BRPI0923228A2 - processo para a modulação da atividade antagonista de um anticorpo monoclonal. - Google Patents

Abstract

PROCESSO PARA A MODULAÇÃO DA ATIVIDADE ANTAGONISTA DE UM ANTICORPO MONOCLONAL. A presente invenção refere-se ao campo da engenharia de anticorpos e, mais especificamente, a um processo para o rastreamento de anticorpos e/ou para modulação da atividade agonista/antagonista de anticorpos. Mais especificamente, a presente invenção diz respeito a um processo para melhorar a atividade antagonista de um anticorpo monoclonal direcionada contra uma molécula-alvo especifica ou um fragmento funcionaçl divalente ou derivado do mesmo , o referido anticorpo sendo capaz de inibir uma ou mais das atividades biológicas da referida molécula-alvo, em que o referido processo compreende um estágio de reconfiguração da região de articulação, consistindo em uma modificação da sequência de aminoâcidos da referida região articulação pela deleção, pela adição ou pela substituição de pelo menos um aminoâcido. A presente invenção refere-se também a polipetídeos úteis para tal método de modulação e aos anticorpos obtidos.

Description

. Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO i PARA A MODULAÇÃO DA ATIVIDADE ANTAGONISTA DE UM ANTICORPO ” MONOCLONAL".

A presente invenção refere-se ao campo da engenharia de anti- l 5 corpose,mais especificamente, a um processo para o rastreamento de anti- corpos e/ou a modulação da atividade agonista/antagonista de anticorpos. Mais especialmente, a presente invenção diz respeito a um método para a modulação da atividade antagonista de um anticorpo monocional ou de um fragmento funcional divalente ou derivado deste por engenharia genética. À invenção refere-se também a polipeptídeos úteis para tal método de modu- lação e aos anticorpos obtidos.

Os termos "anticorpo", "anticorpos" ou "imunoglobulina" são utili- zados alternadamente no sentido mais amplo possível e incluem anticorpos monoclonais (por exemplo, anticorpos monocionais completos ou intactos), anticorpos policlonais, anticorpos multivalentes ou anticorpos multiespecífi- cos (por exemplo, anticorpos biespecíficos desde que exibam a atividade biológica desejada).

Mais especialmente, tal molécula consiste em uma glicoproteína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (LD) interconectadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada é formada por três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é formada por uma região variável de cadeia leve (neste relatório descritivo, abreviada em LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. À região constante da cadeia — leveé formada por um único domínio, CL. As regiões da VH e da VL podem ainda ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regi- ões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de arcabouço (framework, FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas, a partir do amino terminal para o carbóxi terminal, na seguinte ordem: FR1, CDR1,FR2, CDR2, FR3, CDR3, FRA4. As regiões variáveis das cadeias pe- sada e leve contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem atuar na mediação da ligação

“ da imunoglobulina a tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias célu- í las do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componen- À te (Cla) do sistema complemento clássico.

As cadeias pesadas de imunoglobulinas podem ser divididas em Á 5 trêsregiões funcionais: a região Fd, a região de articulação (de articulação), a região Fc (fragmento cristalizável) que estão conectadas por uma região de articulação flexível. A região Fd compreende os domínios VH e CH1 e, combinada com a cadeia leve, forma Fab — o fragmento de ligação a antíge- nos. O fragmento Fc é responsável pelas funções efetorás da imunoglobuli- na,as quais incluem, por exemplo, fixação de complemento e ligação a re- ceptores Fc cognatos de células efetoras. A região de articulação, encontra- da em imunoglobulinas das classes IgG, IgA e IgD, atua como espaçador flexível que permite que a porção Fab se mova livremente em termos espa- ciais relativamente à região Fc. Em contraste às regiões constantes, o domí- nio de articulação é estruturalmente diverso, variando em sequência e em extensão entre classes e subclasses de imunoglobulinas.

De acordo com estudos de cristalografia, a região de articulação de imunoglobulinas pode ser ainda subdividida estrutural e funcionalmente em três regiões: a região de articulação superior, a central e a de articulação inferior (Shin et al., Immunological Reviews 130:87, 1992). A região de arti- culação superior inclui aminoácidos da extremidade carboxila da CH1 até o primeiro resíduo da articulação que restringe a movimentação, geralmente o primeiro resíduo cisteína que forma uma ligação dissulfeto intercadeia entre as duas cadeias pesadas. A extensão da região de articulação superior cor- relaciona-se com a flexibilidade segmentar do anticorpo. A região de articu- lação central contém pontes dissulfeto entre cadeias pesadas. A região de articulação inferior une a extremidade amino terminal e inclui resíduos do domínio CH2. A região de articulação central da I/G1 humana contém a se- quência Cys-Pro-Pro-Cys que, quando dimerizada por formação de ligações dissulfeto, resulta em um octapeptídeo cíclico que supostamente atua como pivô, conferindo dessa forma a flexibilidade. Alterações conformacionais, permitidas pela estrutura e a flexibilidade da sequência polipeptídica da regi-

. ão de articulação da imunoglobulina, pode afetar as funções efetoras da por- í ção Fc do anticorpo. . e Em geral, para preparar anticorpos monoclonais ou seus frag- mentos funcionais, é possível fazer referência a técnicas que estão descritas Ú 5 em especialno manual "Antibodies" (Harlow and Lane, Antibodies: A Labo- ratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 726, 1988) ou a técnica de preparo a partir de hibridomas, descrita por Ko- hler e Milstein (Nature, 256:495-497, 1975). Em seguida, os anticorpos mo- noclonais, podem, por exemplo, ser purificados em coluna de afinidade na qualo receptor de interesse ou um de seus fragmentos contendo o epítopo especificamente reconhecido pelos referidos anticorpos monoclonais que foram previamente imobilizados. Mais especificamente, os referidos anticor- pos monoclonais podem ser purificados por cromatografia em proteína A e/ou G, seguido ou não por cromatografia por troca iônica visando eliminar os contaminantes proteicos residuais, bem como o DNA e a LPS, esta se- guida ou não por cromatografia por exclusão em gel Sepharose a fim de eli- minar os agregados potencialmente causados pela presença de dímeros ou outros multímeros. Em maneira ainda mais preferida, todas estas técnicas podem ser utilizadas simultânea ou sucessivamente.

Por fragmento funcional de um anticorpo de acordo com a in- venção, entende-se indicar especificamente um fragmento de anticorpo, tal como Fv, scFv (sc significando cadeia única), Fab, F(ab')2, Fab', fragmentos scFv-Fc ou diabodies ou qualquer fragmento cujo tempo de meia-vida tives- se sido aumentado por modificação .química, como a adição de po- liçalquileno) glicol, por exemplo, poli(etileno)glicol ("PEGuilação") (fragmen- tos pequilados denominados Fv-PEG, scFV-PEG, Fab-PEG, F(ab').-PEG ou Fab-PEG) ("PEG" significando Poli(Etileno)Glicol), ou por incorporação em lipossomo, os referidos fragmentos contendo pelo menos uma das CDRs características do anticorpo original.

De preferência, estes fragmentos funcionais serão fragmentos Fv, scFv, Fab, F(ab')2, Fab', do tipo scFv-Fc ou diabodies, os quais exibem geralmente a mesma especificidade de ligação que o anticorpo do qual des-

. cendem. De acordo com a presente invenção, fragmentos de anticorpos da á invenção podem ser obtidos a partir de anticorpos, tais como descritos aci- o ma, por métodos como digestão por enzimas, tais como tripsina ou papaína, ' e/ou por clivagem das pontes dissulfeto por redução química. Em outra ma- neira, os fragmentos de anticorpos, incluídos na presente invenção, podem ser obtidos por técnicas de recombinação genética igualmente bem conheci- dos daqueles versados no estado da técnica, ou então por síntese de pepti- deos por meio de, por exemplo, sintetizadores automáticos de peptídeos como aqueles fornecidos pela empresa Applera, etc.

O termo "antagonista", neste relatório descritivo, refere-se a uma molécula que é capaz de inibir uma ou mais das atividades biológicas de uma molécula-alvo, tal como um receptor extracelular ou transmembrana. Antagonistas podem atuar interferindo com a ligação de um receptor a um ligante e vice-versa, diminuindo a fosforilação de receptores e/ou incapaci- tando ou eliminando células que foram ativadas por um ligante. O antagonis- ta pode bloquear completamente interações entre receptor e ligante ou po- dem reduzir substancialmente estas interações por competição, alteração de conformação, blindagem ou regulação negativa. Todos esses pontos de in- tervenção, por um antagonista, serão considerados equivalentes para fins destainvenção.

O termo "agonista", neste relatório descritivo, refere-se a qualquer composto, incluindo proteína, polipeptídeo, peptídeo, anticorpo, fragmento de anticorpo, conjugado, grande molécula, pequena. molécula, capaz de ati- var-uma ou mais das atividades de uma molécula-alvo.

Na pesquisa de anticorpos terapêuticos, é frequentemente espe- rado obter anticorpos como antagonistas tanto quanto possível.

Exemplos clássicos de anticorpos antagonistas são Herceptina, Pertuzumabe, Cetuximabe, anticorpos anti- VEGFR ou anti-|GF-1R.

A título de exemplo específico, pode ser citado o anticorpo anti- c-Met5D5, gerado pela Genentech [WO 96/38557], que se comporta como potente agonista quando adicionado isoladamente em vários modelos. A fim de solucionar essa questão técnica, este anticorpo teve que ser engenheira-

. do como fragmento Fab ou em forma de anticorpo monovalente (com um á braço 5D5) para que exibisse atividade antagonista. Em consequência, este é anticorpo não pode ser considerado anticorpo, porém um fragmento, e não : apresenta todas as vantagens oferecidas pelo formato de "anticorpo comple- to” (sem funções efetoras, menor clearance (depuração) e meia-vida mais curta [2 vezes mais rápido do que anticorpos bivalentes tradicionais, como descrito em Pôster 411 no 20º simpósio EORTC-NCI-AACR, Genebra, 21-24 de outubro, 2008)).

O técnico versado no assunto reconhecerá que funções efetoras incluem, por exemplo, ligação a Clq; citotoxidade dependente de comple- mento (ADCC); fagocitose e regulação negativa de receptores de superfície de células (por exemplo, receptor de células B; BCR) e prolongamento de meia-vida pela incorporação do ligante de salvamento de ligação a receptor (FcRn), como descrito em; por exemplo, Patente U.S. Nº 5 739 277, conce- didaem 14 de abril de 1998.

Um dos aspectos inventivos da presente invenção é solucionar estas questões técnicas, ou seja, melhorar a atividade antagonista de um anticorpo, ao mesmo tempo em que preservando um formato "divalente completo".

Cabe mencionar neste relatório descritivo que a invenção pode ser aplicada para modular a atividade agonista/antagonista de anticorpos humanos, obtidos por imunização de "camundongos humanos" (camundon- gos geneticamente modificados que produzem imunoglobulinas humanas) ou usando técnicas de exibição em fagos para construir anticorpos comple- tosa partirde fragmentos scFV, Fab ou quaisquer outros selecionados.

Outra dificuldade técnica clássica pode ser encontrada durante a quimerização e/ou humanização de um anticorpo murino. É fato bem conhe- cido pelo técnico versado no assunto que, apesar de o processo de quimeri- zação e/ou humanização de um anticorpo murino ser bem fácil em teoria, não é fácil controlar a quimerização e/ou humanização deste anticorpo muri- no sem a Perda total ou parcial das propriedades iniciais. O anticorpo quimé- rico ou humanizado pode perder parte de suas atividades de ADCC, CDC,

. antagonista/agonista, de ligação, (TBC), etc. A presente invenção diz respei- to, mais especialmente, à modificação de atividade agonista/antagonista de á um anticorpo murino após um processo de quimerização e/ou humanização. ! A título de exemplo específico, um conjunto de anticorpos anti- cMet a seguir descritos como 224G11, 2274H1 e 11E1, que se comportam como potentes anticorpos antagonistas murinos, tornaram-se agonistas par- ciais quando quimerizados em formato de I9G1 humana. Esse deslocamento de potentes antagonistas para agonistas parciais resultou em perda comple- ta de atividade in vivo em modelos de xenoenxertos.

A presente invenção pretende solucionar estas dificuldades e re- fere-se, mais especificamente, a um processo para melhorar a atividade an- tagonista de um anticorpo monoclonal direcionado contra uma molécula-alvo específica, ou fragmento funcional divalente ou derivado deste, o referido anticorpo sendo capaz de inibir uma ou mais das atividades biológicas da referida molécula-alvo, em que o referido processo compreende um estágio de reconfiguração da região de articulação, consistindo em uma modificação da sequência de aminoácidos da referida região de articulação pela deleção, a adição ou a substituição de pelo menos um aminoácido.

É evidente que a expressão "melhorar a atividade antagonista" deve ser interpretada em seu sentido mais amplo possível, ou seja, em ter- mos de o resultado desejado. No contexto de mecanismo, este resultado pode ser obtido por melhora da atividade antagonista intrínseca e/ou redu- ção da atividade agonista intrínseca de um anticorpo. Mais especificamente, definições básicas de termos em farma- —cologia quantitativa têm como base as recomendações atualizadas forneci- das pelo Comitê da /nternation Union of Pharmacology (IUPHAR) sobre No- menclatura de receptor (consultar Neubig et a/, 2003).

O termo "agonista" representa um ligante (qualquer tipo de mo- lécula) que se liga a um receptor e altera o estado do receptor, resultando em resposta biológica estimuladora ou aumentada. Agonistas podem atuar como agonistas completos ou agonistas parciais: - Agonista completo: quando o estímulo do receptor, induzido por um agonis-

. ta, atinge a capacidade máxima de resposta do sistema, em seguida, este | produzirá a resposta máxima do sistema e será um agonista completo na- á quele sistema. Diversos agonistas podem provocar a mesma resposta má- . xima, todos são agonistas completos naquele sistema experimental.

