KR20160002882A - 항종양 활성을 갖는 신규한 이중특이적 결합 분자 - Google Patents

항종양 활성을 갖는 신규한 이중특이적 결합 분자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (i) CD3 및 (ii) 암 세포 상의 표면 표적 항원에 특이적으로 결합하는 이중특이적 결합 분자에 관한 것이며, 여기서 결합 분자는 (a) CD3에 특이적으로 결합하는 항체, 및 (b) 암 세포 상의 표면 표적 항원에 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 이루어지되, 단, (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 10 내지 19 내의 적어도 하나의 아미노산은 치환, 결실 또는 부가되고, (ii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 29 내지 36 내의 적어도 하나의 아미노산은 치환, 결실 또는 부가되되, 단, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 갖고, 동일성의 결정은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 12 내지 17 및 31 내지 34를 배제한다.

Description

항종양 활성을 갖는 신규한 이중특이적 결합 분자{NOVEL BISPECIFIC BINDING MOLECULES WITH ANTITUMORAL ACTIVITY}
본 발명은 (i) CD3 및 (ii) 암 세포 상의 표면 표적 항원에 특이적으로 결합하는 이중특이적 결합 분자에 관한 것이며, 결합 분자는 (a) CD3에 특이적으로 결합하는 항체 및 (b) 암 세포 상의 표면 표적 항원에 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, 상기 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 이루어지되, 단, (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 10 내지 19 내의 적어도 하나의 아미노산이 치환되거나, 결실되거나, 부가되며, (ii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 29 내지 36 내의 적어도 하나의 아미노산이 치환되거나, 결실되거나, 부가되되, 단, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 갖고, 동일성의 결정은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 12 내지 17 및 31 내지 34를 배제한다.
본 명세서에서, 특허 출원 및 제조처 매뉴얼을 포함하는 다수의 문헌이 인용된다. 이들 문헌의 개시내용은 본 발명의 특허성에 관련있는 것으로 고려되지는 않지만, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 더욱 구체적으로, 모든 참고 문헌은 각 개별 문헌이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시되는 것처럼 동일한 정도까지 참조로 포함된다.
T 세포가 질병의 조기 및 후기 단계 둘 모두의 암 환자에서 종양 성장 및 생존을 조절할 수 있다는 증거가 증가하고 있다(문헌[Mlecnik B. et al., (2011), Cancer Metastasis Rev, 30, pp. 5-12]). 그러나, 종양-특이적 T-세포 반응은 암 환자에서 시작되고 유지되기에 어렵고, 면역편집 동안 선택되는 종양 세포의 수많은 면역 회피 메카니즘에 의해 제한된다(문헌[Bauerle PA et al. (2009) Cancer Res, 69(12), pp. 4941-4944]). 암 치료법을 위해 T-세포를 개입시키는 대안적인 방법은 암 세포 상의 표면 표적 항원 및 T-세포 상의 CD3에 이중특이적인 항체이다(문헌[Bargou et al. (2008) Science, 321(5891), pp. 974-977]). 이들은 전형적으로, T-세포 수용체 특이성, 동시자극 또는 펩티드 항원 제시와 독립적으로, 세포독성 T-세포 중 임의의 종류를 암 세포에 연결시킬 수 있다.
뮤린 및 인간화 항-CD3 항체, 예를 들어, 무로모납(muromonab)-CD3(문헌[Norman DJ (1995) Ther Drug Monit 17(6), pp. 615-620]), 테플리주맙(teplizumab) 및 오텔릭시주맙(otelixizumab)(문헌[Chatenoud L. (2010) 6(3), pp. 149-157]) 및 Cris-7(문헌[Alberola-Ila J. et al. (1991), J Immunol, 146(4), pp. 1085-1092])이 당업계에 널리 알려져 있다. Conrad 등은 SP34를 포함하는 다른 항-CD3 항체의 개요를 제공한다(문헌[Conrad et al. (2007) Cytometry, 71(11), pp. 925-933]).
언급된 바와 같이, CD3 및 암 세포 상의 표면 표적 항원을 인식하는 이중특이적 항체는 해당 분야에 널리 알려져 있다(또한, 문헌[May C. et al. (2012), Biochemical Pharmacology, 84, pp. 1105-1112] 참조). 역사적으로, 치료제로서 이중특이적 항체의 개발에서의 주요 장애물은 유리한 약물-유사 특성이 있는 이들 복합체 분자를 설계하고, 약물 개발을 지지하기에 충분한 양과 질로 그들을 생성하는 데에서의 어려움임을 주목하는 것이 중요하다(문헌[Chan A. and Carter P. (2010), Nat Rev Immunol, 10(5), pp. 301-316]). 이것은 선택된 특이성이 있는 모노클로널 항체(mAb)를 발현하는 2개의 독특한 뮤린 하이브리도마 클론의 융합으로부터 야기되는 쿼드로마(quadroma) 기술을 사용하는 CD3 분야의 초기 이중특이적 방법에 의해 예시된다(문헌[Staerz et al. (1986) Proc Natl Acad Sci USA, 83, pp. 1453-1457]). 이러한 방법을 통해 제조되는 이중특이적 항체는 IgG 중쇄 및 경쇄의 무작위 짝지음에 의존한다. 항원을 발현하는 세포에서 관찰되는 일부 생물학적 효과에도 불구하고, 이러한 방법은 질병의 임상 경과에 상당한 영향을 야기하지 않았다(문헌[Kufer P. et al. (2004) Trends Biotechnol, 22, pp. 238-244]). 상기 언급된 바와 같이, 이들 제1 세대 이중특이적 항체는 2가지 주요 한계점을 나타내었으며, 이는 대규모의 균질한 뱃치(batch)의 생성의 어려움 및 뮤린 항체 단편의 효능의 결여를 포함한다. 또한, 뮤린 분자의 효능을 심하게 감소시키고, 다중의 투여를 제한하는 인간 항-마우스 항체 반응이 대부분의 처리된 환자에서 관찰되었다(문헌[May C. et al. (2012), Biochemical Pharmacology, 84, pp. 1105-1112]).
Lindhofer 등은 랫트 IgG2a 및 마우스 IgG2b의 짝지음을 통한 이질성 수준의 감소 방법을 확인하였다(문헌[Lindhofer et al. (1995) J Immunol, 155, pp. 219-225]). 저자들은 이들 랫트 및 마우스 아이소타입 특이적 하이브리도마의 융합이 우선적인 종-제한 중쇄/경쇄 짝지음으로 인하여, 정확히 짝지은 이중특이적 항체의 발생을 증가시키는 것을 관찰하였다. 또한, 그들은 모체 항체로부터 기능성 이중특이적 항체의 정제를 용이하게 하는 순차적인 pH 용리 방법을 확인하였다. 이러한 방법에 의해 생성된 하이브리드 항체는 2가지 상이한 항원, 예를 들어, CD3 및 종양 항원에 대한 결합 부위를 포함하며, 종래의 항체와 유사하게, 대식구, NK 세포 및 수지상 세포에서 발현되는 FcγR 수용체에 결합할 수 있는 그의 무손상 Fc를 보유한다. TriomAb®로 지칭되는 이들 이중특이적 항체는 Fc 수용체 발현 세포와 함께, T 세포를 종양으로 재지향시키는 병용 효과를 가지며, T-세포 매개의 용해 및 ADCC의 조합에 의해, 종양 세포를 제거하는 것으로 보고되었다(문헌[Linke R. et al (2010) Mabs, 2, pp. 129-136]). 이러한 형식은 다수의 이중특이적 항체의 개발로 이어졌으며, 이는 임상 시험에서 평가되었다. 이들은 카투막소맙(catumaxomab)(항-EpCAM × 항-CD3), 에르투막소맙(ertumaxomab)(항-HER2 × 항-CD3) 및 FBTA05(항-CD20 × 항-CD3)(문헌[Chames P. et al., (2009), Mabs, 1, pp. 539-547]에서 검토)를 포함한다. 카투막소맙은 개발된 첫번째 TriomAb®이며, 2/3 단계에 의해, 생존의 상당한 개선이 나타났으며, 이는 카투막소맙이 EpCAM-양성 종양이 있는 환자에서의 악성 복수의 치료에 대해 2009년도에 EU 승인을 받게 하였으며, 임상 이용을 위해 승인된 첫번째 이중특이적 항체였다(문헌[Jager M. et al. (2012), Cancer Res, 69, 4941-4944]). HER2 표적화 TriomAb® 에르투막소맙은 HER2 발현 진행성 고형 종양이 있는 환자의 임상 시험에서 현재 조사 중이다. FBTA05, B-세포 악성종양 상에 발현되는 CD20을 표적으로 하기 위해 개발된 세번째 TriomAb®는 만성 림프구성 백혈병(CLL) 환자로부터 유래된 낮은 수준의 CD20 발현을 갖는 B-세포주의 특이적인 용해를 매개하는 것으로 나타났다. 더욱이, FBTA05는 시험관내에서 리툭시맙과 비교하여, 상당히 더 높은 제거율을 나타내었다. 동종이계 이식 후에 CD20 양성 비호지킨 림프종(NHL) 환자에서 재발성 또는 불응성 질병의 치료를 위한 공여자 림프구 주입과 병용한 FBTA05의 안전성 및 효능을 평가하는 단계 1/2 연구가 진행 중이다(문헌[Chames P. et al., (2009), Mabs, 1, pp. 539-547]). 이러한 TriomAb® 형식에 대한 주요 제한점은 비-인간화 마우스/랫트 하이브리드 항체 형식의 반복 투여에 반응하는 환자에 의한 인간 항-마우스 및 항-랫트 항체의 발생으로 인하여 존재한다(문헌[Linke R. et al (2010) Mabs, 2, pp. 129-136]).
