 기술된 바와 같이 통상적인 이가 항체보다 2배 더 짧음]).

당업자라면 효과기 기능이, 예를 들어 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC); 포식작용 (phagocytosis); 및 세포 표면 수용체 (예로, B 세포 수용체; BCR)의 저하조절, 또한 예를 들어 1998년 4월 14일에 발효된 미국특허 번호 제 5,739,277호에서 기술된 바와 같이 재사용 (salvage) 수용체 결합 리간드 (FcRn)의 도입을 통해 반감기를 연장하는 것을 포함하는 점을 잘 인식하고 있을 것이다.

본 발명의 발명적 관점의 하나는 이러한 기술적 문제점을, 예로 "완전한 이가 (full divalent)" 포맷을 보존하면서 항체의 길항 활성을 개선시키는 것으로 해결하는 것이다.

본 발명이 "인간 마우스 (human mice)" (인간 면역글로불린을 생산하는 유전적으로 변형된 마우스)의 면역화에 의해 또는 scFv, Fab 또는 기타 다른 동등한 단편으로부터 선택된 항체 전체를 만드는 파지 디스플레이 (phage display) 기법을 사용함에 의해 획득되는 인간 항체의 작동/길항 활성을 조절하는 데 적용될 수 있는 점이 본 명세서에서 언급되어야 한다.

또 다른 고전적인 기술적 문제점은 마우스 항체의 키메라화 (chimerization)및/또는 인간화 (humanization) 과정으로 만족될 수 있다. 이 이론에서 마우스 항체의 키메라화 및/또는 인간화 과정이 매우 용이하더라도, 이러한 마우스 항체의 키메라화 및/또는 인간화를 초기 특성의 전부 또는 일부를 잃지 않고서 다루는 것이 그리 쉽지 않은 점을 당업자라면 잘 알고 있다. 키메라 또는 인간화 항체는 그의 ADCC, CDC, 길항적/작동적 결합, (TBC)... 활성의 일부분을 상실할 수 있다. 본 발명은 보다 상세하게 키메라화 및/또는 인간화 과정 이후에 마우스 항체의 작동/길항 활성의 변형에 관한 것이다.

상세한 예로는, 이후에 224G11, 2274H1 및 11E1으로서 기술되는, 강력한 길항제 마우스 항체로서 행동하는 항-cMet 항체 세트는 인간 IgG1 포맷 상에서 키메라화될 때 부분적 작동제가 되었다. 강력한 길항제로부터 부분적 작동제까지의 이러한 변화 (shift)은 이종이식 (xenograft) 모델에서 생체내 (in vivo) 활성의 완전한 상실을 가져온다.

본 발명은 이들 문제점을 해결하려고 하며, 보다 상세하게는 항체는 특이 표적 분자의 생물학적 활성 하나 이상을 저해할 수 있고, 방법은 적어도 하나의 아미노산 결실 (deletion), 부가 (addition) 또는 치환 (substitution)에 의해 힌지 부위 (hinge region)의 아미노산 서열을 변형 (modification)시키는 것으로 이루어지는 상기 힌지 부위의 입체 재형성 (reconfiguration)의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 특이 표적 분자에게로 유도되는 모노클론 항체, 또는 그의 이가 (divalent) 기능적 단편 또는 유도체의 길항 활성 (antagonistic activity)을 개선시키는 방법에 관한 것이다.

용어 표현 "길항 활성을 개선시키는 것 (improving the antagonistic activity)"은 그의 가장 광범위한 의미에서, 예로 원하는 결과로서 해석되어야 한다. 기계적으로, 이러한 결과는 내재적 길항 활성의 개선 및/또는 항체의 내재적 길항 활성의 감소에 의해 획득될 수 있다.

보다 상세하게는, 정량적 약리학에서의 기본적 용어 정의는 수용체 명명법 (Nomenclature)에 관한 국제 약리학 연합 (International Union of Pharmacology, IUPHAR) 위원회가 발행하는 최신 권고지침에 근거를 둔다 (Neubig et al ., 2003 참조하라).

용어 표현 "작동제 (agonist)"는 수용체에 결합하고 수용체 상태를 변화시켜 자극적 또는 증가된 생물학적 반응을 유발하는 리간드 (모든 유형의 분자)를 의미한다. 작동제는 완전한 작동제 (full agonists) 또는 부분적 작동제 (partial agonists)로서 작용할 수 있다:

- 완전한 작동제 (full agonist): 작동제에 의해 유도되는 수용체 자극이 시스템의 최대 반응 능력 (capability)에 도달하고 난 다음, 그것이 다시 시스템 최대 반응을 생산하고 이 시스템에서 완전한 작동제가 된다. 몇 가지 작동제는 동일한 최대 반응을 나타낼 수 있고, 이들은 이 실험적 시스템에서 모두 완전한 작동제가 된다.

- 부분적 작동제 (partial agonist): 특정화된 조건 하의 해당 조직에서 동일한 시스템에서 동일한 수용체를 통해 작용하는 완전한 작동제가 할 수 있는 만큼 큰 효과를 나타낼 수 없는 분자. 또한 부분적 작동제는 완전한 작동제의 공-존재 (co-presence) 시, 상기 완전한 작동제의 최대 반응을 그들 자신의 최대 반응까지 감소시키기 때문에 일반적으로 부분적 길항제가 된다. 완전한 대비 (vs) 부분적 작동제의 본 명칭은 시스템-의존적이고, 하나의 시스템 또는 측정법을 위한 완전한 길항제는 또 다른 데에서는 부분적 작동제가 될 수 있다.

용어 표현 "길항제 (antagonist)"는 또 다른 약물, 일반적으로 작동제의 작용을 감소시키는 분자를 의미한다. 많은 길항제는 작동제와 동일한 수용체 거대분자 (macromolecule)에서 작용한다.

*- 길항 기작 (antagonism)의 효능은 길항제와 작동제의 공-존재 시의 시스템 반응이 시스템의 기저 활성 (basal activity) (리간드가 전혀 없음)에 해당하는 곳에서 완벽한 길항 기작이 될 수 있다.

- 길항제는 길항제와 작동제의 공-존재에 의해 나타나는 최대 저해 (심지어 모든 수용체가 길항제로 채워져야 하는, 높은 농도로 적용될 때도)가 시스템의 기저 활성을 초과할 때 부분적 길항제로서 작용할 수 있다.

- 길항 기작은 작동제와 길항제의 결합이 상호 배타적일 때 경쟁적일 수 있다. 이것은 작동제와 길항제가 동일한 결합 부위에 대해 경쟁하거나 겹쳐지는 (overlap) 인접 부위와 결합하기 때문일 수 있다. 세 번째 가능성은 서로 다른 부위가 관여하지만 작동제와 길항제 분자가 동시에 결합될 수 없는 방식으로 수용체 거대분자에 영향을 주는 것이다.

- 비경쟁적인 (non-competitive) 길항 기작은 작동제와 길항제가 수용체에 동시적으로 결합될 수 있을 때 관찰되고; 길항제 결합은 작동제의 결합에 미치는 효과가 있거나 없이 작동제의 작용을 감소시키거나 막는다.

결실 (deletion), 부가 (addition) 또는 치환 (substituiton)은 당업자가 알고 있는 방법이라면 모두에 의해 고전적으로 수행될 수 있다.

몇 가지 방법이 당업자에 의해 해당 DNA 서열에서 부가, 결실 또는 삽입 (insertions)을 생성하는 데 적용될 수 있다. 이에 제한되지는 않지만, 췌장 DNase I을 사용한 DNA 부분적 소화 (partial digestion), 제한효소를 사용한 DNA의 부분적 소화, 링커-기초한 삽입 돌연변이, BAL31 뉴클레아제, DNase I 또는 엑소뉴클레아제 III를 사용하는 결실 돌연변이의 연결된 세트 (nested set)가 언급될 수 있다. 이들 방법은 분자적 클로닝, 실험실 매뉴얼 [Molecular Cloning, A laboratory manual (Sambrook, Fritch and Maniatis)]과 같은 실험실 매뉴얼에 자세하게 기술되어 있다. 또한 몇 가지의 PCR-기초한 방법이 이에 제한되지는 않지만, 중첩된 연장 PCR (overlap extension PCR)과 같이 DNA 분자에서 결실, 삽입 또는 부위-유도된 돌연변이화 (site-directed mutagenesis)를 생성하는 데 적용될 수 있다 (Wurch et al ., 1998). 부위 유도된 돌연변이화를 수행하기 위하여, 몇 가지 다른 기법이 사용될 수 있고, 예로는 이들 것에 제한되지는 않지만 단일 또는 이중-프라이머 방법에 근거하는 올리고 뉴클레오타이드 기초한 돌연변이화, 우라실 도입에 근거한 쿤겔 방법 (Kunkel, 1985)이 언급될 수 있다. 이들 방법은 분자적 클로닝, 실험실 매뉴얼 [Molecular Cloning, A laboratory manual (Sambrook, Fritch and Maniatis)]과 같은 실험실 매뉴얼에 자세하게 기술되어 있다.

부가 (addition)의 비제한적 예로는 힌지 부위 내로 또는 이에 인접하여 프롤린 (Proline)의 부가가 언급될 수 있다.

본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, 상기 변형은

i) 상기 힌지 부위 아미노산 서열의 적어도 하나 아미노산의 결실; 및/또는

ii) 상기 힌지 부위 내로 적어도 하나 디설파이드 연결의 부가:로부터 선택된다.

본 발명을 명확하게 설명하기 위하여, 첫 번째 관점 (i)이 먼저 상세하게 기술될 것이고 두 번째 관점 (ii)은 이후에 상세하게 기술될 것이다. 이 순서는 단지 본 출원의 서술 상의 편의를 위한 것일 뿐이고 이들 관점 둘 다가 하기 본 명세서에서 자명해질 바와 같이 유사한 중요성을 가지는 것으로 이해되어야 한다.

상세한 구현예에서, 힌지 부위의 아미노산 서열을 변형하는 방식은 상기 힌지 부위 아미노산 서열의 많아야 2개, 3개 또는 4개의 아미노산의 결실로 이루어질 것이다.

본 발명의 상세한 관점은 상기 모노클론 항체가 이가 (divalent) 항체라는 것이다. 실제적으로, 하기에서 보여지는 바와 같이, 상기 항체의 구조를 변형시킴에 의해 항체의 작동/길항 활성을 조절하는 것이 가능하다. 처음으로, 본 발명자들은 긴 반감기 또는 효과기 기능과 같은 좋은 특성을 보존하려는 목적으로, 이러한 작동/길항 활성을 항체에 대한 이가 형태를 보존하면서 조절하는 고유의 방식을 보고하고 있다.

또한 본 명세서에서는, 모노클론 항체의 힌지 부위의 변형이 효과기 기능을 증가시키려는 목적으로 이미 선행 기술에서 보고되었더라도, 반대로 힌지 부위 내로의 이러한 변형은 모노클론 항체의 작동/길항 활성의 조절에 흥미로울 수 있다고는 전혀 보고되지 않았을 것이라고 주장할 수 있다. 이것은 분명하게도 기존의 선행 기술을 고려하여 새롭고도 발명적인 본 발명의 주제이다.

본 발명의 방법에 따른 관점으로서, 모노클론 항체는 키메라 항체 (chimeric antibody)이다.

"키메라" 항체에 의하여, 해당 종의 항체로부터 유래된 자연적 가변 부위 (경쇄 및 중쇄)를 상기 해당 종과 이종유래인 (heterologous) 종 (예로, 마우스, 말, 토끼, 개, 소, 닭, 등)의 항체 경쇄 및 중쇄의 불변 부위와 조합하여 포함하는 항체를 가르키도록 의도한다.

본 발명에 따른 항체, 또는 그의 키메라 유형의 단편은 유전적 재조합의 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체는 프로모터 또한 비-인간, 특히 마우스의 본 발명에 따른 모노클론 항체의 가변 부위를 코딩하는 서열, 및 인간 항체의 불변 부위를 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 DNA를 클로닝하는 것에 의해 생산될 수 있다. 이러한 재조합 유전자에 의해 인코드되는 본 발명의 키메라 항체는 예를 들어 마우스-인간 키메라 (chimera)일 것이고, 이 항체의 특이성은 마우스 DNA로부터 유래된 가변 부위에 의해 결정되고 그의 이소형 (isotype)은 인간 DNA로부터 유래된 불변 부위에 의해 결정된다. 키메라 항체를 제조하는 방법을 위해, 예를 들어 버호인 등 (Verhoeyn et al., BioEssays, 8: 74, 1988), 모리슨 등 (Morrison et al ., Proc. natl. Acad. Sci. USA 82: 6851-6855, 1984) 또는 미국특허 번호 제 4,816,567호의 문헌들을 참조하는 것이 가능하다.

본 발명의 방법에 따른 또 다른 관점으로서, 모노클론 항체는 인간화 항체 (humanized antibody)이다.