-Agonista parcial: uma molécula que em determinado tecido, sob condições especificadas, não é capaz de provocar um efeito tão grande (mesmo quan- do aplicado em alta concentração, de modo que todos os receptores estejam ocupados) como um agonista completo atuando através dos mesmos recep- tores no mesmo sistema. Agonistas parciais são em geral também antago- nistas parciais uma vez que, na presença de um agonista completo, redu- zem a resposta máxima do referido agonista completo para a sua própria resposta máxima. Essa designação de agonista completo em comparação a parcial é dependente do sistema, e um agonista completo para um sistema ou mensuração pode ser agonista parcial em outro.

O termo "antagonista" representa uma molécula que reduz a a- ção de outro fármaco, em geral agonista. Muitos antagonistas atuam, na mesma macromolécula do receptor, como o agonista. í - A eficácia do antagonismo pode ser de antagonismo completo, quando a resposta do sistema na copresença do antagonista e do agonista corresponde à atividade basal (sem qualquer ligante) do sistema. .

- Um antagonista pode atuar como antagonista parcial quando a inibição máxima (mesmo quando aplicado em alta concentração, de modo que todos os receptores estejam ocupados pelo antagonista) provocada pela copresença do antagonista e do agonista é acima da atividade basal do sis- tema.

- O antagonismo pode ser competitivo quando a ligação do ago- nista e do antagonista se excluem mutuamente. Isso pode ser porque o ago- nista e o antagonista competem pelo mesmo sítio de ligação ou se combi- nam com sítios adjacentes que se sobrepõem. Uma terceira possibilidade é ade que diferentes sítios estão envolvidos, porém estes influenciam a ma- cromolécula do receptor em tal maneira que as moléculas agonistas e anta- gonistas não são capazes de se ligar ao mesmo tempo.

- - Antagonismo não competitivo é observado quando o agonista e É o antagonista podem se ligar simultaneamente ao receptor; a ligação do an- & tagonista reduz ou impede a ação do agonista sem ou com qualquer efeito H sobre a ligação do agonista.

A deleção, adição ou substituição pode ser realizada classica- mente por qualquer método conhecido por aqueles versados no estado da técnica.

Vários métodos podem ser aplicados pelo técnico no assunto para gerar adições, deleções ou inserções de DNA com DNAse pancreática, digestão parcial de DNA com enzimas de restrição, mutantes de inserções à base de ligantes, conjuntos aninhados de mutantes de deleção usando BLA31 nuclease, DNAse | ou exonuclease Ill. Estes métodos estão exten- samente descritos em manuais de laboratório tais como Molecular Cloning, A laboratory manual (Sambrook, Fritsch e Maniatis). Diversos métodos à base de PCR podem também ser empregados para gerar deleções, inser- ções ou mutagênese sítio-dirigida em molécula de DNA, PCR por extensão sobreposta (Wurch et a/, 1998), porém não se limitam a este. Para mutagê- nese sítio-dirigida, várias outras técnicas podem ser utilizadas, podendo-se mencionar, a título de exemplos, mas sem se limitar a estes, mutagênese à base de oligonucleotídeos de acordo com métodos de iniciador único ou du- * plos, o método de Kunkel à base de incorporação de uracil (Kunkel, 1985). Estes métodos estão extensamente descritos em manuais de laboratório tais como Molecular Cloning, A laboratory manual (Sambrook, Fritsch e Mania- tis). a A título de exemplo não limitativo de adição, pode-se citar a adi- ' ção de uma Prolina em ou adjacente à região de articulação. Em uma concretização preferida do processo da invenção, a re- ferida modificação é selecionada a partir de: i) a deleção de pelo menos um aminoácido da sequência de aminoácidos da referida região de articulação; e/ou ii) a adição de pelo menos uma ponte dissulfeto na referida região de articu- lação.

E No intuito de esclarecer a invenção, a primeira modalidade (i) se- ' rá detalhada primeiramente e a segunda modalidade (ii) será detalhada de- % pois. Deve ser entendido que essa ordem decorre somente da redação do . presente pedido de patente e que ambas estas modalidades, como se torna- rá evidente a seguir, são de importância semelhante.

Em uma concretização específica, uma maneira para se modifi- car a sequência de aminoácidos da região de articulação consistirá na dele- ção de no máximo 2, 3, ou 4 aminoácidos da sequência de aminoácidos da referida região de articulação.

Uma modalidade específica da invenção é a de que o referido anticorpo monoclonal é divalente. Na verdade, como visto abaixo, é possível modular a atividade agonista/antagonista de um anticorpo modificando a es- trutura do referido anticorpo. Pela primeira vez, os inventores relatam uma maneira original para modular tal atividade agonista/antagonista enquanto preservando uma forma divalente do anticorpo, visando conservar boas pro- priedades como meia-vida longa ou funções efetoras.

Pode ser mencionado também que, apesar de a modificação da região de articulação de um anticorpo monoclonal com a finalidade de au- mentar as funções efetoras já tenha sido relatada no estado da técnica ante- rior, nunca foi relatado, ao contrário, que tal modificação na região de articu- lação seria de interesse na modulação da atividade agonista/antagonista de ' um anticorpo monoclonal. Este é claramente o objeto da presente invenção, o qual é inovador e inventivo no que diz respeito ao estado da técnica exis- tente.

Como um aspecto de acordo com o processo da invenção, o an- ticorpo monoclonal é um anticorpo quimérico.

Por anticorpo "quimérico", entende-se indicar um anticorpo que contém uma região variável natural (cadeia leve e cadeia pesada), derivada de um anticorpo de uma determinada espécie, combinada com as regiões constantes da cadeia leve e pesada de um anticorpo de uma espécie heteró- loga à referida determinada espécie (por exemplo, camundongo, cavalo, coelho, cachorro, vaca, galinha, etc.).

. Os anticorpos ou seus fragmentos de tipo quimérico de acordo ' com a invenção podem ser preparados usando as técnicas de recombinação q genética. Por exemplo, o anticorpo quimérico pode ser produzido clonando : um DNA recombinante, contendo um promotor e uma sequência codificado- raparaa região variável de um anticorpo monoclonal não humano, especi- almente murino, de acordo com a invenção, e uma sequência codificadora para a região constante de anticorpo humano. Um anticorpo quimérico da invenção, codificado por tal gene recombinante, será, por exemplo, uma quimera camundongo-homem, a especificidade deste anticorpo sendo de- terminada pela região variável derivada do DNA murino e seu isotipo determi- nado pela região constante derivada do DNA humano. Para os métodos de preparo de anticorpos quiméricos, é possível, por exemplo, fazer referência aos artigos de Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988), Morrison et al. (Proc. Nat!l. Acad. Sci. USA 82:6851-6855, 1984) ou a Patente U.S. Nº 4 816 567.

Como outro aspecto de acordo com o processo da invenção, o anticorpo monoclona! é do tipo humanizado.

Por "anticorpo humanizado", entende-se indicar um anticorpo que contém regiões CDRs derivadas de um anticorpo de origem não huma- na, as outras partes da molécula do anticorpo sendo derivadas de um (ou de vários) anticorpo humano ou de sequências de linhagem germinativa. Adi- cionalmente, alguns resíduos dos segmentos do esqueleto (denominado FR) podem ser modificados de modo a ser conservada a afinidade da ligação (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al, Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et a/., Nature, 332:323-327, 1988).

Os anticorpos humanizados de acordo com a invenção ou seus fragmentos podem ser preparados por técnicas conhecidas por aqueles versa- dos no estado da técnica (tais como, por exemplo, aquelas descritas nos arti- gos de Singer ef al, J. Immun. 150:2844-2857, 1992; Mountain et al, Biotechnol. Genet Eng. Rev, 10:1-142, 1992 ou Bebbington et al, Bio/Technology, 10:169-175, 1992).

Outros métodos de humanização são conhecidos pelo técnico versado no assunto como, por exemplo, o método de "Enxerto de CDR",

. descrito pela Protein Design Lab (PDL) nos pedidos de patente EP 0 421 216, EP 0 682 040, EP O 939 127, EP O 566 647 ou US 5 530 101, US 6 180 370, 7 US 5 585 089 e US 5 693 761. Os seguintes pedidos de patente podem ser . também citados: US 5 639 641, US 6 054 297, US 5 886 152 e US 5877 293. Como outro aspecto de acordo com o processo da invenção, o anticorpo monoclona!l é anticorpo humano.

O termo "anticorpo humano" inclui todos os anticorpos que pos- suem uma ou mais regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulinas humanas. Em uma concretização preferida, todos os domínios (ou regiões) variáveis e constantes são derivados de sequência de imunoglobulina humana (anticorpo completamente humano). Em outras pa- lavras, inclui qualquer anticorpo que possua regiões variáveis e constantes (se presente) derivadas de sequências da linhagem germinativa de imuno- globulina humana, ou seja, que possuem uma sequência de aminoácidos que corresponda àquela de um anticorpo produzido por um ser humano e/ou que tenha sido feito usando quaisquer técnicas para produção de anticorpos humanos, conhecidas pelo técnico versado no assunto.

Em uma concretização, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não humano transgênico, por exemplo, camundongo transgênico, com ge- noma compreendendo um transgene de cadeia pesada humana e um trans- gene de cadeia leve fundidos a uma célula imortalizada.

A título de exemplo deste camundongo transgênico, pode ser mencionado o XENOMOUSE”Y, o qual é uma linhagem engenheirada de camundongo que compreende fragmentos grandes dos lócus de imunoglo- bulina humana e é deficiente em produção de anticorpos de camundongo (Green et a/l., 1994, Nature Genetics, 7:13-21). O XENOMOUSE"Y produz um repertório humano tipo adulto de anticorpos completamente humanos, e gera anticorpos monoclonais humanos específicos para antígenos. Uma se- —gunda geração de XENOMOUSE'" contém aproximadamente 80% di repertó- rio humano de anticorpos (Green & Jakobovits, 1998, J. Exp. Med., 188:483- 495).

. Qualquer outra conhecida pelo técnico versado no assunto, tal Á como técnica de exibição em fagos, pode também ser utilizada para a gera- í ção de anticorpo humano de acordo com a invenção. À O processo de acordo com a invenção pode ser utilizado para — qualquer tipo de imunoglobulina compreendendo uma região de articulação, ou seja, IgA, IgD e IgG.

A título de exemplo, para o isotipo IgA, a região de articulação de IgA1 compreende a sequência de aminoácidos PSTPPTPSPSTPPTPSPS (SEQ ID No. 8) e a região de articulação de IgA2 compreende a sequência de aminoácidos PPPP (SEQ ID No. 9).

De maneira semelhante, a região de articulação de IgD compre- ende a sequência de aminoácidos

SPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTRGGEEKKKEKEKEEQEE ' RETKTP (SEQ ID No. 10). Como uma modalidade particular da invenção, é preferido utilizar IgG, incluindo, por exemplo, IgG1, IgG2, 1963 ou IgG4.

As respectivas sequências de aminoácidos correspondentes aos diferentes isotipos de regiões de articulação de IgG são: | PKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID No. 11) para IgG1, RKCCVECPPCP (SEQ ID No. 7) para IgG2,

LKTPLFTGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPP CPRCPEPKSCDTPPPCPRCP (SEQ ID No. 12) para I9G3, e SKYGPPCPSCP (SEQ ID No. 13) para IgG4.

Ainda mais especialmente, é preferido utilizado I9G1. Na verda- de, no campo de anticorpos terapêuticos e, mais especialmente, no trata- mento de câncer, é preferido gerar IgG1 para obter funções efetoras como ADCC e CDC, além de funções vinculadas à ligação específica ao alvo anti- gênico.

O processo da invenção é caracterizado em que o referido anti- — corpomonocional é IgG1.

. "Molécula-alvo", dentro do significado da invenção, refere-se a qualquer molécula que o anticorpo monoclional seja capaz de ligar-se especi- D——

. ficamente ou de modular a atividade. Em geral, esta molécula-alvo pode ser denominada "antígeno". % A título de exemplo não restritivo de molécula-alvo contra a qual ' um anticorpo monoclonal pode ser direcionado, podem ser citados ligantes — solúveis, receptores tais como receptores de transmembrana, marcadores tumorais de membrana, etc.

Em uma concretização preferida, a referida molécula-alvo é um receptor transmembrana.

A expressão "receptor transmembrana" refere-se a uma proteína que transpõea membrana plasmática de uma célula, com o domínio extra- celular da proteína detendo a capacidade de ligar-se a um ligante e o domí- nio intracelular exibindo uma atividade (tal como proteína quinase) que pode ser alterada (quer aumentada ou reduzida) quando da ligação ao ligante. Em outras palavras, receptores transmembranas são proteínas que integram a membrana, que residem e operam tipicamente na membrana de uma célula, porém também nas membranas de alguns compartimentos e organelas sub- celulares. Ao se ligarem a uma molécula de sinalização ou, às vezes, a um par destas moléculas em um lado da membrana, os receptores transmem- branas iniciam uma resposta no outro lado. Nessa maneira, estes receptores desempenham um papel único e importante em comunicação celular e transdução de sinal.

Muitos receptores transmembranas são compostos por duas ou mais subunidades proteicas que operam coletivamente e que podem disso- ciar-se, quando ligantes se ligam, destacando-se, ou em outro estágio de seus ciclos de "ativação". São classificados frequentemente de acordo com sua estrutura molecular, ou pelo fato de a estrutura ser desconhecida em qualquer detalhe para todos, exceto por alguns receptores, com base em sua topologia hipotética (e às vezes experimentalmente verificada) na mem- brana. Prevê-se que as cadeias polipeptídicas dos mais simples cruzem a barreira lipídica apenas uma vez, enquanto outros a cruzam até sete vezes (os assim-chamados receptores acoplados à proteína G ou GPCRs) ou mais.

. Semelhantemente a qualquer proteína que integre a membrana, ' um receptor transmembrana pode ser subdividido em três partes ou domí-.

" nios, domínio extracelular, domínio transmembrana e domínio intracelular. : O domínio extracelular é a parte do receptor para fora da mem- branano lado externo da célula ou organela. Se a cadeia polipeptídica do receptor cruzar a bicamada várias vezes, o domínio externo pode compre- ender várias "alças" para fora da membrana. Por definição, uma das princi- pais funções de um receptor é reconhecer e responder a um ligante especí- - fico, por exemplo, um neurotransmissor ou hormônio (embora certos recep- tores respondam também a alterações em potencial transmembrana) e, em i muitos receptores, estes ligantes se ligam ao domínio extracelular.

