JP5832899B2 - モノクローナル抗体の拮抗活性の調節方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は抗体工学分野に関し、より詳細には、抗体のスクリーニングおよび／または抗体の促進／拮抗活性の調節方法に関する。より詳細には、本発明は、モノクローナル抗体、またはその二価機能的断片もしくは誘導体の拮抗活性を遺伝子工学による調節方法に関する。本発明はまた、このような調節方法に有用なポリペプチドおよび得られた抗体に関する。
本発明は抗体工学分野に関し、より詳細には、抗体のスクリーニングおよび／または抗体の促進／拮抗活性の調節方法に関する。より詳細には、本発明は、モノクローナル抗体、またはその二価機能的断片もしくは誘導体の拮抗活性を遺伝子工学による調節方法に関する。本発明はまた、このような調節方法に有用なポリペプチドおよび得られた抗体に関する。
「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は最も広い意味において互換的に用いられ、モノクローナル抗体（例えば、全長または完全モノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多価抗体、または多重特異性抗体（例えば、それらが所望の生物活性を示す限り二重特異性抗体(bispecific antibody)）を含む。
より詳細には、このような分子は、ジスルフィド結合により内部連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と、２本の軽（Ｌ）鎖とを含んでなる糖タンパク質からなる。各重鎖は重鎖可変領域（またはドメイン）（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）と、重鎖定常領とからなる。重鎖定常領域は三つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）と、軽鎖定常領域とからなる。軽鎖定常領域は一つのドメインＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存性の高い領域が散在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で並んだ三つのＣＤＲと、四つのＦＲとからなる。重鎖および軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および従来の補体系の第一の成分（Ｃ１ｑ）とを含む宿主組織または因子との結合を媒介し得る。
免疫グロブリンの重鎖は三つの機能的領域：Ｆｄ領域、ヒンジ領域、フレキシブルヒンジ領域により接続されたＦｃ領域（結晶化可能な断片）に分けることができる。Ｆｄ領域はＶＨおよびＣＨ１ドメインを含んでなり、軽鎖と組み合わさってＦａｂ、すなわち抗原結合断片を形成する。Ｆｃ断片は、例えば、補体結合およびエフェクター細胞の同族Ｆｃ受容体との結合を含む免疫グロブリンエフェクター機能を担っている。ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤ免疫グロブリンクラスに見られるヒンジ領域は、Ｆａｂ部分がＦｃ領域に対して空間的に自由に動くことができるようなフレキシブルスペーサーとして働く。定常領域とは対照的に、ヒンジドメインは構造的に多様であり、免疫グロブリンクラスおよびサブクラスの間で配列と長さの双方が異なる。
結晶学的研究によれば、免疫グロブリンヒンジ領域はさらに構造的および機能的に、アッパーヒンジ(upper hinge)、コアおよびロワーヒンジ(lower hinge)の三つの領域に細分することができる(Shin et al, Immunological Reviews 130:87, 1992)。アッパーヒンジは、ＣＨ１のカルボキシル末端から、動きを制限するヒンジの最初の残基、一般には２本の重鎖間で鎖内ジスルフィド結合を形成する最初のシステイン残基までのアミノ酸を含む。アッパーヒンジ領域の長さは抗体のセグメントフレキシビリティーに相関する。コアヒンジ(core hinge)領域は重鎖内ジスルフィド架橋を含む。ロワーヒンジ領域はＣＨ２ドメインのアミノ末端を連結し、ＣＨ２アミノ末端の残基を含む。ヒトＩｇＧ１のコアヒンジ領域は、ジスルフィド結合の形成により二量体化した際に、ピボットとして働くことによってフレキシビリティーを付与すると考えられている環状オクタペプチドを生じる配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓを含む。免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチド配列の構造およびフレキシビリティーにより許容されるコンフォメーション変化は抗体のＦｃ部分のエフェクター機能に影響を及ぼし得る。
一般に、ネズミ起源のモノクローナル抗体またはそれらの機能的断片の作製に関しては、特に、手引き書"Antibodies" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988)に記載されている技術またはKohler and Milstein (Nature, 256:495-497, 1975)により記載されているハイブリドーマからの調製技術を参照することができる。その後、モノクローナル抗体を、例えば該モノクローナル抗体により特異的に認識されるエピトープを含む対象受容体またはその断片の一つが予め固定されたアフィニティーカラムで精製することができる。より詳細には、該モノクローナル抗体は、Ａおよび／またはＧタンパク質上でのクロマトグラフィーにより精製することができ、その後に残留タンパク質夾雑物ならびにＤＮＡおよびＬＰＳを除去することを目的としたイオン交換クロマトグラフィーを行っても行わなくてもよく、それ自体の後に、二量体または他の多量体の存在により起こり得る凝集を排除するためのセファロースゲル上での排除クロマトグラフィーを行っても行わなくてもよい。一層より好ましい様式では、これら全部の技術を同時にまたは連続的に用いることができる。
本発明による抗体の機能的断片とは、特に、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは単鎖を表す）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片もしくはダイアボディー、またはポリ（エチレン）グリコールなどのポリ（アルキレン）グリコールの付加のような化学的修飾（「ペグ化」）（Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧまたはＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれるペグ化断片）（「ＰＥＧ」はポリ（エチレン）グリコールを表す）によるか、もしくはリポソームに組み込むことにより半減期が延長された任意の断片（該断片は元の抗体の少なくとも一つの特徴的なＣＤＲを有する）といった抗体断片を含むことを意図する。
好ましくは、これらの機能的断片は、それらが由来している抗体と同じ結合特異性を一般に有する、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ型の断片、またはダイアボディー(diabody)である。本発明によれば、本発明の抗体断片は、上記のよう抗体から出発して、ペプシンもしくはパパインなどの酵素による消化のような方法および／または化学的還元によるジスルフィド架橋の切断によって得ることができる。別法では、本発明に含まれる抗体断片は、同様に当業者に周知の遺伝子組換え技術、または例えばＡｐｐｌｅｒａ社などによって供給されているものなどの自動ペプチド合成装置の手段によるペプチド合成によって得ることができる。
本明細書において「アンタゴニスト」とは、細胞外または膜貫通受容体などの標的分子の１以上の生物活性を阻害することができる分子を意味する。アンタゴニストは、受容体のリガンドへの（また、その逆）の結合を妨げることにより、および／または受容体のリン酸化を低下させることにより、および／またはリガンドによって活性化された細胞を不能化するか、または死滅させることにより働き得る。アンタゴニストは、受容体−リガンド相互作用を完全に遮断することができるか、あるいは競合、コンフォメーション変化、放出、またはダウンレギュレーションによってこのような相互作用を実質的に低下させることができる。アンタゴニストによるこのような介入(intervention)点は総て、本発明の目的では等価であると考えるべきである。
本明細書において「アゴニスト」とは、標的分子の１以上の生物活性を活性化することができる、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片、コンジュゲート、大分子、小分子を含む任意の化合物を意味する。
治療用抗体の研究においては、できる限りアンタゴニストとしての抗体を得ることが期待される場合が多い。
アンタゴニスト抗体の従来の例として、ヘルセプチン、ペルツズマブ、セツキシマブ、抗ＶＥＧＦＲ、または抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体がある。
特定の例として、種々のモデルにおいて単独で加えた際に強力なアゴニストとして振る舞う、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ［ＷＯ９６／３８５５７号公報］より作出された抗ｃ−Ｍｅｔ ５Ｄ５抗体を挙げることができる。この技術的問題を解決するために、この抗体は、Ｆａｂ断片として、または一価抗体（単腕５Ｄ５）として拮抗活性を有するように操作されなければならなかった。結果として、このような抗体は抗体とは見なされず、断片であり、「完全な抗体」形式であることによる総ての利点を提供するわけではない（エフェクター機能が無く、クリアランスおよび半減期が短い［２００８年１０月２１〜２４日、ジュネーブの第２０回EORTC-NCI-AACRシンポジウムのポスター４１１に記載されているように従来の二価抗体よりも２倍速い]）。
当業者ならば、エフェクター機能には、例えば、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害性、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、食作用、ならびに例えば、１９９８年４月１４日に付与された米国特許第５，７３９，２７７号公報に記載されているようなサルベージ受容体結合リガンド（ＦｃＲｎ）の組み込みによる細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）のダウンレギュレーションおよび半減期の延長が含まれることを認識するであろう。
本発明の態様の一つは、このような技術的問題を解決すること、すなわち「完全二価」形式を保存しつつ、抗体の拮抗活性を改良することである。
ここで、「ヒトマウス」（ヒト免疫グロブリンを産生する遺伝的に改変されたマウス）の免疫化によるか、または選択されたｓｃＦｖ、Ｆａｂもしくは他のいずれかの等価な断片から完全抗体を構築するためのファージディスプレー技術を用いて得られたヒト抗体の促進／拮抗活性を調節するために適用可能であることを述べておかなければならない。
もう一つの従来からの技術的問題は、ネズミ抗体のキメラ化および／またはヒト化の過程で遭遇する。ネズミ抗体のキメラ化および／またはヒト化工程が理論では極めて容易であるとしても、最初の特性の全部または一部を失わずにこのようなネズミ抗体のキメラ化および／またはヒト化を管理することはそれほど容易なことではないのは当業者にはよく知られている。キメラまたはヒト化抗体は、そのＡＤＣＣ、ＣＤＣ、拮抗／促進、結合、（ＴＢＣ）などの活性の一部を失うことがある。本発明はより詳細には、キメラ化および／またはヒト化工程後のネズミ抗体の促進／拮抗活性の改変に関する。
特定の例として、強力なアンタゴニストネズミ抗体として振る舞う一連の抗ｃＭｅｔ抗体（以下、２２４Ｇ１１、２２７４Ｈ１および１１Ｅ１と記載する）は、ヒトＩｇＧ１形式でキメラ化された際に部分的アゴニストとなった。この強力なアンタゴニストから部分的アゴニストへの移行は、異種移植モデルにおいてin vivo活性の完全な消失をもたらした。
本発明はこれらの問題を解決することを意図し、より詳細には、特定の標的分子に対するモノクローナル抗体、またはその二価機能的断片(divalent functional fragment)もしくは誘導体の拮抗活性を改良する方法に関し、該抗体は該標的分子の１以上の生物活性を阻害することができ、該方法は、少なくとも一つのアミノ酸の欠失、付加、または置換によるヒンジ領域のアミノ酸配列の改変からなるヒンジ領域の再構成工程を含んでなる。
「拮抗活性を改良する」という表現はその最も広い意味において、すなわち、望まれる結果として解釈されるべきあるのは明らかである。機械論的には、このような結果は抗体の固有の拮抗活性の改良および／または固有の促進活性の低減により得ることができる。
より詳細には、定量的薬理学における用語の基本定義は、the International Union of Pharmacology (IUPHAR) Committee on receptor Nomenclature (Neubigら 2003参照)に示されている推奨の更新版に基づく。
「アゴニスト」とは、受容体と結合し、その受容体の状態を変化させて生物学的応答の刺激または増強をもたらすリガンド（任意の分子種）を表す。アゴニストは完全アゴニストまたは部分的アゴニストとして働き得る。
・完全アゴニスト：アゴニストにより誘発された受容体刺激がその系の最大応答能に達した場合、それはその系の最大応答をもたらし、それはその系の完全アゴニストである。いくつかのアゴニストが同等の最大応答を惹起することもあり、その実験系においてそれらは総て完全アゴニストである。
・部分的アゴニスト：所与の組織において、特定の条件下で、同じ系で同じ受容体を介して作用する完全アゴニストほど大きな作用を惹起することができない分子（総ての受容体が占有されるはずの高濃度で適用した場合でも）。部分的アゴニストは一般に、完全アゴニストが共存する場合に、それらは該完全アゴニストの最大応答をそれら固有の最大応答まで引き下げることから、部分的アンタゴニストでもある。この完全アゴニストと部分的アゴニストという表記は系に依存し、ある系またはある測定での完全アゴニストは、別の系または別の測定では部分的アゴニストである場合がある。
・完全アゴニスト：アゴニストにより誘発された受容体刺激がその系の最大応答能に達した場合、それはその系の最大応答をもたらし、それはその系の完全アゴニストである。いくつかのアゴニストが同等の最大応答を惹起することもあり、その実験系においてそれらは総て完全アゴニストである。
・部分的アゴニスト：所与の組織において、特定の条件下で、同じ系で同じ受容体を介して作用する完全アゴニストほど大きな作用を惹起することができない分子（総ての受容体が占有されるはずの高濃度で適用した場合でも）。部分的アゴニストは一般に、完全アゴニストが共存する場合に、それらは該完全アゴニストの最大応答をそれら固有の最大応答まで引き下げることから、部分的アンタゴニストでもある。この完全アゴニストと部分的アゴニストという表記は系に依存し、ある系またはある測定での完全アゴニストは、別の系または別の測定では部分的アゴニストである場合がある。
「アンタゴニスト」とは、別の薬剤、一般にはアゴニストの作用を低減する分子を表す。多くのアンタゴニストはそのアゴニストと同じ受容体高分子において働く。