TriomAb® 항체의 제한점의 일부는 항체 조작 및 신규한 형식에 기초한 재조합 이중특이적 분자의 생성에 의해 다루어진다(문헌[May C. et al. (2012), Biochemical Pharmacology, 84, pp. 1105-1112]의 개요 참조). 시험된 이중특이적 항체 설계 중에, BiTE®(이중특이적 T-세포 결합체(engager)용)로 지칭되는 형식이 현재까지 임상에서 가장 큰 성공을 나타내었다. BiTE® 재조합 형식은 펩티드 링커에 의해 공유적으로 연결된 2개의 단쇄 항체를 기반을 한다(이중특이적 scFv 항체 단편 형식 야기). 4개의 별개의 유전자에 의해 인코딩된 총 4개의 가변 도메인은 단지 1개의 유전자에 의해 인코딩된 단일 폴리펩티드 쇄에서 정렬된다. BiTE®는 피코몰(pM) 농도에서 그들의 시험관내 및 생체내 선택적 T-세포 활성화, 및 그들의 작용 메카니즘에 대해 가장 상세하게 연구되었다(문헌[Baeuerle PA et al., (2009), Cancer Res, 69, pp. 4941-4944]). CD19(대부분의 인간 B 세포 악성종양에 의해 발현(문헌[Dreier T. et al., (2003), J Immunol, 170, pp. 4397-4402])) 및 다수의 고형 종양 상에 발현되는 EpCAM(문헌[Brischwein K. et al. (2006), Mol Immunol, 43, pp. 1129-1143])을 표적으로 하는 BiTE®는 가장 진전된 분자이며, 임상 시험에서 현재 시험중이다. 재조합 항-CD3 × 항-CD19 BiTE® 분자인 블리나투모맙(MT103으로도 알려져 있음)은 재발성 비-호지킨 림프종(NHL) 및 급성 림프모구성 백혈병(ALL)이 있는 환자의 치료로서 연구중이다. 단일의 작용제로서 블리나투모맙에 대하여 처음 확인된 반응은 NHL 환자에서 발생하였다(문헌[Bargou R. et al. (2008), Science, 321, pp. 974-977]). 더욱 최근에, 단계 2 임상 연구를 행하여, 최소 잔류 질병(MRD)-양성 B-계통 ALL에서 블리나투모맙의 효능을 결정하였다(문헌[Topp MS et al. (2011) J Clin Oncol, 29, pp. 2493-2498]). 21명의 환자를 0.015 ㎎/㎡/일의 용량 수준으로 처리하였으며, 그 중 16명의 환자가 MRD 음성이 되었다. 재발-부재 생존 확률은 405일의 추적 연구 중앙값에서, 78%인 것으로 보고되었다. 블리나투모맙은 MRD-양성 B-계통 ALL이 있는 환자에서 효과적이며, 잘 용인되었고, 처리는 연장된 백혈병-부재 생존을 야기하였다. CD19 및 EpCAM에 더하여, 예비임상 연구에 의해, BiTE® 항체가 EGFR, CEA, EPHA2, 흑색종-관련 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸, IGFR1, CD33, 섬유아세포-활성화 단백질 알파, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), c-MET, PSMA 및 HER2를 발현하는 종양 세포도 특이적으로 표적으로 할 수 있음이 나타났다(문헌[Baeuerle PA et al., (2009), Cancer Res, 69, pp. 4941-4944]; 문헌[Friedrich M. (2012) Mol Cancer Ther, 11(12), pp. 2664-2673]).
작은 크기의 BiTE® 항체(약 55 kDa) 때문에, 그들은 짧은 혈청 반감기를 특징으로 한다. 예를 들어, 이동식 펌프에 의한 블리나투모맙의 연속 정맥내 주입은 이러한 약물의 투여에 필요하다. 따라서, 짧은 생체내 반감기는 BiTE® 항체의 주요 한계점 중 하나이다(문헌[Kontermann R. (2005) Acta Pharmacologica Sinica, 26(1), pp. 1-9]).
CD3 및 암 세포 상의 표면 표적 항원 둘 모두를 인식하는 scFv 항체 단편에 기초한 다른 이중특이적 형식, 예를 들어, 동시 발현되어, 2개의 특이성 각각에 대하여 하나의 결합 부위를 갖는 공유 결합된 이종이량체 복합체를 생성하는 2개의 별개의 폴리펩티드로 이루어진 DART™ 플랫폼(문헌[Moore et al, (2011), Blood, 117, pp. 4542-4551]), 및 2개의 상이한 항체 유래의 각각 4개의 가변 도메인이 있는 2개의 폴리펩티드가 헤드에서 테일로, 동종이량체 분자로 배열되는, tandab®로 지칭되는 4가 탠덤 디아바디(tandem diabody) 구조(문헌[MØlhØj M. et al, (2007), Mol Immunol, 44(8), pp. 1935-1943])가 당업계에 알려져 있다.
scFv-기반의 이중특이적 전략의 상당히 짧은 반감기에 더하여, scFv-기반의 작제물은 V-영역과 다른 분자 유래의 파트너의 '도메인 교환'으로 인하여 응집물을 형성하는 경향을 갖거나(문헌[Moore et al, (2011), Blood, 117, pp. 4542-4551]), DART™ 플랫폼에 대해 나타낸 바와 같이, 그들은 이종이량체 복합체를 형성하기 위하여 더욱 복잡한 발현 시스템에 좌우된다(문헌[Moore et al, (2011), Blood, 117, pp. 4542-4551]).
최근에, 수많은 다른 이중특이적 형식이 생성되었으며(문헌[Chan A. and Carter P. (2010), Nat Rev Immunol, 10(5), pp. 301-316] 및 문헌[Kontermann R. (2012), Mabs, 4(2), pp. 182-197]에서 검토), 그 중 일부는 CD3 및 종양 세포 표면 항원으로 표적으로 하도록 설계되었다. 또한, 인간 IgG-유사 이중특이적 기술, 예를 들어, 단일 경쇄 항체를 사용하는 Biclonics™ ENGAGE 플랫폼(www.merus.nl), 단일 중쇄 항체에 의존하는 "카파-람다-바디(body)™"(www.novimmune.com) 및 이중특이적 IgG1/IgG2 항체(문헌[Strop et al. (2012) J Mol Biol, 420, pp. 204-219])를 기반으로 한 CD3 이중특이적 물질이 이러한 분야에서 발달되었다. 재지향된 T-세포 사멸을 위한 이중특이적 형식의 조작에서의 이들 최근의 진전에도 불구하고, 이들 더욱 신규한 기술에 대해서 여전히 2개의 중쇄와 단일의 경쇄 또는 하나의 중쇄와 2개의 경쇄의 동시-발현 및 이후의 더욱 복잡한 다운스트림 정제 과정의 요건, 또는 IgG1/IgG2 이중특이적 물질의 경우에 이종이량체화에 적합한 산화환원 조건의 필요와 같은 단점이 있다. 따라서, 약물-유사 특성, 예를 들어, 높은 수준의 발현, 유리한 물리화학적 특성(예를 들어, 높은 용해도 및 안정성에 더하여 낮은 응집 경향) 및 긴 혈청 반감기를 갖는 이중특이적 물질의 생성에 의학적 요구가 크다. 개선된 이중특이적 물질에 대한 요구는 또한 이중특이적 화합물을 논의하는 과학 회의가 생겨남에 의해 예시된다. 예를 들어, 2차 세계 이중특이적 항체 서밋(2nd World Bispecific Antibody Summit)에서 이중특이적 물질에 대한 산업의 집중이 심화되고 있는 것으로 언급되었다. 이중특이적 물질은 지난 2년에 65억 달러 초과의 가치가 있는 몇몇 인상적인 거래의 대상인 것으로 고려된다. 한편으로는, 흥미로운 이용 기회가 있으며, 성장을 위한 막대한 기회가 있지만, 이러한 신규한 부류의 약물이 그의 완전한 잠재력에 도달할 수 있기 전에, 여전히 다루어져야 할 많은 문제가 존재한다(http://www.nature.com/natureevents/science/events/14667; 2nd_World_Bispecific_Antibody_Summit).