"인간화 항체"에 의하여, 비-인간 기원의 항체로부터 유래된 CDR 부위, 하나의 (또는 몇 가지의) 인간 항체 또는 배아유래 (germline) 서열로부터 유래된 항체 분자의 기타 다른 부분을 포함하는 항체를 가르키는 것을 의도한다. 더우기, 골격의 분절 잔기의 일부분 (FR이라고 명명됨)은 결합 친화도를 보존하기 위하여 변형될 수 있다 (Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332: 323-327, 1988).

본 발명에 따른 인간화 항체 또는 그의 단편은 당업자가 숙지하고 있는 기법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어 Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992; 또는 Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992 의 문헌들에 기술되어 있는 것과 같음).

기타 인간화 방법도 역시, 예를 들어 유럽특허출원 번호 제 EP 0 451 261호, 제 EP　0　682 040호, 제 EP 0 939 127호, 제 EP 0 566 647호 또는 미국특허 번호 제 5,530,101호, 제 6,180,370호, 제 5,585,089호 및 제 5,693,761호에 단백질 디자인 랩 (PDL)에 의해 기술된 "CDR 이식 (CDR Grafting)"과 같은 선행기술로서 당업자가 잘 숙지하고 있다. 또한 하기 특허 출원도 언급될 수 있다: 미국특허 번호 제 5,639,641호, 제 6,054,297호, 제 5,886,152호 및 제 5,877,293호.

본 발명의 방법에 따른 또 다른 관점으로서, 모노클론 항체는 인간 항체 (human antibody)이다.

용어 표현 "인간 항체"는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 하나 이상의 가변 및 불변 부위를 가지는 항체 모두를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 모든 가변 및 불변 도메인 (또는 부위)은 인간 면역글로불린 서열 (완전한 인간 항체)로부터 유래된다. 다른 말로 하면, 그것은 인간 배아유래 (germline) 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 부위 (존재하는 경우)를 가지는 항체라면 모두, 예로 인간에 의해 생산된 항체의 것에 해당하는 아미노산 서열을 소유하고 및/또는 당업자가 알고 있는 인간 항체를 만드는 방법이라면 모두를 사용하여 만들어졌던 것을 포함한다.

한 가지 구현예에서, 인간 모노클론 항체는 형질전환 (transgenic) 비-인간 동물, 예로 형질전환 마우스로부터 획득된 B 세포를 포함하고, 불멸화된 세포 (immortalized cell)에 융합된 인간 중쇄 트랜스유전자 (transgene) 및 경쇄 트랜스유전자를 포함하는 게놈을 가지는 하이브리도마에 의해 생산된다.

이러한 형질전환 마우스의 예로는, 인간 면역글로불린 좌위 (loci)의 큰 단편을 포함하고 마우스 항체 생산이 결여된 조작된 마우스 품종 (engineered mouse strain)인 제노마우스^TM (XENOMOUSE^TM)가 언급될 수 있다 (Green et al ., 1994, Nature Genetics, 7: 13-21). 제노마우스^TM는 어른과 유사한 (adult-like) 완전한 인간 항체의 인간 유전자목록 (repertoire)를 생산하고, 항원-특이적 인간 모노클론 항체를 생성한다. 두 번째 세대 제노마우스^TM는 인간 항체 유전자목록의 대략 80%를 포함한다 (Green & Jakobovits, 1998, J. Exp. Med., 188: 483-495).

또한 파지 디스플레이 기법과 같은 당업자가 알고 있는 기타 다른 기법도 본 발명에 따른 인간 항체를 생산하는 데 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 힌지 부위를 포함하는 면역글로불린 유형이라면 모두, 예로 IgA, IgD 및 IgG를 위해 사용될 수 있다.

예로는 IgA 이소형의 경우, IgA1의 힌지 부위는 서열번호 8

의 아미노산 서열을 포함하고 IgA2의 힌지 부위는 서열번호 9

의 아미노산 서열을 포함한다.

유사한 방식으로, IgD 의 힌지 부위는 서열번호 10

의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 상세한 구현예로는, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 포함하는 IgG를 사용하는 것이 바람직하다.

IgG 힌지 부위의 서로 다른 이소형에 해당하는 각각의 아미노산 서열은:

IgG1의 경우 서열번호 11

IgG2의 경우 서열번호 7

IgG3의 경우 서열번호 12, 및

IgG4의 경우 서열번호 13이다.

훨씬 더 상세하게는, IgG1을 사용하는 것이 바람직하다. 실제적으로 치료적 항체의 분야에서는, 보다 상세하게 암의 치료에서는 표적된 항원에 대한 특이 결합과 연관된 기능에 덧붙여 ADCC 및 CDC와 같은 효과기 기능을 얻기 위하여 IgG1을 생성하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법은 상기 모노클론 항체가 IgG1인 것을 특징으로 한다.

*"표적 분자 (target molecule)"는 본 발명의 의미의 범주에서 모노클론 항체가 특이적으로 결합할 수 있거나 활성을 조절할 수 있는 분자라면 모두에 관한 것이다. 일반적으로, 이러한 표적 분자는 "항원 (antigen)"이라고 명명된다.

모노클론 항체에 의해 표적화 될 수 있는 표적 분자의 비제한적인 예로는, 수용성 리간드, 막통과 수용체와 같은 수용체, 막 종양성 마커 등이 언급될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 상기 표적 분자는 막통과 수용체이다.

용어 표현 "막통과 수용체 (transmembrne receptor)"는 단백질의 리간드에 결합하는 능력을 가진 세포외 도메인 및 리간드 결합 시 변화될 수 있는 (증가되거나 감소되는 경우 둘 다) (단백질 키나제와 같은) 능력을 가진 세포내 도메인을 가지면서 세포의 원형질막 (plasma membrane)을 가로지르는 단백질에 관한 것이다. 다른 말로 하면, 막통과 수용체는 통합 (integral) 막 단백질이고, 통상적으로 세포의 원형질막 내에서뿐만 아니라 일부 소세포 기관 (subcellular compartments) 및 소기관의 막에서도 존재하고 작동한다. 막통과 수용체는 막의 한쪽 면 상에 신호전달 (signalling) 분자에 또는 때로 이러한 분자의 쌍에 결합하여, 다른 쪽 면 상에서 반응을 개시시킨다. 이 방식으로 그들은 세포의 소통 (communications) 및 신호전달 (signal transduction)에서 독특하고도 중요한 역할을 한다.

많은 막통과 수용체는 통합적으로 작동하고, 리간드가 결합되거나 해리되거나 그들의 "활성화" 주기의 또 다른 상태에서 분리될 수 있는 두 개 이상의 단백질 소단위 (subunits)로 구성된다. 그들은 종종 그들의 분자적 구조에 근거하여, 또는 소수의 수용체를 제외하고는 구조가 모두 자세하게 알려져 있지 않기 때문에 그들의 가설로 주장된 (또한 때로 실험적으로 확인된) 막 구조학 (topology)에 근거하여 분류된다. 가장 단순한 폴리펩타이드 사슬은 지질 이중막 (lipid bilayer)을 단 한 번만 교차하는 한편, 다른 것은 7번 정도 (소위 말하는 G-단백질과 결합하는 수용체 또는 GPCPs) 또는 그 이상 교차하는 것으로 예측된다.

모든 통합 막 단백질과 같이, 막통과 수용체는 세 가지 부분 또는 도메인, 세포외 도메인, 막통과 도메인 및 세포내 도메인으로 다시 나뉠 수 있다.

세포외 도메인은 세포 또는 소기관의 외부 면 상에 막이 돌출되어 나온 수용체의 부분이다. 수용체의 폴리펩타이드 사슬이 이중막을 여러 번 교차하는 경우에, 외부 도메인은 막으로부터 돌출된 몇 개의 "루프 (loops)"를 포함할 수 있다. 정의에 의하여, 수용체의 주요 기능은 특이적 리간드, 예를 들어 신경전달물질 (neurotransmitter) 또는 호르몬을 인식하여 반응하는 것이고 [그러나 소정의 수용체는 막통과 전위 (potential)에서의 변화에 반응하기도 함], 많은 수용체에서 이들 리간드는 세포외 도메인에 결합한다.

구조적 증거가 존재하는 대다수의 수용체에서, 막통과 알파 나선 (alpha helices)은 대부분의 막통과 도메인을 구성한다. 니코틴성 아세틸콜린 수용체와 같은 소정의 수용체에서, 막통과 도메인은 막을 통과하는 단백질 배열 (protein-lined) 공극, 또는 이온 통로를 형성한다. 적절한 리간드의 결합에 의한 세포외 도메인의 활성화 시, 공극는 이온에 접근가능하게 되고 이온은 그 다음 통과하게 된다. 다른 수용체에서는, 막통과 도메인에 결합 시 입체형태적 변화를 겪는 것으로 여겨지고 이는 세포 내로 효과를 발생시킨다. 7TM 슈퍼패밀리의 구성원과 같은 일부 수용체에서는, 막통과 도메인이 리간드 결합 포켓 (pocket)을 포함할 수 있다.

수용체의 세포내 (또는 세포질) 도메인은 세포 또는 소기관의 내부와 상호작용하여 신호를 전달한다. 이 반응에는 두 가지의 근본적으로 서로 다른 방식이 있다. a) 세포내 도메인은 효과기 단백질과 특이적 단백질-단백질-상호작용을 통해 소통하고, 이는 다시 신호를 신호 연쇄사슬을 따라 그의 목적지까지 보내며 또한 b) 효소-연결된 수용체를 사용하여 세포내 도메인은 효소적 활성을 가진다. 이것은 종종 타이로신 키나제 활성이 된다. 효소적 활성도 역시 세포내 도메인과 관련된 효소 상에 위치할 수 있다.

세포가 막통과 수용체의 활성을 조절하는 몇 가지 방식이 있다. 가장 중요한 방식은 인산화 (phosphorylation) 및 내재화 (internalization) (유비퀴틴을 참조하라) 또는 cAMP, IP, Ca² ⁺ 또는 cGMP와 같은 이차 전달자 연쇄반응 (second messenger cascades)의 활성화이다.

또한 효소적 활성을 나타내는 막 단백질 모두는 본 발명에 기술된 변형을 가진 항체에 의해 표적화될 수 있다. 그 예로는 이에 제한되지는 않지만, 기질 금속프로테아제 (matrix metalloprotease, MMP) 패밀리, 'a 디스인테그린 및 a 금속프로테아제 도메인 프로테아제' (ADAM) 패밀리, 아데닐레이트 사이클라제 (adenylate cyclase),...가 언급될 수 있다.

또한 이온 통로, 공극 및 전달체 (transporters)로서 작용하는 막 단백질 모두가 본 발명에 기술된 변형을 가진 항체에 의해 표적화될 수 있다. 그 예로는 이에 제한되지는 않지만, 소듐 통로 패밀리, 포타슘 통로 패밀리, 니코틴성 아세틸콜린 수용체 패밀리, 시그마 수용체, 모노아민 전달체 패밀리가 언급될 수 있다.

보다 광범위하게, 해당 질병에 대한 특이적 마커로서 확인되어 있는 막 단백질 모두가 또한 항체 치료법에 의해 표적화될 수 있고, 이러한 항체는 본 발명에 기술된 변형에 의해 마찬가지로 개선될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 막통과 수용체는 타이로신 키나제 수용체, 테트라스패닌 및 GPCRs로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

보다 바람직한 구현예에서, 상기 막통과 수용체는 바람직하게 IGF-1R, c-Met, RON, Axl, VEGF, VEGFR, Her-2neu, Erb B 패밀리의 호모이중머 (homodimers) 및 헤테로이중머 (heterodimers), 등등으로 이루어진 그룹에서 선택된다.

본 출원에서, 보다 상세하게는 하기 본 명세서에서 서열들은 IMGT를 기준으로 하여 정의될 것이다. 독특한 IMGT 번호매김 시스템 (IMGT unique numbering system)은 어떤 항원 수용체, 사슬 타입 또는 종이라도 가변 도메인을 비교할 수 있도록 정의되어 왔다 [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997); Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M. P., Pommie C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. 이 번호매김 시스템에서, 보존되는 아미노산은 23번 시스테인 (1st-CYS), 41번 트립토판 (보존되는 TRP), 89번 소수성 아미노산, 104번 시스테인 (2nd-CYS), 118번 페닐알라닌 또는 트립토판 (J-PHE 또는 TRP)과 같이 항상 동일한 위치를 보유한다. 독특한 IMGT 번호매김 시스템은 구조틀 부위 (FR1-IMGT: 1 내지 26번 위치, FR2-IMGT: 39 내지 55번 위치, FR3-IMGT: 66 내지 104번 위치 및 FR4-IMGT: 118 내지 128번 위치) 또한 상보성 결정 부위: CDR1-IMGT: 27 내지 38번 위치, CDR2-IMGT: 56 내지 65번 위치 및 CDR3-IMGT: 105 내지 117번 위치의 표준화된 구획 (standardized delimitation)을 제공한다. "공간 (gaps)"은 채워지지 않은 위치를 나타내기 때문에, CDR-IMGT 길이 (괄호들 사이에 나타나고 점으로 분리됨)는 결정적인 정보가 된다. IMGT 시스템은 IMGT 진주목걸이라고도 명명되는 [Ruiz, M. and Lefranc, M. P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002); Kaas, Q. and Lefranc, M. P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)] 2차원 그래픽 전시에서 또한 IMGT/3D 구조-DB에서의 3차원 구조 [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M. P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]에서 사용된다.

