MX2011005569A - Proceso para la modulacion de la actividad antagonista de un anticuerpo monoclonal. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al campo del diseño de anticuerpos, y más en particular, a un proceso para la identificación sistemática de anticuerpos y/o la modulación de la actividad agonista/antagonista de anticuerpos. Más en particular, la invención se refiere a un método para mejorar la actividad antagonista de un anticuerpo monoclonal dirigido contra una molécula blanco específica, o de un fragmento funcional divalente o un derivado de dicho anticuerpo, donde dicho anticuerpo es capaz de inhibir una o más de las actividades biológicas de dicha molécula blanco; donde dicho proceso comprende una etapa de reconfiguración de la región de bisagra que consiste en una modificación de la secuencia de aminoácidos de dicha región de bisagra mediante la eliminación, la adición o la sustitución de por lo menos un aminoácido. La invención además se refiere a polipéptidos útiles para dicho método de modulación, y a los anticuerpos obtenidos.

Description

PROCESO PARA LA MODULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTAGONISTA DE UN ANTICUERPO MONOCLONAL DESCRIPCIÓN Antecedentes y campo de la invención La presente invención se refiere al campo del diseño de anticuerpos, y más en particular, a un proceso para la identificación sistemática de anticuerpos y/o la modulación de la actividad agonista/antagonista de anticuerpos. Más en particular, la invención se refiere a un método para la modulación de la actividad antagonista de un anticuerpo monoclonal, o de un fragmento funcional divalente o un derivado de dicho anticuerpo, por medio de la ingeniería genética. La invención además se refiere a polipéptidos útiles para dicho método de modulación, y a los anticuerpos obtenidos.

Los términos "anticuerpo", "anticuerpos" o "inmunoglobulina" se usan de modo indistinto en el sentido más amplio, e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes o anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada).

Más en particular, dicha molécula consiste en una glicoproteína que comprende por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas livianas (L) interconectadas por enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región (o dominio) variable de cadena pesada (que, en esta solicitud, se abrevia como HCVR o VH (por sus siglas en inglés)) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta por tres dominios: CH1 , CH2 y CH3. Cada cadena liviana está compuesta por una región variable de cadena liviana (abreviada, en esta solicitud, como LCVR o VL (por sus siglas en inglés)) y una región constante de cadena liviana. La región constante de cadena liviana está compuesta por un dominio CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones de determinación de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés), intercaladas con regiones que son más conservadas, denominadas regiones de marco (FR, por sus siglas en inglés). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el término amino hasta el término carboxi en el siguiente orden: FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y livianas contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina para factores o tejidos huéspedes, que incluyen diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico.

Las cadenas pesadas de inmunoglobulinas pueden dividirse en tres regiones funcionales: la región Fd, la región de bisagra, la región Fe (cristalizable de fragmento), que están conectadas por una región de bisagra flexible. La región Fd comprende los dominios VH y CHI, y en combinación con las cadenas livianas, forma Fab - el fragmento de unión de antígeno. El fragmento Fe es responsable de las funciones efectoras de inmunoglobulina, que incluyen, por ejemplo, la fijación de complemento y la unión a receptores Fe cognados de células efectoras. La región de bisagra, hallada en las clases de inmunoglobulinas IgG, IgA e IgD, actúa como un espaciador flexible que permite que la porción Fab se mueva libremente en el espacio en relación con la región Fe. En contraste a las regiones constantes, el dominio de bisagra es estructuralmente diverso, y varía tanto en términos de secuencia como de longitud entre las clases y subclases de inmunoglobulinas.

De acuerdo con los estudios cristalográficos, la región de bisagra de inmunoglobulina puede .además subdividirse estructural y funcionalmente en tres regiones: la bisagra superior, el centro, y la bisagra inferior (Shin et al., Immunological Reviews, 130: 87, 1992). La bisagra superior incluye aminoácidos del extremo carboxilo de CHI al primer residuo en la bisagra que restringe el movimiento, en general, el primer residuo cisteína que forma un enlace de disulfuro de intercadena entre las dos cadenas pesadas. La longitud de la región de bisagra superior se correlaciona con la flexibilidad segmental del anticuerpo. La región de bisagra de centro contiene los puentes de disulfuro de intercadena pesada. La región de bisagra inferior se une al terminal amino del dominio CH2, e incluye residuos en el dominio CH2. La región de bisagra de centro de lgG1 humana contiene la secuencia Cys-Pro-Pro-Cys, que, cuando es dimerizada por la formación de enlace de disulfuro, logra un octapéptido cíclico que se cree actúa como un centro de giro, para, de ese modo, conferir flexibilidad. Los cambios de conformación permitidos por la estructura y flexibilidad de la secuencia de polipéptido de la región de bisagra de inmunoglobulina pueden afectar las funciones efectoras de la porción Fe del anticuerpo.

En general, para la preparación de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos funcionales, de origen murino, es posible hacer referencia a técnicas descriptas, en particular, en el manual "Antibodies" (Harlow and Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988), o a la técnica de preparación a partir de hibridomas descripta por Kohler y Milstein (Nature, 256: 495-497, 1975). En consecuencia, los anticuerpos monoclonales pueden, por ejemplo, ser purificados en una columna de afinidad sobre la cual el receptor de interés o uno de sus fragmentos que contiene el epítopo específicamente reconocido por dichos anticuerpos monoclonales ha sido previamente inmovilizado. Más en particular, dichos anticuerpos monoclonales pueden purificarse por medio de la cromatografía en proteína A y/o G, seguida o no seguida de la cromatografía de intercambio iónico, destinada a la eliminación de los contaminantes de proteína residuales, al igual que el ADN y los LPS (sigla de "lipopolisacárido"), y esta, a su vez, seguida o no seguida de la cromatografía de exclusión en gel Sepharose, a fin de eliminar los potenciales productos de agregación debido a la presencia de dímeros o de otros multímeros. De un modo aun más preferido, la totalidad de estas técnicas pueden usarse en forma simultánea o sucesiva.

Un fragmento funcional de un anticuerpo de acuerdo con la invención tiene la intención de indicar, en particular, un fragmento de anticuerpo, tal como fragmentos Fv, scFv (se para cadena simple), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc, o diacuerpos, o cualquier fragmento en el cual se ha incrementado la semivida mediante la modificación química, tal como la adición de poli(alquileno) glicol, tal como poli(etileno) glicol ("PEGilación") (fragmentos pegilados denominados Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG o Fab'-PEG) ("PEG" para Poli(Etileno) Glicol), o mediante la incorporación en un liposoma, donde dichos fragmentos tienen por lo menos una de las CDR características del anticuerpo original.

Preferentemente, estos fragmentos funcionales serán fragmentos del tipo Fv, scFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fc o diacuerpos, que tienen generalmente la misma especificidad de unión que el anticuerpo del cual descienden. De acuerdo con la presente invención, los fragmentos de anticuerpos de la invención pueden obtenerse iniciando a partir de anticuerpos tales como se describen con anterioridad, por medio de métodos tales como la digestión por enzimas, como pepsina o papaína, o mediante la disociación de los puentes de disulfuro por medio de la reducción química. De otro modo, los fragmentos de anticuerpos comprendidos en la presente invención pueden obtenerse mediante técnicas de recombinación genética bien conocidas por el experto en el arte, o, de lo contrario, mediante la síntesis de péptidos por medio de, por ejemplo, sintetizadores de péptidos automáticos tales como aquellos suministrados por la compañía Applera, etc.

El término "antagonista", de acuerdo con esta solicitud, se refiere a una molécula que es capaz de inhibir una o más de las actividades biológicas de una molécula blanco, tal como un receptor extracelular o de transmembrana. Los antagonistas pueden actuar interfiriendo con la unión de un receptor a un ligando y viceversa, disminuyendo la fosforilación de receptor, y/o incapacitando o matando células que han sido activadas por un ligando. El antagonista puede bloquear por completo las interacciones de receptor-ligando, o puede reducir de modo sustancial dichas interacciones mediante la competición, ei cambio de conformación, la muda o la regulación descendente. Todos dichos puntos de intervención por un antagonista serán considerados equivalentes para los propósitos de esta invención.

El término "agonista", de acuerdo con la presente solicitud, se refiere a cualquier compuesto, incluso una proteína, un polipéptido, un péptido, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un conjugado, una molécula grande, una molécula pequeña, capaz de activar una o más de las actividades biológicas de una molécula blanco.

En la investigación de anticuerpos terapéuticos, a menudo se espera contar con tantos anticuerpos como antagonistas, como sean posibles.

Ejemplos clásicos de anticuerpos antagonistas son anticuerpos herceptina, pertuzumab, cetuximab, anti-VEGFR o anti-IGF-1 R.

Como un ejemplo particular, puede mencionarse el anticuerpo anti-c- Met 5D5 generado por Genentech [WO 96/38557], que se comporta como un potente agonista cuando se agrega solo en diversos modelos. A fin de resolver este problema técnico, este anticuerpo tuvo que se diseñado como un fragmento Fab o como un anticuerpo monovalente (5D5 de un solo brazo), de modo de poseer una actividad antagonista. En consecuencia, dicho anticuerpo no puede considerarse un anticuerpo, sino un fragmento, y no presenta todas las ventajas del formato de "anticuerpo completo" (sin funciones efectoras, menor aclaramiento y semivida [el doble de velocidad que los anticuerpos bivalentes tradicionales, como se describe en el Póster 411 del 20 simposio de EORTC-NCI-AACR, Geneva, octubre 21-24, 2008]).

El experto en el arte reconocerá que las funciones efectoras incluyen, por ejemplo, la unión C1q; la citotoxicidad dependiente de complemento; la unión de receptor Fe; la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés); fagocitosis; y la regulación descendente de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de célula B; BCR (por sus siglas en inglés) y la prolongación de la semivida a través de la incorporación del ligando de unión del receptor de salvamento (FcRn, por sus siglas en inglés), como se describe, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos Nro. 5.739.277, concedida el 14 de abril de 1998.

Uno de los aspectos de invención de la presente invención consiste en la resolución de dichos problemas técnicos, es decir, el mejoramiento de la actividad antagonista de un anticuerpo, y a la vez, la conservación de un formato "completamente divalente".

Deben mencionarse en esta solicitud, que la invención puede aplicarse a fin de modular la actividad agonista/antagonista de anticuerpos humanos obtenidos mediante la inmunización de "ratones humanos" (ratones genéticamente modificados que producen inmunoglobulinas humanas), o usando técnicas de exhibición de fagos para construir anticuerpos enteros a partir de fragmentos seleccionados scFv, Fab, o cualquier otro fragmento equivalente.

Puede encontrarse otro problema técnico clásico en el curso de la quimerización o humanización de un anticuerpo murino. Es bien sabido por el experto en el arte que, si el proceso de quimerización o humanización de un anticuerpo murino es muy fácil en teoría, no es tan sencillo manipular la quimerización y la humanización de dicho anticuerpo murino sin perder la totalidad o parte de las propiedades iniciales. El anticuerpo quimérico o humanizado puede perder parte de sus actividades ADCC, CDC, antagonista/agonista, de unión (TBC). La presente invención se refiere, más en particular, a la modificación de la actividad agonista/antagonista de un anticuerpo murino, luego de un proceso de quimerización o humanización, o ambos.

A modo de ejemplo particular, un grupo de anticuerpos anti-cMet, descriptos en adelante como 224G1 1 , 2274H1 y 1 1 E1 , que se comportan como potentes anticuerpos murinos antagonistas, se tornaron agonistas parciales cuando se quimerizaron: en un formato lgG1 humano. Este cambio de potentes antagonistas a agonistas parciales logró una pérdida completa de actividad in vivo, en modelos de xenoinjertos.

La presente invención tiene la intención de resolver estos problemas, y se relaciona, más en particular, con un proceso para mejorar la actividad antagonista de un anticuerpo monoclonal dirigido contra una molécula blanco específica, o un fragmento funcional divalente o derivado de dicho anticuerpo, donde dicho anticuerpo es capaz de inhibir una o más de las actividades biológicas de dicha molécula blanco, donde dicho proceso comprende una etapa de reconfiguración de la región de bisagra, que consiste en una modificación de la secuencia de aminoácidos de dicha región de bisagra mediante la eliminación, la adición o la sustitución de por lo menos un aminoácido.

Es claro que la expresión "mejorar la actividad antagonista" debe interpretarse en su más amplio sentido, es decir, como el resultado deseado. En términos técnicos, dicho resultado puede obtenerse por medio de una mejoría de la actividad antagonista intrínseca, y/o una disminución de la actividad agonista intrínseca de un anticuerpo.

Más en particular, las definiciones básicas de términos en farmacología cuantitativa se sustentan en las recomendaciones actualizadas proporcionadas por el Comité de la Unión Internacional de Farmacología (International Union of Pharmacology (IUPHAR)) sobre nomenclatura de receptores (ver la referencia de Neubig et al., 2003). : El término 'agonista' representa un ligando (cualquier tipo de molécula) que se une a un receptor y altera el estado del receptor, para lograr una respuesta biológica estimulante o mayor. Los agonistas pueden actuar como agonistas totales o agonistas parciales: - Agonista total: cuando el estímulo del receptor inducido por un agonista alcanza la capacidad de respuesta máxima del sistema, entonces producirá la respuesta máxima del sistema y será un agonista total en dicho sistema. Varios agonistas pueden producir la misma respuesta máxima, y todos ellos son agonistas totales en dicho sistema experimental.

