KR20240043886A

KR20240043886A - 녹차 펩타이드 및 이를 포함하는 항염용 조성물

Info

Publication number: KR20240043886A
Application number: KR1020220122816A
Authority: KR
Inventors: 정진오; 이동우; 이재은; 이지영; 홍혜인; 정현우; 홍이지
Original assignee: (주)아모레퍼시픽; 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2022-09-27
Filing date: 2022-09-27
Publication date: 2024-04-04

Abstract

본 개시는 녹차 펩타이드 및 이를 포함하는 항염용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 개시에 따른 녹차 펩타이드는 피부에 안전함과 동시에, 우수한 항염 효능을 나타내어 다양한 피부 외용제 조성물, 약학 조성물, 화장료 조성물 및 건강기능식품 조성물에 적용될 수 있다.

Description

녹차 펩타이드 및 이를 포함하는 항염용 조성물{GREEN TEA PEPTIDE AND COMPOSITION FOR ANTI-INFLAMMATION COMPRISING THE SAME}

본 개시는 녹차 펩타이드 및 이를 포함하는 항염용 조성물에 관한 것이다.

차나무는 카멜리아(Camellia) 속으로 분류되는 82종 중 하나로 현재 아시아를 중심으로 아프리카, 남아메리카, 오세아니아 등의 50여개 국가에서 재배되고 있다. 차의 종류는 차나무 잎의 가공방법에 의하여 크게 비발효차, 반발효차, 발녹차, 후발효차로 구분되며, 이중 비발효차는 차나무에 함유된 폴리페놀 옥시다제를 열처리에 의하여 불활성화물 시킨 것으로, 다른 차에 비하여 플라보놀(flavonol), 플라바논(flavanone), 플라보노이드(flavonoid) 등의 폴리페놀(Polyphenol) 류를 많이 함유하고 있어 강한 항산화력을 나타내며, 이러한 물질들은 차 건조중량의 약 30%를 차지한다.

녹차에 함유된 여러 성분들의 약리적인 메커니즘이 점차 밝혀짐에 따라 그 가치가 일반인들에게도 인식되고 있는데, 특히, 녹차의 주성분인 폴리페놀에 의한 항산화 작용, 항암작용, 혈중 콜레스테롤 저하작용, 항노화 작용, 중금속 해독 작용, 충치 예방 및 구취 제거 작용 등의 효과들이 입증되면서 크게 주목되고 있다.

펩타이드는 식물에 함유된 물질 중 산화에 안정하며, 구조가 단순하여 피부효능이 높을 것으로 기대되는 물질이다. 식물에서의 펩타이드는 신호전달 물질로 작용하며, 특히 식물의 성장과 분화, 외부의 자극에 의한 반응에 관여한다고 알려져 있다.

대한민국 등록특허공보 제10-1747200호

본 개시는 녹차 단백질과 특정 식물성 유산균의 배양을 통해 분리 정제된 신규한 아미노산 서열을 가지는 녹차 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하여 우수한 염증 개선 또는 치료 효과를 나타내는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예는 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 녹차 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 다른 실시예는 상기 녹차 펩타이드를 한 종 이상 포함하는, 녹차 펩타이드 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시예는 상기 녹차 펩타이드 조성물을 유효성분으로 포함하는 항염용 조성물을 제공한다.

본 개시에 따른 녹차 펩타이드는 피부에 안전함과 동시에, 우수한 항염 효능을 나타내어 다양한 피부 외용제 조성물, 약학 조성물, 화장료 조성물 및 건강기능식품 조성물에 적용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 녹차 펩타이드의 제조공정을 대략적으로 도시한 것이다.
도 2a 내지 도 2c는 실험예 1에 따른 녹차 펩타이드(GTP) 조성물의 농도별 항염 효과 확인 결과를 나타낸 것이다(^***P < 0.001 vs. LPS, ^**P < 0.01 vs. LPS, ^*P < 0.05 vs. LPS).
도 3a 내지 도 3c는 실험예 2에 따른 녹차 펩타이드(GTP) 조성물의 항염 효과 확인 결과를 나타낸 것이다(^***P < 0.001 vs. LPS, ^**P < 0.01 vs. LPS, ^*P < 0.05 vs. LPS).
도 4는 락티카세이바실러스 파라카세이(L. paracasei)와 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum)의 유사성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a 및 도 5b는 락티카세이바실러스 파라카세이(L. paracasei) 및 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) 각각에 의한 녹차 단백질 분해물의 분자량 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6a 내지 도 6c는 실험예 3에 따른 녹차 펩타이드(GTP)의 분자량 분획별 항염 효과 확인 결과를 나타낸 것이다 (^***P < 0.001 vs. LPS, ^**P < 0.01 vs. LPS).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서, “녹차(차; 카멜리아 시넨시스; Camellia Sinensis)”는 차나무과에 속하는 상록활엽관목으로, 이 잎을 건조한 차는 다방면에 활용되고 있다. 특히 항산화 작용, 항암작용, 심혈관계에 있어 혈중 지질 감소 작용, 혈액 순환 촉진 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다. 상기 녹차는 차나무 잎, 꽃, 줄기, 열매, 뿌리, 줄기, 및 뿌리의 심재로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 포함되며, 바람직하게는 잎일 수 있다.