拮抗作用の有効性は、アンタゴニストとアゴニストの共存下でのその系の応答がその系の基本（リガンド無し）活性に相当する場合には完全拮抗作用であり得る。
アンタゴニストは、アンタゴニストおよびアゴニストの共存により惹起された最大阻害（総ての受容体がそのアンタゴニストにより占有されるはずの高濃度で適用した場合でも）がその系の基本活性を上回る場合に部分的アンタゴニストとして作用し得る。
・拮抗作用は、アゴニストおよびアンタゴニストの結合が互いに相容れない場合に競合的であり得る。これはアゴニストとアンタゴニストが同じ結合部位をめぐって競合し、重複する隣接部位と一緒になるためである可能性がある。第三の可能性は、異なる部位が関与するが、それらは受容体高分子にアゴニスト分子と、アンタゴニスト分子とが同時には結合できないような影響を及ぼすということである。
・非競合的拮抗作用はアゴニストと、アンタゴニストとが同時に受容体に結合できる場合に見られ、アンタゴニストの結合はアゴニストの作用を低下させるか、または妨げ、そのアゴニストの結合に影響を及ぼす場合と及ぼさない場合がある。
・拮抗作用は、アゴニストおよびアンタゴニストの結合が互いに相容れない場合に競合的であり得る。これはアゴニストとアンタゴニストが同じ結合部位をめぐって競合し、重複する隣接部位と一緒になるためである可能性がある。第三の可能性は、異なる部位が関与するが、それらは受容体高分子にアゴニスト分子と、アンタゴニスト分子とが同時には結合できないような影響を及ぼすということである。
・非競合的拮抗作用はアゴニストと、アンタゴニストとが同時に受容体に結合できる場合に見られ、アンタゴニストの結合はアゴニストの作用を低下させるか、または妨げ、そのアゴニストの結合に影響を及ぼす場合と及ぼさない場合がある。
欠失、付加、または置換は、従来から当業者に公知の任意の方法によって行うことができる。
所与のＤＮＡ配列に、付加、欠失、または挿入を作出するために、当業者はいくつかの方法を適用することができる。限定されるものではないが、膵臓ＤＮアーゼＩを用いたＤＮＡの部分的消化、制限酵素を用いたＤＮＡの部分的消化、リンカーに基づく挿入変異体、ＢＡＬ３１ヌクレアーゼ、ＤＮアーゼＩ、またはエキソヌクレアーゼＩＩＩを用いた欠失変異体のネステッドセットを挙げることができる。これらの方法はMolecular Cloning, A laboratory manual(Sambrook, Fritsch and Maniatis)などの実験手引き書に包括的に記載されている。ＤＮＡ分子に欠失、挿入、または部位特異的突然変異誘発を行うにはまた、限定されるものではないがオーバーラップ・エクステンションＰＣＲ(Wurchら 1998)など（これに限定されるものではない）いくつかのＰＣＲに基づく方法も使用することができる。部位特異的突然変異誘発を行うには、他のいくつかの技術を使用することができ。例としては、限定されるものではないが、オリゴヌクレオチドに基づく突然変異誘発（シングルプライマーまたはダブルプライマー法のいずれかに基づく）、ウラシルの組み込みに基づくＫｕｎｋｅｌ法(Kunkel、 1985)を挙げることができる。これらの方法はMolecular Cloning, A laboratory manual (Sambrook, Fritsch and Maniatis)に包括的に記載されている。
限定されるものではないが、付加の例としては、ヒンジ領域への、またはヒンジ領域に隣接したプロリンの付加を挙げることができる。
本発明の方法の好ましい実施形態においては、該改変は、
ｉ）該ヒンジ領域アミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ酸の欠失、および／または
ｉｉ）該ヒンジ領域への少なくとも一つのジスルフィド架橋の付加
から選択される。
ｉ）該ヒンジ領域アミノ酸配列の少なくとも一つのアミノ酸の欠失、および／または
ｉｉ）該ヒンジ領域への少なくとも一つのジスルフィド架橋の付加
から選択される。
本発明を明確にするため、まず、第一の態様（ｉ）を詳細に説明した後、第二の態様（ｉｉ）を詳細に説明する。この順序は単に本願の記載のために過ぎず、これらの両態様は、以降で明らかになるが、同じ重要度であると理解すべきである。
特定の実施形態では、ヒンジ領域のアミノ酸配列を改変する方法は、該ヒンジ領域アミノ酸配列の多くとも２、３、または４個のアミノ酸の欠失からなる。
本発明の特定の態様は、該モノクローナル抗体が二価抗体であることである。実際、以下に示すように、該抗体の構造を改変することによって抗体の促進／拮抗活性を調節することができる。発明者らは、長い半減期またはエフェクター機能などの良好な特性を保存する目的で、抗体の二価形態を保存しつつこのような促進／拮抗活性を調節する独創的な方法を初めて報告する。またここで、エフェクター機能の増強を目的としたモノクローナル抗体のヒンジ領域の改変が先行技術ですでに報告されていたとしても、このようなヒンジ領域への改変がモノクローナル抗体の促進／拮抗活性の調節において着目されるものであり得るということが報告されたことはない。これは明らかに、既存の先行技術に対して新規かつ発明性のある本発明の主題である。
本発明の方法による一態様として、モノクローナル抗体はキメラ抗体である。
「キメラ」抗体とは、所与の種の抗体に由来する天然の可変（軽鎖および重鎖）領域を、その所与の種とは異種（例えば、マウス、ウマ、ウサギ、イヌ、ウシ、ニワトリなど）の抗体の軽鎖および重鎖定常領域と組み合わせて含む抗体を示すものとする。
本発明によるキメラ型の抗体またはそれらの断片は遺伝子組換えの技術を使用することにより作製することができる。例えば、キメラ抗体は、プロモーターと本発明による非ヒト、特にネズミ、モノクローナル抗体の可変領域をコードする配列とヒト抗体の定常領域をコードする配列とを含む組換えＤＮＡをクローニングすることにより作製することができる。このような組換え遺伝子によりコードされる本発明のキメラ抗体は例えばマウス−ヒトキメラであり、この抗体の特異性はネズミＤＮＡに由来する可変領域により決定され、そのアイソタイプ(isotype)はヒトＤＮＡに由来する定常領域により決定される。キメラ抗体の作製方法に関しては、例えば、Verhoeynら(BioEssays, 8:74, 1988)、Morrisonら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6851-6855, 1984)、または米国特許第４，８１６，５６７号公報を参照することができる。
本発明の方法による別の態様として、モノクローナル抗体はヒト化抗体である。「ヒト化抗体」とは、非ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲ領域を含む抗体を示すものとし、この抗体分子の他の部分は一つの（または複数の）ヒト抗体または生殖細胞系に由来する。さらに、その骨格（ＦＲと呼ばれる）のセグメントのいくつかの残基は、結合親和性を保存するために改変することができる(Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986、 Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988、 Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988)。
本発明によるヒト化抗体またはそれらの断片は、当業者に公知の技術（例えば、文献Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992、 Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992、またはBebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992に記載されているものなど）により作製することができる。
例えば、Protein Design Lab (PDL)が、欧州特許出願第ＥＰ０４５１２１６号公報、ＥＰ０６８２０４０号公報、ＥＰ０９３９１２７号公報、ＥＰ０５６６６４７号公報または米国特許第５，５３０，１０１号公報、同第６，１８０，３７０号公報、同第５，５８５，０８９号公報、および同第５，６９３，７６１号公報に記載している「ＣＤＲグラフト」法などの他のヒト化法も当業者に知られている。以下の特許出願も挙げることができる：米国特許第５，６３９，６４１号公報、同第６，０５４，２９７号公報、同第５，８８６，１５２号公報、および同第５，８７７，２９３号公報。
本発明の方法による別の態様として、モノクローナル抗体はヒト抗体である。「ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリン配列に由来する１以上の可変領域と、定常領域をと有するあらゆる抗体を含む。好ましい実施形態では、総ての可変および定常ドメイン（または領域）がヒト免疫グロブリン配列に由来する（完全ヒト抗体）。言い換えれば、それはヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域（存在する場合）を有する、すなわち、ヒトにより生産された抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有し、および／または当業者に公知の任意のヒト抗体作製法を用いて作製されたいずれの抗体も含む。
一つの実施形態においては、ヒトモノクローナル抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子と、軽鎖導入遺伝子とを含んでなるゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を不死化細胞と融合させたものを含むハイブリドーマによって産生される。
このようなトランスジェニックマウスの例として、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の大断片を含んでなり、マウス抗体生産に欠陥がある操作されたマウス系統であるＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）(Green at al, 1994, Nature Genetics, 7:13-21)を挙げることができる。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）は完全ヒト抗体の成体様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を生成する。第二世代のＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）は、およそ８０％のヒト抗体レパートリーを含む(Green & Jakobovits, 1998, J. Exp. Med., 188:483-495)。
また、ファージディスプレー技術などの当業者に公知の他の技術も、本発明によるヒト抗体の作出に使用可能である。
本発明による方法は、ヒンジ領域、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧを含んでなるいずれの種の免疫グロブリンにも使用可能である。一例として、ＩｇＡアイソタイプの場合、ＩｇＡ１のヒンジ領域はアミノ酸配列PSTPPTPSPSTPPTPSPS（配列番号８）を含んでなり、ＩｇＡ２のヒンジ領域はアミノ酸配列PPPPP（配列番号９）を含んでなる。
同様に、ＩｇＤのヒンジ領域はアミノ酸配列
SPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTP（配列番号１０）を含んでなる。
SPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTP（配列番号１０）を含んでなる。
本発明の特定の実施形態として、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４を含むＩｇＧを使用するのが好ましい。
ＩｇＧヒンジ領域の種々のアイソタイプに相当する個々のアミノ酸配列は次の通りである：
ＩｇＧ１は、PKSCDKTHTCPPCP（配列番号１１）、
ＩｇＧ２は、RKCCVECPPCP（配列番号７）、
ＩｇＧ３は、
LKTPLFTGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP（配列番号１２）、および
ＩｇＧ４は、SKYGPPCPSCP（配列番号１３）。
ＩｇＧ１は、PKSCDKTHTCPPCP（配列番号１１）、
ＩｇＧ２は、RKCCVECPPCP（配列番号７）、
ＩｇＧ３は、
LKTPLFTGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP（配列番号１２）、および
ＩｇＧ４は、SKYGPPCPSCP（配列番号１３）。
より一層詳細には、ＩｇＧ１を使用するのが好ましい。実際、治療用抗体の分野では、より詳細には癌の処置において、標的とする抗原への特異的結合に関連する機能に加えてＡＤＣＣおよびＣＤＣなどのエフェクター機能を得るためにＩｇＧ１を生成するのが好ましい。
本発明の方法は、該モノクローナル抗体がＩｇＧ１であることを特徴とする。「標的分子」とは、本発明の意味の範囲内で、モノクローナル抗体が特異的に結合することができる、またはその活性を調節することができるいずれの分子にも関する。一般に、このような標的分子は「抗原」と呼ぶことができる。
限定されるものではないが、モノクローナル抗体が標的とすることのできる標的分子の例としては、可溶性リガンド、膜貫通型受容体などの受容体、膜腫瘍マーカーなどを挙げることができる。
好ましい実施形態では、該標的分子は膜貫通受容体である。
「膜貫通受容体」とは、細胞の原形質膜を貫通し、リガンドに結合する能力を有するタンパク質の細胞外ドメインと、リガンドが結合した際に変化（増強または低下）され得る活性（プロテインキナーゼなど）を有する細胞内ドメインとを備えたタンパク質に関する。言い換えれば、膜貫通受容体は、一般には細胞の原形質膜内に、それだけでなくいくつかの細胞下コンパートメントおよびオルガネラの膜にも存在して働く内在性膜タンパク質である。膜の一方の側でシグナル伝達分子または場合によってはそのような分子の対と結合すると、膜貫通受容体は他方の側で反応を誘発する。このように、それらは細胞のコミュニケーションおよびシグナル伝達において特有で、重要な役割を果たす。
多くの膜貫通受容体は、ひとまとまりになって働き、リガンドが結合した際、または外れた際、またはそれらの「活性化」周期の別の段階にきた際に解離し得る２以上のタンパク質サブユニットからなる。それらは多くの場合にはそれらの分子構造に基づいて、あるいは総てではないが、いくつかの受容体に関しては構造が詳細に分かっていないためにそれらの仮説の（場合によっては実験的に確認された）膜トポロジーに基づいて分類される。単純なポリペプチド鎖は脂質二重層を一度だけ貫通すると推定されているが、他のものは７回も（いわゆるＧタンパク質共役受容体またはＧＰＣＲ）またはそれ以上貫通する。
内在性膜タンパク質と同様に、膜貫通受容体も、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインの三つの部分またはドメインに分けることができる。