따라서, 유리한 약물-유사 특성을 갖고, 약물 개발을 지원하기에 충분한 양과 질로 생성될 수 있으며, 치료제로서 적합한, 종양의 치료에 유용한 신규한 이중특이적 형식에 대한 의학적 요구가 크다. 이에 따라, 본 발명의 목적은 CD3 및 종양 세포 표면 항원을 표적으로 하는 이러한 신규한 이중특이적 결합 분자를 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 제1 실시형태에서, (i) CD3 및 (ii) 암 세포 상의 표면 표적 항원에 특이적으로 결합하는 이중특이적 결합 분자에 관한 것이며, 결합 분자는 (a) CD3에 특이적으로 결합하는 항체 및 (b) 암 세포 상의 표면 표적 항원에 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, 상기 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 이루어지되, 단 (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 10 내지 19 내의 적어도 하나의 아미노산이 치환되거나, 결실되거나, 첨가되고, (ii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 29 내지 36 내의 적어도 하나의 아미노산이 치환되거나, 결실되거나, 첨가되되, 단, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖고, 동일성의 결정은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 12 내지 17 및 31 내지 34를 배제한다.
"(i) CD3 및 (ii) 암 세포 상의 표면 표적 항원에 특이적으로 결합하는 이중특이적 결합 분자"라는 용어는 본 발명의 결합 분자가 CD3의 항원, 및 CD3과 상이한 암 세포 상의 표면 표적 항원의 항원에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다. 더욱이, 본 발명의 이중특이적 결합 분자는 동시에 상기 2개의 표적에 결합할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 "CD3 이중특이적 결합 분자"라는 용어는 또한, 2개의 결합 특이성을 포함하며, 하나는 CD3에 대한 것이며("항-CD3"), 제2의 것은 암 세포 상의 상이한 표면 표적 항원에 대한 것이다("암 세포 상의 항-표면 표적 항원" 또는 "항-종양 항원").
본 발명에 따르면, 각각의 분자가 유사한 구조의 에피토프와 교차 반응하지 않거나, 본질적으로 교차 반응하지 않는 경우, 분자는 특이적으로 결합하는(본원에 특이적으로 상호작용하는 것으로도 지칭) 것으로 여겨진다. 연구 중인 분자 패널의 교차-반응성은 예를 들어, 통상적인 조건하에서 관심있는 에피토프 및 다수의 다소(구조적으로 및/또는 기능적으로) 밀접하게 관련되는 에피토프에 대한 상기 분자의 패널의 결합을 측정함에 의하여, 시험될 수 있다. 그의 관련 맥락에서, 오직 관심있는 에피토프(예를 들어, 단백질 구조 내의 특정 모티프)에 결합하고, 다른 임의의 에피토프에는 결합하지 않거나 또는 본질적으로 결합하지 않는 분자만이 관심있는 에피토프에 특이적인 것으로 여겨진다. 예를 들어, 상응하는 방법이 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988] 또는 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999]에 기재되어 있다. 본원에 사용되는 "유사한 구조의 에피토프와 본질적으로 교차-반응하지 않는 분자"라는 용어는 유사한 구조의 에피토프에 대해서 보다 적어도 5배 더 큰 친화성, 더욱 바람직하게는 적어도 10배 더 큰 친화성, 예를 들어, 적어도 50배 더 큰 친화성, 더욱 바람직하게는 적어도 100배 더 큰 친화성, 예를 들어, 적어도 500배 더 큰 친화성으로 표적 항원에 결합하는 분자를 말한다. 더더욱 바람직하게는, 분자는 유사한 구조의 에피토프에 대해서 보다 적어도 1,000배 더 큰 친화성, 예를 들어, 적어도 10,000배 더 큰 친화성, 가장 바람직하게는 적어도 100,000배 더 큰 친화성으로 표적 항원에 결합한다.
본 발명의 이중특이적 결합 분자는 바람직하게는 5×10-7 내지 10-12 M, 더욱 바람직하게는 10-8 내지 10-12 M, 가장 바람직하게는 10-9 내지 10-12 M의 KD로 CD3에 결합한다. 마찬가지로, 본 발명의 이중특이적 결합 분자는 10-7 내지 10-12 M, 더욱 바람직하게는 10-8 내지 10-12 M, 가장 바람직하게는 10-9 내지 10-12 M의 KD로 암 세포 상의 선택된 표면 표적 항원에 결합한다.
에피토프는 입체적(conformational) 또는 연속적(continuous) 에피토프일 수도 있다. 폴리펩티드 항원에서, 입체적(또는 비연속적(discontinuous)) 에피토프는, 일차 서열에서는 분리되어 있으나, 폴리펩티드가 고유의 3-차원 구조로 폴딩되어 에피토프를 구성하는 경우, 분자 표면상에서 서로 가까이 위치하는 2개 이상의 개별 아미노산 잔기의 존재를 특징으로 한다(문헌[Sela, (1969) Science 166, 1365 and Laver, (1990) Cell 61, 553-6]). 에피토프에 기여하는 2개 이상의 개별 아미노산 잔기는 항원의 개별 섹션 또는 1개 초과의 (폴리)펩티드 쇄에 존재한다. 대조적으로, 선형 또는 연속적 에피토프는 (폴리)펩티드 쇄의 단일의 선형 세그먼트에서 인접하게 위치하는 2개 이상의 별개의 아미노산 잔기로 이루어진다.
"암 세포 상의 표면 표적 항원"이라는 용어는 비-종양 세포에서 발현되지 않거나, 비-종양 세포보다 더 많은 양으로 종양 세포에서 발현되는 항원을 말한다. "암 세포 상의 표면 표적 항원", "종양 항원" 및 "종양 관련 항원"이라는 용어는 본원에 상호교환가능하게 사용된다. 암 세포 상의 표면 표적 항원은 CD3 항원이 아니며, 더욱 바람직하게는 T-세포 수용체의 성분 내의 항원이 아니다. 바람직하게는 항원은 비-종양 세포 상에서보다 적어도 2배 더 많은 양, 더욱 바람직하게는 적어도 5배 더 많은 양, 예를 들어, 적어도 10배 더 많은 양, 더더욱 바람직하게는 적어도 100배 더 많은 양, 예를 들어, 적어도 1000배 더 많은 양, 가장 바람직하게는 적어도 10,000배 더 많은 양으로 종양 세포 상에서 발현된다. 적합한 표적 항원은 종양 세포 상에서 더욱 강력하게 발현되는 임의의 그러한 항원을 포함한다. 바람직하게는, 항원은 본원에 하기에 정의된 항원 중 하나이다.
"펩티드"라는 용어는 최대 30개의 아미노산의 선형 분자 쇄를 말한다. 다른 한편으로, "단백질"이라는 용어와 상호교환가능하게 본원에 사용되는 "폴리펩티드"라는 용어는 30개 초과의 아미노산을 함유하는 단쇄 단백질 또는 그들의 단편을 포함하는 아미노산의 선형 분자 쇄를 설명한다. 본원에 사용되는 "(폴리)펩티드"라는 용어는 펩티드 및 폴리펩티드 둘 모두를 말한다. (폴리)펩티드는 추가로 적어도 2개의 동일한 또는 상이한 분자로 이루어진 올리고머를 형성할 수 있다. 그러한 다량체의 상응하는 고차 구조는 상응하여 동종- 또는 이종이량체, 동종- 또는 이종삼량체 등으로 명명된다. 또한, 융합 단백질의 동종이량체, 삼량체 등은 "폴리펩티드"라는 용어의 정의에 속한다. 또한, 아미노산(들) 및/또는 펩티드 결합(들)이 기능적 유사체로 대체된, 그러한 (폴리)펩티드의 펩티도미메틱(peptidomimetics)도 또한 본 발명에 포함된다. 그러한 기능적 유사체는, 20종의 유전자-인코딩된 아미노산 외에 알려진 모든 아미노산, 예를 들어, 셀레노시스테인을 포함한다. 또한, "폴리펩티드" 및 "펩티드"라는 용어는 자연적으로 변형된 (폴리)펩티드를 말하며, 상기 변형은, 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 인산화 및 당업계에서 잘 알려진 유사 변형에 의하여 시행된다.
본 발명에 따르면, 결합 분자는 (a)에 정의된 바와 같은 항체 및 (b)에 정의된 바와 같은 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진다.
하나 이상의 카피의 상기 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드, 예를 들어, 2, 3 또는 4개의 카피의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드가 본 발명의 이중특이적 결합 분자에 존재할 수 있음이 인식될 것이다. 2개의 카피의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드가 존재하는 것이 바람직하다. 2개의 카피의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드가 존재한다면, 하기의 바람직한 옵션이 이용가능하다: (i) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 N-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 N-말단에 연결되거나(즉, 다시 말하면, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 카피는 상기 항체의 제1 중쇄의 N-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 카피는 상기 항체의 제2 중쇄의 N-말단에 연결됨), (ii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 C-말단에 연결되거나, (iii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 N-말단에 연결되고, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 N-말단에 연결되거나, (iv) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 C-말단에 연결됨.
본원에 "Fynomer®"라는 용어와 상호교환가능하게 사용되는 "Fyn SH3-유래 폴리펩티드"라는 용어는, 인간 Fyn SH3 도메인으로부터 유래된, 비-면역글로불린-유래 결합 폴리펩티드(예를 들어, 소위 스캐폴드)를 말한다. Fyn SH3-유래 폴리펩티드는 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 문헌[Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204], WO 2008/022759호, 문헌[Bertschinger et al (2007) Protein Eng Des Sel 20(2):57-68], 문헌[Gebauer and Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255] 또는 문헌[Schlatter et al. (2012), MAbs 4:4, 1-12]에 기술되어 있다.