- Agonista parcial: una molécula que, en un tejido determinado, en condiciones específicas,: no puede producir un efecto tan grande (aun aplicado en alta concentración, de modo que todos los receptores sean ocupados) como un agonista total que actúa a través de los mismos receptores en el mismo sistema. Los agonistas parciales, en general, son también antagonistas parciales, ya que, en presencia conjunta de un agonista total, reducen la respuesta máxima de dicho agonista total a su propia respuesta máxima. Esta designación de agonista total en comparación con agonista parcial depende del sistema, y un agonista total para un sistema o una medición puede ser un agonista parcial en otro.

El término "antagonista" representa una molécula que reduce la acción de otro fármaco, en general, un agonista. Muchos antagonistas actúan en la misma macromolécula de receptor que el agonista.

- La eficacia del: antagonismo puede consistir en el antagonismo total, donde la respuesta del sistema en presencia conjunta del antagonista y agonista corresponde a la actividad basal (sin ningún ligando) del sistema.

- Un antagonista puede actuar como antagonista parcial cuando la inhibición máxima (aun aplicado en alta concentración, de modo que todos los receptores sean ocupados por el antagonista) producida por la presencia conjunta del antagonista y el agonista es superior a la actividad basal del sistema.

- El antagonismo puede ser competitivo cuando la unión de agonista y antagonista es mutuamente excluyente. Esto puede deberse a que el agonista y el antagonista compiten por el mismo sitio de unión, o se combinan con sitios adyacentes que se superponen. Una tercera posibilidad es que haya diferentes sitios involucrados, si bien estos afectan la macromolécula de receptor de modo tal que las moléculas de agonista y antagonista no pueden unirse al mismo tiempo.

- El antagonismo no competitivo se observa cuando el agonista y el antagonista pueden unirse al receptor en forma simultánea; la unión de antagonista reduce o evita la acción del agonista, con o sin efecto sobre la unión del agonista.

La eliminación, adición o sustitución puede efectuarse de manera clásica por medio de cualquier método conocido por el experto en el arte.

El experto en el arte podrá aplicar varios métodos para generar adiciones, deleciones o inserciones en una secuencia de ADN determinada. Entre estos métodos pueden mencionarse, sin limitación, la digestión parcial de ADN con ADNasa I pancreática, la digestión parcial de ADN con enzimas de restricción, mutantes de inserciones a base de conectores, grupos anidados de mutantes de eliminación usando nucleasa BAL31 , ADNasa I o exonucleasa III. Estos métodos son descriptos extensamente en manuales de laboratorio, tales como Molecular Cloning, A laboratory manual (Sambrook, Fritsch and Maniatis). Además, pueden emplearse varios métodos sobre la base de la PCR (sigla en inglés de "reacción en cadena de la polimerasa"), a fin de generar deleciones o inserciones, o mutagénesis dirigida a sitio en una molécula de ADN tal como la PCR de extensión de superposición (Wurch et al., 1998), sin limitación a ella. A fin de efectuar la mutagénesis dirigida a sitio, pueden usarse varias otras técnicas, cuyos ejemplos son, sin limitación, la mutagénesis sobre la base de oligonucleótidos, sobre la base de métodos de cebador simple; o doble; y el método Kunkel, sobre la base de la incorporación de uracilo (Kunkel, 1985). Estos métodos son descriptos extensamente en manuales de laboratorio tales como Molecular Cloning, A laboratory manual (Sambrook, Fritsch and Maniatis).

A modo de ejemplo no limitativo de adición, puede mencionarse la adición de una prolina en la región de bisagra, o adyacente a ella.

En una realización preferida del proceso de la invención, dicha modificación se selecciona de: i) la eliminación de por lo menos un aminoácido de dicha secuencia de aminoácidos de región de bisagra; y/o ii) la adición de por lo menos un puente de disulfuro en dicha región de bisagra.

A los fines de aclarar la invención, se describirá primero el primer aspecto (i), y a continuación, se describirá el segundo aspecto (ii). Debe entenderse que este orden solo se debe a la presentación escrita de la presente solicitud, y que ambos aspectos, como será evidente en adelante, tienen importancia similar.

En una realización particular, una forma de modificar la secuencia de aminoácidos de la región de bisagra consistirá en la eliminación de, como máximo, 2, 3 ó 4 aminoácidos de dicha secuencia de aminoácidos de región de bisagra.

Un aspecto particular de la invención es que dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo divalente. En realidad, como se observa a continuación, es posible modular la actividad agonista/antagonista de un anticuerpo mediante la modificación de la estructura de dicho anticuerpo. Por primera vez, los inventores informan una manera original de modular dicha actividad agonista/antagonista, y a la vez, conservar una forma divalente del anticuerpo, destinada a la conservación de las buenas propiedades tales como la larga semivida o las funciones efectoras.

Asimismo, puede mencionarse en esta solicitud que, si bien la modificación de la región de bisagra de un anticuerpo monoclonal, a fin de aumentar las funciones efectoras, ya ha sido informada en el arte, nunca se ha informado, por el contrario, que dicha modificación en la región de bisagra podría ser de interés en la modulación de la actividad agonista/antagonista de un anticuerpo monoclonal. Este es claramente el tema de la presente invención, que es novedoso e inventivo en relación con el arte previo existente.

Como un aspecto de acuerdo con el proceso de la invención, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo quimérico.

El término anticuerpo "quimérico" tiene la intención de indicar un anticuerpo que contiene una región variable natural (cadena liviana y cadena pesada) derivada de un anticuerpo de una especie determinada, en combinación con las regiones constantes de cadena liviana y cadena pesada de un anticuerpo de una especie heteróloga en relación con dicha especie determinada (por ejemplo, ratón, caballo, conejo, perro, vaca, pollo, etc.).

Los anticuerpos o sus fragmentos de tipo quimérico de acuerdo con la invención pueden prepararse usando las técnicas de recombinación genética. Por ejemplo, el anticuerpo quimérico puede producirse mediante la clonación de un ADN recombinado que contiene un promotor y una secuencia que codifica para la región variable de un anticuerpo monoclonal no humano, en especial, murino, de acuerdo con la invención, y una secuencia que codifica para la región constante de anticuerpo humano. Un anticuerpo quimérico de la invención codificado por dicho gen recombinado será, por ejemplo, una quimera de ratón-hombre, donde la especificidad de este anticuerpo será determinada por la región variable derivada del ADN murino, y su isotipo será determinado por la región constante derivada del ADN humano. Para los métodos de preparación de anticuerpos quiméricos, puede hacerse referencia, por ejemplo, a los documentos de Verhoeyn et al. (BioEssays, 8: 74, 1988), Morrison et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82: 6851-6855, 1984), o la Patente de los Estados Unidos Nro. 4.816.567.

Como otro aspecto de acuerdo con el proceso de la invención, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humanizado.

Un "anticuerpo humanizado" tiene la intención de indicar un anticuerpo que contiene regiones CDR derivadas de un anticuerpo de origen no humano, donde las otras partes de la molécula de anticuerpo derivan de una secuencia de línea germinal o un anticuerpo humano (o varios anticuerpos humanos). Además, algunos de los residuos de los segmentos del esqueleto (denominados FR) pueden ser modificados a fin de conservar la afinidad de la unión (Jones et al., Nature, 321 : 522-525, 1986; Verhoeyen er a/., Science, 239: 1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332: 323-327, 1988), Los anticuerpos : humanizados de acuerdo con la invención, o sus fragmentos, pueden prepararse por medio de técnicas conocidas para el experto en el arte (por ejemplo, aquellas que se describen en los documentos de Singer et al., J. Immun., 150: 2844-2857, 1992; Mountain er al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142, 1992; o Bebbington et al., Bio/Technology, 10: 169-175, 1992).

Otros métodos de humanización son conocidos por el experto en el arte, por ejemplo, el método de "injerto de CDR" descripto por Protein Design Lab (PDL) en las solicitudes de patente EP 0 451 216, EP 0 682 040, EP 0 939 127, EP 0 566 647 o US 5.530.101 , US 6.180.370, US 5.585.089 y US 5.693.761. Pueden mencionarse además las siguientes solicitudes de patente: US 5.639.641 ; US 6.054.297; US 5.886.152 y US 5.877.293.

Como otro aspecto de acuerdo con el proceso de la invención, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humano.

El término "anticuerpo humano" incluye todos los anticuerpos que tienen una o más regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina humanas. En una realización preferida, todos los dominios (o regiones) variables y constantes derivan de secuencia de inmunoglobulina humana (anticuerpo completamente humano). En otras palabras, comprende cualquier anticuerpo que tenga regiones variables y constantes (si se presentan) derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana, es decir, que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a aquella de un anticuerpo producido por un humano, y/o que se ha preparado empleando cualquier técnica para la preparación de anticuerpos humanos conocida por el experto en el arte.

En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos son producidos por un hibridoma que comprende una célula B obtenida de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena liviana fusionado a una célula inmortalizada.

A modo de ejemplo de dicho ratón transgénico, puede mencionarse el XENOMOUSE™, que es una cepa de ratón diseñada que comprende fragmentos grandes de los loci de inmunoglobulina humana, y que carece de producción de anticuerpo de ratón (Green et al., 1994, Nature Genetics, 7: 13-21). El XENOMOUSE™ produce un repertorio humano de tipo adulto de anticuerpos completamente humanos, y genera anticuerpos monoclonales humanos específicos de antígeno. Un XENOMOUSE™ de segunda generación contiene aproximadamente 80% del repertorio de anticuerpos humanos (Green & Jakobovits, 1998, J. Exp. Med., 188: 483-495).

Puede usarse además cualquier otra técnica conocida por el experto en el arte, tal como la técnica de exhibición de fagos, para la generación de anticuerpo humano de acuerdo con la invención.

El proceso de acuerdo con la invención puede emplearse para cualquier tipo de inmunoglobulina que comprende una región de bisagra, ;es decir, IgA, IgD e IgG.

A modo de ejemplo, para el isotipo IgA, la región de bisagra de un lgA1 comprende la secuencia de aminoácidos PSTPPTPSPSTPPTPSPS (SEC. ID. Nro. 8), y la región de bisagra de un lgA2 comprende la secuencia de aminoácidos PPPPP (SEC. ID. Nro. 9).

De manera similar, la región de bisagra de un IgD comprende la secuencia de aminoácidos SPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTRGGEEKKKEKEKEEQEERE TKTP (SEC. ID. Nro. 10).

Como una realización particular de la invención, se prefiere el uso de un IgG que incluye, por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3 o lgG4.

Las respectivas secuencias de aminoácidos que corresponden a los diferentes isotipos de regiones de bisagra de IgG son: PKSCDKTHTCPPCP (SEC. ID. Nro. 1 ) para un lgG1 , RKCCVECPPCP (SEC. ID. Nro. 7) para un lgG2, LKTPLFTGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP EPKSCDTPPPCPRCP (SEC. ID. Nro. 12) para un lgG3, y SKYGPPCPSCP (SEC. ID. Nro. 13) para un lgG4.

Aun más en particular, se prefiere el uso de un lgG1. En realidad, en el campo de los anticuerpos terapéuticos, y más en particular, en el tratamiento del cáncer, se prefiere la generación de lgG1 a fin de lograr funciones efectoras tales como ADCC y CDC, además de funciones ligadas a la unión específica al antígeno blanco.

El proceso de la invención se caracteriza porque dicho anticuerpo monoclonal es un lgG .

Una "molécula blanco", dentro del contexto de la invención, se refiere a cualquier molécula a la cual el anticuerpo monoclonal es capaz de unirse específicamente, o de modular su actividad. En general, dicha molécula blanco puede denominarse "antígeno".

Como ejemplos no limitativos de molécula blanco que puede ser apuntada por un anticuerpo monoclonal pueden mencionarse ligandos solubles, receptores tales como receptores de transmembrana, marcadores tumorales de membrana, etc.

En una realización preferida, dicha molécula blanco es un receptor de transmembrana.

El término "receptor de transmembrana" se refiere a una proteína que abarca la membrana plasmática de una célula, donde el dominio extracelular de la proteína tiene la capacidad de unirse a un ligando, y el dominio intracelular tiene una actividad (tal: como una proteína quinasa) que puede ser alterada (aumentada o disminuida) con la unión de ligando. En otras palabras, los receptores de transmembrana son proteínas de membrana integrales que residen y funcionan típicamente dentro de la membrana plasmática de una célula, aunque también, en las membranas de algunos orgánulos y compartimientos subcelulares. Con la unión a una molécula de señalización, o a veces, a un par de dichas moléculas, en un lateral de la membrana, los receptores de transmembrana inician una respuesta en el otro lado. De este modo, cumplen una función única importante en las comunicaciones celulares y en la transducción de señal.

Muchos receptores de transmembrana están compuestos por dos o más subunidades de proteína que funcionan en forma colectiva y pueden disociarse cuando los ligandos se ligan, se caen, o en otra etapa de sus ciclos de "activación". A menudo se clasifican sobre la base de su estructura molecular, o si la estructura es désconocida en detalle para casi la totalidad de los receptores, excepto algunos, sobre la base de su hipotética (y a veces, experimentalmente verificada) topología de membrana. Se predice que las cadenas de polipéptido de los más simples cruzan la bicapa lípida. solo una vez, mientras que otros la cruzan tanto como siete veces (los así denominados receptores acoplados a proteína G, o GPCR, por sus siglas en inglés) o más.

Como cualquier proteína de membrana integral, un receptor de transmembrana puede subdividirse en tres partes o dominios, un dominio extracelular, un dominio de transmembrana y un dominio intracelular.

El dominio extracelular es la parte del receptor que sobresale de la membrana al exterior de la célula o del orgánulo. Si la cadena de polipéptido del receptor cruza la bicapa varias veces, el dominio externo puede comprender varias "anillas" que sobresalen de la membrana. Por definición, la principal función del receptor es reconocer y responder a un ligando específico, por ejemplo, un neurotransmisor o una hormona (si bien ciertos receptores también responden a cambios en el potencial de transmembrana), y en muchos receptores, estos ligandos se unen al dominio extracelular.