Na maioria dos receptores para os quais existem evidências es- truturais, hélices alfa transmembrana constituem a maior parte do domínio transmembrana. Em certos receptores como, por exemplo, o receptor nicotí- —nicode acetilcolina, o domínio transmembrana forma um poro revestido por proteína através da membrana, ou canal iônico. Quando da ativação de um domínio extracelular pela ligação do ligante apropriado, o poro torna-se a- - —cessívela ons, os quais então o atravessam. Em outros receptores, os do- mínios transmembranas supostamente sofrem uma alteração conformacio- nal quando da ligação, cujo efeito é intracelular. Em alguns receptores, tais como membros da superfamília 7TM, o domínio transmembrana pode conter . o bolso de ligação ao ligante.

O domínio intracelular (ou citoplasmático) do receptor interage com o interior da célula ou organela, transmitindo o sinal. Existem duas fun- damentalmente diferentes maneiras para essa interação: a) O domínio intra- celular comunica-se via interações específicas proteína-proteíina com profeí- nas efetoras, as quais por sua vez enviam o sinal ao longo da cadeia de si- nalização para o seu destino e b) com receptores ligados a enzimas, o do- mínio intracelular possui atividade enzimática. Frequentemente, esta ativida- deédotipo tirosina quinase. A atividade enzimática pode estar situada tam- bém em uma enzima associada com o domínio intracelular.

Existem muitas maneiras para a célula regular a atividade de um

- receptor transmembrana. Muitas destas operam através do domínio intrace- ' lular. As maneiras mais importantes são fosforilação e internalização (con- " sultar ubiquitina) ou ativação de cascatas de segundo mensageiro, tais como CAMP, IP, Ca?* ou cGMP.

Todas as proteínas de membrana exibindo atividades enzimáti- cas podem ser também alvos para anticorpos com a modificação descrita | nesta invenção. Podem ser citadas, a título de exemplo, entre outros, a famí- lia das metaloproteases da matriz (MMP), a família de "proteases com domí- nio desintegrina e domínio metaloprotease" (ADAM), adenilato ciclases, etc.

. 10 Todas as proteínas de membrana atuando como canais iônicos, poros e transportadoras também ser alvo para anticorpos com a modificação descrita nesta invenção. Podem ser citadas, a título de exemplo, entre ou- tros, a família do canal de sódio, a família do canal de potássio, a família de receptores nicotínicos de acetilcolina, os receptores sigma, a família de trans- portadoras de monoamina.

Em sentido mais amplo, todas as proteínas de membrana identi- ficadas como marcadores específicos para uma determinada doença podem também ser alvo para tratamento com anticorpo, podendo também este anti- corpo ser melhorado pelas modificações descritas nesta invenção.

Em uma concretização preferida da invenção, o referido receptor transmembrana é selecionado do grupo constituído do receptor de tirosina quinase, tetraspanina e GPCRs.

Em uma concretização preferida da invenção, o referido receptor transmembrana é um receptor tirosina quinase, selecionado de preferência no grupo constituído por IGF-1R, c-Met, RON, Ax1, VEGF, VEGFR, Her- 2neu, homodímeros e heterodímeros da família ErbB, etc.

No presente pedido de patente e, mais especificamente, no rela- tório descritivo a seguir, as sequências serão definidas em referência a IMGT. A numeração única IMGT foi definida para comparar os domínios va- riáveis independentemente do receptor antigênico, o tipo de cadeia ou a es- pécie (Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997); Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefrane M.-P., Pommié, C., Ruiz, M., Giu-

. dicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. ' Comp. Immunol., 27, 55-57 (2003)). Na numeração única IMGT, os aminoá- S cidos conservados estão sempre na mesma posição, por exemplo, cisteína . 23 (1º CYS), triptofano 41 (TRP CONSERVADO), aminoácido hidrofóbico 89,cisteina 104 (2º CYS), fenilalanina ou triptofano 118 (J-PHE ou J-TRP). À numeração única IMGT permite delimitar de modo padronizado as regiões framework (FR1-IMGT: posições 1 a 26, FR2-IMGT: 39 a 55, FR3-IMGT: 66 a 104 e FR4-IMGT: 118 a 128) e as regiões determinantes de complementa- ridade: CDR1-IMGT: 27 a 38, CDR2-IMGT: 56 a 65 e CRD3-IMGT: 105 à

117. As lacunas (gaps) representam posições não ocupadas, portanto, as extensões de CDR-IMGT (mostradas entre colchetes e separadas por pon- tos, por exemplo, [8.8.13]) tornam-se informações fundamentais. A numera- ção única IMGT é utilizada em representações gráficas bidimensionais, de- signadas IMGT Colliers de Perles (Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunoge- netícs,53,857-883 (2002); Kaas, Q. and Lefranc M.-P., Current Bioinforma- tics, 2, 21-30 (2007)), e em estruturas tridimensionais em /MGT/SDstructure- DB (Kass, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structu- ral data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)). Para aquele versado no estado da técnica, será óbvio transpor a invenção descrita de acordo com o sistema IMGT em qualquer outro sistema de numeração tal como, por exemplo, o sistema de numeração de Kabat. A numeração única IMGT, para todas as REGIÕES V de IG e TR de todas as espécies baseia-se na alta conservação da estrutura da re- gião variável. Esta numeração, definida após alinhamento de mais de 5 000 sequências, leva em conta e combina a definição das regiões framework (FR) e das determinantes de complementaridade (CDR), dados estruturais provenientes de estudos de difração de raio-X e a caracterização das alças hipervariáveis. As delimitações das regiões FR-IMGT e CDR-IMGT foram definidas. Igualmente, a numeração única IMGT foi aplicada para o DOMÍ- NIOC e permite a delimitação precisa de domínios tipo Ig. O DOMÍNIO C corresponde à REGIÃO C completa, a maior parte da REGIÃO C ou a ape- nas parte da REGIÃO C, dependendo do tipo de imunoglobulina (IG). UmpmpmD—m——n— A.

. A numeração IMGT para DOMÍNIO C (IG e TR) é derivada como ' a numeração única IMGT para DOMÍNIO V, a partir do princeps da numera- S ção única IMGT para REGIÃO V, até a posição 104. As posições de amino- : ácidos podem, portanto, ser facilmente comparadas entre o DOMÍNIO C e o DOMÍNIOV.

Para situar precisamente as regiões De articulação, a numera- ção IMGT do DOMÍNIO C foi aplicada para localizar precisamente os domí- nios CH1 e CH2. A região De articulação inclui todos os resíduos de amino- . ácido inseridos entre o último resíduo de IMGT-CH1 e o primeiro resíduo de IMGT-CH2.

Todos os outros esquemas de numeração de imunoglobulinas, tais como de Kabat ou A. Honegger, abrangendo o mesmo domínio De arti- culação, estão incluídos na presente invenção.

A título de exemplo preferido da invenção, com base no sistema de numeração IMGT descrito acima, as sequências de aminoácidos da regi- ão de articulação de uma IgG1 compreende os resíduos H1 a H14, com o segmento H1 a H9 correspondendo à região De articulação Superior e o segmento H10 a H14 correspondendo à região De articulação Central. Mais especificamente, a região de articulação de I9G1 humana compreende a sequência de aminoácidos PRSCDKTHTCPPCP (SEQ ID No. 11), e a região de articulação de IgG1 murina compreende a sequência de aminoácidos PRDCGCKPCICT (SEQ ID No. 14).

Tabela 1 Região de | Numeração — | Hu-lgG1 | Mu-lgG1 Hu-lgG2 Hu-lgG4 articulação (SEQ ID|(SEQ ID|(SEQ IDI(SEQ ID No. 11 No. 14 No. 7) No. 11 H1 P P - - H2 K R R Ss Articulação H3 Ss D K K superior H4 Cc Cc Cc Y H5 D G - - H6 K = - -

. H7 T Cc Cc G H8 H K v P S Ho T P E P A Articulação H10 Cc Cc Cc Cc central H11 P | P P H12 P - P Ss H13 Cc Cc Cc Cc H14 P T P P Em uma concretização preferida da invenção, é considerada uma modificação visando reduzir a extensão da sequência proteica codifica- da para a região de articulação de um anticorpo divalente. Mais especiífica- mente, o processo de acordo com a invenção compreende uma etapa de —deleçãode pelomenos um aminoácido na região de articulação. Como previamente mencionado, é preferida a deleção de no máximo 2 aminoácidos da referida região de articulação. Como previamente mencionado, é preferida a deleção de no máximo 3 aminoácidos da referida região de articulação.

Como previamente mencionado, é preferida a deleção de no máximo 4 aminoácidos da referida região de articulação.

Em um uso específico do processo da invenção, a modificação consiste em deletar pelo menos um aminoácido selecionado a partir do ami- noácido na posição H1, H2, H3, H5, H6, H7, H8, H9, H11, H12 ou H14.

Mais especificamente, os inventores demonstraram que a impli- cação de um determinado resíduo e de uma determinada modalidade inven- tiva consiste na seleção de certos resíduos.

No caso preferido de IgG1, o aminoácido na posição H1 consiste em Prolina, 1, o aminoácido na posição H2 consiste em Lisina na versão humana e em Arginina na versão murina; 1, o aminoácido na posição H3 consiste em Serina na versão humana e em Aspartato na versão murina; o aminoácido na posição H5 consiste em Aspartato na versão humana e em Glicina na versão murina; o aminoácido na posição H6 consiste em Lisina; o aminoácido na posição H8 consiste em Histidina na versão humana e em

,. Lisina na versão murina; o aminoácido na posição H9 consiste em Treonina ' na versão humana e em Prolina na versão murina; o aminoácido na posição " H11 consiste em Prolina na versão humana e em Isoleucina na versão muri- . na e o aminoácido na posição H12 consiste em Prolina na versão humana. De acordo com uma concretização mais preferida, esta deleção foi efetuada na região "de articulação superior".

Em uma concretização mais preferida, esta deleção é parte da região "de articulação superior" constituído para uma IgG1, por exemplo, pelos aminoácidos H1 a H9, por comparação à região "de articulação cen- tral", constituída pelos aminoácidos H10 a H14.

No presente pedido de patente, a numeração de aminoácidos é feita com referência ao sistema IMGT, conforme previamente descrito. É ób- vio que qualquer outro sistema de numeração, com modificação da numera- ção, porém não da natureza do resíduo implicado na região de articulação, deve ser considerado equivalente. A título de exemplo, a numeração da par- te identificada de aminoácidos da invenção (de acordo com o sistema IMGT) no sistema de Kabat deve ser considerada equivalente.

Outro aspecto da invenção tem como base a deleção de pelo menos uma Cisteína na região "de articulação superior", de preferência situ- adana posição HA4.

Outro aspecto da invenção tem como base a adição de pelo me- nos uma ponte dissulfeto na região de articulação.

Mais especificamente, o processo da invenção é caracterizado em que a modificação consiste na introdução de pelo menos uma Cisteína naregião"de articulação superior".

De acordo com os inventores, uma explicação plausível tem co- mo base uma possível "rigidificação" da articulação, resultante da redução da extensão e/ou da introdução de outra ponte dissulfeto. Esta "rigidificação" permitirá manter uma conformação espacial apropriada do anticorpo com, como consequência, atividade antagonista melhorada.

É claro que qualquer método visando tornar a região de articula- ção mais rígida deverá ser considerado um método equivalente ao processo

7 de acordo com a presente invenção. Ú A introdução de Cisteina pode ser realizada por adição deste S aminoácido, a referida adição sendo efetuada por qualquer método conheci- . do por aquele versado no estado da técnica. Outra maneira preferida para introduzir Cisteína na região de ar- ticulação consiste em substituir pelo menos um aminoácido. Mais especificamente, uma maneira preferida para introduzir | Cisteína na região de articulação consiste em substituir pelo menos um ami- noácido selecionado a partir de H1 a H9. Tal substituição pode ser realizada por qualquer método conhecido pelo técnico versado no assunto.

Mais especificamente, o processo da invenção compreende a substituição da Treonina na posição H7 na região "de articulação superior" por uma Cisteína.

Em outra concretização, o processo da invenção compreende a substituição da Lisina na posição H6 na região "de articulação superior" por uma Cisteína.

Em ainda outra concretização, o processo da invenção compre- ende a substituição da Prolina na posição H1 da região "de articulação supe- rior" por uma Cisteína.

Em ainda outra concretização, o processo da invenção compre- ende a substituição da Lisina na posição H2 da região "de articulação supe- rior" por uma Cisteína.

Em ainda outra concretização, o processo da invenção compre- ende a substituição da Serina na posição H3 da região "de articulação supe- rior" por uma Cisteína.

Em ainda outra concretização, o processo da invenção compre- ende a substituição do Aspartato na posição H5 da região "de articulação superior" por uma Cisteína.

Em ainda outra concretização, o processo da invenção compre- endea substituição da Histidina na posição H8 da região "de articulação su- perior" por uma Cisteína.

Em ainda outra concretização, o processo da invenção compre-

.-. ende a substituição da Treonina na posição H9 da região "de articulação su- ' perior" por uma Cisteína. S De acordo com outra concretização, é possível também reduzir a extensão da região de articulação e/ou adicionar uma ponte dissulfeto tro- candotodaa sequência de aminoácidos codificadora para a região de articu- lação.

A título de exemplo preferido, a modificação do processo da in- | venção consiste em substituir os aminoácidos H1 a H14 da região de articu- lação da IgG1 pelos aminoácidos H1 a H14 da região de articulação de uma 1IgG2, de preferência quando o referido anticorpo monoclonai cuja atividade antagonista se deseja melhorar é um anticorpo I9G1.

