KR20160120307A - 키메라 항원 수용체 및 제조방법 - Google Patents

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애나 베아트리즈 코른골드
브라이언 에이. 라비노비치
하지트 싱
시몬 올리바레스
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Abstract

키메라 항원 수용체 (CAR)를 생성하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, CAR의 라이브러리 스크리닝은 항원-결합 도메인(예: scFv 영역), 힌지 영역 및 엔도도메인을 인코딩하는 벡터의 라이브러리로부터의 벡터의 무작위 부착으로부터 CAR을 인코딩하는 벡터를 생성함으로써 수행된다. 일부 구현예에서, 벡터는 트랜스포손을 함유한다.

Description

키메라 항원 수용체 및 제조방법{CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS AND METHODS OF MAKING}
본원은 하기의 이점을 주장한다: 미국 가출원 제 61/940,339호(2014년 2월 14일에 출원), 이의 전체는 본원에 참고로 인용되어 있다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 의학 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 이는 키메라 항원 수용체(CAR)를 생성하는 방법에 관한 것이다.
관련 기술의 설명
입양 T 세포 전달은 암 치료를 위해 사용될 수 있는 유망한 치료학적 접근법이다. 입양 T 세포 전달은 종양 세포를 선택적으로 죽일 수 있는 항원-특이적 T 세포를 단리시키고 확대시킴을 포함한다. 일반적으로, T 세포는 대상체로부터 제거되고, 시험관내에서 배양된다. 키메라 항원 수용체(CAR)는 항원의 발현에 기초하여 종양 세포를 선택적으로 죽이기 위해 대상체에 재도입되면, T 세포를 지시하기 위해 시험관내 T 세포로 도입될 수 있다(예: Wieczorek 등 2013; Berry 등, 2013).
입양 T 세포 전달과 관련된 하나의 문제는, 예를 들면, 특정 암을 치료하기 위한 환자의 특정 집단에서 보다 효과적으로 작동할 수 CAR 사이에 상당한 변동성이 존재한다는 것이다. 암에 대한 치료학적 활성을 나타낼 수 있는 잠재적으로 생성될 수 있는 잠재적인 상이한 CAR의 매우 다수로 인해, 현재 임상의는 CAR가 소정의 암 또는 암의 아형에 대하여 치료학적 활성을 나타낼 수 있음을 예상하기가 매우 어렵다. 입양 T 세포 전달의 중요한 치료학적 가능성에 기인하여, 새로운 CAR을 동정하고 생성하기 위한 개선된 방법이 명백하게 필요하다.
발명의 요약
본 발명은, 일부 측면에서, CAR의 생성 방법을 제공하고, 특정 CAR이 제공된다. 일부 측면에서, 특정 암 또는 암의 아형에 대한 활성에 대해 스크리닝될 수 있는 다수의 CAR을 생성하기 위한 방법이 제공되고; 이러한 방식으로, 특정 암 또는 암의 아형에 대한 개선된 치료학적 가능성을 나타낼 수 있는 CAR이 생성되고 동정될 수 있다. 본원에 제공된 CAR은, 예를 들면, 암을 치료하기 위해 대상체 또는 인간 환자에게 치료학적으로 투여될 수 있다.
임상 데이터는, 소장의 종양 관련 항원(TAA)으로 T 세포를 표적화하는 특정의 키메라 항원 수용체(CAR) 설계가 상이한 환자에서 가변적인 치료학적 가능성을 가질 수 있음을 입증한다. 예를 들면, 키메라 CD28/CD3제타 또는 CD137/CD3-제타를 통해 활성화된 제2 세대 CD19-특이적 CAR은 자가 유전자 변형 T 세포가 만성 B-혈통 백혈병보다 급성 환자에게 투여될 때 우수한 임상적 반응을 나타낼 수 있다. 이 문제를 해결하기 위해, 소정의 종양에 대한 개선된 항-종양 효과를 나타낼 수 있는 CAR 종을 생성하는 방법이 본원에 제공된다.
예를 들면, 소정의 환자로부터 암을 치료하는 이들의 능력에 대해 다수의 CAR을 생성하고 스크리닝하기 위해 사용될 수 있는 방법이 제공되고; 이러한 방식으로, 상기 방법은 환자를 위한 치료를 개인화하고 특정 암을 갖는 특정 환자 또는 환자의 서브세트를 위한 개선된 치료학적 가능성을 나타내는 특정 CAR을 선택하기 위해 사용될 수 있다. 유전자 치료의 임상적 접근법은, 예를 들면, 환자의 작은 서브세트를 위한 개별적 CAR 설계를 제조하기 위한 비용 및 복잡성을 감소시키기 위해 슬리핑 뷰티(SB) 트랜스포손 시스템으로부터 DNA 플라스미드의 전자 수송을 이용할 수 있다. CAR+ T 세포를 개인화하기 위한 이러한 방법은 소정의 환자에 이익을 줄 수 있는 이들의 능력을 스크리닝하고 평가할 수 있는 다수의 CAR 분자의 생성을 이용할 수 있다.
일부 측면에서, 삼중 부위 특이적 재조합 시스템(또한, "EZ-CAR" 플랫폼으로서 칭명됨)을 사용하여CAR 분자의 높은 처리량 어셈블리 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 (i) 특이성을 규정하는 단일 쇄 가변 단편(scFv), (ii) 세포 표면으로부터 scFv를 부가하는 스캐폴드/힌지 및 (iii) 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인으로부터 원형 CAR의 3 성분의 신속한 조합을 가능하게 할 수 있다. 예를 들면, 이하 실시예에서 나타낸 바와 같이, 키메라 CD28/CD3-제타를 통해 활성화된 CD19-특이적 CAR은 EZ CAR 플랫폼을 임상적 등급 CD19RCD28mξ CAR+ T 세포(CG CAR)와 함께 사용하여 생성되었다.
일부 구현예에서, 본원에 제공되거나 본 발명에 따르는 방법에 의해 생성된 CAR은 막 결합 IL-15를 갖는 T 세포에서 공동 발현될 수 있다. 이러한 방식으로, T 세포는 시험관내 또는 생체내에서 유의한 증식 없이 정지 상태로 생존하거나 존재할 수 있다. 대조적으로, 이미 기재된 바와 같이, CAR를 발현시키는 T-세포는 전형적으로 사이토카인이 시험관내에서 인출될 때 죽을 것이고, 이 세포사는 T 세포가 임상적으로 투여될 때 특정 경우에 안전 기능으로서 작용할 수 있다. T 세포 증식은 전형적으로 자율적 세포 검정을 사용하여 측정된다. 따라서, T 세포가 항원 자극 없이 시험관내에서 존속할 수 없는 특정의 이전에동정된 CAR과 대조적으로, 시험관내에서 자율적 증식 없이 세포독성을 유도할 수 있는 CAR이 본원에서 제공된다. 목적하는 특정 구현예에 따라서, 본 발명의 방법에 의해 제조되거나 본원에 제공된 CAR은 막 결합 IL-15의 T 세포에서 공동-발현의 존재 또는 부재하에 T 세포에서 발현될 수 있다.
본 발명의 측면은 하기를 포함하는 조성물에 관한 것이다: (a) 하나 이상의 별개의 항원 결합 도메인을 인코딩하는 제1 벡터의 다수; (b) 하나 이상의 별개의 힌지 도메인을 인코딩하는 제2 벡터의 다수; 및 (c) 하나 이상의 별개의 엔도도메인을 인코딩하는 제3 벡터의 다수; 여기서, 상기 제1, 제2 및 제3 벡터 중 적어도 두 개는 각각 별개의 항원 결합 도메인, 힌지 도메인 및/또는 엔도도메인을 인코딩하는 둘 이상의 벡터의 다수를 포함하고, 추가로 상기 벡터는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 제4 벡터의 생성을 가능하게 하는 상동 재조합 부위를 포함한다.
본 발명에서, 단백질 도메인 및 폴리펩티드, 예를 들면, 항원 결합 도메인, 힌지 도메인, 막관통 도메인 및 엔도도메인을 참조로 사용된 바와 같이, 용어 "별개의"는 상이한 폴리펩티드 (아미노산) 서열을 갖고, 포함하거나 이들로 이루어진 도메인을 의미한다. 예를 들면, 두 개의 "별개의" 항원 결합 도메인은 동일한 항원(사실, 심지어 그 항원 상의 동일한 에피토프)에 결합할 수 있지만; 항원 결합 도메인은, 그들의 연속 아미노산 조성물이 서로 상이할 경우, "별개이다". 마찬가지로, 연속 아미노산 조성이 상이한 두 개의 "별개의" 항원 결합 도메인은 또한 상이한 항원 및 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 반대로, 본원에 사용된 바와 같이, 동일한 아미노산 서열의 두 분자 (폴리펩티드)는 "별개의" 폴리펩티드가 아니다.
일부 구현예에서, 제1 벡터의 다수는 별개의 항원 결합 도메인의 다수를 인코딩하고, 제2 벡터의 다수는 하나의 힌지 도메인을 인코딩하고, 제3 벡터의 다수는 별개의 엔도도메인의 다수를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 제1 벡터의 다수는 별개의 항원 결합 도메인의 다수를 인코딩하고, 제2 벡터의 다수는 별개의 힌지 도메인의 다수를 인코딩하고, 제3 벡터의 다수는 별개의 엔도도메인의 다수를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 제1 벡터의 다수는 별개의 항원 결합 도메인의 다수를 인코딩하고, 제2 벡터의 다수는 별개의 힌지 도메인의 다수를 인코딩하고, 제3 벡터의 다수는 하나의 엔도도메인을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 제1 벡터의 다수는 하나의 항원 결합 도메인을 인코딩하고, 제2 벡터의 다수는 별개의 힌지 도메인의 다수를 인코딩하고, 제3 벡터의 다수는 별개의 엔도도메인의 다수를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하거나 scFv로 이루어진다. 제3 벡터는 막관통 도메인을 인코딩할 수 있다. 제2 벡터는 막관통 도메인을 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 막관통 도메인을 인코딩하는 제5 벡터의 다수를 추가로 포함하고; 여기서, 상기 제1 벡터, 제2 벡터, 제3 벡터 및 제4 벡터는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 제4 벡터를 생성하기 위한 상동 재조합 부위를 포함한다. 제1 벡터는 상동 제조합의 제1 서열 및 제2 부위를 포함할 수 있다. 제2 벡터는 상동 조합의 제2 서열 및 상동 재조합을 제3 서열을 포함할 수 있다. 제3 벡터는 상동 재조합의 제3 서열 및 상동 재조합의 제4 서열을 포함할 수 있다. 제3 벡터는 상동 재조합의 제3 서열 및 상동 재조합의 제4 서열을 포함할 수 있다. 제4 벡터는 상동 재조합의 제1 서열 및 상동 재조합의 제4 서열을 포함한다. 제1 벡터, 제2 벡터 및/또는 제3 벡터는 트랜스포사제를 인코딩할 수 있다. 트랜스포사제는 연어과 형태 Tc1-형 트랜스포사제(SB)일 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 벡터, 제2 벡터, 제3 벡터, 제4 벡터 및/또는 제5 벡터 중의 1, 2, 3, 4개 또는 모두는 슬리핑 뷰티(SB) 또는 피기백 (piggyback) 트랜스포손 벡터이다. 또는, 일부 구현예에서, 제1 벡터, 제2 벡터, 제3 벡터, 제4 벡터 및/또는 제5 벡터는 슬리핑 뷰티(SB) 또는 피기백 트랜스포손 벡터가 아니고; 예를 들면, 일부 구현예에서, CAR은 슬리핑 뷰티(SB) 또는 피기백 벡터를 사용하지 않고 생성될 수 있고, 이어서, CAR은 후속적으로 T 세포(예를 들면, 예를 들면, 문헌(참조: Singh 등,)에 기재된 바와 같이 슬리핑 뷰티(SB)에 삽입된)를 형질감염시키기에 적합한 벡터에 삽입될 수 있다 2015). 그럼에도 불구하고, 일부 구현예에서, T 세포를 형질감염시키기에 적합한 벡터에 이미 존재하는 CAR를 생성하는 것은 공정을 단순화할 수 있거나 CAR의 생성 및 T 세포의 형질감염 둘 다를 위해 필요한 단계의 수를 감소시킬 수 있다. 별개의 항원 결합 도메인은 선택적으로 상이한 항원에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 별개의 항원 결합 도메인은 선택적으로 동일한 항원에 결합할 수 있다. 항원 결합 도메인은 선택적으로 CD19, 범용 항원 (마우스), HER-3, GD2, Gp75, CS1 단백질, 메소텔린, 포스파티딜세린, cMyc, CD22, CD4, CD44v6, CD45, CD28, CD3, CD3e, CD123, CD138, CD52, CD56, CD74, CD30, Gp75, CD38, CD33, CD20, Her1/HER3 융합, GD2, 탄수화물, 아스페르길루스( Aspergillus ), ROR1, c-MET, EGFR, 덱틴, 에볼라, 진균, GP, HERV-K (HERVK), NY-ESO-1, VEGF-R2, TGF-b2R, IgG4, 비오틴 또는 O-AcGD2에 결합할 수 있다. 별개의 항원 결합 도메인은 scFv로 이루어지거나 scFv를 포함할 수 있다. 힌지 영역은 12 AA 펩티드 (GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCT; 서열번호 1), t-20 AA 펩티드, IgG4 Fc Δ EQ, IgG4 Fc Δ Q, (t-12AA + t-20AA), mKate, phiLov, dsRed, Venus, eGFP, CH3 HA, (CD8 α + t-20AA), 이중 t-20 AA, (t-20AA + CD8α), (CD8α + 류신 지퍼 Basep1), (CD8α + 류신 지퍼 Acid1), 2D3, CD8 α 또는 IgG4 Fc로 이루어지거나 이들을 포함할 수 있다. 엔도도메인 중 적어도 하나는 CD3ξ를 포함할 수 있다. 엔도도메인 중 적어도 하나는 하나 이상의 ITAM 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 엔도도메인 중 적어도 하나는 (CD28 +CD3ξ), (CD28 +CD27 + CD3ξ), (CD28 + OX40 + CD3ξ), (CD28 + 4-1BB + CD3ξ), (CD28 + CD27 + OX40 + CD3ξ), (CD28 + 4-1BB + CD27 + CD3ξ), (CD28 + 4-1BB + OX40 + CD3ξ), (4-1BB + CD3ξ), (4-1BB + OX40 + CD3ξ), (4-1BB + CD27 +CD3ξ), (CD27 + CD3ξ), (CD27 + OX 40 + CD3ξ), (CD28Δ +CD3ξ), (CD28Δ +CD27 + CD3ξ), (CD28Δ + OX40 + CD3ξ), (CD28Δ + 4-1BB + CD3ξ), (CD28Δ + 4-1BB + OX40 + CD3ξ), (CD28Δ + CD27 + OX40 + CD3ξ), (CD28Δ + 4-1BB + CD27 + CD3ξ), (4-1BB + ICOS + CD3ξ), (CD28 + ICOS + CD3ξ), (ICOS + CD3ξ), CD3ξ 또는 CD28 단독을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은, 예를 들면, iQueTM 스크리너(IntelliCyt, Albuquerque, NM)를 사용하여 활성에 대해 시험될 수 있다. 일부 구현예에서, CAR은, 예를 들면, 유동 세포 분석법과 같은 기술을 사용하여 T 세포와 같은 세포에서 발현될 때, 하나 이상의 특성(예: 생존율, 활성화 신호의 상향조절, CD25의 상향조절, 사이토카인 방출 및/또는 세포 사멸)에 대해 평가될 수 있다.