En la mayoría de los receptores para los cuales existe evidencia estructural, las alfa hélices de transmembrana forman la mayor parte del dominio de transmembrana. En ciertos receptores, tales como el receptor de acetilcolina nicotínico, el dominio de transmembrana forma un poro alineado con la proteína a través de la membrana, o un canal iónico. Con la activación de un dominio extracelular mediante la unión del ligando apropiado, el poro se torna accesible para los iones, que entonces pasan a través de este. En otros receptores, se presume que los dominios de transmembrana sufren un cambio de conformación con la unión, lo que ejerce un efecto en forma intracelular. En algunos receptores, tales como miembros de la superfamilia 7TM, el dominio de transmembrana puede contener el saco de unión de ligando.

El dominio intracelular (o citoplásmico) del receptor interactúa con el interior de la célula o del orgánulo, transmitiendo la señal. Existen dos formas fundamentalmente diferentes para esta interacción: a) el dominio intracelular se comunica, mediante interacciones específicas de proteína-proteína, con proteínas efectoras, que, a su vez, envían la señal a lo largo de una cadena de señal, a su destino; y b) con receptores ligados a enzimas, el dominio intracelular tiene actividad enzimática. A menudo, esta actividad es una actividad de tirosina quinasa. La actividad enzimática además puede ubicarse en una enzima asociada con el dominio intracelular.

Existen varias formas en que la célula regula la actividad de un receptor de transmembrana. La mayoría de ellas funcionan a través del dominio intracelular. Las formas más importantes son la fosforilación y la internalización (ver ubiquitina) o activación de cascadas mensajeras secundarias tales como cAMP, IP, Ca2+ o cGMP.

Todas las proteínas de membrana que muestran actividades enzimáticas además pueden ser apuntadas por anticuerpos con la modificación descripta en esta invención. A modo de ejemplo, pueden mencionarse, sin limitación, la familia de metaloproteasas de matriz (MMP, por sus siglas en inglés), la familia de ' proteasas de un dominio de desintegrina y un dominio de metaloproteasa' (ADAM, por sus siglas en inglés), adenilato ciclasas, etc.

Todas las proteínas de membrana que actúan como canales iónicos, poros y transportadores también pueden ser apuntadas por anticuerpos con la modificación que se describe en esta invención. A modo de ejemplo, pueden mencionarse, sin limitación, la familia de canales de sodio, la familia de canales de potasio, la familia de receptores de acetilcolina nicotínicos, los receptores sigma, la familia de transportadores de monoamina.

Más ampliamente, todas las proteínas de membrana identificadas como marcadores específicos para una enfermedad determinada también pueden ser apuntadas por tratamientos de anticuerpos, donde los anticuerpos además pueden ser mejorados por las modificaciones que se describen en esta invención.

En una realización preferida de la invención, dicho receptor de transmembrana se selecciona del grupo que consiste en el receptor de tirosina quinasa, tetraspanina y GPCR.

En una realización más preferida, dicho receptor de transmembrana es un receptor de tirosina quinasa seleccionado, preferentemente, del grupo que consiste en IGF-1R,; c-Met, RON, Axl, VEGF, VEGFR, Her-2neu, homodímeros y heterodímeros de la familia ErbB, etc.

En la presente solicitud, y más en particular, en la siguiente memoria descriptiva, las secuencias se definirán con referencia a IMGT (base de datos de inmunogenética). Se ha definido la numeración única de IMGT a fin de comparar los dominios variables sin consideración del receptor de antígeno, el tipo de cadena o la especie [Lefranc M. -P., Immunology Today, 18, 509 (1997); Lefranc M. -P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M..-P., Pommié, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L, Thouvenin-Contet, V. y Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. En la numeración única de IMGT, los aminoácidos conservados siempre tienen la misma posición, por ejemplo, cisteína 23 (1era.-CYS), triptófano 41 (TRP-CONSERVADO), aminoácido hidrófobo 89, cisteína 104 (2da.-CYS), fenilalanina o triptófano 118 (J-PHE o J-TRP). La numeración única de IMGT proporciona una delimitación estandarizada de las regiones de marco (FR1-IMGT: posiciones 1 a 26, FR2-IMGT: 39 a 55, FR3-IMGT: 66 a 104 y FR4-IMGT: 118 a 128) y de las regiones de determinación de complementariedad: CDR1-IMGT: 27 a 38, CDR2-IMGT: 56 a 65 y CDR3-IMGT: 105 a 1 17. Debido a que los espacios representan las posiciones no ocupadas, las longitudes de CDR-IMGT (expuestas entre corchetes y separadas por puntos, por ejemplo, [8.8. 3]) se tornan información crucial. La numeración única de IMGT se usa en representaciones gráficas 2 D, designadas IMGT Colliers de Pe es [Ruiz, M. and Lefranc, M. -P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002); Kaas, Q. and Lefranc, M.: -P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], y en estructuras 3 D, en IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M. -P., "T cell receptor and MHC structural data". Nucí. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

Para el experto en el arte, será evidente el traspaso de la invención descripta de acuerdo con el sistema IMGT, a cualquier otro sistema de numeración, tal como el sistema de numeración Kabat.

La numeración única de IMGT para todas las regiones V IG y TR de todas las especies se sustenta en la alta conservación de la estructura de la región variable. Esta numeración, establecida luego de la alineación de más de 5000 secuencias, tiene en cuenta y combina la definición de las regiones de marco (FR) y de determinación de complementariedad (CDR), la información estructural de estudios de difracción de rayos X, y la caracterización de las anillas hipervariables. Se han definido las delimitaciones de las regiones FR-IMGT y CDR-IMGT. Asimismo, la numeración única de IMGT ha sido aplicada para el dominio C, y permite la precisa delimitación de dominios de tipo Ig. El dominio C corresponde a la región C completa, a la mayor parte de la región C, o solo a parte de la región C, de acuerdo con e tipo de inmunoglobulina (IG).

La numeración de IMGT para el dominio C (IG y TR) deriva, como la numeración única de IMGT para el dominio V, de los principios de la numeración única de IMGT para la región V, hasta la posición 104. Por lo tanto, las posiciones de aminoácidos pueden compararse sin dificultad, entre el dominio C y el dominio V.

A fin de localizar con precisión las regiones de bisagra, se aplicó la numeración de IMGT del dominio C a fin de localizar en forma precisa los dominios CH1 y CH2. La región de bisagra incluye todos los residuos de aminoácidos entre el último residuo de IMGT-CH1 y el primer residuo de IMGT-CH2.

Todos los otros esquemas de numeración de inmunoglobulinas, tales como el de Kabat o A. Honegger, que cubren el mismo dominio de bisagra, se incluyen en la presente invención.

A modo de ejemplo preferido de la invención, sobre la base del sistema de numeración de IMGT que se describe con anterioridad, la secuencia de aminoácidos de la región de bisagra de un lgG1 comprende los residuos H1 a H14, donde el segmento H1 a H9 corresponde a la bisagra superior, y el segmento H10 a H14 corresponde a la bisagra de centro. Más en particular, la región de bisagra de lgG1 humano comprende la secuencia de aminoácidos PKSCDKTHTCPPCP (SEC. ID. Nro. 11), y la región de bisagra de lgG1 murino comprende la secuencia de aminoácidos PRDCGCKPCICT (SEC. ID. Nro. 14).

Tabla 1.

Hu-IgG2 Hu-IgG4 (SEC. ID. (SEC. ID.

Hu-IgGl Mu-IgGl Región de Nro. 7) Nro. 11) Numeración (SEC. ID. (SEC. ID. bisagra Nro. 11) Nro. 14) Hl P P — — H2 K R R S H3 s D K K H4 C C C Y Bisagra H5 D G — superior H6 K — — — H7 T C C G H8 H K V P H9 T P E P H10 C C C C Hl l P I P P Bisagra H12 P P s centro H13 C C C C H14 P T P P En una realización preferida de la invención, se considera una modificación que tiene el objetivo de reducir la longitud de la secuencia de proteína que codifica para la región de bisagra de un anticuerpo divalente. Más en particular, el proceso de acuerdo con la invención comprende una etapa de eliminación de por lo menos un aminoácido en la región de bisagra.

Como se menciona anteriormente, se prefiere la eliminación de, como máximo, 2 aminoácidos de dicha región de bisagra.

Como se menciona anteriormente, se prefiere la eliminación de, como máximo, 3 aminoácidos de dicha región de bisagra.

Como se menciona anteriormente, se prefiere la eliminación de, como máximo, 4 aminoácidos de dicha región de bisagra.

En un uso particular del proceso de la invención, la modificación consiste en por lo menos una eliminación de un aminoácido seleccionado de los aminoácidos en las posiciones H1 , H2, H3, H5, H6, H7, H8, H9, H11 , H12 o H14.

Más en particular, los inventores han demostrado la implicancia de residuos particulares, y un aspecto inventivo particular de la invención consiste en la selección de ciertos residuos.

En el caso preferido de un lgG1 , el aminoácido en la posición H1 consiste en una prolina; el aminoácido en la posición H2 consiste en una lisina, en la versión humana, y en una arginina, en la versión murina; el aminoácido en la posición H3 consiste en una serina, en la versión humana, y en un aspartato, en la versión murina; el aminoácido en la posición H5 consiste en un aspartato, en la versión humana, y en una glicina, en la versión murina; el aminoácido en la posición H6 consiste en una lisina; el aminoácido en la posición H8 consiste en una histidina en la versión humana, y en una lisina, en la versión murina; el aminoácido en la posición H9 consiste en una treonina en la versión humana, y en una prolina, en la versión murina; el aminoácido en la posición H11 consiste en una prolina en la versión humana, y en una isoleucina, en la versión murina; y el aminoácido en la posición H12 consiste en una prolina en la versión humana.

De acuerdo con una realización preferida, esta eliminación debe efectuarse en la región de "bisagra superior".

En una realización más preferida, esta eliminación es parte de la "bisagra superior" constituida, para un lgG1 , por ejemplo, por los aminoácidos H1 a H9, en comparación con la "bisagra de centro", constituida por los aminoácidos H10 a H14.

En la presente solicitud, la numeración de aminoácidos se realiza con respecto al sistema de IMGT descripto previamente. Es evidente que cualquier otro sistema de numeración, con una modificación de la numeración, si bien sin modificación de la naturaleza de residuos implicados en la región de bisagra, debe considerarse equivalente. A modo de ejemplo, debe considerarse equivalente la renumeración de la parte de aminoácidos identificada de la invención (de acuerdo con el sistema de IMGT ), en el sistema de Kabat.

Otro aspecto de la invención se sustenta en la eliminación de por lo menos una cisteína en la región de "bisagra superior", preferentemente, ubicada en la posición H4.

Otro aspecto de la invención se sustenta en la adición de por lo menos un puente de disulfuro en la región de bisagra.

Más en particular, el proceso de la invención se caracteriza porque la modificación consiste en la introducción de por lo menos una cisteína en la región de "bisagra superior".

De acuerdo con los inventores, una explicación razonable se sustenta en un posible "rigidez" de: la bisagra, resultante o bien de la reducción de la longitud, o de la introducción de otro puente de disulfuro, o de ambos. Dicha "rigidez" permitirá mantener una conformación espacial apropiada del anticuerpo, y como consecuencia, una mejor actividad antagonista.

Es claro que cualquier método que tenga el objetivo de aportar rigidez a la región de bisagra debe considerarse un método equivalente al proceso de acuerdo con la presente invención.

La introducción de una cisteína puede efectuarse mediante la adición de dicho aminoácido, donde dicha adición se realiza por cualquier método conocido por el experto en el arte.

Otra forma preferida de introducir una cisteína en la región de bisagra consiste en una sustitución de por lo menos un aminoácido.

Más en particular, una forma preferida para introducir una cisteína en la región de bisagra consiste en una sustitución de por lo menos un aminoácido seleccionado de H1 a H9. Dicha sustitución puede efectuarse por cualquier método conocido por el experto en el arte.

Más en particular, el proceso de la invención comprende la sustitución de la treonina en la posición H7, en la región de "bisagra superior", por una cisteína.

En otra realización, el proceso de la invención comprende la sustitución de la lisina en la posición H6, en la región de "bisagra superior", por una cisteína.

En aun otra realización, el proceso de la invención comprende la sustitución de la prolina en la posición H1 , en la región de "bisagra superior", por una cisteína.

En aun otra realización, el proceso de la invención comprende la sustitución de la lisina en la posición H2, en la región de "bisagra superior", por una cisteína.

En incluso otra realización, el proceso de la invención comprende la sustitución de la serina en la posición H3, en la región de "bisagra superior", por una cisteína.

En aun otra realización, el proceso de la invención comprende la sustitución del aspartato en la posición H5, en la región de "bisagra superior", por una cisteína.

En aun otra realización, el proceso de la invención comprende la sustitución de la histidina en la posición H8, en la región de "bisagra superior", por una cisteína.

En incluso otra realización, el proceso de la invención comprende la sustitución de la treonina en la posición H9, en la región de "bisagra superior", por una cisteína.

De acuerdo con otra realización, también es posible reducir la longitud de la región de bisagra, o agregar un puente de disulfuro, mediante el cambio de la totalidad de la secuencia de aminoácidos que codifica la región de bisagra.

A modo de ejemplo preferido, la modificación del proceso de la invención consiste en un reemplazo de los aminoácidos H1 a H14 de la región de bisagra de lgG1 , por los aminoácidos H1 a H14 de una región de bisagra de lgG2, preferentemente, cuando dicho anticuerpo monoclonal que se desea para mejorar su actividad antagonista es un anticuerpo lgG1.