Em outra aplicação, a invenção refere-se a um processo de ras- treamento de um anticorpo monoclonal antagonista direcionado contra uma molécula-alvo específico, ou um fragmento funcional divalente ou derivado deste, oreferido anticorpo sendo capaz de inibir uma ou mais das atividades biológicas da referida molécula-alvo, em que o referido processo compreen- de as etapas de: (a) selecionar um anticorpo inicial com nível inicial de inibição da referida única ou mais atividades biológicas da referida molécula-alvo, (b) modificar a sequência de aminoácidos da região de articula- ção do referido anticorpo inicial pelo processo da invenção, (c) avaliar o anticorpo modificado da etapa (b) quanto a sua ca- pacidade para inibir a referida única ou mais atividades biológicas da referida molécula-alvo e i (d) selecionar, em resultado positivo, o anticorpo da etapa (c) com nível de inibição da referida única ou mais atividades biológicas da refe- rida molécula-alvo mais alta do que o nível inicial da referida inibição.

Anticorpos iniciais podem ser selecionados entre os anticorpos existentes, tais como, entre outros, anticorpos antagonistas contra IGF-1R, cMet, RON, Ax1, CD151, VEGF, VEGFR, Her-2neu, homodímeros e hete- rodímeros da família ErbB. Exemplos preferidos não restritivos para os refe- ridos anticorpos iniciais podem incluir Herceptina, Pertuzumabe, Cetuxima-

i 22/46 be, anticorpos anti-VEGFR ou anti-I|GF-1R.

' "Nível de inibição", dentro do significado da invenção, ilustra a a- S tividade antagonista de um anticorpo. Este nível de inibição pode ser deter- . minado por qualquer método conhecido por aquele versado na técnica tal como, entre outros, a) contagem direta de células ou uso de 3[H]Timidina, sais de tetrazolina ou qualquer outro meio fluorescente para avaliar a prolife- ração, b) Ensaios de rastreamento por Westem Blotting, ELISA de rastrea- mento de fósforo ou alfa para monitorar transdução de sinal, c) análise por BRET ou FRET para ensaio de dimerização, d) microscopia ou métodos flu- orescentes para monitorar migração, invasão, angiogênese ou morfogênese e e) medição de tumores com paquímetro para avaliações in vivo.

Este processo de rastreamento pode ser utilizado para a melho- ra de anticorpos validados ou como estágio de seleção para pesquisa ou de anticorpos pré-clínicos.

Outro aspecto de acordo com a invenção refere-se a um anticor- po monoclonal direcionado contra uma molécula-alvo específica, ou frag- mentos funcionais divalentes ou derivados deste, a serem obtidos pelo pro- : cesso da invenção, o referido anticorpo sendo caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de aminoácidos na região de articulação sele- cionadaa partir do grupo constituído por: SEQ ID No. 1 (PRDCGCKPCICT), SEQ ID No. 2

. (PKSCGCKPCICT), SEQ ID No. 3 (PKSCGCKPCICP), SEQ ID No. 4 . (PRDCGCKPCPPCP), SEQ ID No. 5 (PRDCGCHTCPPCP), SEQ ID No. 6 - (PKSCDCHCPPCP), SEQ ID No. 7 (RKCCVECPPCP), SEQ ID No. 22 7 (CKSCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 23 (PCSCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 24 - (PKCCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 25 (PKSCCKTHTCPPCP), SEQ ID No. 26 (PKSCDCTHTCPPCP) SEQ ID No. 27 (PKSCDKCHTCPPCP), SEQ ID No. 28 (PKSCDKTCTCPPCP), SEQ ID No. 29 (PKSCDKTHCCPPCP), SEQ ID No. 30 : (PKSCDKTHTCCPCP), SEQ ID No. 31 (PKSCDKTHTCPCCP), SEQ ID No. 32 (PKSCDKTHTCPPCC), SEQ ID No. 33 (PSCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 34 (PKSCDTHTCPPCP), SEQ ID No. 35 (PKSCDKTHCPPCP), SEQ ID No. 36 (KCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 37 (PSCKTHTCPPCP), SEQ ID No. 38 (PKSCDTHCPPCP), SEQ ID No. 39 (PKSCTHTCPPCP), SEQ ID No. 40 (PKSCDKTTCPCP), SEQ ID No. 41 (PKSCDKTHCPPC), SEQ ID No. 42 (PKSCDCHTCPPCP), SEQ ID No. 43 (PKSCDCTHCPPCP), SEQ ID No. 44 (PCSCKHTCPPCP), SEQ ID No. 45 (PSCCTHTCPPCP), SEQ ID No. 46 (PSCDKHCCPPCP), SEQ ID No. 47 (PKSTHTCPPCP), SEQ ID No. 48 (PKSCTCPPCP) or SEQ ID No. 49 (PKSCDKCVECPPCP). Um anticorpo monocional preferido obtido pela implantação do processo da invenção pode ser caracterizado pelo fato de compreender uma —sequênciade aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído por: SEQ ID No. 1 (PRDCGCKPCICT), SEQ ID No. 2 PKSCGCKPCICT), SEQ ID No. 3 (PKSCGCKPCICP), SEQ ID No 4 ] (PRDCGCKPCPPCP), SEQ ID No. 5 (PRDCGCHTCPPCP), SEQ ID No. 6 (PKSCDCHCPPCP), SEQ ID No. 7 (RKCCVECPPCP), SEQ ID No 22 (CKSCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 23 (PCSCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 24 (PPRCCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 25 (PKSCCKTHTCPPCP), SEQ ID No. 26 (PKSCDCTHTCPPCP) SEQ ID No. 27 (PKSCDKCHTCPPCP), SEQ ID No. 28 (PKSCDKTCTCPPCP), SEQ ID No. 29 (PKSCDKTHCCPPCP), SEQ ID No. 30 (PKSCDKTHTCCPCP), SEQ 1D No. 31 (PKSCDKTHTCPCCP), SEQ ID No. 32 (PKSCDKTHTCPPCC), SEQ ID No. 33 (PSCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 34 (PKSCDTHTCPPCP), SEQ ID No. 35 (PKSCDKTHCPPCP), SEQ ID No. 36 (KCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 37 (PSCKTHTCPPCP), SEQ ID No. 38 (PKSCDTHCPPCP), SEQ ID No. 39 (PKSCTHTCPPCP) SEQ ID No. 40 (PKSCDKTTCPCP), SEQ ID No. 41 (PKSCDKTHCPPC), SEQ ID No. 42 (PKSCDCHTCPPCP), SEQ ID No. 43 (PKSCDCTHCPPCP), SEQ ID No. 44 (PCSCKHTCPPCP), SEQ ID No. 45 (PSCCTHTCPPCP), SEQ ID No. 46 (PSCDKHCCPPCP), SEQ ID No. 47 (PKSTHTCPPCP), SEQ ID No. 48 (PKSCTCPPCP) or SEQ ID No. 49 PKSCDKCVECPPCP). ——

. Em uma concretização preferida, o referido anticorpo monoclo- ' nal é um anticorpo humano, mais preferido, é um anticorpo IgG1. A invenção refere-se também a um ácido nucleico isolado que : codifica para um anticorpo monoclonal conforme previamente descrito, ou seja, compreendendo uma sequência de aminoácidos na região de articula- ção selecionada a partir do grupo constituído por: SEQ ID No. 1 (PRDCGCKPCICT), SEQ ID No. 2 (PKSCGCKPCICT), SEQ ID No. 3 (PKSCGCKPCICP), SEQ ID No. 4 (PRDCGCKPCPPCP), SEQ ID No. 5 (PRDCGCHTCPPCP), SEQ ID No. 6 (PKSCDCHCPPCP), SEQ ID No. 7 (RKCCVECPPCP), SEQ ID No. 22 (CKSCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 23 (PCSCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 24 (PKCCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 25 (PKSCCKTHTCPPCP), SEQ ID No. 26 (PKSCDCTHTCPPCP) SEQ ID No. 27 (PKSCDKCHTCPPCP), SEQ ID No. 28 (PKSCDKTCTCPPCP), SEQ ID No. 29 (PKSCDKTHCCPPCP), SEQ ID No. 30 (PKSCDKTHTCCPCP), SEQ ID No. 31 (PKSCDKTHTCPCCP), SEQ ID No. 32 (PKSCDKTHTCPPCCO), SEQ ID No. 33 (PSCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 34 (PKSCDTHTCPPCP), SEQ ID No. 35 (PKSCDKTHCPPCP), SEQ ID No. 36 (KCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 37 (PSCKTHTCPPCP), SEQ ID No. 38 (PKSCDTHCPPCP), SEQ ID No. 39 (PKSCTHTCPPCP), SEQ ID No. 40 (PKSCDKTTCPCP), SEQ ID No. 41 (PKSCDKTHCPPC), SEQ ID No. 42 (PKSCDCHTCPPCP), SEQ ID No. 43 (PKSCDCTHCPPCP), SEQ ID No. 44 (PCSCKHTCPPCP), SEQ ID No. 45 (PSCCTHTCPPCP), SEQ ID No. 46 (PSCDKHCCPPCP), SEQ ID No. 47 (PKSTHTCPPCP), SEQ ID No. 48 : (PKSCTCPPCP) or SEQ ID No. 49 PKSCDKCVECPPCP).

De acordo com ainda outra modalidade, a presente invenção re- fere-se a um ácido nucleico isolado, caracterizado em que este é escolhido a partir dos seguintes ácidos nucleicos: a) ácido nucleico, DNA ou RNA, codificador de uma região de articulação artificial de acordo com a invenção, o ácido nucleico RNA corres- pondente deste ou a sequência complementar deste; b) sequência isolada de ácido nucleico, compreendendo uma sequência nucleica selecionada a partir do grupo constituído pela SEQ ID No. 15 a SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 50 a SEQ ID No. 77, o ácido nucleico RNA correspondente desta e a sequência complementar desta; e c) ácido nucleico contendo pelo menos 18 nucleotídeos capazes de se hibridizarem sob condições de alto rigor com pelo menos uma das se-

ND

' quências SEQ ID. Nos. 15 a 21 e 50 a 77. ' De preferência, a invenção compreende um ácido nucleico iso- lado compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo constituí- : do pela SEQ ID No. 15 a SEQ ID No. 21 e SEQ ID No. 50 a SEQ ID No. 77. A invenção também integra um vetor de expressão ou célula hospedeira transformada, compreendendo um ácido nucleico isolado, como | previamente descrito, e, mais especialmente, um ácido nucleico isolado com- preendendo uma sequência selecionada a partir do grupo constituído pela SEQ ID No. 15 a SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 50 a SEQ ID No. 77, o ácido nuclei- coRNA correspondente desta e a sequência complementar desta.

Por ácido nucleico, sequência nucleica ou de ácido nucleico, po- linucleotídeo, oligonucleotídeo, sequência de polinucleotídeos, sequência de nucleotídeos, termos que serão empregados indiferentemente na presente invenção e que se destinam a indicar neste relatório descritivo uma ligação precisa de nucleotídeos, os quais estão modificados ou não, permitindo que um fragmento ou região de um ácido nucleico seja definido, contendo ou não nucleotídeos não naturais e sendo capaz de corresponder muito bem a um DNA de fita dupla, um DNA de fita simples, bem como aos produtos de transcrição dos referidos DNAs.

Deve ser também entendido que a presente invenção não diz respeito às sequências de nucleotídeos em seu ambiente cromossômico natural, ou seja, no estado natural. A invenção está relacionada com se- 'quências que foram isoladas e/ou purificadas, ou seja, que foram seleciona- das direta ou indiretamente, por exemplo, por cópia, seu ambiente tendo si- do pelomenos parcialmente modificado. Destina-se, portanto, a indicar, nes- te relatório descritivo, os ácidos nucleicos isolados obtidos por recombinação genética por meio, por exemplo, de células hospedeiras, ou aqueles obtidos por síntese química.

Uma hibridização sob condições de alto rigor significa que as condições de temperatura e de força iônica são escolhidas em tal maneira que permitam manter a hibridização entre dois fragmentos de DNA comple- mentar. A título de ilustração, condições de alto rigor da etapa de hibridiza- —— :

, ção para fins de definir os fragmentos de polinucleotídeos descritos acima ' são vantajosamente as seguintes. 1 A hibridização de DNA-DNA ou DNA-RNA é conduzida em duas . etapas: (1) pré-hibridização a 42ºC por 3 horas em tampão fosfato (20 mM, pH7,5), contendo 5x SSC (1x SSC corresponde a uma solução de NaCI 0,15 M + citrato de sódio 0,015 M), 50% de formamida, 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 10 x solução de Denhardt, 5% de sulfato de dextrano e 1% de DNA de esperma de salmão; (2) real hibridização por 20 horas a uma temperatura que depende do tamanho da sonda (ou seja, 42ºC, para tama- nhode sonda > 100 nucleotídeos), seguido por 2 lavagens de 20 minutos a 20ºC em 2 x SSC + 2% de SDS, 1 lavagem de 20 minutos a 20ºC em 0,1 x SSC + 0,1% de SDS.

A última lavagem é realizada em 0,1 x SSC + 0,1% de SDS por 30 minutos a 60ºC para tamanho de sonda > 100 nucleotídeos.

As condições de hibridização de alto rigor descritas acima para um polinucleotí- deode tamanho definido podem ser adaptadas por aquele versado no esta- do da técnica para oligonucleotídeos de tamanho maior ou menor, de acordo com o ensinamento de Sambrook et al. (1989, Molecular cloning: a laborato- 1y manual, 2º edição, Cold Spring Harbor). A invenção refere-se igualmente a um vetor compreendendo um ácidonucleico de acordo com a presente invenção. i A invenção visa especialmente vetores de clonagem e/ou de ex- pressão que contenham uma sequência de nucleotídeos de acordo com a invenção. . Os vetores de acordo com a invenção contêm elementos, de preferência, que permitam a expressão e/ou a secreção das sequências tra- duzidas de nucleotídeos em uma determinada célula hospedeira.

O vetor precisa, portanto, conter um promotor, sinais de iniciação e terminação de tradução, bem como regiões apropriadas de regulação de transcrição.

Deve ser capaz também de ser mantido em maneira estável na célula hospedeira e poder conter opcionalmente sinais particulares que específiquem a secre- ção da proteína traduzida.