본 발명의 또 하나의 측면은 별개의 항원 결합 도메인, 힌지 도메인 및 엔도 도메인의 다수를 인코딩하는 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 벡터의 집합을 포함하는 조성물로서, 상기 집합의 벡터가 상기 도메인에 대해 무작위화되는, 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 하나의 측면은 (i) 본 발명의 벡터의 다수를 포함하는 조성물(예를 들면, 상기 기재된 바와 같음)을 수득하는 단계; 및 (ii) 상기 조성물을 별개의 항원 결합 도메인, 힌지 도메인 및/또는 엔도도메인이 제4 벡터의 다수를 제조하기 위한 상동 재조합을 통해 재조합하기 위해 상기 벡터에 포함되거나 상기 벡터에 의해 인코딩되도록 하기에 충분한 조건에 적용하는 단계를 포함하여 각각 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 다수의 벡터를 생성하는 방법으로서, 상기 제4 벡터가 각각 CAR을 인코딩하는, 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 세포에서 CAR을 발현시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 CAR을 활성에 대해 시험하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 벡터 중 하나 이상은 scFv 영역을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 제3 벡터 중 하나 이상은 막관통 도메인을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 제2 벡터 중 하나 이상은 막관통 도메인을 인코딩한다. 상기 방법은 상기 제4 벡터를 형성하기 위해 상기 제1 벡터, 제2 벡터 및 제3 벡터와 막관통 도메인을 인코딩하는 제5 벡터의 재조합에 의해 무작위로 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제1 벡터 및 상기 제2 벡터는 별개의 scFv 영역의 다수 및 별개의 힌지 영역의 다수를 인코딩하는 다수의 벡터로부터 무작위로 부착된다. 일부 구현예에서, 상기 제1 벡터 및 상기 제3 벡터는 별개의 scFv 영역의 다수 및 별개의 엔도도메인의 다수를 인코딩하는 다수의 벡터로부터 무작위로 부착된다. 일부 구현예에서, 상기 제2 벡터 및 상기 제3 벡터는 별개의 힌지 영역의 다수 및 별개의 엔도도메인의 다수를 인코딩하는 다수의 벡터로부터 무작위로 부착된다. 일부 구현예에서, 상기 제1 벡터, 상기 제2 벡터 및 상기 제3 벡터는 별개의 scFv 영역의 다수, 별개의 힌지 영역의 다수 및 별개의 엔도도메인의 다수를 인코딩하는 다수의 벡터로부터 무작위로 부착된다. 방법은 CAR을 인코딩하는 상기 제4 벡터를 형성하기 위해, 다수의 scFv 영역을 인코딩하는 벡터의제1 라이브러리로부터 상기 제1 벡터의 무작위 부착, 다수의 scFv 영역을 인코딩하는 벡터의 제2 벡터로부터 상기 제2 벡터의 무작위 부착 및 다수의 엔도도메인을 인코딩하는 벡터의 제3 라이브러리로부터 상기 제3 벡터의 무작위 부착에 의해 상기 제4 벡터를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 제1 벡터는 상동 재조합의 제1 서열 및 제2 부위를 포함할 수 있다. 제2 벡터는 상동 재조합의 제2 서열 및 상동 재조합의 제3 서열을 포함할 수 있다. 제3 벡터는 상동 재조합의 제3 서열 및 상동 재조합의 제4 서열을 포함할 수 있다. 제3 벡터는 상동 재조합의 제3 서열 및 상동 재조합의 제4 서열을 포함할 수 있다. 제4 벡터는 상동 재조합의 제1 서열 및 상동 재조합의 제4 서열을 포함할 수 있다. 제1 벡터, 제2 벡터 및/또는 제3 벡터는 트랜스포사제를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 제6 벡터는 트랜스포사제를 인코딩하고, 여기서 상기 방법은 상기 제4 벡터 및 상기 제6 벡터 중의 하나 이상을 세포에 도입하고 전기천공하거나 형질감염시키는 단계를 포함한다. 트랜스포사제는 연어과 형태 Tc1-형 트랜스포사제(SB)일 수 있다. 방법은 CAR 발현 T 세포의 확대를 자극할 수 있는 인공 항원 제시 세포(aAPC)의 존재하에 CAR로 형질감염된 세포를 배양하거나 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, scFv 영역, 힌지 영역 및 엔도도메인 각각은 각각 슬리핑 뷰티(SB) 또는 피기백 트랜스포손 벡터에서 인코딩된다. 일부 구현예에서, 제1 벡터, 제2 벡터 및/또는 제3 벡터 각각은 복수의 별개의 scFv 영역, 힌지 영역 및 엔도도메인을 인코딩하는 다수의 벡터로부터의 상기 재조합에 의해 무작위로 부착된다. 일부 구현예에서, 상기 제1 벡터, 제2 벡터 및 제3 벡터는 각각 트랜스포손을 함유하고; 여기서 상동 재조합을 통한 상기 부착은 부위 특이적 재조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 벡터 및 제2 벡터는 각각 제1 상동 재조합 부위를 갖고; 여기서 제2 벡터및 제3 벡터는 각각 제2 상동 재조합 부위를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 벡터는 제3 재조합 부위를 갖고, 여기서 제4 벡터는 제4 재조합 부위를 갖고, 제3 재조합 부위 및 제4 재조합 부위는 세포에서 상동 재조합을 가능하게 할 수 있다. 세포는, 예를 들면, 알파 베타 T 세포, 감마 델타 T 세포 또는 NK 세포 또는 NKT 세포와 같은 T 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는, 예를 들면, 줄기 세포 또는 유도 다능성 줄기 세포와 같은 다능성 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 줄기 세포, 유도 다능성 줄기 세포 또는 줄기 세포로부터 유도된다. 세포는 유도 다능성 줄기 세포로부터 유도된 T 세포 또는 NK 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 별개의 항원 결합 도메인은 상이한 항원을 선택적으로 인식하는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 별개의 항원 결합 도메인은 동일한 항원을 선택적으로 인식하는(즉, 특이적으로 결합하는) 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 선택적으로 (특이적으로) CD19, 범용 항원 (마우스), HER-3, GD2, Gp75, CS1 단백질, 메소텔린, 포스파티딜세린, cMyc, CD22, CD4, CD44v6, CD45, CD28, CD3, CD3e, CD123, CD138, CD52, CD56, CD74, CD30, Gp75, CD38, CD33, CD20, Her1/HER3 융합, GD2, 탄수화물, 아스페르길루스, ROR1, c-MET, EGFR, 덱틴, 에볼라, 진균, GP, HERV-K, NY-ESO-1, VEGF-R2, TGF-b2R, IgG4, 비오틴 또는 O-AcGD2에 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하거나 scFv로 이루어진다. 힌지 영역은 12 AA 펩티드 (GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCT, 서열번호 1), t-20 AA 펩티드, IgG4 Fc Δ EQ, IgG4 Fc Δ Q, (t-12AA + t-20AA), mKate, phiLov, dsRed, Venus, eGFP, CH3 HA, (CD8 α + t-20AA), 이중 t-20 AA, (t-20AA + CD8α), (CD8α + 류신 지퍼 Basep1), (CD8α + 류신 지퍼 Acid1), 2D3, CD8 α 또는 IgG4 Fc를 인코딩할 수 있다. 엔도도메인은 CD3ξ를 인코딩할 수 있다. 엔도도메인은 하나 이상의 ITAM 도메인을 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 엔도도메인은 (CD28 +CD3ξ), (CD28 +CD27 + CD3ξ), (CD28 + OX40 + CD3ξ), (CD28 + 4-1BB + CD3ξ), (CD28 + CD27 + OX40 + CD3ξ), (CD28 + 4-1BB + CD27 + CD3ξ), (CD28 + 4-1BB + OX40 + CD3ξ), (4-1BB + CD3ξ), (4-1BB + OX40 + CD3ξ), (4-1BB + CD27 +CD3ξ), (CD27 + CD3ξ), (CD27 + OX 40 + CD3ξ), (CD28Δ +CD3ξ), (CD28Δ +CD27 + CD3ξ), (CD28Δ + OX40 + CD3ξ), (CD28Δ + 4-1BB + CD3ξ), (CD28Δ + 4-1BB + OX40 + CD3ξ), (CD28Δ + CD27 + OX40 + CD3ξ), (CD28Δ + 4-1BB + CD27 + CD3ξ), (4-1BB + ICOS + CD3ξ), (CD28 + ICOS + CD3ξ), (ICOS + CD3ξ), CD3ξ 또는 CD28 단독을 인코딩한다. 일부 구현예에서, CAR은, 예를 들면, iQueTM 스크리너(IntelliCyt, Albuquerque, NM)를 사용하여 활성에 대해 시험될 수 있다. 일부 구현예에서, CAR은, 예를 들면, 유동 세포 분석법과 같은 기술을 사용하여 T 세포와 같은 세포에서 발현될 때, 하나 이상의 특성(예: 생존율, 활성화 신호의 상향조절, CD25의 상향조절, 사이토카인 방출 및/또는 세포 사멸)에 대해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 활성은 암 세포에 선택적으로 결합하고, 병원균에 선택적으로 결합하고, 자가면역 질환에 관련된 세포에 선택적으로 결합하거나, T-세포의 활성화, T 세포의 파괴, T 세포의 분화, T 세포의 증식, T 세포의 탈-분화, T-세포의 이동, T 세포에 의한 사이토카인 생산 또는 T 세포에 의한 사멸을 촉진시키는 CAR의 능력을 포함한다.
일부 구현예에서, 암 세포는 난소암, 림프종, 신장 세포 암종, B-세포 악성 종양, CLL, B-ALL, ALL, 백혈병, B-세포 악성 종양 또는 림프종, 외피 세포 림프종, 무통성 B-세포 림프종, 호지킨 림프종, AML, 자궁경부암, 유방암, 결장직장암, 난소암, 신경아세포종, 피부암, 흑색종, 폐암, 골육종, 신경교종, 상피 유래 종양, 전립선암 또는 소아암이다. 병원균은 바이러스, 진균 또는 세균일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 시험은 단일 세포 이미징, 단일 세포 유전학, 단일 T 세포 또는 T 세포 집단의 평가; 특이적 사멸 또는 일련의 사멸, 유전자 발현, 단백질 발현, 표적을 향한 또는 표적으로부터의 이동, 증식, 활성화 유도 세포사, 사이토카인의 분비 또는 케모카인의 분비의 측정을 포함한다. 방법은 단일 CAR의 특성에 기초하여 상기 다수의 벡터로부터 단일 CAR을 선택하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 방법은 단일 CAR을 대상체에게 치료학적으로 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대상체는, 예를 들면, 인간과 같은 포유동물일 수 있다.
본 발명의 또 하나의 측면은 다음과 같은 CAR들을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드에 관한 것이다. CAR 217 (서열번호 2), CAR 194 (서열번호 3), CAR 212 (서열번호 4), CAR 213 (서열번호 5), CAR 265 (서열번호 6), CAR 214 (서열번호 56), CAR 215(서열번호 57), CAR 216 (서열번호 58), CAR 218 (서열번호 59), CAR 193 (서열번호 55) 또는 CAR 268 (서열번호 7).
본 발명의 또 하나의 측면은 CAR 217 (서열번호 2), CAR 194 (서열번호 3), CAR 212 (서열번호 4), CAR 213 (서열번호 5), CAR 265 (서열번호 6), CAR 214 (서열번호 56), CAR 215(서열번호 57), CAR 216 (서열번호 58), CAR 218 (서열번호 59), CAR 193 (서열번호 55) 또는 CAR 268 (서열번호 7)을 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드를 발현시키는 형질전환된 T 세포에 관한 것이다. 세포는 불멸화된 세포일 수 있다. T 세포는 알파 베타 T 세포, 감마 델타 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 줄기 세포, 면역계 세포를 포함하는 줄기 세포 유래 세포일 수 있다.
본 발명의 또 하나의 측면은 본 발명의 형질전환된 T 세포를 포함하는 약제학적 제제에 관한 것이다.
본 발명의 또 하나의 측면은 CAR 217 (서열번호 2), CAR 194 (서열번호 3), CAR 212 (서열번호 4), CAR 213 (서열번호 5), CAR 265 (서열번호 6), CAR 214 (서열번호 56), CAR 215(서열번호 57), CAR 216 (서열번호 58), CAR 218 (서열번호 59), CAR 193 (서열번호 55) 또는 CAR 268 (서열번호 7)을 포함하거나 이들로 이루어진 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 핵산은, 예를 들면, 알파 베타 T 세포, 감마 델타 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 줄기 세포 또는 다능성 세포 유래 T 세포와 같은 T 세포에 포함될 수 있다. T 세포는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제에 포함될 수 있다.
본 발명의 또 하나의 측면은 상이한 CAR 인코딩 벡터의 라이브러리를 포함하는 조성물로서, 상기 라이브러리의 벡터가 별개의 항원 결합 도메인, 힌지 도메인 및/또는 엔도도메인과 관련하여 무작위화되는, 조성물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 라이브러리는 별개의 항원 결합 도메인, 힌지 도메인 및 엔도도메인과 관련하여무작위화된다. 일부 구현예에서, 라이브러리는 별개의 항원 결합 도메인 및 엔도도메인과 관련하여 무작위화된다. 일부 구현예에서, 라이브러리는 별개의 항원 결합 도메인 및 힌지 도메인과 관련하여 무작위화된다. 일부 구현예에서, 라이브러리는 별개의 항원 힌지 도메인 및 엔도도메인과 관련하여 무작위화된다.
CAR을 생성하기 위해 본 발명의 방법에 사용되는 항원 결합 도메인, 힌지 영역, 막관통 도메인 및 엔도도메인의 예는 이하 표 1에 나타낸다. 항원 결합 도메인, 힌지 영역, 막관통 도메인 및 엔도도메인은 단순히 비제한적 예로서 표 1에 제공되고, 특별한 임상 적용에 목적시되는 임의의 항원 결합 도메인(예를 들면, 암 세포, 세균, 진균, 바이러스 또는 바이러스 감염 세포를 표적화하는)을 실질적으로 선택할 수 있음이 예상된다. 표 1에서, 항원 결합 도메인의 표적이 제공된다(예를 들면, "CD19"는 선택적으로 CD19에 결합하는 scFv 영역을 나타낼 수 있다). 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항원에 선택적으로 결합하는 scFv를 포함하거나 scFv로 이루어진다. 원하는 경우, scFv의 일부(예: scFv의 가변 영역의 일부)를 원하는 경우 무작위화될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 선택적으로 단백질에 결합한다. 또는, 항원 결합 도메인은, 예를 들면, 진균, 바이러스, 세균 또는 암 세포와 같은 표적 상에서 발현된 탄수화물에 선택적으로 결합할 수 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 진균 세포 벽에서 발견된 β-글루칸 및 탄수화물에 선택적으로 결합할 수 있는 덱틴-1을 포함하거나 덱틴-1로 이루어진다. 일부 구현예에서, CAR은 바이러스에 선택적으로 결합할 수 있고, 예를 들면, CAR은 간염 엔벨로프 단백질과 같은 바이러스성 단백질에 결합할 수 있다(예: Krebs 등, 2013). 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 사이토카인이다. 항원 결합 도메인은 단백질, 탄수화물 또는 당에 선택적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, CAR은 단일 표적, 항원에 선택적으로 결합하는 다수의 항원 결합 도메인으로부터 생성되거나, 항원 결합 도메인은 중복 항원을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, CAR는 상이한 표적 또는 항원에 선택적으로 결합하는 다수의 항원 결합 도메인으로부터 생성된다. CAR 중의 엔도도메인은 억제성 신호(예: 예를 들면, T 세포 또는 천연 킬러 (NK) 세포와 같은 CAR 발현 세포에서 PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, BTLA, ITIM, SHP-1, LAIR-1, TIGIT, Siglecs를 유도할 수 있다 ) 또는 자극성 신호(예: CD27, CD28, ICOS, CD134, CD137, LCK, DAP10, ITAM, ZAP-70, LAT, SLP-76, 사이토카인 뿐만 아니라 사이토카인 수용체; 뿐만 아니라 조합 및 돌연변이). 항원 결합 영역이 항원을 선택적으로 인식할 때, 엔도도메인은 세포(예: 세포 사멸, 이동, 분화, 탈분화를 활성화시키거나 세포에서 세포괴사 신호를 유도하는 CAR을 포함하는 T 세포 또는 NK 세포를 유도하거나 촉진시킬 수 있다). 세포괴사 신호는 CTLA4 세포괴사 신호 및/또는 PD1 (단백질 사망 1) 세포괴사 신호를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 별개의 CAR은, 예를 들면, T 세포 또는 NK 세포와 같은 세포에서 발현될 수 있다. 예를 들면, 제1 CAR 및 제2 CAR은 세포에서 발현될 수 있고, 여기서 제1 CAR은 건강한 세포 상에서 항원에 선택적으로 결합하고 제1 엔도도메인을 통해 억제성 신호를 유도하고(예를 들면, T 세포 또는 NK 세포가 건강한 세포를 손상시킬 가능성을 감소시키고), 제2 CAR은 표적 세포(예: 암 세포, 진균, 바이러스 감염 세포, 세균) 상에서 항원에 선택적으로 결합하고, 제2 엔도도메인을 통해 자극성 신호를 유도한다(예를 들면, T 세포 또는 NK 세포에 의한 표적 세포의 세포 사멸을 촉진시키거나 유도한다). 본 발명의 방법을 통해 생성된 CAR은 통합 DNA로서(예를 들면, 트랜스포사제/트랜스포손 벡터 또는 시스템을 통해 전기천공 및 상동 재조합을 사용하여) 또는 비통합 DNA 또는 RNA로서(예를 들면, 예를 들면, 렌티바이러스 또는 레트로바이러스와 같은 바이러스성 벡터를 사용하여 mRNA의 바이러스 전달), 예를 들면, T 세포 또는 NK 세포와 같은 표적 세포에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따르는 CAR을 인코딩하는 T 세포는 불멸화된 세포이고; 이러한 불멸화된 세포는 CAR의 치료 가능성 또는 독성을 평가하거나 측정하기 위해 사용될 수 있는 기능을 할 수 있다. 이러한 방식으로, 다수의 CAR는 목적하는 약리학적 프로파일, 병든 세포 또는 병원균에 대한 독성, 건강한 세포에서 독성의 부족 및/또는 치료학적 효능에 대해 스크리닝할 수 있다.
표 1. CAR . 를 생성하기 위해 항원 결합 도메인-힌지-신호전달 도메인으로서 조합될 수 있는 DNA 분자
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
ξ - 제타; Δ- 돌연변이; 참고 = 4-1BB는 또한 CD137로서 칭명되고; "+"는 상이한 영역의 융합을 나타낸다.
예를 들면, 일부 구현예에서, 다음 항원-결합 도메인, 힌지/스캐폴드, 막관통 도메인 및 엔도도메인이 표 2에 나타낸 바와 같이 사용될 수 있다. 신호전달 도메인, 예를 들면, 표 1 또는 표 2에 포함된 서열의 예는 CD27 (서열번호 41), CD28 (서열번호 42), CD28Δ (서열번호 43), CD134 (OX40) (서열번호 44), CD137 (41BB) (서열번호 45), ICOS (서열번호 46) 및 CD3 제타 (서열번호 47)를 포함한다. 표 2에 나열된 바와 같은 scFv 항-EGFR 도메인의 예는 니모툭시맙 ( Nimotuximab ) (서열번호 48) 및 세툭시맙(Cetuximab) (서열번호 49)을 포함한다. 표 2에 나열된 바와 같은 scFv 항-포스파티딜세린의 예는 바비툭시맙 (서열번호 50)이다.
표 2: CAR을 생성하기 위해 사용된 라이브러리의 예
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
본원에 사용된 용어 "키메라 항원 수용체(CAR)" 또는 "CAR"은 인공 T-세포 수용체, 키메라 T-세포수용체 또는 키메라 면역수용체를 포함한다. CAR은 일반적으로 특정 면역 이펙터 세포 상에 인공적인 특이성을 그래프트할 수 있는 유전자조작 수용체이다. CAR은 T 세포 상에 모노클로날 항체의 특이성을 부여하기 위해 사용될 수 있고, 이에 의해, 예를 들면, 입양 세포 요법에 사용하기 위한 다수의 특이적 T 세포가 생성되도록 한다. 일부 구현예에서, CAR은 종양 관련 항원에 대한 세포의 특이성을 지시한다. 바람직한 구현에에서, CAR은 엔도도메인 (세포내 활성화 도메인 포함), 막관통 도메인, 힌지 또는 스캐폴드 영역 및 표적화 도메인을 포함하는 세포외 도메인 (예: 모노클로날 항체로부터 유도된 scFv)을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 표적화 도메인은 수용체의 리간드 (예: 단백질 수용체에 선택적으로 결합하는 펩티드)일 수 있다. 일부 구현예에서, 악성 세포에 특이적인 CAR를 사용하여 (예를 들면, 암 B-혈통 세포를 표적화하는 항-CD19 scFv를 사용하여) T 세포의 특이성을 재지시함으로써 악성 세포를 표적화할 수 있다.
scFv 영역, 힌지/스캐폴드 영역, 막관통 도메인 및 엔도도메인의 예는 표 1에 나타내고, 관련 서열의 예도 또한 본원에 제공된다. scFv 영역이 특정 표적에 대한 다수의 scFv 영역을 의미할 수 있다(예를 들면,는 것을 표 1에서 참조한다 표 1에서 "CD19"는 단일 모노클로날 항체 서열을 의미할 수 있고, 또는 일부 바람직한 구현예에서, 이는 CD19를 선택적으로 표적화하는 모노클로날 항체로부터 유도된 다수의 scFv 영역을 의미할 수 있다). 본 발명의 방법이, 예를 들면, 표 1의 scFv 영역, 힌지/스캐폴드, 막관통 도메인 및 엔도도메인의 임의의 조합의 융합을 포함하는 CAR을 생성하기 위해 사용될 수 있음이 예상된다. 예를 들면, 일부 구현예에서, CAR은 IgG4 Fc 힌지/스캐폴드 영역, CD28 막관통 도메인, 및 CD28 및 CD3ξ를 포함하는 엔도도메인에 융합된 CD19(예를 들면, 마우스, 인간 또는 인간화 모노클로날 항체로부터 유도됨)를 선택적으로 표적화하는 scFv 영역을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CAR은 IgG4 Fc 힌지/스캐폴드 영역, CD28 막관통 도메인, 및 CD28 및 CD3ξ를 포함하는 엔도도메인에 융합된 ROR1을 선택적으로 표적화하는 scFv 영역을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CAR은 IgG4 Fc 힌지/스캐폴드 영역, CD28 막관통 도메인, 및 4-1BB 및 CD3ξ를 포함하는 엔도도메인에 융합된 ROR1을 선택적으로 표적화하는 scFv 영역을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CAR은 IgG4 Fc 힌지/스캐폴드 영역, CD28 막관통 도메인, 및 CD28 및 CD3ξ를 포함하는 엔도도메인에 융합된 CD19(예를 들면, 마우스, 인간 또는 인간화 모노클로날 항체로부터 유도됨)를 선택적으로 표적화하는 scFv 영역을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항원"은 항체 또는 T-세포 수용체에 의해 결합될 수 있는 분자이다. 항원은 일반적으로 체액성 면액 반응 및/또는 B 및/또는 T 림프구의 생산을 유도하는 세포성 면역 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다.