Fyn 키나아제의 SH3 도메인(Fyn SH3)은 63개의 잔기, 즉, 서열번호 1에 나타낸 바와 같이 서열
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를 갖는 문헌[Semba et al. (1986) (Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 83(15): 5459-63)] 및 문헌[Kawakami et al. (1986) (Mol Cell Biol. 6(12): 4195-201)]에 보고된 서열의 아미노산 83 내지 145를 포함한다. Fyn은 티로신 키나아제의 Src 과의 59 kDa 구성원이다. 선택적 스플라이싱의 결과, Fyn 단백질은 그들의 키나아제 도메인이 상이한 2개의 상이한 아이소폼(isoform)으로 존재한다: 하나의 형태는 흉선세포, 비장세포 및 일부 혈액림프 세포주에서 발견되는 한편, 제2의 형태는 주로 뇌에서 축적된다(문헌[Cooke and Perlmutter (1989),New Biol. 1(1): 66-74]). 세포내 단백질인 Fyn의 생물학적 기능은 다양하고 T 세포 수용체를 통한 신호전달, 뇌 기능 조절 및 부착 매개의 신호전달을 포함한다(문헌[Resh (1998) Int. J. Biochem. Cell Biol. 30(11): 1159-62]). 다른 SH3 도메인과 같이, Fyn SH3은 2개의 역평행 β-시트로 이루어지고, 다른 단백질과 상호작용하기 위한 2개의 유연한 루프(RT-Src 및 n-Src-루프)를 함유한다. 2개의 유연한 루프(RT-Src 및 n-Src-루프라 칭함)의 서열은, 각각, SEQ ID NO: 1에 밑줄 및 두 줄-밑줄로 표시되어 있다. SEQ ID NO: 1의 Fyn SH3의 아미노산 서열은 인간, 마우스, 랫트 및 원숭이(긴팔원숭이) 간에서 완전히 보존된다.
당업계에서 나타난 바와 같이(WO 2008/022759호; 문헌[Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204]), Fyn SH3 도메인은 결합 폴리펩티드를 생성하기에 특히 매력적인 스캐폴드, 즉, Fynomer®이다. 그 이유는 Fynomer®가 (i) 박테리아에서 용해성 형태로 다량 발현될 수 있고, (ii) 용액에 보관 시 응집되지 않으며, (iii) 매우 안정하고(Tm 70.5℃), (iv) 시스테인 잔기가 결여되어 있으며, (v) 마우스에서 인간까지 완전히 보존되는 아미노산 서열을 특징으로 하여, 인간으로부터 본래 유래되어, 원치않는 면역원성 반응을 감소시키기 때문이다.
본 발명의 Fynomer®는 바람직하게는 천연에 존재하거나 천연으로부터 단리된 천연 SH3 도메인 함유 단백질이 아니다. 다시 말하면, 본 발명의 범주는 바람직하게는 야생형 SH3 도메인 함유 단백질을 배제한다. 천연에 풍부한 SH3 도메인 함유 단백질이 존재한다. 이들 천연 SH3 단백질은 그들의 천연 리간드에 대하여 결합 친화성을 갖는다. 이들 천연 SH3 리간드의 대부분은 PxxP 모티프를 갖는다. 본 발명의 Fynomer®는 야생형 SH3 도메인의 표적과 상이한 비-천연 표적에 대한 친화성을 갖도록 설계된 조작된 단백질이다. SH3 도메인의 비천연 표적은 임의의 표적일 수 있되, 단, 상기 표적은 천연에 존재하는 야생형 SH3 도메인의 천연(즉, 야생형), 세포내 리간드가 아니다. 예를 들어, SH3 도메인의 비천연 표적은 천연에 존재하는, 바람직하게는 포유류에 존재하는, 더욱 바람직하게는 인간에 존재하는 임의의 표적일 수 있되, 단, 상기 표적은 천연에 존재하는 야생형 SH3 도메인의 천연, 세포내 리간드가 아니다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 Fynomer®는 본질적으로 임의의 천연, 세포내 SH3 결합 리간드, 가장 바람직하게는 PxxP 모티프를 갖는 임의의 천연, 세포내 SH3 결합 리간드에 결합 친화성을 갖지 않는다.
특정 표적 항원에 특이적으로 결합하는 Fyn SH3-유래 폴리펩티드의 유래는 당업계에 기술되어 있다. 예를 들어, 상이한 Fyn SH3의 라이브러리는 상기 SEQ ID NO: 1에 나타낸 서열을 변경하여 생성될 수 있다. 바람직하게는, 변경은 (i) RT-루프를 나타내는 서열(상기 SEQ ID NO: 1에 밑줄로 나타나 있음) 또는 선택적으로 상기 서열에 인접한 최대 2개의 아미노산 위치에서(즉, SEQ ID NO: 1에서, 서열 DYEARTEDDL), 또는 (ii) Scr 루프(상기 SEQ ID NO: 1에 두 줄 밑줄로 나타나 있음) 또는 선택적으로 상기 서열에 인접한 최대 2개의 아미노산 위치에서(즉, SEQ ID NO: 1에서 서열 ILNSSEGD) 또는 (iii) 동시에 두 서열에서, 수행된다. 바람직하게는, 변경은 당업계에서 기술된 바와 같은 치환, 결실 또는 부가이다(예를 들어, WO 2008/022759호; 문헌[Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204] 참조). 아미노산 서열을 변경하는 수단 및 방법은 당업계에서 잘 알려져 있고, 예를 들어, 당업계에, 예를 들어, 문헌[Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204]에 기술되어 있다.
이후에, 이러한 Fyn SH3 라이브러리는 파지미드 벡터, 예를 들어, pHEN1으로 클로닝될 수 있으며(문헌[Hoogenboom et al. "Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains", Nucleic Acids Res, 19(15):4133-7, 1991]), 상기 라이브러리는 이후에 파지(phage) 상에 디스플레이되고 패닝(panning), 바람직하게는 예를 들어, 각 항원에 대하여 적어도 2회, 더욱 바람직하게는 적어도 3회의 패닝과 같은 반복된 횟수의 패닝을 거칠 수 있다. 그 다음, 확립된 기술, 예를 들어, 모노클로널 파지-ELISA에 의하여 결합 (폴리)펩티드에 대한 스크리닝이 수행될 수 있다. 그 다음, 이에 따라 확인된 클론의 시퀀싱을 사용하여, 풍부한 서열을 나타낼 수 있다. 이에 따라 확인된 결합 (폴리)펩티드는 추가로 예를 들어, 확인된 서열의 변경에 기초한 추가의 라이브러리의 생성에 의한 것과 같은 추가의 성숙 단계 및 반복된 파지 디스플레이 및 패닝 단계를 거칠 수 있다. 마지막으로, 생성된 Fyn SH3-유래 폴리펩티드의 교차-반응성 및 면역원성이 분석될 수도 있고, 표적 항원에 특이적인 Fyn SH3-유래 폴리펩티드가 선택될 수 있다.
결합 (폴리)펩티드의 파지 디스플레이 스크리닝 및 최적화 방법은 일반적으로 당업계에 알려져 있다.
본 발명의 맥락에서, Fyn 키나아제 SH3 도메인의 RT 루프(때때로 RT-Src-루프로도 표기)는 SEQ ID NO: 1의 위치 12 내지 17에 위치한 아미노산 "EARTED"로 이루어진다. RT 루프 내의 또는 그에 인접한 치환, 결실 및/또는 부가될, 즉 돌연변이될 위치는 본 발명에 따르면, 아미노산 10 내지 19, 바람직하게는 11 내지 18, 더욱 바람직하게는 12 내지 17이다.
이와 같이, 본 발명의 맥락에서, FYN 키나아제의 src 루프(때때로 n-Src-루프로도 표기)는 SEQ ID NO: 1의 위치 31 내지 34에 위치한 아미노산 NSSE로 이루어진다. src 루프 내의 또는 그에 인접한 치환, 결실 및/또는 부가될, 즉 돌연변이될 위치는 본 발명에 따르면, 아미노산 29 내지 36, 바람직하게는 30 내지 35, 더욱 바람직하게는 31 내지 34이다.