당업자에게, IMGT 시스템에 따라 기술된 본 발명을 예를 들어 카밧 번호매김 시스템 (Kabat numbering system)과 같은 기타 다른 번호매김 시스템으로 변환시키는 것은 자명한 것이 될 것이다.

모든 종의 IG 및 TR V-부위 (V-REGIONs) 모두에 대한 IMGT 독특한 번호매김법은 가변 부위 구조의 높은 보존성 (conservation)에 의존한다. 이 번호매김법은 5,000개 이상의 서열을 정렬시킨 이후 정립되고, 구조틀 (FR) 및 상보성 결정 부위 (CDR)의 정의, X-선 회절 연구로부터 나온 구조적 데이타, 및 과다가변 루프의 특성분석을 고려하고 이를 종합하고 있다. FR-IMGT 및 CDR-IMGT 부위의 경계 (delimitations)가 정의되어 왔다. 유사하게, IMGT 독특한 번호매김법은 C-도메인 (C-DOMAIN)에 적용되어 왔고, Ig-유사 도메인의 정확한 경계를 가능하게 한다. C-도메인은 면역글로불린 (IG) 유형에 의존하여, 완전한 C-부위, C-부위의 대부분 또는 C-부위의 단지 일부분에 속한다.

C-도메인 (IG 및 TR)에 대한 IMGT 번호매김법은 V-도메인에 대한 IMGT 독특한 번호매김법과 같이 104번 위치까지의 V-부위에 대한 초판 (princeps) IMGT 독특한 번호매김법으로부터 유래한다. 따라서 아미노산 위치는 C-도메인 및 V-부위 간에 용이하게 비교될 수 있다.

힌지 부위를 정확하게 정착시키기 위하여, C-도메인의 IMGT 번호매김법은 CH1 및 CH2 도메인을 정확하게 위치시키는 데 사용되었다. 힌지 부위는 IMGT-CH1의 마지막 잔기와 IMGT-CH2의 첫 번째 잔기 사이에 있는 아미노산 잔기 모두를 포함한다.

동일한 힌지 도메인을 포괄하는 카밧 또는 A. 호네거 (A. Honegger)와 같은 기타 면역글로불린 번호매김법 설계 모두가 본 발명에 포함된다.

상기에서 기술된 바와 같은 IMGT 번호매김 시스템에 근거하는 본 발명의 바람직한 예로서, IgG1의 힌지 부위의 아미노산 서열은 상부 힌지 (upper hinge)에 해당하는 H1 내지 H9 분절 및 중심 힌지 (core hinge)에 해당하는 H10 내지 H14 분절로 구성된 H1 내지 H14 잔기를 포함한다. 보다 상세하게, 인간 IgG1 힌지 부위는 서열번호 11

의 아미노산 서열을 포함하고, 마우스 IgG1 힌지 부위는 서열번호 14

의 아미노산 서열을 포함한다.

표 1

본 발명의 바람직한 구현예에서는, 이가 항체의 힌지 부위를 코딩하는 단백질 서열의 길이를 감소시키는 것을 목적으로 하는 변형이 고려된다. 보다 상세하게, 본 발명에 따른 방법은 힌지 부위에서 적어도 하나의 아미노산을 결실시키는 단계를 포함한다.

이전에 언급된 바와 같이, 상기 힌지 부위의 많아야 2개 아미노산의 결실이 바람직하다.

이전에 언급된 바와 같이, 상기 힌지 부위의 많아야 3개 아미노산의 결실이 바람직하다.

이전에 언급된 바와 같이, 상기 힌지 부위의 많아야 4개 아미노산의 결실이 바람직하다.

본 발명의 방법의 상세한 용도에 있어서, 변형은 적어도 H1, H2, H3, H5, H6, H7, H8, H9, H11, H12 또는 H14 위치에서의 아미노산으로부터 선택된 아미노산의 결실로 이루어진다.

보다 상세하게, 본 발명자들은 특정한 잔기 및 본 발명의 특정한 발명적 관점의 의미는 소정의 잔기를 선택하는 것으로 이루어지는 점을 기술하여 왔다.

IgG1의 바람직한 사례에서, H1 위치에서의 아미노산은 프롤린 (Proline)으로 구성되고; H2 위치에서의 아미노산은 인간 버전에서 라이신 (Lysine)으로, 또한 마우스 버전에서는 아르기닌 (Arginine)으로 구성되며; H3 위치에서의 아미노산은 인간 버전에서 세린 (Serine)으로, 또한 마우스 버전에서 아스파테이트 (Aspartate)로 구성되고; H5 위치에서의 아미노산은 인간 버전에서 아스파테이트로, 마우스 버전에서 글리신 (Glycine)으로 구성되며; H6 위치에서의 아미노산은 라이신으로 구성되고; H8 위치에서의 아미노산은 인간 버전에서 히스티딘 (Histidine)으로, 마우스 버전에서 라이신으로 구성되며; H9 위치에서의 아미노산은 인간 버전에서 트레오닌 (Threonine)으로, 마우스 버전에서 프롤린으로 구성되고; H11 위치에서의 아미노산은 인간 버전에서 프롤린으로, 마우스 버전에서 이소루이신 (Isoleucine)으로 구성되며; 또한 H12 위치에서의 아미노산은 인간 버전에서 프롤린으로 구성된다.

바람직한 구현예에 따르면, 이러한 결실은 "상부 힌지" 부위에서 이루어져야 한다.

보다 바람직한 구현예에서, 이러한 결실은 예를 들어 IgG1의 경우, H10 내지 H14 아미노산으로 구성된 "중심 힌지"와 비교하여, H1 내지 H9 아미노산으로 구성된 "상부 힌지"의 일부분이다.

본 출원에서는, 아미노산 번호매김법이 이전에 기술된 바와 같이 IMGT 시스템을 고려하여 시행되었다. 힌지 부위에 연루된 잔기의 본성이 아닌 번호매김의 변형을 가진 기타 다른 번호매김 시스템은 동등하게 고려되어야 하는 점은 자명하다. 한 예로는, 본 발명의 (IMGT 시스템에 따라) 확인된 아미노산 부분을 카밧 시스템으로 다시 번호매김 (renumbering)하는 것이 동등하게 고려되어야 한다.

본 발명의 또 다른 관점은 "상부 힌지" 부위, 바람직하게는 H4 위치에 위치하는 부위 내로 적어도 하나의 시스테인 (Cysteine) 결실에 근거한다.

본 발명의 또 다른 관점은 힌지 부위 내로 적어도 하나의 디설파이드 연결의 부가에 근거한다.

보다 상세하게, 본 발명의 방법은 "상부 힌지" 부위 내로 적어도 하나의 시스테인 도입으로 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명자들에 따르면, 그럴듯한 설명은 길이의 감소 및/또는 또 다른 디설파이드 연결의 도입으로부터 야기되는 힌지의 가능한 "경직화 (rigidification)"에 근거를 둔다. 이러한 "경직화"는 항체의 적절한 공간적 입체형태를 그 결과로 개선된 길항 활성을 가지면서 유지시키는 것을 허용할 것이다.

힌지 부위를 경직화하는 것을 목적으로 하는 방법이라면 모두가 본 발명에 따른 방법과 동등한 방법으로서 고려되어야 하는 것은 명백하다.

시스테인의 도입은 이러한 아미노산의 부가에 의해 시행될 수 있고, 상기 부가는 당업자가 알고 있는 방법이라면 모두에 의해 시행될 수 있다.

힌지 부위 내로 시스테인을 도입하는 또 다른 바람직한 방식은 적어도 하나의 아미노산의 치환으로 이루어진다.

보다 상세하게, 힌지 부위 내로 시스테인을 도입하는 바람직한 방식은 H1 내지 H9으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산의 치환으로 이루어진다. 이러한 치환은 당업자가 알고 있는 방법이라면 모두에 의해 시행될 수 있다.

보다 상세하게, 본 발명의 방법은 "상부 힌지" 부위 내로 시스테인에 의한 H7 위치에서의 트레오닌의 치환을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 "상부 힌지" 부위 내로 시스테인에 의한 H6 위치에서의 라이신의 치환을 포함한다.

보다 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 "상부 힌지" 부위 내로 시스테인에 의한 H1 위치에서의 프롤린의 치환을 포함한다.

보다 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 "상부 힌지" 부위 내로 시스테인에 의한 H2 위치에서의 라이신의 치환을 포함한다.

보다 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 "상부 힌지" 부위 내로 시스테인에 의한 H3 위치에서의 세린의 치환을 포함한다.

보다 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 "상부 힌지" 부위 내로 시스테인에 의한 H5 위치에서의 아스파테이트의 치환을 포함한다.

보다 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 "상부 힌지" 부위 내로 시스테인에 의한 H8 위치에서의 히스티딘의 치환을 포함한다.

보다 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 "상부 힌지" 부위 내로 시스테인에 의한 H9 위치에서의 트레오닌의 치환을 포함한다.

또 다른 구현예에 따르면, 힌지 부위를 인코딩하는 아미노산 서열의 전체를 변화시킴에 의해 힌지 부위의 길이를 감소시키고 및/또는 디설파이드 연결을 추가하는 것도 역시 가능하다.

바람직한 예로서, 본 발명의 방법의 변형은 항체의 길항 활성을 개선시킬 것으로 기대되는 상기 모노클론 항체가 IgG1일 때, IgG2 힌지 부위의 아미노산 H1 내지 H14에 의한 IgG1 힌지 부위의 아미노산 H1 내지 H14의 대체로 이루어진다.

또 다른 출원으로, 본 발명은 상기 항체는 특이 표적 분자의 하나 이상의 생물학적 활성을 저해할 수 있고, 상기 방법은

(a) 상기 표적 분자의 상기 하나 이상 생물학적 활성의 초기 저해 수준을 가진 초기 항체를 선별하고,

(b) 본 발명의 방법에 의해 상기 초기 항체의 힌지 부위의 아미노산 서열을 변형시키고,

(c) 단계 (b)의 변형된 항체를 상기 표적 분자의 상기 하나 이상의 생물학적 활성을 저해하는 그의 능력에 대해 평가하고, 또한

(d) 단계 (c)의 항체는 양성 결과로서, 상기 초기 저해 수준보다 더 높은, 상기 표적 분자의 상기 하나 이상 생물학적 활성의 저해 수준으로 선별하는: 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 특이 표적 분자에게로 유도되는 길항적 모노클론 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체에 대해 검색하는 방법에 관한 것이다.

초기 항체는 이에 제한되지는 않지만 IGF-1R, c-Met, RON, Axl, CD151, VEGF, VEGFR, Her-2neu, Erb B 패밀리의 호모이중머 (homodimers) 및 헤테로이중머 (heterodimers)에 대한 항체 길항제와 같은 기존의 항체들 중에서 선택될 수 있다. 비제한적인 바람직한 예로서, 상기 초기 항체는 허셉틴 (Herceptin), 퍼투주마브 (Pertuzumab), 세투시마브 (Cetuximab), 항-VEGFR 또는 항-IGF-1R 항체로 이루어질 수 있다.

본 발명의 의미의 범주에서 "저해 수준 (inhibition level)"은 항체의 길항 활성을 묘사한다. 이러한 저해 수준은 이에 제한되지는 않지만 a) 증식을 평가하기 위한 직접적인 세포 계수 (counting) 또는 3[H]티미딘 (thymidine), 테트라졸린 (tetrazoline) 염 또는 기타 다른 형광 수단의 사용, b) 신호 전달을 감시하기 위한 웨스턴 블럿팅, 포스포-엘라이자 (phospho-ELISA) 또는 알파-검색 분석법 (alpha-screen assays), c) 이중화 분석법 (dimerization assay)을 위한 BRET 또는 FRET 분석, d) 이동 (migration), 침투 (invasion), 혈관형성 (angiogenesis) 또는 형태형성 (morphogenesis)를 감시하기 위한 현미경법 또는 형광적 방법, 및 e) 생체내 평가를 위한 종양의 크기 측정 (calliper measurement)과 같은, 당업자가 알고 있는 방법이라면 모두에 의해 결정될 수 있다.

이러한 검색 방법은 확인된 항체의 개선을 위해 또는 연구 또는 전-임상 항체를 선별하는 단계로서 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 또 다른 관점은 본 발명의 방법에 의해 획득될 수 있고,

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로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 힌지 부위 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 특이 표적 분자에게로 유도되는 모노클론 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체에 관한 것이다.

본 발명의 방법의 실행에 의해 획득되는 바람직한 모노클론 항체는

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로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 상기 모노클론 항체는 인간 항체, 보다 바람직하게는 IgG1 항체이다.

또한 본 발명은 이전에 기술된 바와 같은 모노클론 항체를 인코딩하는 분리된 핵산, 예로

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서열번호 43

서열번호 44

서열번호 45

서열번호 46

서열번호 47

서열번호 48

또는 서열번호 49

로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 힌지 부위의 아미노산 서열을 포함하는 것에 관한 것이다.