본원 명세서에 사용된 바와 같이, "a" 또는 "an"은 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원 특허청구범위(들)에 사용된 바와 같이, 단어 "포함하는"과 함께 사용될 때, 단어 "a" 또는 "an"은 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다.
특허청구범위에 용어 "또는"의 사용은, 명세서가 단지 대안물 및 "및/또는"을 의미하는 정의를 지지하지만, 명시적으로 대안물만을 의미하는 것으로 지시되거나 대안물이 상호 배타적이지 않는 한, "및/또는"을 의미하기 위해 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, "또 하나"는 적어도 제2 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
본원 전반에 걸쳐, 용어 "약"은 값이 장치의 오차의 고유 변동을 포함함을 나타내기 위해 사용되고, 방법은 그 값, 또는 연구 대상체 사이에 존재하는 변이를 결정하기 위해 사용된다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 이하 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 취지 및 범위 내의 다양한 변경 및 수정이 이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이기 때문에, 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내면서 단지 예시로써 제공된다는 것이 이해되어야 한다.
도면의 간단한 설명
이하의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 발명의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정 구현예의 상세한 설명과 함께 이러한 도면 중 하나 이상을 참조로보다 잘 이해될 수 있다.
도 1. 클로닝 벡터를 (i) 특정의 scFv, (ii) 세포외 힌지 및 (iii) 엔도도메인을 발현시키는 3개의 공여체 플라스미드를 사용하여 CAR을 재조립하기 위해 사용했다. 이 접근법은 힌지, 막관통 및 세포내 영역이 상이한 CAR의 패널을 생성하도록 적합화된다. 삼중 재조합 부위 시스템을 사용하여 성분 scFv, IgG4 Fc (긴 힌지); 또는 CD8a (중간 힌지) 또는 펩티드 단독 (작은 힌지) 및 상이한 신호전달 도메인을 갖는 CD3ξ조합으로부터 CAR 분자의 유전자조작. 3개의 공여체 플라스미드(엔트리 클론)에서 인코딩된 scFv 및 별개의 스캐폴드 및 신호전달 도메인의 라이브러리를 발현 DNA 벡터에서 재조합시킨다. 이 접근법은 복수의 CAR 종을 scFv-B-스캐폴드-C-신호전달 도메인(들)의 포맷으로 생성했다.
도 2a-b: (도 2a) 유동 세포 분석법에 의한 66일 전기천공 후 T 세포에서 CAR (Fc) 및 CD8+ 의 발현. 세포를 CD19 항원(클론 4)이 적재된 aAPC에서 확대시켰다 (도 2b) CD19+ EL-4의 용해는 삼중 재조합 부위 (EZ CAR) 및 CARneg T 세포에 의한 CD19CAR+ T 세포 임상 등급 (CG) CD19CAR+ T 세포에 의한 4-h 크롬 방출 검정을 사용하여 CD19neg EL-4의 배경 용해와 비교했다. CARneg T는 K562-유래 aAPC 클론 #4가 적재된 조사된 항-CD3 (OKT3)에서 확대시켰다.
도 3: CAR 설계. CAR 212 = 서열번호 4; CAR 213 = 서열번호 5; CAR 214 = 서열번호 56; CAR 215 = 서열번호 57; CAR 216 = 서열번호 58; CAR 217 = 서열번호 2; CAR 218 = 서열번호 59; CAR 193 = 서열번호 55.
도 4: 슬리핑 뷰티 추적 플라스미드
도 5: CAR 발현.
도 6: CAR 발현 동태
도 7: 표현형.
도 8a-b: 확대된 표현형은 도 8a 및 도 8b에 도시된다.
도 9: 웨스턴 블롯 분석.
도 10: 확장 동태.
도 11: 중첩 확장: 총 세포
도 12: 중첩 확장: CAR+ T 세포.
도 13: 세포독성.
도 14: 4-1BB CAR: 세포독성.
도 15: TM 도메인: 세포독성.
도 16: 스페이서 (IgG4 vs CD8): 세포독성
도 17: IFN-γ 생산.
도 18: 4-1BB CAR: IFN-γ 생산
도 19: TM 도메인: IFN-γ 생산
도 20: 스페이서 (IgG4 vs CD8): IFN-γ 생산.
도 21: 안전성: SB11 트랜스포사제를 위한 PCR.
도 22: 안전성: CAR 카피 수 (qPCR).
도 23: 안전성: 자율적 증식. 도면에 도시된 바와 같이, 자율적 증식의 결여가 관찰되었다.
도 24: CAR 설계. CAR의 예는 도면의 우측에 제공된다.
도 25: CD3-제타. 질문 = 서열번호 51; 대상체 - 상부 = 서열번호 52; 대상체 - 중간 = 서열번호 53; 대상체 - 하부 = 서열번호 54.
도 26: CAR 설계.
도 27: CAR.
도 28: CAR 발현.
도 29: 확장 동태.
도 30: 확장 동태.
도 31: 세포독성.
도 32: 세포독성.
도 33: 메모리 마커. (도26에 도시된 발현 작제물을 발현시키는) CAR+ T 세포 상에서 CD27, CD62L, CD28 및 CCR7의 발현 퍼센트가 도시된다.
도 34: IFN-γ 생산.
도 35: IFN-γ 생산 (PMA-Ion)
도 36: 자율적 증식.
도 37: CAR 카피 수.
도 38: CAR 카피 수.
도 39: CAR 카피 수.
도 40a-e: 리포펙타민에 의해 CAR DNA (pSBSO EZ CAR)를 수반하는 플라스미드에 의한 293-HEK 세포의 형질감염을 수행했다. 형질감염된 세포는 항-Fc 또는 항-이디오티픽 (항CD19svFv) 항체로 염색시킨 후 유동 세포분석법으로 분석했다.
도 41a-b: 도 41a, Nalm-6; EL-4 CD19+ 세포; MCL 및 CLL (표적)을 갖는 환자 종양 세포는 이전에 GFP를 발현시키도록 수정되었다. 5x103 표적 세포는 증가하는 농도의 CD19RIgG4CD28CAR T 세포, CD19RCD8αCD28 CAR T 세포 및 CARneg T 세포(대조군으로 사용됨)로 4시간 동안 배양했다. 4시간 후, 세포는 IntelliCyt's iQue에 의해 취득했고, 데이터 분석은 그들의 독점 소프트웨어로 수행했다. 도 42b, 그래프는 종양 세포에 대한 CAR T 세포의 사멸 퍼센트를 나타내고 있다. 이펙터 및 표적 세포 사이의 비는 0 내지 40 세포의 범위였다.
도 42: 5x103 표적 세포 (EL-4 CD19+ 그랜자임 B 세포 리포터)는 증가하는 농도의 임상 등급 CD19RIgG4CD28CAR T 세포, EZ CD19RCD8αCD28 CAR T 세포 및 CARneg T 세포(대조군으로서 사용됨)로 4시간 및 10시간 동안 배양했다. 배양 시간 후, 세포를 IntelliCyt's iQue에 의해 취득했고, 데이터 분석은 그들의 독점 소프트웨어로 수행했다. 그래프는 종양 세포에 대한 CAR T 세포의 사멸 퍼센트를 나타내고 있다. 이펙터와 표적 세포 사이의 비는 0 내지 20 세포의 범위 내였다.
예시적 구현예의 설명
키메라 항원 수용체(CAR)를 생성하는 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법은 각각 항원 결합 도메인(예: scFv 영역), 힌지 영역, 막관통 영역 및/또는 엔도도메인을 인코딩하는 다수의 벡터를 이용한다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 제1 벡터는 항원 결합 도메인을 인코딩하고, 제2 벡터는 힌지 영역을코딩하고, 제3 영역은 엔도도메인을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 막관통 영역은 제2 벡터, 제3 벡터 또는 제4 벡터에서 인코딩한다. 일부 바람직한 구현예에서, 벡터는 항원 결합 도메인, 힌지 영역 및 막관통 영역 및 엔도도메인을포함하는 CAR을 인코딩하는 핵산을 형성하기 위해 상동 재조합할 수 있다. 이러한 방식으로, 다수의 CAR을 생성시키고 목적하는 활성, 예를 들면, CAR에 의해 선택적으로 결합된 항원을 발현시키는 암 세포의 선택적 인식 및 사멸에 대해 스크리닝할 수 있다. 이어서, CAR는 통합 핵산(예: 트랜스포사제/트랜스포손을 사용하여 숙주 게놈에 통합된 DNA)으로서 또는 비통합 핵산(예: 렌티바이러스 또는 레트로바이러스와 같은 바이러스성 벡터를 통해 전달된 mRNA)으로서 T 세포 또는 천연 킬러(NK) 세포와 같은 세포에서 발현시킬 수 있다. 이어서, CAR을 발현시키는 T 세포 또는 NK 세포는 질환(예: 암, 진균 감염, 세균 감염 또는 바이러스 감염)을 치료하거나 예방하기 위해 인간 환자와 같은 대상체에게 약제학적 제제 또는 부형제로 투여할 수 있다.
I. 라이브러리 생성
scFv 영역, 힌지/스캐폴드 영역, 막관통 도메인 및 엔도도메인(신호전달 도메인)의 다수를 인코딩하는 라이브러리는 당업자에게 공지된 방법으로 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 가능성은 scFv 영역, 힌지/스캐폴드 영역 및 엔도도메인(신호전달 도메인) 중 2개 또는 3개에 이용 가능하다. 일부 구현예에서, 복수의 가능성은 scFv 영역, 힌지/스캐폴드 영역, 막관통 도메인 및 엔도도메인(신호전달 도메인) 중 2개, 3개 또는 모두에 이용 가능하다. scFv 영역, 힌지/스캐폴드 영역, 막관통 도메인 및 엔도도메인(신호전달 도메인)의 예는, 예를들면, 표 1에 제공된다. 일부 구현예에서, 라이브러리는, 예를 들면, 복수의 항암 또는 종양-표적화 항원과 같은 상이한 항원을 표적화하는 다수의 scFv를 인코딩할 수 있고; 다른 구현예에서, 라이브러리는 단일 표적 (예:, CD19 등과 같은 단일 항암 항원)에 선택적으로 결합하는 다수의 상이한 scFv를 인코딩할 수 있다. 이러한 방식으로, 당해 방법은 종양 표적화 작제물이 소정의 세포 샘플(예를 들면, 개인 의학에 사용되는)에 대해 보다 효과적으로 작동할 수 있음을 동정하기 위해 사용될 수 있거나 방법은 소정의 항원을 표적화하는데 보다 효과적으로 기능하는 새로운 CAR을 동정하기 위해 사용될 수 있다. scFv 영역은 일반적으로 항체로부터 유래된 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)를 포함한다. 일부 구현예에서, VL 및 VH 영역의 일부는 원하는 경우 무작위화될 수 있다. 라이브러리를 생성하는 일반적 방법은, 예를 들면, 효모 라이브러리, 세균, 파지 라이브러리, 침윤성 B 세포, 하이브리도마(인간 및 설치류에서 포함), 또는 라마, 낙타, 말 라이브러리로부터의 라이브러리의 생성 및 인 실리코 방법을 포함한다(참조: 예를 들면, Lennard, 2002).
일부 구현예에서, scFv, 힌지/스캐폴드 영역, 막관통 도메인 및 엔도도메인을 인코딩하는 상이한 벡터는 CAR을 인코딩하는 단일 벡터를 형성하기 위해 융합된다. 융합은 트랜스포손 매개된 상동 재조합을 통해 발생할 수 있다.
예를 들면, 일부 구현예에서, scFv, 힌지/스캐폴드 영역, 막관통 도메인 및/또는 엔도도메인을 인코딩하는 벡터는 슬리핑 뷰티 (SB) 또는 피기백 DNA 플라스미드일 수 있다. 슬리핑 뷰티 (SB) 및 피기백 DNA 플라스미드는, 예를 들면, 문헌(참조: Maiti 등)에 기재되어 있다 (2013), Singh 등 (2008), and Huls 등 (2013). 일부 구현예에서, 트랜스포손은 연어과 형태 Tc1-형 트랜스포사제(SB)에 의해 매개된다. 일부 바람직한 구현예에서, CAR을 인코딩하는 벡터는 문헌(참조: Singh 등,)에 기재된 방법을 통해 인간 암 환자와 같은 대상체로부터의 T 세포에서 형질감염되거나 통합된다 2014 또는 Huls 등 예를 들면, 슬리핑 뷰티 (SB) 시스템으로부터 유래된 DNA 벡터는 재조합 바이러스 벡터를 사용하여 T 세포를 형질도입하는데 관련되는 비용 및 제조 어려움을 피하기 위해 사용될 수 있다. 전기천공 후, 트랜스포손/트랜스포사제는 T 세포 중의 CAR 및 다른 도입 유전자를 발현시키기 위해 사용된 플라스미드의 통합 효율을 향상시킬 수 있다. 인공 항원 제시 세포(aAPC)와 조합된 SB 시스템은 선택적으로 전파하고, 인간 용도에 적합한 CAR(+) T 세포를 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, 두 개의 DNA 플라스미드, SB 트랜스포손 (목적하는 CAR를 인코딩하는) 및 SB 트랜스포사제(예:의 동시 전자 전송 SB11)은 가용성 재조합 인간 IL-2 및 IL-21의 존재하에 γ-조사된 aAPC의 모든 7일 첨가(자극 주기)에 의해 안정한 통합체의 검색에 후속될 수 있다. 예를 들면, 목적하는 CAR을 안정하게 발현시키는 T 세포의 임상적으로 매력적인 수를 생성하기 위해 4 주기(28일 연속 배양)가 수행될 수 있다. 트랜스포손/트랜스포사제 시스템의 사용은, 예를 들면, 문헌(참조: Hackett 등)에 기재된 바와 같이 CAR을 발현시키는 T 세포의 전달을 위해 이용될 수 있다.
II. 키메라 항원 수용체
본 발명의 구현예는 항원 특이적 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 생성 및 동정을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다(hCAR).
일부 구현예에서, CAR은 하나 이상의 항원 사이의 공유 공간으로 구성된 에피토프를 인식할 수 있다. 패턴 인식 수용체, 예를 들면, 덱틴-1은 탄수화물 항원에 대한 특이성을 구동시키기 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 결합 영역은 모노클로날 항체의 상보성 결정 영역, 모노클로날 항체의 가변 영역 및/또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 영역은 scFv이다. 또 하나의 구현예에서, 수용체 또는 세포 표적에 결합하는 펩티드 (예: 사이토카인)는 가능성으로서 포함될 수 있거나 CAR의 결합 영역에서 scFv 영역을 치환할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, CAR은 복수의 scFv 영역 및/또는 다른 표적화 단백질을 인코딩하는 다수의 벡터로부터 생성될 수 있다. 상보성 결정 영역(CDR)은 항원을 보완하고, 따라서 그 특정 항원에 대한 이의 특이성을 갖는 수용체를 제공하는 항원 수용체(예: 면역글로불린 및 T-세포 수용체) 단백질의 가변 도메인에서 발견된 짧은 아미노산 서열이다. 항원 수용체의 각각의 폴리펩티드 쇄는 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 함유한다. 항원 수용체가 전형적으로 두 개의 폴리펩티드 쇄로 구성되기 때문에, 항원과 접촉될 수 있는 각각의 항원 수용체를 위해 6개의 CDR이 존재한다 - 각각 중쇄 및 경쇄는 3개의 CDR을 함유한다. 면역글로불린 및 T-세포 수용체 선택성과 관련된 대부분의 서열 변화가 일반적으로 CDR에서 발견되기 때문에, 이들 영역은 때때로 초가변 도메인으로서 칭명된다. 이들 중에서, CDR3은 VJ (중쇄 및 TCR αβ 쇄의 경우 VDJ) 영역의 재조합에 의해 인코딩될 때 최대변동을 나타낸다.
본 발명을 통해 생성된 CAR-코딩 핵산은 인간 환자를 위한 세포 면역요법을 증강시키기 위해 하나 이상의 인간 유전자 또는 유전자 단편을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 전장 CAR cDNA 또는 인코딩 영역은 본원에 기재된 방법을 통해 생성될 수 있다. 항원 결합 영역 또는 도메인은 이하에 기재된 것들과 같은 특정 인간 모노클로날 항체로부터 유래된 일본쇄 가변 단편(scFv)의 VH 및 VL 쇄의 단편을 포함할 수 있다: U.S. 특허 7,109,304, 본원에 참조로 인용된다. 일부 구현예에서, scFv는 인간 항원 특이적 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, scFv 영역은 인간 세포에서 발현시키기 위한 인간 코돈 사용 빈도를 위해 최적화된 서열에 의해 인코딩된 항원 특이적 scFv이다.
