KR20160114968A

KR20160114968A - 녹차잎으로부터 추출된 당단백 또는 이의 가수분해물의 제조방법 및 이들을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20160114968A
Application number: KR1020150041533A
Authority: KR
Inventors: 여민아; 이지언; 한정희; 이근하; 이정민; 권순상
Original assignee: (주)모아캠
Priority date: 2015-03-25
Filing date: 2015-03-25
Publication date: 2016-10-06
Also published as: KR101747200B1

Abstract

본 발명은 녹차잎으로부터 추출된 당단백 또는 이의 가수분해물의 제조방법 및 이들을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 녹차잎으로부터 추출된 당단백 또는 이의 가수분해물을 함유하는 화장료 조성물의 항염증, 미백, 주름개선, 항산화 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 녹차잎으로부터 추출된 당단백 또는 이의 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 미용 또는 건강에 유용하며, 본 발명에 따른 녹차잎으로부터 당단백을 추출하는 방법 및 이를 가수분해하는 방법은 녹차 당단백 및 이의 가수분해물의 수득률을 높여 효율적으로 획득하는 데에 유용하다.

Description

녹차잎으로부터 추출된 당단백 또는 이의 가수분해물의 제조방법 및 이들을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{Method for Preparing Green Tea Glycoprotein Extract or its hydrolysate, and the Cosmetic Composition Containing the Same}

본 발명은 녹차잎으로부터 추출된 당단백 또는 이의 가수분해물의 제조방법 및 이들을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 녹차잎으로부터 추출된 당단백 또는 이의 가수분해물을 함유하는 화장료 조성물의 항염증, 미백, 주름개선, 항산화 용도에 관한 것이다.

녹차는 동백나무과의 카멜리아 시넨시스 (Camellia Sinensis)의 싹이나 잎을 이용하여 차엽 속에 존재하는 산화 효소를 화열(火熱)이나 증기로 실활(失活)시켜 제조한 것으로서, 기원전부터 기호차로서 음용되어져 왔다.

녹차에 함유된 여러 성분들의 약리적인 메커니즘이 점차 밝혀짐에 따라 그 가치가 일반인들에게도 인식되고 있는데, 대표적으로 항산화, 항염증, 항돌연변이, 심장질환예방, 항혈관형성, 세포사멸, 비만예방, 콜레스테롤강하, 항동맥경화증, 항당뇨, 항균, 항바이러스, 노화방지 등의 약리작용이 알려진 바 있다.

특히, 최근에는 녹차의 주성분인 폴리페놀에 의한 항산화 작용, 항암작용, 혈중 콜레스테롤 저하작용, 항노화 작용, 중금속 해독 작용, 충치 예방 및 구취 제거 작용 등의 효과들이 입증되면서 크게 주목되고 있다.

또한, 녹차의 다당류는 면역기능, 항방사성, 항혈액응고, 항암, 항HIV, 혈당강하 작용이 있다고 보고된 바 있다 (Isiguki, K. et al., Anti-diabetes mellitus effect of water-soluble tea polysaccharide, The Organizing Committee of ISTS. p. 240-241, 1991). 그러나, 녹차로부터 추출된 여러 성분 중, 올리고당(oligosaccharide)과 단백질(protein)이 공유결합으로 연결된 화학 구조를 가지는 당단백(glycoprotein)이 가지는 효능에 대해서는 아직 보고된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 녹차 당단백의 유익한 효능을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 녹차로부터 추출된 당단백 또는 당단백을 가수분해시켜 얻은 가수분해물이 항염효과, 콜라게나아제 MMP-1 억제에 의한 주름 개선효과, 멜라닌 합성 억제에 의한 미백효과, 및 라디칼 제거에 의한 항산화 효과가 있다는 점을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 녹차잎으로부터 추출된 당단백, 상기 당단백의 가수분해물, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 녹차잎으로부터 당단백을 추출하는 방법 및 상기 당단백을 가수분해시켜 가수분해물을 얻는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 녹차잎으로부터 추출된 분자량 3,000,000~5,000,000Da의 당단백, 상기 당단백의 가수분해물로서 분자량이 200,000~1,000,000Da인 가수분해물, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 건조된 녹차잎에 3차 증류수를 가한 후, 60~80℃에서 6~8시간 동안 열수추출하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 얻어진 추출물을 여과한 후, 추출물 총량의 20~40%로 감압농축하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 감압농축한 녹차 당단백 농축액에 에탄올을 투입하여 침전시키는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 얻어진 침전물을 건조하여 녹차 당단백 파우더를 얻는 단계를 포함하는, 녹차잎으로부터 당단백을 추출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 건조된 녹차잎에 3차 증류수를 가한 후, 60~80℃에서 6~8시간 동안 열수추출하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 얻어진 추출물을 여과한 후, 추출물 총량의 20~40%로 감압농축하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 감압농축한 녹차 당단백 농축액에 에탄올을 투입하여 침전시키는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 얻어진 침전물을 건조하여 녹차 당단백 파우더를 얻는 단계; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 녹차 당단백 파우더를 정제수에 용해시킨 후, 가수분해 효소를 혼합하여, 40~50℃의 조건에서 당단백을 가수분해시키는 단계; 및 (f) 80℃에서 15~20분 동안 가열하여 상기 (e) 단계의 효소를 실활시킴으로써 반응을 종료시키는 단계를 포함하는, 녹차잎으로부터 추출된 당단백의 가수분해물을 얻는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 녹차잎으로부터 추출된 당단백, 상기 당단백의 가수분해물, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 항염효과, 미백효과, 주름개선효과, 항산화효과를 가지고 있어 미용 또는 건강에 유용하며, 본 발명에 따른 녹차잎으로부터 당단백을 추출하는 방법 및 이를 가수분해하는 방법은 녹차 당단백 및 이의 가수분해물의 수득률을 높여 효율적으로 획득하는 데에 유용하다.