보다 또 다른 관점에 따르면, 본 발명은 하기 핵산으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산에 관한 것이다:

a) 본 발명에 따른 인위적인 힌지 부위를 코딩하는 핵산, DNA 또는 RNA, 이에 해당하는 그의 RNA 핵산 또는 그의 상보적인 서열;

b) 서열번호 15 내지 서열번호 21 및 서열번호 50 내지 서열번호 77로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 서열, 이에 해당하는 그의 RNA 핵산 및 그의 상보적 서열; 또한

c) 서열번호 15 내지 서열번호 21 및 서열번호 50 내지 서열번호 77 서열의 적어도 하나와 높은 엄격도 조건 하에서 혼성화 (hybridization)할 수 있는 적어도 18개 뉴클레오타이드의 핵산.

바람직하게, 본 발명은 서열번호 15 내지 서열번호 21 및 서열번호 50 내지 서열번호 77으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산을 포함한다.

또한 본 발명의 일부분은 이전에 기술된 바와 같은 분리된 핵산을 포함하는 발현 벡터 또는 형질전환된 숙주세포이고, 보다 상세하게는 서열번호 15 내지 서열번호 21 및 서열번호 50 내지 서열번호 77로 구성되는 그룹으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산, 이에 해당하는 그의 RNA 핵산 및 그의 상보적 서열이다.

본 발명에서 무관심하게 사용될 용어 표현인 핵산 (nucleic acid), 핵산의 (nucleic) 또는 핵산 (nucleic acid) 서열, 폴리뉴클레오타이드 (polynucleotide), 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide), 폴리뉴클레오타이드 서열 (polynucleotide sequence) 및 뉴클레오타이드 서열 (nucleotide sequence)에 의하여, 변형되던지 또는 변형되지 않은 핵산의 단편 또는 부위를 정의되도록 하며, 비-자연적 뉴클레오타이드를 포함하기도 하는 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA 또는 상기 DNAs의 전사 산물로 존재할 수 있는 뉴클레오타이드의 정확한 연결 (linkage)를 의미하는 것을 의도한다.

또한 본 명세서에서 본 발명은 그들의 자연적 염색체 환경에서, 다시 말하면 자연적 상태에서의 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이 아니라는 점이 이해되어야 한다. 그것은 분리되었던 및/또는 정제되었고, 다시 말하면 예를 들어 복제본에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 선별되었으며, 그들의 환경은 적어도 부분적으로는 변형되었던 서열에 관한 것이다. 따라서, 본 명세서에서는 마찬가지로 예를 들어 숙주세포 수단에 의한 유전적 재조합에 의해 획득되거나 또는 화학적 합성에 의해 획득되는 분리된 핵산을 가르키는 것을 의도한다.

높은 엄격도의 조건 하에서의 혼성화는 온도 및 이온 강도에 관한 조건이 그들이 두 가지 상보적인 DNA 단편들 간에만 혼성화를 유지하도록 하는 방식으로 선별되는 것을 의미한다. 설명을 하자면, 상기에서 기술된 폴리뉴클레오타이드 단편을 정의하려는 목적을 위한 혼성화 단계의 높은 엄격도 조건은 유리하게는 하기와 같다.

DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화는 두 단계로 수행된다: (1) 5 x SSC (1 x SSC 는 0.15 M NaCl + 0.015 M 소듐 사이트레이트 용액에 해당한다), 50% 포름아마이드, 7% 소듐 도데실 설페이트 (SDS), 10 x 덴하르트 용액 (Denhardt's), 5% 덱스트란 설페이트, 1% 연어정자 DNA를 포함하는 포스페이트 완충용액에서 42℃에서 3시간 동안 전혼성화 (prehybridization); (2) 탐침의 길이에 의존적인 온도에서 (예로, > 100개 뉴클레오타이드 길이의 탐침의 경우 42℃) 20시간 동안 일차적으로 혼성화, 이어서 2 x SSC + 2% SDS에서 20분 동안 20℃에서 두 번 세척, 0.1 x SSC + 0.1% SDS에서 20분 동안 20℃에서 한 번 세척. 최종 세척은 > 100개 뉴클레오타이드 실이의 탐침의 경우 0.1 x SSC + 0.1% SDS에서 30분 동안 60℃에서 수행된다. 정해진 크기의 폴리뉴클레오타이드에 대한 상기에서 기술된 매우 높은 엄격도 조건은 샘브룩 등의 지침에 따라 (Sambrook et al., 1989, 분자 클로닝: 실험실 매뉴얼 제 2판, 콜드 스프링 하버), 더 길거나 더 짧은 길이의 올리고 뉴클레오타이드의 경우 당업자에 의해 적응될 수 있다.

본 발명은 마찬가지로 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 특히 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 클로닝 및/또는 발현 벡터를 목적으로 한다.

본 발명에 따른 벡터는 바람직하게 정해진 숙주 세포에서 해독된 뉴클레오타이드 서열의 발현 및/또는 분비를 허용하는 요소 (elements)를 포함한다. 따라서 본 벡터는 프로모터, 해독 개시 및 종결 신호뿐만 아니라 적합한 전사 조절 부위를 포함해야 한다. 이것은 숙주세포에서 안정한 방식으로 유지될 수 있어야 하고, 선택 사양으로 해독된 단백질의 분비를 결정하는 (specifying) 특정한 신호를 가질 수 있다. 이들 서로 다른 요소들은 선택되어 사용된 세포 숙주의 기능으로서 당업자에 의해 최적화된다. 이러한 효과를 위해, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열은 선택된 숙주 내에서 자가 복제하는 (autonomous replication) 벡터 내로 삽입될 수 있거나 선택된 숙주의 융합 벡터 (integrative vector)가 될 수 있다.

이러한 벡터는 당업자에 의해 통상적으로 사용되는 방법에 의해 제조될 수 있고 그 결과 나온 클론은 리포펙션 (lipofection), 전기천공법 (electroporation), 열 충격 (heat shock) 또는 화학적 방법과 같은 표준 방법에 의해 적합한 숙주 내로 도입될 수 있다.

본 발명에 따른 벡터는, 예를 들어 플라스미드 또는 바이러스 기원의 벡터이다. 그들은 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열을 클론하거나 발현시키기 위하여 숙주 세포를 형질전환시키는 데 사용될 수 있다.

본 발명은 마찬가지로 본 발명에 따른 벡터로 형질전환되거나 이를 포함하는 숙주세포를 포함한다.

세포 숙주는 원핵성 또는 진핵성 시스템, 예를 들어 박테리아 세포뿐만 아니라 효모 세포 또는 동물 세포, 상세하게는 포유동물 세포로부터 선택될 수 있다. 마찬가지로 곤충 세포 또는 식물 세포를 사용하는 것도 가능하다.

본 발명의 기타 다른 특징 및 장점은 실시예들 및 도면들과 함께 연속하여 기술내용으로 나타난다.
도 1A 및 도 1B는 A549 세포 상의 c-Met 수용체 인산화에 미치는 인간 IgG1/카파 이소형으로서 생산되는 일련의 마우스 및 이에 해당하는 키메라 항-c-Met Mabs의 효과를 나타낸 것이다.
도 1A는 HGF [100 ng/ml]에 의한 c-Met 인산화의 최대 자극에 대비한 퍼센트로서 계산되는 작동제 효과를 나타낸 것이다.
도 1B는 HGF [100 ng/ml]에 의한 c-Met 인산화의 최대 자극의 저해 퍼센트 (percentage of inhibition)로서 계산되는 작동제 효과를 나타낸 것이다.
도 2A 및 도 2B는 A549 세포 상에서 c-Met 수용체 인산화 시 다양한 조작된 힌지 부위를 포함하는 마우스 224G11 Mab 및 키메라 224G11 Mabs 간의 비교를 나타낸 것이다.
도 2A는 HGF [100 ng/ml]에 의한 c-Met 인산화의 최대 자극에 대비한 퍼센트로서 계산되는 작동제 효과를 나타낸 것이다.
도 2B는 HGF [100 ng/ml]에 의한 c-Met 인산화의 최대 자극의 저해 퍼센트로서 계산되는 작동제 효과를 나타낸 것이다.
도 3A 및 도 3B, 도 4 또한 도 5는 c-Met 이중화 및 활성화 BRET 모델을 나타낸 것이다.
도 6A 및 도 6B는 키메라 및 인간화 224G11 형태에 의한 c-Met 인식을 나타낸 것이다.
도 7A, 도 7B 및 도 7C는 시험관내 (in vitro) NCI-H441 세포의 HGF-유도성 증식에 미치는 마우스 및 키메라 항체의 효과를 나타낸 것이다. NCI-H441 세포는 무혈청 배지에 도말되었다. 도말하고 24시간 이후에, m11E1 및 [11E1] 킴 (chim)(도 7A), m227H1 및 [227H1] 킴 (도 7B) 또는 m224G11 및 [224G11] 킴 (도 7C)가 HGF 부재 시 또는 존재 시에 첨가되었다. 검은색 화살표는 HGF 부재 시 ↙ 또는 존재 시 ↘ 세포 단독으로 도말된 웰을 가르킨다. 마우스 IgG1 (mIgG1)이 이소형 대조군으로서 도입되었다.
도 8은 NCI-H441 이종이식 모델 상에서 마우스 및 키메라 224G11 Mabs의 생체내 비교를 나타낸 것이다.
도 9A 및 도 9B는 시험관내 NCI-H441 세포의 HGF-유도성 증식에 미치는 마우스 224G11 Mab 및 이 항체의 다양한 키메라 및 인간화 버전의 효과를 나타낸 것이다. NCI-H441 세포는 무혈청 배지에 도말되었다. 도말하고 24시간 이후에, 테스트될 항체가 HGF 부재 시 또는 존재 시에 첨가되었다. 패널 (도 9A)에서는, 마우스 m224g11, 키메라 IgG1 [224G11] 킴, 인간화 IgG1 [224G11][Hz1], [224G11][Hz2], [224G11][Hz3] 버전을 나타내었다. 패널 (도 9B)에서는, 마우스 m224G11, 다양한 키메라 IgG1 형태들 ([224G11] 킴, [224G11][MH 킴], [224G11][MUP9H 킴], [224G11][MMCH 킴], [224G11][TH7 킴])를 나타내었다. 검은색 화살표는 HGF 부재 시 ↙ 또는 존재 시 ↘ 세포 단독으로 도말된 웰을 가르킨다. 마우스 IgG1이 작동제 활성에 대한 음성 대조군으로서 도입되었다. m5D5가 용량-의존적인 완전한 작동제 대조군으로서 사용되었다.
도 10은 시험관내 NCI-H441 세포의 HGF-유도성 증식에 미치는 마우스 224G11 Mab 및 이 항체의 다양한 키메라 및 인간화 버전의 효과를 나타낸 것이다. NCI-H441 세포는 무혈청 배지에 도말되었다. 도말하고 24시간 이후에, 테스트될 항체가 HGF 부재 시 또는 존재 시에 첨가되었다. 마우스 m224g11, [224G11] 킴, [224G11][TH7 킴] IgG1 키메라 형태 및 [224G11][TH7 Hz1], [224G11][TH7 Hz3]를 나타내었다. 검은색 화살표는 HGF 부재 시 ↙ 또는 존재 시 ↘ 세포 단독으로 도말된 웰을 가르킨다. 마우스 IgG1이 작동제 활성에 대한 음성 대조군으로서 도입되었다. m5D5가 용량-의존적인 완전한 작동제 대조군으로서 사용되었다.
도 11A 및 도 11B 또한 도 12A 및 도 12 B는 A549 세포 상에서 c-Met 수용체 인산화 시 본 발명의 조작된 힌지 부위를 가진 일련의 항-c-Met Mabs의 효과를 나타낸 것이다.
도 11A 및 도 11B는 HGF [100 ng/ml]에 의한 c-Met 인산화의 최대 자극에 대비한 퍼센트로서 계산되는 작동제 효과를 나타낸 것이다.
도 12A 및 12B는 HGF [100 ng/ml]에 의한 c-Met 인산화의 최대 자극의 저해 퍼센트로서 계산되는 작동제 효과를 나타낸 것이다.
도 13A 및 도 13B는 c-Met 이중화 및 활성화 BRET 모델을 나타낸 것이다.
도 14A는 HGF [100 ng/ml]에 의한 c-Met 인산화의 최대 자극에 대비한 퍼센트로서 계산되는 작동제 효과를 나타낸 것이다.
도 14B는 HGF [100 ng/ml]에 의한 c-Met 인산화의 최대 자극의 저해 퍼센트로서 계산되는 작동제 효과를 나타낸 것이다.
도 15는 c-Met 이중화 및 활성화 BRET 모델을 나타낸 것이다.
도 16은 PC3 세포 부착에 미치는 서로 다른 형태의 Mab 214B2의 효과를 현미경 분석법으로 나타낸 것이다.
도 17은 PC3 세포 부착에 미치는 서로 다른 형태의 Mab 214B2의 효과 분석을 ATP 분석법 (ATP assay)을 사용하여 나타낸 것이다. 각 웰에서, 부착된 세포의 숫자는 0 내지 200,000개 세포/웰까지의 PC3 표준 곡선을 사용하여 결정되었다. 그 결과는 하기와 같이 표현되었다: 처리되지 않은 세포를 기준군 (100%)으로 삼아서 처리된 세포를 기준군의 %로서 표현하였다.