언급된 적어도 85% 서열 동일성은 임의의 더 큰 값의 서열 동일성을 포괄한다. 서열 동일성의 예상된 값은 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 및 100%이다. 서열 동일성을 결정하는 경우, SEQ ID NO: 1로 이루어진 서열과 관련하여 정의된, 표기된 아미노산 위치(12 내지 17 및 31 내지 34)는 무시되어야 한다. 다시 말하면, 주요 실시형태의 항목 (i) 및 (ii)가 SEQ ID NO: 1의 야생형 SH3 도메인 서열에 관하여 차이를 필요로 하는 한편, Fynomer® 서열의 나머지는 야생형에 대하여 85% 내지 100%의 서열 동일성을 갖는다. 그러한 정의된 서열 동일성의 결정은 예를 들어, 쌍별 서열 정렬을 수행하고, 정렬 프로그램에 의해 기록된 서열 동일성을 무시하고, SEQ ID NO: 1의 위치 12 내지 17 및 31 내지 34가 고려되지 않도록 서열 동일성의 정도를 재평가함으로써 행해질 수 있다. 그러한 서열 동일성의 재평가는 이들 결정 지침을 고려하여 추가의 노력 없이 당업자에 의해 행해질 수 있다. 언급된 바와 같이, 12 내지 17 및 31 내지 34의 범위는 본원에 상기 SEQ ID NO: 1의 서열의 표시에서 밑줄로 표시되어 있다. 어느 하나의 측에 2개의 플랭킹(flanking) 아미노산을 포함하는 경우, 10 내지 19 및 29 내지 36의 범위가 수득되며(항상 SEQ ID NO: 1로 이루어진 서열의 아미노산에 관하여), 이는 어느 하나의 경우에, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가가 시행될 주요 실시형태의 항목 (i) 및 (ii)에 따른 영역이다.
본원에 사용되는 아미노산 서열 간의 "아미노산 서열 동일성"이라는 용어는 생화학의 당업자의 통상의 및 광범위하게 사용되는 정렬 및 비교 기술에 관한 것을 의미한다. 2개의 아미노산 서열의 아미노산 서열 동일성은 흔한 정렬 방법 및 툴(tool)에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열에 비한 임의의 폴리펩티드의 아미노산 서열 동일성의 정도의 결정을 위하여, SIM 국소 유사성 프로그램이 바람직하게 사용되며(문헌[Xiaoquin Huang and Webb Miller (1991), Advances in Applied Mathematics, vol. 12: 337-357]), 그것은 저자 및 그들의 기관으로부터 자유롭게 이용가능하다(월드 와이드 웹: http://www.expasy.org/tools/sim-prot.html도 또한 참조). 다중의 정렬 분석을 위하여, 바람직하게는 ClustalW가 사용된다(문헌[Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res., 22(22): 4673-4680]). SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열에 대한 폴리펩티드의 아미노산 서열 동일성의 정도는 SEQ ID NO: 1의 위치 12 내지 17 및 31 내지 34를 제외하고, SEQ ID NO: 1의 완전한 서열에 비하여 결정된다.
치환은 보존적 또는 비보존적 치환일 수 있으나, 바람직하게는 보존적 치환이다. 일부 실시형태에 있어서, 치환은 또한 비천연 발생 아미노산으로의 천연 발생 아미노산의 교환을 포함한다. 보존적 치환은 치환되는 아미노산과 유사한 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로의 아미노산의 치환을 포함한다. 바람직하게는, 보존적 치환은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환이다: (i) 상이한 염기성 아미노산으로의 염기성 아미노산의 치환; (ii) 상이한 산성 아미노산으로의 산성 아미노산의 치환; (iii) 상이한 방향족 아미노산으로의 방향족 아미노산의 치환; (iv) 상이한 비극성 지방족 아미노산으로의 비극성 지방족 아미노산의 치환; 및 (v) 상이한 극성 비하전 아미노산으로의 극성 비하전 아미노산의 치환. 염기성 아미노산은 아르기닌, 히스티딘 및 라이신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 산성 아미노산은 아스파르트산염 또는 글루탐산염으로부터 선택된다. 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 비극성 지방족 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 메티오닌 및 이소류신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 극성 비하전 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 프롤린, 아스파라긴 및 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 비보존적 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환과 대조적으로, 상기 약술된 보존적 치환 (i) 내지 (v)에 속하지 않는 임의의 아미노산으로의 하나의 아미노산의 교환이다.
본원에 간단히 "CD3"으로 지칭되는 CD3(분화 클러스터 3) T-세포 공동-수용체는 단백질 복합체이며, 4개의 별개의 쇄로 이루어진다. 포유류에서, 복합체는 CD3γ 쇄, CD3δ 쇄 및 2개의 CD3ε 쇄를 함유한다. 이들 쇄는 T-세포 수용체(TCR)로 알려져 있는 분자 및 ζ-쇄와 회합하여, T 림프구에서 활성화 신호를 생성한다. TCR, ζ-쇄 및 CD3 분자는 함께 TCR 복합체를 이룬다. 상기 논의된 바와 같이, 뮤린 및 인간화 항-CD3 항체, 예를 들어, 무로모납-CD3(문헌[Norman DJ (1995) Ther Drug Monit 17(6), pp. 615-620]), 테플리주맙 및 오텔릭시주맙(문헌[Chatenoud L. (2010) 6(3), pp. 149-157]), Cris-7(문헌[Alberola-Ila J. et al. (1991), J Immunol, 146(4), pp. 1085-1092]) 및 기타, 예를 들어, SP34(문헌[Conrad et al. (2007) Cytometry, 71(11), pp. 925-933])가 당업계에 널리 알려져 있다. 또한, 암 환자의 치료를 위한 CD3 및 암 세포 상의 표면 표적 항원 둘 모두를 인식하는 몇몇의 이중특이적 항체 형식은 문헌에 기술되어 있다. 그러나, 언급된 바와 같이, 많은 이중특이적 CD3 형식은 불량한 약물-유사 특성, 예를 들어, 만족스럽지 않은 생성의 용이성, 생성 수율, 산물 용해도 및 산물의 약동학적 파라미터를 나타낸다.
본 발명에 따라 사용되는 "항체"라는 용어는 예를 들어, 폴리클로널 또는 모노클로널 항체를 포함한다. 또한, 여전히 결합 특이성을 유지하는 유도체 또는 그의 단편도 또한, "항체"라는 용어에 포함된다. 항체 단편 또는 유도체는 특히, Fab 또는 Fab' 단편, Fd, F(ab')2, Fv 또는 scFv 단편, 단일 도메인 VH 또는 V-유사 도메인, 예를 들어, VhH 또는 V-NAR-도메인 및 다량체 형식, 예를 들어, 미니바디, 디아바디, 트리바디, 테트라바디 또는 화학적으로 컨쥬게이트된 Fab'-다량체를 포함한다(예를 들어, 문헌[Altshuler et al., 2010., Holliger and Hudson, 2005] 참조). 또한, "항체"라는 용어는 예를 들어, 키메라(인간 불변 도메인, 비인간 가변 도메인), 단쇄 및 인간화(비인간 CDR을 제외한 인간 항체) 항체와 같은 실시형태를 포함한다. 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 이루어진 인간화 전장 IgG 항체가 가장 바람직하다. 이에 따라, "전장 항체"라는 용어는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 이루어진 항체를 말한다.
"항체의 Fc 부분"은 당업자에게 잘 알려져 있는 용어이며, 항체의 파파인 절단에 기초하여 정의된다. 그들의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 부류, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 나뉘며, 이들의 몇몇은 하위부류(아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 중쇄 불변 영역에 따라, 상이한 부류의 면역글로불린은 각각 [알파], [델타], [엡실론], [감마] 및 [뮤]로 지칭된다. 항체의 Fc 부분은 ADCC(항체-의존성 세포-매개의 세포독성) 및 보체 활성화, C1q 결합 및 Fc 수용체 결합에 기초한 CDC(보체-의존성 세포독성)에 직접 연루된다. 4개의 인간 IgG 아이소타입은 상이한 친화성으로, 상이한 수용체, 예를 들어, 신생아 Fc 수용체, 활성화 Fc 감마 수용체, FcgRI, FcgRIIa 및 FcgRIIIa, 억제 수용체 FcgRIIb 및 C1q에 결합하여, 매우 상이한 활성을 제공한다. 인간 항체의 Fc 부분의 활성화 및 억제 수용체에 대한 친화성이 조작되고 변형될 수 있는 것이 알려져 있다(문헌[Strohl W. (2009) Curr Opin Biotechnol, 20, p. 685-691] 참조).
본 발명의 이중특이적 결합 분자 내의 CD3에 특이적으로 결합하는 항체는 바람직하게는 본 발명의 이중특이적 결합 분자의 생체내 반감기가 연장되게 하는 Fc 부분을 포함한다. 그러한 Fc 부분은 인간 기원의 것, 더욱 바람직하게는 IgG1 항체의 인간 Fc 부분, 더더욱 바람직하게는 이펙터 기능의 활성화 또는 침묵화가 있는 IgG1의 조작된 인간 Fc 부분이며, 이펙터 기능의 침묵화가 이펙터 기능의 활성화에 비해 바람직하다. 가장 바람직하게는 그러한 Fc 부분은 L234 및 L235의 돌연변이와 함께 이펙터 기능의 침묵화가 있는 IgG1의 조작된 인간 Fc 부분이며, 넘버링은 카바트(Kabat)의 EU 인덱스에 따른다(문헌[Johnson G. and Wu T.T. (2000) Nucleic Acids Res. 28 p. 214-218] 참조). 작제물 COVA420, COVA422 및 COVA467의 제조를 위해 본원에서 하기 실시예에 사용된 SEQ ID NO: 2 및 3을 갖는 항체는 이펙터 기능의 침묵화 및 위치 L234 및 L235의 돌연변이가 있는 항-CD3 항체이다. 또한, 작제물 COVA493, COVA494, COVA497 및 COVA499의 제조를 위해 본원에서 하기 실시예에 사용된 SEQ ID NO: 171 및 172를 갖는 항체는 위치 D265 및 P329의 침묵화 이펙터 돌연변이가 있는 항-CD3 항체이며, 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따른다(문헌[Shields RL. et al (2001) J. Biol. Chem. 276 p. 6591 - 6604] 참조).