細胞外ドメインは、細胞またはオルガネラの外側の膜に突き出ている受容体の部分である。受容体のポリペプチド鎖が二重層を数回貫通する場合、外部ドメインは膜の外に突き出た数個の「ループ」を含んでなり得る。定義によれば、受容体の主な機能は特定のリガンド、例えば、神経伝達物質またはホルモンを認識して応答し（ある種の受容体は膜電位の変化にも応答するが）、多くの受容体では、これらのリガンドは細胞外ドメインと結合する。
構造的証拠がある大部分の受容体では、膜貫通αヘリックスが膜貫通ドメインのほとんどを構成している。ニコチン性アセチルコリン受容体などのある種の受容体では、膜貫通ドメインは膜にタンパク質が並んだ細孔、すなわち、イオンチャネルを形成する。適当なリガンドの結合により細胞外ドメインが活性化すると、この孔はイオンの接近が可能となり、イオンが通過する。他の受容体においては、膜貫通ドメインは結合時にコンフォメーション変化を受けて細胞内に影響を及ぼすと仮定される。７ＴＭスーパーファミリーのメンバーなどのいくつかの受容体では、膜貫通ドメインはリガンド結合ポケットを含み得る。
受容体の細胞内（または細胞質）ドメインは細胞またはオルガネラの内部と相互作用してシグナルを中継する。この相互作用には、ａ）細胞内ドメインが特異的タンパク質−タンパク質相互作用を介してエフェクタータンパク質とコミュニケーションをとり、シグナル鎖に沿ってその目標点にシグナルを送るか、ｂ）酵素結合受容体とコミュニケーションをとり、細胞内ドメインが酵素活性を有するか、の基本的に異なる二つの方法がある。多くの場合、これはチロシンキナーゼ活性である。この酵素活性はまた、細胞内ドメインと会合している酵素上に存在している場合もある。
細胞が膜貫通受容体の活性を調節するにはいくつかの方法がある。それらのほとんどが細胞内ドメインを介して働くものである。最も重要な方法は、リン酸化およびインターナリゼーション（ユビキチン参照）またはｃＡＭＰ、ＩＰ、Ｃａ２＋、もしくはｃＧＭＰなどのセカンドメッセンジャーカスケードの活性化である。
酵素活性を示す膜タンパク質も総て、本発明に記載されている改変を伴う抗体によって標的とされ得る。例としては、限定されるものではないが、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）ファミリー、「ディスインテグリン・メタロプロテアーゼドメイン・プロテアーゼ(disintegrin and a metalloprotease domain protease)」（ＡＤＡＭ）ファミリー、アデニル酸シクラーゼなどを挙げることができる。
イオンチャネル、細孔、およびトランスポーターとして働く膜タンパク質も総て、本発明に記載されている改変を伴う抗体によって標的とされ得る。例としては、限定されるものではないが、ナトリウムチャネルファミリー、カリウムチャネルファミリー、ニコチン性アセチルコリン受容体ファミリー、シグマ受容体、モノアミントランスポーターファミリーを挙げることができる。
さらに広くは、所与の疾病の特異的マーカーであることが確認されている膜タンパク質も総て抗体処置によって標的とされ得るが、この抗体も同様に本発明に記載されている改変によって改良することができる。
本発明の好ましい実施形態では、該膜貫通受容体はチロシンキナーゼ受容体、テトラスパニン(tetraspanin)、およびＧＰＣＲからなる群から選択される。
より好ましい実施形態においては、該膜貫通受容体は好適にはＩＧＦ−１Ｒ、ｃ−Ｍｅｔ、ＲＯＮ、Ａｘ１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、Ｈｅｒ−２ｎｅｕ、ＥｒｂＢファミリーのホモ二量体、およびヘテロ二量体などからなる群から選択されるチロシンキナーゼ受容体である。
本願において、およびより詳細には以下の明細書において、配列はＩＭＧＴを参照して定義される。ＩＭＧＴ特有のナンバリングは、どんな抗原受容体、鎖種または種であれ、可変ドメインを比較するために定義されている[Lefranc M. -P., Immunology Today 18, 509 (1997)、 Lefranc M. -P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)、 Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V.およびLefranc, Dev. Comp. Immunol, 27, 55-77 (2003)]。このＩＭＧＴ特有のナンバリングでは、例えば、システイン２３（１ｓｔ−ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ−ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ−ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）など、保存されているアミノ酸は常に同じ位置を有する。ＩＭＧＴ特有のナンバリングはフレームワーク領域（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：１〜２６位、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５位、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４位およびＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８位）ならびに相補性決定領域：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８位、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５位およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７位の標準的画定を行う。ギャップが占有されていない位置を表す場合、ＣＤＲ−ＩＭＧＴ長（括弧内に示され、ドットで分けられる、例えば、［８．８．１３］）は重要な情報となる。ＩＭＧＴ特有のナンバリングは、IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M. -P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002)、 Kaas, Q. and Lefranc, M. -P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)]と呼ばれる２Ｄグラフ、およびIMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M. -P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]における３Ｄ構造に使用される。
当業者にとって、ＩＭＧＴシステムによって記載される本発明を例えば、Ｋａｂａｔナンバリングシステムなどの他のいずれかのナンバリングシステムに置き換えることは自明である。
あらゆる種のあらゆるＩＧおよびＴＲ Ｖ領域のＩＭＧＴ特有のナンバリングが、可変領域の構造の保存性が高いことに頼っている。５０００を超える配列を整列した後に設定されたこのナンバリングは、フレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）の定義、Ｘ線回折研究からの構造データ、ならびに超可変ループの特性決定を考慮に入れ、組み合わせている。ＦＲ−ＩＭＧＴ領域と、ＣＤＲ−ＩＭＧＴ領域との限界はすでに定義されている。同様に、ＩＭＧＴ特有のナンバリングはＣドメインにも適用されており、Ｉｇ様ドメインの正確な画定を可能とする。Ｃドメインは免疫グロブリン（ＩＧ）の種類によって完全なＣ領域、またはＣ領域の大部分、またはＣ領域の一部のみに相当する。
Ｃドメイン（ＩＧおよびＴＲ）のＩＭＧＴナンバリングは、Ｖ領域の主要ＩＭＧＴ特有のナンバリングから１０４位までのＶドメインのＩＭＧＴ特有のナンバリングとして導かれる。従って、アミノ酸の位置はＣドメインと、Ｖドメインとの間で容易に比較することができる。
ヒンジ領域を正確に位置決定するために、ＣドメインのＩＭＧＴナンバリングを適用してＣＨ１およびＣＨ２ドメインの正確な位置を決定した。ヒンジ領域はＩＭＧＴ−ＣＨ１の最後の残基と、ＩＭＧＴ−ＣＨ２の最初の残基との間の総てのアミノ酸残基を含む。同じヒンジドメインにわたるＫａｂａｔまたはＡ．Ｈｏｎｅｇｇｅｒなどの他の免疫グロブリンナンバリングは総て本発明に含まれる。
本発明の好ましい例として、上記のようなＩＭＧＴナンバリングシステムに基づけば、ＩｇＧ１のヒンジ領域のアミノ酸配列は、アッパーヒンジに相当するセグメントＨ１〜Ｈ９と、コアヒンジに相当するセグメントＨ１０〜Ｈ１４とを有するＨ１〜Ｈ１４の残基を含んでなる。より詳細には、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域はアミノ酸配列PKSCDKTHTCPPCP（配列番号１１）を含んでなり、ネズミＩｇＧ１ヒンジ領域はアミノ酸配列PRDCGCKPCICT（配列番号１４）を含んでなる。
本発明の好ましい実施形態においては、二価抗体のヒンジ領域をコードするタンパク質配列を短縮することを目的とする改変を意図する。より詳細には、本発明による方法は、ヒンジ領域の少なくとも一つのアミノ酸を欠失させる工程を含んでなる。
上述のように、前記ヒンジ領域の多くとも二つのアミノ酸の欠失が好ましい。
上述のように、前記ヒンジ領域の多くとも三つのアミノ酸の欠失が好ましい。
上述のように、前記ヒンジ領域の多くとも四つのアミノ酸の欠失が好ましい。
上述のように、前記ヒンジ領域の多くとも三つのアミノ酸の欠失が好ましい。
上述のように、前記ヒンジ領域の多くとも四つのアミノ酸の欠失が好ましい。
本発明の方法の特定の使用では、改変はＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、またはＨ１４位のアミノ酸から選択される少なくとも一つのアミノ酸の欠失からなる。より詳細には、本発明者らは特定の残基の関与を実証し、本発明の特定の態様はある特定の残基の選択からなる。
ＩｇＧ１の好ましい場合では、Ｈ１位のアミノ酸はプロリンからなり、Ｈ２位のアミノ酸は、ヒト型ではリシン、ネズミ型ではアルギニンからなり、Ｈ３位のアミノ酸は、ヒト型ではセリン、ネズミ型ではアスパラギン酸からなり、Ｈ５位のアミノ酸はヒト型ではアスパラギン酸、ネズミ型ではグリシンからなり、Ｈ６位のアミノ酸はリシンからなり、Ｈ８位のアミノ酸はヒト型ではヒスチジン、ネズミ型ではリシンからなり、Ｈ９位のアミノ酸はヒト型ではトレオニン、ネズミ型ではプロリンからなり、Ｈ１１位のアミノ酸はヒト型ではプロリン、ネズミ型ではイソロイシンからなり、Ｈ１２位のアミノ酸はヒト型ではプロリンからなる。
好ましい実施形態によれば、この欠失は「アッパーヒンジ」領域で行われなければならない。
より好ましい実施形態では、この欠失は、例えばＩｇＧ１の場合、アミノ酸Ｈ１０〜Ｈ１４からなった「コアヒンジ」との比較により、アミノ酸Ｈ１〜Ｈ９からなった「アッパーヒンジ」の部分である。
本願では、アミノ酸のナンバリングはこれまでに記載したようにＩＭＧＴシステムを考慮して行われる。ナンバリングは違っているが、ヒンジ領域に関与する残基の性質は変わらない他のナンバリングシステムはいずれも等価であると考えなければならないのは明らかである。
一例として、特定された本発明のアミノ酸部分（ＩＭＧＴシステムによる）をＫａｂａｔシステムで再ナンバリングすることも等価であると考えなければならない。
本発明の別の態様は、「アッパーヒンジ」領域における、好ましくは、Ｈ４位に存在する少なくとも一つのシステインの欠失に基づく。本発明の別の態様は、ヒンジ領域への少なくとも一つのジスルフィド架橋の付加に基づく。
より詳細には、本発明の方法は、その改変が「アッパーヒンジ」領域への少なくとも一つのシステインの導入からなることを特徴とする。
本発明者らによれば、満足のいく例(plausible explanation)は、長さの短縮および／または別のジスルフィド架橋の導入のいずれかによって起こるヒンジの「厳密化」に基づく。このような「厳密化」により、結果として改良された拮抗活性を有する抗体の適当な空間的コンフォメーションの維持が可能となるだろう。ヒンジ領域の厳密化を目的とした方法はいずれも本発明による方法と等価な方法であると考えなければならないのは明らかである。
システインの導入はこのようなアミノ酸の付加により行うことができ、該付加は当業者に公知の任意の方法により行われる。
ヒンジ領域にシステインを導入するための別の好ましい方法は、少なくとも一つのアミノ酸の置換からなる。
より詳細には、ヒンジ領域にシステインを導入するための別の好ましい方法は、Ｈ１〜Ｈ９から選択される少なくとも一つのアミノ酸の置換からなる。このような置換は当業者に公知の任意の方法により行うことができる。
より詳細には、本発明の方法は、「アッパーヒンジ」領域におけるＨ７位のトレオニンの、システインによる置換を含んでなる。
別の実施形態では、本発明の方法は、「アッパーヒンジ」領域におけるＨ６位のリシンの、システインによる置換を含んでなる。
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、「アッパーヒンジ」領域におけるＨ１位のプロリンの、システインによる置換を含んでなる。
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、「アッパーヒンジ」領域におけるＨ２位のリシンの、システインによる置換を含んでなる。
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、「アッパーヒンジ」領域におけるＨ３位のセリンの、システインによる置換を含んでなる。
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、「アッパーヒンジ」領域におけるＨ５位のアスパラギン酸の、システインによる置換を含んでなる。
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、「アッパーヒンジ」領域におけるＨ８位のヒスチジンの、システインによる置換を含んでなる。
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、「アッパーヒンジ」領域におけるＨ９位のトレオニンの、システインによる置換を含んでなる。
別の実施形態では、本発明の方法は、「アッパーヒンジ」領域におけるＨ６位のリシンの、システインによる置換を含んでなる。
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、「アッパーヒンジ」領域におけるＨ１位のプロリンの、システインによる置換を含んでなる。
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、「アッパーヒンジ」領域におけるＨ２位のリシンの、システインによる置換を含んでなる。
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、「アッパーヒンジ」領域におけるＨ３位のセリンの、システインによる置換を含んでなる。
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、「アッパーヒンジ」領域におけるＨ５位のアスパラギン酸の、システインによる置換を含んでなる。
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、「アッパーヒンジ」領域におけるＨ８位のヒスチジンの、システインによる置換を含んでなる。