Estes diferentes elementos são escolhidos e oti- mizados por aquele versado no estado da técnica em função da célula hos-

. pedeira utilizada. Para tanto, as sequências de nucleotídeos de acordo com ' a invenção podem ser inseridas em vetores de replicação autônoma no hos- & pedeiro escolhido, ou serem vetores integrativos do hospedeiro escolhido. Estes vetores são preparados por métodos correntemente utili- —zados por aquele versado no estado da técnica, e os clones resultantes po- dem ser introduzidos em um hospedeiro apropriado por métodos padrão, tais como lipofecção, eletroporação, choque térmico ou métodos químicos.

Os vetores de acordo com a invenção são, por exemplo, vetores de origem plasmídica ou viral. São úteis para transformar células hospedei- rascom a finalidade de clonar ou expressar as sequências de nucleotídeos de acordo com a invenção.

A invenção compreende igualmente as células hospedeiras transformadas ou compreendendo um vetor de acordo com a invenção.

A célula hospedeira pode ser escolhida a partir de sistemas pro- carióticos ou eucarióticos, por exemplo, células bacterianas, porém igual- mente células de levedura ou células de animais, especialmente, células de mamíferos. É do mesmo modo possível utilizar células de insetos ou células de plantas.

Outras características e vantagens da invenção surgem na con- tinuaçãoda descrição com os exemplos e as figuras em que: Figuras 1A e 1B: Efeito de uma série de Mabs anti-c-Met muri- nos e correspondentes quiméricos, produzidos como isotipo de IgG1 huma- na/kappa sobre fosforilação de receptores c-Met em células A549.

Figura 1A: Efeito agonista calculado em percentual em compa- raçãoàestimulação máxima de fosforilação de c-Met por HGF (100 ng/mL).

Figura 1B: efeito antagonista calculado em percentual de inibi- ção da estimulação máxima de fosforilação de c-Met por HGF (100 ng/mL).

Figuras 2A e 2B: Comparação entre Mab 224G11 murino e Mabs 224G11 quiméricos contendo várias regiões de articulação engenhei- radas, sobre fosforilação de receptores c-Met em células A549 Figura 2A: Efeito agonista calculado em percentual em compa- ração à estimulação máxima de fosforilação de c-Met por HGF (100 ng/mL).

- Figura 2B: efeito antagonista calculado em percentual de inibi- ' ção da estimulação máxima de fosforilação de c-Met por HGF (100 ng/mL). | Figuras 3A e 3B, 4 e 5: Modelos de dimerização e ativação de c- Met por BRET. Figuras 6A e 6B: Reconhecimento de c-Met por formas quiméri- cas e humanizadas de 224G11.

Figuras 7A, 7B e 7C: Efeito de anticorpos murinos e quiméricos sobre proliferação de células NCI-H441 in vitro, induzida por HGF. Células NCI-H441 foram semeadas em meio sem soro. Vinte e quatro horas após a semeadura (figura 7A), M11E1 e [11E1] chim (figura 7B), m227H1 e [227H1] chim Ou (figura 7C) m224G11 e [224G11] chim foram adicionados em au- sência ou em presença de HGF. Setas pretas indicam as cavidades semea- das apenas com células, quer em ausência é ou em presença n de HGF. Uma IgG1 murina (mlgG1) foi introduzida como controle de isotipo.

Figura 8: Comparação in vivo de Mabs 224G11 murino e quimé- rico no modelo de xenoenxerto de NCI-H441.

Figuras 9A e 9B: Efeito do anticorpo 244G11 murino e de várias versões quiméricas e humanizadas deste anticorpo sobre proliferação de células NCI-H441 in vitro, induzida por HGF. Células NCI-H441 foram seme- adasem meio sem soro. Vinte e quatro horas após a semeadura, anticorpos a serem testados foram adicionados em ausência ou em presença de HGF. No painel (figura 9A), o m224G11 murino, IgG1 quimérica [224G11] chim, versões humanizadas de IgG1 [224G11] [Hz1], [224G11] [Hz2], [224G11] [Hz3] são mostrados. No painel (figura 9B), o m224G11 murino e várias for- mas de lgG1 quimérica ([224G11] chim, [224G11] [MH chim], [224G11] [MUP9H chim], [224G11] [MMCH chim], [224611] [TH7 chim]) foram apre- sentados. Setas pretas indicam as cavidades semeadas apenas com célu- las, quer em ausência v ou em presença yn de HGF. Uma IgG1 murina (mIgG1) foi introduzida como controle negativo para atividade agonista. O —m5D5 foi utilizado como controle de agonista completo dose-dependente.

Figura 10: Efeito do Mab 244G11 murino e de várias versões quiméricas e humanizadas deste anticorpo sobre proliferação de células

. NCI-H441 in vitro, induzida por HGF. Células NCI-H441 foram semeadas em ' meio sem soro. Vinte e quatro horas após a semeadura, anticorpos a serem õ testados foram adicionados em ausência ou em presença de HGF. No painel (figura 9A), o m224G11 murino, formas quiméricas de I9G1 ([224G11] chim, i 5 [224G11] [TH7 chim]) e [224G11] [TH7 Hz1], [224G11] [TH7 Hz3] foram a- presentados. Setas pretas indicam as cavidades semeadas apenas com cé- ' lulas, quer em ausência v ou em presença n de HGF. Uma IgG1 murina (mIgG1) foi introduzida como controle negativo para atividade agonista. O m5DS foi utilizado como controle de agonista completo dose-dependente. Figuras 11A-11B e 12A-12B: Efeito de uma série de Mabs anti-c- Met, com região de articulação engenheirada, da invenção sobre fosforilação de receptores c-Met em células A549. Figura 11A e 11B: Efeito agonista calculado em percentual em comparação à estimulação máxima de fosforilação de c-Met por HGF (100 ng/mL). Figura 12A e 12B: efeito antagonista calculado em percentual de inibição da estimulação máxima de fosforilação de c-Met por HGF (100 ng/mL).

Figura 13A e 13B: Modelos de dimerização e ativação de c-Met por BRET.

Figura 14A: Efeito agonista calculado em percentual em compa- raçãoà estimulação máxima de fosforilação de c-Met por HGF (100 ng/mL).

Figura 14B: efeito antagonista calculado em percentual de inibi- ção da estimulação máxima de fosforilação de c-Met por HGF (100 ng/mL).

Figura 15: Modelos de dimerização e ativação de c-Met por BRET.

Figura 16: Análise microscópica do efeito de diferentes formas de Mab 214B2 sobre adesão de células PC3.

Figura 17: Análise do efeito de diferentes formas de Mab 214B2 sobre adesão de células PC3, utilizando um ensaio para ATP. Em cada ca- vidade, o número de células aderidas foi determinado utilizando uma curva padrão para PC3, de O a 200 000 células/cavidade. Os resultados são apre- sentados como segue: as células não tratadas são consideradas de referên- cia (100%), e as células tratadas são apresentadas em termos de o % da

. referência. õ Exemplo 1: Construção de Mabs quiméricos e avaliação funcional do status & de fosforilação de receptores c-Met Vários Mabs de camundongo, direcionados contra um protótipo | 5 dereceptor tirosina quinase (receptor c-Met) foram reformatados como Mabs quiméricos carreando. domínios variáveis de camundongo e domínios cons- tantes humanos. Suas atividades intrínsecas foram analisadas com base em um ensaio funcional monitorando a inibição de fosforilação de receptores c- Met dependente de ligante (HGF).

Após clonagem por PCR de sequências de domínio variável de camundongo (VH, VL), Mabs quiméricos foram engenheirados mediante a ligação de um fragmento de restrição (Nhe1-Bcl1), carreando sequências VH ou VL de camundongo, em um vetor pCEP4 (Invitrogen, EUA) contendo toda a sequência de codificação do domínio constante de uma cadeia leve huma- na Ckappa ou uma cadeia pesada humana [CH1-Articulação-CH2-CH3] de uma imunoglobulina IgG1. Todas as etapas de clonagem foram realizadas de acordo com técnicas convencionais de biologia molecular como descritas no manual Laboratory (Sambrook e Russel, 2001), ou de acordo com as ins- truções do fornecedor. Cada construção genética foi inteiramente validada por sequenciamento de nucleotídeos, usando o kit de sequenciamento de ciclo terminador Big Dye (Applied Biosystems, EUA), e analisada com Anali- sador 3100 Genetic (Applied Biosystems, EUA). A produção dos Mabs qui- méricos correspondentes foi realizada com células HEK293 EBNA adapta- das em suspensão (InVitrogen, EUA), cultivadas em meio sem soro Excell 293 (SAFC Biosciences), suplementado com glutamina 6 mM. O processo de cultivo foi monitorado com base em viabilidade celular e produção de Mab. Os Mabs foram purificados empregando uma abordagem convencional de cromatografia em resina contendo Proteína A (GE Healthcare, EUA).

Todas as diferentes formas de Mabs foram produzidas em níveis adequados com avaliações funcionais. Os níveis de produtividade variam tipicamente entre 15 e 30 mg/L de Mabs purificados.

As avaliações funcionais foram realizadas em células A549 de N——

. câncer de pulmão humano. O sfatus de fosforilação de receptores c-Met foi ' monitorado em lisados celulares, usando um ensaio ELISA de captura espe- õ cífica. Um Mab anti-c-Met de cabra (R&D, ref. AF276) foi utilizado como anti- : corpo de captura, enquanto que o anticorpo de detecção correspondeu a um Mab anti-fosfo-c-Met (Biosource, ref. KHO0281). As leituras de luminescên- cia foram registradas em leitor de placa multimodo Mithras LB920 (Berthold). Todos os três Mabs murinos, 11E1, 224G11 e 227H1, resulta- ram em atividades intrínsecas comparáveis sobre fosforilação de receptor c- Met: quase nenhuma atividade agonista por si próprio (menos de 5% de efei- todoHGF, Figura 1A) e forte inibição de fosforilação de receptor c-Met indu- zida por HGF [100 ng/mL] (Inibição em >70% do efeito de HGF, Figura 1B). De maneira bastante surpreendente, ao se modificar o domínio constante do Mab, trocando de IgG1/kappa de camundongo para IgG1 kappa humana, uma modificação completa das atividades intrínsecas dos Mabs quiméricos resultantes foi observada (Figuras 1A-1B). De fato, forte agonismo foi obser- vado (atingindo 20% do efeito de HGF para c11E1, Figura 1A) foi observado associado com uma importante redução na eficácia antagonista (restando apenas 60% de inibição do efeito de HGF para c224G11, Figura 1B). Este efeito independeu do domínio variável do anticorpo uma vez que o mesmo fenômeno foi observado para os três Mabs investigados (os anticorpos mo- noclonais 1161, 224G11 e 227H1 são secretados pelo hibridoma depositado na Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos) (Institut Pasteur, Paris, França) em 14/03/2007 sob os números CNCM 1-3724 (correspondente a 11E1), 1-3731 (correspondente a 224G11) e 1-3732 (correspondente a 227H1) (consultar a publicação do pedido de patente PCT sob o número WO 2009/007427). Exemplo 2: Desenho, clonagem e produção de versões de articulação enge- nheiradas Com base na observação feita acima, foi levantada a hipótese de que o perfil famacológico comprometido observado quando da reforma- ção de IgG1 de camundongo para Mabs humanos IgG1 teria sido provocado pelo domínio da IgG1 humana.

WD

. Por um lado, sabia-se na literatura que a ativação do receptor c- ' Met estava associada com sua dimerização e que a inibição da dimerização % do receptor c-Met pode inibir a sua fosforilação e sinalização em sentido : descendente.

Por outro lado, Mabs por essência são moléculas divalentes em virtude de sua base estrutural inerente e, portanto, podem agir como induto- res da dimerização de receptores c-Met.

Por conseguinte, foi levantada a hipótese de que restringindo a flexibilidade conformacional de Mabs quiméricos, como rotação, dobramento oudeformação angular tipo "wagging" (consultar Roux et al., 1997), poderia ser possível reaver as atividades intrínsecas de interesse (forte antagonismo e fraco agonismo) dos Mabs murinos precursores. Esta hipótese é reforçada pela análise das respectivas sequências de região de articulação de I9gG1 de camundongo e da humana (também denominada região H de I9G1): Região H de IgG1 de camundongo PRDCGCKPCICT SEQ ID No. 1 Região H de I9G1 de camundongo PKSCDKTHTCPPCP SEQ ID No. 11 Região H de IgG2 de camundongo RKCCVECPPCP SEQ ID No. 7 Este alinhamento mostra que a região H da IgG1 de camundon- go é mais curta e contém uma ponte dissulfeto adicional (Cys), em compara- ção à região H da IgG1 humana. Além disso, indica que a região H da IgG2 humana se assemelha à região H da IgG1 de camundongos, tanto em ex- tensão (11 AA) como em número de pontes dissulfeto (4).

Por conseguinte, é especulado se a rigidez da região H da I9gG1 humana poderia ser aumentada se fossem introduzidas mutações estabili- zadoras, tais como resíduos Cys e/ou ou se este segmento em particular fosse encurtado. Esta suposta rigidez aumentada da região H pode estar associada com propriedades funcionais melhoradas do Mab engenheirado delgG1humana.

Uma primeira série de 7 versões engenheiradas foi desenhada ; (Tabela 2), nas quais regiões H quiméricas foram produzidas pela troca de porções de articulação em N-terminal ou C-terminal entre sequências de D camundongo e humanas. Uma IgG2 equivalente foi também engenheirada.

. Tabela 2 . : ATIRGEO WERE o VIER HulgG, Huligo, MlçG, MH MMCH MMH MUPIH MUCTH THTCA69 . EG, IgG EG 6 -kgG IgG, - = P F P F Fr P P P R x R R &X x R R x . K 8 D D 8 s p ) s Cc c c c c c c c c p - D G G c G G G E) - x - - - - - - - Cc T c c c c Cc c c : v E x K &x x x É q E T Pp P P P Pr r - Cc c c c c c c c c P P 1 z 1 1 P Pp P : P P - - - - P P Pp Cc c c Cc c c c c c P P T rT T Pr Pr P Pr Uma série adicional de 28 mutantes na região H foi desenhada e engenheirada com a finalidade de avaliar a influência da introdução de um resíduo cisteína adicional dentro da região H, da deleção de pelo menos um aminoácido ou de se combinar simultaneamente a adição de uma cisteína e a deleção de pelo menos um aminoácido dentro da região H.