En otra aplicación, la invención se refiere a un proceso para la identificación sistemática de un anticuerpo monoclonal antagonista dirigido contra una molécula blanco específica, o un fragmento funcional divalente o derivado de dicho anticuerpo, donde dicho anticuerpo es capaz de inhibir una o más de las actividades biológicas de dicha molécula blanco, donde dicho proceso comprende las etapas de: (a) la selección de un anticuerpo inicial con un nivel inicial de inhibición de dichas una o más actividades biológicas de dicha molécula blanco; (b) la modificación de la secuencia de aminoácidos de la región de bisagra de dicho anticuerpo inicial, por medio del proceso de la invención; (c) la evaluación del anticuerpo modificado de la etapa (b), a fin de establecer su capacidad: para inhibir dichas una o más actividades biológicas de dicha molécula blanco; y (d) la selección, como un resultado positivo, del anticuerpo de la etapa (c) con un nivel de inhibición de dichas una o más actividades biológicas de dicha molécula blanco, superior al nivel inicial de dicha inhibición.

Los anticuerpos iniciales pueden seleccionarse entre los anticuerpos existentes, tales como, sin limitación, anticuerpos antagonistas para IGF-1 R, c- Met, RON, Axl, CD151 , VEGF, VEGFR, Her-2neu, homodímeros y heterodímeros de la familia ErbB. A modo de ejemplos preferidos no limitativos, dichos anticuerpos iniciales pueden consistir en herceptina, pertuzumab, cetuximab, anticuerpos anti-VEGFR o anti-IGF-1 R.

El término "nivel de inhibición", dentro del contexto de la invención, ilustra la actividad antagonista de un anticuerpo. Dicho nivel de inhibición puede determinarse por cualquier método conocido por el experto en el arte, por ejemplo, sin limitación: a) el recuento celular directo, o el uso de 3[H]Timidina, sales de tetrazolina o cualquier otro medio fluorescente para la evaluación de la proliferación; b) western blotting, ensayos de fosfo-ELISA o, ensayos de identificación sistemática alfa, a fin de controlar la transducción de señal; c) análisis BRET (sigla en inglés de "transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia") o FRET (sigla en inglés de "transferencia de energía por resonancia de fluorescencia"), para el ensayo de dimerización; d) microscopía o métodos fluorescentes, a fin de controlar la migración, la invasión, la angiogénesis o la morfogénesis; y e) medición de calibre de tumores para evaluaciones in vivo.

Este proceso de identificación sistemática puede usarse para el mejoramiento de anticuerpos validados o como una etapa de selección para anticuerpos de investigación o preclínicos.

Otro aspecto de acuerdo con la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal dirigido contra una molécula blanco específica, o fragmentos funcionales divalentes p derivados de dicho anticuerpo, que se obtiene por medio del proceso de la invención, donde dicho anticuerpo se caracteriza porque comprende una secuencia de aminoácidos de región de bisagra seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. Nro. 1 (PRDCGCKPCICT), SEC. ID. Nro. 2 (PKSCGCKPCICT), SEC. ID. Nro. 3 (PKSCGCKPCICP), SEC.

ID. Nro. 4 (PRDCGCKPCPPCP), SEC. ID. Nro. 5 (PRDCGCHTCPPCP), SEC. ID. Nro. 6 (PKSCDCHCPPCP), SEC. ID. NRo. 7 (RKCCVECPPCP), SEC. ID. NRo. 22 (CKSCDKTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 23 (PCSCDKTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 24 (PKCCDKTHTCPPCP), SEC. ID, NRo. 25 (PKSCCKTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 26 (PKSCDCTHTCPPCP) SEC. ID. NRo. 27 (PKSCDKCHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 28 (PKSCDKTCTCPPCP), SEC. ID. NRo. 29 (PKSCDKTHCCPPCP), SEC. ID. NRo. 30 (PKSCDKTHTCCPCP), SEC. ID. NRo. 31 (PKSCDKTHTCPCCP), SEC. ID. NRo. 32 (PKSCDKTHTCPPCC), SEC. ID. NRo. 33 (PSCDKTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 34 (PKSCDTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 35 (PKSCDKTHCPPCP), SEC. ID. NRo. 36 (KCDKTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 37 (PSCKTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 38 (PKSCDTHCPPCP), SEC. ID. NRo. 39 (PKSCTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 40 (PKSCDKTTCPCP), SEC. ID. NRo. 41 (PKSCDKTHCPPC), SEC. ID. NRo. 42 (PKSCDCHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 43 (PKSCDCTHCPPCP), SEC. ID. NRo. 44 (PCSCKHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 45 (PSCCTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 46 (PSCDKHCCPPCP), SEC. ID. NRo. 47 (PKSTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 48 (PKSCTCPPCP) o SEC . ID. NRo. 49 (PKSCDKCVECPPCP).

Un anticuerpo monoclonal preferido obtenido mediante la implementación del proceso de la invención puede caracterizarse porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. NRo. 1 (PRDCGCKPCICT), SEC. ID. NRo. 2 (PKSCGCKPCICT), SEC. ID. NRo. 3 (PKSCGCKPCICP), SEC. ID. NRo. 4 (PRDCGCKPCPPCP), SEC. ID. NRo. 5 (PRDCGCHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 6 (PKSCDCHCPPCP), SEC. ID. NRo. 7 (RKCCVECPPCP), SEC. ID. NRo. 22 (CKSCDKTHTCPPCP), SEC. ID.

NRo. 23 (PCSCDKTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 24 (PKCCDKTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 25 (PKSCCKTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 26 (PKSCDCTHTCPPCP) SEC. ID. NRo. 27 (PKSCDKCHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 28 (PKSCDKTCTCPPCP), SEC. ID. NRo. 29 (PKSCDKTHCCPPCP), SEC. ID. NRo. 30 (PKSCDKTHTCCPCP), SEC. ID. NRo. 31 (PKSCDKTHTCPCCP), SEC. ID. NRo. 32 (PKSCDKTHTCPPC.C), SEC. ID. NRo. 33 (PSCDKTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 34 (PKSCDTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 35 (PKSCDKTHCPPCP), SEC. ID. NRo. 36 (KCDKTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 37 (PSCKTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 38 (PKSCDTHCPPCP), SEC. ID. NRo. 39 (PKSCTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 40 (PKSCDKTTCPCP), SEC. ID. NRo. 41 (PKSCDKTHCPPC), SEC. ID. NRo. 42 (PKSCDCHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 43 (PKSCDCTHCPPCP), SEC. ID. NRo. 44 (PCSCKHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 45 (PSCCTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 46 (PSCDKHCCPPCP), SEC. ID. NRo. 47 (PKSTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 48 (PKSCTCPPCP) o SEC. ID. NRo. 49 (PKSCDKCVECPPCP).

En una realización preferida, dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humano, más preferentemente, es un anticuerpo lgG1.

La invención además se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica para un anticuerpo monoclonal como se describe con anterioridad, es decir, que comprende una secuencia de aminoácidos de región de bisagra seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. NRo. 1 (PRDCGC PCICT), SEC. ID. NRo. 2 (PKSCGCKPCICT), SEC. ID. NRo. 3 (PKSCGCKPCICP), SEC. ID. NRo. 4 (PRDCGCKPCPPCP), SEC. ID. NRo. 5 (PRDCGCHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 6 (PKSCDCHCPPCP), SEC. ID. NRo. 7 (RKCCVECPPCP), SEC. ID. NRo. 22 (CKSCDKTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 23 (PCSCDKTHTCPPCP), SEC. ID.

NRo. 24 (PKCCDKTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 25 (PKSCCKTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 26 (PKSCDCTHTCPPCP) SEC. ID. NRo. 27 (PKSCDKCHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 28 (PKSCDKTCTCPPCP), SEC. ID.

NRo. 29 (PKSCDKTHCCPPCP), SEC. ID. NRo. 30 (PKSCDKTHTCCPCP), SEC. ID. NRo. 31 (PKSCDKTHTCPCCP), SEC. ID.. NRo. 32 (PKSCDKTHTCPPCC), SEC. ID. NRo. 33 (PSCDKTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 34 (PKSCDTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 35 (PKSCDKTHCPPCP), SEC. ID.

NRo. 36 (KCDKTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 37 (PSCKTHTCPPCP), SEC. ID.

NRo. 38 (PKSCDTHCPPCP), SEC. ID. NRo. 39 (PKSCTHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 40 (PKSCDKTTCPCP), SEC. ID. NRo. 41 (PKSCDKTHCPPC), SEC. ID.

NRo. 42 (PKSCDCHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 43 (PKSCDCTHCPPCP), SEC.

ID. NRo. 44 (PCSCKHTCPPCP), SEC. ID. NRo. 45 (PSCCTHTCPPCP), SEC.

ID. NRo. 46 (PSCDKHCCPPCP), SEC. ID. NRo. 47 (PKSTHTCPPCP), SEC.

ID. NRo. 48 (PKSCTCPPCP) o SEC. ID. NRo. 49 (PKSCDKCVECPPCP).

De acuerdo con aun otro aspecto, la presente invención se refiere a un ácido nucleico aislado, caracterizado porque se selecciona de los siguientes ácidos nucleicos: a) un ácido nucleico, ADN o ARN, que codifica para una región de bisagra artificial de acuerdo con la invención, su correspondiente ácido nucleico de ARN o su secuencia complementaria; b) una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. NRo. 15 a SEC. ID. NRo. 21 , SEC. ID. NRo. 50 a SEC. ID. NRo. 77, su correspondiente ácido nucleico de ARN y su secuencia complementaria; y c) un ácido nucleico de por lo menos 18 nucleótidos, capaz de hibridar en condiciones de alta rigurosidad, con por lo menos una de las secuencias de SEC. ID. NRos. 15 a 21 y 50 a 77.

Preferentemente, la invención comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. NRo. 15 a SEC. ID. NRo. 21 , y SEC. ID. NRo. 50 a SEC. ID. NRo. 77.

Además, es parte de la invención un vector de expresión o una célula huésped transformada que comprende un ácido nucleico aislado como se describe con anterioridad, más en particular, un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. NRo. 15 a SEC. ID. NRo. 21 y SEC. ID. NRo. 50 a SEC. ID. NRo. 77, su correspondiente ácido nucleico de ARN y su secuencia complementaria.

Los términos ácido nucleico, secuencia de ácido nucleico o nucleica, polinucleótido, oligonucleótido, secuencia de polinucleótido, secuencia de nucleótido, que se emplean de modo indistinto en la presente invención, tienen la intención de indicar una unión precisa de nucleótidos, modificados o no modificados, que permite la definición de un fragmento o de una región de un ácido nucleico, que contiene o no contiene nucleótidos no naturales, y que es capaz de corresponder tanto a un ADN de doble filamento, a un ADN de filamento simple, como a los productos de transcripción de dichos ADN.

Además, debe entenderse en esta solicitud que la presente invención no se refiere a las secuencias de nucleótidos en su entorno cromosómico natural, es decir, en el estado natural. Se refiere a secuencias que han sido aisladas o purificadas, es decir, que se han seleccionado directa o indirectamente, por ejemplo, por medio de la copia, donde su entorno ha sido al menos parcialmente modificado. Por lo tanto, tiene la intención de indicar, asimismo, los ácidos nucleicos aislados obtenidos mediante la recombinación genética, por medio de, por ejemplo, las células huéspedes, u obtenidos por medio de la síntesis química.

Una hibridación en condiciones de alta rigurosidad significa que las condiciones de temperatura y concentración iónica se seleccionan de modo tal que permiten el mantenimiento de la hibridación entre dos fragmentos de ADN complementario. A modo de ilustración, convenientemente, las condiciones de alta rigurosidad de la etapa de hibridación para los propósitos de definición de los fragmentos de polinücleótidos descriptos con anterioridad son las siguientes.

La hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN se lleva a cabo en dos etapas: (1) la prehibridación a 42°C durante 3 horas en regulador de fosfato (20 mM, pH 7,5) que contiene 5 x SSC (1 x SSC corresponde a una solución de NaCI, 0,15 M, + citrato de sodio, 0,015 M), 50% de formamida, 7% de dodecil sulfato de sodio (SDS, por sus siglas en inglés), 10 x solución de Denhardt, 5% de sulfato de dextrano y 1 % de ADN de esperma de salmón; (2) La hibridación real durante 20 horas a una temperatura que depende del tamaño de la sonda (es decir: 42°C, para un tamaño de sonda de > 100 nucleótidos), seguida de 2 lavados de 20 minutos a 20°C en 2 x SSC + 2 % de SDS, 1 lavado de 20 minutos a 20°C en 0,1 x SSC + 0,1 % de SDS. El último lavado se lleva a cabo en 0,1 x SSC + 0,1 % de SDS durante 30 minutos a 60°C, para un tamaño de sonda de > 100 nucleótidos. Las condiciones de hibridación de alta rigurosidad que se describen anteriormente para un polinucleótido de tamaño definido pueden ser adaptadas por el experto en el arte para oligonucleótidos de mayor o menor tamaño, de acuerdo con las descripciones de Sambrook et al. (1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor).

Asimismo, la invención se refiere a un vector que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención.

La invención se dirige especialmente a vectores de clonación y/o expresión que contienen una secuencia de nucieótidos de acuerdo con la invención.

Los vectores de acuerdo con la invención, preferentemente, contienen elementos que permiten la expresión y la secreción de las secuencias de nucieótidos traducidas en una célula huésped determinada. El vector, por lo tanto, debe contener un promotor, señales de iniciación y terminación de traducción, al igual que regiones apropiadas de regulación de la transcripción. Debe poder mantenerse de manera estable en la célula huésped y, opcionalmente, puede tener señales particulares que especifican la secreción de la proteína traducida. Estos elementos diferentes son seleccionados y optimizados por el experto en el arte, como una función de la célula huésped utilizada. A estos fines, las secuencias de nucieótidos de acuerdo con la invención pueden insertarse en vectores de replicación autónoma en el huésped seleccionado, o pueden ser vectores integrantes del huésped seleccionado.