본 발명은 일 측면에서, 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 녹차 펩타이드에 관한 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 녹차 펩타이드는, AYKRRKGKFA (서열번호 1), FFFFFFFFFFFFFFFYL (서열번호 2), ISKIWNSEVPETEVKNEAESP (서열번호 3), PFFCEKMMETN (서열번호 4), RFLHERMAYYH (서열번호 5), RNLNRLQRLLSMKQEYSPRNHLGSRWREY (서열번호 6) 및 TTSSRKKEKPRRFWNNHEEVFLITTK (서열번호 7)로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명은 다른 측면에서, 상기 녹차 펩타이드를 한 종 이상 포함하는, 녹차 펩타이드 조성물에 관한 것일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 녹차 펩타이드 조성물의 60%(w/w) 이상, 65%(w/w) 이상, 70%(w/w) 이상, 75%(w/w) 이상, 80%(w/w) 이상, 85%(w/w) 이상, 90%(w/w) 이상 또는 95%(w/w) 이상이 상기 한 종 이상의 녹차 펩타이드로 이루어질 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 녹차 펩타이드 조성물은 녹차 단백질을 식물성 유산균으로 발효하여 얻어질 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 발효는 pH 5 내지 8의 조건에서 이루어질 수 있다. 구체적으로, 상기 발효는 pH 5 이상, pH 5.2 이상, pH 5.4 이상, pH 5.6 이상, pH 5.8 이상, pH 6 이상, pH 6.2 이상, pH 6.4 이상, pH 6.6 이상, pH 6.8 이상, pH 7 이상, pH 7.2 이상, pH 7.4 이상, pH 7.6 이상 또는 pH 7.8 이상에서 이루어질 수 있고, 또한, 상기 발효는 pH 8 이하, pH 7.8 이하, pH 7.6 이하, pH 7.4 이하, pH 7.2 이하, pH 7 이하, pH 6.8 이하, pH 6.6 이하, pH 6.4 이하, pH 6.2 이하, pH 6 이하, pH 5.8 이하, pH 5.6 이하, pH 5.4 이하 또는 pH 5.2 이하에서 이루어질 수 있다. 바람직하게는 상기 발효는 pH 6.8에서 이루어질 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 발효는 25℃ 내지 45℃에서 이루어질 수 있다. 구체적으로, 상기 발효는 25℃ 이상, 27℃ 이상, 29℃ 이상, 31℃ 이상, 33℃ 이상, 35℃ 이상, 37℃ 이상, 39℃ 이상, 41℃ 이상 또는 43℃ 이상에서 이루어질 수 있고, 또한, 상기 발효는 45℃ 이하, 43℃ 이하, 41℃ 이하, 39℃ 이하, 37℃ 이하, 35℃ 이하, 33℃ 이하, 31℃ 이하, 29℃ 이하 또는 27℃ 이하에서 이루어질 수 있다. 바람직하게는 상기 발효는 37℃에서 이루어질 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 발효는 24 내지 72시간 동안 이루어질 수 있다. 구체적으로, 상기 발효는 24 시간 이상, 26 시간 이상, 28 시간 이상, 30 시간 이상, 32 시간 이상, 34 시간 이상, 36 시간 이상, 38 시간 이상, 40 시간 이상, 42 시간 이상, 44 시간 이상, 46 시간 이상, 48 시간 이상, 50 시간 이상, 52 시간 이상, 54 시간 이상, 56 시간 이상, 58 시간 이상, 60 시간 이상, 62 시간 이상, 64 시간 이상, 66 시간 이상, 68 시간 이상 또는 70 시간 이상 동안 이루어질 수 있고, 또한 상기 발효는 72 시간 이하, 70 시간 이하, 68 시간 이하, 66 시간 이하, 64 시간 이하, 62 시간 이하, 60 시간 이하, 58 시간 이하, 56 시간 이하, 54 시간 이하, 52 시간 이하, 50 시간 이하, 48 시간 이하, 46 시간 이하, 44 시간 이하, 42 시간 이하, 40 시간 이하, 38 시간 이하, 36 시간 이하, 34 시간 이하, 32 시간 이하, 30 시간 이하, 28 시간 이하 또는 26 시간 이하 동안 이루어질 수 있다. 바람직하게는 상기 발효는 48시간 동안 이루어질 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 식물성 유산균은 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum)일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 식물성 유산균은 락티플란티바실러스 플란타럼 APsulloc 331261(Lactiplantibacillus plantarum APsulloc 331261)(한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms), 수탁번호 KCCM11179P, 수탁일자 20110328)일 수 있다. 상기 락티플란티바실러스 플란타럼 APsulloc 331261에 관한 내용은 대한민국 등록특허공보 제10-1719197호를 참조한다.