도 1은 본 발명의 녹차 당단백의 ELSD 크로마토그램이다.
도 2는 본 발명의 녹차 당단백 가수분해물의 ELSD 크로마토그램이다.
도 3은 표준물질인 250pM 아미노산 분석 스탠다드(AAS, Agilent, USA)의 HPLC(고속액체크로마토그래피) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 녹차 당단백 가수분해물에 포함된 아미노산의 HPLC 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 녹차 당단백의 FT-IR 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 녹차 당단백의 세포 독성을 시험한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7는 본 발명의 녹차 당단백의 항염 효과를 시험한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8는 본 발명의 녹차 당단백 가수분해물의 멜라닌 생성 억제효과(tyrosinase activity)를 시험한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9은 본 발명의 녹차 당단백 가수분해물의 멜라닌 생성 억제효과(zymography)를 시험한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 녹차 당단백 가수분해물의 콜라게나제 MMP-1 저해능을 시험한 결과를 나타낸 그래프이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 일 관점에서, 녹차잎으로부터 추출된 분자량 3,000,000~5,000,000Da의 당단백, 상기 당단백의 가수분해물로서 분자량이 200,000~1,000,000Da인 가수분해물, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 사용되는 녹차잎으로부터 추출된 당단백은, 단백질과 올리고당 사슬이 폴리펩타이드 곁사슬에 공유결합되어 있는 화학 구조를 가진다. 당 사슬과 단백질의 공유결합 종류는 N-아세틸-D-글루코사민(N-Acetyl-D-glucosamine)과 아스파라진(asparagine) 간의 N-글리코시드결합(하기 화학식 1), N-아세틸-D-갈락토사민(N-Acetyl-D-galactosamine)과 세린(serine) 또는 트레오닌(threonine) 간의 O-글리코시드결합(하기 화학식 2), D-갈락토오스(D-Galactose)와 히드록시리신(hydroxylysine)간의 O-글리코시드결합의 3가지가 가능할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 녹차로부터 추출된 당단백의 당은 글루코스(glucose), 갈락토스(galactose), 만노오스(mannose), 푸코오스(fucose), N-아세틸갈락토사민(N-Acetylgalactosamine), N-아세틸글루코사민(N-Acetylglucosamine), N-아세틸뉴라민산(N-Acetylneuraminic acid), 자일로오스(xylose), 람노오스(rhamnose), 아라비노오스(arabinose) 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서, 녹차잎으로부터 추출된 당단백 및 당단백의 가수분해물의 분자량을 HPLC(high performance liquid chromatography; 고속 액체 크로마토그래피)로 측정한 결과, 녹차 당단백의 경우 3,000,000~5,000,000Da 범위 내의 분자량을 갖는 것으로 측정되었고, 녹차 당단백 가수분해물의 경우 200,000~1,000,000Da 범위 내의 분자량을 갖는 것으로 측정되었다.

본 발명에 있어서, 상기 녹차잎으로부터 추출된 당단백은 건조된 녹차잎에 3차 증류수를 가한 후, 60~80℃에서 6~8시간 동안 열수추출함으로써 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 녹차잎으로부터 추출된 당단백의 가수분해물은 상기 열수추출된 당단백에 가수분해 효소를 처리하여 40~50℃에서 가수분해시킴으로써 제조되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 가수분해 효소는 프로타맥스(protamex), 플라보자임(flavourzyme), 알카라제(alcalase), 파파인(papain), 트립신(trypsin), 펩신(pepsin), 브로멜라인(bromelain), 프로모자임(promozyme), 셀루클라스트(celluclast), 비스코자임(viscozyme), 덱스트로자임(dextrozyme), 아밀로글루코시다제(amyloglucosidase), 펙티나제(pectinase), 나린지나제(naringinase), 셀룰라제(cellulase), 또는 헤미셀룰라제(hemicellulase) 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 온도조건에서 상기 가수분해 효소로 본 발명의 녹차 당단백을 가수분해시키면, 단당류, 아미노산 등의 단량체, 또는 올리고당, 다당류, 폴리펩타이드, 또는 더 작은 단위의 당단백 등이 가수분해물로 생성될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 녹차 당단백 가수분해물의 폴리펩타이드 함량을 단백질 정량법 중 하나인 BCA assay를 사용하고, 당 함량은 페놀-황산법을 사용하여 분석한 결과, 녹차 당단백 가수분해물의 폴리펩타이드 함량은 12~45%이고, 당 함량은 15~50%인 것을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명에 있어서, 상기 녹차잎으로부터 추출된 당단백의 가수분해물은 폴리펩타이드 함량이 12~45%이고, 당 함량이 15~50%인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 항염증용, 미백용, 피부 주름 개선용, 항산화용, 또는 항균활성용인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 염증 반응 유도 인자인 지질다당류(LPS:lipopolysaccharides)를 세포에 처리하여 NO의 발생을 유도하고, 본 발명의 녹차 당단백을 처리한 후, LPS만 처리한 음성대조군과 비교하였다. 그 결과, 녹차 다당체를 처리한 경우 세포독성 없이 농도 의존적으로 NO 발생이 줄어들어, 항염 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 다른 실시예에서, B16F10 멜라닌 형성세포에 본 발명의 녹차 당단백 가수분해물을 처리하여 멜라닌 형성 효소인 티로시나제(tyrosinase)의 활성 억제를 측정하는 실험을 하였다. 그 결과, 녹차 당단백 가수분해물은 세포로부터 분비되는 멜라닌을 감소시켜 미백 효과가 뛰어남을 확인할 수 있었다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 인간 피부 섬유아세포(NHF)에 자외선 A(UVA)를 조사한 후 본 발명의 녹차 다당체 가수분해물을 처리하여 콜라게나아제 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1)의 억제 효과를 확인하는 실험을 하였다. 그 결과, MMP-1의 생성이 억제되어, 녹차 당단백 가수분해물은 우수한 피부 주름 개선 효과가 있음을 확인할 수 있었다