Dichos vectores se preparan mediante métodos actualmente utilizados por el experto en el arte, y los clones resultantes pueden introducirse en un huésped apropiado por métodos convencionales, tales como la lipofección, electroporación, choque térmico o métodos químicos.

Los vectores de acuerdo con la invención son, por ejemplo, vectores de origen plásmido o viral. Son útiles para la transformación de células huéspedes a fin de clonar o expresar las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención.

Asimismo, la invención comprende las células huéspedes transformadas por un vector de acuerdo con la invención, o que comprenden un vector de acuerdo con la invención.

La célula huésped puede seleccionarse de sistemas procariotos o eucariotos, por ejemplo, células bacterianas, si bien, asimismo, células de levaduras o células de animales, en particular, células de mamíferos. Asimismo, es posible utilizar células de insectos o células de plantas.

Otras características y ventajas de la invención serán expuestas en la descripción y en los ejemplos y las figuras, donde: Figuras 1A y 1B: Efecto de una serie de Mab anti-c-Met murinos y correspondientes quiméricos producidos como un isotipo lgG1/kappa humano sobre la fosforilación de receptor de c-Met en células A549.

Figura 1A: efecto agonista calculado como porcentaje en comparación con la estimulación máxima de la fosforilación de c-Met por HGF [100 ng/ml].

Figura 1 B: efecto antagonista calculado como porcentaje de inhibición de la estimulación máxima de fosforilación de c-Met por HGF [100 ng/ml].

Figuras 2A y 2B: Comparación entre Mab 224G11 murino y Mab 224G11 quiméricos que contienen diversas regiones de bisagra diseñadas, sobre la fosforilación de receptor de c-Met en células A549.

Figura 2A: efecto agonista calculado como porcentaje en comparación con la estimulación máxima de fosforilación de c-Met por HGF [100 ng/ml].

Figura 2B: efecto antagonista calculado como porcentaje de inhibición de la estimulación máxima de fosforilación de c-Met por HGF [100 ng/ml].

Figuras 3A y 3B, 4 y 5: Dimerización de c-Met y modelos BRET de activación.

Figuras 6A y 6B: Reconocimiento de c-Met por formas 224G11 quiméricas y humanizadas.

Figuras 7A, 7B y 7C: Efecto de anticuerpos murinos y quiméricos sobre la proliferación inducida por HGF, de células NCI-H441 in vitro. Las células NCI-H441 se colocaron en placas libres de suero. Veinticuatro horas después de la colocación en las placas (Figura 7A), se agregaron m11 E1 y [11 E1] quim. (Figura 7B), m227H1 y [227H1] quim. (Figura 7C), o m224G11 y [224G1 1] quim., o bien en ausencia o en presencia de HGF. Las flechas negras indican los receptáculos con placas de células solas, en ausencia l¿ o en presencia i. de HGF. Se introdujo un lgG1 murino (mlgG1) como un control de isotipo.

Figura 8: Comparación in vivo de Mab 224G11 murinos y quiméricos en el modelo de xenoinjerto NCI-H441.

Figuras 9A y 9B: Efecto del Mab 224G11 murino y de diversas versiones quiméricas y humanizadas de este anticuerpo sobre la proliferación inducida por HGF, de células NCI-H441 in vitro. Las células NCI-H441 se colocaron en placas libres de suero. Veinticuatro horas después de la colocación en las placas, se agregaron los anticuerpos por ser evaluados, o bien en ausencia o en presencia de HGF. En el panel (Figura 9A), se muestran las versiones m224G11 murina, lgG1 quimérico [224G11] quim., lgG1 humanizado [224G11] [Hz1], [224G11] [Hz2], [224G11] [Hz3]. En el panel (Figura 9B), se presentan el m224G11 murino y diversas formas quiméricas lgG1 ([224G11] quim., [224G11] [MH quim.], [224G11] [MUP9H quim.], [224G11] [MMCH quim.], [224G11] [TH7 quim.]). Las flechas negras indican los receptáculos con placas de células solas en ausencia l¿ o en presencia de HGF. Se introdujo un lgG1 murino como un control negativo para la actividad agonista. Se usó el m5D5 como un control agonista total dependiente de la dosis.

Figura 10: Efecto del Mab 224G11 murino y de diversas versiones quiméricas y humanizadas de este anticuerpo, sobre la proliferación inducida por HGF, de células NCI-H441 in vitro. Las células NCI-H441 se colocaron en placas en medio libre de suero. Veinticuatro horas después de la colocación en las placas, se agregaron los anticuerpos por ser evaluados, en ausencia o en presencia de HGF. Se presentan las formas quiméricas lgG1 m224G1 1 murino, [224G1 1] quim., [224G11] [TH7 quim.]) y [224G1 1] [TH7 Hz1], [224G1 1] [TH7 Hz3]). Las flechas negras indican los receptáculos con placas con células solas, o bien en ausencia i¿ o en presencia ^ de HGF. Se introdujo un lgG1 murino como un control negativo para la actividad agonista. Se usó el m5D5 como un control agonista total dependiente de la dosis.

Figuras 1 1A-1 1B y 12A-12B: Efecto de una serie de Mab anti-c-Met, con bisagra diseñada, de la invención, sobre la fosforilación de receptor de c- Met en células A549.

Figuras 11A y 11 B: efecto agonista calculado como porcentaje en comparación con la estimulación máxima de fosforilación de c-Met por HGF [100 ng/ml].

Figuras 12A y 12B: efecto antagonista calculado como porcentaje de inhibición de la estimulación máxima de fosforilación de c-Met por HGF [100 ng/ml].

Figuras 13A y 13B: Dimerización de c-Met y modelos de activación BRET.

Figura 14A: efecto agonista calculado como porcentaje en comparación con la estimulación máxima de fosforilación c-Met por HGF [100 ng/ml].

Figura 14B: efecto antagonista calculado como porcentaje de inhibición de la estimulación máxima de fosforilación c-Met por HGF [100 ng/ml].

Figura 15: dimerización de c-Met y modelos de activación BRET.

Figura 16: análisis microscópico del efecto de diferentes formas de Mab 214B2 sobre la adhesión celular PC3.

Figura 17: análisis del efecto de diferentes formas de Mab 214B2 sobre la adhesión celular PC3 usando un ensayo de ATP (sigla en inglés de "adenosina 5'-trifosfato"). En cada receptáculo, se determinó la cantidad de células adheridas usando una curva modelo PC3, de 0 a 200.000 células/receptáculo. Los resultados se presentan de la siguiente manera: las células no tratadas se toman como referencia (100%), y las células tratadas se presentan como el % de referencia.

Ejemplo 1. Construcción de Mab quiméricos y evaluación funcional del estado de fosforilación de receptor c-Met.

Se reformaron varios Mab de ratón, que apuntaban un receptor de tirosina quinasa prototípico (receptor c-Met), como Mab quiméricos que portaban dominios variables de ratón y dominios constantes humanos. Se analizaron sus actividades intrínsecas sobre la base de un ensayo funcional que controlaba la inhibición de fosforilación de receptor c-Met dependiente de ligando (HGF).

Con la clonación de PCR de secuencias de dominio variable de ratón (VH, VL), se construyeron Mab quiméricos con la ligación de un fragmento de restricción {Nhe1-Bcl1} que portaba o bien secuencias VH o VL de ratón, en un vector pCEP4 (InVitrogen, US) que portaba la secuencia de codificación entera del dominio constante o bien de una cadena liviana humana Ckappa o una cadena pesada humana [CH1-Bisagra-CH2-CH3] de una inmunoglobulina lgG1. Todas las etapas de clonación se efectuaron de acuerdo con técnicas de biología molecular convencionales, por ejemplo, como se describe en el manual de laboratorio (Sambrook and Russel, 2001), o de acuerdo con las. instrucciones del proveedor. Cada construcción genética fue completamente validada por el secuenciamiento de nucleótidos usando el equipo de secuenciamiento de ciclos de terminador Big Dye (Applied Biosystems, US), y analizada usando un instrumento de análisis 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, US). La producción de los correspondientes Mab quiméricos se efectuó empleando células HEK293 EBNA adaptadas a la suspensión (InVitrogen, US), cultivadas en medio libre de suero Excell 293 (SAFC Biosciences) suplementado con glutamina, 6 mM. Se realizó la transfección transiente usando polietilenimina lineal, 25 kDa (PEI) (Polysciences). El proceso de cultivo se controló sobre la base de la viabilidad celular y la producción de Mab. Se purificaron los Mab usando un enfoque de cromatografía convencional sobre una resina de Proteína A (GE Healthcare, US).

Todas las formas diferentes de Mab se produjeron en niveles adecuados, con evaluaciones funcionales. Los niveles de productividad variaron típicamente entre 15 y 30 mg/l de Mab purificados.

Se efectuaron evaluaciones funcionales en células de cáncer de pulmón humanas A549. Se controló el estado de fosforilación del receptor c-Met en lisados celulares, usando un ensayo ELISA de captura específico. Se usó un Mab anti-c-Met de cabra (R&D, ref. AF276) como anticuerpo de captura, mientras que el anticuerpo de detección correspondió a un Mab anti-fosfo-c-Met (Biosource ref. KHO0281). Se registraron las lecturas de luminiscencia en un lector de placa de multimodo Mithras LB920 (Berthold).

Los tres Mab murinos 11E1 , 224G11 y 227H1 , lograron actividades intrínsecas comparables sobre la fosforilación de receptor c-Met: casi ninguna actividad agonista por sí mismos (menos de 5% de efecto HGF, Figura 1A), y una fuerte inhibición de Ja fosforilación de c-Met inducida por HGF [100 ng/ml] (> 70% de inhibición de efecto HGF, Figura 1 B). De manera muy sorprendente, mediante la modificación exclusiva del dominio constante de Mab a fin de cambiar de un lgG1/kappa de ratón a un lgG1 kappa humano, se observó una modificación completa de las actividades intrínsecas de los Mab quiméricos resultantes (Figuras 1A-1B). De hecho, se observó fuerte agonismo (que alcanzó el 20% de efecto HGF para c1 E1 , Figura A), asociado con una disminución importante en al eficacia antagonista (donde solo quedó el 60% de inhibición del efecto HGF para C224G11 , Figura 1B). Este efecto fue independiente del dominio variable del anticuerpo, ya que se observó el mismo fenómeno para los tres Mab investigados (los anticuerpos monoclonales 11E1 , 224G11 y 227H1 son secretados por el hibridoma depositado en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos) (Instituí Pasteur, Paris, France) el 14/03/2007, con los números CNCM I-3724 (que corresponde a 11E1), 1-3731 (que corresponde a 224G11) y I-3732 (que corresponde a 227H1) (ver la Solicitud de Patente PCT publicada con el número WO 2009/007427).

Ejemplo 2: Diseño, clonación y producción de versiones de bisagra diseñadas.

Sobre la base de la observación realizada anteriormente, se tiene la hipótesis de que el alterado perfil farmacológico observado con la reformación del lgG1 de ratón en Mab lgG1 humanos se debió al dominio lgG1 humano.

Por una parte, se sabía en la literatura que la activación del receptor c-Met se asociaba con su dimerización, y que la inhibición de la dimerización del receptor c-Met podía inhibir la fosforilación de c-Met y la señalización corriente descendente.

Por otra parte, los Mab son, en esencia, moléculas divalentes debido a su base estructural inherente y, en consecuencia, pueden actuar como inductores de la dimerización del receptor c-Met.

Por lo tanto, se tiene la hipótesis de que, mediante la restricción de la flexibilidad de conformación de los Mab quiméricos,- por ejemplo, la rotación, el doblado o la oscilación (ver la referencia de Roux et al., 1997), podría ser posible recuperar las actividades intrínsecas de interés (fuerte antagonismo y débil agonismo) de los Mab murinos progenitores. Esta hipótesis se refuerza por el análisis de las respectivas secuencias de regiones de bisagra lgG1 de ratón y humanas (también denominadas regiones lgG1 H): Región lgG1 H de ratón PRDCGCKPCICT (SEC. ID. NRo. 1) Región lgG1 H humana PKSCDKTHTCPPCP (SEC. ID. NRo. 11) Región lgG2 H humana RKCCVECPPCP (SEC. ID. NRo. 7) Esta alineación muestra que la región lgG1 H de ratón es más corta y contiene un puente de disulfuro adicional (Cys), en comparación con la región lgG1 H humana. Además, muestra que la región lgG2 H humana se asemeja a aquella de la región lgG1 H de ratón, tanto en su longitud (11 AA) como en la cantidad de puentes de disulfuro (4).

Por lo tanto, se cree que la mayor rigidez de la región lgG1 H humana podría obtenerse mediante la introducción de mutaciones estabilizadoras tales como residuos Cys, y/o mediante el acortamiento de este segmento particular. Esta mayor rigidez putativa de la región H puede asociarse con mejores propiedades funcionales del Mab lgG1 humano diseñado.

Se ha construido, una primera serie de 7 versiones diseñadas (Tabla 2), preparando regiones H quiméricas con el intercambio o bien de las porciones de bisagra N-terminales o C-terminales entre secuencias de ratón y humanas. Asimismo, se efectuó la construcción de un lgG2 equivalente.

Tabla 2.