실시예 1: 키메라 항체의 제작 및 c- Met 수용체 인산화 상태의 기능적 평가

원형적 (prototypical) 타이로신 키나제 수용체 (c-Met 수용체)를 표적화하는 몇 가지 마우스 Mabs가 마우스 가변 도메인 및 인간 불변 도메인을 보유하는 키메라 Mabs로서 다시 포맷되었다. 그들의 내재적 (intrinsic) 활성은 리간드 (HGF)-의존성 c-Met 수용체 인산화의 저해를 감시하는 기능적 분석법에 근거하여 분석되었다.

마우스 가변 도메인 서열 (VH, VL)의 PCR 클로닝 시, 키메라 Mabs는 IgG1 면역글로불린의 인간 경쇄 C카파 또는 인간 중쇄 [CH1-힌지-CH2-CH3] 둘 중 하나의 전체 코딩 서열을 보유하는 pCEP4 벡터 내로 VH 또는 VL 서열의 둘 중 하나를 보유하는 {Nhe1 - Bcl1} 제한효소 단편을 라이게이션 하여 제작되었다. 모든 클로닝 단계는 실험실 매뉴얼 (Sambrook and Russel, 2001)에 기술된 바와 같이 통상적인 분자생물학 기법에 따라 또는 제조사의 지침서에 따라 수행되었다. 각 유전적 작제물 (genetic construct)은 빅 다이 터미네이터 사이클 서열결정 (Big Dye terminator cycle sequencing) 키트 (어플라이드 바이오시스템사, 미국)를 사용하는 뉴클레오타이드 서열결정에 의해 전적으로 확인되었고 3100 유전적 분석기기 (Genetic Analyzer) (어플라이드 바이오시스템사, 미국)를 사용하여 분석되었다. 해당하는 키메라 Mabs의 생산이 6 mM 글루타민이 보충된 무혈청 배지 Excell 293 (SAFC 바이오사이언스사)에서 자라는 현탁 배양-적응성 HEK293 EBNA 세포 (인비트로겐사, 미국)를 사용하여 수행되었다. 일시적 형질전환 (transient transfection)은 직선상 25 kDa 폴리에틸렌이민 (PEI)(폴리사이언스사)를 사용하여 수행되었다. 배양 과정은 세포 생존율 및 Mab 생산을 기초로 하여 감시되었다. Mabs는 프로테인 A 레진 (GE 헬스케어사, 미국) 상에서 통상적인 크로마토그래피 접근법을 사용하여 정제되었다.

서로 다른 형태의 Mabs 모두는 기능적 평가에 적합한 수준으로 생산되었다. 생산 수준은 전형적으로 정제된 Mabs의 15 내지 30 mg/l 범위 사이에 분포하고 있다.

기능적 평가는 A549 인간 폐암 세포 상에서 수행되었다. c-Met 수용체 인산화 상태는 특이적 포집 엘라이자 분석법 (specific capture ELISA assay)을 사용하여 세포 용출액 상에서 감시되었다. 염소 항-c-Met Mab (R & D사, 참조번호 AF276)가 포집 항체 (capture antibody)로서 사용되었던 한편, 검출 항체로는 항-포스포-c-Met Mab (바이오소스사, 참조번호 KHO0281)가 사용되었다. 발광 해독 결과 (luminescence readings)는 미스라스 LB920 다중방식 플레이트 리더 (Mithras LB920 Multimode plate reader, 베르톨드사) 상에 기록되었다.

모두 세 가지의 마우스 Mabs 11E1, 224G11 및 227H1가 c-Met 수용체 인산화 상에서 비교가능한 내재적 (intrinsic) 활성을 나타내었다: 그들 자신에 의한 작동제 활성은 거의 없고 (5% 이하의 HGF 효과, 도 1A), HGF [100 ng/ml]-유도성 c-Met 수용체 인산화는 강하게 저해 (> 70%의 HGF 저해 효과). 매우 놀랍게도, 마우스 IgG1/카파로부터 인간 IgG1 카파까지 변화하도록 Mab의 불변 도메인을 배타적으로 변형시킴에 의해 그 결과 나온 키메라 Mabs의 내재적 활성의 완전한 변형이 관찰되었다 (도 1A 내지 도 1B). 따라서, 강한 작동 기작 (agonism) (c11E1의 경우 20%에 이르는 HGF 효과, 도 1A)이 길항적 효능에서의 중요한 감소 (c224G11의 경우 단지 60%만 남아있는 HGF 저해 효과, 도 1B)와 관련되어 관찰되었다. 이 효과는 동일한 현상이 세 가지 조사된 Mab에서 관찰되었기 때문에 항체의 가변 도메인과는 무관하였다 [11E1, 224G11 및 227H1 모노클론 항체가 미생물 배양의 수집기관 (CNCM, 프랑스 파리, 파스퇴르 연구소)에 2007년 03월 14일자 수탁번호 CNCM 제 I-3724호 (11E1에 해당함), 제 I-3731호 (224G11에 해당함) 및 제 I-3732호 (227H1에 해당함)로 기탁된 하이브리도마에 의해 분비된다](국제특허출원 번호 제 WO 2009/007427호 하에서 발행된 PCT 특허출원을 참조하라).

실시예 2: 조작된 힌지 버전의 설계, 클로닝 및 생산

상기에서 관찰된 바를 기초로 하여, 마우스 IgG1을 인간 IgG1으로 재포맷할 때 관찰되는 손상된 약리학적 프로파일은 인간 IgG1 도메인으로 인해 생긴 것으로 가정되었다.

한편으로는, c-Met 수용체의 활성화가 그의 이중화와 관련되어 있었고, c-Met 수용체 이중화의 저해가 c-Met 수용체 인산화 및 하부 (downstream) 신호전달을 저해할 수 있는 것으로 문헌에 보고되었다.

다른 한편으로, Mabs는 그들 내재적 구조적 기초로 인해 본질적으로 이가 분자이고, 따라서 그들은 c-Met 수용체 이중화의 유도인자 (inducers)로서 작용할 수 있다.

따라서, 키메라 Mabs의 회전, 구부림 또는 흔들림과 같은 입체 형태적 유연성을 제한함에 의해 (Roux et al ., 1997를 참조하라), 부모가 되는 마우스 Mabs의 흥미있는 내재적 활성을 (강한 길항 기작 및 약한 작동 기작) 다시 획득하는 것이 가능할 수 있다고 가정된다. 이러한 가설은 마우스 및 인간 IgG1 힌지 부위 (IgG1 H-부위라고도 약칭됨)의 개별 서열의 분석에 의해 강력히 뒷받침된다.

마우스 IgG1 H-부위 (서열번호 1)

인간 IgG1 H-부위 (서열번호 11)

인간 IgG2 H-부위 (서열번호 7)

이 정렬은 마우스 IgG1 H-부위가 더 짧고, 인간 IgG1 H-부위과 비교하여 추가로 하나의 부가적 디설파이드 연결 (Cys)를 포함하는 것을 보여준다. 또한 인간 IgG2 H-부위는 마우스 IgG1 H-부위와 그의 길이 (11개의 아미노산) 및 디설파이드 연결 (4개)의 숫자 둘 다에서 닮아있는 점을 보여준다.

따라서, 인간 IgG1 H-부위의 증가된 경직도 (rigidity)는 Cys 잔기와 같은 안정화시키는 (stabilizing) 돌연변이를 도입함에 의해 및/또는 이 특정한 분절을 축소함 (shortening)에 의해 획득될 수 있는 것으로 사료된다. 추정되는 이러한 H-부위의 증가된 경직도는 조작된 인간 IgG1 Mab의 개선된 기능적 특성과 관련될 수 있다.

일련의 7가지 조작된 버전의 첫 번째는 마우스 및 인간 서열 간의 N-말단 또는 C-말단 힌지 부분의 교환으로 키메라 H-부위를 제조하여 설계되었다 (표 2). IgG2 동등물의 제작도 마찬가지로 수행되었다.

표 2

H-부위 내에 하나의 추가적인 시스테인 잔기의 도입, 또는 적어도 하나의 아미노산을 결실시키는 것, 또는 H-부위 내에 하나의 시스테인의 부가 및 적어도 하나의 아미노산의 결실을 동시에 조합하는 것의 영향을 평가하기 위하여, 추가적인 일련의 H-부위에서의 28가지 돌연변이가 설계되었고 제작되었다.

이 새로운 일련의 힌지 돌연변이는 표 3에 기술되어 있다.

표 3

힌지 조작의 예로서, 224G11이라고 불리는 마우스 항-c-Met Mab의 가변 도메인 (중쇄 및 경쇄)이 선택되었다.

이들 마우스 서열은 첫 번째 경우에 경쇄를 위해 인간 불변 도메인 [C카파] 또한 인간 IgG1 중쇄를 위해 [CH1-힌지-CH2-CH3]에 융합되었다. 힌지 부위의 변형은 원하는 변형을 보유하는 동등한 부분에 의해 {Nhe1-Bcl1} 제한효소 단편을 교환시킴에 의해 수행되었고, 각각의 개별 {Nhe1-Bcl1} 제한효소 단편은 광범위 유전자 합성법 (global gene synthesis, 진큐스트사, LU)에 의해 합성되었다.

모든 클로닝 단계는 실험실 매뉴얼 (Sambrook and Russel, 2001)에 기술된 바와 같이 통상적인 분자생물학 기법에 따라 또는 제조사의 지침서에 따라 수행되었다. 각 유전적 작제물 (genetic construct)은 빅 다이 터미네이터 사이클 서열결정 키트 (어플라이드 바이오시스템사, 미국)를 사용하는 뉴클레오타이드 서열결정에 의해 전적으로 확인되었고 3100 유전적 분석기기 (어플라이드 바이오시스템사, 미국)를 사용하여 분석되었다.

현탁 배양-적응성 HEK293 EBNA 세포 (인비트로겐사, 미국)는 250 ml 플라스크에서 50 ml의 6 mM 글루타민이 보충된 무혈청 배지 Excell 293 (SAFC 바이오사이언스사)를 사용하여 일상적으로 배양하였다. 일시적 형질전환은 혼합된 플라스미드 DNA의 1 mg/ml 최종 농도 (중쇄와 경쇄 플라스미드가 1 : 1 비율인 경우, 1.25 μg/ml의 최종 농도)에서 물에 녹인 직선상 25 kDa의 폴리에틸렌이민 (PEI)(폴리사이언스사)를 사용하여 2.10⁶세포/ml로 수행되었다. 형질전환 4시간 이후에, 배양액은 동일한 부피의 신선한 배양 배지로 희석시켜 10⁶세포/ml의 최종 세포 농도를 만들었다. 배양 과정은 세포 생존율 및 Mab 생산을 기초로 하여 감시되었다. 전형적으로, 배양액은 4 내지 5일 동안 유지되었다. Mabs는 프로테인 A 레진 (GE 헬스케어사, 미국) 상에서 통상적인 크로마토그래피 접근법을 사용하여 정제되었다.

실시예 3: 포스포 -c- Met -특이적 엘라이자 분석법에서 조작된 Mabs의 평가

A549 세포는 완전 배양 배지 [F12K + 10% FCS]를 사용하여 12 다중웰 (MW) 플레이트에 접종되었다. 세포는 HGF [100 ng/ml]로 자극하기 이전에 16시간 동안 굶겼고, 테스트될 각 Mab는 리간드 자극하기 15분 이전에 30μg/ml의 최종 농도로 첨가되었다. 얼음에 차갑게 한 용해 완충용액이 HGF 첨가하기 15분 이후에 첨가되어 인산화 반응을 정지시켰다. 세포에는 기계적으로 상처를 주었고, 세포 용출액은 13,000 rpm에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하여 상청액 상태 (phase)에 해당하는 것을 수집하였다. 단백질 함량은 BCA 키트 (피어스사)를 사용하여 정량되었고 사용하기 전 -20℃에 저장되었다. C-Met의 인산화 상태는 엘라이자에 의해 정량되었다. 염소 항-c-Met Mab (R & D사, 참조번호 AF276)가 포집 항체 (4℃에서 하룻 밤 동안 코팅됨)로서 사용되었고, 5% TBS-BSA 완충용액을 사용한 포화 단계 이후에 (상온 (RT)에서 1시간), 25μg의 단백질 용출액이 코팅된 96 MW 플레이트의 각 웰에 첨가되었다. RT에서 90분 배양하기 이후에, 플레이트는 네 번 세척되었고 검출 항체가 첨가되었다 (1230, 1234 및 1235 위치에서의 인산화된 Tyr 잔기에게로 유도되는 항-포스포-c-Met Mab). 추가적인 1시간 배양 및 4번 세척하기 이후에, HRP (바이오소스사)가 결합된 항-토끼 항체가 RT에서 1시간 동안 첨가되었고 발광 검출이 루미놀을 첨가하여 수행되었다. 발광 해독이 미스라스 LB920 다중방식 플레이트 리더 (베르톨드사) 상에서 이루어졌다.