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、「アッパーヒンジ」領域におけるＨ９位のトレオニンの、システインによる置換を含んでなる。
別の実施形態によれば、ヒンジ領域をコードするアミノ酸配列全部を交換することにより、ヒンジ領域の長さを短縮すること、および／またはジスルフィド架橋を付加することも可能である。
好ましい例として、本発明の方法の改変は、好ましくはその拮抗活性を改良することが望まれるモノクローナル抗体がＩｇＧ１抗体である場合、ＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸Ｈ１〜Ｈ１４の、ＩｇＧ２ヒンジ領域のアミノ酸Ｈ１〜Ｈ１４による置換からなる。
別の適用では、本発明は、特定の標的分子に対するモノクローナル抗体、またはその二価機能的断片または誘導体をアンタゴニストに関してスクリーニングする方法に関し、該抗体は該標的分子の一以上の生物活性を阻害することができ、該方法は以下の工程を含んでなる：
（ａ）該標的分子の該一以上の生物活性の、初期レベルの阻害を有する初期抗体を選択する工程、
（ｂ）該初期抗体のヒンジ領域のアミノ酸配列を本発明の方法により改変する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の改変抗体を、その該標的分子の該一以上の生物活性を阻害する能力に関して評価する工程、および
（ｄ）該標的分子の該一以上の生物活性の阻害レベルが該阻害の初期レベルよりも高い工程（ｃ）の抗体を陽性結果として選択する工程。
（ａ）該標的分子の該一以上の生物活性の、初期レベルの阻害を有する初期抗体を選択する工程、
（ｂ）該初期抗体のヒンジ領域のアミノ酸配列を本発明の方法により改変する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の改変抗体を、その該標的分子の該一以上の生物活性を阻害する能力に関して評価する工程、および
（ｄ）該標的分子の該一以上の生物活性の阻害レベルが該阻害の初期レベルよりも高い工程（ｃ）の抗体を陽性結果として選択する工程。
初期抗体は、限定されるものではないが、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃ−Ｍｅｔ、ＲＯＮ、Ａｘ１、ＣＤ１５１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、Ｈｅｒ−２ｎｅｕ、ＥｒｂＢファミリーのホモ二量体およびヘテロ二量体に対する抗体アンタゴニストなどの既存の抗体から選択することができる。限定されるものではないが、好ましい例として、該初期抗体はヘルセプチン、ペルツズマブ、セツキシマブ、抗ＶＥＧＦＲ、または抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体からなり得る。
「阻害レベル」は、本発明の意味の範囲内で、抗体の拮抗活性を示す。このような阻害レベルは、限定されるものではないが、ａ）直接的細胞計数または３［Ｈ］チミジン、テトラゾリン塩もしくは増殖を評価するための他のいずれかの蛍光手段の使用、ｂ）シグナル伝達を測定するためのウエスタンブロット法、ホスホ−ＥＬＩＳＡまたはα−スクリーンアッセイ、ｃ）二量体形成アッセイのためのＢＲＥＴまたはＦＲＥＴ分析、ｄ）移動、浸潤、脈管形成、または形態形成を測定するための顕微鏡または蛍光法、およびｅ）in vivo評価のための腫瘍のカリパス測定などの当業者に公知の方法によって測定することができる。
このスクリーニング方法は、バリデートされた抗体の改良のため、または研究用または前臨床抗体の選択段階として使用することができる。
本発明による別の態様は、本発明の方法により得ることのできる特定の標的分子に対するモノクローナル抗体、または二価機能的もしくは誘導体に関し、該抗体は、配列番号１(PRDCGCKPCICT)、配列番号２(PKSCGCKPCICT)、配列番号３(PKSCGCKPCICP)、配列番号４(PRDCGCKPCPPCP)、配列番号５(PRDCGCHTCPPCP)、配列番号６(PKSCDCHCPPCP)、配列番号７(RKCCVECPPCP)、配列番号２２(CKSCDKTHTCPPCP)、配列番号２３(PCSCDKTHTCPPCP)、配列番号２４(PKCCDKTHTCPPCP)、配列番号２５(PKSCCKTHTCPPCP)、配列番号２６(PKSCDCTHTCPPCP)、配列番号２７(PKSCDKCHTCPPCP)、配列番号２８(PKSCDKTCTCPPCP)、配列番号２９(PKSCDKTHCCPPCP)、配列番号３０(PKSCDKTHTCCPCP)、配列番号３１(PKSCDKTHTCPCCP)、配列番号３２(PKSCDKTHTCPPCC)、配列番号３３(PSCDKTHTCPPCP)、配列番号３４(PKSCDTHTCPPCP)、配列番号３５(PKSCDKTHCPPCP)、配列番号３６(KCDKTHTCPPCP)、配列番号３７(PSCKTHTCPPCP)、配列番号３８(PKSCDTHCPPCP)、配列番号３９(PKSCTHTCPPCP)、配列番号４０(PKSCDKTTCPCP)、配列番号４１(PKSCDKTHCPPC)、配列番号４２(PKSCDCHTCPPCP)、配列番号４３(PKSCDCTHCPPCP)、配列番号４４(PCSCKHTCPPCP)、配列番号４５(PSCCTHTCPPCP)、配列番号４６(PSCDKHCCPPCP)、配列番号４７(PKSTHTCPPCP)、配列番号４８(PKSCTCPPCP)、または配列番号４９(PKSCDKCVECPPCP)からなる群から選択されるヒンジ領域アミノ酸配列を含んでなることを特徴とする。
本発明の方法の実施により得られる好ましいモノクローナル抗体は、配列番号１(PRDCGCKPCICT)、配列番号２(PKSCGCKPCICT)、配列番号３(PKSCGCKPCICP)、配列番号４(PRDCGCKPCPPCP)、配列番号５(PRDCGCHTCPPCP)、配列番号６(PKSCDCHCPPCP)、配列番号７(RKCCVECPPCP)、配列番号２２(CKSCDKTHTCPPCP)、配列番号２３(PCSCDKTHTCPPCP)、配列番号２４(PKCCDKTHTCPPCP)、配列番号２５(PKSCCKTHTCPPCP)、配列番号２６(PKSCDCTHTCPPCP)、配列番号２７(PKSCDKCHTCPPCP)、配列番号２８(PKSCDKTCTCPPCP)、配列番号２９(PKSCDKTHCCPPCP)、配列番号３０(PKSCDKTHTCCPCP)、配列番号３１(PKSCDKTHTCPCCP)、配列番号３２(PKSCDKTHTCPPCC)、配列番号３３(PSCDKTHTCPPCP)、配列番号３４(PKSCDTHTCPPCP)、配列番号３５(PKSCDKTHCPPCP)、配列番号３６(KCDKTHTCPPCP)、配列番号３７(PSCKTHTCPPCP)、配列番号３８(PKSCDTHCPPCP)、配列番号３９(PKSCTHTCPPCP)、配列番号４０(PKSCDKTTCPCP)、配列番号４１(PKSCDKTHCPPC)、配列番号４２(PKSCDCHTCPPCP)、配列番号４３(PKSCDCTHCPPCP）、配列番号４４(PCSCKHTCPPCP)、配列番号４５(PSCCTHTCPPCP)、配列番号４６(PSCDKHCCPPCP)、配列番号４７(PKSTHTCPPCP)、配列番号４８(PKSCTCPPCP)、または配列番号４９(PKSCDKCVECPPCP)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなることを特徴とし得る。
好ましい実施形態では、該モノクローナル抗体はヒト抗体であり、より好ましくはＩｇＧ１抗体である。
本発明はまた、これまでに記載したような、すなわち、配列番号１(PRDCGCKPCICT)、配列番号２(PKSCGCKPCICT)、配列番号３(PKSCGCKPCICP)、配列番号４(PRDCGCKPCPPCP)、配列番号５(PRDCGCHTCPPCP)、配列番号６(PKSCDCHCPPCP)、配列番号７(RKCCVECPPCP)、配列番号２２(CKSCDKTHTCPPCP)、配列番号２３(PCSCDKTHTCPPCP)、配列番号２４(PKCCDKTHTCPPCP)、配列番号２５(PKSCCKTHTCPPCP)、配列番号２６(PKSCDCTHTCPPCP)、配列番号２７(PKSCDKCHTCPPCP)、配列番号２８(PKSCDKTCTCPPCP)、配列番号２９(PKSCDKTHCCPPCP)、配列番号３０(PKSCDKTHTCCPCP)、配列番号３１(PKSCDKTHTCPCCP)、配列番号３２(PKSCDKTHTCPPCC)、配列番号３３(PSCDKTHTCPPCP)、配列番号３４(PKSCDTHTCPPCP)、配列番号３５(PKSCDKTHCPPCP)、配列番号３６(KCDKTHTCPPCP)、配列番号３７(PSCKTHTCPPCP)、配列番号３８(PKSCDTHCPPCP)、配列番号３９(PKSCTHTCPPCP)、配列番号４０(PKSCDKTTCPCP)、配列番号４１(PKSCDKTHCPPC)、配列番号４２(PKSCDCHTCPPCP)、配列番号４３(PKSCDCTHCPPCP)、配列番号４４(PCSCKHTCPPCP)、配列番号４５(PSCCTHTCPPCP)、配列番号４６(PSCDKHCCPPCP)、配列番号４７(PKSTHTCPPCP)、配列番号４８(PKSCTCPPCP)、または配列番号４９(PKSCDKCVECPPCP)からなる群から選択されるヒンジ領域アミノ酸配列を含んでなるモノクローナル抗体をコードする単離核酸に関する。
さらに別の態様によれば、本発明は、以下核酸から選択される単離核酸に関する：
ａ）本発明による人工ヒンジ領域をコードする核酸、ＤＮＡ、またはＲＮＡ、その対応するＲＮＡ核酸またはその相補的配列、
ｂ）配列番号１５〜２１、配列番号５０〜７７からなる群から選択される核酸配列(nucleic sequence)を含んでなる単離核酸配列、その対応するＲＮＡ核酸およびその相補的配列、および
ｃ）高ストリンジェンシー条件下で配列番号１５〜２１および５０〜７７の少なくとも一つの配列とハイブリダイズし得る少なくとも１８ヌクレオチドの核酸。
ａ）本発明による人工ヒンジ領域をコードする核酸、ＤＮＡ、またはＲＮＡ、その対応するＲＮＡ核酸またはその相補的配列、
ｂ）配列番号１５〜２１、配列番号５０〜７７からなる群から選択される核酸配列(nucleic sequence)を含んでなる単離核酸配列、その対応するＲＮＡ核酸およびその相補的配列、および
ｃ）高ストリンジェンシー条件下で配列番号１５〜２１および５０〜７７の少なくとも一つの配列とハイブリダイズし得る少なくとも１８ヌクレオチドの核酸。
好ましくは、本発明は、配列番号１５〜２１および配列番号５０〜７７からなる群から選択される核酸配列を含んでなる単離核酸を含んでなる。
また、これまでに記載したような単離核酸、より詳細には、配列番号１５〜配列番号２１および配列番号５０〜配列番号７７からなる群から選択される核酸配列を含んでなる単離核酸、その対応するＲＮＡ核酸およびその相補的配列を含んでなる発現ベクターまたは形質転換宿主細胞も本発明の一部である。
本発明において違いなく使用される用語の核酸、核酸配列(nucleic sequence)または核酸配列、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド配列、ヌクレオチド配列は、核酸の断片または領域の定義を可能とし、非天然ヌクレオチドを含むまたは含まない、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ならびに該ＤＮＡの転写産物に相当し得る、改変型または非改変型の正確なヌクレオチドの結合を示すものとする。また、ここで、本発明はそれらの天然の染色体環境にある、すなわち天然状態のヌクレオチド配列には関係しないと理解すべきである。それは、単離された、および／または精製された、すなわち、例えばコピーにより直接または間接的に選択された配列に関する（それらの環境は少なくとも部分的に改変されている）。よって、同様に、ここでは、例えば宿主細胞の手段による遺伝子組換えにより得られる、または化学合成により得られる単離核酸を示すものとする。
高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションは、温度条件およびイオン強度条件が相補的ＤＮＡの二つの断片間のハイブリダイゼーションを維持可能なように選択されることを意味する。例としては、上記のポリヌクレオチド断片を定義することを目的としたハイブリダイゼーション工程の高ストリンジェンシー条件は有利には以下のものである。
ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションを二段階で行う：（１）５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム溶液に相当する）、５０％のホルムアミド、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０×デンハート、５％のデキストラン硫酸および１％のサケ精子ＤＮＡを含有するリン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）中、４２℃で３時間のプレハイブリダイゼーション、（２）プローブのサイズに応じた温度（すなわち、プローブサイズが＞１００ヌクレオチドの場合４２℃）で２０時間の実際のハイブリダイゼーションの後、２×ＳＳＣ＋２％のＳＤＳ中、２０℃で２０分の洗浄２回、０．１×ＳＳＣ＋０．１％のＳＤＳ中、２０℃で２０分の洗浄１回。この最後の洗浄は、プローブサイズが＞１００ヌクレオチドの場合、０．１×ＳＳＣ＋０．１％のＳＤＳ中、６０℃で３０分行う。大きさが定義されたポリヌクレオチドに対する上記の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、Sambrookら(1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor)の教示に従い、当業者により、より大きなまたは小さなオリゴヌクレオチドに適したものとすることができる。
本発明は同様に、本発明による核酸を含んでなるベクターに関する。
本発明は、特に、本発明によるヌクレオチド配列を含むクローニングおよび／または発現ベクターを目的とする。
本発明によるベクターは好ましくは、所定の宿主細胞において翻訳されるヌクレオチド配列の発現および／または分泌を可能とするエレメントを含む。よって、ベクターはプロモーター、翻訳の開始および終結のシグナル、ならびに転写調節の適当な領域を含まなければならない。それは宿主細胞内で安定な様式で維持され得るものでなければならず、所望により、翻訳されるタンパク質の分泌を指定する特定のシグナルを持っていてもよい。
これらの種々のエレメントは、当業者により、使用する宿主細胞に応じて選択および至適化される。この主旨で、本発明によるヌクレオチド配列を選択された宿主内の自律複製ベクターに挿入することができ、あるいは選択された宿主の組み込みベクターに挿入することができる。
このようなベクターは当業者に現在用いられている方法によって作製することができ、得られたクローンを、リポフェクション、エレクトロポレーション、熱ショック、または化学法などの標準的な方法によって適当な宿主に導入することができる。
本発明によるベクターは、例えばプラスミド起源またはウイルス起源のベクターである。それらは本発明によるヌクレオチド配列をクローニングするまたは発現させるために宿主細胞を形質転換するのに有用である。