본 발명의 또 다른 실시예에서, 유기 라디칼인 DPPH의 환원에 의해 (항산화제는 산화됨) 발생되는 흡광도의 변화를 이용하여 본 발명의 녹차 당단백 가수분해물의 항산화능을 평가하였다. 그 결과, 양성대조군인 아스코르브산과 유사한 항산화 효능을 나타내, 녹차 다당체 가수분해물은 항산화 효과가 뛰어남을 알 수 있었다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 녹차 당단백 또는 녹차 당단백 가수분해물의 항균활성을 측정하기 위해, 원형여과지법(Paper disc method)에 의하여 항균실험을 하였다. 그 결과, 녹차 당단백 또는 녹차 당단백 가수분해물은 항균활성 효과가 뛰어남을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 녹차잎으로부터 추출된 당단백은 조성물 총 중량에 대하여 0.01~5.0중량%로 함유되고, 상기 녹차잎으로부터 추출된 당단백의 가수분해물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001~5.0중량%로 함유되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 녹차 당단백은 조성물 총 중량에 대하여 0.01~10.0중량%, 보다 바람직하게는 0.01~5.0중량%의 양으로 함유될 수 있고, 본 발명의 녹차 당단백 가수분해물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001~10.0중량%, 보다 바람직하게는 0.001~5.0중량%의 양으로 함유될 수 있다. 녹차 당단백의 경우 0.01중량% 미만, 녹차 당단백 가수분해물의 경우 0.001중량% 미만에서는 원하는 효과를 기대할 수 없으며, 10.0중량%를 초과하는 경우에는 변취 등 화장품 변성의 우려가 있고 화장품 제형의 점도 조절이 쉽지 않으며 에멀젼 제형 제조시 전상이 일어나기 쉽기 때문에 화장료 제형으로서 개발하기 어렵고 생산 경제성도 떨어지게 된다.

본 발명의 화장료 조성물은 항노화, 항산화, 피부 탄력, 주름개선, 피부보습, 항염, 항균 및 재생용 화장품에 사용될 수 있으며 그 제형에 있어서는 특별히 한정되는 바가 없고 예를 들면 유액, 크림, 화장수, 에센스, 팩, 젤, 파우더, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 로션 또는 피부 점착 타입 화장료의 제형 혹은 경피투여형 제형일 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, (a) 건조된 녹차잎에 3차 증류수를 가한 후, 60~80℃에서 열수추출하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 얻어진 추출물을 여과한 후, 추출물 총량의 20~40%로 감압농축하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 감압농축한 녹차 당단백 농축액에 에탄올을 투입하여 침전시키는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 얻어진 침전물을 건조하여 녹차 당단백 파우더를 얻는 단계를 포함하는, 녹차잎으로부터 당단백을 추출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 건조된 녹차잎에 3차 증류수를 가한 후, 60~80℃의 조건에서 열수추출하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 얻어진 추출물을 여과한 후, 추출물 총량의 20~40%로 감압농축하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 감압농축한 녹차 당단백 농축액에 에탄올을 투입하여 침전시키는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 얻어진 침전물을 건조하여 녹차 당단백 파우더를 얻는 단계; (e) 상기 (d) 단계에서 얻은 녹차 당단백 파우더를 정제수에 용해시킨 후, 가수분해 효소를 혼합하여, 40~50℃의 조건에서 당단백을 가수분해시키는 단계; 및 (f) 80℃에서 15~20분 동안 가열하여 상기 (e) 단계의 효소를 실활시킴으로써 반응을 종료시키는 단계를 포함하는, 녹차잎으로부터 추출된 당단백의 가수분해물을 얻는 방법에 관한 것이다.

상기 당단백을 추출하는 방법 및 당단백의 가수분해물을 얻는 방법 중 (a) 단계에서, 순도가 높은 3차 증류수를 추출용매로 사용함으로써, 본 발명의 효과를 극대화할 수 있다. 또한, 3차 증류수를 녹차잎 중량의 10~20배를 가하여 열수추출하는 것이 바람직하다.

상기 당단백을 추출하는 방법 및 당단백의 가수분해물을 얻는 방법 중 (c) 단계에서 에탄올을 투입하는 경우, 80~95% 에탄올을 이용할 수 있다. 또한, (f) 단계에서 효소를 실활시키기 위하여 15~20분간 가열하는 것이 바람직하나, 반드시 상기 시간에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계의 가수분해 효소는 프로타맥스(protamex), 플라보자임(flavourzyme), 알카라제(alcalase), 파파인(papain), 트립신(trypsin), 펩신(pepsin), 브로멜라인(bromelain), 프로모자임(promozyme), 셀루클라스트(celluclast), 비스코자임(viscozyme), 덱스트로자임(dextrozyme), 아밀로글루코시다제(amylroglucosidase), 펙티나제(pectinase), 나린지나제(naringinase), 셀룰라제(cellulase), 및 헤미셀룰라제(hemicellulase)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

[ 실시예 1] 녹차 당단백의 추출

7월에 수확하여 건조된 녹차 잎 100g을 3차 증류수 1500mL에 가하고, 프로펠러 믹서를 이용하여 200~500rpm, 60~80℃ 조건에서 6~8시간 동안 교반하면서 열수추출을 진행하였다. 그 다음, 녹차 잎을 제거한 추출물을 여과한 후, 추출물 총량의 20~40% 까지 감압농축하였다.