중쇄 힌지 도메인의 일련의 조작된 버전이 제작되었고 c-Met 수용체 인산화 분석법으로 분석되었다. 도 2A에서 나타난 바와 같이, 224G11[IgG1-키메라]과 비교하여, hIgG1/카파 이소형과 관련된 작동제 효과의 중요한 감소가 IgG2-기초한 작제물 및 일부 조작된 IgG1/카파 작제물 [MH, MUP9H 및 TH7, 도 2A] 둘 다의 경우에서 관찰되었다. 가장 약하고 비교 가능한 작동기작 활성이 완전한 마우스 IgG1 힌지 부위 및 224G11[TH7]을 포함하고 가장 인간으로 조작된 IgG 힌지를 포함하는 224G11[MH-IgG1]을 사용하여 획득되었다. 길항제 효능의 동시적인 증가도 마찬가지로 획득되었다 (도 2B). 따라서, 마우스 224G11 가변 도메인과 관련된 IgG2-기초하고 조작된 hIgG1/카파-기초한 TH7 힌지 돌연변이는 마우스 224g11 Mab의 것과 거의 유사한 기능적 활성을 수득하였다. 그러나, 224G11[MMCH-IgG1-킴]의 작동/길항 활성의 224G11[IgG1-킴]과 비교는 증가된 길항 활성이 이러한 항체의 내재적 작동 특성과는 무관하게 항체 조작에 의해 획득될 수 있는 것을 보여주었다.

중쇄 힌지 도메인의 두 번째 일련의 조작된 버전이 제작되었고 c-Met 수용체 인산화 분석법으로 분석되었다. 도 11A에서 나타난 바와 같이, 시스테인 잔기를 도입하는 중쇄 힌지 도메인에서의 아미노산 치환은 항체의 작동제 효과를 변형시켰다. 따라서, 한편으로, 일부 돌연변이된 버전은 예를 들어 c224G11[C2], c224G11[C3], c224G11[C5], c224G11[C6] 또는 c224G11[C7]와 같이 c224G11보다 더 작은 작동제 효과를 나타내었던 반면, 다른 것은 c224G11[C11], c224G11[C12] 및 c224G11[C14]와 같이 작동제 효과를 증가시켰다. 더우기, 아미노산 치환과 관련되거나 관련되지 않은 중쇄 힌지 도메인에서의 아미노산 결실도 항체의 작동제 특성을 변형시켰다 (도 11B). 예를 들어, c224G11[△1-3], c224G11[△4-5-6], c224G11[△5-6-7-8], c224G11[C7△6], c224G11[C6△9], c224G11[C2△5-7], c224G11[C5△2-6] 또는 c224G11[C9△2-7]는 c224G11보다 더 약한 작동제 효과를 보여주었던 반면, c224G11[△8-11]은 더 강한 작동제 효과를 나타내었다. c224G11[TH7]과 같이, 더 약한 작동제 효과를 나타내는 모든 새로운 버전은 길항제 활성에서 동시적인 증가를 보여주었던 반면 (도 12A 및 도 12 B) 더 강한 작동제 효과를 나타내는 것은 더 약한 길항제 효능을 보유하였다.

본 출원에서 각진 괄호의 사용은 필요하지 않고, 예를 들어 기준 [224G11][IgG2킴]는 224G11IgG2킴과 일치하는 것으로 고려되어야 한다. 동일한 방식으로, 항체가 마우스의 것이라고 가르키기 위해, 용어 표현 마우스 (murine) 또는 문자 m이 첨가될 수 있고; 항체가 키메라인 것을 가르키기 위해, 용어 표현 킴 (chim) 또는 문자 c가 첨가될 수 있으며; 항체가 인간화된 것을 가르키기 위해 용어 표현 흄 (hum) 또는 문자 h가 첨가될 수 있다. 예로서, 키메라 항체 22G11IgG2는 c22G11IgG2, c22G11[IgG2], c[22G11][IgG2], 22G11IgG2킴, 22G11[IgG2킴], [22G11]IgG2킴 또는 [22G11][IgG2킴]이라고 약칭될 수 있다.

기호 △는 결실을 의미한다.

실시예 4: BRET 분석법

첫 번째 실험 세트에서, 부적절한 마우스 IgG1, 인간 IgG1 및 인간 IgG2는 BRET 모델 둘 다에서 HGF 유도성 BRET 신호의 효과를 전혀 보유하지 않도록 통제되었다 (도 3). 이들 Mabs는 더 나아가 대조군으로서 사용되었다.

마우스 224G11 Mab ([224G11] 킴), 마우스 11E1 Mab ([11E1] 킴) 및 마우스 227H1 Mab ([227H1] 킴)의 IgG1 키메라 형태가 c-Met 이중화 및 c-Met 활성화에 미치는 효과가 그 다음 평가되었다.

마우스 224G11 Mab는 c-Met 이중화 모델 상에서 HGF 유도성 BRET 신호의 59%를 저해하였던 반면, [224G11] 킴 Mab는 단지 29%만을 저해하였다 (도 4). [224G11] 킴 및 m224G11 항체가 HGF 유도성 BRET 신호의 34.5% 및 56.4%를 저해하였기 때문에 [224G11] 킴 항체도 역시 HGF 유도성 c-Met 활성화를 저해하는 데 덜 효과적이었다 (도 5). 더우기, [224G11]킴이 HGF 유도성 신호의 32.9%에 해당하는 c-Met 활성화에 미치는 부분적 작동제 효과를 가지는 한편, m224G11 단독으로는 c-Met 활성에 미치는 효과가 전혀 없었다. 또한 [224G11]킴 단독으로 m224g11의 경우의 21.3% 대비 46.6%의 HGF-유도성 신호에 해당하는 BRET 증가를 유도하였기 때문에 이러한 [224G11]킴의 부분적 작동제 효과는 c-Met 이중화 BRET 모델 상에서도 관찰되었다.

중쇄 힌지 도메인의 두 번째 일련의 조작된 버전의 작동제 효능이 c-Met 활성화 BRET 모델에서 평가되었다 (도 13A 및 도 13B). c-Met 활성에 부분적 작동제 효과를 가지는 224G11와는 대조적으로, 아미노산 치환, 아미노산 결실 또는 둘 다를 포함하는 224G11 항체의 서로 다른 힌지 돌연변이된 키메라 형태는 c224G11[C2], c224G11[C3], c224G11[C5], c224G11[C6] 또는 c224G11[C7], c224G11[△1-3], c224G11[△4-5-6], c224G11[△5-6-7-8], c224G11[C7△6], c224G11[C6△9], c224G11[C2△5-7], c224G11[C5△2-6] 또는 c224G11[C9△2-7] 각각의 경우, c-Met 활성화에 단독으로 유의한 효과를 전혀 보이지 않았다. 대조적으로, c224G11[△6], c224G11[C11], c224G11[C12] 및 c224G11[C14]와 같은 다른 힌지 돌연변이된 키메라 형태는 증가된 작동제 효과를 보여주었다.

실시예 5: 키메라 및 인간화 224G11 형태의 c- Met 인식

재조합 c-Met 상에서 다양한 키메라 및 인간화 형태의 결합 능력을 결정하기 위하여, 직접 엘라이자 (direct ELISA)가 수립되었다. 간략하게 R & D 시스템사로부터 나온 재조합 이중 c-Met가 96-웰 이뮤론 II (Immunlon II) 플레이트 상에 1.25 μg/ml 농도로 코팅되었다. 4℃에서 하룻밤 동안 배양한 이후에, 웰을 0.5% 젤라틴/PBS 용액으로 포화시켰다. 그 다음 플레이트는 테스트될 항체의 2배 희석액을 첨가하기 이전에 37℃에서 1시간 동안 배양되었다. 플레이트는 마우스 항체를 검출하기 위한 염소 항-마우스 IgG HRP 또한 키메라 및 인간화 항체의 인식을 위한 염소 항-인간 카파 경쇄 HRP를 첨가하기 이전에 추가 시간 동안 배양되었다. 플레이트는 한 시간 동안 배양되었고 퍼옥시다제 기질 TMB 웁티마 (TMB Uptima)가 1 M H₂SO₄로 중화시키기 전에 5분 동안 첨가되었다. 도 6A 및 도 6B에 나타난 결과는 모든 테스트된 형태가 c-Met 인식에 대해 비교 가능하였던 것을 보여주었다.

실시예 6: 시험관내 NCI -H441 세포의 HGF -유도성 증식에 미치는 마우스 및 키메라 항체의 효과

ATCC로부터 구입한 NCI-H441 세포는 10% FCS (인비트로겐사), 1% L-글루타민 (인비트로겐사)이 보충된 RPMI 1640 배지 (인비트로겐사, 영국 스코틀랜드)에서 일상적으로 배양되었다. 증식 분석법을 위해, 세포는 사용하기 3일 전에 분주되어 도말하기 전에 성장이 충만한 단계 (confluent phase)에 있었다. NCI-H441 세포는 200μl의 무혈청 배지 (1% L-글루타민이 보충된 RPMI 1640 배지)를 사용하여 3.75 x 10⁴ 세포/웰의 밀도로 96-웰 조직배양 플레이트에 도말되었다. 도말하고 24시간 이후에 테스트될 항체가 NCI-H441 세포에 첨가되었고 HGF를 400 ng/ml (5 nM)의 최종 농도로 추가 142 시간 동안 첨가하기 이전에 37℃에서 30분 동안 배양되었다. 각 항체의 경우에 테스트되는 용량 범위는 10으로부터 0.0097 μg/ml (각 웰의 최종 농도)까지이다. 이 실험에서, 마우스 IgG1 Mab는 마우스 이소형 대조군으로서 첨가되었고 테스트된 항체는 하기의 것이었다: m224G11, m11E1, m227H1 또한 [224G1] 킴, [11E1] 킴 및 [227H1] 킴으로서 각각 확인된 그들의 인간 IgG1 키메라 형태. -/+ HGF의 세포 단독으로 도말된 웰도 역시 포함되었다. 그 다음, 세포는 0.25 μCi의 [³H] 티미딘 (에머샴 바이오사이언스 AB사, 스웨덴 웁살라)로 7시간 30분 동안 펄스처리되었다 (pulsed). 트리클로로아세트산-불용성 DNA에 도입된 [³H] 티미딘의 크기는 액체 신틸레이션 계수법 (liquid scintillation counting)에 의해 정량되었다. 결과는 항-c-Met Mabs가 단독으로 종양세포에 첨가되었을 때 일어날 수 있는 잠재적인 내재적 작동제 활성을 더 잘 평가하기 위하여 변환되지 않은 cpm 데이타로서 표현된다.

도 7A, 도 7B 및 도 7C에 나타난 결과는 예측된 바와 같이, 마우스 항체는 테스트 용량이 어떠하든지 단독으로 종양세포에 첨가되었을 때 작동제 효과를 전혀 나타내지 않는 것을 보여주었다. 이 실험에서 본 이소형 대조군의 경우에 관찰된 높은 cpm 변화를 고려할 때, HGF-유도성 증식의 유의한 저해가 이소형 대조군에서는 전혀 관찰되지 않았다. 마우스 m224G11 또는 m11E1 또는 m227H1의 어느 것도 단독으로 첨가되었을 때, mIgG1 이소형 대조군 Mab 또는 세포 단독과 비교하여 작동제 효과를 나타내지 않았다. 용량 의존성 항-증식 활성은 m224G11, m11E1 또는 m227H1 Mabs의 경우 각각 78%, 80% 또는 80%에 도달하였다 (% 저해 계산법: 100 - [(세포 cpm + mIgG1의 테스트된 Mab-평균 cpm 기저값) x 100 / (세포의 평균 cpm + 세포 단독의 HGF-평균 cpm)]). 놀랍게도, 이들 3가지 Mabs의 키메라 형태는 단독으로 첨가되었을 때 유의하고도 용량 의존적 작동제 효과를 유도하였고, [11E1]킴 및 [227H1]킴의 경우는 HGF를 사용하여 각각 관찰되는 것과 유사한 성장 자극을 보유하였다. 특히 높은 내재적 작동제 활성을 보여주는 이들 2가지 항체의 경우, 길항제 활성이 그들 둘 다의 마우스 형태의 경우에서 관찰되는 80%에 비해 저해 효과가 53% 및 21%로 유의하게 감소되었다. 또한 키메라 [224G11]킴으로 관찰된 작동제 효과는 용량 의존적이었지만, [11E1]킴 및 [227H1]킴의 경우에 관찰된 것보다 더 낮았다. 그러나 이러한 작동제 효과는 마우스 m224G11의 경우 78%로부터 그의 키메라 형태의 50%까지 이르면서 시험관내 HGF-유도성 증식 저해에 영향을 주었다. 이러한 "더 낮은 (lower)" 시험관내 내재적 작동제 활성이 변화되지 않은 생체내 효과와 양립가능한지 여부를 조사하기 위하여, m224G11 및 [224G11]킴 둘 다가 생체내 테스트를 위해 생산되었다. 이전의 연구에서, 30 μg/마우스 용량이 유의한 생체내 활성을 나타내었기 때문에, 이 용량이 생체내 평가를 위해 선택되었다.