CAR의 항원 결합 도메인의 배치는 디아바디 또는 다량체와 같은 다량체일 수 있다. 다량체는 디아바디로서 칭명될 수 있는 것에서 경쇄 및 중쇄의 가변 부분의 교차 쌍에 의해 형성될 수 있다. CAR의 힌지 부분은 일부 구현예에서 단축되거나 배제될 수 있다(즉, 단지 항원 결합도메인, 막관통 영역 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 생성한다). 힌지의 다중도는, 예를 들면, 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명과 함께 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 제1 시스테인을 유지시키거나 프롤린 또는 세린 치환에 의해 돌연변이되거나 제1 시스테인까지 절단될 수 있다. Fc 부분은 본 발명에 따르는 CAR을 생성하기 위해 항원 결합 영역으로 사용된 scFv로부터 결실될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 영역은 단지 하나의 Fc 도메인, 예를 들면, 인간 면역글로불린으로부터 CH2 또는 CH3 도메인을 인코딩할 수 있다. 또한, 이량체화 및 올리고머화를 개선시키기 위해 수정된 인간 면역글로불린의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지 부분은 8-14 아미노산 펩티드 (예: 12 AA 펩티드), CD8α의 부분 또는 IgG4 Fc를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 CD8 알파와 같은, 올리고머화를 촉진시키는 도메인을 사용하여 세포 표면으로부터 매달릴 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 모노클로날 항체(mAb) 클론 2D3(예를 들면, 문헌(참조: Singh 등,에 기재된 mAb 클론 2D3)에 의해 인식된 도메인을 사용하여 세포 표면으로부터 매달릴 수 있다 2008).
CAR의 엔도도메인 또는 세포내 신호전달 도메인은 일반적으로 CAR을 포함하는 면역 세포의 정상적 이펙터 기능 중의 적어도 하나의 활성화를 일으키거나 촉진시킬 수 있다. 예를 들면, 엔도도메인은, 예를 들면, 세포용해 활성 또는 사이토카인의 분비를 포함하는 헬퍼 활성과 같은 T 세포의 이펙터 기능을 촉진시킬 수 있다. 천연, 메모리 또는 메모리형 T 세포에서 이펙터 기능은 항원 의존성 증식을 포함할 수 있다. 용어 "세포내 신호전달 도메인" 또는 "엔도도메인"은 이펙터 기능 신호를 형질도입할 수 있고/있거나 세포가 특수한 기능을 수행하도록 지시할 수 있는 CAR의 부분을 나타낸다. 일반적으로 전체 세포내 신호전달 도메인이 CAR에 포함될 수 있는 반면, 일부 경우에, 엔도도메인의 절단된 부분이 포함될 수 있다. 일반적으로, 엔도도메인은 절단된 엔도도메인을 포함하고, 여기서 절단된 엔도도메인은 세포에 이펙터 기능 신호를 형질도입하는 능력을 유지시킨다.
일부 구현예에서, 엔도도메인은 T 세포 수용체의 제타 쇄 또는 임의의 이의 동족체 (예: 에타, 델타, 감마 또는 엡실론), MB1 쇄, B29, Fc RIII, Fc RI, 및 신호전달 분자의 조합, 예를 들면, CD3ξ 및 CD28, CD27, 4-1BB, DAP-10, OX40, 및 이의 조합 뿐만 아니라 다른 유사한 분자 및 단편을 포함한다. FcγRIII 및 FcεRI와 같은 활성화 단백질의 패밀리의 다른 구성원의 세포내 신호전달 부분이 사용될 수 있다. . 이러한 대안적 막관통 및 세포내 도메인의 예는, 예를 들면, 다음 문헌에서 찾을 수 있다: Gross 등 (1992), Stancovski 등 (1993), Moritz 등 (1994), Hwu 등 (1995), Weijtens 등 (1996), 및 Hekele 등 (1996), 이는 전문이 본원에 참조로 인용된다. 일부 구현예에서, 엔도도메인은 인간 CD3ξ 세포내 도메인을 포함할 수 있다.
항원 특이적 세포외 도메인 및 세포내 신호전달 도메인은 바람직하게는 막관통 도메인에 의해 연결된다. CAR에 포함될 수 있는 막관통 도메인은, 예를 들면, 인간 IgG4 Fc 힌지 및 Fc 영역, 인간 CD4 막관통 도메인, 인간 CD28 막관통 도메인, 막관통 인간 CD3ξ 도메인, 또는 시스테인 돌연변이된 인간 CD3ξ 도메인, 또는, 예를 들면, CD16 및 CD8 및 에리트로포이에틴 수용체와 같은 인간 막관통 신호전달 단백질로부터의 막관통 도메인을 포함한다. 막관통 도메인의 예는, 예를 들면, 표 1에 제공된다.
일부 구현예에서, 엔도도메인은 공자극 수용체, 예를 들면, 수정된 CD28 세포내 신호전달 도메인, 또는 CD28, CD27, OX-40 (CD134), DAP10, 또는 4-1BB (CD137) 공자극 수용체를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD3ξ에 의해 개시된 둘 다의 주요 신호, 인간 공자극 수용체에 의해 제공된 추가의 신호는 형질전환된 T 세포를 보다 효과적으로 활성화시키기 위해 CAR에 포함될 수 있고, 이는 입양 면역요법의 생체내 지속성 및 치료학적 성공을 개선시키는 것을 도울 수 있다. 표 1에 명시된 바와 같이, 엔도도메인 또는 세포내 수용체 신호전달 도메인은 단독으로 또는 예를 들면, 다음과 같은 Fcγ RIII 공자극 신호전달 도메인과 함께 CD3의 제타 쇄를 포함할 수 있다: CD28, CD27, DAP10, CD137, OX40, CD2, 4-1BB. 일부 구현예에서, 엔도도메인은 하나 이상의 TCR 제타 쇄, CD28, CD27, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FcεRIγ, ICOS/CD278, IL-2R베타/CD122, IL-2R알파/CD132, DAP10, DAP12 및 CD40 중의 일부 또는 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 1, 2, 3, 4개 이상의 세포질 도메인이 엔도도메인에 포함될 수 있다. 예를 들면, 일부 CAR에서, 함께 융합된 적어도 두 개 또는 세 개의 신호전달 도메인이 부가적 또는 상승적 효과를 초래할 수 있음이 관찰되었다.
일부 측면에서, CAR을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 단리된 핵산 세그먼트 및 발현 카세트가 생성될 수 있다. 다양한 벡터가 사용될 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 벡터는 T 세포와 같은 면역에 CAR을 인코딩하는 DNA의 전달을 가능하게 할 수 있다. CAR 발현은, 예를 들면, MNDU3 프로모터, CMV 프로모터, EF1알파 프로모터 또는 유비퀴틴 프로모터와 같은 규제된 진핵생물 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 또한, 벡터는, 다른 이유가 없다면, 시험관내에서 그들의 조작을 촉진시키기 위해 선택가능한 마커를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, CAR은 DNA 주형으로부터 시험관내 전사된 mRNA로부터 발현될 수 있다.
키메라 항원 수용체 분자는 재조합체이고, 항원에 결합하고 이들의 세포질 꼬리에 존재하는 면역수용체 활성화 모티프(ITAM's)를 통해 활성화 신호를 형질도입하는 이들의 두 능력에 의해 구별된다. 항원-결합 잔기(예를 들면, 일본쇄 항체(scFv)로부터 생성됨)를 이용하는 수용체 작제물은 그들이 HLA-독립 양식으로 표적 세포 표면에서 천연 항원에 결합할 수 있다는 점에서 "범용"이다는 추가의 이점을 부여한다. 예를 들면, scFv 작제물은 CD3 복합체 제타 쇄(ξ), Fc 수용체 감마 쇄 및 스카이 티로신 키나제의 세포내 부분을 인코딩하는 서열에 융합될 수 있다(참조: Eshhar 등, 1993; Fitzer-Attas 등, 1998). CTL에 의한 종양 인식 및 용해를 포함하는 재지시된 T 세포 이펙터 메커니즘은 다수의 뮤린 및인간 항원-scFv:ξ 시스템에 기재되어 있다(참조: Eshhar 등, 1997; Altenschmidt 등, 1997; Brocker 등, 1998).
항원 결합 영역은, 예를 들면, 인간 또는 비인간 scFv로부터 유래될 수 있다. 비인간 항원 결합 영역, 예를 들면, 뮤린 모노클로날 항체를 사용하는 경우의 하나의 가능한 문제는 인간 이펙터 기능의 감소 및 종양 괴상을 침투하는 능력의 감소이다. 또한, 비인간 모노클로날 항체는 외래 단백질로서 인간 숙주에 의해 인식될 수 있고, 따라서 이러한 외래 항체의 반복 주사는 유해한 과민성 반응을 초래하는 면역 반응의 유도를 초래할 수 있다. 뮤린계 모노클로날 항체의 경우, 이 효과는 인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응으로서 칭명되고 있다. 일부 구현예에서, CAR에 인간 항체 또는 scFv 서열의 포함시키면 일부 뮤린 항체와 비교하여 HAMA 반응을 거의 또는 전혀 일으키지 않을 수 있다. 유사하게, CAR에 인간 서열의 포함은 수용자에 존재하여 HLA에 기초하여 처리된 항원을 인식할수 있는 내인성 T 세포에 의해 면역 매개 인식 또는 제거의 위험을 감소시키거나 피하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, CAR은 다음을 포함한다: a) 세포내 신호전달 도메인, b) 막관통 도메인, c) 힌지 영역 및 d) 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인. 일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인 및 막관통 도메인은 힌지 영역을 인코딩하는 벡터 및 항원 결합 영역을 인코딩하는 벡터와 (예를 들면, 트랜스포손 지시된 상동 재조합을 통해) 융합될 수 있는 단일 벡터에 의해 엔도도메인으로 인코딩된다 다른 구현예에서, 세포내 신호전달 영역 및 막관통 영역은 (예를 들면, 트랜스포손 지시된 상동 재조합을 통해) 융합된 두 개의 별도의 벡터에 의해 인코딩될 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인으로서 칭명되기도 하는 CAR의 항원특이적 부분은 종양 관련 항원을 선택적으로 표적화한다. 종양 관련 항원은, 그것이 종양 세포의 세포 표면에서 발현되는 한, 임의의 종류일 수 있다. 본 발명을 통해 생성된 CAR로 표적화될 수 있는 종양 관련 항원의 예는, 예를 들면, 다음을 포함한다: CD19, CD20, 암 배아성 항원, 알파페토프로테인, CA-125, MUC-1, CD56, EGFR, c-Met, AKT, Her2, Her3, 상피 종양 항원, 흑색종 관련 항원, 돌연변이 p53, 돌연변이 ras, 덱틴-1 등. 일부 구현예에서, CAR의 그 항원 특이적 부분은 scFv이다. 종양-표적화 scFv의 예는 표 1에 제공된다. 일부 구현예에서, CAR은, 예를 들면, 소량의 종양 관련 항원이 존재할 경우 지속성을 개선시키기 위해 막 결합 사이토카인과 공동 발현될 수 있다. 예를 들면, CAR은 막 결합된 IL-15와 공동 발현될 수 있다.
일부 구현예에서, 예를 들면, 다음과 같은 세포내 종양 관련 항원 HA-1, 서바이빈, WT1 및 p53은 CAR로 표적화할 수 있다. 이는 HLA의 맥락에서 세포내 종양 관련 항원으로부터 기재된 처리 펩티드를 인식하는 범용 T 세포 상에서 발현된 CAR에 의해 달성될 수 있다. 또한, 범용 T 세포는 HLA의 맥락에서 세포내 처리된 종양 관련 항원을 인식하는 T-세포 수용체 쌍을 발현시키기 위해 유전적으로 수정될 수 있다.
CAR에 의해 인식된 병원균은 본질적으로 임의의 종류의 병원균일 수 있지만, 일부 구현예에서, 병원균은 진균, 세균 또는 바이러스이다. 예시적인 바이러스 병원균은 아데노바이러스과, 엡스타인-바 바이러스(EBV), 사이토메갈로바이러스(CMV), 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV), JC 바이러스, BK 바이러스, HSV, 바이러스의 HHV 패밀리, 피코르나바이러스과, 헤르페스바이러스과, 헤파드나바이러스과, 플라비바이러스과, 레트로바이러스과, 오르토믹소바이러스과, 파라믹소바이러스과, 파포바바이러스과, 폴리오마바이러스, 라브도바이러스과 및 토가바이러스과의 패밀리의 것들을 포함한다. 예시적인 병원성 바이러스는 천연두, 인플루엔자, 유행성 이하선염, 홍역, 수두, 에볼라 및 풍진을일으킨다. 예시적인 병원성 진균은 칸디다(Candida), 아스페르길루스( Aspergillus ), 크립토코쿠스( Cryptococcus ), 히스토플라스마 (Histoplasma), 뉴모시스티스 ( Pneumocystis ) 및 스타키보트리스(Stachybotrys)를 포함한다. 예시적인 병원성 세균은 스트렙토코쿠스 (Streptococcus), 슈도모나스( Pseudomonas ), 시겔라 ( Shigella ), 캄필로박터 (Campylobacter), 스타킬로코쿠스 (Staphylococcus), 헬리코박터( Helicobacter ), 이. 콜리 (E. coli ), 리케치아 (Rickettsia), 바실루스 (Bacillus), 보르데텔라 (Bordetella), 클라미디아( Chlamydia ), 스피로헤타(Spirochetes) 및 살모넬라(Salmonella)를 포함한다. 일부 구현예에서, 병원균 수용체 덱틴-1은 아스페르길루스와 같은 진균의 세포벽 위의 탄수화물 구조를 인식하는 CAR을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 또 하나의 구현예에서, CAR은 바이러스 감염 및 병리를 중단하기 위해 바이러스성 결정인자(예: CMV 및 에볼라로부터 당단백질)를 인식하는 항체에 기초하여 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, CAR을 인코딩하는 나체 DNA 또는 적합한 벡터를 대상체의 T 세포(예: 암 또는 다른 질환을 갖는 인간 환자로부터 수득된 T 세포에 도입할 수 있다). 나체 DNA를 사용하여 전기천공에 의해 T 세포를 안정하게 형질 감염시키는 방법은 당해 분야에공지되어 있다. 예를 들면, 다음을 참조한다: U.S. 특허 제 6,410,319호. 나체 DNA는 일반적으로 발현에 적절한 방향으로 플라스미드 발현 벡터에 함유된 본 발명의 키메라 수용체를 인코딩하는 DNA를 의미한다. 일부 구현예에서, 나체 DNA의 사용은 본 발명의 방법을 통해 생성된 CAR을 발현시키는 T 세포를 생성하기 위해 필요한 시간을 감소시킬 수 있다.
또는, 바이러스 벡터(예: 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터)는 T 세포에 키메라 작제물을 도입하기 위해 사용될 수 없다. 일반적으로, 대상체로부터 T 세포를 형질감염시키기 위해 사용된 CAR을 인코딩하는 벡터는 일반적으로 대상체의 T 세포에서 비복제성이어야 한다. 바이러스에 기초하는 다수의 벡터가 공지되어 있고, 여기서 세포 내에 유지된 바이러스의 카피 수는 세포의 생존능력을 유지하기에 충분히 낮다. 예시적인 벡터는 HIV, SV40, EBV, HSV 또는 BPV에 기초하는 벡터 뿐만 아니라 pFB-네오 벡터(STRATAGENE®)를 포함한다.
형질 감염되거나 형질 도입된 T 세포가 표면 막 단백질로서 CAR을 목적하는 조절로 목적하는 수준으로 발현시킬 수 있음이 확립되면, 키메라 수용체가 목적하는 신호 유도를 제공하기 위해 숙주 세포에서 기능적인지의 여부를 결정할 수 있다. 후속적으로, 형질 도입된 T 세포는 대상체에서 항종양 반응을 활성화시키기 위해 대상체에게 재도입되거나 투여될 수 있다. 투여를 촉진시키기 위해, 형질 도입된 T 세포는 약제학적 조성물로 제조되거나 바람직하게는 약제학적으로 허용되는 적합한 담체 또는 희석제와 함께 생체내 투여에 적합한 임플란트로 제조될 수 있다. 이러한 조성물 또는 임플란트를 제조하는 수단은 당해 분야에 기재되어 있다(참조: 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack, ed. (1980)). 적절한 경우, CAR을 발현시키는 형질 도입된 T 세포는 이들 각각의 투여 경로에 대해 통상적인 방식으로 캡슐, 용액, 주사제, 흡입제 또는 에어로졸과 같은 반고체 또는 액체 형태의 제제로 제형화될 수 있다. 당해 분야에 공지된 수단은 표적 조직 또는 기관에 도달할 때까지 조성물의 방출 및 흡수를 예방하거나 최소화하거나, 조성물의 지효성을 보장하기 이해 사용될 수 있다. 일반적으로, 키메라 수용체를 발현시키는 세포를 발효시키는 약제학적으로 허용되는 형태가 바람직하게 사용된다. 따라서, 바람직하게 형질 도입된 T 세포는 행크스 균형 염 용액 또는 생리 식염수와 같은 균형 염 용액을 함유하는 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.