감압농축 후, 상기 감압농축한 당단백 농축액에 3~7배의 95% 에탄올을 호모믹서로 교반(1000~2000rpm)하면서 서서히 투입하였다. 30~60분동안 에탄올 침전반응을 시켜 완료된 후에 350mesh를 이용하여 에탄올을 제거하고, 이를 통해 얻어진 당단백을 수득하여 건조함으로써 녹차 당단백 파우더를 얻을 수 있었다.

[ 실시예 2] 추출된 녹차 당단백의 가수분해물 제조

실시예 1에서 제조된 녹차 당단백 파우더를 정제수에 투입하여 선용해시킨후, 가수분해 효소인 브로멜라인(bromelain)과 셀룰라제(cellulase)를 투입하여 가수분해를 진행시켰다.

가수분해 효소가 투입된 혼합물을 40~50℃, 150~200rpm에서 12시간 동안 교반하여 녹차 당단백을 가수분해시킨 후, 가수분해가 완료되면 80℃에서 15분 동안 가열하여 반응을 종료시켰다.

[ 시험예 1] 녹차 당단백과 녹차 당단백의 가수분해물의 분자량 측정

분자량 측정을 위해, 기기는 HPLC(Agilent 1200series system, Agilent, 미국), 디텍터(detector)는 ELSD(Alltech 3300), 및 컬럼(PL aquagel OH 50 8㎕, Agilent, 미국)을 사용하여, 증류수(distilled water)를 이동상으로 하여 분자량을 측정하였다.

기기에 투입될 시료를 제조하기 위해, 실시예 1에서 얻어진 녹차 당단백과 실시예 2에서 얻어진 녹차 당단백 가수분해물에 용매를 혼합하여 각각 적정 농도로 맞추었다. 이를 0.45μm필터에 여과한 후, 전처리하여 기기에 주입하였다. 분석 결과, 녹차 당단백의 분자량은 도 1과 같이 나타났고, 녹차 당단백 가수분해물의 분자량은 도 2와 같이 나타났다.

녹차 당단백의 평균 분자량을 Da으로 환산하기 위해, 표준물질로 각 분자량별 PEG(polyethylene glycol)를 사용하여 시료의 컬럼 내 지연시간에 따른 분자량의 검량선을 작성하여 확인한 결과, 평균 분자량이 약 4,400,000Da 임을 확인할 수 있었다 (표 1). 이를 종합하여, 녹차 당단백은 대략 3,000,000~5,000,000Da의 분자량 범위를 가지고, 녹차 당단백 가수분해물은 대략 200,000~1,000,000Da의 분자량 범위를 가진다는 것을 확인할 수 있었다.

	검량곡선식	R²value	Mw(Da)
녹차 당단백	y=-0.289x + 9.068	0.992	약 4,400,000

[ 시험예 2] 녹차 당단백과 녹차 당단백 가수분해물의 성분 측정

1. 폴리펩티드 함량 측정

본 실험에서 사용한 단백질 정량법은 일반적으로 많이 사용되는 정량법 중 하나인 Lowry법을 계량하여 Folin 시약대신 BCA assay (Micro BCA Protein Assay Kit, Thermo Scientific)를 사용하였다.

일정 농도로 희석한 실시예 1 및 실시예 2에서 제조된 각각의 샘플에, BCA Protein Assay Kit 3종을 섞은 솔루션을 제조하여 투입하고 볼텍싱(voltexing)을 하였다. 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 microplate reader(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

Active Agent	녹차 당단백(실시예1)	녹차 당단백의 가수분해물(실시예2)
폴리펩티드(단백질) 함량	25~50%	12~45%

2. 당 함량 측정

당 함량은 페놀-황산(phenol-sulfuric acid)법(Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. 1956. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal Chem 28: 350-356.)에 따라 측정하였다.

일정 농도로 희석한 실시예 1 및 실시예 2에서 제조된 각각의 샘플에, 5% 페놀과 황산을 투입하고 강하게 볼텍싱(voltexing)하였다. 실온에서 20분간 반응 후에 microplate reader(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 글루코스(glucose) 수용액으로 구한 표준곡선을 이용하여 정량분석하였고, 그 결과를 표 3에 나타내었다.

Active Agent	녹차 당단백(실시예1)	녹차 당단백의 가수분해물(실시예2)
당 함량	15~55%	15~50%

3. 녹차 당단백 가수분해물의 당 분석

녹차 당단백을 구성하는 당의 종류를 알아보기 위하여, 2.5mg의 녹차 당단백(실시예 1)을 1ml의 3차 증류수에 용해한 후 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)를 이용하여 가수분해시켰다. 그 후 CarboPacTM PA1 컬럼과 Bio LC(HPAEC-PAD system, Dionex, USA)를 이용하여 18mM NaOH 단일용매 기울기로 분석하였으며, 유속은 1 ml/min로 표준물질 1 mM 혼합물(Fucose, Rhamnose, Arabinose, Galactose, Glucose, Mannose, Xylose, Fructose, Galacturonic acid)을 사용하여 검량선을 작성하고, 본 발명의 녹차 당단백을 구성하는 당의 종류를 확인한 후 그 결과를 표 4에 나타내었다.