Esta série inovadora de mutantes de articulação está descrita na Tabela 3. Tabela3 (601 Nº02 Nº03 Nº04 NºOS5 Nº06 NºO7 NºOB NºOS Nº10 Neil Nºt2 Nº13 Nolá EANES C | K s ce D x rT E 7 c P P c P * ea P|— Cc s c D xK Tt E T c P P c P MP | K c c D xK T E T Cc P PF c P PK 8 c e K 7 E T c P P ce P P K s ce D c 7 E T Cc PF P c P PK s ce D x Cc E T Cc P P Cc P Pr K 8 ce D K.|-7 ce z c P P c P PÍIK 8 ce D x T E c ce P P c P P x sa Cc D xK T A T c Cc P ce P A PÍIXK E c D xK 7 E Tr c P ce Cc P SE Pp | x | s | c | |D|x|TtT|=|/tT|/c|r|r| clic [8 |e|-|s|e|D|x|t|jmE|tT|c|rirjc|r ras | PIRK s ce D ” T E T c P P c P | as | P K 8 c D xK T E - c P P c P - x - ce D K 7 E Tr Cc P P ce P ' Pj- 8 c - x 7 E T Cc P P c P [| a6s | P K 8 ce D - T E - Cc P P cc P [| asse |r|x|s|c|-|-[|*je|tT|c|P|Pr|c|r PI|K s c D K T - T ce - Pp Cc P PÍIXK s Cc D xK T E -. Cc P P ce - P|IK s c D r ce E T Cc P P Cc PF Í | css | P K s c D c r E - ce P P ce P P Cc Ss Cc - K - E T Cc P P c P | csar6 | P - s ce ce - Tr E T Cc P P Cc P [| csaz7 | P - s c D K - E c c P P e P EEE Pp | x | s | - | - |- | tz |8 | Tt |/c|PjP|c|P Se P|x|s|c|-|-|-|-|tT|cirjr|c|r ESSA Pp | x | s | c | D|x | c|vi|erjcir|rj|cir —

. Como um exemplo de construção de região de articulação, o ' domínio variável (cadeias pesada e leve) de um Mab anti-c-Met de camun- , dongo, denominado 224G11, foi escolhido.

Estas sequências de camundongo foram fundidas em primeira instância a domínios constantes humanos [Ckappa], para a cadeia leve, e [CH1-Articulação-CH2-CH3] para a cadeia pesada da I9G1 humana. A modi- ficação da região de articulação foi realizada trocando um segmento de res- trição (Nhe1-Bcl1) pela porção equivalente carreando as modificações dese- jadas, cada respectivo fragmento (Nhe1-Bcl1) sendo sintetizado por síntese gênica global (Genecust, LU). Todos os novos mutantes de articulação fo- ram engenheirados sobre a mesma base. Todas as etapas de clonagem foram realizadas de acordo com técnicas convencionais de biologia molecular, conforme descritas no manual Laboratory (Sambrook e Russel, 2001) ou de acordo com as instruções do fornecedor. Cada construção genética foi integralmente validade por se- quenciamento de nucleotídeos, usando o kit de sequenciamento de ciclo terminal Big Dye (Applied Biosystems, EUA) e analisadas com Analisador 3100 Genetic (Applied Biosystems, EUA). Células HEK293 EBNA adaptadas em suspensão (InVitrogen, EUA) foram cultivadas como de rotina em frascos de 250 mL em 50 mL de meio Excell 293 sem soro (SAFC Biosciences), suplementado com glutami- na 6 mM, em misturador orbital (velocidade de rotação: 110 rpm). A trans- fecção transitória foi realizada com 2,10º células/mL, usando polietilenoimina (PEI) de 25 kDa (Polysciences), preparada em água em concentração final de1 mg/ml misturado e DNA de plasmídio (concentração final de 1,25 p- g/mL para razão de 1:1 de cadeia leve para pesada de plasmídio). Após 4 horas da transfecção, a cultura foi diluída com um volume de meio de cultura fresco para se obter densidade celular final de 10º células/mL. O processo de cultivo foi monitorado com em base viabilidade celular e produção de —Mab. Tipicamente, as culturas foram mantidas por 4 a 5 dias. Os Mabs foram purificados empregando uma abordagem convencional de cromatografia em resina contendo Proteína A (GE Healthcare, EUA). E———

- Todas as diferentes formas de Mabs foram produzidas em níveis ' adequados com avaliações funcionais.

Os níveis de produtividade variam : tipicamente entre 15 e 30 mg/L de Mabs purificados.

Exemplo 3: Avaliação dos Mabs engenheirados em ensaio ELISA específico parafosfo-c-Met.

Células A549 foram semeadas em uma placa multicavidade (MV) de 12 cavidades em meio completo de crescimento [F12K + FCS 10%]. As células foram submetidas à privação por 16 horas antes de estimulação com HGF [100 ng/mL], e cada Mab a ser testado foi adicionado em sua con- centração final de 30 ug/MI, 15 minutos antes que a estimulação com o |li- gante.

Tampão de lise gelado foi adicionado 15 minutos depois da adição de HGF para interromper a reação de fosforilação.

As células foram raspadas mecanicamente, e os lisados celulares foram coletados por centrifugação a 13000 rpm por 10 minutos a 4ºC e corresponderam à fase sobrenadante.

O conteúdo proteico foi quantificado com kit BCA (Pierce) e armazenado a - 20ºC até o uso.

O status de fosforilação de c-Met foi quantificado por ELISA.

Um Mab anti-c-Met de cabra (R&D, ref.

AF276) foi utilizado como anticorpo de captura (revestimento durante a noite a 4ºC) e, após uma etapa de satu- ração com tampão TBS-BSA 5% (1 hora em temperatura ambiente (TA)), 25 ug de lisados de proteína foram adicionados a cada cavidade da placa 96MW re- vestida.

Depois de 90 minutos de incubação em TA, as placas foram lavadas quatro vezes e o anticorpo de detecção foi adicionado (Mab anti-fosfo-c-Met direcionado contra os resíduos Tyr fosforilados nas posições 1230, 1234 e 1235). Após 1 hora adicional de incubação e 4 lavagens, um anticorpo anti- coelho acoplado a HRP (Biosource) foi adicionado por 1 hora em TA, e a detecção de luminescência foi realizada adicionando Luminol.

A luminescên- cia foi lida em leitor de placa multimodo Mithras LB920 (Berthold). Uma série de versões engenheiradas do domínio de articulação da cadeia pesada foi engenheirada e analisada no ensaio de fosforilação de receptor c-Met.

Como mostrado na Figura 2A, comparado a 224G11[19G1- Chim], uma importante redução do efeito agonista associado com o isotipo hlgG1/kappa foi observada para a construção à base de IgG2 e para algu- Ne

º mas versões engenheiradas de IgG1/kappa [MH, MUP9H e TH7], Figura ' 2A]. Atividades agonistas mais fracas e comparáveis foram obtidas com í 24G11[MH-lgG1], contendo a região de articulação completa de I9G1 muri- na, e 224G11[TH7] contendo a mais região de articulação engenheirada de IgG1 humana. Um aumento concomitante em eficácia antagonista foi tam- bém obtido [Figura 2B]. Dessa forma, tanto o mutante à base de IgG2 como o mutante de articulação TH7 à base de hlgG1/kappa, associados com do- mínio variável de 224G11 murino, resultaram em atividades funcionais quase que semelhantes àquela do Mab 224G11 de camundongo. No entanto, a comparação de atividades agonista/antagonista de 224G11[MMCH-lgG1- chim] com 224G11[IgG1-chim] demonstrou que poderia a atividade antagonista poderia ser aumentada, pela construção de anticorpo, independentemente das propriedades agonistas intrínsecas deste anticorpo.

Uma segunda série de versões engenheiradas do domínio de ar- ticulação da cadeia pesada foi engenheirada e analisada no ensaio de fosfo- rilação de receptor c-Met. De acordo com a Figura 11A, a substituição de aminoácido em domínio de articulação de cadeia pesada introduzindo resí- duos cisteína modificou o efeito agonista de anticorpos. De fato, por um lado, algumas versões mutantes exibiram efeito agonista mais fraco do que c224G11, como por exemplo, c224G11[C2], c224G11[C3], c224G11[C5], c224G11[C6] ou c224G11[C7], enquanto outras, efeito agonista aumentado como c224G11[C11], c224G11 [012] e c224G11[C14]. Além disso, deleções de aminoácidos no domínio de articulação da cadeia pesada, associadas ou não com substituições, modificaram também as propriedades agonistas dos anticorpos [Figura 11B]. Por exemplo, C224G11[A41-3], c224G11[A44-5-6], c224G11[A5-6-7-8], c224G11[C7A6]), c224G11[C6A9], c224G11[C2A5-7], c224G11[C5A2-6] ou c224G11[C9A2-7] revelaram efeito agonista mais fraco do que c224G11, enquanto c224G11 [48-11] exibiu efeito agonista mais for- te. Da mesma forma que c224G11 [TH7], todas as novas versões exibindo efeito agonista mais frasco mostraram aumento concomitante em eficácia antagonista [Figura 12A e 126), enquanto aquelas exibindo efeito agonista mais forte apresentaram eficácia antagonista mais fraca.

nn

. No presente pedido de patente, o uso de colchetes não é neces- ' sário e, a título de exemplo, a referência [224G11][IgG2chim] deve ser conside- : rada idêntica a 224G11I/gG2chim. Na mesma maneira, para indicar que o anti- : corpo é murino, a expressão murino ou a letra m pode ser adicionada; para indi- carqueo anticorpo é quimérico, a expressão chim ou a letra c pode ser adicio- nada; para indicar que o anticorpo é humanizado, a expressão hum ou a letra h pode ser adicionada. A título de exemplo, o anticorpo quimérico 224G1119G2 pode estar referido como c224G11I/g9G2, c224G11[19G2], c[224G11]I19G2, c[224G11][19G2], 224G111g9G2chim, 224G11[IgG2chim, [224G11]IgG2chim ou[224G11][lgG2chim]. | O símbolo A significa deleção. Exemplo 4: Análise por BRET Em um primeiro conjunto de experimentos, foi controlado que IgG1 de camundongo, IgG1 humana e IgG2 humana irrelevantes não apre- sentavam efeito de sinal BRET induzido por HGF em ambos os modelos BRET .(Figura 3). Esses Mabs foram utilizados ainda como controles. O efeito de formas quiméricas de IgG1 de Mab 224G11 de ca- mundongo ([224G11] chim), Mab 11E11 de camundongo ([11E1] chim) e de Mab 227H1 de camundongo ([227H1] chim) sobre dimerização de c-Met e ativaçãode c-Met em modelo BRET foi então avaliado. * Enquanto o Mab 224G11 de camundongo inibiu 59% do sinal BRET induzido por HGF em modelo de dimerização de c-Met, o Mab

[224611] chim inibiu somente 29% (Figura 4), O anticorpo [224G11] chim foi também menos eficaz em inibir ativação de c-Met induzida por HGF uma vez queos anticorpos [224G11] chim e m224G11 inibiram o sinal de BRET indu- zido por HGF em 34,5% e 56,4% (Figura 5). Além disso, apenas m224G11 não apresentou efeito sobre ativação de c-Met, enquanto [224G11] chim ob- teve efeito agonista parcial sobre ativação de c-Met, correspondente a 32,9% do sinal induzido por HGF. Este efeito agonista parcial do [224G11] chim foivisto também no modelo BRET de dimerização de c-Met, uma vez que apenas [224G11] chim induziu aumento em BRET, correspondendo a 46,6% de sinal induzido por HGF, em comparação a 21,3% para m224G11. U——

. A eficácia agonista da segunda série de versões engenheiradas ' do domínio de articulação da cadeia pesada foi avaliada em modelo BRET õ de ativação de c-Met (Figura 13A e 13B). Ao contrário de c224G11 que a- presentou efeito agonista parcial sobre ativação de c-Met, diferentes formas quiméricascom articulação mutante do anticorpo 224G11, compreendendo substituição de aminoácido, deleção de aminoácido ou ambos, não exibiram i efeito significativo sobre ativação apenas de c-Met para 224G11[C2], c224G11[C3], c224G11 [C5], c224G11[C6], c224G11[C7], c224G11[/A41-3], c224G11[A4-5-6], c224G11 [45-6-7-8], c224G11[C7A6], c224G11[C6A8], c224G11[C2A5-7], c224G11[C5A2-6] ou c224G11[C9A2-7], respectivamen- te. Em contraste, outras formas quiméricas com articulação mutante exibi- ram efeito agonista aumentado, como c224G11[A6], c224G11[C11], c224G11[012] e c224G11[C14]. Exemplo 5: Reconhecimento de c-Met por formas quiméricas e humanizadas de224G11 Uma análise por ELISA direto foi definida para determinar a -ca- pacidade de ligação das várias formas quiméricas e humanizadas no c-Met recombinante. Resumidamente, c-Met dimérico recombinante da R&D Sys- tems foi revestido em 1,25 ug/ml. em placas Immuntlon 1! de 96 cavidades. Após incubação durante a noite a 4ºC, as cavidades foram saturadas com solução de gelatina 5%/PBS. As placas foram então incubadas por 1 hora a 37ºC, antes que fossem adicionados anticorpos a serem testados em dilui- ções de duas vezes. As placas foram incubadas por mais 1 hora antes que fosse adicionado uma IgG anticamundongo de cabra conjugada com HRP para detectaro anticorpo murino, e um anti-kappa de cadeia leve humana de cabra conjugado com HRP para reconhecimento de anticorpos quiméricos e humanizados. As placas foram incubadas por uma hora e o substrato TMB Uptima para peroxidase foi adicionado por 5 minutos antes de neutralização com H2SO;,. Os resultados apresentados nas Figuras 6A e 6B indicaram que todas as formas testadas eram comparáveis no que diz respeito a reconhe- cimento de c-Met. Exemplo 6: Efeito de anticorpos murinos e quiméricos sobre proliferação de