IV. 인공 항원 제시 세포
일부 경우에, aAPC는 CAR-기반 치료학적 조성물 및 세포 치료 제품을 제조하는데 유용하다. 항원 제시 시스템의 제조 및 사용에 관한 일반적인 가이드라인을 위해, 예를 들면, 다음을 참조한다: U.S. 특허 제 6,225,042호, 제6,355,479호, 제6,362,001호 및 제6,790,662호; U.S. 특허 출원 공보 제 2009/0017000호 및 제2009/0004142호; 및 국제 공보 제 WO2007/103009호).
aAPC는 CAR을 발현시키는 T 세포를 확대하기 위해 사용될 수 있다. 종양 항원과 직면하는 동안, 항원 제시 세포에 의해 T 세포로 전달되는 신호는 T 세포 프로그래밍 및 이들의 후속적 치료 효능에 영향을 미칠 수 있다. 이는 T 세포에 제공된 신호에 대한 최적의 제어를 허용하는 인공 항원 제시 세포를 개발하는 노력을 자극했다(참조: Turtle 등, 2010). 목적하는 항체 또는 항원 이외에, aAPC 시스템은 또한 적어도 하나의 외인성 보조 분자를 포함할수 있다. 보조 분자의 임의의 적합한 수 및 조합이 사용될 수 있다. 보조 분자는 공동-자극 분자 및 접착 분자와 같은 보조 분자로부터 선택될 수 있다. 예시적인 공동-자극 분자는 T 세포의 표면 위에서 CD28 및/또는 CTLA-4 분자에 결합하여, 예를 들면, 다음에 영향을 미칠 수 있는 CD70 및 B7.1(또한 B7 또는 CD80으로 칭명됨)을 포함한다: T-세포 확대, Th1 분화, 단기간 T-세포 생존, 및 인터류킨(IL)-2와 같은 사이토카인 분비(참조: Kim 등, 2004). 접착 분자는, 예를 들면, 세포-대-세포 또는 세포-대-매트릭스 접촉을 촉진시키는 셀렌틴과 같은 탄수화물 결합 당단백질, 인테그린과 같은 막관통 결합 당단백질, 캐드헤린과 같은 칼슘 의존 단백질, 및 세포내 접착 분자(ICAM)과 같은 단일-통과 막관통 면역글로불린(Ig) 슈퍼패밀리 단백질을 포함할 수 있다. 예시적인 접착 분자는 LFA-3 및 ICAM, 예를 들면, ICAM-1을 포함한다. 공동-자극 분자 및 접착 분자를 포함하는 예시적인 보조 분자의 선택, 클로닝, 제조 및 발현에 유용한 기술, 방법 및 시약은, 예를 들면, 다음에 예시된다: U.S. 특허 제 6,225,042호, 제6,355,479호 및 제6,362,001호.
aAPC가 되도록 선택된 세포는 바람직하게는 세포내 항원 처리, 세포내 펩티드 수송 및/또는 세포내 MHC 부류 I 또는 부류 II 분자-펩티드 부하에서 결핍을 갖거나, 변온성(즉, 포유동물 세포주보다 온도 도전에 덜 민감성)이거나, 결핍 및 변온 특성 둘 다를 포함한다. 바람직하게는, aAPC가 되도록 선택된 세포는 또한 외인성 MHC 부류 I 또는 부류 II 분자 및 세포 내에 도입된 원조 분자 성분에 대한 적어도 하나의 내인성 대응부(예: 상기한 바와 같은 내인성 MHC 부류 I 또는 부류 II 분자 및/또는 내인성 보조 분자)를 발현시키는 능력이 부족하다. 또한, aAPC는 바람직하게는 aAPC를 생성하기 위해 이들의 수정 전에 세포에 의해 포함된 결핍 및 변온 특성을 유지한다. 예시적인 aAPC는 곤충 세포주와 같은 항원 처리(TAP)-결함 세포주와 관련된 수송체를 구성하거나수송체로부터 유도된다. 예시적인 변온성 세포주는 초파리 세포주, 예를 들면, 슈나이더 2 세포주이다(예: Schneider, J.m 1972). 슈나이더 2 세포의 제조, 증식 및 배양을 위한 예시적 방법은 하기에 제공된다: U.S. 특허 제 6,225,042호, 제6,355,479호 및 제6,362,001호.
aAPC는 동결-해동 사이클에 제공될 수 있다. 예를 들면, aAPC는 동결이 신속하게 일어날 수 있도록 aAPC를 함유하는 적합한 용기를 적절한 양의 액체 질소, 고체 이산화탄소(드라이 아이스) 또는 유사한 저온 물질과 접촉시킴으로써 동결시킬 수 있다. 이어서, 동결된 aAPC는 저온 물질로부터 aAPC의 제거 및 주위 실온 조건에 노출에 의해 또는 보다 짧은 해동 시간을 촉진시키기 위해 미지근한 수욕 또는 따뜻한 손이 사용되는 촉진된 해동 공정에 의해 해동시킨다. 추가로, aAPC는 동결시키고 해동 전 연장된 시간 동안 저장할 수 있다. 동결된 aAPC는 또한 해동시킨 다음, 추가로 사용하기 전에 동결 건조시킬 수 있다. 동결-해동 절차에 유해하게 영향을 미칠 수 있는 방부제, 예를 들면, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 다른 방부제는 동결-해동 사이클을 경험하는 aAPC를 함유하는 배지로부터 유리하게 부재할 수 있거나, 예를 들면, 본질적으로 상기 방부제가 없는 배지로 aAPC의 전송에 의해 본질적으로 제거될 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 이종 핵산 및 aAPC에 내인성인 핵산은 본질적으로 핵산의 세포 증식, 복제 또는 발현이 불활성화 후 발생하지 않도록 가교결합에 의해 불활성화될 수 있다. 예를 들면, aAPC는 외인성 MHC 및 보조 분자의 발현, aAPC의 표면 상에서 이러한 분자의 제시 및 선택된 펩티드 또는 펩티드들과 함께 제시된 MHC 분자의 부하에 이어지는 시점에서 불활성화될 수 있다. 따라서, 이러한 불활성화되고 선택된 펩티드 부하 aAPC는 본질적으로 증식시키거나 복제할 수 없도록 하면서, 선택된 펩티드 제시 기능을 유지시킬 수 있다. 가교결합은 또한 실질적으로 aAPC의 항원 제시 세포 기능을 감소시키지 않고 세균 및 바이러스와 같은 미생물의 오염을 본질적으로 함유하지 않는 aAPC를 유도할 수 있다. 따라서, 가교결합은 aAPC를 사용하여 개발된 세포 치료 제품의 안정성에 대한 우려를 경감시키는것을 지원하면서 aAPC의 중요한 APC 기능을 유지시키기 위해 사용될 수 있다. 가교결합 및 aAPC에 관련된 방법에 대해, 예를 들면, 다음을 참조한다: U.S. 특허 출원 공보 제 20090017000호, 이는 본원에 참조로 인용된다.
IV. 실시예
다음 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 입증하기 위해 포함된다. 하기 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실시에서 충분히 기능하는 것으로 본 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내고, 따라서 이의 실시를 위한 바람직한 양식을 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 당업자에 의해 이해되어야 한다. 그러나, 당업자는, 본 개시에 비추어, 많은 변화가 개시된 특정 구현예에서 수행될 수 있고, 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않고 같거나 유사한 결과를 수득할 수 있음을 이해해야 한다.
실시예 1
재료 및 방법
임상 등급 DNA 플라스미드의 생성
SB 트랜스포손, CoOpCD19RCD28ξ/pSBSO는 신장 인자- 1a (EF-1a [Kim 등,로 구성된 EF-1/HTLV 하이브리드 복합 프로모터(InvivoGen)하에 인간 코돈 최적화된(CoOp) 제2 세대 CoOpCD19RCD28ξ CAR을 발현시킨다 1990] 및 인간 T-세포 백혈병 바이러스(HTLV)의 59개 비번역 영역[Singh 등, 2011; Davies 등, 2010]. 이 DAN 플라스미드의 유도는 도 S1에 기재된다. 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터하에, SB 트랜스포사제, SB11은 DNA 플라스미드 pCMV-SB11로부터 시스 형태로 발현된다(Singh 등, 2011; Singh 등, 2008). 두 플라스미드는 전체적으로 서열분석되었고, 세균 균주 이.의 선택을 위해 칸나마이신을 사용하여 와이즈만 클리니컬 바이오매뉴팩쳐링 퍼실러티(Madison, WI)에 의해 제조되었다 Coli DH5a.
삼중 부위 특이적 재조합 DNA 플라스미드 - EZ-빌드-CAR의 생성
상기한 CAR(CoOpCD19RCD28z/pSBSO)로부터 DNA 서열을 사용하여, 부분 CD19 ScFv, 힌지 IgG4 Fc 및 도메인 CD28 막통과 및 CD3ξ 신호전달 도메인과 접합된 시토졸 부분은 PCR 생성물로서 Geneart (Life Technologies)에 의해 합성된 람다 재조합 부위와 인접시켰다. 이러한 세 부분은 개별적으로 pDonors221 플라스미드에 삽입시켰다(효소 BP 클로나제에 의해(둘 다 Invitrogen으로부터). 3개의 플라스미드를 EZ-빌드 CD19CD28ξ CAR을 scFv- B -스캐폴드- C -신호전달 도메인(들)의 포맷으로 생성하는 효소 LR PLUS 클로나제(Invitrogen)에 의해 삼중 부위 특이적 재조합 슬리핑 뷰티 플라스미드와 재조합시켰다.(도 1).
세포 계수
트리판-블루 배제를 죽은 세포로부터 살아 있는 세포를 구별하기 위해 사용하였고, 셀로미터(Nexecelom Bioscience)를 사용하여 계수했다(Singh 등, 2011).
PBMC의 단리
두 남성 자원 봉사자 건강한 공여자로부터 백혈구 성분 채집 제품은 Key Biologics LLC(Memphis, TN)에서 구입하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 cGMP에 준거하여 작업하기 위한 Biosafe Sepax system(Eysins, Switzerland)을 적합화함으로써 단리시켰다. 간단하게, CS-900 키트 상에서 클램프를 모두 밀폐시킨 후, 100mL 피콜(GE Healthcare)을 루어-락 커넥터를 통해 밀도 구배 배지 백("피콜 백")으로 60mL 시린지를 통해 무균적으로 전송시키고, 튜브를 핸드 헬드 실러(Sebra, Model# 2380)를 사용하여 가열 밀봉시켰다. 키트는 세척물을 위한 20mL 25% 인간 혈청 알부민(HSA)(Baxter)(2% v/v, 세척 완충제)과 함께 CliniMACS 완충제(PBS/EDTA, Miltenyi, Cat#70026)를 함유하는 1,000mL 백, 최종 생성물 백[커플러를 갖는 300 mL 전송 팩(Baxter/ Fenwal 4R2014)] 및 시약/혈액 백에 스파이크 연결시켰다. 밀도 구배 기반 분리 프로토콜(v126)을 사용하여, 시린지 피스톤을 CAR+ T 세포를 선택적으로 전파시키기 위해 원심분리 챔버 및 Sepax aAPC의 커버(클론 #4)에 부하하고, c-조사된 aAPC를 유전적으로 수정된 T 세포를 수치 확대하기 위해 사용했다. WCB로부터 해동된 aAPC를 VueLife 세포 배양 백 중에서 최대 60일 동안 CM으로 전파시키고, Biosafe Sepax II 수거 절차를 사용하여 수거했다. 간단하게, CS-490.1 키트를 루어 락 연결을 통해 300mL 출력 백(전송 팩)에 연결시켰다. 분리 챔버를 피트 내에 설치하고, 튜브를 T-위치로 배열된 광학 센서 및 마개에 삽입했다. 압력 센서 라인을 연결시킨 후, 생성물 백 및 상청액/혈장 백을 홀더 상에 걸었다. 수정된 프로토콜 PBSCv302는 Sepax 메뉴로부터 선택했고, 처리될 입력 생성물의 용적(초기 용적)을 #840 mL로 설정했다. 검증 및 키트 시험 후, 절차를 개시했다. 완료 후, 백을 제거하고, 클램프를 밀폐시키고, 키트를 제거했다. 최종 생성물 백으로부터 세포를 무균적으로 제거하고, 세척 배지(플라스말리트 중 10% HSA)로 2회 세척하고, 계수했다. aAPC를 CIS BIO 인터내셔널 라디에이터(IBL-437 C#09433)를 사용하여 조사했고(100 Gy), 제어된 속도 동결기(Planer Kryo 750)를 사용하여 동결보존 배지 중에서 이후 사용을 위해 동결 보존시켰다. 항-CD3 (OKT3) 부하된 K562-유래 aAPC 클론 #4를 유전적 수정을 받지 않은 대조군 (CARneg) 자가 조절 T 세포를 증식시키기 위해 사용했다. 배양물로부터 수득된 aAPC를 적재 배지(LM)라 칭명되는, 0.2% 아세틸 시스테인(Acetadote, Cumberland Pharmaceuticals)을 함유하는 혈청 부재 X-Vivo 15(cat # 04-744Q, Lonza)에서 밤새 배양했다. 다음 날, 세포를 세척하고, Gamma Cell 1000 Elite Cs-137 라디에이터(MDS Nordion)를 사용하여 조사하고(100 Gy), 1mg/106 세포의 기능적 등급 정제된 항-인간 CD3(클론-OKT3, 16-0037-85, eBioscience)과 함께 106 세포/mL의 농도로 LM에 재현탁시키고, 30분 동안 40C에서 3-D 회전체(Lab-Line) 상에서 완만하게 진탕시키면서 배양했다. LM으로 3회 세척 후, 세포를 실험에 사용하거나 이후 사용을 위해 증기 층 중 액체 질소에 분량으로 동결시켰다.
CAR+ T 세포의 제조
해동된 PBMC를 (i) 인간 T-세포 키트(cat# VPA-1002, Lonza; 하나의 큐벳 중의 2x107에 대해 100 μL)에, (ii) CD19RCD28 CAR 트랜스포손 (큐벳당 2x107 PBMC 당 15 μg 슈퍼코일된 DNA)을 인코딩하는 DNA 플라스미드 (CoOpCD19RCD28/pSBSO) 및 (iii) SB11 트랜스포사제 (큐벳당 2x107 PBMC 당 5 μg 슈퍼코일된 DNA)를 인코딩하는 DNA 플라스미드 (pCMVSB11)와 함께 재현탁시켰다. 이 혼합물을 즉시 큐벳(Lonza)으로 옮기고, Nucleofector II (Program U-14, Amaxa/Lonza)를 사용하여 전기천공시키고(배양 0일째를 정의하는), 2 내지 3시간 후 10% RPMI 완전 배지 중에 휴지시키고, 1/2 배지를 변경한 후, 37oC, 5% CO2에서 밤새 배양했다. 다음 날, 세포를 수거하고, 계수하고, 유동 세포 분석법으로 표현형화하고, c-조사된 aAPC를 사용하여 1:2 (CAR + T cell:aAPC)의 비로 공배양하고, 이는 배양 1일째 및 7일 자극 사이클의 개시시 마킹했다. IL-21 (cat # AF-200-21, PeproTech) 및 IL-2 (cat # NDC 65483-116-07, Novartis)를 각각 1일 및 7일째의 월요일-수요일-금요일 스케쥴 진행에 추가했다 NK 세포는, 특히 과증식이 조직 배양 공정에서 초기에 발생하는 경우 CAR + T 세포의 수치 확대를 방지할 수 있다. 따라서, CD3negCD56 + 세포 $10%가 25% HSA (80 mL/107 세포)를 함유하는 CliniMACS 완충제 중의 LS 컬럼 (cat #130-042-401, Miltenyi Biotech) 상에서 CD56 비즈(cat #70206, Miltenyi Biotech, 20 mL 비즈/107 세포)를 사용하는 경우, CD56-고갈을 수행했다.
CAR neg 제어 T 세포의 생성
대조군으로서, 5x106 모의 형질 감염된 PBMC를 7일 자극 사이클에서 조사된 항-CD3 (OKT3) 부하된 K562-유래된 aAPC 클론 #4와 1:1의 비로 공배양했다. 모든 배양물은 배양 후 1일째로부터 IL-21 (30 ng/mL)을, 배양 개시 후 7일째에 개시하여 IL-2 (50 U/mL)를 보충했다. 후속적으로, 모든 사이토카인을 격일로 첨가했다
세포의 면역표현형
세포를 4oC에서 30분 동안 100 mL FACS 완충제 (2% FBS, 0.1% 나트륨 아지드) 중의 항체를 사용하여 염색했다. 취득은 FACSCalibur (BD Bioscience)를 사용하여 수행하고 FCS Express 3.00.0612를 사용하여 분석했다.
크롬 방출 검정
T 세포는 51Cr-표지된 표적 세포를 사용하여 표준 4시간 크롬 방출 검정으로 이들의세포독성에 평가했다. T 세포는 1x105, 0.5x105, 0.25x105, 0.125x105 기저 플레이트(Costar)에서 삼중으로 플레이팅했다. 배양 후, 50 L의 상청액을 LumaPlate(Perkin Elmer) 상에서 수거하고, TopCount NXT(Perkin Elmer)로 판독하고, 특이적 용해 퍼센트는 다음에 따라 계산했다:
Figure pct00009
자발적 및 최대 방출은 각각 CM 또는 0.1% 트리톤 X-100 (Sigma)로 배양한 표적 세포로부터 조정된 상청액에서 크롬을 96-웰 V (Manufacturee Novo Software, Thornhill, Ontario, Canada)에서 5x103 표적 세포를 사용하여 0.0625x105 세포/웰로 측정함으로써 결정되었다.
실시예 2
CD19 + CAR의 생성
CD19+ CAR은 실시예 1에서 상기 기재된 방법("EZ" 방법으로서 칭명됨)을 사용하여 생성했다. 이러한 CD19+ CAR (CD19CAR)은 이전 방법을 통해 생성된 임상 등급 ("CG") CD19CAR과 비교했다.
데이터는 삼중 부위-재조합 시스템은 임상 등급 CD19CAR (CG)과 유사한 CD19CAR (EZ)를 생성했음을 나타냈다. 플라스미드 중의 재조합-부위가 남긴 발자국은 CAR의 발현 및 기능을 간섭하지 않았다 (도 2a-b).
실시예 3
(CD8, CD28) 막관통 도메인 및 (CD28, 4- 1BB ) 신호전달 도메인을 함유하는 CAR의 생성
시험된 다양한 CAR는 유사한 확대, 세포독성 및 Th1 세포독성을 나타냈다. CD19-BB-z는 Th2 사이토카인의 낮은 생산을 나타냈고; 생체내에서, 이는 마우스의 질환을 제어하는데 효율적이었다(참조: Molecular Therapy 17 (8): 1453-1464, 2009). 그럼에도 불구하고, 세포가 항원 자극 없이 시험관내에서 지속되었다는 사실에 기인하는 우려가 존재한다.
임상 중 CAR은 이하 표 2에 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 발명의 CAR은 이하 표 2에 나타낸 바와 같이 특정 작제물을 갖지 않는다. 또는, 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 그럼에도 현재 임상에 사용되는 CAR과 별개인 이하 표2에 언급된 CAR의 특성을 갖는 CAR의 다른 변형을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
표 2: 임상 중 CAR
Figure pct00010
특정 CAR 작제물 설계는 다음에 도시되어 있다: 도 3. 다음에 나타낸 바와 같이: 도 3, CD19scfv, CD8a 힌지 또는 IgG4 Fc 스토크, CD8 막관통 (TM) 또는 CD28 TM 또는 CD137 TM의 조합을 사용하여 각종 CAR의 개략도 및 CD3제타 엔도도메인과 함께 CD28 또는 CD137 엔도도메인을 통한 신호전달이 생성되었다.
다음에 도시된 CAR 작제물: 도 이어서, 3은 통상의 CVseq7 프라이머를 사용하여 증폭된 경우 경쟁적 재집단 연구에서 추적할 수있는 SIM 및 FRA 태그를 함유하는 슬리핑 뷰티 플라스미드로 클로닝했다. 슬리핑 뷰트 추적 플라스미드는 다음에 나타낸다: 도 4.
다음에 도시된 CAR 작제물: 도 3은 Amaxa Nucleofector II를 사용하여 T 세포에서 전기천공시키고, 사이토카인(IL2, IL-21)의 존재하에 28일 동안 aAPC와 공배양했다. 전기천공 후 날(1일) 및 aAPC와 공배양 28일 후(28일) CAR 발현이 제시된다. CD3 및 CAR의 도트-플롯이 제시되고, 여기서 CD3 및 항-CD19scfv 특이적 Ab가 T 세포 및 CAR를 구별하기 위해 사용되었다. CAR 발현 결과는 다음에 나타낸다: 도 5.