WT-IgG2 WT-IgG, Variantes Hu-IgG2 Hu-lgG, Mu-IgG, MH MMCH MMH MUP9H MUC7H TH7CA6,9 -IgG , -IgG, -IgG , -IgG, -IgG , -IgG, - P P P P P P P P R K R R K K R R K K s D D s S D D s C c C C c C C C c - D G 6 G G G G D V L . c T C C C C C C C V H K K K K K H H E T P P P P P T — C C C C c C c C c P P I I I I P P P P P - - - - P P P C C c c c c c C c P P T T T P P P P Se diseñó y se construyó una serie adicional de 28 mutantes en la región H, a fin de evaluar la influencia de, o bien la introducción de un residuo cisteina adicional dentro de la región H, o la eliminación de por lo menos un aminoácido, o la combinación simultánea de la adición de una cisteina y la eliminación de por lo menos un aminoácido dentro de la región H.

Esta nueva serie de mutantes de bisagra se describe en la Tabla 3.

Tabla 3 Como un ejemplo de la construcción de bisagras, se seleccionó el dominio variable (cadenas pesada y liviana) de un Mab anti-c-Met de ratón -denominado 224G11.

Estas secuencias de ratón se fusionaron, en un primer caso, con dominios constantes humanos [Ckappa] para la cadena liviana, y [CH1-Bisagra-CH2-CH3], para la cadena pesada lgG1 humana. La modificación de la región de bisagra se efectuó mediante el intercambio de un fragmento de restricción {Nhe1-Bcl1} por la porción equivalente que . portaba las modificaciones deseadas, donde cada respectivo fragmento {Nhe1-Bcl1} se sintetizó por medio de la síntesis de genes global (Genecust, LU). Todas las nuevas mutantes de bisagra se construyeron sobre la misma base.

Todas las etapas de clonación se efectuaron de acuerdo con técnicas de biología molecular convencionales, como se describe en el manual de laboratorio (Sambrook y: Russel, 2001), o de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Cada construcción genética fue completamente validada por el secuenciamiento de nucleotidos usando el equipo de secuenciamiento de ciclos de terminador Big Dye (Applied Biosystems, US), y se analizó empleando un equipo 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, US).

Las células HEK293 EBNA adaptadas a la suspensión (InVitrogen, US) se cultivaron en forma rutinaria en matraces de 250 mi en 50 ml de medio libre de suero Excell 293 (SAFC Biosciences) suplementado con glutamina, 6 mM, en una agitadora orbital (110 r. p. m. velocidad de rotación). Se efectuó la transfección transiente con 2.106 células/ml, usando polietilenimina lineal, 25 kDa (PEI) (Polysciences), preparada en agua, en una concentración final de 1 mg/ml, ADN plásmido y mixto (concentración final de 1 ,25 pg/ml, para una relación de plásmido de cadena pesada a liviana de 1 :1). A las 4 horas posteriores a la transfección, el cultivo se diluyó con un volumen de medio de cultivo fresco, a fin de lograr una densidad celular final de 106 células/ml. El proceso de cultivo se controló sobre la base de la viabilidad celular y la producción de Mab. Típicamente, los cultivos se mantuvieron durante 4 a 5 días. Los Mab se purificaron empleando un enfoque de cromatografía convencional en una resina de Proteína A (GE Healthcare, US).

Todas las formas diferentes de Mab se produjeron en niveles adecuados, con evaluaciones funcionales. Los niveles de productividad típicamente variaron entre 15 y 30 mg/l de Mab purificados.

Ejemplo 3: Evaluación de los Mab diseñados en un ensayo ELISA específico de fosfo-c-Met.

Se sembraron células A549 en una placa de multirreceptáculos (MW, por sus siglas en inglés) 12,. en medio de crecimiento completo [F12K + 10% FCS]. Las células se privaron durante 16 horas antes de la estimulación con HGF [100 ng/ml], y cada Mab por ser ensayado se agregó en su concentración final de 30 pg/ml, 15 minutos antes de la estimulación de ligando. Se agregó regulador de lisis helado 15 minutos después de la adición de HGF, a fin de detener la reacción de fosforilación. Las células se rasparon mecánicamente, y se recogieron los lisados celulares mediante la centrifugación a 13.000 r. p. m. durante 10 minutos a 4°C, que correspondieron a la fase de sobrenadante. Se cuantificó el contenido de proteína empleando un equipo BCA kit (Pierce), y se realizó el almacenamiento a -20°C hasta el uso. Se cuantificó el estado de fosforilación de c-Met por ELISA. Se usó un Mab de cabra anti-c-Met (R&D, ref. AF276) como un anticuerpo de captura (revestimiento durante la noche a 4°C), y después de una etapa de saturación con un regulador al 5% de TBS-BSA (1 hora a temperatura ambiente (TA)), se agregaron 25 gg de lisados de proteína a cada receptáculo de la placa 96MW revestida. Luego de una incubación de 90 minutos a TA, las placas se lavaron cuatro veces, y se agregó el anticuerpo de detección (Mab anti-fosfo-c-Met, dirigido contra los residuos Tyr fosforilados en las posiciones 1230, 1234 y 1235). Luego de una incubación adicional de 1 hora y de 4 lavados, se agregó un anticuerpo anticonejo acoplado a HRP (sigla en inglés de "peroxidasa de rábano rusticano") (Biosource) durante un período de tiempo de 1 hora a TA, y se efectuó la detección de luminiscencia mediante la adición de Luminol. Las lecturas de luminiscencia se realizaron en un lector de placa de multimodo Mithras LB920 (Berthold).

Se construyó una serie de versiones diseñadas del dominio de bisagra de cadena pesada, y se ensayó en el ensayo de fosforilación de receptor c- Met. Como se muestra en la Figura 2A, en comparación con 224G11[lgG1- Quim], se observó una importante reducción del efecto agonista asociado con el isotipo hlgG1/kappa, tanto para la construcción sobre la base de lgG2 como para algunas construcciones diseñadas lgG1/kappa [MH, MUP9H y TH7, Figura 2A]. Se obtuvieron actividades de agonismo más débiles y comparables, con 224G1 [MH-lgG1], que contenía una región de bisagra lgG1 completamente murina, y con 224G11[TH7], que contenía la región de bisagra lgG1 diseñada más humana. Se obtuvo además un incremento concomitante en la eficacia antagonista [Figura 2B]. En consecuencia, tanto la muíante de bisagra TH7 sobre la base de lgG2 como aquella sobre la base de hlgG1/kapa diseñada asociada con el dominio variable 224G11 murino lograron actividades funcionales casi similares a aquella del Mab de ratón 224G11. Sin embargo, la comparación de las actividades agonistas/antagonistas de 224G11[MMCH-lgG1-quim] con 224G11[lgG1-quim] demostró que pudo obtenerse una actividad antagonista mayor por medio del diseño de anticuerpo, sin consideración de las propiedades agonistas intrínsecas de dicho anticuerpo.

Se construyó una segunda serie de versiones diseñadas del dominio de bisagra de cadena pesada, y se ensayó en el ensayo de fosforilación de receptor c-Met. Como se muestra en la Figura 11A, la sustitución de aminoácidos en el dominio de bisagra de cadena pesada para la introducción de residuo cisteína modificó el efecto agonista de los anticuerpos. De hecho, por una parte, algunas versiones mutadas exhibieron efecto agonista más débil que C224G11 , por ejemplo, c224G11[C2], c224G11[C3], c224G11[C5], c224G11[C6] o c224G:11[C7], mientras que otras incrementaron el efecto agonista, como c224G11[C11], c224G11[C12] y c224G11[C14]. Asimismo, las deleciones de aminoácidos en el dominio de bisagra de cadena pesada, asociadas o no con sustituciones de aminoácidos, modificaron también las propiedades agonistas de los anticuerpos [Figura 11B]. Por ejemplo, c224G11[A1-3], c224G11[A4-5-6], c224G11[A5-6-7-8], c224G11[C7A6], c224G11[C6A9], c224G11[C2A5-7], c224G11[C5A2-6] o C224G11[C9A2-7] mostraron un efecto agonista más débil que C224G11 , mientras que c224G11 [A8-11] exhibió un efecto agonista más fuerte. Como c224G11[TH7], todas las nuevas versiones que exhibían un efecto agonista más débil mostraron un incremento concomitante en la eficacia antagonista [Figuras 12A y 12B], mientras que aquellas que exhibían un efecto agonista mayor tuvieron una eficacia antagonista más débil.

En la presente solicitud, el uso de corchetes no es necesario; a modo de ejemplo, la referencia [224G1 1][lgG2quim] debe considerarse idéntica a 224G11 lgG2quim. Del mismo modo, a fin de indicar que el anticuerpo es un anticuerpo murino, pueden agregarse el término "murino" o la letra m; para indicar que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, pueden agregarse el término "quim" o "chim" o la letra c (del inglés chimeric); y para .indicar que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, pueden agregarse el término "hum" o la letra h. A modo de ejemplo, el anticuerpo quimérico 224G1 lgG2 puede denominarse c224G11 lgG2, c224G11[lgG2], c[224G11]lgG2, c[224G 1][lgG2], 224G11 lgG2quim, : 224G11[lgG2quim], [224G11]lgG2quim o [224G11][lgG2quim].

El símbolo ? significa eliminación.

Ejemplo 4: Análisis BRET.

En un primer grupo de experimentos, se controló que lgG1 de ratón, lgG1 humano e lgG2 humano irrelevantes no tuvieran efecto de señal BRET inducida por HGF, en ambos modelos BRET (Figura. 3). Dichos Mab se usaron adicionalmente como controles.

Se evaluó entonces el efecto de formas quiméricas lgG1 de Mab 224G1 1 de ratón ([224G1 1] quim), Mab J 1 E1 de ratón ([11 E1] quim) y Mab 227H1 de ratón ([227H1] quim) sobre la dimerización de c-Met y el modelo BRET de activación c-met.

Si bien Mab 224G11 de ratón inhibió el 59% de la señal BRET inducida por HGF sobre el modelo de dimerización de c-Met, Mab [224G11] quim inhibió solo el 29% (Figura 4). El anticuerpo [224G11] quim también fue menos eficaz en la inhibición de la activación de c-Met inducida por HGF, ya que los anticuerpos [224G11] quim y m224G11 inhibieron 34,5% y 56,4% de la señal BRET inducida por HGF (Figura 5). Además, m224G11 solo no tuvo efecto sobre la activación de: c-Met, mientras que [224G11] quim tuvo un efecto agonista parcial sobre la activación de c-Met que correspondió al 32,9% de la señal inducida por HGF.. Este efecto agonista parcial del [224G11] quim también se observó en el modelo BRET de dimerización de c-Met, ya que [224G11] quim solo indujo un incremento BRET que correspondió al 46,6% de señal inducida por HGF, en comparación con 21 ,3%, para m224G11.

La eficacia agonista de la segunda serie de versiones diseñadas del dominio de bisagra de cadena pesada se evaluó en el modelo BRET de activación de c-Met (Figuras 13A y 13B). En contraste a c224G11 , que tuvo un efecto agonista parcial sobre la activación de c-Met, diferentes formas quiméricas mutadas de bisagra de anticuerpo 224G11 que comprendían sustitución de aminoácidos, eliminación de aminoácidos, o ambas, no mostraron efecto significativo sobre la activación de c-Met sola para c224G11[C2], c224G11[C3], c224G11[C5], c224G11[C6], c224G11[C7], c224G11[A1-3], c224G11[?4-5-6], c224G11[A5-6-7-8], c224G11[C7A6], c224G11[C6A9], c224G11[C2A5-7], c224G11[C5A2-6] o c224G11[C9A2-7], respectivamente. En contraste, otras formas quiméricas mutadas de bisagra mostraron mayor efecto agonista, como c224G11[A6], c224G11[C11], c224G11 [C12] y c224G11[C14].

Ejemplo 5: Reconocimiento de c- et por formas 224G11 quiméricas y humanizadas.

Se ha establecido un ensayo ELISA directo a fin de determinar la capacidad de unión de las diversas formas quiméricas y humanizadas, sobre c-Met recombinado. Brevemente, se recubrieron placas de 96 receptáculos Immunlon II con c-Met dímero recombinado, de R&D Systems, en una concentración de 1 ,25 µg/m\. Después de la incubación durante la noche a 4°C, los receptáculos fueron saturados con una solución de 0,5% de gelatina/PBS. Las placas entonces se incubaron durante 1 hora a 37°C, antes de la adición de diluciones dobladas de anticuerpos por ser ensayados. Las placas se incubaron una hora adicional, antes de la adición de un IgG antirratón de cabra HRP para la detección del anticuerpo murino, y una cadena liviana Kappa antihumana de cabra HRP, para el reconocimiento de anticuerpo quimérico y humanizado. Las placas se incubaron durante una hora, y se agregó el sustrato de peroxidasa TMB Uptima 5 mn antes de la neutralización con H2S04, 1 M. Los resultados que se presentan en las Figuras 6A y 6B mostraron que todas las formas ensayadas fueron comparables para el reconocimiento de c-Met.

Ejemplo 6: Efecto de anticuerpos murinos y quiméricos sobre la proliferación inducida por HGF, de células NCI-H441 in vitro.