일 실시예에 있어서, 상기 녹차 단백질은 녹차를 무수 또는 함수 C1-C6 저급 알코올로 추출한 1차 추출물의 잔사로부터 얻어질 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 함수 C1-C6 저급 알코올 중 알코올의 농도는 20 내지 80%(v/v)일 수 있다. 구체적으로, 상기 함수 C1-C6 저급 알코올 중 알코올의 농도는 20%(v/v) 이상, 22%(v/v) 이상, 24%(v/v) 이상, 26%(v/v) 이상, 28%(v/v) 이상, 30%(v/v) 이상, 32%(v/v) 이상, 34%(v/v) 이상, 36%(v/v) 이상, 38%(v/v) 이상, 40%(v/v) 이상, 42%(v/v) 이상, 44%(v/v) 이상, 46%(v/v) 이상, 48%(v/v) 이상, 50%(v/v) 이상, 52%(v/v) 이상, 54%(v/v) 이상, 56%(v/v) 이상, 58%(v/v) 이상, 60%(v/v) 이상, 62%(v/v) 이상, 64%(v/v) 이상, 66%(v/v) 이상, 68%(v/v) 이상, 70%(v/v) 이상, 72%(v/v) 이상, 74%(v/v) 이상, 76%(v/v) 이상 또는 78%(v/v) 이상일 수 있고, 또한, 80%(v/v) 이하, 78%(v/v) 이하, 76%(v/v) 이하, 74%(v/v) 이하, 72%(v/v) 이하, 70%(v/v) 이하, 68%(v/v) 이하, 66%(v/v) 이하, 64%(v/v) 이하, 62%(v/v) 이하, 60%(v/v) 이하, 58%(v/v) 이하, 56%(v/v) 이하, 54%(v/v) 이하, 52%(v/v) 이하, 50%(v/v) 이하, 48%(v/v) 이하, 46%(v/v) 이하, 44%(v/v) 이하, 42%(v/v) 이하, 40%(v/v) 이하, 38%(v/v) 이하, 36%(v/v) 이하, 34%(v/v) 이하, 32%(v/v) 이하, 30%(v/v) 이하, 28%(v/v) 이하, 26%(v/v) 이하, 24%(v/v) 이하 또는 22%(v/v) 이하일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 함수 C1-C6 저급 알코올은 20 내지 80%(v/v) 에탄올 수용액일 수 있다. 구체적으로, 상기 함수 C1-C6 저급 알코올은 20%(v/v) 에탄올 수용액, 25%(v/v) 에탄올 수용액, 30%(v/v) 에탄올 수용액, 35%(v/v) 에탄올 수용액, 40%(v/v) 에탄올 수용액, 41%(v/v) 에탄올 수용액, 42%(v/v) 에탄올 수용액, 43%(v/v) 에탄올 수용액, 44%(v/v) 에탄올 수용액, 45%(v/v) 에탄올 수용액, 46%(v/v) 에탄올 수용액, 47%(v/v) 에탄올 수용액, 48%(v/v) 에탄올 수용액, 49%(v/v) 에탄올 수용액, 50%(v/v) 에탄올 수용액, 51%(v/v) 에탄올 수용액, 52%(v/v) 에탄올 수용액, 53%(v/v) 에탄올 수용액, 54%(v/v) 에탄올 수용액, 55%(v/v) 에탄올 수용액, 56%(v/v) 에탄올 수용액, 57%(v/v) 에탄올 수용액, 58%(v/v) 에탄올 수용액, 59%(v/v) 에탄올 수용액, 60%(v/v) 에탄올 수용액, 65%(v/v) 에탄올 수용액, 70%(v/v) 에탄올 수용액, 75%(v/v) 에탄올 수용액 또는 80%(v/v) 에탄올 수용액일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 녹차 단백질은 상기 1차 추출물의 잔사를 열수로 추출한 2차 추출물의 잔사로부터 얻어질 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 녹차 단백질은 상기 2차 추출물의 잔사로부터 알칼리 추출, 여과 및 산 침전의 과정을 거쳐 얻어질 수 있다.

도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 녹차 펩타이드 조성물은 녹차를 주정으로 1차 추출 후 남은 잔사를 열수로 2차 추출하고 2차 추출 후 남은 잔사를 알칼리 추출, 여과 및 산 침전을 거쳐 얻어진 녹차 단백을 유산균 배양함으로써 얻어질 수 있다.