실시예 7: NCI -H441 이종이식 모델 상에서 마우스 및 키메라 224G11 Mabs의 생체내 비교

NCI-H441은 유두모양 폐 샘암종 (papillary lung adenocarcinoma)로부터 유래되고 c-Met을 높은 수준으로 발현하며 c-Met RTK의 전신적 인산화 (constitutive phosphorylation)를 나타낸다.

NCI-H441 이종이식 모델 상에서 항체의 생체내 효과를 평가하기 위하여, 6주 내지 8주령 된 올드 누드 마우스를 멸균된 필터-뚜껑이 있는 사육상자에 넣어두었고 무균 조건에서 유지시켰으며 프랑스 및 유럽 지침에 따라 조작하였다. 마우스에는 9 x 10⁶개의 세포가 피하적으로 주사하였다. 그 다음 세포 이식하고 6일 이후에 종양은 측정 가능하였고 (대략 100 mm³), 동물은 비교가능한 종양 크기를 가지는 6마리 마우스 그룹으로 나뉘었다. 이것은 먼저 60 μg 항체/마우스의 로딩 용량으로 그 다음 주당 두 번씩 1 mg/용량의 각 테스트될 항체로 처리되었다. 마우스는 이어서 이종이식 성장율이 관찰되었다. 종양 부피는 공식 π(Pi)/6 x 길이 x 너비 x 높이:에 의해 게산되었다. 도 8에 기술된 결과는 생체내 작동제 활성이 결여된 마우스 Mab가 예측된 바와 같이 심지어 낮은 테스트 용량에서도 길항제로서 행동하는 것을 보여주고 있다. 마우스 Mab를 사용하여 관찰된 것과는 대조적으로, 키메라인 것은 매우 일시적인 생체내 활성을 나타내었고 종양은 세포 주입 이후 D20일에서의 처리까지 완전히 사라졌다. 이 실험은 길항제 활성의 감소를 가져왔던 시험관내 작동제 효과의 증가도 역시 길항제 활성의 유의한 생체내 소실을 부여하였던 것을 분명하게 보여주었다.

실시예 8: 시험관내 NCI -H441 세포의 HGF -유도성 증식에 미치는 마우스 224G11 Mab 및 이 항체의 다양한 키메라 및 인간화 버전의 효과

ATCC로부터 구입한 NCI-H441 세포는 10% FCS (인비트로겐사), 1% L-글루타민 (인비트로겐사)이 보충된 RPMI 1640 배지 (인비트로겐사, 영국 스코틀랜드)에서 일상적으로 배양되었다. 증식 분석법을 위해, 세포는 사용하기 3일 전에 분주되어 도말하기 전에 성장이 충만한 단계에 있었다. NCI-H441 세포는 200μl의 무혈청 배지 (1% L-글루타민이 보충된 RPMI 1640 배지)를 사용하여 3.75 x 10⁴ 세포/웰의 밀도로 96-웰 조직배양 플레이트에 도말되었다. 도말하고 24시간 이후에 테스트될 항체가 NCI-H441 세포에 첨가되었으며 HGF가 400 ng/ml (5 nM)의 최종 농도로 추가로 142 시간 동안 첨가되기 이전에 37℃에서 30분 동안 배양되었다. 각 항체의 경우에 테스트되는 용량 범위는 10으로부터 0.0097 μg/ml (각 웰의 최종 농도)까지이다. 이 실험에서, 마우스 IgG1 Mab는 마우스 이소형 대조군으로서 또한 작동제 음성 대조군으로서 첨가되었다. 테스트된 항체는 하기의 것이었다: i) m224G11, ii) [224G11]킴, [224G11] [MH 킴], [224G11][MUP9H 킴], [224G11][MMCH 킴], [224G11][TH7 킴][Hz2]으로서 각각 확인된 그의 인간 IgG1 키메라 형태, iii) [224G11][Hz1], [224G11][Hz2], [224G11][Hz3]로서 각각 기술되는 그의 인간화 IgG1 형태. -/+ HGF의 세포 단독으로 도말된 웰도 역시 포함되었다. 하이브리도마 세포주로서 ATCC에서 시판하며 제넨테크사로부터 얻은 5D5 전체 항체가 완전한 작동제 양성 대조군으로서 도입되었고 이후에 m5D5라고 명명되었다. 그 다음, 세포는 0.25 μCi의 [³H] 티미딘 (에머샴 바이오사이언스 AB사, 스웨덴 웁살라)로 7시간 30분 동안 펄스처리되었다. 트리클로로아세트산-불용성 DNA에 도입된 [³H] 티미딘의 크기는 액체 신틸레이션 계수법에 의해 정량되었다. 결과는 항-c-Met Mabs가 단독으로 종양세포에 첨가되었을 때 일어날 수 있는 잠재적인 내재적 작동제 활성을 더 잘 평가하기 위하여 변환되지 않은 cpm 데이타로서 표현된다.

도 9A에 기술된 결과는 예측된 바와 같이, 이소형 대조군 또는 m224G11 어느 것도 NCI-H441 증식에 전혀 작동제 활성을 나타내지 않았다. 이소형 대조군은 HGF-유도성 세포 증식에 효과가 없었던 반면, m224G11은 10μg/ml의 최종 농도로 첨가되었을 때 66% 저해를 보여주었다. 작동제 대조군으로서 사용된 m5D5는 예측된 바와 같이, 단독으로 세포에 첨가되었을 때 완전한 용량 의존적 작동제 효과를 보여주었다. 이미 관찰된 바와 같이, [224G11]킴 Mab는 유의한 용량-의존적 작동제 효과를 나타내었고, 이 키메라 형태의 감소된 저해 활성이 관찰되었다: 마우스 형태의 경우의 66% 대신에 19%. 3가지의 IgG1 인간화 Mabs는 단독으로 첨가되었을 때, m224G11 형태에 비하여 용량 의존적 작동제 효과를 나타내었다. [224G11][Hz1], [224G11][Hz2] 및 [224G11][Hz3]은 약 46, 30 및 35%로 비교가능한 길항 활성을 가졌다. 이들 활성은 m224g11의 경우에서 관찰되는 것보다 유의하게 더 낮은 것이었다. 도 9B에서, 다양한 IgG1 키메라 형태가 테스트되었다. 단독으로 NCI-H441 세포에 첨가되었을 때 용량-의존적 작동제 효과를 나타내었던 [224G11}킴에 비하여, [224G11][MH 킴], [224G11][MUP9H 킴], [224G11][MMCH 킴], [224G11][TH7 킴] 형태는 유의한 내재적 작동제 효과가 없었다. 그들의 길항제 활성은 m224G11 Mab의 경우에 관찰되는 것 (57%)보다 더 높고, 저해는 [224G11][MH 킴], [224G11][MUP9H 킴], [224G11][MMCH 킴] 및 [224G11][TH7 킴]의 경우에서 각각 79, 78, 84 및 83%에 이르렀다.

실시예 9: 224G11 Mab의 다양한 IgG1 키메라 및 인간화 형태의 시험관내 효과

ATCC로부터 구입한 NCI-H441 세포는 10% FCS (인비트로겐사), 1% L-글루타민 (인비트로겐사)이 보충된 RPMI 1640 배지 (인비트로겐사, 영국 스코틀랜드)에서 일상적으로 배양되었다. 증식 분석법을 위해, 세포는 사용하기 3일 전에 분주되어 도말하기 전에 성장이 충만한 단계에 있었다. NCI-H441 세포는 200μl의 무혈청 배지 (1% L-글루타민이 보충된 RPMI 1640 배지)를 사용하여 3.75 x 10⁴ 세포/웰의 밀도로 96-웰 조직배양 플레이트에 도말되었다. 도말하고 24시간 이후에 테스트될 항체가 NCI-H441 세포에 첨가되었으며 HGF가 400 ng/ml (5 nM)의 최종 농도로 추가로 142 시간 동안 첨가되기 이전에 37℃에서 30분 동안 배양되었다. 각 항체의 경우에 테스트되는 용량 범위는 10으로부터 0.0097 μg/ml (각 웰의 최종 농도)까지이다. 이 실험에서, 마우스 IgG1 Mab는 작동제 활성을 위한 기저값 음성 대조군으로서 첨가되었고 테스트된 항체는 하기의 것이었다: i) m224G11, ii) [224G11]킴, [224G11][TH7 킴]으로서 각각 확인된 그의 인간 IgG1 키메라 형태, iii) [224G11][TH7 Hz1], [224G11][TH7 Hz3]로서 각각 기술되는 그의 인간화 IgG1 형태. -/+ HGF의 세포 단독으로 도말된 웰도 역시 포함되었다. 하이브리도마 세포주로서 ATCC에서 시판하며 제넨테크사로부터 얻은 5D5 전체 항체가 완전한 작동제 양성 대조군으로서 도입되었고 이후에 m5D5라고 명명되었다. 그 다음, 세포는 0.25 μCi의 [³H] 티미딘 (에머샴 바이오사이언스 AB사, 스웨덴 웁살라)로 7시간 30분 동안 펄스처리되었다. 트리클로로아세트산-불용성 DNA에 도입된 [³H] 티미딘의 크기는 액체 신틸레이션 계수법에 의해 정량되었다. 결과는 항-c-Met Mabs가 단독으로 종양세포에 첨가되었을 때 일어날 수 있는 잠재적인 내재적 작동제 활성을 더 잘 평가하기 위하여 변환되지 않은 cpm 데이타로서 표현된다.

도 10은 m224G11 Mab가 보통의 저해 효과 (74% 저해)를 나타내는 것을 보여주었다. 키메라 IgG1 형태 [224G11]킴은 예측된 바와 같이 용량 의존적 내재적 작동제 효과를 또한 마우스 형태에 비하여 더 낮은 길항제 효과를 가졌다: 33% 대비 74% 저해. [224G11][TH7 킴]은 이 실험에서 매우 낮은 작동제 활성을 가졌다. 또한, 그것은 마우스 Mab의 경우에 관찰되는 것과 근접한 높은 저해 효과 (81%)를 나타내었다. 2가지 인간화 형태는 내재적 작동제 효과가 전혀 없었고 마우스 Mab 또는 [224G11][TH7 킴]의 경우에서 관찰되는 것과 근접하게 [224G11][TH7 Hz1] 및 [224G11][TH7 Hz3]에 대해 각각 67 및 76%의 길항제 활성을 보유하였다.

실시예 10: 조작된 [TH7] 힌지 부위에 대한 이소형 변환

인간 IgG1이 아닌, 면역글로불린 이소형 골격 (backbones) 내에서

에 해당하는 [TH7] 힌지 서열에 의해 유도되는 약리학적 특성의 조절을 평가하기 위하여, 우리는 상기 기술된 [TH7] 서열을 인간 IgG2 및 IgG4 골격 내로 유전적으로 이전시켰다. 힌지 부위의 변형은 [TH7] 변형을 보유하는 동등한 부분에 의해 {Nhe1-Bcl1} 제한효소 단편을 교환시킴에 의해 수행되었고, {Nhe1-Bcl1} 단편은 광범위 유전자 합성법 (진큐스트사, LU)에 의해 합성되었다. 클로닝 단계는 실험실 매뉴얼 (Sambrook and Russel, 2001)에 기술된 바와 같이 통상적인 분자생물학 기법에 따라 또는 제조사의 지침서에 따라 수행되었다. 각 유전적 작제물은 빅 다이 터미네이터 사이클 서열결정 키트 (어플라이드 바이오시스템사, 미국)를 사용하는 뉴클레오타이드 서열결정에 의해 전적으로 확인되었고 3100 유전적 분석기기 (어플라이드 바이오시스템사, 미국)를 사용하여 분석되었다. 그 결과 나온 서열은 TH7-조작된 인간 IgG2 및 IgG4 이소형 (중쇄의 경우만 해당함, 경쇄는 다른 모든 IgG1-기초한 작제물에 사용되는 c224G11/인간 C카파와 일치하였다)의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열 각각에 대해 서열번호 78, 79, 80 및 81로서 기술된다. 이들 새로운 작제물은 실시예 2에서 상기 기술된 바와 같이 키메라 224G11 항-c-Met에 적용되었다.

이에 해당하는 조작된 항체 c224G11[IgG2TH7] 및 c224G11[IgG4TH7]가 상기 기술된 바와 같이 현탁 배양-적응된 HEK293 EBNA 세포에서 일시적 발현에 의해 생산되었다.