항체 및 그의 단편의 생성을 위한 다양한 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Altshuler et al., 2010]에 기술되어 있다. 이에 따라, 폴리클로널 항체는 첨가제 및 애쥬번트와의 혼합물 중 항원으로의 면역화 후에 동물의 혈액으로부터 수득될 수 있으며, 모노클로널 항체는 연속 세포주 배양에 의해 생성되는 항체를 제공하는 임의의 기술에 의해 생성될 수 있다. 이러한 기술에 대한 예는 예를 들어, 문헌[Harlow and Lane (1988) and (1999)]에 기술되어 있으며, 원래 문헌[Kohler and Milstein, 1975]에 기술된 하이브리도마 기술, 트리오마(trioma) 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(예를 들어, 문헌[Kozbor, 1983]; 문헌[Li et al., 2006] 참조) 및 인간 모노클로널 항체를 생성하기 위한 EBV-하이브리도마 기술(문헌[Cole et al., 1985])을 포함한다. 추가로, 재조합 항체는 모노클로널 항체로부터 수득될 수 있거나, 다양한 디스플레이 방법, 예를 들어, 파지, 리보솜, mRNA 또는 세포 디스플레이를 사용하여 새로이 제조될 수 있다. 재조합(인간화) 항체 또는 그의 단편의 발현에 적합한 시스템은 예를 들어, 박테리아, 효모, 곤충, 포유류 세포주 또는 트랜스제닉 동물 또는 식물로부터 선택될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,080,560호; 문헌[Holliger and Hudson, 2005] 참조). 추가로, 단쇄 항체의 생성에 대해 기재된 기술(특히, 미국 특허 제4,946,778호 참조)을 조정하여, 본 발명의 표적에 특이적인 단쇄 항체를 생성할 수 있다. BIAcore 시스템에 사용되는 바와 같은 표면 플라스몬 공명을 사용하여 파지 항체의 효율을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 이중특이적 결합 분자는 많은 통상적이며, 잘 알려져 있는 기술 중 임의의 것, 예를 들어, 플레인 유기 합성 전략, 고체상-보조 합성 기술에 의해 또는 상업적으로 이용가능한 자동화 합성기에 의해 제조될 수 있다. 다른 한편으로, 그들은 또한 단독의 통상의 재조합 기술에 의해 또는 통상의 합성 기술과 병용하여 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 이중특이적 결합 분자는 본원에 상기 (a) 및 (b)에 정의된 바와 같이 화합물을 조합함으로써 수득될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, CD3 및 암 세포 상의 표면 표적 항원 둘 모두를 인식하는 일부 이중특이적 항체는 매우 강력한 항-종양 사멸 활성을 나타낸다. 따라서, BiTE® 항체는 표적 종양 항원을 발현하는 세포의 높은 효력의 재지향된 용해를 나타낸다. 일반적으로 BiTE® 항체의 EC50 값은 0.1 내지 50 pM 범위이다(문헌[Bauerle PA and Reinhardt C. (2009) Cancer Res. 69(12), pp. 4941-4944]). 약리학적으로 요망되는 효과를 가하기 위하여, 종양 세포의 강력한 세포 사멸이 필요하다. 검토에서, Rader C.는 BiTE® 형식의 강력한 사멸 능력이 (1) 표적과 이펙터 세포를 매우 근접되게 하여, 세포용해 시냅스의 형성을 가능하게 하는 그의 작은 크기 및 (2) 표적 세포의 부재하에 이펙터 세포의 전신 활성화를 방지하는 TCR 복합체의 그의 1가 결합 때문인 것이 보고되었다(문헌[Rader C, (2011), Blood, 117(17), pp. 4403-4404]). 또한, 종래 기술에서는 BiTE® 부류의 이중특이적 항체가 다른 CD3-이중특이적 형식 및 완전한 모노클로널 IgG1 항체에 비하여 종양 세포 용해에서 전형적으로 100 내지 10,000배 더 높은 효능을 갖는 것을 기재하였다(문헌[Wolf et al (2005) Drug Discov Today 10(18), pp. 1237-1244]). 또한, 완전한 항체는 본 발명의 이중특이적 결합 분자의 부분을 형성한다. MØlhØj M. 등은 추가로 보다 작은 1가 BiTE® 형식(55 kDa)이 보다 큰 2가 tandab® 형식(대략 115 kDa)보다 훨씬 더 강력한 것을 보여주었다(특정 분석법에서 2000배 초과)(문헌[MØlhØj M. et al, (2007), Mol Immunol, 44(8), pp. 1935-1943]). 저자는 CD3으로의 BiTE®의 1가 결합이 BiTE® 분자의 강력한 사멸 활성의 원인임을 언급한다.
약술하면, 종래 기술은 작은 1가의 항-CD3 × 항-종양 항원 이중특이적 항체 형식(예를 들어, BiTE® 형식)이 큰 2가의 CD3 이중특이적 형식보다 더욱 강력한 재지향된 T 세포 사멸 활성을 나타냄을 교시한다. 이에 따라, 종래 기술은 강력한 항-종양 사멸이 전형적으로, 작은 1가의 CD3 이중특이적 형식으로 수득되기 때문에, 큰 2가의 CD3 이중특이적 형식의 사용을 막는다.
놀랍게도, 본 발명과 관련하여, 완전한 항-CD3 항체 및 종양 관련 항원에 결합하는 2개의 카피의 Fynomer로 이루어진 이중특이적 결합 분자가 강력한 재지향된 T-세포 사멸 활성을 매개할 수 있는 것이 관찰되었다. 본 발명의 이중특이적 결합 분자가 약 165 kDa의 크기를 갖는 것은 주목할 만하다. 본 발명의 큰 이중특이적 결합 분자의 T-세포 매개의 세포독성은 상기 논의된 종래 기술 교시와 대조적으로, 예상치 않게 작은 1가의 CD3 이중특이적 분자; 즉, BiTE® 형식에 대하여 전형적으로 관찰되는 것과 유사한 범위이다. 본 발명의 CD3 이중특이적 결합 분자 및 종래 기술의 1가 CD3 이중특이적 분자 둘 모두의 매우 강력한 항-종양 사멸 활성을 입증하는 비교 데이터가 본 명세서의 실시예에 제공된다. 더욱 구체적으로, 항-CD3 항체 및 3가지 상이한 종양 관련 항원에 결합하는 Fynomer로 이루어진 융합 단백질의 예가 나타나 있다. 실시예 1 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 CD3/HER2 이중특이적 분자 COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164)은 작은 1가 이중특이적 scFv 대조군(SEQ ID NO: 167)의 세포독성 효능만큼 우수한 세포독성 효능을 보여주며, 둘 모두는 두 자리 수의 pM 범위의 EC50 값을 갖는다(각각 87 pM 및 60 pM의 EC50 값). 본 발명의 EGFR/CD3 이중특이적 분자 COVA493(SEQ ID NO: 170 및 172), COVA494(SEQ ID NO: 171 및 198), COVA497(SEQ ID NO: 199 및 172), COVA499(SEQ ID NO: 171 및 200)를 기재하는 실시예 2, 및 본 발명의 CD33/CD3 이중특이적 분자 COVA467(SEQ ID NO: 2 및 175)을 기재하는 실시예 3은 추가로 본 발명의 이중특이적 분자의 강력한 재지향된 T-세포 사멸 활성을 보여준다. 또한, 도 6은 매개체로서 농축된 T-세포를 사용하는 사멸 분석법에서 본 발명의 이중특이적 분자, COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164) 및 COVA422(SEQ ID NO: 165 및 166) 둘 모두에 대하여 피코몰의 EC50 값이 수득되었음을 보여준다(각각 8 pM 및 175 pM). 더욱이, 본원의 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 Fynomer-항체 융합은 이중특이적 scFv 대조군 항체 형식(SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 173 및 SEQ ID NO: 176)과 매우 유사한 매우 유리한 발현 수율(CHO 세포의 일시적 트랜스펙션 후의 두 자리 수의 ㎎/ℓ 범위)을 보여준다. 또한, 본 발명의 Fynomer-항체 융합은 유리한 생물물리학적 특성을 가지며, 응집하지 않고(도 3; 도 11 및 도 15a), 생체내에서 긴 IgG-유사 반감기를 나타낸다(도 8). 증가된 반감기는 직접적으로 환자에 대한 그의 상당한 이익으로 나타나는데, 그 이유는 연속 주입이 필요하지 않을 것이며/거나 연속 처리 간에 보다 긴 간격이 가능하게 되며, 이는 건강관리 시스템에 대한 비용 부담을 줄이는데도 도움을 주기 때문이다. 주 2회 주사 후에, COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164)은 생체내 종양 모델에서 scFv 대조군 분자(COVA446(SEQ ID NO: 167); 매일의 주사)에 비하여 뛰어난 상당한 종양 성장 지연을 나타내며, 이는 추가로, COVA420의 강력한 항-종양 효능을 보여준다(도 9).