본 발명은 다른 측면에서, 상기 녹차 펩타이드 조성물을 유효성분으로 포함하는 항염용 조성물에 관한 것일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 녹차 펩타이드 조성물은 IL-1β, IL-6 및 iNOS 중 어느 하나 이상의 발현을 저해할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 녹차 펩타이드 조성물은 항염용 조성물 총 중량 대비 50 내지 80 중량%의 양으로 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 녹차 펩타이드 조성물은 항염용 조성물 총 중량 대비 0.001 중량% 이상, 0.003 중량% 이상, 0.005 중량% 이상, 0.007 중량% 이상, 0.009 중량% 이상, 0.01 중량% 이상, 0.05 중량% 이상, 0.1 중량% 이상, 0.5 중량% 이상, 1 중량% 이상, 5 중량% 이상, 10 중량% 이상, 15 중량% 이상, 20 중량% 이상, 25 중량% 이상, 30 중량% 이상, 35 중량% 이상, 40 중량% 이상, 45 중량% 이상, 50 중량% 이상, 55 중량% 이상, 60 중량% 이상, 65 중량% 이상, 70 중량% 이상 또는 75 중량% 이상의 양으로 포함될 수 있고, 또한, 상기 녹차 펩타이드 조성물은 항염용 조성물 총 중량 대비 80 중량% 이하, 75 중량% 이하, 70 중량% 이하, 65 중량% 이하, 60 중량% 이하, 55 중량% 이하, 50 중량% 이하, 45 중량% 이하, 40 중량% 이하, 35 중량% 이하, 30 중량% 이하, 25 중량% 이하, 20 중량% 이하, 15 중량% 이하, 10 중량% 이하, 5 중량% 이하, 1 중량% 이하, 0.5 중량% 이하, 0.1 중량% 이하, 0.05 중량% 이하, 0.01 중량% 이하, 0.009 중량% 이하, 0.007 중량% 이하, 0.005 중량% 이하 또는 0.003 중량% 이하의 양으로 포함될 수 있다. 바람직하게는, 상기 녹차 펩타이드 조성물은 항염용 조성물 총 중량 대비 0.001 내지 10 중량%의 양으로 포함될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 녹차 펩타이드 조성물은 5 내지 2,000 mg/kg/일의 양으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 녹차 펩타이드 조성물은 5 mg/kg/일 이상, 6 mg/kg/일 이상, 7 mg/kg/일 이상, 8 mg/kg/일 이상, 9 mg/kg/일 이상, 10 mg/kg/일 이상, 20 mg/kg/일 이상, 30 mg/kg/일 이상, 40 mg/kg/일 이상, 50 mg/kg/일 이상, 60 mg/kg/일 이상, 70 mg/kg/일 이상, 80 mg/kg/일 이상, 90 mg/kg/일 이상, 100 mg/kg/일 이상, 200 mg/kg/일 이상, 300 mg/kg/일 이상, 400 mg/kg/일 이상, 500 mg/kg/일 이상, 600 mg/kg/일 이상, 700 mg/kg/일 이상, 800 mg/kg/일 이상, 900 mg/kg/일 이상, 1,000 mg/kg/일 이상, 1,200 mg/kg/일 이상, 1,400 mg/kg/일 이상, 1,600 mg/kg/일 이상 또는 1,800 mg/kg/일 이상의 양으로 투여될 수 있고, 또한, 상기 녹차 펩타이드 조성물은 2,000 mg/kg/일 이하, 1,800 mg/kg/일 이하, 1,600 mg/kg/일 이하, 1,400 mg/kg/일 이하, 1,200 mg/kg/일 이하, 1,000 mg/kg/일 이하, 900 mg/kg/일 이하, 800 mg/kg/일 이하, 700 mg/kg/일 이하, 600 mg/kg/일 이하, 500 mg/kg/일 이하, 400 mg/kg/일 이하, 300 mg/kg/일 이하, 200 mg/kg/일 이하, 100 mg/kg/일 이하, 90 mg/kg/일 이하, 80 mg/kg/일 이하, 70 mg/kg/일 이하, 60 mg/kg/일 이하, 50 mg/kg/일 이하, 40 mg/kg/일 이하, 30 mg/kg/일 이하, 20 mg/kg/일 이하, 10 mg/kg/일 이하, 9 mg/kg/일 이하, 8 mg/kg/일 이하, 7 mg/kg/일 이하 또는 6 mg/kg/일 이하의 양으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 상기 녹차 펩타이드 조성물은 300 내지 1,000 mg/kg/일의 양으로 투여될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 항염용 조성물은 약학, 화장료 또는 식품 조성물일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 조성물은 염증 개선 또는 치료용 약학 조성물, 염증 개선용 화장료 조성물 또는 염증 개선용 식품 조성물일 수 있다.

상기 식품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 환제, 분말제, 드링크제와 같은 액제, 캐러멜, 겔, 바, 티백 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형의 식품 조성물은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업계의 통상의 기술자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다. 또한 상기 식품은 건강기능식품일 수도 있다.