녹차 당단백(실시예1)
번호	당 종류	함량(mg/시료 1mg)
1	Fucose	0.0008
2	Rhamnose	0.0026
3	Arabinose	0.0109
4	Galactose	0.0248
5	Glucose	0.0337
6	Mannose	0.0012

4. 녹차 당단백 가수분해물의 아미노산 분석

녹차 당단백을 구성하는 아미노산의 종류를 알아보기 위하여, 실시예 2에서 얻은 녹차 당단백 가수분해물 0.2g을 20㎖의 6N HCl에 130℃ 24시간 동안 가수분해시켜 단백질의 펩타이드 결합을 끊어 유리아미노산으로 만들었다. 그 후 유리 아미노산을 OPA(o-phthalaldehyde,Agilent), FMOC(9-fluorenylmethylchloroformate) 유도체를 사용하여 형광을 띄는 아이소인돌(isoindole)을 형성시킨 후 고속액체크로마토그래피(Agilent Technologies 1200 Series HPLC, Agilent, USA)를 이용한 형광검출기(FLD, Agilent Technologies, USA)에서 아미노산을 검출하였다. 표준물질로 250pM 아미노산 분석 스탠다드(AAS, Agilent, USA) (도 3)를 사용하여 검량선을 작성하고, 본 발명의 녹차 당단백 가수분해물의 성분 아미노산을 확인한 후 그 결과를 표 5 및 도 4에 나타내었다.

	녹차 당단백 가수분해물(실시예2)
아미노산 종류	함량(mg/ml)
Asp	0.035
Glu	0.058
Ser	0.010
His	_
Gly	0.016
Thr	0.012
Arg	0.015
Ala	0.015
Tyr	_
Cys	0.063
Val	0.011
Met	_
Phe	_
Ile	_
Leu	0.012
Lys	_
Pro	0.017
Total	0.264

5. 녹차 당단백의 IR 분석

본 발명의 녹차 당단백의 분자 구조 분석을 위해, 분광학적 분석법인 FT-IR분석(적외선 분광법)을 이용하여 하기와 같이 실험하였다. 실시예 1에서 얻어진 녹차 당단백 시료 0.001g을 KBr(Potassium bromide, FT-IR grade, Sigma) 0.5g과 함께 막자사발로 고르게 분쇄하였다. 그 후 소량을 펠렛 주형에 넣고 유압기를 사용하여 펠렛으로 만들었다. FT-IR(IR 100/200, ThermoFisher Scientific, 영국)을 이용하여 적외선 스펙트럼을 측정한 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 3,300~3,400 cm^-1에서 당고리의 전형적인 O-H의 신축(stretching)진동, 2,900 cm^-1 부근에서 C-H 신축진동을 확인할 수 있었다. 또한, 단백질의 기본구조인 펩타이드의 아미노카보닐(C=O)기를 1,600 cm^-1 부근에서 확인하였다. 1,000~1,100 cm^-1에서는 C-H와 C-O 변각운동이 일어나는 것, 850~800 cm^-1 부근의 피크는 글루코오스(Glucose), 갈락토오스(Galactose) 등의 C-O-C 결합을 확인할 수 있었다.

[시험예 3] 녹차 당단백의 세포독성 시험

상기 실시예 1에서 제조된 녹차 당단백(파우더)의 세포독성을 확인하기 위하여, Raw 264.7 대식세포를 이용하였다.

Raw 264.7을 96-웰 플레이트에 5×10⁴/웰의 밀도로 분주하고, 24시간 후 녹차 당단백을 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm로 희석시켜 각각의 웰에 처리하였다. 24시간 후, 테트라졸리움 염(Tetrazolium salt (WST-1))에서 포마잔(formazan) 색소로 변화하는 원리를 이용하여 세포 증식 능력을 확인할 수 있는 WST-1 시약으로 녹차 단당백의 독성을 확인하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 녹차 당단백 추출물의 농도가 100 ppm 이하일 경우 세포 증식이 음성 대조군에 비해 큰 차이가 없어, 녹차 당단백으로부터 독성이 발생하지 않음을 확인할 수 있었다.

[ 시험예 4] 녹차 당단백의 항염효과 측정

대식세포는 염증반응시에 활성 산소종과 IL-1β, TNF-α, IL-6와 같은 사이토카인을 생산하여 감염 초기의 반응에 관여하고, NO(nitric oxide)는 이러한 사이토카인에 의해 생성되어 만성염증을 유발한다. 따라서, 상기 실시예 1에서 제조된 녹차 당단백(파우더)의 항염 효과를 확인하기 위하여, Raw 264.7 대식세포에 NO를 처리하여 염증반응을 유발한 후 녹차 다당체를 처리하는 실험을 하였다.

먼저, Raw 264.7 대식세포를 96-웰 플레이트에 5×10⁴/웰의 밀도로 분주하고, 24시간 동안 배양 후, 농도별 녹차 다당체(100 ppm, 50 ppm, 25 ppm)를 triple로 처치하였다. 12시간 후 염증 반응 유도 인자인 지질다당류(LPS:lipopolysaccharides)를 각 웰에 250ng/mL의 농도로 처리하여 NO의 발생을 유도하고, 24시간 후 NO의 생성 정도와 세포 성장을 측정하였다. 그 다음, 상기 각 웰에 실시예 1에서 제조된 녹차 당단백 파우더를 독성이 없는 농도(100 ppm, 50 ppm, 25 ppm)로 희석하여 각각 처리하고, LPS만 처리한 음성대조군과 비교하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 녹차 다당체를 처리한 경우 세포독성 없이 농도 의존적으로 NO 발생이 줄어들어, 항염 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.