또한, 언급된 바와 같이, 1가 CD3 이중특이적 분자는 그들의 작은 크기 때문에, 오직 수시간의 짧은 혈청 반감기를 특징으로 한다. 이에 따라, 휴대용 미니-펌프를 사용한 연속 정맥내 주입에 의해 작은 크기의 1가 CD3 이중특이적 분자를 투여하는 것이 종종 필요하며, 이는 치료할 환자에게 편하지 않다. 본 발명의 이중특이적 분자가 전형적으로 전장 항체로 수득되는 것과 대략 동일한 혈청 반감기를 갖는 것이 유리하며(실시예 참조), 이러한 혈청 반감기는 1가 CD3 이중특이적 분자의 혈청 반감기보다 뛰어나다. 1가 CD3 이중특이적 분자의 다른 주요 제한점은 그들에 기능적 특성, 예를 들어, Fc-수용체로의 결합과 관련된 항체의 불변 영역이 결여되어 있다는 것이다. 본 발명의 이중특이적 분자는 항-CD3 항체의 불변 영역을 포함한다.
그러므로, 본 발명의 CD3 이중특이적 결합 분자는 1가 CD3 이중특이적 분자와 완전한 항-CD3 항체의 이점을 조합한다.
1가 CD3 이중특이적 분자에 비한, 특히 BiTE® 항체에 비한 본 발명의 CD3 이중특이적 결합 분자의 다른 이점은 암 세포에서 과발현되는 많은 표면 표적 항원이 비록 상당히 더 낮은 수준이지만, 비-종양 세포 상에서도 발현된다는, 잘 알려져 있고, 상기 논의되어 있는 사실에 기인한다. 강력한 재지향된 T-세포 사멸 활성을 매개하는 이중특이적 분자는 이상적으로 높은 수준의 표면 항원을 갖는 암 세포에서 선택적으로 그의 활성을 가하며, 낮은 수준의 표면 항원을 갖는 정상 세포에서 그의 활성을 가하지 않는다.
따라서, BiTE® 항체가 종양 항원을 발현하는 세포의 높은 효력의 재지향된 용해를 나타내지만, BiTE® 항체의 한가지 주요 단점은 그들이 종양 항원을 보다 낮은 수준으로 발현하는 비-비-종양 세포도 또한 상당한 정도로 사멸시킬 수 있다는 점이다. 예를 들어, Lutterbuese 등은 원숭이에서 항-CD3/EGFR BiTE®가 주입 시작 후 56시간 내에 31 및 154 ㎍/㎏/일의 용량에서 중증의 독성의 증후를 보이는 것을 보고하였다(문헌[Lutterbuese R. et al. (2010) PNAS, vol 107, no.28, pp. 12605-12610]). 31 또는 154 ㎍/㎏/일로 C-BiTE를 제공받은 동물의 조직병리학적 분석에 의해, 간 및 신장 독성의 증후가 나타났으며, 이는 이들 기관에서 낮은 수준의 EGFR을 발현하는 세포의 재지향된 용해의 결과일 수 있다. 추가로, 저자는 EGFR을 발현하는 것으로 알려져 있는 모든 조직, 즉, 침샘, 간, 위, 소장, 결장, 직장, 신장, 부신, 요관, 방광, 전립선 및 부고환에서의 세포사를 주목한다.
또한, 이중특이적 scFv 항체 단편에 의한 EGFR 발현 세포의 비-선택적 사멸이 본원에 하기 실시예에서 확인된다. 유방암 MDA-MB-468 세포는 EGFR을 상당히 과발현하는 한편, 결장암 HT-29 세포는 비-종양 세포와 거의 동일한 EGFR의 발현 수준을 갖는다(문헌[Yingjie et al (2005); Mol Cancer Ther, 4(3):435-442]). 실시예 2.3에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 항-CD3/EGFR scFv 항체 단편(SEQ ID NO: 173)은 높은 EGFR 발현 수준(MDA-MB-468 세포) 및 낮은 EGFR 발현 수준(HT-29 세포)을 갖는 세포의 강력한 재지향된 용해를 매개하였다. 각각 MDA-MB-468 및 HT-29 세포의 사멸에 대한 EC50 값은 0.2 pM 및 2.5 pM이었다(즉, 오직 12.5배 차이). 이에 따라, EGFR에 대하여 예시된 바와 같이, 이중특이적 scFv 항체 단편은 표면 종양 항원을 과발현하는 세포에서 선택적으로 강력한 재지향된 T-세포 사멸 활성을 매개할 수 없다. 비-종양 세포의 상당한 요망되지 않는 세포-사멸 부작용이 본 발명자들 및 상기 논의된 Lutterbuese R. 등의 문헌에 의해 관찰되었다.
그에 반하여, 놀랍게도, 항-CD3 항체 및 종양 관련 항원에 결합하는 Fynomer로 이루어진 이중특이적 결합 분자가 항원을 과발현하는 세포에 대하여 선택적으로 강력한 재지향된 T-세포 사멸 활성을 매개할 수 있는 것이 관찰되었으며, 보다 낮은 수준의 항원이 있는 세포는 심지어 고농도에서도 사멸되지 않았다. 각각 항-CD3 항체 및 EGFR에 결합하는 2개 카피의 Fynomer로 이루어진 4개의 상이한 이중특이적 결합 분자에 대하여 실시예 2.3에 나타낸 바와 같이, 고 및 저 EGFR-발현 세포 간의 사멸 활성의 차이는 580배 내지 3'500배 초과의 범위였다.
또한, CD3 및 HER2-발현 세포를 표적으로 하는 이중특이적 scFv 항체 단편이 높은 수준 및 낮은 수준으로 HER2를 발현하는 둘 모두의 세포를 비-선택적으로 사멸시키는 것은 본 발명의 실시예 1.7로부터 명백하다. 난소암 SKOV-3 세포는 HER2를 상당히 과발현하는 한편, 유방암 MCF-7 세포는 훨씬 더 낮은 발현 수준의 HER2를 갖는다(문헌[Lattrich et al. (2008), Oncology Reports, 19:811-817]). 실시예 1.7에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 항-CD3/HER2 scFv 항체 단편(SEQ ID NO: 167)은 높은 HER2 발현 수준(SKOV-3 세포) 및 낮은 HER2 발현 수준(MCF-7 세포)을 갖는 세포의 강력한 재지향된 용해를 매개하였다. 각각 SKOV-3 및 MCF-7 세포의 사멸에 대한 EC50 값은 2.3 pM 및 53 pM이었다(즉, 오직 23배 차이). 이에 따라, CD3 및 HER2에 대한 이중특이적 scFv 항체 단편도 또한, 표면 종양 항원을 과발현하는 세포에서 선택적으로 강력한 재지향된 T-세포 사멸 활성을 매개할 수 없다. 다시, 비-종양 세포의 상당한 요망되지 않는 세포-사멸 부작용이 본 발명자들에 의해 관찰되었으며, 이에 의해, CD3 및 EGFR에 대한 이중특이적 scFv 항체 단편과 관련하여 수득된 결과가 확인된다.
또한, 놀랍게도, 항-CD3 항체 및 종양 관련 항원, 즉 HER2에 결합하는 Fynomer로 이루어진 이중특이적 결합 분자가 항원을 과발현하는 세포에 대하여 선택적으로 강력한 재지향된 T-세포 사멸 활성을 매개할 수 있는 한편, 더 낮은 수준의 항원을 갖는 세포는 심지어 고 농도에서도 사멸되지 않았음이 다시 관찰되었다. 항-CD3 항체 및 HER2에 결합하는 2개 카피의 Fynomer(SEQ ID NO: 163 및 164)로 이루어진 이중특이적 결합 분자에 대하여 실시예 1.7 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 고 및 저 HER2-발현 세포 간의 사멸 활성의 차이는 4310배 초과였다.
정상 항원 수준을 갖는 세포를 살리면서, 항원을 과발현하는 종양 세포를 선택적으로 사멸시키는 것은, 직접적으로 환자에 대한 상당한 이익으로 나타나는데, 그 이유는 CD3-기반의 방법에 대한 치료 창(therapeutic window)이 개선되기 때문이다. 이에 따라, 비-종양 세포의 원치않는 세포-사멸 부작용은 본 발명의 이중특이적 작제물을 사용함으로써 최소화되거나 심지어는 회피될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, CD3에 특이적으로 결합하는 항체는 테플리주맙, 오텔릭시주맙, Cris-7 또는 SP34이다.