상기 조성물은 단순 섭취, 음용, 주사 투여, 스프레이 투여 또는 스퀴즈 투여 등 다양한 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 식품 조성물에 있어서, 상기 유효 성분의 투여량 결정은 당업계의 통상의 기술자의 수준 내에 있으며, 투여하고자 하는 대상의 연령, 건강 상태, 합병증 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 식품 조성물은, 예를 들어, 츄잉껌, 캐러멜 제품, 캔디류, 빙과류, 과자류 등의 각종 식품류, 청량 음료, 미네랄 워터, 알코올 음료 등의 음료 제품, 비타민이나 미네랄 등을 포함한 건강기능식품 제품일 수 있다.

상기 외에, 본 발명의 일 측면에 따른 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 일측면에 따른 식품 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않으나 본 발명의 일측면에 따른 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 60 중량부의 범위에서 포함되는 것이 일반적이다.

본 발명의 일 측면에 따른 상기 약학 조성물은 경구, 비경구, 직장, 국소, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 등으로 투여될 수 있다. 경구 투여를 위한 제형은 정제(錠劑), 환제(丸劑), 연질 및 경질 캅셀제, 과립제(顆粒劑), 산제, 세립제, 액제, 유탁제(乳濁濟) 또는 펠렛제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 용액제, 현탁제, 유액제, 겔, 주사제, 점적제, 좌제(坐劑), 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제형은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있으며, 계면 활성제, 부형제, 수화제, 유화 촉진제, 현탁제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제, 착색제, 향신료, 안정화제, 방부제, 보존제 또는 기타 상용하는 보조제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수도 있는데, 상기 염은 (1) 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산으로 형성되거나; 또는 아세트산, 프로파이온산, 헥사노산, 시클로펜테인프로피온산, 글라이콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일) 벤조산, 신남산, 만델산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 1,2-에테인-디설폰산, 2-히드록시에테인설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캄퍼설폰산, 4-메틸바이시클로 [2,2,2]-oct-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로파이온산, 트리메틸아세트산, tert-부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 히드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산과 같은 유기산으로 형성되는 산 부가염(acid addition salt); 또는 (2) 모 화합물에 존재하는 산성 프로톤이 치환될 때 형성되는 염을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 상기 약학 조성물의 적용량 또는 투여량은 투여 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 유효성분 투여량 결정은 당업계 통상의 기술자의 수준 내에 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 상기 화장료 조성물은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유할 수 있다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 또한 포말(foam)의 형태로 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택될 수 있다. 예를 들어, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 클렌징워터, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디클렌저 및 바디에센스 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물에는 상기 녹차 펩타이드 이외에 기능성 첨가물 및 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분이 추가로 포함될 수 있다. 상기 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어지는 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다.

상기 조성물에는 또한, 상기 기능성 첨가물과 더불어 필요에 따라 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분을 배합해도 된다. 이외에 포함되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조절제, 알코올, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이러한 실시예 및 시험예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이러한 실시예 및 시험예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.

[실시예 1] 녹차 펩타이드(GTP) 조성물 제조

녹차(camelia sinensis, ㈜농업법인 오설록농장) 50kg을 1톤 추출 탱크에 넣고, 50%(v/v) 에탄올을 15배수로 첨가한 다음 70℃에서 2시간 동안 추출(1차 추출) 및 여과하여 카테킨류를 제거하고 녹차 1차 추출물의 잔사를 획득하였다. 획득한 녹차 1차 추출물의 잔사 고형분에 15배의 비율로 정제수를 첨가하고 90℃에서 3시간 동안 추출(2차 추출) 및 여과하여 수용성 다당 등을 제거하고 녹차 2차 추출물의 잔사를 획득하였다. 획득한 녹차 2차 추출물의 잔사 고형분에 10배의 비율로 2%(w/w) NaOH (98%, (주)영진) 수용액을 첨가하고 70℃에서 3시간 동안 추출(알칼리 추출) 및 여과하여 여과액을 획득하였다. 획득한 여과액을 상온으로 냉각하고 35%(w/w) 염산(대정화금)을 첨가하여 pH가 3.5 내지 4.5 이하가 되도록 하였다. 상층액을 제거하고 침전물을 정제수로 3회 내지 7회 세척한 후 Ohkawara OC-16 spray dryer (inlet 220℃, outlet 90℃)를 사용하여 침전물을 분무 건조하여 조단백 함량이 50%(w/w) 이상인 녹차 단백질을 획득하였다. 녹차 단백질을 1%(w/w) 함유한 락티플란티바실러스 플란타럼 APsulloc 331261 (Lactiplantibacillus plantarum APsulloc 331261) 배지(정제수, 비타민 용액, 아미노산 용액, 미네랄 용액 함유)를 혐기 발효조에 넣고, pH 6.8 및 37℃에서 48시간 동안 배양한 다음 배양액을 4℃, 10,000g에서 20분 동안 원심분리(Labogene 1580R (Serial No. KLG4226180220023))하여 상등액을 획득하였다. 획득한 상등액을 70℃의 드라이 오븐에서 농축하였으며, 농축액을 4℃, 100,000g 에서 1시간 동안 원심분리(Hitachi centrifuge CS150NX) 하여 상등액을 획득하였다. 획득한 상등액을 막 여과(pore size 0.22μm)를 통해 여과액을 획득하였고 획득한 여과액을 동결건조하여 녹차 펩타이드 조성물 (Green Tea Peptide; GTP)(녹차 펩타이드 함량 14%(w/w))을 획득하였다.