[ 시험예 5] 녹차 당단백 가수분해물의 B16F10 멜라닌 형성세포를 이용한 멜라닌 생성 억제효과( Tyrosinase activity ) 측정

실시예 2에서 제조된 녹차 당단백 가수분해물의 멜라닌 생성억제 효과를 확인하기 위하여, B16F10 멜라닌 형성세포에 녹차 당단백 가수분해물을 처리하여 멜라닌 형성 효소인 티로시나제(tyrosinase)의 활성 억제를 측정하는 실험을 하였다.

B16F10 세포를 48-웰 플레이트에 1×10⁴cell/웰의 밀도로 분주한 후, 다음날 a-MSH(a-melanocyte stimulating hormone) 10nM를 처리하고, 다시 농도별 녹차 당단백 가수분해물(50 ppm, 25 ppm, 12.5 ppm, 6.25 ppm)을 triple로 처치하였다. 37℃에서 다시 3일 동안 배양한 후 배지를 회수하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포를 용해(lysis)시켜 단백질 정량을 통해 세포 생존률을 구한 후 음성대조군과 대비한 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 녹차 당단백 가수분해물은 티로시나제 활성을 억제하여 세포로부터 분비되는 멜라닌을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 양성대조군인 50 ppm 농도의 알부틴(Arbutin)보다 낮은 농도로 녹차 다당체 가수분해물을 처리했을 때에도, 50 ppm 알부틴과 유사하게 멜라닌 생성을 감소시키는 것을 확인하여, 미백 화장품의 원료로 널리 쓰이는 알부틴보다 미백 효과가 우수함을 알 수 있었다.

[ 시험예 6] 녹차 당단백 가수분해물의 B16F10 멜라닌 형성세포를 이용한 멜라닌 생성 억제효과( Zymography ) 측정

실시예 2에서 제조된 녹차 당단백 가수분해물의 멜라닌 생성억제 효과를 확인하기 위하여, 티로시나제(tyrosinase)의 활성을 측정하기 위한 지모그래피(zymography)를 실시하였다.

B16F10 세포를 6-웰 플레이트에 2×10⁵cell/ml의 밀도로 분주한 후, 다음날 a-MSH(a-melanocyte stimulating hormone) 10nM과 녹차 당단백 가수분해물을 농도별로 처리(50 ppm, 25 ppm, 12.5 ppm, 6.25 ppm)하였다. 37℃에서 다시 3일 동안 배양한 후 배지를 회수하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 다음, 배지를 제거한 세포를 PBS로 세척하고, 0.1 M sodium phosphate (pH 6.8) 버퍼로 용해(lysis)하여 BCA로 단백질 정량을 하였다. 12% SDS-PAGE로 단백질의 전기영동 분리를 실시한 후 L-DOPA 용액에서 o/n 배양하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 녹차 당단백 가수분해물은 티로시나제 활성을 억제하여 세포로부터 분비되는 멜라닌을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 양성대조군인 50 ppm 농도의 알부틴(Arbutin)보다 낮은 농도로 녹차 다당체 가수분해물을 처리했을 때에도, 50 ppm 알부틴과 유사하게 티로시나제 활성을 억제하는 것을 확인하여, 미백 화장품의 원료로 널리 쓰이는 알부틴보다 미백 효과가 우수함을 알 수 있었다.

[ 시험예 7] 녹차 당단백 가수분해물의 콜라게나제 MMP -1 저해능 측정

실시예 2에서 제조된 녹차 당단백 가수분해물의 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1) 억제 효과를 확인하기 위하여, 인간 진피 섬유아세포에 자외선 A(UVA)를 조사한 후 녹차 다당체 가수분해물을 처리하는 실험을 하였다.

먼저, NHF(p6) 세포를 12-웰 플레이트에 0.75×10⁵/웰의 밀도로 분주하고, UV 챔버를 이용하여 NHF 세포에 자외선 A(UVA)를 5 J/㎠의 에너지로 조사하였다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비 실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간 유지하였다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다.

UVA를 조사한 후, 녹차 당단백 가수분해물이 각각 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm의 농도로 들어간 배지로 교환하였다. 농도별로 duplicate처리(100 ppm, 50 ppm, 25 ppm)한 후, Kit (Amersham, RPN2610) 지시대로 실험하였다. 양성 대조군으로는 녹차 당단백 가수분해물 대신 10μM RA, 1 ppm BioGF1K를 이용하였고, 음성 대조군으로는 녹차 당단백 가수분해물을 첨가하지 않은 것을 이용하였다. 이를 24시간 동안 배양하고, 배지를 회수하여 96-웰 플레이트에 코팅하였다.

그 다음, 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체와 MMP-2(Ab-3) 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 60분 반응시켰다. 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질 용액(1 mg/mlρ-nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더로 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 녹차 당단백 가수분해물을 100 ppm, 50ppm의 농도로 처리하였을 때, 자외선을 조사하지 않았을 때와 비슷한 수준으로 MMP-1 발현이 억제되어 피부 콜라겐 분해가 저해되는 것으로 보아, 녹차 당단백 가수분해물은 우수한 피부 주름 개선 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

[시험예 8] 녹차 당단백 또는 녹차 당단백 가수분해물의 항균활성 측정

상기 실시예 1 및 실시예 2에서 제조된 녹차 당단백 또는 녹차 당단백 가수분해물의 항균활성을 측정하기 위해, 원형여과지법(Paper disc method)에 의하여 항균실험을 하였다. 그람양성균으로 포도상구균(Staphylococcus aureus KCTC 6910), 그람음성균으로 녹농균(Pseudomonas aeruginosa KCTC 1637), 대장균(E.Coli KCTC 1039), 효모로는 캔디다 효모(Candida albicans KCTC 7965), 사상균으로 흑국균(Aspergillus niger KCTC 6910)의 실험균주(총 4종)를 한국생명공학연구원으로부터 분양받아 사용하였다.