실시예 11: 포스포 -c- Met -특이적 엘라이자 분석법 및 BRET 분석법에서 조작된 Mabs c224G11[IgG2TH7] 및 c224G11[IgG4TH7]의 평가

TH7 힌지는 또한 IgG2 및 IgG4 키메라 224G11 Mabs 상에도 도입되었고 c-Met 수용체 인산화 분석법에서 테스트 되었다. 도 14A 및 도 14B에서 나타난 바와 같이, c224G11[IgG2TH7] 및 c224G11[IgG4TH7]는 희미한 작동제 효과만을 단독으로 유도하였지만 c224G11 Mab 보다는 유의하게 더 약하였고, 224G11 Mab의 마우스 형태 (m224G11)와 비교가능한 길항제 효과를 나타내었다. 이 결과는 c-Met 활성화 BRET 모델 (도 15) 상에서 확인되었고, 여기서도 c224G11[IgG2TH7] 및 c224G11[IgG4TH7]가 역시 c224G11 Mab보다 더 약한 작동제인 것을 보여주었다.

따라서, IgG2 또는 IgG4 Mab 포맷 상에 도입된 TH7 힌지 돌연변이는 c224g11[TH7]과 유사한 특성을 가진 기능적 항체를 제공하였다.

실시예 12: 세포 부착 분석법

PC3 전립선암 세포가 트립신을 사용하여 디쉬로부터 탈착되었고 무혈청 F13K 배지를 사용하여 3번 세척되었으며 동일한 배지에서 재현탁되었다. 세포 (100,000 세포/웰)는 1 μg/ml 농도의 라미닌 1으로 코팅된 96-웰 플레이트 상에 도말되었다. 테스트될 항-CD151 Mab의 하기 형태가 10 μg/ml의 최종 농도로 동시적으로 첨가되었다: 마우스 IgG1 Mab m214B2, c214B2라고 불리는 변형되지 않은 키메라 IgG1 항체 형태, 및 cTH7-214B2라고 불리는 TH7 변형을 가진 키메라 IgG1 항체 형태.

CD151은 테트라스패닌 패밀리에 속하는 막 단백질이고 2008년 2월 21일자로 CNCM에 기탁된 하이브리도마 제 I-3919호에 의해 생산되는 항-CD151 Mab 214B2가 발행된 국제특허출원 제 WO 2009/136070호에 기술되어 있다.

마우스 및 인간 IgG1 항체가 이소형 대조군 항체로서 사용되었다. 최종 조건은 하기와 같았다: 100,000 세포/웰 및 10 μg/ml에서의 항체. 37℃에서 한 시간 동안 배양한 이후에, 플레이트를 털어버렸고 무혈청 F12K 배지를 사용하여 두 번 세척하였다. 분석법 이전에 100 μl의 무혈청 F12K 배지가 각 웰에 배분되었다. 세포 부착 상에서의 항체의 효과를 평가하기 위하여, 웰을 위상차 현미경 하에서 사진을 찍었다 (도 16). 그 다음 부착된 세포의 숫자가 ATP 분석법을 사용하여 결정되었다 (도 17).

마우스 214B2 및 키메라 TH7-214B2 항체는 세포-대-세포 상호작용을 변형시키고 (도 16) 동등하게 PC3 세포 부착을 증가시킬 수 있었던 (도 17) 반면, 인간 IgG1 이소형 대조군 항체와 비교가능하였던 214B2의 변형되지 않은 키메라 형태 (c214B2)로는 아무런 효과가 관찰되지 않았다.

[수탁번호]

기탁기관명 : 미생물 배양의 수집기관 (CNCM, 프랑스 파스퇴르 연구소)

수탁번호 : CNCM03724

수탁일자 : 20070314

수탁번호 : CNCM03731

수탁일자 : 20070314

수탁번호 : CNCM03732

수탁일자 : 20070314

수탁번호 : CNCM03919

수탁일자 : 20080221

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Met Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 79 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificial modified hinge region <400> 79 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ala Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ser Leu Gly Glu Ser Leu Asp Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Lys Pro Asn Asn Gly Leu Ala Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Glu Ile Thr Thr Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ala Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Cys His 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 80 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificial modified hinge region <400> 80 gaggtccagc tgcagcagag cgggccagaa ctggttaaac ctggcgccag cgtgaagatt 60 agctgtaaga ccagcggtta catctttaca gcatatacca tgcactgggt gaggcagagt 120 ctgggggaat ctctggactg gatcggaggt attaagccca acaatggcct ggctaactat 180 aatcaaaaat tcaagggcaa agccacactg accgtcgata agtcctcttc cacagcttac 240 atggatctga gaagcctgac atccgaggac agtgcagtgt actactgcgc ccggtctgag 300 atcactaccg agttcgacta ttggggacag ggcactgcac tgaccgtctc ctccgccagc 360 accaagggcc caagcgtgtt cccgctagcc ccctgcagca gaagcaccag cgagagcaca 420 gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt gtcttggaac 480 agcggagccc tgaccagcgg cgtgcacacc tttccagccg tgctgcagag cagcggcctg 540 tacagcctga gcagcgtggt gacagtgccc agcagcaact tcggcaccca gacctacacc 600 tgtaacgtgg accacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaccgtgga gcccaagagc 660 tgcgattgcc actgcccccc ttgtcctgct cctcctgtgg ccggacccag cgtgttcctg 720 ttccccccaa agcccaagga caccctgatg atcagccgga cccccgaagt gacctgcgtg 780 gtggtggacg tgtcccacga ggaccccgag gtgcagttca attggtacgt ggacggcgtg 840 gaggtgcaca acgccaagac caagccccgg gaggaacagt tcaacagcac cttccgggtg 900 gtgtccgtgc tgaccgtggt gcaccaggac tggctgaacg gcaaagagta caagtgcaag 960 gtctccaaca agggcctgcc tgcccccatc gagaaaacca tcagcaagac caagggccag 1020 cctcgggagc ctcaggtgta caccctgccc cccagccggg aggaaatgac caagaaccag 1080 gtgtccctga cctgtctggt gaaaggcttc taccccagcg atatcgccgt ggagtgggag 1140 agcaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc ccatgctgga cagcgacggc 1200 agcttcttcc tgtactccaa actgaccgtg gataagagcc ggtggcagca gggcaacgtg 1260 ttcagctgca gcgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gtccctgagc 1320 ctgagccccg gcaaatga 1338 <210> 81 <211> 1341 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> artificial modified hinge region <400> 81 gaggtccagc tgcagcagag cgggccagaa ctggttaaac ctggcgccag cgtgaagatt 60 agctgtaaga ccagcggtta catctttaca gcatatacca tgcactgggt gaggcagagt 120 ctgggggaat ctctggactg gatcggaggt attaagccca acaatggcct ggctaactat 180 aatcaaaaat tcaagggcaa agccacactg accgtcgata agtcctcttc cacagcttac 240 atggatctga gaagcctgac atccgaggac agtgcagtgt actactgcgc ccggtctgag 300 atcactaccg agttcgacta ttggggacag ggcactgcac tgaccgtctc ctccgccagc 360 accaagggcc caagcgtgtt cccgctagcc ccctgcagca gaagcaccag cgagagcaca 420 gccgccctgg gctgcctggt gaaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt gtcttggaac 480 agcggagccc tgaccagcgg cgtgcacacc tttccagccg tgctgcagag cagcggcctg 540 tacagcctga gcagcgtggt gacagtgcct agcagcagcc tgggcaccaa gacctacacc 600 tgtaacgtgg accacaagcc cagcaacacc aaggtggaca 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Claims

항체는 특이 표적 분자의 생물학적 활성의 하나 이상을 저해할 수 있고, 방법은 적어도 하나의 아미노산 결실 (deletion), 부가 (addition) 또는 치환 (substitution)에 의해 힌지 부위 (hinge region)의 아미노산 서열을 변형 (modification)시키는 것으로 이루어지는 상기 힌지 부위의 입체 재형성 (reconfiguration) 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 특이 표적 분자에게로 유도되는 모노클론 항체, 또는 그의 이가 (divalent) 기능적 단편 또는 유도체의 길항 활성 (antagonistic activity)을 개선시키는 방법.
제 1항에 있어서,
상기 변형은
i) 상기 힌지 부위 아미노산 서열의 적어도 하나 아미노산의 결실; 및/또는
ii) 상기 힌지 부위 내로 적어도 하나의 디설파이드 연결의 부가:
로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서,
상기 변형 i)은 상기 힌지 부위 아미노산 서열의 많아야 2개, 3개 또는 4개의 아미노산의 결실로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서,
상기 모노클론 항체는 이가 항체 (divalent antibody)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서,
상기 모노클론 항체는 키메라 항체 (chimeric antibody)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서,
상기 모노클론 항체는 인간화 항체 (humanized antibody)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서,
상기 모노클론 항체는 인간 항체 (human antibody)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 7항의 어느 한 항에 있어서,
상기 모노클론 항체는 IgG1인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 8항의 어느 한 항에 있어서,
상기 표적 분자는 막통과 수용체 (transmembrane receptor)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서,
상기 막통과 수용체는 타이로신 키나제 수용체 (tyrosine kinase receptors), 테트라스패닌 (tetraspanins) 및 GPCRs로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 10항의 어느 한 항에 있어서,
상기 변형은 적어도 H1, H2, H3, H5, H6, H7, H8, H9, H11, H12 또는 H14 위치에서의 아미노산으로부터 선택된 아미노산의 결실로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 10항의 어느 한 항에 있어서,
상기 변형은 적어도 상기 힌지 아미노산 서열의 H1 및 H9 위치 사이에 위치하는 "상부 힌지 (upper hinge)" 부위에서의 아미노산의 결실로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 12항의 어느 한 항에 있어서,
상기 변형은 "상부 힌지" 부위, 바람직하게는 H4 위치에 위치하는 부위 내에 적어도 하나의 시스테인 (Cysteine) 결실로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 12항의 어느 한 항에 있어서,
상기 변형은 "상부 힌지" 부위 내로 적어도 하나의 시스테인 도입으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서,
상기 변형은 "상부 힌지" 부위 내로 시스테인에 의한 H7 위치에서의 트레오닌 (Threonine)의 치환으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서,
상기 변형은 "상부 힌지" 부위 내로 시스테인에 의한 H6 위치에서의 라이신 (Lysine)의 치환으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서,
상기 변형은 "상부 힌지" 부위 내로 시스테인에 의한 H1 위치에서의 프롤린 (Proline)의 치환으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서,
상기 변형은 "상부 힌지" 부위 내로 시스테인에 의한 H2 위치에서의 라이신의 치환으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서,
상기 변형은 "상부 힌지" 부위 내로 시스테인에 의한 H3 위치에서의 세린 (Serine)의 치환으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서,
상기 변형은 "상부 힌지" 부위 내로 시스테인에 의한 H5 위치에서의 아스파테이트 (Aspartate)의 치환으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서,
상기 변형은 "상부 힌지" 부위 내로 시스테인에 의한 H8 위치에서의 히스티딘 (Histidine)의 치환으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서,
상기 변형은 "상부 힌지" 부위 내로 시스테인에 의한 H9 위치에서의 트레오닌의 치환으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 10항의 어느 한 항에 있어서,
상기 변형은 항체의 길항 활성을 개선시킬 것으로 기대되는 상기 모노클론 항체가 IgG1일 때, IgG2 힌지 부위의 아미노산 H1 내지 H14에 의한 IgG1 힌지 부위의 아미노산 H1 내지 H14의 대체로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
항체는 특이 표적 분자의 하나 이상의 생물학적 활성을 저해할 수 있고, 방법은
(a) 상기 표적 분자의 상기 하나 이상의 생물학적 활성의 초기 저해 수준을 가진 초기 항체를 선별하고,
(b) 제 1항 내지 제 23항의 어느 한 항의 방법에 의해 상기 초기 항체의 힌지 부위의 아미노산 서열을 변형시키고,
(c) 단계 (b)의 변형된 항체를 상기 표적 분자의 상기 하나 이상 생물학적 활성을 저해하는 그의 능력에 대해 평가하고, 또한
(d) 단계 (c)의 항체는 양성 결과로서, 상기 초기 저해 수준보다 높은, 상기 표적 분자의 상기 하나 이상 생물학적 활성의 저해 수준으로 선별하는:
단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 특이 표적 분자에게로 유도되는 길항적 모노클론 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체에 대해 검색하는 방법.
제 1항 내지 제 24항의 어느 한 항의 방법에 의해 획득될 수 있고,
서열번호 1

서열번호 2

서열번호 3

서열번호 4

서열번호 5

서열번호 6

서열번호 7

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서열번호 48

또는 서열번호 49

로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 힌지 부위 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 특이 표적 분자에게로 유도되는 모노클론 항체, 또는 그의 이가 기능적 단편 또는 유도체.
서열번호 1

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서열번호 45

서열번호 46

서열번호 47

서열번호 48

또는 서열번호 49

로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 모노클론 항체.
제 25항 또는 제 26항에 있어서,
상기 항체는 인간 항체인 것을 특징으로 하는 모노클론 항체.
제 25항 내지 제 27항의 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 IgG1 항체인 것을 특징으로 하는 모노클론 항체.
제 25항 내지 제 28항의 모노클론 항체를 인코딩하는 분리된 핵산.
제 29항에 있어서,
상기 핵산은 서열번호 15 내지 서열번호 21 및 서열번호 50 내지 서열번호 77로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.