DUE

. células NCI-H441 in vitro induzida por HGF ' Células NCI-H441 da ATCC foram cultivadas como de rotina em : meio RPMI 1640 (Invitrogen Corporation, Escócia, Reino Unido), FCS 10% (Invitrogen Corporation) e L-glutamina 1% (Invitrogen Corporation). Para en- —saiosde proliferação, as células foram divididas 3 dias antes do uso de mo- do que estivessem em fase confluente de crescimento antes da semeadura. Células NCI-H441 foram semeadas em placas de cultura de tecido de 96 cavidades em densidade de 3,75 x 10º células/cavidade em 200 ul de meio sem soro (meio RPMI 1640 mais L-glutamina 1%). Vinte e quatro horas após a semeadura, os anticorpos a serem testados foram adicionados às células NCI-H441 e incubados a 37ºC por trinta minutos antes de adicionar HGF em concentração final de 400 ng/mL (5 nM) por 142 horas adicionais. O intervalo de dose testado para cada anticorpo é de 10 a 0,0097 pg/mL (concentração final em cada cavidade). Neste experimento, Mab IgG1 murino foi adicionado como isotipo murino de controle, e os anticorpos testados foram: m224G11, m11E1, m227H1 e suas formas quiméricas de IgG1 humana, identificadas respectivamente como [224G11] chim, [11E1] chim e [227H1] chim. Placas . semeadas apenas com células + / - HGF foram incluídas também. Em se- guida, as células foram submetidas a um pulso de 0,25 uCi de PHITImidina (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suécia] por 7 horas e 30 minutos. À magnitude de [?PHJTimidina incorporada em DNA insolúvel em ácido tricloroa- cético foi quantificado por contagem de cintilação líquida. Os resultados es- tão expressos em dados não transformados de cpm para avaliar melhor a atividade agonista intrínseca potencial! que ocorreria com Mabs anti-c-Met — quando adicionados isoladamente à célula tumoral.

Os resultados descritos nas figuras 7A, 7B e 7C demonstraram que, como previsto, os anticorpos não exibiram efeito agonista quando adi- cionados isoladamente a células cancerosas, independentemente da dose testada. Não foi observada inibição significativa da proliferação induzida por HGF com o isotipo de controle, no tocante às altas variações de com obser- vadas para este isotipo de controle neste experimento. Quando adicionados isoladamente, nem m224G11 murino, nem m11E1 ou m227H1 exibiram efei-

. to agonista, comparado ao Mab mIgG1 do isotipo de controle ou células iso- ' ladamente.

Atividades antiproliferativas dose-dependente, atingindo 78%, : 80% ou 80%, ocorreram respectivamente para os Mabs m224G11, m11E1 ou m227H1 (Cálculo de inibição %: 100-[(cpm de células + cpm média de fundodemigG1do Mab a ser testado) x 100 / (com média de células + com média de apenas células-HGF)]. Surpreendentemente, a forma quimérica destes 3 Mabs induziram um efeito agonista significativo dependente de do- se, quando adicionados isoladamente, com estimulações de crescimento próximas daquela observada com HGF para [11E1] chim e [227H1] chim respectivamente.

Para estes 2 anticorpos exibindo atividades agonistas in- trínsecas especialmente altas, o efeito antagonista foi significativamente di- minuído, com 53% e 21% de efeitos inibidores, comparados a 80% observa- dos para as suas formas murinas.

O efeito agonista observado com o [224G11] chim quimérico foi também do tipo dose-dependente, porém foi mais baixo do que aqueles observados para [11E1] chim e [227H1] chim.

Contudo, este efeito agonista teve impacto sobre a inibição in vitro de prolife- ração in vitro induzida por HGF, a qual deslocou de 78%, para o m224G11 murino, para 50% para sua forma quimérica.

A fim de determinar se esta atividade agonista intrínseca "mais baixa" era compatível com um efeito in vivo inalterado, ambos m224G11 e [224G11] chim foram produzidos para ' testes in vivo.

Em estudos anteriores, a dose de 30 ug/camundongo de- monstrou atividade significativa in vivo, portanto, esta dose foi selecionada para avaliação in vivo.

Exemplo 7: Comparação in vivo de Mabs 224G11 murino e quimérico no 25! modelo de xenoenxerto de NCI-H441 NCI-H441 é derivada de adenocarcinoma papilar do pulmão, ex- pressa altos níveis de c-Met e demonstra fosforilação constitutiva de c-Met « RTK A fim de avaliar o efeito in vivo de anticorpos no modelo de xe- —noenxerto de NCI-H441, camundongos atímicos de seis a oito semanas de idade foram abrigados em gaiolas esterilizadas com filtro na parte superior, mantidos em condições estéreis e tratados de acordo com as diretrizes fran- Vn——

. cesas e europeias.

Os camundongos foram injetados por via subcutânea ' com 9 x 10º células.

Em seguida, seis dias após o implante celular, os tumo- ' res eram mensuráveis (aproximadamente 100 mm?), e os camundongos fo- ram divididos em grupos de 6 com tumor de tamanho comparável e tratados inicialmente com uma dose de ataque de 60 ug/camundongo e, depois, duas vezes por semana com 1 mg/dose de cada anticorpo a ser testado.

Os ca- mundongos foram acompanhados para a observação de taxa de crescimen- to do xenoenxerto.

O volume tumoral foi calculado pela fórmula: tr (Pi)/6 x comprimento x largura x altura.

Os resultados descritos na Figura 8 demons- tram que o Mab murino desprovido de atividade agonista in vivo comporta- se, como previsto, como potente antagonista mesmo na dose baixa testada.

Em contraste ao observado com o Mab murino, o quimérico exibiu uma ativi- dade muito transitória in vivo e o tumor escapou completamente ao trata- mento no D20 após a injeção das células.

Este experimento demonstra cla- ramente que o aumento de efeito agonista in vitro que resultou em redução de atividade antagonista foi responsável também por uma perda significativa in vivo de atividade antagonista.

Exemplo 8: Efeito do Mab 224G11 murino e de várias versões quiméricas e humanizadas deste anticorpo sobre proliferação induzida por HGF de células NCI-H441 in vitro Células NCI-H441 da ATCC foram cultivadas como de rotina em meio RPMI 1640 (Invitrogen Corporation, Escócia, Reino Unido), FCS 10% (Invitrogen Corporation) e L-glutamina 1% (Invitrogen Corporation). Para en- saios de proliferação, as células foram divididas 3 dias antes do uso de mo- do que estivessem em fase confluente de crescimento antes da semeadura.

Células NCI-H441 foram semeadas em placas de cultura de tecido de 96 cavidades em densidade de 3,75 x 10º células/cavidade em 200 ul de meio sem soro (meio RPMI 1640 mais L-glutamina 1%). Vinte e quatro horas após a semeadura, os anticorpos a serem testados foram adicionados às células NCI-H441 e incubados a 37ºC por trinta minutos antes de adicionar HGF em concentração final de 400 ng/mL (5 nM) por 142 horas adicionais.

O intervalo de dose testado para cada anticorpo é de 10 a 0,0097 ug/mL (concentração U——"——

. final em cada cavidade). Neste experimento, Mab IgG1 murino foi adicionado ' como isotipo murino de controle e controle negativo de agonista.

Os anticor- ' pos testados foram: i) m224G11, ii) suas formas quiméricas de IgG1 huma- na, identificadas respectivamente como [224G11] chim, [224G11] [MH chim], [224G11] [MUP9H chim], [224G11] [MMCH chim], [224G11] [TH7 chim], iii) suas formas humanizadas de IgG1, descritas respectivamente como [224G11] [Hz1], [224611] [Hz2], [224611] [Hz3]. O anticorpo completo 5D5 da Genentech, comercialmente disponível na ATCC como linhagem celular de hibridoma, foi introduzido como controle positivo de agonista completo e, posteriormente, denominado m5D5. Em seguida, as células foram submeti- i das a um pulso de 0,25 JCi de PHITimidina (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suécia] por 7 horas e 30 minutos.

A magnitude de [HITimidina in- corporada em DNA insolúvel em ácido tricloroacético foi quantificado por contagem de cintilação líquida.

Os resultados estão expressos em dados não transformados de cpm para avaliar melhor a atividade agonista intrínse- ca potencial que ocorreria com Mabs anti-c-Met quando adicionados isola-

damente à célula tumoral.

Os resultados descritos na figura 9A demonstraram que, como previsto, nem o isotipo de controle, nem o m224G11 exibiram efeito agonista sobre proliferação de NCI-H441. O isotipo de controle não teve efeito sobre proliferação celular induzida por HGF, enquanto que m224G11 mostrou 66% de inibição quando adicionado na concentração final de 10 ug/ml.

O m5D5 utilizado como controle de agonista revelou, como previsto, efeito de agonis- ta completo dose-dependente quando adicionado isoladamente às células.

Comojá observado, o Mab [224G11] chim exibiu efeito agonista significativo dose-dependente e, atividade inibidora reduzida deste quimérico foi obser- vada: 19% em vez de 66% para a forma murina.

Quando adicionados isola- damente, os 3 Mabs IgG1 humanizados demonstraram efeitos agonistas dose-dependente, comparado à forma m224G11. [224G11] [Hz1], [224G11] [Hz2] e [224611] [Hz3) apresentaram atividades antagonistas comparáveis de aproximadamente 46, 30 e 35%. Estas atividades são significativamente mais baixas do que a observada para m224G11. Na Figura 9B, várias for-

—

. mas quiméricas de IgG1 foram testadas. Comparadas à forma [224G11] ' chim, que exibiu efeito agonista dose-dependente quando adicionada isola- : damente a células NCI-H441, as formas [224G11] [MH chim], [224G11] , IMUP9H chim], [224911] [MMCH chim] e [224G11] [TH7] não tiveram efeito agonista intrínseco significativo. A atividade antagonista destas formas foi * mais alta do que a observada para o Mab m224G11 (57%) com inibições atingindo 79, 78, 84 e 93%, respectivamente para [224911] [MH chiml], [224G11] [MUP9H chiml], [224911] [MMCH chim] e [224G11] [TH7]. Exemplo 9: Efeito in vitro de várias formas quiméricas e humanizadas de IgG1doMab 224G11 Células NCI-H441 da ATCC foram cultivadas como de rotina em meio RPMI 1640 (Invitrogen Corporation, Escócia, Reino Unido), FCS 10% (Invitrogen Corporation) e L-glutamina 1% (Invitrogen Corporation). Para en- saios de proliferação, as células foram divididas 3 dias antes do uso de mo- doque estivessem em fase confluente de crescimento antes da semeadura. Células NCI-H441 foram semeadas em placas de cultura de tecido de 96 cavidades em densidade de 3,75 x 10º células/cavidade em 200 uL de meio sem soro (meio RPMI 1640 mais L-glutamina 1%). Vinte e quatro horas após a semeadura, os anticorpos a serem testados foram adicionados às células NCI-H441 e incubados a 37ºC por trinta minutos antes de adicionar HGF em concentração final de 400 ng/mL (5 nM) por 142 horas adicionais. O intervalo de dose testado para cada anticorpo é de 10 a 0,0097 ug/mL (concentração final em cada cavidade). Neste experimento, Mab I9gG1 murino foi adicionado como controle negativo de fundo para atividade agonista, e os anticorpos testados foram: i) m224G11, ii) suas formas quiméricas de IgG1 humana, identificadas respectivamente como [224G11] chim, [224G11] [MH chim], [224G11] [TH7 chim], iii) suas formas humanizadas de I9G1, descritas como

[224911] [TH7 Hz1], [224G11] [(TH7 Hz3]. Cavidades semeadas com apenas células +/- HGF foram incluídas também. O anticorpo completo 5D5 da Ge- nentech, comercialmente disponível na ATCC como linhagem celular de hi- bridoma, foi introduzido como controle positivo de agonista completo e, pos- teriormente, denominado m5D5. Em seguida, as células foram submetidas a —

” um pulso de 0,25 uCi de [H]ITimidina (Amersham Biosciences AB, Uppsala, ' Suécia] por 7 horas e 30 minutos. A magnitude de ['HITimidina incorporada em ' DNA insolúvel em ácido tricloroacético foi quantificado por contagem de cintila- ' ção líquida. Os resultados estão expressos em dados não transformados de cpm para avaliar melhor a atividade agonista intrínseca potencial que ocorreria com Mabs anti-c-Met quando adicionados isoladamente à célula tumoral.

A figura 10 indicou que o Mab m224G11 exibiram o efeito inibi- dor habitual (74% de inibição). A forma quimérica de IgG1, [224911] chim, teve, como previsto, efeito agonista intrínseco dose-dependente e efeito an- tagonista mais baixo comparado à forma murina: 33% versus 74% de inibi- ção. O [224G11] [TH7 chim] apresentou atividade agonista muito fraca neste experimento. Adicionalmente, exibiu alto efeito inibidor (81%), próximo àquele observado para o Mab murino. As 2 formas humanizadas não tiverem efeito agonista intrínseco e sua atividade antagonista foi próxima daquelas observa- dasparaoMab murino ou para o [224G1 1] [TH7 chim], com respectivamente 67% e 76% de inibição para [224G11] [TH7 Hz1] e [224G11] [TH7 Hz3]. Exemplo 10: Troca de isotipo para a região de articulação (TH7] engenheira- da A fim de avaliar a modulação de propriedades farmacológicas induzidas pela sequência de articulação [TH7], correspondente a PKSCD- CHCPPCP, em cadeias principais de imunoglobulinas diferentes da I9G1 humana, os inventores transferiram geneticamente a sequência [TH7] descri- ta acima em cadeias principais de IgG2 e IgG4 humanas. A região de articu- lação foi modificada pela troca de um fragmento de restrição (Nhel1-Bel1) —pelaporção equivalente carreando a modificação [TH7], o fragmento (Nhel1- Bel1) sendo sintetizado por síntese gênica global (Genecust, LU). As etapas de clonagem foram realizadas de acordo com técnicas convencionais de biologia molecular como descritas no manual Laboratory (Samuel e Russel, 2001) ou de acordo as instruções do fornecedor. Cada construção genética foi integralmente validada por sequenciamento de nucleotídeos usando o kit de sequenciamento de ciclo terminador Big Dye (Applied Biosystems) e anali- sados com Analisador 3100 Genetic (Applied Biosystems). As sequências re- ——

-” sultantes são descritas como SEQ ID Nos. 78, 79, 80 e 81, respectivamente ' para sequências de aminoácidos e de nucleotídeos dos isotipos I9G2 e IgG4 ' engenheiradas com TH7 (apenas a cadeia pesada, a cadeia leve era idênti- ca à de c224G11/Ckappa humana, utilizada para todas as outras constru- çõescom base em !IgG1). Estas construções inovadoras foram aplicadas ao Mab quimérico 224G11 anti-c-Met, como descrito acima no Exemplo 2. Os anticorpos correspondentes engenheirados, c224G11[IgG2th7] e c224G11[IgG4th7], foram produzidos como descrito acima por expressão transitória em células HEK293 EBN adaptadas em suspensão.