평판 배지에 배양된 각 균주를 1 백금이량 취해서 액체배지 10㎖에서 24시간 배양하여 활성화시킨 후 다시 액체 배지 10㎖에 균액을 0.1㎖ 접종하여 6시간 배양한 후 평판배지 1개당 균액을 약 10⁷cfu/㎖이 되게 접종하여 멸균된 도발봉으로 균일하게 도말하였다. 그 후 멸균된 원형여과지(6mm, Satorius, 독일)를 고체 평판 배지에 올려놓은 다음, 용매에 녹인 시료를 0.5mg/disc가 되도록 흡수시켜 배양하였다.

표 6에 나타난 바와 같이, 포도상구균(Staphylococcus aureus), 그람음성균인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 및 대장균(E. Coli)은 37℃에서 24시간, 진균 종류인 캔디다 효모(Candida albicans) 및 사상균인 흑국균(Aspergillus niger)는 27℃에서 120시간 배양한 후, 원형여과지 주위 투명존의 직경(단위:mm)을 측정하였다. 양성대조군으로 항균활성이 강력한 합성 방부제인 메틸파라벤(methyl paraben)을 사용하였다. 투명존의 직경이 9~12mm일 경우 '+(좋음)', 13~15mm일 경우 '++(우수함)', 16mm 이상일 경우 '+++(매우 우수함)'으로 그 효과를 기재하였다.

그 결과, 아래 표 7에 나타난 바와 같이, 본 발명의 녹차 당단백 및 이의 가수분해물은 5가지 균주에 대하여 모두 항균 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

균주명	분류	배양시간
Staphylococcus aureus	Gram positive bacteria	24 H
Escherichia coli	Gram positive bacteria	24 H
pseudomonas aeruginosa	Gram positive bacteria	24 H
Candida albicans	Yeast	120 H
Aspergillus niger	Fungi	120 H

균주	녹차 당단백 (실시예1)	녹차 당단백의 가수분해물 (실시예2)	메틸파라벤 (양성대조군)
S. aureus	+ 9(mm)	+ 9(mm)	++ 13.5(mm)
E. Coli	+ 12(mm)	+ 11.1(mm)	++ 15(mm)
P.aeruginosa	+ 11.5(mm)	+ 12(mm)	+ 15.2(mm)
C. albicans	+ 9(mm)	+ 9.3(mm)	+++ 18(mm)
A. Niger	++ 14(mm)	++ 15(mm)	+++ 19(mm)

- : 항균효과 미약, + : 좋음, ++ : 우수함, +++: 매우 우수함

[ 제형예 1~2 및 비교제형예 1~2]

하기 표 8의 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양크림을 제조하였다(단위: 중량%).

배합성분	제형예1	제형예2	비교제형예1
정제수	To 100	To 100	To 100
녹차 당단백	1.0	-	-
녹차 당단백 가수분해물	-	1.0	-
식물성 경화유	1.50	1.50	1.50
스테아린산	0.60	0.60	0.60
글리세롤 스테아레이트	1.00	1.00	1.00
스테아릴 알코올	2.00	2.00	2.00
폴리글리세릴-10 펜타스테아레이트 & 베헤닐 알코올 & 소디움 스테아로일 락틸에이트	1.00	1.00	1.00
아라키딜 베헤닐 알코올 &아라키딜글루코사이드	1.00	1.00	1.00
세틸아릴 알코올 & 세테아릴글루코사이드	2.00	2.00	2.00
PEG-100 스테아레이트 & 글리세롤올레이트 & 프로필렌글리콜	1.50	1.50	1.50
카프릴릭/카르릭 트리 글리세라이드	11.00	11.00	11.00
사이클로메디콘	6.00	6.00	6.00
방부제, 향	적량	적량	적량
트리에탄올 아민	0.1	0.1	0.1

[ 시험예 8] 피부 주름 개선 효능 확인

본 발명의 조성물에 의한 사람에서의 주름 개선 효과를 확인하기 위하여 상기 제형예 1~2 및 비교제형예 1을 이용하였다.

상기 제형예 1~2 및 비교제형예 1의 주름 개선 효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 평가하였다. 40대의 건강한 여성 30명을 각각 제형예 1~2 및 비교제형예 1의 3개 군에 대해 10명씩 3조로 나누어 영양크림을 매일 1회씩 12주간 안면에 도포하게 한 후, 실리콘을 이용하여 레플리카를 떠서 주름의 상태를 피부측정기(visiometer, SV600, Courage+Khazaka electronic GmbH, Germany)로 측정하여 화상분석하였다. 그 결과는 하기 표 9에 나타내었다. 하기 표 9의 값은, 도포 12주 후의 각각의 변수(parameter)값에서 도포 전 변수값을 뺀 것의 평균을 나타낸 것이다.

사용 8주 후 임상 결과	R1	R2	R3	R4	R5
제형예 1	0.16	0.14	0.09	0.02	0.02
제형예 2	0.12	0.11	0.07	0.02	0.01
비교제형예 1	0.32	0.28	0.21	0.03	0.03

R1 : 주름 등고선의 최고치와 최저치의 차이값

R2 : 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값 들의 평균

R3 : 5개씩 나눈 R1값 중 최고 값

R4 : 주름 등고선의 베이스라인(baseline)에서 각 각의 꼭대기와 계곡의 값을 뺀 평균값

R5 : 주름 등고선의 베이스라인(baseline)에서 각 각의 주름 윤곽을 뺀 값의 차이 값

상기 표 9에 나타난 바와 같이, 제형예 1~2의 조성물은 피부 주름 개선 효과가 매우 우수함을 확인할 수 있었다.