한편, 상기 녹차 펩타이드 조성물에 함유된 녹차 펩타이드의 서열은 다음과 같은 단계를 거쳐 분석하였다:

1) 상기 녹차 단백질을 함유한 락티플란티바실러스 플란타럼 APsulloc 331261 (Lactiplantibacillus plantarum APsulloc 331261) 배지를 원심분리하여 상등액을 분리한 후, 막 여과 및 크기 배제 크로마토그래피(Size Exclusion Chromatography)를 거쳐 저분자 펩타이드 구간에서 분획된 펩타이드만을 획득하는 단계;

2) 1)에서 획득한 펩타이드를 동결건조 및 탈염(de-salting)한 후 0.1%(w/w) 포름산에 용해하여 LC-MS/MS로 분석하는 단계로,

이때 시료 3μg(단백질 정량 기준)을 대상으로 LC-MS/MS 분석을 진행하였으며 사용한 장비 및 분석 조건은 아래와 같음;

LC 장비	UltiMate 3000 RSLC nano system
MS 장비	Q-Exactive Orbitrap HF-X mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific)
Column	(trap) Internal diameter: 75 μm Х 2 cm, packed with Acclaim PepMap 100 C18, 3 μm(analytical) Internal diameter: 75 μm Х 50 cm, packed with PepMap RSLC C18, 2 μm
Mobile phase	(solvent A) 0.1% (w/w) formic acid (FA) in water(solvent B) 0.1% (w/w) FA in acetonitrile
Mode	Positive ion mode
Collision energy	27%

3) 2)에서 LC-MS/MS 분석을 통해 얻어진 스펙트럼 파일(spectra file)을 대상으로 녹차 (camelia sinensis [UniProt Proteome ID: UP000327468]) 및 유산균 (L. plantarum DSM 20174 [NCBI accession: GCA_014131735.1], L. plantarum APsulloc 331261) 단백체 서열 데이터베이스를 활용하여 펩타이드 서열을 탐색하는 단계로,

이때 활용한 분석 조건은 아래와 같음.

Search engine	MS-GF+
Modifications	(fixed) None(variable) oxidation (+15.99) of methionine & acetylation (+42.01) of the peptide N-terminal
m/z tolerance	Precursor: ± 10 ppmFragment: ± 20 ppm
False discovery rate cut-off	1%

위 단계를 거쳐 분석된 본 발명의 일 실시예에 따른 녹차 펩타이드 서열은 아래와 같다.

AYKRRKGKFA	서열번호 1
FFFFFFFFFFFFFFFYL	서열번호 2
ISKIWNSEVPETEVKNEAESP	서열번호 3
PFFCEKMMETN	서열번호 4
RFLHERMAYYH	서열번호 5
RNLNRLQRLLSMKQEYSPRNHLGSRWREY	서열번호 6
TTSSRKKEKPRRFWNNHEEVFLITTK	서열번호 7

[실험예 1] 녹차 펩타이드(GTP) 조성물의 농도별 처리에 의한 항염 효과 확인

Lipopolysaccharide(LPS)는 그람 음성균의 세포벽을 구성하는 당지질로, 숙주의 염증 반응을 유발하는 것으로 알려져 있다. 염증 반응은 해로운 물질로부터 보호해주기 위한 필수적인 생리 반응이나, 병원성 물질 없이 발생하는 만성 염증은 지질대사이상, 산화스트레스, 대사질환, 암, 노화 촉진 등 다양한 이상증을 유발한다. 따라서 LPS에 대하여 항염 효과를 보이는 물질은 대사질환 및 노화 방지에 있어서 긍정적인 역할을 수행할 것으로 기대할 수 있다.