本発明はまた、本発明によるベクターにより形質転換された、または本発明によるベクターを含んでなる宿主細胞を含んでなる。
宿主細胞は原核生物系または真核生物系、例えば、細菌細胞から、また酵母Ｔ細胞または動物細胞、特に、哺乳類細胞から選択することができる。同様に、昆虫細胞または植物細胞も使用することができる。
本発明の他の特徴および利点は、実施例および図面とともに一連の記載で明らかになる。
実施例１：キメラＭａｂの構築およびｃ−Ｍｅｔ受容体のリン酸化状態の機能的評価
原型チロシンキナーゼ受容体（ｃ−Ｍｅｔ受容体）を標的とする数種のマウスＭａｂを、マウス可変ドメインと、ヒト定常ドメインとを有するキメラＭａｂとして再構成した。それらの固有の活性を、リガンド（ＨＧＦ）依存的なｃ−Ｍｅｔ受容体リン酸化の阻害を測定する機能的アッセイに基づき分析した。マウス可変ドメイン配列（ＶＨ、ＶＬ）のＰＣＲ−クローニングの際、マウスＶＨまたはＶＬ配列のいずれかを有する｛ＮｈｅＩ−ＢｃｌＩ｝制限断片を、ＩｇＧ１免疫グロブリンのヒト軽鎖Ｃκまたはヒト重鎖［ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３］のいずれかの定常ドメインの全コード配列を有するｐＣＥＰ４ベクター(InVitrogen, US)に連結してキメラＭａｂを構築した。クローニング工程は総て、Laboratory manual (Sambrook and Russel, 2001)に記載されているような慣例の分子生物学的技術に従って、または供給者の説明書に従って行った。各遺伝子構築物をＢｉｇ Ｄｙｅターミネーターサイクルシーケンシングキット(Applied Biosystems, US)を用いたヌクレオチド配列決定により完全にバリデートし、３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ(Applied Biosystems, US)を用いて分析した。対応するキメラＭａｂの作製は６ｍＭグルタミンを添加した血清不含培地Ｅｘｃｅｌｌ ２９３(SAFC Biosciences)で増殖させた、懸濁に適応したＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞(InVitrogen, US)を用いて分析した。直鎖状２５ｋＤａポリエチレンイミン（ＰＥＩ）(Polysciences)を用い、一時的トランスフェクションを行った。培養工程を、細胞生存率とＭａｂ生産に基づいて測定した。Ａタンパク質樹脂(GE Healthcare, US)上での慣例的クロマトグラフィーアプローチを用い、Ｍａｂを精製した。
原型チロシンキナーゼ受容体（ｃ−Ｍｅｔ受容体）を標的とする数種のマウスＭａｂを、マウス可変ドメインと、ヒト定常ドメインとを有するキメラＭａｂとして再構成した。それらの固有の活性を、リガンド（ＨＧＦ）依存的なｃ−Ｍｅｔ受容体リン酸化の阻害を測定する機能的アッセイに基づき分析した。マウス可変ドメイン配列（ＶＨ、ＶＬ）のＰＣＲ−クローニングの際、マウスＶＨまたはＶＬ配列のいずれかを有する｛ＮｈｅＩ−ＢｃｌＩ｝制限断片を、ＩｇＧ１免疫グロブリンのヒト軽鎖Ｃκまたはヒト重鎖［ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３］のいずれかの定常ドメインの全コード配列を有するｐＣＥＰ４ベクター(InVitrogen, US)に連結してキメラＭａｂを構築した。クローニング工程は総て、Laboratory manual (Sambrook and Russel, 2001)に記載されているような慣例の分子生物学的技術に従って、または供給者の説明書に従って行った。各遺伝子構築物をＢｉｇ Ｄｙｅターミネーターサイクルシーケンシングキット(Applied Biosystems, US)を用いたヌクレオチド配列決定により完全にバリデートし、３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ(Applied Biosystems, US)を用いて分析した。対応するキメラＭａｂの作製は６ｍＭグルタミンを添加した血清不含培地Ｅｘｃｅｌｌ ２９３(SAFC Biosciences)で増殖させた、懸濁に適応したＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞(InVitrogen, US)を用いて分析した。直鎖状２５ｋＤａポリエチレンイミン（ＰＥＩ）(Polysciences)を用い、一時的トランスフェクションを行った。培養工程を、細胞生存率とＭａｂ生産に基づいて測定した。Ａタンパク質樹脂(GE Healthcare, US)上での慣例的クロマトグラフィーアプローチを用い、Ｍａｂを精製した。
種々の形態のＭａｂは総て機能的評価に好適なレベルで作製した。生産性レベルは一般に精製Ｍａｂ１５〜３０ｍｇ／ｌの範囲である。
機能的評価はＡ５４９ヒト肺癌細胞で行った。ｃ−Ｍｅｔ受容体のリン酸化状態は、細胞溶解液に対して特異的捕捉ＥＬＩＳＡアッセイを用いて行った。ヤギ抗ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂ(R&D, AF276)を捕捉抗体として用い、検出抗体は抗ホスホ−ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂ(Biosource ref KHO0281)に相当した。発光の読み取り値はＭｉｔｈｒａｓ ＬＢ９２０マルチモードプレートリーダー(Berthold)で記録した。
三種類のネズミＭａｂ １１Ｅ１、２２４Ｇ１１、および２２７Ｈ１は総てｃ−Ｍｅｔ受容体リン酸化に対して匹敵する固有活性を生じ、すなわち、それら自体によるアゴニスト活性はほとんど無く（ＨＧＦ作用は５％未満、図１Ａ）、ＨＧＦ［１００ｎｇ／ｍｌ］により誘発されたｃ−Ｍｅｔ受容体のリン酸化が強く阻害された（ＨＧＦ作用の阻害は＞７０％、図１Ｂ）。大変驚くべきことに、マウスＩｇＧ１／κからヒトＩｇＧ１κへ切り換えるためにもっぱらＭａｂの定常ドメインを改変することにより、得られたキメラＭａｂの固有活性の完全な改変が見られた（図１Ａ〜１Ｂ）。実際、アンタゴニスト効力に重要な低下を伴って（ｃ２２４Ｇ１１に対するＨＧＦ作用の阻害の６０％をとどめるに過ぎない、図１Ｂ）強い促進作用（ｃ１１Ｅ１に対するＨＧＦ作用の２０％に達する、図１Ａ）が見られた。これらの３種類の供試Ｍａｂ（１１Ｅ１、２２４Ｇ１１および２２７Ｈ１モノクローナル抗体は２００７年３月１４日にＣＮＣＭ Ｉ−３７２４（１１Ｅ１に相当）、Ｉ−３７３１（２２４Ｇ１１に相当）およびＩ−３７３２（２２７Ｈ１に相当）としてthe Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, National Collection of Microorganism Cultures) (Institut Pasteur, Paris, France)に寄託されたハイブリドーマにより分泌される）で同じ現象が見られたことから、この作用は抗体の可変ドメインに依存していた（ＷＯ２００９／００７４２７号公報として公開されているＰＣＴ特許出願を参照）。
実施例２：操作されたヒンジ型の設計、クローニング、および作製
上記の所見に基づけば、マウスＩｇＧ１ ＭａｂをヒトＩｇＧ１ Ｍａｂへ再構成した際に見られた薬理学的特性の障害はヒトＩｇＧ１ドメインによるものであったとの仮説が立てられる。一方、文献では、ｃ−Ｍｅｔ受容体の活性化がその二量体化と関連していること、およびｃ−Ｍｅｔ受容体の二量体化の阻害がｃ−Ｍｅｔ受容体のリン酸化および下流のシグナル伝達を阻害し得ることが知られていた。
上記の所見に基づけば、マウスＩｇＧ１ ＭａｂをヒトＩｇＧ１ Ｍａｂへ再構成した際に見られた薬理学的特性の障害はヒトＩｇＧ１ドメインによるものであったとの仮説が立てられる。一方、文献では、ｃ−Ｍｅｔ受容体の活性化がその二量体化と関連していること、およびｃ−Ｍｅｔ受容体の二量体化の阻害がｃ−Ｍｅｔ受容体のリン酸化および下流のシグナル伝達を阻害し得ることが知られていた。
他方、Ｍａｂは本質的にはそれらの固有の構造的基礎による二価分子であり、従って、それらはｃ−Ｍｅｔ受容体二量体化の誘導物質として働き得る。従って、回転、折れ曲がりまたは振れなどのキメラＭａｂのコンフォメーションのフレキシビリティーを制限することにより（Rouxら、1997参照)、親型のネズミＭａｂの着目する固有活性（強い拮抗作用および弱い促進作用）を取り戻すことができるとの仮説が立てられる。この仮説はマウスおよびヒトＩｇＧ１ヒンジ領域（ＩｇＧ１ Ｈ領域とも呼ばれる）の以下の個々の配列の分析により補強される：
マウスＩｇＧ１ Ｈ領域 PRDCGCKPCICT （配列番号１）
ヒトＩｇＧ１ Ｈ領域 PKSCDKTHTCPPCP （配列番号１１）
ヒトＩｇＧ２ Ｈ領域 RKCCVECPPCP （配列番号７）。
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マウスＩｇＧ１ Ｈ領域 PRDCGCKPCICT （配列番号１）
ヒトＩｇＧ１ Ｈ領域 PKSCDKTHTCPPCP （配列番号１１）
ヒトＩｇＧ２ Ｈ領域 RKCCVECPPCP （配列番号７）。
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このアライメントは、マウスＩｇＧ１ Ｈ領域はヒトＩｇＧ１ Ｈ領域と比べた際に短く、余分な１個のジスルフィド架橋（Ｃｙｓ）を含むことを示す。また、それはヒトＩｇＧ２ Ｈ領域がその長さ（１１ＡＡ）と、ジスルフィド架橋の数（４）との双方でマウスＩｇＧ１ Ｈ領域と似ていることをも示す。
よって、ヒトＩｇＧ１ Ｈ領域の堅牢性の増強は、Ｃｙｓ残基などの安定化突然変異を導入することにより、および／またはこの特定のセグメントを短縮することにより得ることができると推測される。この推定される増強されたＨ領域の堅牢性は、操作されたヒトＩｇＧ１ Ｍａｂの改良された機能的特性に関連するものである可能性がある。
最初の系列の７つの操作型は、マウス配列とヒト配列の間でＮ末端ヒンジ領域かまたはＣ末端ヒンジ領域のいずれかが交換された際にキメラＨ領域を作り出すことにより設計されたものである（表２）。ＩｇＧ２均等物の構築も同様に行った。
Ｈ領域内に１個の付加的システイン残基を導入すること、または少なくとも一つのアミノ酸の欠失を作出すること、またはＨ領域内における１個のシステインの付加と少なくとも一つのアミノ酸の欠失を同時に組み合わせることのいずれかの影響を評価するために、Ｈ領域におけるさらなる系列の２８の変異株を設計および構築した。
この新規な系列のヒンジ突然変異体を表３に記載する。
ヒンジ操作の例として、２２４Ｇ１１と呼ばれるマウス抗ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂの可変ドメイン（重鎖および軽鎖）を選択した。
これらのマウス配列を、最初の場合では、ヒトＩｇＧ1軽鎖のヒト定常ドメイン［Ｃκ］に、そして重鎖の［ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３］に融合させた。ヒンジ領域の改変は、｛Ｎｈｅ１−Ｂｃｌ１｝制限断片を、所望の改変を有する均等部分と交換することにより行った（各個の｛Ｎｈｅ１−Ｂｃｌ１｝断片はグローバルな遺伝子合成(Genecust, LU)により合成される）。同様にして総ての新たなヒンジ突然変異体を構築した。
クローニング工程は総て、Laboratory manual (Sambrook and Russel, 2001)に記載されているような慣例の分子生物学的技術に従って、または供給者の説明書に従って行った。各遺伝子構築物をＢｉｇ Ｄｙｅターミネーターサイクルシーケンシングキット(Applied Biosystems, US)を用いたヌクレオチド配列決定により完全にバリデートし、３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ(Applied Biosystems, US)を用いて分析した。
懸濁に適応したＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞(InVitrogen, US)は通常、オービタルシェーカー（回転速度１１０ｒｐｍ）上、２５０ｍｌフラスコの、６ｍＭグルタミンを添加した５０ｍｌの血清不含培地Ｅｘｃｅｌｌ ２９３(SAFC Biosciences)中で増殖させた。一時的トランスフェクションは、水中に終濃度１ｍｇ／ｍｌ混合物で調製した直鎖状２５ｋＤａポリエチレンイミン（ＰＥＩ）(Polysciences)とプラスミドＤＮＡ（重鎖プラスミドと軽鎖プラスミドの比を１：１として、終濃度１．２５μｇ／ｍｌ）を用い、２．１０６細胞／ｍｌで行った。トランスフェクション後４時間で、培養物を最終細胞密度が１０６細胞／ｍｌとなるように１容量の新鮮培養培地で希釈した。培養工程を細胞生存率およびＭａｂの生産に基づいて測定した。一般に、培養を４〜５日間維持した。Ａタンパク質樹脂(GE Healthcare, US)上での慣例的クロマトグラフィーアプローチを用いてＭａｂを精製した。
種々の形態のＭａｂを総て機能的評価に好適なレベルで生産した。生産レベルは一般に精製Ｍａｂ１５〜３０ｍｇ／ｌの間の範囲である。
実施例３：ホスホ−ｃ−Ｍｅｔ特異的ＥＬＩＳＡアッセイにおける操作されたＭａｂの評価
Ａ５４９細胞を１２マルチウェル（ＭＷ）プレートの完全増殖培地［Ｆ１２Ｋ＋１０％ＦＣＳ］に播種した。細胞を１６時間飢餓状態にした後、ＨＧＦ［１００ｎｇ／ｍｌ］で刺激し、リガンド刺激の１５分前に各供試Ｍａｂを終濃度３０μｇ／ｍｌで加えた。氷冷溶解バッファーを加え、１５分後にＨＧＦを加えてリン酸化反応を停止させた。細胞を機械的にこすり落とし(scaped)、細胞溶解液を４℃、１３０００ｒｐｍにて１０分間の遠心分離により回収し、細胞溶解液は上清相に相当する。タンパク質含量はＢＣＡキット(Pierce)を用いて定量し、使用まで−２０℃で保存した。ｃ−Ｍｅｔのリン酸化状態をＥＬＩＳＡにより定量した。ヤギ抗ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂ(R&D, ref AF276)を捕捉抗体として用い（一晩４℃でコーティング）、ＴＢＳ−ＢＳＡ５％バッファーを用いた飽和工程（室温で（ＲＴ）１時間）の後、２５μｇのタンパク質溶解液を、コーティングした９６ＭＷプレートの各ウェルに加えた。室温で９０分インキュベートした後、プレートを４回洗浄し、検出抗体（位置１２３０、１２３４および１２３５のリン酸化されたＴｙｒ残基に対する抗ホスホ−ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂ）を加えた。さらに１時間インキュベートし、４回洗浄した後に、ＨＲＰ(Biosource)に結合された抗ウサギ抗体を室温で１時間加え、ルミノールを加えることにより発光の検出を行った。発光の読み取りはＭｉｔｈｒａｓ ＬＢ９２０マルチモードプレートリーダー(Berthold)にて行った。