다음에 도시된 CAR 작제물: 도 3은 28일 동안 경시적으로 CAR 발현에 대해 평가하여 나타낸다. 21일 후, 대부분의 배양물은 >80% CAR 발현이 있었다. CAR 발현 동태는 다음에 나타낸다: 도 6.
도 3으로부터 CAR이 핵안 도입된 배양물 중 CD4 및 CD8 T 세포의 발현 퍼센트는 aAPC와 공배양 28일 후 나타낸다. 이러한 표현형 결과는 다음에 나타낸다: 도 7.
공양 28일 후, CAR+ T 세포 (다음에 기재된 CAR를 발현시킴: 도 3)는 메모리 (CD45RA, CCR7, CD27), 활성화 (CD69, HLA-DR), 세포독성 (퍼포린, 그랜자임 B), 고갈/노화 (CD57, KLRG1, PD1) 및 접착성 (CD39, CD150)에 관련되는 마커의 발현에 대해 평가했다. 이 확대된 표현형에 관한 결과는 다음에 나타낸다: 도 8a-b.
CAR+ T 세포 (다음에 기재된 CAR을 발현시킴: 도 3)는 웨스턴 블롯을 사용하여 CD3 ξ의 발현에 대해 평가했다. 세포 용해물은 변성 조건하에 작동시키고, 이동시키고, 키메라 CD3 ξ의 발현은 SuperSignal 웨스트 펨토 최대 감도 기질을 사용하는 1차 마우스 항-인간 CD3ξ mAb 및 HRP-접합 염소 항-마우스 IgG를 사용하여 측정했다. 52, 71 및 78 kD에서 키메라 CD3ξ 밴드가 CAR 작제물의 크기에 배해 관찰되었다. 이러한 웨스턴 블롯 결과는 다음에 나타낸다: 도 9.
CAR 작제물로 전기천공된 T 세포(다음에 기재됨: 도 3)는 28일 동안 1일째 및 이후 7일 마다 K562 aAPC로 자극시켰다. 각 자극 사이클의 말기에, 세포는 트리판 블루 배제 방법을 사용하여 계수하고, CD3 및 CAR 발현을 위해 표현형화했다. 다음에 도시된 그래프: 도 10은 경시적으로 전체, CD3, 및 CAR+ T 세포에 대한 추론 세포 수를 나타낸다.
세포의 팽창을 측정했다. 전체 세포 (도 11) 및 CAR+ (도 12) T 세포에 대한 중첩 팽창은 (전기천공 후) 1일까지 계수를 비교함으로써 공배양 14일, 21일 및 28일째에 계산했다. 결과는 다음에 나타낸다: 도 11 및 도 12.
세포독성은 CAR-발현 T 세포(CAR+ T 세포)에 대해 측정했다. CAR+ T 세포 (다음에 기재된 CAR을 발현시킴: 도 3)은 표준 4시간 크롬 방출 검정에서 CD19neg EL-4와 비교하여 CD19+ 종양 표적 (Daudiβ2m, NALM-6 및 CD19+ EL-4)에 대한 이들의 세포독성에 대해 평가했다. 결과는 다음에 나타낸다: 도 13, 도 14, 도 15, 및 도 16.
세포내 IFN-γ 생산. CAR+ T 세포 (다음에 기재된 작제물을 발현시킴: 도 3)는 4 내지 6시간 동안 단백질 수송 억제제의 존재하에 (CD19+ 및 CD19neg) 자극 세포로 배양하고, 고정시키고, 투과처리하고, IFN- γ 특이적 mAb로 염색했다. PMA-이오노마이신은 양성 대조군으로서 사용했다. 세포내 IFN-γ 생산의 결과는 다음에 나타낸다: 도 17, 도 18, 도 19, 및 도 20.
SB11 트랜스포사제를 위한 PCR. CAR+ T 세포로부터 단리된 DNA(도 3)는 열 순환기에서 SB11 특이적 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. GAPDH는 하우스키핑 유전자로서 사용했고, pCMV-SB11 플라스미드를 선형화하고, SB11을 발현시키는 주르카트 세포로부터 게놈 DNA를 양성 대조군으로서 사용했다. CARneg 세포(DNA 없음)는 음성 대조군으로서 사용했다. 이러한 PCR 결과는 다음에 나타낸다: 도 21.
CAR 카피 수는 정량적 PCR (qPCR)을 사용하여 측정하였다. (다음에 도시된 CAR 작제물: 도의 세포 중 CAR 이식 유전자의 통합 수 3)는 IgG4 Fc 스토크 및 반전/직접 반복체 (IR/DR)에 대해 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용하여 게놈 DNA를 증폭시킴으로써 평가했다. RNAse P 유전자는 내부 대조군으로서 사용했고, CAR의 단일 카피를 발현시키는 주르카트 세포주는 표준 곡선을 생성하기 위해 사용했다. 결과는 다음에 나타낸다: 도 22.
이어서, CAR+ T 세포는 자율적 증식의 존재 또는 부재에 대해 측정했다. CAR + T 세포(도 3에서 보여진 CAR 작제물을 발현시킴)의 이상 증식을 모니터하고, 사이토카인 및 aAPC의 부재하에 T 세포를 배양함으로써 측정했다. 세포를 7일마다 계수하고, 살아 있는 세포/ 죽은 세포(1일째로부터) 퍼센트를 계산하고 플롯팅했다. 다음에 나타낸 바와 같이: 도 23, 80% 이상의 T 세포가 14일까지 죽은 것으로 관찰되어 자율적 증식의 부족을 나타낸다.
다양한 CAR이 발현될 수 있었고(>80%), 확대되었고(약 1010), 유사한 정도로 세포독성이었다(약 60%, Daudi). 스캐폴딩 도메인 (IgG4 또는 CD8α)은 CAR을 증강시키기 위해 사용되었고, 발현 및 효력에 영향을 미치지 않았다. 막관통 도메인(CD8, CD28)은 효력에 영향을 미치지 않았다. 4-1BB 막관통 도메인(216)은 발현(anti-scFv Ab)에 영향을 미쳤지만, 세포독성 및 사이토카인 생산에는 미치지 않았다. 신호전달 도메인, CD28 및 4-1BB의 조합은 부가 효과를 갖지 않았다. CAR+ T 세포는 메모리/이펙터 표현형을 나타냈다. 단지 4-1BB 도메인(212, 214, 217)을 함유하는 CAR은 다른 것들과 비교하여 더 높은 CCR7 발현을 나타냈다. 세포는 메모리(CD27hi, CD45RAhi, CCR7lo), 활성화 (CD69med, HLA-DRhi), 세포용해 (granzymehi, perforinlo) 및 접착성 (CD39hi, CD150lo)을 위한 마커를 발현시키지만, 무시할만한 양의 억제성 마커 (CD57, PD1, KLRG1)가 관찰되었다. 4-1BB 도메인을 함유하는 것을 포함하는 모든 CAR은 SB11 트랜스포사제가 부족하고, 자가 증식하지 않았다.
실시예 4
CD3-제타를 함유하는 CAR의 생성
CD3ξ를 함유하는 CAR이 이 실시예에 제공된다. CAR 설계의 일반적 다이아그램이 다음에 제시된다: 도 24. 다음에 나타낸 바와 같이: 도 24, CAR 설계(도 의 비교 항체 분자(도 24, 좌측)와 함께 24, 우측)을 나타낸다.
CD3ξ 서열은 다음에 나타낸다: 도 25. CD3제타 및 이의 아이소폼의 서열은 다음에 나타낸다: 도 25. CAR 설계는 엔도도메인 신호전달 잔기 중의 하나를 형성하고 3개의 ITAM을 갖는 CD3 제타 (아이소폼 1)를 포함했다.
특정 CAR 작제물은 다음에 도시되어 있다: 도 26 및 도 27. 도 26은 CD28 또는 CD137 엔도도메인을 통해 신호전달하는 긴 (IgG4), 중간 (CD8a 힌지) 및 작은 (IgG 12 aa) 스토크를 갖는 CD19-특이적 CAR의 개략도를 도시한다. 상이한 스토크 및 신호전달을 갖는 CAR 분자의 명명법은 다음에 도시된다: 도 27.
CAR 발현을 측정하였다. CAR의 발현 (다음에 기재됨: 도 26)은 전기천공 후 날(1일) 및 aAPC 상에서 공배양 28일 후(28일)에 측정했다. CD3 및 CAR의 도트 플롯(CD19scfv-특이적 mAb에 의해 측정됨)은 다음에 도시된다: 도 28.
CAR에 대한 팽창 동태를 측정하였다. CAR 작제물(다음에 도시됨: 도로 전기천공된 T 세포 26)은 7일 자극 사이클로 aAPC 상에서 공배양시켰다. 세포를 계수하고, CD3 및 CAR의 발현에 대해 평가했다. 결과는 다음에 나타낸다: 도 29 및 도 30.
CAR+ T 세포의 세포독성을 측정하였다. 공배양 28일의 말기에, CAR+ T 세포(다음에 도시된 작제물을 발현시킴: 도 26)는 크롬 방출 검정으로 종양 표적에 대한 세포독성에 대해 평가하였다. 도 31에 도시된 바와 같이, 세포독성 퍼센트는 CD19+ 및 CD19neg 종양 표적에 대한 CD19RCD28 (CAR 194) 및 CD19RCD137 (CAR 217) CAR의 다양한 이펙터-대-표적 비로 측정하였다. 도 32에 도시된 바와 같이, CAR+ T 세포 (다음에 도시된 CAR 작제물을 발현시킴: 도 33에 의한 CD19+ EL-4의 용해 퍼센트에 대한 데이터가 수득되었다 26) E:T 비 20:1에서. CAR+ T 세포(다음에 도시된 작제물을 발현시킴: 도 상에서 CD27, CD62L, CD28 및 CCR7의 발현 퍼센트 26)를 측정하였고, 결과는 다음에 나타낸다.
세포내 사이토카인 생산은 CAR+ T 세포에 대해 측정하였다. 자극 세포 (CD19+ 및 CD19neg)를 CAR+ T 세포 (다음에 도시된 CAR을 발현시킴: 도와 배양시켰다 26) 단백질 수송 억제제의 존재하에 4시간 동안, 그리고 IFN- γ 및 IL-2 mAb로 염색하였다. PMA-이오노마이신은 양성 대조군으로서 기능하고, T 세포는 단독으로 음성 대조군으로서 기능하였다. 도 34는 자극 후 IFN- γ 생산 세포의 퍼센트를 도시한다. 도 35 세포 자극 칵테일(PMA-이오노마이신)과 배양 후 IFN- γ 및 또는 IL-2 생산 세포의 분해를도시한다.
CAR+ T 세포는 자율적 증식의 부재의 존재에 대해 측정하였다. CAR+ T 세포 (다음에 기재된 CAR을 발현시킴: 도 26)는 18일 동안 외부 자극 (사이토카인 및 aAPC)의 부재하에서 이상 증식의 부족에 대해 평가하였다. 18일의 말기에, 80% 이상의 세포가 죽어 불필요한 증식의 부족을 나타내었다. 다음에 나타낸 바와 같이: 도 36, 자율적 증식의 부족이 관찰되었다.
CAR 카피 수가 CAR+ T 세포에서 측정되었다. 통합된 CAR 분자의 카피 수는 qPCR에 의해 IgG4-Fc 및 IR/DR 영역에 특이적인 프라이머/프로브를 사용하여 평가하였다. 도 37에 도시된 바와 같이, (도 26에 도시된 CAR의 통합된 CAR 카피 수)는 IR/DR 프로브를 사용하여 관찰하였다. 두 개의 별도의 실험(P491;C714 및 GCR357861)에서 시험된 바와 같이, 도 38 및 도 39에 도시된 바와 같이, CAR 카피 수 데이터의 편집은 (도 3에 도시된 CAR 작제물 및 도 26에서 도시된 CAR 작제물 둘 모두에 대해) CAR 작제물에 대해 표 및 그래프 형태로 제공된다.
이러한 데이터는, 다양한 스페이서를 갖는 CAR이 발현될 수 있고, 본원에 기재된 배양 시스템에서 시험관내 증식될 수 있음을 나타낸다. 모든 CAR은 유사한 CAR 발현을 갖는 것으로 관찰되었다. CD19+ EL-4의 최대 세포독성은 CD8 힌지 영역을 갖는 CAR에서 관찰되었다. CD62L 및 CD28의 유사한 발현이 시험된 모든 CAR에 대해 관찰되었다. CAR 카피 수에 의해 측정된 고집적 주파수는, IgG4-Fc 스토크를 함유하는 CAR를 제외한 모든 CAR에서 관찰되었다. 자율적 증식 및 SB11의 부족은 PCR에 의해 관찰되었다. 이전 보고서와 반대로, CAR에 12aa 스페이서를 포함시키면 이러한 연구에서 개선된 기능성을 부여하지 않았다.
실시예 5
주요 성분으로부터 CAR의 신속한 조립
본 발명자들은 임상 등급 CD19RCD28mξ CAR+ T 세포(CG CAR)와 병행하여 EZ CAR 플랫폼을 사용하여 키메라 CD28/CD3-제타를 통해 활성화된 CD19-특이적 CAR을 생성했다. 임상 등급 CD28/CD3-ξ 및 EZ CAR CD19RCD28mξ CAR 서열 둘 다를 슬리핑 뷰티 트랜스포손 벡터에 삽입하고, T 세포에 전기 천공하였다. 전기천공 후, T 세포는 T 세포의 항원 특이적 팽창을 위해 CD19+ 인공 항원 제시 세포 (또한 활성화 및 전파 세포, 또는 AaPC로서 칭명됨)의 존재하에 배양했다. T 세포의 표면에서 CAR의 발현은 유동 세포 분석법 (Fc+ 발현)에 의해 매주 측정하여, 임상등급 CD19 CAR T 세포 및 EZ CD19 CAR T 세포에서 유사한 CAR 발현을 나타내었다. 크롬 방출 검정(CRA)은 또한 종양 세포에 대한 EZ CAR에 의해 생성된 T 세포 CD19 CAR+의 사멸 기능을 평가하기 위해 실행하였다. 4시간 배양 후, 특이적 세포 용해의 퍼센트는 EZ CAR T 세포에 의해 52%, CG CAR T 세포에 의해 49%인 것으로 관찰되었다.
이러한 결과는, 기능적 CAR+ T 세포가 이러한 방법을 사용하여 생성되었음을 입증한다. 이어서, 본 발명자들은 CAR 분자의 다음 세 성분을 함유하는 플라스미드의 라이브러리와 함께 상기 기재된 방법을 사용하여 CAR의 신속한 생산을 수행하였다: (i) 항-CD19 scFv (ii) 상이한 크기를 갖는 5개 힌지 (긴 - IgG4a 및 IgG4ΔEQ, 중간 - CD8α, 짧은 - t-20AA 및 t-12AA) 및 (iii) CD3ξ 도메인과 7개 신호전달 도메인(CD27, CD28, CD28ΔY173
Figure pct00011
F173, CD134, CD137, CD278)의 상이한 조합. CAR 이식 유전자 를 함유하는 플라스미드로 HEK 293 세포의 형질감염은 세포 표면에서 CAR 단백질의 발현을 보장하기 위한 27개의 상이한 CAR 작제물을 스크리닝하기 위해 사용되었다. 개별 CAR 분자의 높은 처리량 시험은 iQueTM 스크리너 (Intellicyt, Albuquerque, NM), 고처리량 유동 세포 분석기를 사용하여 착수하였고, 여기서 세포독성 검정은 형광성 그랜자임 B 리포터 또는 GFP를 발현시키는 유전자조작된 표적 세포를 사용하여 수행된다. 결과는 다음에 나타낸다: 도 40a-e.
추가의 실험은 IntelliCyt's iQueTM을 사용하여 CAR 분자를 스크리닝하기 위해 실행하였다. iQueTM은 다중화 기능 및 세포에 의한 세포 분석을 사용하여 대규모 집단을 연구함으로써 정보를 생성하는 보완 기술인 고처리량 유동 세포 분석법을 사용한다. 본 발명자들은 CAR의 패널로 수정된 T 세포의 치료학적 가능성에 대해 통지하는 이 기술을 채택했다. 웰로부터 T 세포를 활성화 신호(예: CD25의 상향조절), 사이토카인 방출 및 사멸 뿐만아니라 생존능력을 위해 염색할 수 있다. 따라서, 발명자들은 iQue 스크리너를 채택하고, 다중화 비드-기반 사이토카인 검출 및 세포 기반검정을 수행하는 이의 능력을 활용했다. 수득된 결과는, 이 기술은 EZ CAR 플랫폼에 의해 생성된 다수의 상이한 CAR T 세포를 시험하기 위해 사용될 수 있음을 나타낸다. 데이터는 IntelliCyt's iQueTM을 사용하여 생성하였고, 여기서 2개 집단의 CAR T 세포는 표적 세포를 사멸하는 이들의 능력에 대해 평가하였다. 결과는 다음에 나타낸다: 도 41a-b 및 도 42. 이러한 결과는, CAR 분자가 활성이었고, iQueTM 방법이 CAR 활성을 평가하기 위해 효과적으로 사용될 수 있음을 입증한다.
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본원에 개시되고 특허청구된 방법 모두가 본 개시에 비추어 과도한 실험 없이 제조되고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 구현예와 관련하여 기재되었지만, 본 발명의 개념, 취지 및 범위로부터 벗어나지 않고 본원에 기재된 방법 및 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변형이 적용될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련된 특정 제제가 동일하거나 유사한 결과가 달성되는 동안 본원에서 기재된 제제를 치환할 수 있음이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 이러한 유사한 치환체 및 수정이 모두 첨부된 특허청구범위에 의해 정의된 본 발명의 취지, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.
참조문헌
다음 참조문헌은 그들이 본원에 제시된 것들을 보충하는 예시적 절차 또는 다른 상세함을 제공하는 정도로 구체적으로 본원에 참고로 인용된다.