Exemplo 11: Avaliação dos Mabs engenheirados c224G11[I19G2TH7] e c224G11 [IgG4TH7] em ensaio ELISA específico para fosfo-c-Met e ensaio BRET.

A articulação TH7 foi introduzida também em Mabs quiméricos 224G11 IgG2 e IgG4 e testada no ensaio de fosforilação de receptor c-Met.

Como mostradoem 14A e 14B, c224G11[IgG2TH7] e c224G11[IgG4TH7] indu- ziram apenas leve efeito agonista, porém significativamente mais fraco do que Mab c224G11, e exibiram efeito antagonista comparável à forma murina do Mab 224G11 (m224G11). Esse resultado foi confirmado em modelo BRET de ativação de c-Met (Figura 15), no qual c224G11[IgG2TH7] e c224G11 [IgG4TH7] revelaram também ser agonista mais fraco do que Mab c224G11.

Portanto, a mutação de articulação TH7 introduzida em formato de IgG2 oulgG4 de Mab deu origem a anticorpos funcionais com proprieda- des semelhantes a c224G11[TH7].

Exemplo 12: Ensaio de adesão celular ' Células PC3 de câncer de próstata foram destacadas de placas com tripsina, lavadas 3 vezes com meio F12k sem soro e novamente sus- pensas no mesmo meio. As células (100.000 células/cavidade) fora semeadas em placas de 96 cavidades, revestidas com Laminin 1 a 1 ug/mL. As formas a seguir do Mab anti-CD151 a ser testado foram adicionadas simultaneamente na concentração final de 10 ug/mL: o Mab IgG1 murino m214B2, a forma de anticorpo quimérico não modificado I9G1 denominado c214B2 e a forma de anticorpo quimérico IgG1 com a modificação TH7 denominado cTH7-214B2.

DEE

. CD151 é uma proteína de membrana pertencente à família de ' tetraspanina, e o Mab 214B2 anti-CD151, produzido pelo hibridoma 1-3919, depositado na CNCM em 21 de fevereiro de 2008, estão descritos na publi- cação do pedido de patente WO 2009/136070.

Os anticorpos IgG1 murino e humano foram utilizados como an- ticorpos de controle de isotipo. As condições finais foram: 100.000 célu- las/cavidade e anticorpos a 10 ug/mL. Após uma hora de incubação a 37ºC, as placas foram desfolhadas e lavadas duas vezes com meio F12k sem so- ro. Antes da análise, 100 ul de meio F12k sem soro foram distribuídos em cada cavidade. A fim de determinar o efeito de anticorpos sobre adesão ce- lular, as cavidades foram fotografadas sob microscópio de contraste de fase (figura 16). Em seguida, o número de células aderidas foi determinado com um ensaio para ATP (Figura 17). Os anticorpos 214B2 murino e TH7-214B2 quimérico foram ca- pazes de modificar interações célula-célula (Figura 16) e aumentar equiva- lentemente a adesão de células PC3 (Figura 17), enquanto que não foi ob- servado efeito com a forma quimérica não modificada de 214B2 (c214B2), que foi comparável ao anticorpo IgG1 humano de controle de isotipo. Do eee

Claims (30)

1. . REIVINDICAÇÕES º 1. Processo para melhorar a atividade antagonista de um anti- ' corpo monoclonal direcionado contra uma molécula-alvo específica, ou um ' fragmento funcional divalente ou derivado do mesmo, o referido anticorpo sendo capaz de inibir uma ou mais das atividades biológicas da referida mo- lécula-alvo, em que o referido processo compreende um estágio de reconfi- guração da região de articulação, consistindo em uma modificação da se- quência de aminoácidos da referida região de articulação pela deleção, pela adição ou pela substituição de pelo menos um aminoácido.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a referida modificação é selecionada a partir de: i) a deleção de pelo menos um aminoácido da referida sequên- cia de aminoácidos da região de articulação; e/ou ii) a adição de pelo menos uma ponte dissulfeto na referida regi- ãáode articulação.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que a modifi- cação i) consiste na deleção de no máximo 2, 3 ou 4 aminoácidos da referi- da sequência de aminoácidos da região de articulação.
4. 4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a : 20 3,emqueoreferido anticorpo monocilonal é um anticorpo divalente.
5. 5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 3, em que o referido anticorpo monoclonal é um anticorpo quimérico.
6. 6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o referido anticorpo monoclonal é um anticorpo humanizado.
7. 7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o referido anticorpo monoclonal é um anticorpo humano.
8. 8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o referido anticorpo monoclonal é uma IgG1.
9. 9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8,emqueareferida molécula-alvo é um receptor transmembrana.
10. 10. Processo de acordo com a reivindicação 9, em que o referido receptor transmembrana é selecionado a partir do grupo constituído pelos
11. "” receptores tirosina quinase, tetraspanina e GPCRs. " 11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 = í a 10, em que a referida modificação consiste em pelo menos uma deleção : de um aminoácido selecionado a partir do aminoácido nas posições H1, H2, H3,H5,H6,H7,H8,H9,H11,H120ouH14.
12. 12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que a referida modificação consiste em pelo menos uma deleção de um aminoácido na região "de articulação superior", situada entre as posi- ções H1 e H9 da referida sequência de aminoácidos da região de articula- ção.
13. 13. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 12, em que a referida modificação consiste na deleção de pelo menos uma Cisteína na região "de articulação superior", de preferência situada na posição H4.
14. 14. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 12, em que a referida modificação consiste na introdução de pelo menos uma Cisteína na região "de articulação superior".
15. 15. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que a referi- da modificação consiste na substituição da Treonina na posição H7 da regi- ão "de articulação superior" por uma Cisteína.
16. 16. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que a referi- da modificação consiste na substituição da Lisina na posição H6 da região "de articulação superior" por uma Cisteína.
17. 17. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que a referi- da modificação consiste na substituição da Prolina na posição H1 da região "de articulação superior" por uma Cisteína. |
18. 18. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que a referi- da modificação consiste na substituição da Lisina na posição H2 da região "de articulação superior" por uma Cisteína.
19. 19. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que a referi- da modificação consiste na substituição da Serina na posição H3 da região "de articulação superior" por uma Cisteína.
20. 20. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que a referi-
21. NU f da modificação consiste na substituição do Aspartato na posição H5 da regi- ' ão "de articulação superior" por uma Cisteína. Í 21. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que a referi- . da modificação consiste na substituição da Histidina na posição H8 da região "dearticulação superior" por uma Cisteína.
22. 22. Processo de acordo com a reivindicação 14, em que a referi- da modificação consiste na substituição da Treonina na posição H9 da regi- ão "de articulação superior" por uma Cisteína.
23. 23. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 10, em que a referida modificação consiste em uma substituição dos aminoácidos H1 a H14 da região de articulação de I9G1 pelos aminoácidos H1 a H14 de uma região de articulação de IgG2, quando o referido anticorpo monoclonal para o qual se deseja melhorar sua atividade antagonista é uma 19G1.
24. 24. Processo de rastreamento para um anticorpo monoclonal an- tagonista direcionado contra uma molécula-alvo específica, ou um fragmento funcional divalente ou derivado do mesmo, o referido anticorpo sendo capaz de inibir uma ou mais das atividades biológicas da referida molécula-alvo, em que o referido processo compreende as etapas de: (a) selecionar um anticorpo inicial com nível inicial de inibição da referida uma ou mais atividades biológicas da referida molécula-alvo; (b) modificar a sequência de aminoácidos da região de articula- ção do referido anticorpo inicial pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, | (c) avaliar o anticorpo modificado da etapa (b) quanto a sua ca- —pacidade para inibir a referida uma ou mais atividades biológicas da referida molécula-alvo, e (d) selecionar, como resultado positivo, o anticorpo da etapa (c) com nível de inibição da referida uma ou mais atividades biológicas da refe- rida molécula-alvo mais alta do que o nível inicial da referida inibição.
25. 25. Anticorpo monoclonal direcionado contra uma molécula-alvo específica, ou fragmentos funcionais divalentes ou derivados dos mesmos, a serem obtidos pelo processo como definido em uma das reivindicações 1 a

    « r 24, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de aminoácidos :º da região de articulação selecionada a partir do grupo constituído por: í SEQ ID No. 1 (PRDCGCKPCICT), SEQ ID No. 2 (PKSCGCKPCICT), SEQ ID No. 3 (PKSCGCKPCICP), SEQ ID No. 4 v (PRDCGCKPCPPCP), SEQ ID No. 5 (PRDCGCHTCPPCP), SEQ ID No. 6 (PKSCDCHCPPCP), SEQ ID No. 7 (RKCCVECPPCP), SEQ 1D No. 22 (CKSCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 23 (PCSCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 24 (PKCCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 25 (PKSCCKTHTCPPCP), SEQ ID No. 26 (PKSCDCTHTCPPCP) SEQ ID No. 27 (PKSCDKCHTCPPCP), SEQ ID No. 28 (PKSCDKTCTCPPCP), SEQ ID No. 29 (PKSCDKTHCCPPCP), SEQ ID No. 30 (PKSCDKTHTCCPCP), SEQ ID No. 31 (PKSCDKTHTCPCCP), SEQ ID No. 32 (PKSCDKTHTCPPCO), SEQ ID No. 33 (PSCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 34 (PKSCDTHTCPPCP), SEQ ID No. 35 (PKSCDKTHCPPCP), SEQ ID No. 36 (KCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 37 (PSCKTHTCPPCP), SEQ IDNo. 38 (PKSCDTHCPPCP), SEQ ID No. 39 (PKSCTHTCPPCP), SEQ ID No. 40 (PKSCDKTTCPCP), SEQ ID No. 41 (PKSCDKTHCPPC), SEQ ID No. 42 (PKSCDCHTCPPCP), SEQ ID No. 43 (PKSCDCTHCPPCP), SEQ ID No. 44 (PCSCKHTCPPCP), SEQ ID No. 45 (PSCCTHTCPPCP), SEQ ID No. 46 (PSCDKHCCPPCP), SEQ ID No. 47 (PKSTHTCPPCP), SEQ ID No. 48 — (PKSCTCPPCP) or SEQID No.49 (PKSCDKCVECPPCP).
26. 26. Anticorpo monocional, caracterizado pelo fato de compreen- der uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído por: SEQ ID No. 1 (PRDCGCKPCICT), SEQ ID No. 2 (PKSCGCKPCICT), SEQ ID No. 3 (PKSCGCKPCICP), SEQ ID No. 4 (PRDCGCKPCPPCP), SEQ ID No. 5 (PRDCGCHTCPPCP), SEQ ID No. 6 (PKSCDCHCPPCP), SEQ ID No 7 (RKCCVECPPCP), SEQ ID No. 22 (CKSCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 23 (PCSCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 24 (PKCCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 25 (PKSCCKTHTCPPCP), SEQ ID No. 26 (PKSCDCTHTCPPCP) SEQ ID No. 27 (PKSCDKCHTCPPCP), SEQ ID No. 28 (PKSCDKTCTCPPCP), SEQ ID No. 29 (PKSCDKTHCCPPCP), SEQ ID No, 30 (PKSCDKTHTCCPCP), SEQ ID No. 31 (PKSCDKTHTCPCCP), SEQ ID No. 32 (PKSCDKTHTCPPCC), SEQ ID No. 33 (PSCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 34 (PKSCDTHTCPPCP), SEQ ID No. 35 (PKSCDKTHCPPCP), SEQ ID No. 36 (KCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 37 (PSCKTHTCPPCP), SEQ IDNo. 38 (PKSCDTHCPPCP), SEQ ID No. 39 (PKSCTHTCPPCP), SEQ ID No. 40 (PKSCDKTTCPCP), SEQ ID No. 41! (PKSCDKTHCPPC), SEQ ID No. 42 y (PKSCDCHTCPPCP), SEQ ID No. 43 (PKSCDCTHCPPCP), SEQ ID No. 44 . (PCSCKHTCPPCP), SEQ ID No. 45 (PSCCTHTCPPCP), SEQ ID No. 46 . (PSCDKHCCPPCP), SEQ ID No. 47 (PKSTHTCPPCP), SEQ ID No. 48 . (PKSCTCPPCP) or SEO ID No. 49 (PKSCDKCVECPPCP). ,
27. 27. Anticorpo monoclonal de acordo com uma das reivindicações 25 e 26, em que o referido anticorpo é um anticorpo humano.
28. 28. Anticorpo monoclonal de acordo com uma das reivindicações 25a27,emqueo referido anticorpo é um anticorpo IgG1.
29. 29. Ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo monocional como definido na reivindicação 25 a 28.
30. 30. Ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 29, em que o referido ácido nucleico que compreende uma sequência nucleica é selecionado a partir do grupo constituído pela SEQ ID No. 15 a SEQ ID No. 21 e SEQ ID No. 50 a SEQ ID No. 77.

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