상기 실시예 1에 따른 녹차 펩타이드(GTP) 조성물의 항염 효과를 확인하기 위하여, ATCC에서 구매한 생쥐 유래 대식세포(RAW 264.7)에 GTP 조성물을 각 10, 50, 100 μg/ml 농도로 2시간 동안 전처리한 후 LPS(Sigma Aldrich, 10 ng/ml)를 12시간 처리하고 Takara MiniBEST Universal RNA Extraction Kit(TakaraBio)를 이용하여 세포에서 RNA를 분리하였다. 각 RNA sample 중 1μg씩 이용하여 Thermo Fisher Scientific 사의 RevertAid 1^st Strand cDNA Synthesis Kit로 cDNA를 합성한 후, Bio-Rad사의 CFX96 thermocycler를 이용하여 염증 관련 유전자(IL-1β, IL-6, iNOS)들의 발현 양상을 관찰하였고 그 결과는 도 2a 내지 도 2c에 나타내었다. 본 실험에 필요한 IL-1β, IL-6, iNOS의 프라이머는 바이오니어 사에서 구입하여 사용하였다.

도 2a 내지 도 2c의 결과로부터, 본 발명의 일 실시예에 따른 녹차 펩타이드 조성물은 LPS에 의해 유도되는 염증 관련 유전자들(IL-1β, IL-6, iNOS)의 mRNA 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 녹차 펩타이드 조성물의 처리 농도가 증가함에 따라 항염 효과 역시 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 2] 상이한 제조 방식에 따른 녹차 펩타이드(GTP) 조성물의 항염 효과 확인

제조 방식에 따른 녹차 펩타이드의 항염 효능을 비교하기 위하여, i) 상기 실시예 1의 녹차 펩타이드 조성물 제조 과정 중 얻어진 녹차 조단백, ii) 상기 실시예 1의 녹차 펩타이드 조성물 제조 과정 중 얻어진 녹차 단백질을 정제수를 이용하여 1:40(w/v) 농도로 제조한 후 35%(w/w) 염산을 첨가하여 pH 5로 적정한 다음 37℃에서 6시간 동안 가수분해하고 4℃, 10,000g에서 원심분리(Labogene 1580R (Serial No. KLG4226180220023))하여 얻은 상등액(녹차 단백질 산처리 분획), iii) 상기 실시예 1의 녹차 펩타이드 조성물 제조 과정 중 얻어진 녹차 단백질을 0.1M 인산나트륨 완충액(sodium phosphate buffer, pH 8)을 사용하여 1:40(w/v)의 농도로 제조한 후 단백질 분해 효소 브로멜라인(bromelain)을 녹차 단백질 대비 1%(w/v) 첨가하여 45℃, pH 6.2에서 24시간 동안 가수분해한 다음 90℃에서 30분 동안 가열하고 4℃, 10,000g에서 원심분리(Labogene 1580R (Serial No. KLG4226180220023))하여 얻은 상등액(녹차 단백질 효소 처리 분획), 및 iv) 상기 실시예 1에서 락티플란티바실러스 플란타럼 APsulloc 331261 (Lactiplantibacillus plantarum APsulloc 331261) 대신 동물성 유산균인 락티카세이바실러스 파라카세이(Lacticaseibacillus paracasei KCTC 3510 (ATCC 균주번호: ATCC 25302), 생물자원센터(KCTC))를 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 제조된 펩타이드 조성물을 함께 처리하여 항염 효능을 비교하였다. 구체적인 실험 방법은 녹차 조단백, 녹차 단백질 산처리 분획, 녹차 단백질 효소(bromelain) 처리 분획, 동물성 유산균인 락티카세이바실러스 파라카세이(L. paracasei) 발효 펩타이드 조성물, 실시예 1에 따른 녹차 펩타이드 조성물을 각각 100 μg/ml처리한 것을 제외하고는 상기 실험예 1과 동일하게 진행하였다. 그 결과는 도 3a 내지 도3c에 나타내었다.

도 3a 내지 도3c의 결과로부터, 녹차 조단백, 산 분해 펩타이드 및 효소 분해 펩타이드는 유의한 항염 효능을 나타내지 않는 반면 본 발명의 일 실시예에 따른 녹차 펩타이드 조성물에서만 현저한 항염 효능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

한편, 도 4는 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum)과 락티카세이바실러스 파라카세이(L. paracasei)의 유사성을 분석한 결과를 나타낸 것이다. 유사성 분석은 NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)에서 균주 별 유전체 정보(genbank)를 다운로드하여 어노테이션(annotation) 된 보존 단백질(conserved protein) 유전 정보만 남기고 나머지는 버림한 후 집계 전체 개수 대비 비율로 계산하여 산출하였다. 이때 POCP (percentage of conserved proteins) 계산을 위해 R 프로그램을 활용하였고 (코드 출처: https://github.com/hoelzer/pocp.git) 분석 조건은 다음과 같다:

- E-value = 1Хe^-5

- Sequence identity = 0.4

- Alignment length = 0.5.