Ａ５４９細胞を１２マルチウェル（ＭＷ）プレートの完全増殖培地［Ｆ１２Ｋ＋１０％ＦＣＳ］に播種した。細胞を１６時間飢餓状態にした後、ＨＧＦ［１００ｎｇ／ｍｌ］で刺激し、リガンド刺激の１５分前に各供試Ｍａｂを終濃度３０μｇ／ｍｌで加えた。氷冷溶解バッファーを加え、１５分後にＨＧＦを加えてリン酸化反応を停止させた。細胞を機械的にこすり落とし(scaped)、細胞溶解液を４℃、１３０００ｒｐｍにて１０分間の遠心分離により回収し、細胞溶解液は上清相に相当する。タンパク質含量はＢＣＡキット(Pierce)を用いて定量し、使用まで−２０℃で保存した。ｃ−Ｍｅｔのリン酸化状態をＥＬＩＳＡにより定量した。ヤギ抗ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂ(R&D, ref AF276)を捕捉抗体として用い（一晩４℃でコーティング）、ＴＢＳ−ＢＳＡ５％バッファーを用いた飽和工程（室温で（ＲＴ）１時間）の後、２５μｇのタンパク質溶解液を、コーティングした９６ＭＷプレートの各ウェルに加えた。室温で９０分インキュベートした後、プレートを４回洗浄し、検出抗体（位置１２３０、１２３４および１２３５のリン酸化されたＴｙｒ残基に対する抗ホスホ−ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂ）を加えた。さらに１時間インキュベートし、４回洗浄した後に、ＨＲＰ(Biosource)に結合された抗ウサギ抗体を室温で１時間加え、ルミノールを加えることにより発光の検出を行った。発光の読み取りはＭｉｔｈｒａｓ ＬＢ９２０マルチモードプレートリーダー(Berthold)にて行った。
重鎖ヒンジドメインの第一の系列の操作型を構築し、ｃ−Ｍｅｔ受容体リン酸化アッセイでアッセイした。図２Ａに示されるように、２２４Ｇ１１［ＩｇＧ１−Ｃｈｉｍ］と比較して、ＩｇＧ２に基づく構築物といくつかの操作型ＩｇＧ１／κ構築物［ＭＨ、ＭＵＰ９ＨおよびＴＨ７、図２Ａ］の双方で、ｈＩｇＧ１／κアイソタイプに関連したアゴニスト作用の重要な低下が見られた。最も弱く、匹敵する促進活性が完全ネズミＩｇＧ１ヒンジ領域を含む２２４Ｇ１１［ＭＨ−ＩｇＧ１］とほとんどヒトの操作型ＩｇＧ１ヒンジ領域を含むと２２４Ｇ１１［ＴＨ７］で見られた。同時にアンタゴニスト抗力の増加も得られた［図２Ｂ］。よって、ネズミ２２４Ｇ１１可変ドメインを伴うＩｇＧ２に基づくものと操作型ｈＩｇＧ１／κに基づくＴＨ７ヒンジ突然変異体は、マウス２２４Ｇ１１ Ｍａｂの場合とほぼ同様の機能的活性を生じた。しかしながら、２２４Ｇ１１［ＭＭＣＨ−ＩｇＧ１−ｃｈｉｍ］と２２４Ｇ１１［ＩｇＧ１−ｃｈｉｍ］との促進／拮抗活性を比較したところ、拮抗活性の増強はこのような抗体の固有の拮抗特性に関係なく抗体を操作することにより得られ得ることが証明された。
重鎖ヒンジドメインの第二の系列の操作型を構築し、ｃ−Ｍｅｔ受容体リン酸化アッセイでアッセイした。図１１Ａに示されるように、システイン残基を導入する重鎖ヒンジドメインにおけるアミノ酸置換は抗体のアゴニスト作用を改変した。実際、一方で、例えばｃ２２４Ｇ１１［Ｃ２］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ３］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ５］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ６］、またはｃ２２４Ｇ１１［Ｃ７］などのいくつかの突然変異型はｃ２２４Ｇ１１よりも弱いアゴニスト作用を示し、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ１１］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ１２］、およびｃ２２４Ｇ１１［Ｃ１４］などの他のものはアゴニスト作用を増強した。さらに、アミノ酸置換に関連する、または関連しない重鎖ヒンジドメインにおけるアミノ酸欠失も抗体のアゴニスト特性を改変した［図１１Ｂ］。例えば、ｃ２２４Ｇ１１［Δ１−３］、ｃ２２４Ｇ１１［Δ４−５−６］、ｃ２２４Ｇ１１［Δ５−６−７−８］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ７Δ６］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ６Δ９］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ２Δ５−７］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ５Δ２−６］、またはｃ２２４Ｇ１１［Ｃ９Δ２−７］は、ｃ２２４Ｇ１１よりも弱いアゴニスト作用を示したが、ｃ２２４Ｇ１１［Δ８−１１］はより強いアゴニスト作用を示した。ｃ２２４Ｇ１１［ＴＨ７］のように、より弱いアゴニスト作用を示す新規な型は総て、同時にアンタゴニスト効力の増強を示したが［図１２Ａおよび１２Ｂ］、より強いアゴニスト作用を示すものは弱いアンタゴニスト効力を示した。
本願において、角括弧の使用は必ずしも必要ではなく、例としては、［２２４Ｇ１１］［ＩｇＧ２ｃｈｉｍ］は２２４Ｇ１１ＩｇＧ２ｃｈｉｍと同じであると考えるべきである。同様に、抗体がネズミ抗体であることを示すためには、ネズミという表示またはｍの文字を付け足すことができ、抗体がキメラ抗体であることを示すためには、ｃｈｉｍという表示またはｃの文字を付け足すことができ、抗体がヒト化抗体であることを示すためには、ｈｕｍという表示またはｈの文字を付け足すことができる。例として、キメラ抗体２２４Ｇ１ＩｇＧ２はｃ２２４ＧＨＩｇＧ２、ｃ２２４Ｇ［ＩｇＧ２］、ｃ［２２４Ｇ１１］ＩｇＧ２、ｃ［２２４Ｇ１１］［ＩｇＧ２］、２２４Ｇ１１ＩｇＧ２ｃｈｉｍ、２２４Ｇ１１［ＩｇＧ２ｃｈｉｍ］、［２２４Ｇ１１］ＩｇＧ２ｃｈｉｍ、または［２２４Ｇ１１］［ＩｇＧ２ｃｈｉｍ］と呼ぶことができる。
記号Δは欠失を意味する。
記号Δは欠失を意味する。
実施例４：ＢＲＥＴ分析
第一の実験セットでは、無関連のマウスＩｇＧｌ、ヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ２は両ＢＲＥＴモデルにおいてＨＧＦにより誘導されるＢＲＥＴシグナルの効果は無かったことを対照とした（図３）。これらのＭａｂをさらに対照として用いた。
第一の実験セットでは、無関連のマウスＩｇＧｌ、ヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ２は両ＢＲＥＴモデルにおいてＨＧＦにより誘導されるＢＲＥＴシグナルの効果は無かったことを対照とした（図３）。これらのＭａｂをさらに対照として用いた。
次に、ｃ−Ｍｅｔ二量体化およびｃ−ｍｅｔ活性化ＢＲＥＴモデルにおいて、マウス２２４Ｇ１１ Ｍａｂ（［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍ）、マウス１１Ｅ１ Ｍａｂ（１１Ｅ１］ｃｈｉｍ）、およびマウス２２７Ｈ１ Ｍａｂ（［２２７Ｈ１］ｃｈｉｍ）のＩｇＧ１キメラ型の作用を評価した。
マウス２２４Ｇ１１ Ｍａｂはｃ−Ｍｅｔ二量体化モデルにおいてＨＧＦにより誘導されるＢＲＥＴシグナルの５９％を阻害したが、［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍ Ｍａｂは２９％を阻害したに過ぎなかった（図４）。［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍおよびｍ２２４Ｇ１１抗体はＨＧＦにより誘導されるＢＲＥＴシグナルの３４．５％および５６．４％を阻害したことから（図５）、［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍ抗体もまた、ＨＧＦにより誘導されるｃ−Ｍｅｔの活性化の阻害にあまり有効でなかった。さらに、ｍ２２４Ｇ１１単独もｃ−Ｍｅｔの活性化に効果が無く、一方、［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍはｃ−Ｍｅｔの活性化に、ＨＧＦにより誘導されるシグナルの３２．９％に相当する部分的アゴニスト作用を持っていた。［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍは単独でｍ２２４Ｇ１１の場合の２１．３％に対してＨＧＦにより誘導されるシグナルの４６．６％に相当するＢＲＥＴの増強を誘導したことから、この［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍの部分的アゴニスト作用はｃ−Ｍｅｔ二量体化ＢＲＥＴモデルでも見られた。
第二の系列の操作型重鎖ヒンジドメインのアゴニスト効力をｃ−Ｍｅｔ活性化ＢＲＥＴモデルで評価した（図１３Ａおよび１３Ｂ）。ｃ−Ｍｅｔの活性化に対して部分的アゴニスト作用を有していたｃ２２４Ｇ１１とは対照的に、アミノ酸置換、アミノ酸欠失またはその双方を含んでなる２２４Ｇ１１抗体の種々のヒンジ突然変異キメラ形態は、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ２］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ３］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ５］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ６］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ７］、ｃ２２４Ｇ１１［Δ１−３］、ｃ２２４Ｇ１１［Δ４−５−６］、ｃ２２４Ｇ１１［Δ５−６−７−８］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ７Δ６］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ６Δ９］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ２Δ５−７］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ５Δ２−６］、またはｃ２２４Ｇ１１［Ｃ９Δ２−７］のそれぞれで単独に、ｃ−Ｍｅｔの活性化に有意な作用を示さなかった。これに対し、ｃ２２４Ｇ１１［Δ６］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ１１］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ１２］、およびｃ２２４Ｇ１１［Ｃ１４］のような他のヒンジ突然変異キメラ型は、アゴニスト作用の増強を示した。
実施例５：キメラおよびヒト化２２４Ｇ１１型によるｃ−Ｍｅｔ認識
組換えｃ−Ｍｅｔの種々のキメラ形態およびヒト化形態の結合能を調べるために直接的ＥＬＩＳＡを設定した。要するに、R&D Systemsからの組換え二量体ｃ−Ｍｅｔを９６ウェルＩｍｍｕｎｌｏｎ ＩＩプレートに１．２５μｇ／ｍｌでコーティングした。４℃で一晩インキュベートした後、ウェルを０．５％ゼラチン／ＰＢＳ溶液で飽和させた。次に、プレートを３７℃で１時間インキュベートした後、２倍希釈の供試抗体を加えた。プレートをさらに１時間インキュベートした後、ネズミ抗体を検出するためのヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰとキメラおよびヒト化抗体認識のためのヤギ抗ヒトκ軽鎖ＨＲＰを加えた。プレートを１時間インキュベートし、ペルオキシダーゼ基質ＴＭＢ Ｕｐｔｉｍａを５分間加え、Ｈ２ＳＯ４ １Ｍで中和した。図６Ａおよび６Ｂに示す結果は、供試した総ての形態でｃ−Ｍｅｔ認識は匹敵するものであったことを示した。
組換えｃ−Ｍｅｔの種々のキメラ形態およびヒト化形態の結合能を調べるために直接的ＥＬＩＳＡを設定した。要するに、R&D Systemsからの組換え二量体ｃ−Ｍｅｔを９６ウェルＩｍｍｕｎｌｏｎ ＩＩプレートに１．２５μｇ／ｍｌでコーティングした。４℃で一晩インキュベートした後、ウェルを０．５％ゼラチン／ＰＢＳ溶液で飽和させた。次に、プレートを３７℃で１時間インキュベートした後、２倍希釈の供試抗体を加えた。プレートをさらに１時間インキュベートした後、ネズミ抗体を検出するためのヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰとキメラおよびヒト化抗体認識のためのヤギ抗ヒトκ軽鎖ＨＲＰを加えた。プレートを１時間インキュベートし、ペルオキシダーゼ基質ＴＭＢ Ｕｐｔｉｍａを５分間加え、Ｈ２ＳＯ４ １Ｍで中和した。図６Ａおよび６Ｂに示す結果は、供試した総ての形態でｃ−Ｍｅｔ認識は匹敵するものであったことを示した。
実施例６：in vitroにおけるＨＧＦにより誘導されるＮＣＩ−Ｈ４４１細胞の増殖に対するネズミ抗体およびキメラ抗体の作用
ＡＴＣＣからのＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を通常、ＲＰＭＩ１６４０培地(Invitrogen Corporation, Scotland, UK)、１０％ＦＣＳ(Invitrogen Corporation)、１％Ｌ−グルタミン(Invitrogen Corporation)中で培養した。増殖アッセイのため、プレーティング前にコンフルエント増殖期となるように使用の３日前に細胞を分割した。ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を９６ウェル組織培養プレートの２００μｌの血清不含培地（ＲＰＭＩ１６４０培地および１％Ｌ−グルタミン）中に３．７５×１０４細胞／ウェルの密度でプレーティングした。プレーティング２４時間後に、供試抗体をＮＣＩ−Ｈ４４１に加え、３７℃で３０分間インキュベートし、その後、ＨＧＦを終濃度４００ｎｇ／ｍｌ（５ｎＭ）でさらに１４２時間加えた。各抗体の試験用量範囲は１０〜０．００９７μｇ／ｍｌ（各ウェル中の終濃度）である。この実験では、ネズミＩｇＧ１ Ｍａｂをネズミアイソタイプ対照として加え、供試抗体は次のものであった：それぞれ［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍ、［１１Ｅ１］ｃｈｉｍおよび［２２７Ｈ１］ｃｈｉｍとして識別されるｍ２２４Ｇ１１、ｍ１１Ｅ１、ｍ２２７Ｈ１およびそれらのヒトＩｇＧ１キメラ形態。細胞単独−／＋ＨＧＦをプレーティングしたウェルも含めた。次に、細胞を０．２５μＣｉの［３Ｈ］チミジン(Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden)で７時間３０分刺激した。トリクロロ酢酸に不溶なＤＮＡに組み込まれた［３Ｈ］チミジンの規模を液体シンチレーション計数により定量した。結果は、腫瘍細胞に単独で加えた場合の抗ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂで見られ得る潜在的な固有アゴニスト活性をより良く評価するために未変換のｃｐｍデータとして表す。
ＡＴＣＣからのＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を通常、ＲＰＭＩ１６４０培地(Invitrogen Corporation, Scotland, UK)、１０％ＦＣＳ(Invitrogen Corporation)、１％Ｌ−グルタミン(Invitrogen Corporation)中で培養した。増殖アッセイのため、プレーティング前にコンフルエント増殖期となるように使用の３日前に細胞を分割した。ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を９６ウェル組織培養プレートの２００μｌの血清不含培地（ＲＰＭＩ１６４０培地および１％Ｌ−グルタミン）中に３．７５×１０４細胞／ウェルの密度でプレーティングした。プレーティング２４時間後に、供試抗体をＮＣＩ−Ｈ４４１に加え、３７℃で３０分間インキュベートし、その後、ＨＧＦを終濃度４００ｎｇ／ｍｌ（５ｎＭ）でさらに１４２時間加えた。各抗体の試験用量範囲は１０〜０．００９７μｇ／ｍｌ（各ウェル中の終濃度）である。この実験では、ネズミＩｇＧ１ Ｍａｂをネズミアイソタイプ対照として加え、供試抗体は次のものであった：それぞれ［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍ、［１１Ｅ１］ｃｈｉｍおよび［２２７Ｈ１］ｃｈｉｍとして識別されるｍ２２４Ｇ１１、ｍ１１Ｅ１、ｍ２２７Ｈ１およびそれらのヒトＩｇＧ１キメラ形態。細胞単独−／＋ＨＧＦをプレーティングしたウェルも含めた。次に、細胞を０．２５μＣｉの［３Ｈ］チミジン(Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden)で７時間３０分刺激した。トリクロロ酢酸に不溶なＤＮＡに組み込まれた［３Ｈ］チミジンの規模を液体シンチレーション計数により定量した。結果は、腫瘍細胞に単独で加えた場合の抗ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂで見られ得る潜在的な固有アゴニスト活性をより良く評価するために未変換のｃｐｍデータとして表す。
図７Ａ、７Ｂ、および７Ｃに示す結果は、予測されたように、ネズミ抗体は、どんな供試用量であっても癌細胞に単独で加えた場合にはアゴニスト作用を示さないことを実証した。この実験でのこのアイソタイプ対照に関して見られた高いｃｐｍ変動からして、このアイソタイプ対照ではＨＧＦにより誘導される増殖の有意な阻害は見られなかった。単独で加えた場合、ネズミｍ２２４Ｇ１１もｍ１１Ｅ１またはｍ２２７Ｈ１も、ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照Ｍａｂまたは細胞単独に比べてアゴニスト作用を示さなかった。ｍ２２４Ｇ１１、ｍ１１Ｅ１またはｍ２２７Ｈ１ Ｍａｂに関してはそれぞれ７８％、８０％、または８０％に達する用量依存的な抗増殖活性であった（阻害率％の計算：１００−［（ｃｐｍ細胞＋供試Ｍａｂ−平均ｃｐｍバックグラウンドｍＩｇＧ１）×１００／（平均ｃｐｍ細胞＋ＨＧＦ−平均ｃｐｍ細胞単独）］）。驚くことに、これらの３種類のＭａｂのキメラ形態は、単独で加えた場合、それぞれ［１１Ｅ１］ｃｈｉｍおよび［２２７Ｈ１］ｃｈｉｍに関して、ＨＧＦで見られたものに近い増殖刺激を伴って、有意な用量依存的アゴニスト作用を誘導した。特に高い固有アゴニスト活性を示すこれら２種類の抗体では、アンタゴニスト作用は有意に低下し、それらの両ネズミ形態で見られた８０％に比べて５３％および２１％の阻害作用であった。キメラ［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍで見られたアゴニスト作用もまた用量依存的であったが、それは［１１Ｅ１］ｃｈｉｍおよび［２２７Ｈ１］ｃｈｉｍに関して見られたものより低かった。しかしながら、このアゴニスト作用はＨＧＦにより誘導される増殖のin vitro阻害に影響を示し、ネズミｍ２２４Ｇ１１の７８％からそのキメラ形態の５０％までシフトさせた。このような「低い」in vitro固有アゴニスト活性が変化のないin vivo作用と相容れたのか否かを調べるため、in vivo試験のためにｍ２２４Ｇ１１と［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍとの双方を作製した。事前の試験で３０μｇ／マウスの用量が有意なin vivo活性を示したことから、その用量をin vivo評価用に選択した。
実施例７：ＮＣＩ−Ｈ４４１異種移植モデルにおけるネズミおよびキメラ２２４Ｇ１１ Ｍａｂのin vivo比較
ＮＣＩ−Ｈ４４１は乳頭状肺腺癌に由来し、高レベルのｃ−Ｍｅｔを発現し、ｃ−Ｍｅｔ ＲＴＫの構成的リン酸化を示す。
ＮＣＩ−Ｈ４４１は乳頭状肺腺癌に由来し、高レベルのｃ−Ｍｅｔを発現し、ｃ−Ｍｅｔ ＲＴＫの構成的リン酸化を示す。
ＮＣＩ−Ｈ４４１異種移植モデルに対する抗体のin vivo作用を評価するために、６〜８週齢の無胸腺マウスを濾過除菌フィルターで蓋をしたケージで飼育し、無菌条件で維持し、仏国および欧州ガイドラインに従って操作した。マウスに９×１０６細胞を皮下注射した。そして、細胞移植６日後に腫瘍が測定可能となり（約１００ｍｍ３）、動物を匹敵する大きさの腫瘍を有する６匹ずつに分け、まず、６０μｇ抗体／マウスの負荷用量で処置し、その後、１週間に２回、各供試抗体１ｍｇ／用量で処置した。異種移植増殖速度を観測するためにマウスを追跡した。腫瘍体積は、式：π（Ｐｉ）／６×長さ×幅×高さにより算出した。図８に示した結果は、予測されたように、in vivoアゴニスト活性を欠いたネズミＭａｂは、供試用量が低くても強力なアンタゴニストとして振る舞うことを示す。ネズミＭａｂの場合に見られたものとは対照的に、キメラ型のものは極めて一時的なin vivo活性を示し、腫瘍は細胞注射２０日後に完全にこの処置を回避した。この実験は、アンタゴニスト活性の低下をもたらしたin vitroアゴニスト作用の増強がin vivoにおける有意なアンタゴニスト活性の損失も担っていたことを明らかに示す。
実施例８：in vitroにおけるＨＧＦにより誘導されるＮＣＩ−Ｈ４４１細胞の増殖に対するネズミ２２４Ｇ１１ Ｍａｂならびにこの抗体の種々のキメラ型およびヒト化型の作用
ＡＴＣＣからのＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を通常、ＲＰＭＩ１６４０培地(Invitrogen Corporation, Scotland, UK)、１０％ＦＣＳ(Invitrogen Corporation)、１％Ｌ−グルタミン(Invitrogen Corporation)で培養した。増殖アッセイのため、プレーティング前にコンフルエント増殖期となるように使用の３日前に細胞を分割した。ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を９６ウェル組織培養プレートの２００μｌの血清不含培地（ＲＰＭＩ１６４０培地および１％Ｌ−グルタミン）中に３．７５×１０４細胞／ウェルの密度でプレーティングした。プレーティング２４時間後に、供試抗体をＮＣＩ−Ｈ４４１に加え、３７℃で３０分間インキュベートし、その後、ＨＧＦを終濃度４００ｎｇ／ｍｌ（５ｎＭ）でさらに１４２時間加えた。各抗体の試験用量範囲は１０〜０．００９７μｇ／ｍｌ（各ウェル中の終濃度）である。この実験では、ネズミＩｇＧ１ Ｍａｂをネズミアイソタイプ対照として、またアゴニスト陰性対照として加えた。供試抗体は次のものであった：ｉ）ｍ２２４Ｇ１１、ｉｉ）それぞれ［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍ、［２２４Ｇ１１］［ＭＨ ｃｈｉｍ］、［２２４Ｇ１１］［ＭＵＰ９Ｈ ｃｈｉｍ］、［２２４Ｇ１１］［ＭＭＣＨ ｃｈｉｍ］、［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ ｃｈｉｍ］として識別されるそのヒトＩｇＧ１キメラ形態、ｉｉｉ）それぞれ［２２４Ｇ１１］［Ｈｚ１］、［２２４Ｇ１１］［Ｈｚ２］、［２２４Ｇ１１］［Ｈｚ３］として記載されるそのヒト化ＩｇＧ１形態。細胞単独−／＋ＨＧＦをプレーティングしたウェルも含めた。ＡＴＣＣでハイブリドーマ細胞株として商業的に入手可能なGenentechからの５Ｄ５完全抗体を完全アゴニスト陽性対照として含め、以降、ｍ５Ｄ５と呼んだ。次に、細胞を０．２５μＣｉの［３Ｈ］チミジン(Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden)で７時間３０分刺激した。トリクロロ酢酸に不溶なＤＮＡに組み込まれた［３Ｈ］チミジンの規模を液体シンチレーション計数により定量した。結果は、腫瘍細胞に単独で加えた場合の抗ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂで見られ得る潜在的な固有アゴニスト活性をより良く評価するために未変換のｃｐｍデータとして表す。
ＡＴＣＣからのＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を通常、ＲＰＭＩ１６４０培地(Invitrogen Corporation, Scotland, UK)、１０％ＦＣＳ(Invitrogen Corporation)、１％Ｌ−グルタミン(Invitrogen Corporation)で培養した。増殖アッセイのため、プレーティング前にコンフルエント増殖期となるように使用の３日前に細胞を分割した。ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を９６ウェル組織培養プレートの２００μｌの血清不含培地（ＲＰＭＩ１６４０培地および１％Ｌ−グルタミン）中に３．７５×１０４細胞／ウェルの密度でプレーティングした。プレーティング２４時間後に、供試抗体をＮＣＩ−Ｈ４４１に加え、３７℃で３０分間インキュベートし、その後、ＨＧＦを終濃度４００ｎｇ／ｍｌ（５ｎＭ）でさらに１４２時間加えた。各抗体の試験用量範囲は１０〜０．００９７μｇ／ｍｌ（各ウェル中の終濃度）である。この実験では、ネズミＩｇＧ１ Ｍａｂをネズミアイソタイプ対照として、またアゴニスト陰性対照として加えた。供試抗体は次のものであった：ｉ）ｍ２２４Ｇ１１、ｉｉ）それぞれ［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍ、［２２４Ｇ１１］［ＭＨ ｃｈｉｍ］、［２２４Ｇ１１］［ＭＵＰ９Ｈ ｃｈｉｍ］、［２２４Ｇ１１］［ＭＭＣＨ ｃｈｉｍ］、［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ ｃｈｉｍ］として識別されるそのヒトＩｇＧ１キメラ形態、ｉｉｉ）それぞれ［２２４Ｇ１１］［Ｈｚ１］、［２２４Ｇ１１］［Ｈｚ２］、［２２４Ｇ１１］［Ｈｚ３］として記載されるそのヒト化ＩｇＧ１形態。細胞単独−／＋ＨＧＦをプレーティングしたウェルも含めた。ＡＴＣＣでハイブリドーマ細胞株として商業的に入手可能なGenentechからの５Ｄ５完全抗体を完全アゴニスト陽性対照として含め、以降、ｍ５Ｄ５と呼んだ。次に、細胞を０．２５μＣｉの［３Ｈ］チミジン(Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden)で７時間３０分刺激した。トリクロロ酢酸に不溶なＤＮＡに組み込まれた［３Ｈ］チミジンの規模を液体シンチレーション計数により定量した。結果は、腫瘍細胞に単独で加えた場合の抗ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂで見られ得る潜在的な固有アゴニスト活性をより良く評価するために未変換のｃｐｍデータとして表す。
図９Ａに記載した結果は、予測されたように、アイソタイプ対照もｍ２２４Ｇ１１もＮＣＩ−Ｈ４４１の増殖に対してアゴニスト活性を示さなかったことを示した。アイソタイプ対照はＨＧＦにより誘導される細胞増殖に対して作用を持たなかったが、ｍ２２４Ｇ１１は終濃度１０μｇ／ｍｌで加えた場合に６６％の阻害を示した。アゴニスト対照として用いたｍ５Ｄ５は、予測されたように、完全な用量依存的アゴニスト作用を示した。すでに見られたように、［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍ Ｍａｂは有意な用量依存的アゴニスト作用を示し、このキメラ形態の低い阻害活性が見られた：ネズミ形態の６６％に対して１９％。単独で加えた場合、これらの３種類のＩｇＧ１ヒト化Ｍａｂはｍ２２４Ｇ１１形態に比べて用量依存的なアゴニスト作用を示した。［２２４Ｇ１１］［Ｈｚ１］、［２２４Ｇ１１］［Ｈｚ２］および［２２４Ｇ１１］［Ｈｚ３］は約４６、３０、および３５％といった匹敵するアンタゴニスト活性を持っていた。これらの活性はｍ２２４Ｇ１１の場合に見られたものよりも有意に低い。図９Ｂでは、種々のＩｇＧ１キメラ形態を試験した。ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞に単独で加えた場合に用量依存的なアゴニスト作用を示した［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍ形態と比較すると、［２２４Ｇ１１］［ＭＨ ｃｈｉｍ］、［２２４Ｇ１１］［ＭＵＰ９Ｈ ｃｈｉｍ］、［２２４Ｇ１１］［ＭＭＣＨ ｃｈｉｍ］、［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ ｃｈｉｍ］形態は有意な固有のアゴニスト作用を持たなかった。それらのアンタゴニスト活性はｍ２２４Ｇ１１ Ｍａｂ（５７％）で見られたものよりも高く、その阻害は［２２４Ｇ１１］［ＭＨ ｃｈｉｍ］、［２２４Ｇ１１］［ＭＵＰ９Ｈ ｃｈｉｍ］、［２２４Ｇ１１］［ＭＭＣＨ ｃｈｉｍ］および［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ ｃｈｉｍ］でそれぞれ７９、７８、８４、および９３％に達するものであった。
実施例９：２２４Ｇ１１ Ｍａｂの種々のＩｇＧ１キメラおよびヒト化形態のin vitro作用
ＡＴＣＣからのＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を通常、ＲＰＭＩ１６４０培地(Invitrogen Corporation, Scotland, UK)、１０％ＦＣＳ(Invitrogen Corporation)、１％Ｌ−グルタミン(Invitrogen Corporation)で培養した。増殖アッセイのため、プレーティング前にコンフルエント増殖期となるように使用の３日前に細胞を分割した。ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を９６ウェル組織培養プレートの２００μｌの血清不含培地（ＲＰＭＩ１６４０培地および１％Ｌ−グルタミン）中に３．７５×１０４細胞／ウェルの密度でプレーティングした。プレーティング２４時間後に、供試抗体をＮＣＩ−Ｈ４４１に加え、３７℃で３０分間インキュベートし、その後、ＨＧＦを終濃度４００ｎｇ／ｍｌ（５ｎＭ）でさらに１４２時間加えた。各抗体の試験用量範囲は１０〜０．００９７μｇ／ｍｌ（各ウェル中の終濃度）である。この実験では、ネズミＩｇＧ１ Ｍａｂをアゴニスト活性のバックグランド陰性対照として加え、供試抗体は次のものであった：ｉ）ｍ２２４Ｇ１１、ｉｉ）それぞれ［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍ、［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ ｃｈｉｍ］として識別されるそのヒトＩｇＧ１キメラ形態、ｉｉｉ）それぞれ［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ Ｈｚ１］、［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ Ｈｚ３］として記載されるそのヒト化ＩｇＧ１形態。細胞単独−／＋ＨＧＦをプレーティングしたウェルも含めた。ＡＴＣＣでハイブリドーマ細胞株として商業的に入手可能なGenentechからの５Ｄ５完全抗体を完全アゴニスト陽性対照として含め、以降、ｍ５Ｄ５と呼んだ。次に、細胞を０．２５μＣｉの［３Ｈ］チミジン(Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden)で７時間３０分刺激した。トリクロロ酢酸に不溶なＤＮＡに組み込まれた［３Ｈ］チミジンの規模を液体シンチレーション計数により定量した。結果は、腫瘍細胞に単独で加えた場合の抗ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂで見られ得る潜在的な固有アゴニスト活性をより良く評価するために未変換のｃｐｍデータとして表す。
ＡＴＣＣからのＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を通常、ＲＰＭＩ１６４０培地(Invitrogen Corporation, Scotland, UK)、１０％ＦＣＳ(Invitrogen Corporation)、１％Ｌ−グルタミン(Invitrogen Corporation)で培養した。増殖アッセイのため、プレーティング前にコンフルエント増殖期となるように使用の３日前に細胞を分割した。ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を９６ウェル組織培養プレートの２００μｌの血清不含培地（ＲＰＭＩ１６４０培地および１％Ｌ−グルタミン）中に３．７５×１０４細胞／ウェルの密度でプレーティングした。プレーティング２４時間後に、供試抗体をＮＣＩ−Ｈ４４１に加え、３７℃で３０分間インキュベートし、その後、ＨＧＦを終濃度４００ｎｇ／ｍｌ（５ｎＭ）でさらに１４２時間加えた。各抗体の試験用量範囲は１０〜０．００９７μｇ／ｍｌ（各ウェル中の終濃度）である。この実験では、ネズミＩｇＧ１ Ｍａｂをアゴニスト活性のバックグランド陰性対照として加え、供試抗体は次のものであった：ｉ）ｍ２２４Ｇ１１、ｉｉ）それぞれ［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍ、［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ ｃｈｉｍ］として識別されるそのヒトＩｇＧ１キメラ形態、ｉｉｉ）それぞれ［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ Ｈｚ１］、［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ Ｈｚ３］として記載されるそのヒト化ＩｇＧ１形態。細胞単独−／＋ＨＧＦをプレーティングしたウェルも含めた。ＡＴＣＣでハイブリドーマ細胞株として商業的に入手可能なGenentechからの５Ｄ５完全抗体を完全アゴニスト陽性対照として含め、以降、ｍ５Ｄ５と呼んだ。次に、細胞を０．２５μＣｉの［３Ｈ］チミジン(Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden)で７時間３０分刺激した。トリクロロ酢酸に不溶なＤＮＡに組み込まれた［３Ｈ］チミジンの規模を液体シンチレーション計数により定量した。結果は、腫瘍細胞に単独で加えた場合の抗ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂで見られ得る潜在的な固有アゴニスト活性をより良く評価するために未変換のｃｐｍデータとして表す。
図１０は、ｍ２２４Ｇ１１ Ｍａｂが通常の阻害作用を示すことを示した（７４％阻害）。キメラＩｇＧ１形態［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍは、予測されたように、用量依存的な固有のアゴニスト作用とネズミ形態に比べて低いアンタゴニスト作用（７４％阻害に対して３３％）を示した。［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ ｃｈｉｍ］はこの実験で、極めて弱いアゴニスト活性を有していた。さらに、それはネズミＭａｂに関して見られたものに近い、高い阻害作用（８１％）を示した。この２種類のヒト化形態は固有のアゴニスト作用を持たず、ネズミＭａｂまたは［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ ｃｈｉｍ］に関して見られたものに近いアンタゴニスト活性（［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ Ｈｚ１］、および［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ Ｈｚ３］でそれぞれ６７％および７６％の阻害）を持っていた。
実施例１０：操作型［ＴＨ７］ヒンジ領域に関して切り換えるアイソタイプ
ＰＫＳＣＤＣＨＣＰＰＣＰに相当する［ＴＨ７］ヒンジ配列によりヒトＩｇＧ１以外の免疫グロブリンアイソタイプ骨格に誘導される薬理学的特性の調節を評価するために、本発明者らは上記の［ＴＨ７］配列をヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４骨格へ遺伝的に移入した。ヒンジ領域の改変は、｛Ｎｈｅ１Ｉ−Ｂｃｌ１｝制限断片を［ＴＨ７］改変を有する均等部分と交換することにより行った。なお、この｛ＮｈｅＩ−Ｂｃｌ１｝断片はグローバルな遺伝子合成(Genecust, LU)により合成される。クローニング工程は、Laboratory manual (Sambrook and Russel, 2001)に記載されているような慣例の分子生物学的技術に従って、または供給者の説明書に従って行った。各遺伝子構築物をＢｉｇ Ｄｙｅターミネーターサイクルシーケンシングキット(Applied Biosystems, US)を用いたヌクレオチド配列決定により完全にバリデートし、３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ(Applied Biosystems, US)を用いて分析した。得られた結果をＴＨ７操作ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４アイソタイプ（重鎖のみ、軽鎖は他の総てのＩｇＧ１系構築物に用いられているｃ２２４Ｇ１１／ヒトＣκと同じ）のそれぞれアミノ酸配列とヌクレオチド配列に関して配列番号７８、７９、８０、および８１として記載する。これらの新規な構築物を上記実施例２のようにキメラ２２４Ｇ１１抗ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂに適用した。
ＰＫＳＣＤＣＨＣＰＰＣＰに相当する［ＴＨ７］ヒンジ配列によりヒトＩｇＧ１以外の免疫グロブリンアイソタイプ骨格に誘導される薬理学的特性の調節を評価するために、本発明者らは上記の［ＴＨ７］配列をヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４骨格へ遺伝的に移入した。ヒンジ領域の改変は、｛Ｎｈｅ１Ｉ−Ｂｃｌ１｝制限断片を［ＴＨ７］改変を有する均等部分と交換することにより行った。なお、この｛ＮｈｅＩ−Ｂｃｌ１｝断片はグローバルな遺伝子合成(Genecust, LU)により合成される。クローニング工程は、Laboratory manual (Sambrook and Russel, 2001)に記載されているような慣例の分子生物学的技術に従って、または供給者の説明書に従って行った。各遺伝子構築物をＢｉｇ Ｄｙｅターミネーターサイクルシーケンシングキット(Applied Biosystems, US)を用いたヌクレオチド配列決定により完全にバリデートし、３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ(Applied Biosystems, US)を用いて分析した。得られた結果をＴＨ７操作ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４アイソタイプ（重鎖のみ、軽鎖は他の総てのＩｇＧ１系構築物に用いられているｃ２２４Ｇ１１／ヒトＣκと同じ）のそれぞれアミノ酸配列とヌクレオチド配列に関して配列番号７８、７９、８０、および８１として記載する。これらの新規な構築物を上記実施例２のようにキメラ２２４Ｇ１１抗ｃ−Ｍｅｔ Ｍａｂに適用した。
上記のように懸濁に適応したＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞における一時的発現により、対応する操作型抗体ｃ２２４Ｇ１１［ＩｇＧ２ＴＨ７］およびｃ２２４Ｇ１１［ＩｇＧ４ＴＨ７］を作出した。
実施例１１：ホスホ−ｃ−Ｍｅｔ特異的ＥＬＩＳＡアッセイおよびＢＲＥＴアッセイにおける操作型Ｍａｂｓ ｃ２２４Ｇ１１［ＩｇＧ２ＴＨ７］およびｃ２２４Ｇ１１［ＩｇＧ４ＴＨ７］の評価
ＴＨ７ヒンジをＩｇＧ２およびＩｇＧ４キメラ２２４Ｇ１１ Ｍａｂにも導入し、ｃ−Ｍｅｔ受容体リン酸化アッセイで試験した。１４Ａおよび１４Ｂに示されるように、ｃ２２４Ｇ１１［ＩｇＧ２ＴＨ７］およびｃ２２４Ｇ１１［ＩｇＧ４ＴＨ７］は微弱ながらｃ２２４Ｇ１１ Ｍａｂよりも有意に弱いアゴニスト作用のみを誘導し、２２４Ｇ１１ Ｍａｂのネズミ形態（ｍ２２４Ｇ１１）に匹敵するアンタゴニスト作用を示した。この結果をｃ−Ｍｅｔ活性化ＢＲＥＴモデルで確認したところ（図１５）、ｃ２２４Ｇ１１［ＩｇＧ２ＴＨ７］およびｃ２２４Ｇ１１［ＩｇＧ４ＴＨ７］もｃ２２４Ｇ１１ Ｍａｂより弱いアゴニストを示した。
ＴＨ７ヒンジをＩｇＧ２およびＩｇＧ４キメラ２２４Ｇ１１ Ｍａｂにも導入し、ｃ−Ｍｅｔ受容体リン酸化アッセイで試験した。１４Ａおよび１４Ｂに示されるように、ｃ２２４Ｇ１１［ＩｇＧ２ＴＨ７］およびｃ２２４Ｇ１１［ＩｇＧ４ＴＨ７］は微弱ながらｃ２２４Ｇ１１ Ｍａｂよりも有意に弱いアゴニスト作用のみを誘導し、２２４Ｇ１１ Ｍａｂのネズミ形態（ｍ２２４Ｇ１１）に匹敵するアンタゴニスト作用を示した。この結果をｃ−Ｍｅｔ活性化ＢＲＥＴモデルで確認したところ（図１５）、ｃ２２４Ｇ１１［ＩｇＧ２ＴＨ７］およびｃ２２４Ｇ１１［ＩｇＧ４ＴＨ７］もｃ２２４Ｇ１１ Ｍａｂより弱いアゴニストを示した。
よって、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ Ｍａｂ形式に導入されたＴＨ７ヒンジ突然変異は、ｃ２２４Ｇ１１［ＴＨ７］よりも類似の特性を有する機能的抗体をもたらした。
実施例１２細胞接着アッセイ
ＰＣ３前立腺癌細胞を、トリプシンを用いてディッシュから剥がし、血清不含Ｆ１２ｋ培地で３回洗浄し、同じ培地に再懸濁させた。細胞（１００，０００細胞／ウェル）を、１μｇ／ｍｌのラミニン１をコーティングした９６ウェルプレートにプレーティングした。以下の形態の供試抗ＣＤ１５１ Ｍａｂを同時に終濃度１０μｇ／ｍｌで加えた：ネズミＩｇＧ１ Ｍａｂ ｍ２１４Ｂ２、ｃ２１４Ｂ２と呼ばれる非改変キメラＩｇＧ１抗体形態およびｃＴＨ７−２１４Ｂ２と呼ばれるＴＨ７改変を伴うキメラＩｇＧ１抗体形態。
ＰＣ３前立腺癌細胞を、トリプシンを用いてディッシュから剥がし、血清不含Ｆ１２ｋ培地で３回洗浄し、同じ培地に再懸濁させた。細胞（１００，０００細胞／ウェル）を、１μｇ／ｍｌのラミニン１をコーティングした９６ウェルプレートにプレーティングした。以下の形態の供試抗ＣＤ１５１ Ｍａｂを同時に終濃度１０μｇ／ｍｌで加えた：ネズミＩｇＧ１ Ｍａｂ ｍ２１４Ｂ２、ｃ２１４Ｂ２と呼ばれる非改変キメラＩｇＧ１抗体形態およびｃＴＨ７−２１４Ｂ２と呼ばれるＴＨ７改変を伴うキメラＩｇＧ１抗体形態。
ＣＤ１５１はテトラスパニンファミリーに属す膜タンパク質であり、２００８年２月２１日にＣＮＣＭに提出されたハイブリドーマＩ−３９１９により生産される抗ＣＤ１５１ Ｍａｂ ２１４Ｂ２は公開特許出願ＷＯ２００９／１３６０７０ 号公報に記載されている。
ネズミおよびヒトＩｇＧ１抗体をアイソタイプ対照抗体として用いた。最終条件は次の通りである：１０００００細胞／ウェルおよび抗体１０μｇ／ｍｌ。３７℃で１時間インキュベートした後、これらのプレートを軽くたたき落とし、血清不含Ｆ１２ｋ培地で２回洗浄した。分析前に１００μｌの血清不含Ｆ１２ｋ培地を各ウェルに分注した。細胞接着ウェルに対する抗体の影響を評価するため、位相差顕微鏡下で写真撮影を行った（図１６）。その後、ＡＴＰアッセイを用いて接着した細胞の数を求めた（図１７）。
ネズミ２１４Ｂ２抗体およびキメラＴＨ７−２１４Ｂ２抗体は、細胞と細胞との相互作用を改質することができ（図１６）、ＰＣ３細胞接着を均等に増強することができたが（図１７）、２１４Ｂ２の非改変キメラ形態（ｃ２１４Ｂ２）を用いた場合の効果は無かった（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体に匹敵）。
Claims (14)
- 特定の標的分子に対するモノクローナル抗体、またはその二価の機能的断片もしくは誘導体の拮抗活性を改良する方法であって、該抗体は該標的分子の１以上の生物活性を阻害することができ、少なくとも一つのアミノ酸の欠失、付加、または置換によるヒンジ領域のアミノ酸配列の改変からなるヒンジ領域の再構成工程を含んでなり、アミノ酸配列の改変によって得られた再構成されたヒンジ領域が、配列番号１、２、４、６、７、２２〜２９、３３〜３９、および４２〜４９からなる群から選択される配列を有するヒンジ領域である、方法。
- モノクローナル抗体が二価抗体である、請求項１に記載の方法。
- モノクローナル抗体がキメラ抗体である、請求項１または２に記載の方法。
- モノクローナル抗体がヒト化抗体である、請求項１または２に記載の方法。
- モノクローナル抗体がヒト抗体である、請求項１または２に記載の方法。
- モノクローナル抗体がＩｇＧ１である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
- 標的分子が膜貫通受容体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
- 膜貫通受容体がチロシンキナーゼ受容体、テトラスパニン、およびＧＰＣＲからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
- 特定の標的分子に対するモノクローナル抗体、またはその二価機能的断片または誘導体をアンタゴニストに関してスクリーニングする方法であって、該抗体は該標的分子の１以上の生物活性を阻害することができ、
（ａ）該標的分子の該一以上の生物活性の、初期レベルの阻害を有する初期抗体を選択する工程、
（ｂ）該初期抗体のヒンジ領域のアミノ酸配列を、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法により改変する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の改変抗体を、その該標的分子の該一以上の生物活性を阻害する能力に関して評価する工程、および
（ｄ）該標的分子の該一以上の生物活性の阻害レベルが、該阻害の初期レベルよりも高い工程（ｃ）の抗体を陽性結果として選択する工程
を含んでなる、方法。 - 配列番号２、４、６、２２〜２６、２８、２９、３３〜３９、および４２〜４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、モノクローナル抗体。
- ヒト抗体である、請求項１０に記載のモノクローナル抗体。
- ＩｇＧｌ抗体である、請求項１０または１１に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体をコードする単離核酸。
- 配列番号１６〜２０、５０〜５４、５６、５７、６１〜６７、および６９〜７７からなる群から選択される核酸配列を含んでなる、請求項１３に記載の単離核酸。
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