Se cultivaron en forma rutinaria células NCI-H441 de ATCC, en medio RPMI 1640 (Invitrogen Corporation, Scotland, UK), 10% de FCS (Invitrogen Corporation), 1 % de L-Glutamina (Invitrogen Corporation). Para los ensayos de proliferación, las células se dividieron tres días antes del uso, de modo de encontrarse en la fase confluente de crecimiento, antes de la colocación en las placas. Las células NCHH441 se colocaron en placas de cultivo de tejido de 96 receptáculos a una densidad de 3,75 x 104 células/receptáculo, en 200 µ? de medio libre de suero (medio RPMI 1640 más 1% de L-Glutamina). Veinticuatro horas después de la colocación en las placas, se agregaron los anticuerpos por ser ensayados a NCI-H441 y se incubaron a 37°C durante 30 minutos, antes de agregar HGF en una concentración final de 400 ng/ml (5 nM), durante 142 horas adicionales. El rango de dosis ensayado para cada anticuerpo fue de 10 a 0,0097 pg/ml (concentración final en cada receptáculo). En este experimento, se agregó un Mab lgG1 murino como un control de isotipo murino, y los anticuerpos ensayados fueron los siguientes: m224G11 , m11 E1, m227H1 y sus formas quiméricas lgG1 humanas, respectivamente, identificadas como [224G11] quim, [11E1] quim y [227H1] quim. Se incluyeron también receptáculos de placas con células solas -/+ HGF. A continuación, las células se pulsaron con 0,25 pCi de [3H]Timidina (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden) durante 7 horas 30 minutos. La magnitud de [3H]Tim¡dina incorporada en ácido tricloroacético-ADN insoluble se cuantificó por medio del recuento de centelleo líquido. Los resultados se expresan como información cpm no transformada a fin de evaluar mejor la potencial actividad agonista intrínseca que pudo producirse con Mab anti-c-Met agregados solos a células tumorales.

Los resultados descriptos en las Figuras 7A, 7B y 7C demostraron que, como se esperaba, los anticuerpos murinos no exhibieron efecto agonista cuando se agregaron solos a células neoplásicas, sin consideración de la dosis ensayada. No se observó inhibición significativa de la proliferación inducida por HGF, con el isotipo de control, con respecto a las altas variaciones de cpm observadas para este control de isotipo en este experimento. Cuando se agregó solo, ni m224G1 1 murino ni m11 E1 o m227H1 mostró efecto agonista, en comparación con el Mab de control de isotipo mlgG1 o células solas. Las actividades antiproliferativas dependientes de la dosis que alcanzaron el 78%, 80% u 80% fueron, respectivamente, para Mab m224G1 1 , m11 E1 o m227H1 (cálculo de % de inhibición: 100-[(cpm células + Mab por ser ensayado-media cpm fondo mlgG1) x 100 / (media cpm células + HGF- media cpm células solas)]). Sorprendentemente, la forma quimérica de estos tres Mab indujo un efecto agonista significativo dependiente de la dosis, cuando se agregó sola con estimulaciones de crecimiento cercanas a aquella observada con HGF para [1 1 E1] quim y [227H1] quim, respectivamente. Para estos dos anticuerpos que exhibían actividades agonistas intrínsecas particularmente altas, el efecto antagonista disminuyó de manera significativa, con 53% y 21 % de efectos inhibitorios, en comparación con el 80% observado para ambas de sus formas murinas. El efecto agonista observado con el quimérico [224G1 1] quim también fue dependiente de la dosis, si bien fue inferior a aquellos observados para [1 1 E1] quim y [227H1] quim. Sin embargo, este efecto agonista tuvo un impacto sobre la inhibición in vitro de la proliferación inducida por HGF, que cambió de 78% para el m224G11: murino, al 50%, para su forma quimérica. A fin de determinar si dicha actividad agonista intrínseca in vitro "menor" era compatible con un efecto no cambiado in vivo, se produjeron tanto m224G1 1 como [224G1 ] quim para el ensayo in vivo. Como en estudios previos, la dosis de 30 pg/ratón había demostrado una actividad significativa in vivo, se seleccionó dicha dosis para la evaluación in vivo.

Ejemplo 7: Comparación in vivo de Mab muri os y quiméricos 224G11 sobre el modelo de xenoinjerto NCI-H441.

NCI-H441 deriva de adenocarcinoma pulmonar papilar, expresa altas concentraciones de c-Met, y demuestra fosforilación constitutiva de c-Met RTK.

A fin de evaluar: el efecto in vivo de anticuerpos sobre el modelo de xenoinjerto NCI-H441 , se albergaron ratones atímicos de seis a ocho semanas de edad en jaulas esterilizadas con la parte superior de filtro, se mantuvieron en condiciones estériles y se manipularon de acuerdo con las pautas francesas y europeas. Se inyectaron a los ratones por vía subcutánea 9 x 106 células. A continuación, seis días después de la implantación de células, los tumores podían medirse (aproximadamente 100 mm3), y los animales se dividieron en grupos de seis ratones con tamaños de tumor comparables, y se trataron, en primer lugar, con una dosis de carga de 60 µg de anticuerpo/ratón, y luego, dos veces por semana, con 1 mg/dosis de cada anticuerpo por ser ensayado. Los ratones se siguieron para la observación del índice de crecimiento de xenoinjerto. Se calculó el volumen tumoral mediante la fórmula: p (Pi)/6 X longitud X ancho X altura. Los resultados descriptos en la Figura .8 demuestran que el Mab murino privado de actividad agonista in vivo se comportó, como se esperaba, como un potente antagonista, aun en la baja dosis ensayada. En contraste a lo observado con el Mab murino, el Mab quimérico exhibió una actividad in vivo muy transitoria, y el tumor evadió por completo el tratamiento al Día 20 luego de la inyección de células. Este experimento demuestra claramente que el incremento de efecto agonista in vitro que logró una disminución de la actividad antagonista también fue responsable de una pérdida significativa in vivo de actividad antagonista.

Ejemplo 8: Efecto del Mab 224G11 murino y de diversas versiones quiméricas y humanizadas de este anticuerpo, sobre la proliferación inducida por HGF, de células NCI-H441 in vitro.

Se cultivaron en forma rutinaria células NCI-H441 de ATCC, en medio RPMI 1640 (Invitrogen Corporation, Scotland, UK), 10% de FCS (Invitrogen Corporation), 1 % de L-Glutamina (Invitrogen Corporation). Para los ensayos de proliferación, las células se dividieron tres días antes del uso, de modo de encontrarse en la fase confluente de crecimiento, antes de la colocación en las placas. Las células NCI-H441 se colocaron en placas de cultivo de tejido de 96 receptáculos a una densidad de 3,75 x 104 células/receptáculo, en 200 µ? de medio libre de suero (medio RPMI 1640 más 1% de L-Glutamina). Veinticuatro horas después de la colocación en las placas, se agregaron los anticuerpos por ser ensayados a NCI-H441 y se incubaron a 37°C durante 30 minutos, antes de agregar HGF en una concentración final de 400 ng/ml (5 nM), durante 142 horas adicionales. El rango de dosis ensayado para cada anticuerpo fue de 10 a 0,0097 pg/ml (concentración final en cada receptáculo). En este experimento, se agregó Mab lgG1 murino como un control de isotipo murino, y como un control negativo agonista. Los anticuerpos ensayados fueron los siguientes: i) m224G11 , ¡i) sus formas quiméricas lgG1 humanas, identificadas, respectivamente, como [224G11] quim, [224G11] [MH quim], [224G11] [MUP9H quim], [224G11] [MMCH quim], [224G11] [TH7 quim], iii) sus formas lgG1 humanizadas, respectivamente, descriptas como [224G11] [Hz1], [224G11] [Hz2], [224G 1] [Hz3]. Se incluyeron también receptáculos de placas con células solas -/+ HGF. El anticuerpo entero 5D5 de Genentech, que puede obtenerse en el mercado en la ATCC, como una estirpe celular de hibridoma, se introdujo como un control positivo agonista total, y luego se denominó m5D5. A continuación, las células se pulsaron con 0,25 pCi de [3H]Timidina (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden) durante 7 horas 30 minutos. La magnitud de [ HjTimidina incorporada en ácido tricloroacético-ADN insoluble se cuantificó por medio del recuento de centelleo líquido. Los resultados se expresan como información cpm no transformada a fin de evaluar mejor la potencial actividad agonista intrínseca que pudo producirse con Mab anti-c-Met agregados solos a células tumorales.

Los resultados descriptos en la Figura 9A demostraron que, como se esperaba, ni el control de isotipo ni el m224G1 1 exhibió ninguna actividad agonista sobre la proliferación de NCI-H441. El control de isotipo no tuvo efecto sobre la proliferación celular inducida por HGF, mientras que m224G11 mostró una inhibición del 66%, cuando se agregó en la concentración final de 10 pg/ml. El m5D5 utilizado como un control agonista mostró, como se esperaba, un efecto agonista dependiente de la dosis total, cuando se agregó solo a las células. Como ya se observó, el Mab [224G1 1] quim exhibió un efecto agonista dependiente de la dosis significativo, y se observó una menor actividad inhibitoria de esta forma quimérica: 19% en lugar de 66% para la forma murina. Cuando se agregaron solos, los tres Mab humanizados lgG1 demostraron efectos agonistas dependientes de la dosis, en comparación con la forma m224G11. [224G1 1] [Hz1], [224G1 1] [Hz2] y [224G11] [Hz3] tuvieron actividades antagonistas comparables de alrededor de 46, 30 y 35%. Estas actividades son significativamente inferiores a aquella observada para m224G1 1. En la Figura 9B, se ensayaron diversas formas quiméricas lgG1 . En comparación con la forma [224G11] quim, que exhibió un efecto agonista dependiente de la dosis cuando se agregó solo a células NCI-H441 , las formas [224G11] [MH quim], [224G11] [MUP9H quim], [224G11] [MMCH quim], [224G11] [TH7 quim] no tuvieron efecto agonista intrínseco significativo. Su actividad antagonista fue superior a la observada para el Mab m224G11 (57%), con inhibiciones que alcanzaron 79, 78, 84 y 93%, respectivamente, para [224G11] [MH quim], [224G11] [MUP9H quim], [224G11] [MMCH quim] y [224G11] [TH7 quim].

Ejemplo 9: Efecto in vitro de diversas formas lgG1 quiméricas y humanizadas del Mab 224G11.

Se cultivaron en forma rutinaria células NCI-H441 de ATCC, en medio RPMI 1640 (Invitrogen Corporation, Scotland, UK), 10% de FCS (Invitrogen Corporation), 1% de L-Glutamina (Invitrogen Corporation). Para los ensayos de proliferación, las células se dividieron tres días antes del uso, de modo de encontrarse en la fase confluente de crecimiento, antes de la colocación en las placas. Las células NCI-H441 se colocaron en placas de cultivo de tejido de 96 receptáculos a una densidad de 3,75 x 104 células/receptáculo, en 200 µ? de medio libre de suero (medio RPMI 1640 más 1% de L-Glutamina). Veinticuatro horas después de la colocación en las placas, se agregaron los anticuerpos por ser ensayados a NCI-H441 y se incubaron a 37°C durante 30 minutos, antes de agregar HGF en una concentración final de 400 ng/ml (5 nM), durante 142 horas adicionales. El rango de dosis ensayado para cada anticuerpo fue de 10 a 0,0097 pg/ml (concentración final en cada receptáculo). En este experimento, se agregó Mab lgG1 murino como un control negativo de fondo para la actividad agonista, y los anticuerpos ensayados fueron los siguientes: i) m224G11 , ii) sus formas quiméricas lgG1 humanas, identificadas, respectivamente, como [224G11] quim, [224G11] [TH7 quim], iii) sus formas lgG1 humanizadas, respectivamente, descriptas como [224G11] [TH7 Hz1], [224G11] [TH7 Hz3]. Se incluyeron también receptáculos de placas con células solas -/+ HGF. El anticuerpo entero 5D5 de Genentech, que puede obtenerse en el mercado en la ATCC, como una estirpe celular de hibridoma, se introdujo como un control positivo agonista total, y luego se denominó m5D5. A continuación, las células se pulsaron con 0,25 pCi de [3H]Timidina (Amersham Biosciences.AB, Uppsala, Sweden) durante 7 horas 30 minutos. La magnitud de [3H]Timidina incorporada en ácido tricloroacético-ADN insoluble se cuantifico por medio del recuento de centelleo líquido. Los resultados se expresan como información cpm no transformada a fin de evaluar mejor la potencial actividad agonista intrínseca que pudo producirse con Mab anti-c-Met agregados solos a células tumorales.

La Figura 10 muestra que Mab m224G11 exhibió el efecto inhibitorio habitual (74% de inhibición). La forma lgG1 quimérica [224G11] quim tuvo, como se esperaba, un efecto agonista intrínseco dependiente de la dosis, y un menor efecto antagonista, en comparación con la forma murina: 33% en comparación con 74% de inhibición. El [224G11] [TH7 quim] tuvo una actividad agonista muy débil en este experimento. Además, exhibió un alto efecto inhibitorio (81%), cercano a aquel observado para el Mab murino. Las dos formas humanizadas no tuvieron efecto agonista intrínseco, y tuvieron una actividad antagonista cercana a aquellas observadas para el Mab murino o el [224G11] [TH7 quim], respectivamente, con 67 y 76% de inhibición para [224G11] [TH7 Hz1] y [224G11] [TH7 Hz3].

Ejemplo 10: Cambio de isotipo para la región de bisagra [TH7] diseñada.

A fin de evaluar la modulación de las propiedades farmacológicas inducida por la secuencia de bisagra [TH7], que corresponde a PKSCDCHCPPCP, en espinazos de isotipos de inmunoglobulina diferentes del lgG1 humano, transferimos genéticamente la secuencia [TH7] descripta anteriormente a espinazos de lgG2 e lgG4 humanos. La modificación de la región de bisagra se efectuó mediante el intercambio de un fragmento de restricción {Nhe1 l-Bcl1} por la porción equivalente que portaba la modificación [TH7], donde el fragmento {Nhe1-Bcl1} fue sintetizado por medio de la síntesis genética global (Genecust, LU). Las etapas de clonación se llevaron a cabo de acuerdo con técnicas de biología molecular convencionales, como se describen en el manual de laboratorio (Sambrook and Russel, 2001), o de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Cada construcción genética fue validada por completo por el secuenciamiento de nucleótidos, usando el equipo de secuenciamiento de ciclos de terminador Big Dye (Applied Biosystems, US), y analizada usando un instrumento de análisis 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, US). Las secuencias resultantes se describen como SEC. ID. NROs.: 78; 79; 80 y 81 , para, respectivamente, las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de los isotipos lgG2 e lgG4 humanos diseñados con TH7 (solo cadena pesada; la cadena liviana fue idéntica a la c224G11/humana Ckappa utilizada para todas las otras construcciones a base de lgG1). Estas nuevas construcciones se aplicaron al Mab anti-c-Met 224G11 quimérico, tal como se describe con anterioridad en el Ejemplo 2.