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
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Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 50 55 60 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 100 105 <210> 53 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 53 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 50 55 60 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 54 <211> 111 <212> PRT <213> 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accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300 gagcaggagg acatcgccac ctacttttgc cagcagggca acacactgcc ctacaccttt 360 ggcggcggaa caaagctgga gatcaccggc agcacctccg gcagcggcaa gcctggcagc 420 ggcgagggca gcaccaaggg cgaggtgaag ctgcaggaga gcggccctgg cctggtggcc 480 cccagccaga gcctgagcgt gacctgtacc gtgtccggcg tgtccctgcc cgactacggc 540 gtgtcctgga tccggcagcc ccctaggaag ggcctggagt ggctgggcgt gatctggggc 600 agcgagacca cctactacaa cagcgccctg aagagccggc tgaccatcat caaggacaac 660 agcaagagcc aggtgttcct gaagatgaac agcctgcaga ccgacgacac cgccatctac 720 tactgtgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggactactg gggccagggc 780 accagcgtga ccgtgtccag cgagagcaag tacggccctc cctgcccccc ttgccctgcc 840 cccgagttcc tgggcggacc cagcgtgttc ctgttccccc ccaagcccaa ggacaccctg 900 atgatcagcc ggacccccga ggtgacctgt gtggtggtgg acgtgtccca ggaggacccc 960 gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc 1020 cgggaggagc agttcaatag cacctaccgg gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag 1080 gactggctga acggcaagga atacaagtgt aaggtgtcca acaagggcct gcccagcagc 1140 atcgagaaaa ccatcagcaa ggccaagggc cagcctcggg agccccaggt gtacaccctg 1200 ccccctagcc aagaggagat gaccaagaat caggtgtccc tgacctgcct ggtgaagggc 1260 ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaacg gccagcccga gaacaactac 1320 aagaccaccc cccctgtgct ggacagcgac ggcagcttct tcctgtacag caggctgacc 1380 gtggacaaga gccggtggca ggagggcaac gtctttagct gctccgtgat gcacgaggcc 1440 ctgcacaacc actacaccca gaagagcctg tccctgagcc tgggcaagat gttctgggtg 1500 ctggtcgtgg tgggtggcgt gctggcctgc tacagcctgc tggtgacagt ggccttcatc 1560 atcttttggg tgaggagcaa gcggagcaga ggcggccaca gcgactacat gaacatgacc 1620 ccccggaggc ctggccccac ccggaagcac taccagccct acgcccctcc cagggacttc 1680 gccgcctacc ggagccgggt gaagttcagc cggagcgccg acgcccctgc ctaccagcag 1740 ggccagaacc agctgtacaa cgagctgaac ctgggccgga gggaggagta cgacgtgctg 1800 gacaagcgga gaggccggga ccctgagatg ggcggcaagc cccggagaaa gaaccctcag 1860 gagggcctgt ataacgaact gcagaaagac aagatggccg aggcctacag cgagatcggc 1920 atgaagggcg agcggcggag gggcaagggc cacgacggcc tgtaccaggg cctgagcacc 1980 gccaccaagg atacctacga cgccctgcac atgcaggccc tgccccccag atga 2034 <210> 56 <211> 2040 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 56 atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgtgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60 atccccgaca tccagatgac ccagaccacc tccagcctga gcgccagcct gggcgaccgg 120 gtgaccatca gctgccgggc cagccaggac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 180 aagcccgacg gcaccgtcaa gctgctgatc taccacacca gccggctgca cagcggcgtg 240 cccagccggt ttagcggcag cggctccggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300 gagcaggagg acatcgccac ctacttttgc cagcagggca acacactgcc ctacaccttt 360 ggcggcggaa caaagctgga gatcaccggc agcacctccg gcagcggcaa gcctggcagc 420 ggcgagggca gcaccaaggg cgaggtgaag ctgcaggaga gcggccctgg cctggtggcc 480 cccagccaga gcctgagcgt gacctgtacc gtgtccggcg tgtccctgcc cgactacggc 540 gtgtcctgga tccggcagcc ccctaggaag ggcctggagt ggctgggcgt gatctggggc 600 agcgagacca cctactacaa cagcgccctg aagagccggc tgaccatcat caaggacaac 660 agcaagagcc aggtgttcct gaagatgaac agcctgcaga ccgacgacac cgccatctac 720 tactgtgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggactactg gggccagggc 780 accagcgtga ccgtgtccag cgagagcaag tacggccctc cctgcccccc ttgccctgcc 840 cccgagttcc tgggcggacc cagcgtgttc ctgttccccc ccaagcccaa ggacaccctg 900 atgatcagcc ggacccccga ggtgacctgt gtggtggtgg acgtgtccca ggaggacccc 960 gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc 1020 cgggaggagc agttcaatag cacctaccgg gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag 1080 gactggctga acggcaagga atacaagtgt aaggtgtcca acaagggcct gcccagcagc 1140 atcgagaaaa ccatcagcaa ggccaagggc cagcctcggg agccccaggt gtacaccctg 1200 ccccctagcc aagaggagat gaccaagaat caggtgtccc tgacctgcct ggtgaagggc 1260 ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaacg gccagcccga gaacaactac 1320 aagaccaccc cccctgtgct ggacagcgac ggcagcttct tcctgtacag caggctgacc 1380 gtggacaaga gccggtggca ggagggcaac gtctttagct gctccgtgat gcacgaggcc 1440 ctgcacaacc actacaccca gaagagcctg tccctgagcc tgggcaagat gatctacatc 1500 tgggcccctc tggccggcac ctgtggcgtg ctgctgctga gcctggtcat caccctgtac 1560 tgcaaccacc ggaacaagag aggccggaag aaactgctgt acatcttcaa gcagcccttc 1620 atgcggcccg tgcagaccac ccaggaagag gacggctgca gctgccggtt ccccgaggaa 1680 gaggaaggcg gctgcgaact gcgggtgaag ttcagccgga gcgccgacgc ccctgcctac 1740 cagcagggcc agaaccagct gtacaacgag ctgaacctgg gccggaggga ggagtacgac 1800 gtgctggaca agcggagagg ccgggaccct gagatgggcg gcaagccccg gagaaagaac 1860 cctcaggagg gcctgtataa cgaactgcag aaagacaaga tggccgaggc ctacagcgag 1920 atcggcatga agggcgagcg gcggaggggc aagggccacg acggcctgta ccagggcctg 1980 agcaccgcca ccaaggatac ctacgacgcc ctgcacatgc aggccctgcc ccccagatga 2040 2040 <210> 57 <211> 2037 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 57 atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgtgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60 atccccgaca tccagatgac ccagaccacc tccagcctga gcgccagcct gggcgaccgg 120 gtgaccatca gctgccgggc cagccaggac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 180 aagcccgacg gcaccgtcaa gctgctgatc taccacacca gccggctgca cagcggcgtg 240 cccagccggt ttagcggcag cggctccggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300 gagcaggagg acatcgccac ctacttttgc cagcagggca acacactgcc ctacaccttt 360 ggcggcggaa caaagctgga gatcaccggc agcacctccg gcagcggcaa gcctggcagc 420 ggcgagggca gcaccaaggg cgaggtgaag ctgcaggaga gcggccctgg cctggtggcc 480 cccagccaga gcctgagcgt gacctgtacc gtgtccggcg tgtccctgcc cgactacggc 540 gtgtcctgga tccggcagcc ccctaggaag ggcctggagt ggctgggcgt gatctggggc 600 agcgagacca cctactacaa cagcgccctg aagagccggc tgaccatcat caaggacaac 660 agcaagagcc aggtgttcct gaagatgaac agcctgcaga ccgacgacac cgccatctac 720 tactgtgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggactactg gggccagggc 780 accagcgtga ccgtgtccag cgagagcaag tacggccctc cctgcccccc ttgccctgcc 840 cccgagttcc tgggcggacc cagcgtgttc ctgttccccc ccaagcccaa ggacaccctg 900 atgatcagcc ggacccccga ggtgacctgt gtggtggtgg acgtgtccca ggaggacccc 960 gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc 1020 cgggaggagc agttcaatag cacctaccgg gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag 1080 gactggctga acggcaagga atacaagtgt aaggtgtcca acaagggcct gcccagcagc 1140 atcgagaaaa ccatcagcaa ggccaagggc cagcctcggg agccccaggt gtacaccctg 1200 ccccctagcc aagaggagat gaccaagaat caggtgtccc tgacctgcct ggtgaagggc 1260 ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaacg gccagcccga gaacaactac 1320 aagaccaccc cccctgtgct ggacagcgac ggcagcttct tcctgtacag caggctgacc 1380 gtggacaaga gccggtggca ggagggcaac gtctttagct gctccgtgat gcacgaggcc 1440 ctgcacaacc actacaccca gaagagcctg tccctgagcc tgggcaagat gatctacatc 1500 tgggcccctc tggccggcac ctgtggcgtg ctgctgctga gcctggtcat caccctgtac 1560 tgcaaccacc ggaataggag caagcggagc agaggcggcc acagcgacta catgaacatg 1620 accccccgga ggcctggccc cacccggaag cactaccagc cctacgcccc tcccagggac 1680 ttcgccgcct accggagccg ggtgaagttc agccggagcg ccgacgcccc tgcctaccag 1740 cagggccaga accagctgta caacgagctg aacctgggcc ggagggagga gtacgacgtg 1800 ctggacaagc ggagaggccg ggaccctgag atgggcggca agccccggag aaagaaccct 1860 caggagggcc tgtataacga actgcagaaa gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc 1920 ggcatgaagg gcgagcggcg gaggggcaag ggccacgacg gcctgtacca gggcctgagc 1980 accgccacca aggataccta cgacgccctg cacatgcagg ccctgccccc cagatga 2037 <210> 58 <211> 2037 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 58 atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgtgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60 atccccgaca tccagatgac ccagaccacc tccagcctga gcgccagcct gggcgaccgg 120 gtgaccatca gctgccgggc cagccaggac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 180 aagcccgacg gcaccgtcaa gctgctgatc taccacacca gccggctgca cagcggcgtg 240 cccagccggt ttagcggcag cggctccggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300 gagcaggagg acatcgccac ctacttttgc cagcagggca acacactgcc ctacaccttt 360 ggcggcggaa caaagctgga gatcaccggc agcacctccg gcagcggcaa gcctggcagc 420 ggcgagggca gcaccaaggg cgaggtgaag ctgcaggaga gcggccctgg cctggtggcc 480 cccagccaga gcctgagcgt gacctgtacc gtgtccggcg tgtccctgcc cgactacggc 540 gtgtcctgga tccggcagcc ccctaggaag ggcctggagt ggctgggcgt gatctggggc 600 agcgagacca cctactacaa cagcgccctg aagagccggc tgaccatcat caaggacaac 660 agcaagagcc aggtgttcct gaagatgaac agcctgcaga ccgacgacac cgccatctac 720 tactgtgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggactactg gggccagggc 780 accagcgtga ccgtgtccag cgagagcaag tacggccctc cctgcccccc ttgccctgcc 840 cccgagttcc tgggcggacc cagcgtgttc ctgttccccc ccaagcccaa ggacaccctg 900 atgatcagcc ggacccccga ggtgacctgt gtggtggtgg acgtgtccca ggaggacccc 960 gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc 1020 cgggaggagc agttcaatag cacctaccgg gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag 1080 gactggctga acggcaagga atacaagtgt aaggtgtcca acaagggcct gcccagcagc 1140 atcgagaaaa ccatcagcaa ggccaagggc cagcctcggg agccccaggt gtacaccctg 1200 ccccctagcc aagaggagat gaccaagaat caggtgtccc tgacctgcct ggtgaagggc 1260 ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaacg gccagcccga gaacaactac 1320 aagaccaccc cccctgtgct ggacagcgac ggcagcttct tcctgtacag caggctgacc 1380 gtggacaaga gccggtggca ggagggcaac gtctttagct gctccgtgat gcacgaggcc 1440 ctgcacaacc actacaccca gaagagcctg tccctgagcc tgggcaagat gattatctca 1500 ttcttcctgg ccctgacctc taccgccctg ctgtttctgc tgttctttct gaccctgcgg 1560 ttcagcgtgg tcaagagagg ccggaagaaa ctgctgtaca tcttcaagca gcccttcatg 1620 cggcccgtgc agaccaccca ggaagaggac ggctgcagct gccggttccc cgaggaagag 1680 gaaggcggct gcgaactgcg ggtgaagttc agccggagcg ccgacgcccc tgcctaccag 1740 cagggccaga accagctgta caacgagctg aacctgggcc ggagggagga gtacgacgtg 1800 ctggacaagc ggagaggccg ggaccctgag atgggcggca agccccggag aaagaaccct 1860 caggagggcc tgtataacga actgcagaaa gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc 1920 ggcatgaagg gcgagcggcg gaggggcaag ggccacgacg gcctgtacca gggcctgagc 1980 accgccacca aggataccta cgacgccctg cacatgcagg ccctgccccc cagatga 2037 <210> 59 <211> 2160 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 59 atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgtgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60 atccccgaca tccagatgac ccagaccacc tccagcctga gcgccagcct gggcgaccgg 120 gtgaccatca gctgccgggc cagccaggac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 180 aagcccgacg gcaccgtcaa gctgctgatc taccacacca gccggctgca cagcggcgtg 240 cccagccggt ttagcggcag cggctccggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300 gagcaggagg acatcgccac ctacttttgc cagcagggca acacactgcc ctacaccttt 360 ggcggcggaa caaagctgga gatcaccggc agcacctccg gcagcggcaa gcctggcagc 420 ggcgagggca gcaccaaggg cgaggtgaag ctgcaggaga gcggccctgg cctggtggcc 480 cccagccaga gcctgagcgt gacctgtacc gtgtccggcg tgtccctgcc cgactacggc 540 gtgtcctgga tccggcagcc ccctaggaag ggcctggagt ggctgggcgt gatctggggc 600 agcgagacca cctactacaa cagcgccctg aagagccggc tgaccatcat caaggacaac 660 agcaagagcc aggtgttcct gaagatgaac agcctgcaga ccgacgacac cgccatctac 720 tactgtgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggactactg gggccagggc 780 accagcgtga ccgtgtccag cgagagcaag tacggccctc cctgcccccc ttgccctgcc 840 cccgagttcc tgggcggacc cagcgtgttc ctgttccccc ccaagcccaa ggacaccctg 900 atgatcagcc ggacccccga ggtgacctgt gtggtggtgg acgtgtccca ggaggacccc 960 gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc 1020 cgggaggagc agttcaatag cacctaccgg gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag 1080 gactggctga acggcaagga atacaagtgt aaggtgtcca acaagggcct gcccagcagc 1140 atcgagaaaa ccatcagcaa ggccaagggc cagcctcggg agccccaggt gtacaccctg 1200 ccccctagcc aagaggagat gaccaagaat caggtgtccc tgacctgcct ggtgaagggc 1260 ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaacg gccagcccga gaacaactac 1320 aagaccaccc cccctgtgct ggacagcgac ggcagcttct tcctgtacag caggctgacc 1380 gtggacaaga gccggtggca ggagggcaac gtctttagct gctccgtgat gcacgaggcc 1440 ctgcacaacc actacaccca gaagagcctg tccctgagcc tgggcaagat gttctgggtg 1500 ctggtcgtgg tgggtggcgt gctggcctgc tacagcctgc tggtgacagt ggccttcatc 1560 atcttttggg tgaggagcaa gcggagcaga ggcggccaca gcgactacat gaacatgacc 1620 ccccggaggc ctggccccac ccggaagcac taccagccct acgcccctcc cagggacttc 1680 gccgcctacc ggagcaagag aggccggaag aaactgctgt acatcttcaa gcagcccttc 1740 atgcggcccg tgcagaccac ccaggaagag gacggctgca gctgccggtt ccccgaggaa 1800 gaggaaggcg gctgcgaact gcgggtgaag ttcagccgga gcgccgacgc ccctgcctac 1860 cagcagggcc agaaccagct gtacaacgag ctgaacctgg gccggaggga ggagtacgac 1920 gtgctggaca agcggagagg ccgggaccct gagatgggcg gcaagccccg gagaaagaac 1980 cctcaggagg gcctgtataa cgaactgcag aaagacaaga tggccgaggc ctacagcgag 2040 atcggcatga agggcgagcg gcggaggggc aagggccacg acggcctgta ccagggcctg 2100 agcaccgcca ccaaggatac ctacgacgcc ctgcacatgc aggccctgcc ccccagatga 2160 2160

Claims (88)

  1. 다음을 포함하는 조성물:
    (a) 하나 이상의 별개의 항원 결합 도메인을 인코딩하는 제1 벡터의 다수;
    (b) 하나 이상의 별개의 힌지 도메인을 인코딩하는 제2 벡터의 다수; 및
    (c) 하나 이상의 별개의 엔도도메인을 인코딩하는 제3 벡터의 다수;
    여기서, 상기 제1, 제2 및 제3 벡터 중 적어도 둘은 각각 별개의 항원 결합 도메인, 힌지 도메인및/또는 엔도도메인을 인코딩하는 둘 이상의 벡터의 다수를 포함하고, 추가로, 상기 벡터는 키메라 항원 수용체 (CAR)을 인코딩하는 제4 벡터의 생성을 가능하게 하는 상동 재조합 부위를 포함한다.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 다수의 제1 벡터가 다수의 별개의 항원 결합 도메인을 인코딩하고, 상기 다수의 제2 벡터가 하나의 힌지 도메인을 인코딩하고, 상기 다수의 제3 벡터가 다수의 별개의 엔도도메인을 인코딩하는, 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 다수의 제1 벡터가 다수의 별개의 항원 결합 도메인을 인코딩하고, 상기 다수의 제2 벡터가 다수의 별개의 힌지 도메인을 인코딩하고, 상기 다수의 제3 벡터가 다수의 별개의 엔도도메인을 인코딩하는, 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 다수의 제1 벡터가 다수의 별개의 항원 결합 도메인을 인코딩하고, 상기 다수의 제2 벡터가 다수의 별개의 힌지 도메인을 인코딩하고, 상기 다수의 제3 벡터가 하나의 엔도도메인을 인코딩하는, 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 다수의 제1 벡터가 하나의 항원 결합 도메인을 인코딩하고, 상기 다수의 제2 벡터가 다수의 별개의 힌지 도메인을 인코딩하고, 상기 다수의 제3 벡터가 다수의 별개의 엔도도메인을 인코딩하는, 조성물.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 scFv를 포함하거나 scFv로 이루어지는, 조성물.
  7. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 벡터가 막관통 도메인을 인코딩하는, 조성물.