이 중 2개의 유전체가 50% 이상 유사성을 보이는 경우 같은 클러스터(cluster)로 분류하였고 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum)과 락티카세이바실러스 파라카세이(L. paracasei)는 유사성이 46.84%로 매우 유사한 것으로 나타났다. 이와 같이, 실시예 1에서 사용한 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum)과 매우 유사한 동물성 유산균인 락티카세이바실러스 파라카세이(L. paracasei)로 발효하여 얻어진 녹차 펩타이드 조성물(PCasei)의 경우에는 항염 효능을 나타내지 않고 오히려 염증 관련 유전자 mRNA의 발현량이 모두 증가하여 염증 반응이 악화되는 것을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명의 일 실시예에 따른 녹차 펩타이드 조성물의 항염 효능은 식물성 유산균인 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum)을 이용한 발효를 통하여 얻어지는 것임을 알 수 있다.

[실험예 3] 녹차 펩타이드(GTP)의 분자량에 따른 항염 효과 확인

실시예 1에서 제조된 녹차 펩타이드 조성물로부터 분리 및 정제된 펩타이드의 서열 분석 결과 서열번호 1 내지 7의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 동정되었다.

도 5a 및 도 5b는 락티카세이바실러스 파라카세이(L. paracasei) 및 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) 각각에 의한 녹차 단백질 분해물의 분자량 분석 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로 분자량 분석은 FPLC (Faste Protein Liquid Chromatography)를 이용하여 크기 배제 크로마토그래피를 시행하였으며 FPLC 시행 기기와 버퍼에 대한 구체적인 조건은 아래와 같다:

장비	BioLogic Duoflow Chromatography System
Column	Superdex 30 pg (200 ml)
Buffer	20 mM Tris-HCl, pH 7.0
Flow rate	1.5 ml/min
Pressure	7-9 psi
시료 양(농도)	> 10 kDa fraction	50 mg (25 mg/ml)
	1-10 kDa fraction	100 mg (50 mg/ml)
	< 1 kDa fraction	100 mg (50 mg/ml)

도 5에 도시된 바와 같이, 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) 발효를 통해 얻어진 녹차 펩타이드 조성물은 락티카세이바실러스 파라카세이(L. paracasei)로 발효한 녹차 펩타이드(PCasei)와 달리 대부분 10kDa 이하의 저분자 펩타이드들을 포함하는 것을 확인할 수 있다.

이에 실시예 1에서 제조된 녹차 펩타이드 조성물을 각각 분자량 1kDa 및 10kDa 기준으로 분리하여 상기 표 4에 기재된 농도로 처리하고 각 분획별 항염 효능을 비교하였다. 그 결과는 도 6a 내지 도 6c에 나타내었다.

도 6a 내지 도 6c에 도시된 바와 같이, 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) 발효에 의해 생성된 신규 펩타이드가 다량 함유된 저분자(<1kDa, <10kDa) 분획에서 우수한 항염 효능을 나타내는 반면, 신규 펩타이드가 포함되지 않은 고분자(>10kDa) 분획에서는 항염 효능이 나타나지 않은 것을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명의 일 실시예에 따른 녹차 펩타이드 조성물의 항염 효능은 발효 유산균인 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum)에 의해 분해된 신규 펩타이드에 의한 것임을 알 수 있다.

Claims

서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 녹차 펩타이드.
제1항에 따른 녹차 펩타이드를 한 종 이상 포함하는, 녹차 펩타이드 조성물.
제2항에 있어서, 상기 녹차 펩타이드 조성물은 녹차 단백질을 식물성 유산균으로 발효하여 얻어지는 것을 특징으로 하는, 녹차 펩타이드.
제3항에 있어서, 상기 식물성 유산균은 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum)인 것을 특징으로 하는, 녹차 펩타이드.
제3항에 있어서, 상기 녹차 단백질은 녹차를 무수 또는 함수 C1-C6 저급 알코올로 추출한 1차 추출물의 잔사로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는, 녹차 펩타이드.
제5항에 있어서, 상기 함수 C1-C6 저급 알코올 중 알코올의 농도는 20 내지 80%(v/v)인 것을 특징으로 하는, 녹차 펩타이드.
제6항에 있어서, 상기 함수 C1-C6 저급 알코올은 20 내지 80%(v/v) 에탄올 수용액인 것을 특징으로 하는, 녹차 펩타이드.
제5항에 있어서, 상기 녹차 단백질은 상기 1차 추출물의 잔사를 열수로 추출한 2차 추출물의 잔사로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는, 녹차 펩타이드.
제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 녹차 펩타이드 조성물을 유효성분으로 포함하는, 항염용 조성물.
제9항에 있어서, 상기 녹차 펩타이드 조성물은 IL-1β, IL-6 및 iNOS 중 어느 하나 이상의 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제9항에 있어서, 상기 녹차 펩타이드 조성물은 조성물 총 중량 대비 0.001 내지 80 중량%의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제9항에 있어서, 상기 녹차 펩타이드 조성물은 5 내지 2,000 mg/kg/일의 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제9항에 있어서, 상기 조성물은 약학, 화장료 또는 건강기능식품 조성물인 것을 특징으로 하는, 조성물.