Los correspondientes anticuerpos diseñados, c224G11[lgG2TH7] y c224G11[lgG4TH7] se produjeron como se describe con anterioridad, mediante la expresión transiente en células EBNA HEK293 adaptadas a la suspensión.

Ejemplo 11 : Evaluación de los Mab diseñados c224G11[lgG2TH7] y c224G11[lgG4TH7] en un ensayo ELISA específico de fosfo-c-Met y un ensayo BRET.

La bisagra TH7 también se introdujo en Mab 224G11 quiméricos lgG2 e lgG4 y se evaluó en el ensayo de fosforilación de receptor c-Met. Como se muestra en las Figuras 14 y 14B, c224G11[lgG2TH7] y c224G11[lgG4TH7] indujeron un leve efecto agonista solos, si bien significativamente más débil que el Mab c224G1 , y exhibieron un efecto antagonista comparable con la forma murina de Mab 224G11 (m224G11). Este resultado fue confirmado en el modelo BRET de activación de c-Met (Figura 15), donde c224G11[lgG2TH7] y c224G11[lgG4TH7] mostraron también un efecto agonista más débil que Mab C224G11.

En consecuencia la mutación de bisagra TH7 introducida en el formato de Mab lgG2 o lgG4 proporcionó anticuerpos funcionales con propiedades similares a c224G11[TH7].

Ejemplo 12: Ensayo de adhesión celular.

Se desprendieron células de cáncer de próstata PC3 de los discos, con tripsina, se lavaron tres veces con medio F12k libre de suero, y se resuspendieron en el mismo medio. Las células (100.000 células/receptáculo) se colocaron en placas de 96 receptáculos revestidas con laminina 1 , en una concentración de 1 µg/ml. Se agregaron simultáneamente las siguientes formas del Mab anti-CD151 por evaluar, en la concentración final de 10 µg/ml: el Mab lgG1 murino m214B2, la forma de anticuerpo lgG1 quimérico no modificado denominada C214B2, y la forma de anticuerpo lgG1 quimérico con la modificación TH7 denominada cTH7-214B2.

CD151 es una proteína de membrana que pertenece a la familia de tetraspaninas, y el Mab anti-CD151 214B2, producido por el hibridoma 1-3919, presentado en la CNCM el 21 de febrero de 2008, se describe en la Solicitud de Patente Publicada WO 2009/136070.

Se usaron los anticuerpos lgG1 murinos y humanos como anticuerpos de control de isotipo. Las condiciones finales fueron las siguientes: 100.000 células/receptáculo, y anticuerpos en concentraciones de 10 µg/ml. Después de una hora de incubación a 37°C, las placas se sacudieron y se lavaron dos veces con medio F12k libre de suero. Antes del análisis, se distribuyeron 00 µ? de medio F12k libre de suero en cada receptáculo. A fin de evaluar el efecto de ios anticuerpos sobre la adhesión celular, los receptáculos se fotografiaron bajo un microscopio de contraste de fases (Figura 16). A continuación, se determinó la cantidad de células adheridas usando un ensayo de ATP (Figura 17).

Los anticuerpos TH7-214B2 quimérico y 214B2 murino fueron capaces de modificar las interacciones de célula a célula (Figura 16) y de incrementar la adhesión celular PC3 de manera equivalente (Figura 17), mientras que no se observó ningún efecto con la forma quimérica no modificada de 214B2 (c214B2), comparable con el anticuerpo de control de isotipo lgG1 humano.

Claims (30)

REIVINDICACIONES Habiendo así especialmente descripto y determinado la naturaleza de la presente invención y la forma como la misma ha de ser llevada a la práctica, se declara reivindicar como de propiedad y derecho exclusivo:

1. Un proceso para mejorar la actividad antagonista de un anticuerpo monoclonal dirigido contra una molécula blanco específica, o un fragmento funcional divalente o derivado de dicho anticuerpo, donde dicho anticuerpo es capaz de inhibir una o más de las actividades biológicas de dicha molécula blanco, donde dicho proceso comprende una etapa de reconfiguración de la región de bisagra, que consiste en una modificación de la secuencia de aminoácidos de dicha región de bisagra mediante la eliminación, la adición o la sustitución de por lo menos un aminoácido.

2. El proceso de la reivindicación 1 , donde dicha modificación se selecciona de: i) la eliminación de por lo menos un aminoácido de dicha secuencia de aminoácidos de región de bisagra; y/o ii) la adición de por lo menos un puente de disulfuro en dicha región de bisagra.

3. El proceso de la reivindicación 2, donde la modificación i) consiste en la eliminación de, como máximo, 2, 3 ó 4 aminoácidos de dicha secuencia de aminoácidos de región de bisagra.

4. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo divalente.

5. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo quimérico.

6. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humanizado.

7. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humano.

8. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicho anticuerpo monoclonal es un lgG1.

9. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 8, donde dicha molécula blanco es un receptor de transmembrana.

10. El proceso de la reivindicación 9, donde dicho receptor de transmembrana se selecciona del grupo que consiste en los receptores de tirosina quinasa, tetraspanina y GPCR.

11. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 10, donde dicha modificación consiste en por lo menos una eliminación de un aminoácido seleccionado del aminoácido en la posición H1 , H2, H3, H5, H6, H7, H8, H9, H11 , H12 o H14.

12. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 10, donde dicha modificación consiste en por lo menos una eliminación de un aminoácido en la región de "bisagra superior", ubicado entre las posiciones H1 y H9 de dicha secuencia de aminoácidos de región de bisagra.

13. El proceso de las reivindicaciones 1 a 12, donde dicha modificación consiste en la eliminación de por lo menos una cisteína en la región de "bisagra superior", ubicada, preferentemente, en la posición H4.

14. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 12, donde dicha modificación consiste en la introducción de por lo menos una cisterna en la región de "bisagra superior".

15. El proceso de la reivindicación 14, donde dicha modificación consiste en la sustitución de la treonina en la posición H7 en la región de "bisagra superior", por una cisteína.

16. El proceso de la reivindicación 14, donde dicha modificación consiste en la sustitución de la lisina en la posición H6 en la región de "bisagra superior", por una cisteína.

17. El proceso de la reivindicación 14, donde dicha modificación consiste en la sustitución de la prolina en la posición H1 en la región de "bisagra superior", por una cisteína.

18. El proceso de la reivindicación 14, donde dicha modificación consiste en la sustitución de la lisina en la posición H2 en la región de "bisagra superior", por una cisteína.

19. El proceso de la reivindicación 14, donde dicha modificación consiste en la sustitución de la serina en la posición H3 en la región de "bisagra superior", por una cisteína.

20. El proceso de la reivindicación 14, donde dicha modificación consiste en la sustitución del aspartato en la posición H5 en la región de "bisagra superior", por una cisteína.

21. El procesó de la reivindicación 14, donde dicha modificación consiste en la sustitución de la histidina en la posición H8 en la región de "bisagra superior", por una cisteína.

22. El proceso de la reivindicación 14, donde dicha modificación consiste en la sustitución de la treonina en la posición H9 en la región de "bisagra superior", por una cisteína.

23. El proceso de las reivindicaciones 1 a 10, donde dicha modificación consiste en un reemplazo de los aminoácidos H1 a H14 de la región de bisagra de lgG1 , por los aminoácidos H1 a H14 de una región de bisagra de lgG2, cuando dicho anticuerpo monoclonal cuya actividad antagonista se desea mejorar es un lgG1.

24. Un proceso para la identificación sistemática de un anticuerpo monoclonal antagonista dirigido contra una molécula blanco específica, o un fragmento funcional divalente o derivado de dicho anticuerpo, donde dicho anticuerpo es capaz de inhibir una o más de las actividades biológicas de dicha molécula blanco, donde dicho proceso comprende las etapas de: (a) la selección de un anticuerpo inicial con un nivel inicial de inhibición de dichas una o más actividades biológicas de dicha molécula blanco; (b) la modificación de la secuencia de aminoácidos de la región de bisagra de dicho anticuerpo inicial, por medio del proceso de una de las reivindicaciones 1 a 23; (c) la evaluación del anticuerpo modificado de la etapa (b), a fin de establecer su capacidad para inhibir dichas una o más actividades biológicas de dicha molécula blanco; y (d) la selección, como un resultado positivo, del anticuerpo de la etapa (c) con un nivel de inhibición de dichas una o más actividades biológicas de dicha molécula blanco, superior al nivel inicial de dicha inhibición.

25. Un anticuerpo monoclonal dirigido contra una molécula blanco especifica, o fragmentos funcionales divalentes o derivados de dicho anticuerpo, que se obtiene por medio del proceso de una de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos de región de bisagra seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. NRO. 1 (PRDCGCKPCICT), SEC. ID. NRO. 2 (PKSCGCKPCICT), SEC. ID. NRO. 3 (PKSCGCKPCICP), SEC. ID. NRO. 4 (PRDCGCKPCPPCP), SEC. ID. NRO. 5 (PRDCGCHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 6 (PKSCDCHCPPCP), SEC. ID. NRO. 7 (RKCCVECPPCP), SEC. ID. NRO. 22 (CKSCDKTHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 23 (PCSCDKTHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 24 (PKCCDKTHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 25 (PKSCCKTHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 26 (PKSCDCTHTCPPCP) SEC. ID. NRO. 27 (PKSCDKCHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 28 (PKSCDKTCTCPPCP), ;SEC. ID. NRO. 29 (PKSCDKTHCCPPCP), SEC. ID. NRO. 30 (PKSCDKTHTCCPCP), SEC. ID. NRO. 31 (PKSCDKTHTCPCCP), SEC. ID. NRO. 32 (PKSCDKTHTCPPCC), SEC. ID. NRO. 33 (PSCDKTHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 34 (PKSCDTHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 35 (PKSCDKTHCPPCP), SEC. ID. NRO. 36 (KCDKTHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 37 (PSCKTHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 38 (PKSCDTHCPPCP), SEC. ID. NRO. 39 (PKSCTHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 40 (PKSCDKTTCPCP), SEC. ID. NRO. 41 (PKSCDKTHCPPC), SEC. ID. NRO. 42 (PKSCDCHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 43 (PKSCDCTHCPPCP), SEC. ID. NRO. 44 (PCSCKHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 45 (PSCCTHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 46 (PSCDKHCCPPCP), SEC. ID. NRO. 47 (PKSTHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 48 (PKSCTCPPCP) o SEC. ID. NRO. 49 (PKSCDKCVECPPCP).

26. Un anticuerpo monoclonal, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. NRO. 1 (PRDCGCKPCICT), SEC. ID. NRO. 2 (PKSCGCKPCICT), SEC. ID. NRO. 3 (PKSCGCKPCICP), SEC. ID. NRO. 4 (PRDCGCKPCPPCP), SEC. ID. NRO. 5 (PRDCGCHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 6 (PKSCDCHCPPCP), SEC. ID. NRO. 7 (RKCCVECPPCP), SEC. ID. NRO. 22 (CKSCDKTHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 23 (PCSCD THTCPPCP), SEC. ID. NRO. 24 (PKCCDKTHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 25 (PKSCCKTHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 26 (PKSCDCTHTCPPCP) SEC. ID. NRO. 27 (PKSCDKCHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 28 (PKSCDKTCTCPPCP), SEC. ID. NRO. 29 (PKSCDKTHCCPPCP), SEC. ID. NRO. 30 (PKSCDKTHTCCPCP), SEC. ID. NRO. 31 (PKSCDKTHTCPCCP), : SEC. ID. NRO. 32 (PKSCDKTHTCPPCC), SEC. ID. NRO. 33 (PSCDKTHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 34 (PKSCDTHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 35 (PKSCDKTHCPPCP), SEC. ID. NRO. 36 (KCDKTHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 37 (PSCKTHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 38 (PKSCDTHCPPCP), SEC. ID. NRO. 39 (PKSCTHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 40 (PKSCDKTTCPCP), SEC. ID. NRO. 41 (PKSCDKTHCPPC), SEC. ID. NRO. 42 (PKSCDCHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 43 (PKSCDCTHCPPCP), SEC. ID. NRO. 44 (PCSCKHTCPPCP),;SEC. ID. NRO. 45 (PSCCTHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 46 (PSCDKHCCPPCP), SEC. ID. NRO. 47 (PKSTHTCPPCP), SEC. ID. NRO. 48 (PKSCTCPPCP) o SEC. ID. NRO. 49 (PKSCDKCVECPPCP).

27. Un anticuerpo monoclonal de una de las reivindicaciones 25 y 26, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo humano.

28. Un anticuerpo monoclonal de una de las reivindicaciones 25 a 27, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo lgG1.

29. Un ácido nucleico aislado que codifica para un anticuerpo monoclonal de las reivindicaciones 25 a 28.

30. Un ácido nucleico aislado de la reivindicación 29, : donde dicho ácido nucleico comprende una secuencia nucleica seleccionada del grupo que consiste en SEC. ID. NRO. 15 a SEC. ID. NRO. 21 y SEC. ID. NRO. 50 a SEC. ID. NRO. 77.