  8. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 벡터가 막관통 도메인을 인코딩하는, 조성물.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 하나 이상의 막관통 도메인을 인코딩하는 제2 벡터의 다수를 추가로 포함하고, 상기 제1 벡터, 상기 제2 벡터, 상기 제3 벡터 및 상기 제4 벡터가 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 제4 벡터를 생성하기 위한 상동 재조합 부위를 포함하는, 조성물.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 벡터가 상동 재조합의 제1 서열 및 제2 부위를 포함하는, 조성물.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 벡터가 상동 재조합의 상기 제2 서열 및 상동 재조합의 제3 서열을 포함하는, 조성물.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 벡터가 상동 재조합의 상기 제3 서열 및 상동 재조합의 제4 서열을 포함하는, 조성물.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 벡터가 상동 재조합의 상기 제3 서열 및 상동 재조합의 제4 서열을 포함하는, 조성물.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제4 벡터가 상동 제조합의 상기 제1 서열 및 상동 재조합의 상기 제4 서열을 포함하는, 조성물.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 벡터, 상기 제2 벡터 및/또는 상기 제3 벡터가 트랜스포사제를 인코딩하는, 조성물.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스포사제가 연어과-형태 Tc1-형 트랜스포사제 (SB)인, 조성물.
  17. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 벡터, 상기 제2 벡터, 상기 제3 벡터 및/또는 상기 제4 벡터 중의 1, 2, 3, 4, 5개가 슬리핑 뷰티(SB) 또는 피기백 (piggyback) 트랜스포손 벡터인, 조성물.
  18. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 별개의 항원 결합 도메인이 선택적으로 상이한 항원에 결합하는, 조성물.
  19. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 별개의 항원 결합 도메인이 선택적으로 동일한 항원에 결합하는, 조성물.
  20. 청구항 1 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 선택적으로 CD19, 범용 항원 (마우스), HER-3, GD2, Gp75, CS1 단백질, 메소헬린(mesohelin), 포스파티딜세린, cMyc, CD22, CD4, CD44v6, CD45, CD28, CD3, CD3e, CD123, CD138, CD52, CD56, CD74, CD30, Gp75, CD38, CD33, CD20, Her1/HER3 융합, GD2, 탄수화물, 아스페르길루스( Aspergillus ), ROR1, c-MET, EGFR, 덱틴, 에볼라, 진균, GP, HERV-K (HERVK), NY-ESO-1, VEGF-R2, TGF-b2R, IgG4, 비오틴 또는 O-AcGD2에 결합하는, 조성물.
  21. 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 별개의 항원 결합 도메인이 scFv를 포함하거나 scFv로 이루어지는, 조성물.
  22. 청구항 1 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역이 12 AA 펩티드 (GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCT, 서열번호 1), t-20 AA 펩티드, IgG4 Fc Δ EQ, IgG4 Fc Δ Q, (t-12AA + t-20AA), mKate, phiLov, dsRed, Venus, eGFP, CH3 HA, (CD8 α + t-20AA), 이중 t-20 AA, (t-20AA + CD8α), (CD8α + 류신 지퍼 Basep1), (CD8α + 류신 지퍼 Acid1), 2D3, CD8 α 또는 IgG4 Fc를 인코딩하는, 조성물.
  23. 청구항 1 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도도메인 중 적어도 하나가 CD3ξ를 포함하는, 방법.
  24. 청구항 1 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도도메인 중 적어도 하나가 하나 이상의 ITAM 도메인을포함하는, 방법.
  25. 청구항 1 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도도메인 중 적어도 하나가 (CD28 +CD3ξ), (CD28 +CD27 + CD3ξ), (CD28 + OX40 + CD3ξ), (CD28 + 4-1BB + CD3ξ), (CD28 + CD27 + OX40 + CD3ξ), (CD28 + 4-1BB + CD27 + CD3ξ), (CD28 + 4-1BB + OX40 + CD3ξ), (4-1BB + CD3ξ), (4-1BB + OX40 + CD3ξ), (4-1BB + CD27 +CD3ξ), (CD27 + CD3ξ), (CD27 + OX 40 + CD3ξ), (CD28Δ +CD3ξ), (CD28Δ +CD27 + CD3ξ), (CD28Δ + OX40 + CD3ξ), (CD28Δ + 4-1BB + CD3ξ), (CD28Δ + 4-1BB + OX40 + CD3ξ), (CD28Δ + CD27 + OX40 + CD3ξ), (CD28Δ + 4-1BB + CD27 + CD3ξ), (4-1BB + ICOS + CD3ξ), (CD28 + ICOS + CD3ξ), (ICOS + CD3ξ), CD3ξ, CD28 단독을 포함하는, 방법.
  26. 별개의 항원 결합 도메인, 힌지 도메인 및 엔도도메인의 다수를 인코딩하는 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 벡터의 집합을 포함하는 조성물로서, 상기 집합체의 벡터가 상기 도메인에 대해 무작위화되는, 조성물.
  27. 다음을 포함하는, 각각 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 다수의 벡터를 생성하는 방법:
    (i) 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항의 조성물을 수득하는 단계; 및
    (ii) 다수의 제4 벡터를 생성하기 위해 상동 재조합을 통해 재조합하기 위해 상기 별개의 항원 결합 도메인, 힌지 도메인 및/또는 엔도도메인이 상기 벡터에 의해 인코딩되도록 하기에 충분한 조건하에 상기 조성물을 적용하는 단계로서, 상기 제4 벡터 각각이 CAR을 코팅하는, 단계.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 방법이 세포에서 CAR를 발현시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  29. 청구항 27 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 CAR을 활성에 대해 시험하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  30. 청구항 27 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 벡터 중 하나 이상이 scFv 영역을 인코딩하는, 방법.
  31. 청구항 27 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 벡터 중 하나 이상이 막관통 도메인을 인코딩하는, 방법.
  32. 청구항 27 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 벡터 중 하나 이상이 막관통 도메인을 인코딩하는, 방법.
  33. 청구항 27 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 제4 벡터를 형성하기 위해 막관통 도메인을 인코딩하는 제5 벡터를 상기 제1 벡터, 제2 벡터 및 제3 벡터와 재조합하여 무작위로 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  34. 청구항 27 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 벡터 및 상기 제2 벡터가 다수의 별개의 scFv 영역 및 다수의 별개의 힌지 영역을 인코딩하는 다수의 벡터로부터 무작위로 부착되는, 방법.
  35. 청구항 27 내지 34 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 벡터 및 상기 제3 벡터가 다수의 별개의 scFv 영역 및 다수의 별개의 엔도도메인을 인코딩하는 다수의 벡터로부터 무작위로 부착되는, 방법.
  36. 청구항 27 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 벡터 및 상기 제3 벡터가 다수의 별개의 힌지 영역 및 다수의 별개의 엔도도메인을 인코딩하는 다수의 벡터로부터 무작위로 부착되는, 방법.
  37. 청구항 27 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 벡터, 상기 제2 벡터 및 상기 제3 벡터가 다수의 별개의 scFv 영역, 다수의 별개의 힌지 영역 및 다수의 별개의 엔도도메인을 인코딩하는 다수의 벡터로부터 무작위로 부착되는, 방법.
  38. 청구항 27 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR을 인코딩하는 상기 제4 벡터를 형성하기 위해, 다수의 scFv 영역을 인코딩하는 벡터의 제1 라이브러리로부터 상기 제1 벡터의 무작위 부착, 다수의 scFv 영역을 인코딩하는 벡터의 제2 라이브러리로부터 상기 제2 벡터의 무작위 부착 및 다수의 엔도도메인을 인코딩하는 벡터의 제3 라이브러리로부터 상기 제3 벡터의 무작위 부착에 의해 상기 제4 벡터를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  39. 청구항 27 내지 38 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 벡터가 상동 재조합의 제1 서열 및 제2 부위를 포함하는, 방법.
  40. 청구항 27 내지 39 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 벡터가 상동 재조합의 상기 제2 서열 및 상동 재조합의 제3 서열을 포함하는, 방법.
  41. 청구항 27 내지 40 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 벡터가 상동 재조합의 상기 제3 서열 및 상동 재조합의 제4 서열을 포함하는, 방법.
  42. 청구항 27 내지 41 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 벡터가 상동 재조합의 상기 제3 서열 및 상동 재조합의 제4 서열을 포함하는, 방법.
  43. 청구항 27 내지 42 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제4 벡터가 상동 재조합의 상기 제1 서열 및 상동 재조합의 상기 제4 서열을 포함하는, 방법.
  44. 청구항 27 내지 43 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 벡터, 상기 제2 벡터 및/또는 상기 제3 벡터가 트랜스포사제를 인코딩하는, 방법.
  45. 청구항 27 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, 제6 벡터가 트랜스포사제를 인코딩하고, 상기 방법이 하나 이상의 상기 제4 벡터 및 상기 제6 벡터를 세포에 도입하고, 전기천공하거나 형질감염시키는 단계를 포함하는, 방법.
  46. 청구항 45에 있어서, 상기 트랜스포사제가 연어과 형태 Tc1-형 트랜스포사제 (SB)인, 방법.
  47. 청구항 27 내지 46 중 어느 한 항에 있어서, CAR로 형질감염된 세포를 CAR-발현 T-세포의 팽창을 자극할 수 있는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 존재하에 배양하거나 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  48. 청구항 27 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 scFv 영역, 상기 힌지 영역 및 상기 엔도도메인 각각이 각각 슬리핑 뷰티 (SB) 또는 피기백 트랜스포손 벡터에서 인코딩되는, 방법.
  49. 청구항 27 내지 48 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 벡터, 상기 제2 벡터 및/또는 상기 제3 벡터 각각이 복수의 별개의 scFv 영역, 힌지 영역 및 엔도도메인을 인코딩하는 다수의 벡터로부터 상기 재조합에 의해 무작위로 부착되는, 방법.
  50. 청구항 27 내지 49 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 벡터, 상기 제2 벡터 및 상기 제3 벡터 각각이 트랜스포손을 함유하고, 상동 재조합을 통한 상기 부착이 부위 특이적 재조합을 포함하는, 방법.
  51. 청구항 50에 있어서, 상기 제1 벡터 및 상기 제2 벡터가 각각 제1 상동 재조합 부위를 갖고, 상기 제2 벡터 및 상기 제3 벡터가 각각 제2 상동 재조합 부위를 갖는, 방법.
  52. 청구항 50 내지 51 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 벡터가 제3 재조합 부위를 갖고, 상기 제4 벡터가 제4 재조합 부위를 갖고, 상기 제3 재조합 부위 및 제4 재조합 부위가 세포에서 상동 재조합을 가능하게 할 수 있는, 방법.
  53. 청구항 28 내지 52 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 T 세포인, 방법.
  54. 청구항 53에 있어서, 상기 T 세포가 알파 베타 T 세포, 감마 델타 T 세포, 또는 NK 세포, 또는 NKT 세포인, 방법.
  55. 청구항 53에 있어서, 상기 세포가 다능성 세포인, 방법.
  56. 청구항 55에 있어서, 상기 다능성 세포가 줄기 세포 또는 유도 다능성 줄기 세포인, 방법.
  57. 청구항 53에 있어서, 상기 세포가 줄기 세포, 유도 다능성 줄기 세포 또는 줄기 세포로부터 유도되는, 방법.
  58. 청구항 56 내지 57 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 유도 다능성 줄기 세포로부터 유도된 T 세포 또는 NK 세포인, 방법.
  59. 청구항 27 내지 58 중 어느 한 항에 있어서, 상기 별개의 항원 결합 도메인이 상이한 항원을 선택적으로 인식하는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 scFv를 포함하는, 방법.
  60. 청구항 27 내지 59 중 어느 한 항에 있어서, 상기 별개의 항원 결합 도메인이 동일한 항원을 선택적으로 인식하는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 scFv를 포함하는, 방법.
  61. 청구항 27 내지 60 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 선택적으로 CD19, 범용 항원 (마우스), HER-3, GD2, Gp75, CS1 단백질, 메소텔린, 포스파티딜세린, cMyc, CD22, CD4, CD44v6, CD45, CD28, CD3, CD3e, CD123, CD138, CD52, CD56, CD74, CD30, Gp75, CD38, CD33, CD20, Her1/HER3 융합, GD2, 탄수화물, 아스페르길루스, ROR1, c-MET, EGFR, 덱틴, 에볼라, 진균, GP, HERV-K (HERVK), NY-ESO-1, VEGF-R2, TGF-b2R, IgG4, 비오틴 또는 O-AcGD2에 결합하는, 방법.
  62. 청구항 27 내지 61 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 scFv를 포함하거나 scFv로 이루어진, 방법.
  63. 청구항 27 내지 62 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역이 12 AA 펩티드 (GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCT, 서열번호 1), t-20 AA 펩티드, IgG4 Fc Δ EQ, IgG4 Fc Δ Q, (t-12AA + t-20AA), mKate, phiLov, dsRed, Venus, eGFP, CH3 HA, (CD8 α + t-20AA), 이중 t-20 AA, (t-20AA + CD8α), (CD8α + 류신 지퍼 Basep1), (CD8α + 류신 지퍼 Acid1), 2D3, CD8 α 또는 IgG4 Fc를 인코딩하는, 방법.
  64. 청구항 27 내지 63 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도도메인이 CD3ξ를 인코딩하는, 방법.
  65. 청구항 27 내지 64 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도도메인이 하나 이상의 ITAM 도메인을 인코딩하는, 방법.
  66. 청구항 27 내지 65 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도도메인이 (CD28 +CD3ξ), (CD28 +CD27 + CD3ξ), (CD28 + OX40 + CD3ξ), (CD28 + 4-1BB + CD3ξ), (CD28 + CD27 + OX40 + CD3ξ), (CD28 + 4-1BB + CD27 + CD3ξ), (CD28 + 4-1BB + OX40 + CD3ξ), (4-1BB + CD3ξ), (4-1BB + OX40 + CD3ξ), (4-1BB + CD27 +CD3ξ), (CD27 + CD3ξ), (CD27 + OX 40 + CD3ξ), (CD28Δ +CD3ξ), (CD28Δ +CD27 + CD3ξ), (CD28Δ + OX40 + CD3ξ), (CD28Δ + 4-1BB + CD3ξ), (CD28Δ + 4-1BB + OX40 + CD3ξ), (CD28Δ + CD27 + OX40 + CD3ξ), (CD28Δ + 4-1BB + CD27 + CD3ξ) ), (4-1BB + ICOS + CD3ξ), (CD28 + ICOS + CD3ξ), (ICOS + CD3ξ), CD3ξ, CD28 단독을 인코딩하는, 방법.
  67. 청구항 29 내지 66 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성이 암 세포에 선택적으로 결합하고, 병원균에 선택적으로 결합하고, 자가면역 질환에 관련된 세포에 선택적으로 결합하거나, T-세포의 활성화, T 세포의 파괴, T 세포의 분화, T 세포의 증식, T 세포의 탈-분화, T 세포의 이동, T 세포에 의한 사이토킨 생산 또는 T 세포에 의한 사멸을 촉진시키는 상기 CAR의 능력을 포함하는, 방법.
  68. 청구항 67에 있어서, 상기 암 세포가 난소암, 림프종, 신장 세포 암종, B-세포 악성 종양, CLL, B-ALL, ALL, 백혈병, B-세포 악성 종양 또는 림프종, 외투 세포 림프종, 무통성 B-세포 림프종, 호지킨 림프종, AML, 자궁경부암, 유방암, 결장직장암, 난소암, 신경아세포종, 피부암, 흑색종, 폐암, 골육종, 신경교종, 상피 유래 종양, 전립선암 또는 소아암인, 방법.
  69. 청구항 67에 있어서, 상기 병원균이 바이러스, 진균 또는 세규인, 방법.
  70. 청구항 29 내지 69 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 단계가 단일 세포 이미징, 단일 세포 유전학, 단일 T 세포 또는 T 세포 집단의 평가; 특정 사멸 또는 일련의 사멸, 유전자 발현, 단백질 발현, 표적을 향한 또는 표적으로부터의 이동, 증식, 활성화 유래 세포사, 사이토카인의 분비 또는 케모카인의 분비의 측정을 포함하는, 방법.
  71. 청구항 27 내지 70 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 CAR의 특성에 기초하여 상기 다수의 벡터로부터 단일 CAR을 선택하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  72. 청구항 71에 있어서, 상기 방법이 대상체에게 상기 단일 CAR을 치료학적으로 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  73. 청구항 72에 있어서, 상기 대상체가 포유동물인, 방법.
  74. 청구항 73에 있어서, 상기 포유동물이 인간인, 방법.
  75. CAR 217 (서열번호 2), CAR 194 (서열번호 3), CAR 212 (서열번호 4), CAR 213 (서열번호 5), CAR 265 (서열번호 6), CAR 214 (서열번호 56), CAR 215(서열번호 57), CAR 216 (서열번호 58), CAR 218 (서열번호 59), CAR 193 (서열번호 55) 또는 CAR 268 (서열번호 7)을 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드.
  76. 청구항 75의 폴리펩티드를 발현시키는 형질전환된 T 세포.
  77. 청구항 76에 있어서, 상기 세포가 불멸화된 세포인, 형질전환된 세포.
  78. 청구항 76에 있어서, 상기 T 세포가 알파 베타 T 세포, 감마 델타 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 줄기 세포, 면역계 세포를 포함하는 줄기 세포 유래 세포인, T 세포.
  79. 청구항 76 내지 78 중 어느 한 항의 형질전환된 T 세포를 포함하는 약제학적 제제.
  80. CAR 217 (서열번호 2), CAR 194 (서열번호 3), CAR 212 (서열번호 4), CAR 213 (서열번호 5), CAR 265 (서열번호 6), CAR 214 (서열번호 56), CAR 215(서열번호 57), CAR 216 (서열번호 58), CAR 218 (서열번호 59), CAR 193 (서열번호 55) 또는 CAR 268 (서열번호 7)을 포함하거나 이들로 이루어진 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산.
  81. 청구항 80에 있어서, 상기 핵산이 T 세포에 포함되는, 핵산.
  82. 청구항 81에 있어서, 상기 T 세포가 알파 베타 T 세포, 감마 델타 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 줄기 세포 또는 다능성 세포 유래 T 세포인, 핵산.
  83. 청구항 81에 있어서, 상기 T 세포가 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제에 포함되는, 핵산.
  84. 상이한 CAR 인코딩 벡터의 라이브러리를 포함하는 조성물로서, 상기 라이브러리의 벡터가 별개의 항원 결합 도메인, 힌지 도메인 및/또는 엔도도메인과 관련하여 무작위화되는, 조성물.
  85. 청구항 84에 있어서, 상기 라이브러리가 별개의 항원 결합 도메인, 힌지 도메인 및 엔도도메인과 관련하여 무작위화되는, 조성물.
  86. 청구항 84에 있어서, 상기 라이브러리가 별개의 항원 결합 도메인 및 엔도도메인과 관련하여 무작위화되는, 조성물.
  87. 청구항 84에 있어서, 상기 라이브러리가 별개의 항원 결합 도메인 및 힌지 도메인과 관련하여 무작위화되는, 조성물.
  88. 청구항 84에 있어서, 상기 라이브러리가 별개의 항원 힌지 도메인 및 엔도도메인과 관련하여 무작위화되는, 조성물.
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