[ 시험예 9] 녹차 당단백 가수분해물의 항산화 효과 측정

유기 라디칼인 DPPH(1,1-디페닐-2-피크릴하이드라질, 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)의 환원에 의해 (항산화제는 산화됨) 발생되는 흡광도의 변화를 확인하여 녹차 당단백 가수분해물의 항산화능을 평가하는 방법을 사용하였다. 즉, 실시예 2에서 수득한 녹차 당단백 가수물에 대해 DPPH의 산화가 억제되어 흡광도가 대조군에 비해 감소되는 정도를 측정하여, 대조군의 흡광도에 비해서 50％ 이하의 흡광도를 나타내는 농도를 유효 항산화 농도로 평가하였다.

100μM(in 에탄올) DPPH 용액 190㎕와 상기에서 수득한 실시예 2의 녹차 당단백 가수분해물 및 양성 대조군을 각각 10㎕씩 넣어 반응액을 만들고 37℃에서 30분간 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 양성대조군으로는 항산화 효과 비교에 널리 사용하고 있는 항산화제인 아스코르브산(ascorbic acid)을 사용하였다. 각 물질의 DPPH 분석결과는 하기 표 10에 나타내었으며, IC₅₀은 첨가한 시료에 의해 흡광도가 50％ 감소했을 때의 시료 농도를 의미한다.

시험물질	IC₅₀(μg/ml)
녹차 당단백 가수분해물	6
아스코르브산	5

상기 표 10에 나타난 바와 같이, 실시예 2의 녹차 당단백 가수분해물은 양성 대조군으로 사용한 아스코르브산과 유사한 항산화 효과를 나타내었다. 따라서, 본 발명의 녹차 다당체 가수분해물은 항산화 효과가 뛰어남을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

녹차잎으로부터 추출된 분자량 3,000,000~5,000,000Da의 당단백, 상기 당단백의 가수분해물로서 분자량이 200,000~1,000,000Da인 가수분해물, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 녹차잎으로부터 추출된 당단백은 건조된 녹차잎에 3차 증류수를 가한 후, 60~80℃에서 6~8시간 동안 열수추출함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 녹차잎으로부터 추출된 당단백의 가수분해물은 상기 당단백에 가수분해 효소를 처리하여 40~50℃에서 가수분해시킴으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제3항에 있어서, 상기 가수분해 효소는 프로타맥스(protamex), 플라보자임(flavourzyme), 알카라제(alcalase), 파파인(papain), 트립신(trypsin), 펩신(pepsin), 브로멜라인(bromelain), 프로모자임(promozyme), 셀루클라스트(celluclast), 비스코자임(viscozyme), 덱스트로자임(dextrozyme), 아밀로글루코시다제(amyloglucosidase), 펙티나제(pectinase), 나린지나제(naringinase), 셀룰라제(cellulase), 및 헤미셀룰라제(hemicellulase)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 녹차잎으로부터 추출된 당단백의 가수분해물은 폴리펩타이드 함량이 12~45%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 녹차잎으로부터 추출된 당단백의 가수분해물은 당 함량이 15~50%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 항염증용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 미백용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 주름 개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 항산화용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 항균활성용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 녹차잎으로부터 추출된 당단백은 조성물 총 중량에 대하여 0.01~5.0중량%로 함유되고, 상기 녹차잎으로부터 추출된 당단백의 가수분해물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001~5.0중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
다음 단계를 포함하는, 녹차잎으로부터 당단백을 추출하는 방법:
(a) 건조된 녹차잎에 3차 증류수를 가한 후, 60~80℃에서 6~8시간 동안 열수추출하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 얻어진 추출물을 여과한 후, 추출물 총량의 20~40%로 감압농축하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 감압농축한 녹차 당단백 농축액에 에탄올을 투입하여 침전시키는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 얻어진 침전물을 건조하여 녹차 당단백 파우더를 얻는 단계.
다음 단계를 포함하는, 녹차잎으로부터 추출된 당단백의 가수분해물을 얻는 방법:
(a) 건조된 녹차잎에 3차 증류수를 가한 후, 60~80℃에서 6~8시간 동안 열수추출하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 얻어진 추출물을 여과한 후, 추출물 총량의 20~40%로 감압농축하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 감압농축한 녹차 당단백 농축액에 에탄올을 투입하여 침전시키는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 얻어진 침전물을 건조하여 녹차 당단백 파우더를 얻는 단계;
(e) 상기 (d) 단계에서 얻은 녹차 당단백 파우더를 정제수에 용해시킨 후, 가수분해 효소를 혼합하여, 40~50℃의 조건에서 당단백을 가수분해시키는 단계; 및
(f) 80℃에서 15~20분 동안 가열하여 상기 (e) 단계의 효소를 실활시킴으로써 반응을 종료시키는 단계.
제14항에 있어서, 상기 (e) 단계의 가수분해 효소는 프로타맥스(protamex), 플라보자임(flavourzyme), 알카라제(alcalase), 파파인(papain), 트립신(trypsin), 펩신(pepsin), 브로멜라인(bromelain), 프로모자임(promozyme), 셀루클라스트(celluclast), 비스코자임(viscozyme), 덱스트로자임(dextrozyme), 아밀로글루코시다제(amylroglucosidase), 펙티나제(pectinase), 나린지나제(naringinase), 셀룰라제(cellulase), 및 헤미셀룰라제(hemicellulase)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 녹차잎으로부터 추출된 당단백의 가수분해물을 얻는 방법.