항체 테플리주맙, 오텔릭시주맙(문헌[Chatenoud L. (2010) 6(3), pp. 149-157]), Cris-7(문헌[Alberola-Ila J. et al. (1991), J Immunol, 146(4), pp. 1085-1092]) 및 SP34는 종래 기술에서 알려져 있다. MGA031 및 hOKT3-감마1(Ala-Ala)로도 지칭되는 테플리주맙(CAS-Nr: 876387-05-2)은 인간화 항-CD3 모노클로널 항체이다. 테플리주맙은 성숙 T 림프구에서 발현되는 CD3-엡실론 쇄의 에피토프에 결합하며, 그렇게 함으로써, 다수의 자가면역 질병의 근본적인 병적 면역 반응을 조절할 수 있다. 구체적으로, 테플리주맙은 원치않는 이펙터 T 세포를 억제하고, 유익한 조절 T 세포 기능을 증진시켜, 면역 용인성을 촉진시킬 수 있다. TRX4로도 알려져 있는 오텔릭시주맙(CAS Nr 881191-44-2)은 마찬가지로 CD3의 엡실론 쇄를 표적으로 한다. 모노클로널 항체 Cris-7은 성숙 인간 T-세포 상의 CD3 항원을 인식한다. CD3 항원은 T 세포 수용체(TCR) 및 ζ-쇄와 회합하여, T 림프구에서 활성화 신호를 생성하는 4개의 별개의 쇄(CD3γ, CD3δ 및 2개의 CD3ε)로 이루어진 단백질 복합체이다. 항체는 비엠에이 바이오메디컬즈(BMA BIOMEDICALS)로부터 수득될 수 있다. SP34는 비디 바이오사이언스즈(BD Biosciences)로부터 수득될 수 있다.
본 발명에 따르면, 인간화 버전의 Cris-7 또는 SP34가 CD3에 특이적으로 결합하는 항체로서 사용되는 것이 바람직하다.
항체의 인간화 수단 및 방법은 당업계에 널리 확립되어 있으며; 예를 들어, 문헌[Riechmann et al. (1988), Nature 332 (6162): 332-323] 또는 문헌[Kashmiri et al., Methods 36 (1): 25-34]을 참조한다.
항체 테플리주맙 및 오텔릭시주맙은 침묵화된 이펙터 기능을 갖는 항체이다. 또한, 침묵화된 이펙터 기능을 갖는 변형된 버전의 Cris-7 또는 SP34가 CD3에 특이적으로 결합하는 항체로서 사용되는 것이 바람직하다. 본원에서 상기 더욱 상세화된 바와 같이, 침묵화된 이펙터 기능을 갖는 항체가 L234 및 L235, 또는 위치 D265 및 P329에 돌연변이를 갖는 것이 가장 바람직하며, 넘버링은 카바트의 EU 인덱스에 따른다. 또한, 침묵화된 이펙터 기능을 갖는 인간화 버전의 Cris-7 또는 SP34가 CD3에 특이적으로 결합하는 항체로서 사용되는 것이 바람직한 것이 이해되어야 한다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 항-CD3 항체는 SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3을 포함하거나, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3을 포함하거나 이로 이루어진다.
SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3이 각각 항-CD3 항체의 VH 및 VL 영역인 것이 본 명세서에서 이해되어야 한다. 본 발명의 항-CD3 항체가 SEQ ID NO: 2의 VH 영역을 포함함과 동시에 SEQ ID NO: 3의 VL 영역을 포함하지 않는 경우에, 항-CD3 항체가 SEQ ID NO: 3 이외의 항-CD3 항체의 VL 영역을 포함하는 것이 이해되어야 한다. 마찬가지로, 본 발명의 항-CD3 항체가 SEQ ID NO: 3의 VL 영역을 포함함과 동시에 SEQ ID NO: 2의 VH 영역을 포함하지 않는 경우에, 항-CD3 항체가 SEQ ID NO: 2 이외의 항-CD3 항체의 VH 영역을 포함하는 것이 이해되어야 한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 항-CD3 항체는 SEQ ID NO: 171 및/또는 SEQ ID NO: 172를 포함하거나, SEQ ID NO: 171 및 SEQ ID NO: 172를 포함하거나 이로 이루어진다.
SEQ ID NO: 171 및 SEQ ID NO: 172가 각각 항-CD3 항체의 VH 및 VL 영역임이 본 명세서에서 이해되어야 한다. 본 발명의 항-CD3 항체가 SEQ ID NO: 171의 VH 영역을 포함함과 동시에 SEQ ID NO: 172의 VL 영역을 포함하지 않는 경우에, 항-CD3 항체가 SEQ ID NO: 172 이외의 항-CD3 항체의 VL 영역을 포함하는 것이 이해되어야 한다. 마찬가지로, 본 발명의 항-CD3 항체가 SEQ ID NO: 172의 VL 영역을 포함함과 동시에 SEQ ID NO: 171의 VH 영역을 포함하지 않는 경우에, 항-CD3 항체가 SEQ ID NO: 171 이외의 항-CD3 항체의 VH 영역을 포함하는 것이 이해되어야 한다.
본원에서 하기 실시예로부터 명백한 바와 같이, 본 발명을 예시하기 위하여 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3을 포함하는 항-CD3 항체 및 SEQ ID NO: 171 및 SEQ ID NO: 172를 포함하는 항-CD3 항체를 사용한다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시형태에 따르면, 결합 분자는 HER2, CD19, EGFR, CEA, EPHA2, 흑색종-관련 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸, IGFR1, CD33, 섬유아세포-활성화 단백질 알파, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), c-MET, EpCAM 또는 PSMA에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 목록에서, EGFR, HER2 및 CD33이 가장 바람직하다. 이러한 3개의 표적의 목록에서, EGFR 및 HER2가 바람직하다. EGFR이 가장 바람직하다.
이에 따라, 본 발명의 바람직한 결합 분자는 HER2에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3을 포함하거나; CD19에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3을 포함하거나; EGFR에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3을 포함하거나; CEA에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3을 포함하거나; EPHA2에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3을 포함하거나; 흑색종-관련 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3을 포함하거나; IGFR1에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3을 포함하거나; CD33에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3을 포함하거나; 섬유아세포-활성화 단백질 알파에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3을 포함하거나; 전립선 줄기 세포 항원(PSCA)에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3을 포함하거나; c-MET에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3을 포함하거나; EpCAM에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3을 포함하거나; PSMA에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3을 포함한다.
마찬가지로, 본 발명의 바람직한 결합 분자는 HER2에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, SEQ ID NO: 171 및/또는 SEQ ID NO: 172를 포함하거나; CD19에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, SEQ ID NO: 171 및/또는 SEQ ID NO: 172를 포함하거나; EGFR에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, SEQ ID NO: 171 및/또는 SEQ ID NO: 172를 포함하거나; CEA에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, SEQ ID NO: 171 및/또는 SEQ ID NO: 172를 포함하거나; EPHA2에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, SEQ ID NO: 171 및/또는 SEQ ID NO: 172를 포함하거나; 흑색종-관련 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, SEQ ID NO: 171 및/또는 SEQ ID NO: 172를 포함하거나; IGFR1에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, SEQ ID NO: 171 및/또는 SEQ ID NO: 172를 포함하거나; CD33에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, SEQ ID NO: 171 및/또는 SEQ ID NO: 172를 포함하거나; 섬유아세포-활성화 단백질 알파에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, SEQ ID NO: 171 및/또는 SEQ ID NO: 172를 포함하거나; 전립선 줄기 세포 항원(PSCA)에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, SEQ ID NO: 171 및/또는 SEQ ID NO: 172를 포함하거나; c-MET에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, SEQ ID NO: 171 및/또는 SEQ ID NO: 172를 포함하거나; EpCAM에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, SEQ ID NO: 171 및/또는 SEQ ID NO: 172를 포함하거나; PSMA에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, SEQ ID NO: 171 및/또는 SEQ ID NO: 172를 포함한다.
상기 논의된 단백질 및 항원은 암 세포 상에 발현되는 표면 표적 항원이거나 그를 포함하는 것으로 당업계에 널리 특성화되어 있다.
Neu, ErbB-2, CD340(분화 클러스터 340) 또는 p185로도 알려져 있는 HER2(인간 상피 성장 인자 수용체 2)는 인간에서 ERBB2 유전자에 의해 인코딩된 단백질이다. HER2는 1984년에 처음 설명된 185-kDa 수용체이다(문헌[Schlechter et al (1984) Nature 312:513-516]). HER2는 상피 성장 인자 수용체(EGFR/ErbB) 과의 구성원이다. 인간 HER2는 NCBI 참조번호: NP_004439로 표시된다. 이러한 유전자의 증폭 또는 과발현은 특정한 공격적인 유형의 유방암의 발병 및 진행에 중요한 역할을 수행하는 것으로 나타났으며, 최근에는 질병에 대한 중요한 바이오마커 및 치료법의 표적이 되었다. 다른 HER2 양성 종양은 난소암 및 위암을 포함한다.
B-림프구 항원 CD19 또는 CD19(분화 클러스터 19)는 인간에서 CD19 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다(NCBI 참조번호: NP_001171569). CD19는 B-세포의 특징이기 때문에, 상기 단백질은 이러한 유형의 세포, 특히, B-ALL 및 비-호지킨 림프종(NHL)을 포함하는 B-세포 림프종으로부터 야기되는 암을 진단하거나 그를 치료하기 위한 표적으로 사용되었다.
상피 성장 인자 수용체(EGFR; ErbB-1; 인간에서 HER1)는 세포외 단백질 리간드의 상피 성장 인자 과(EGF-과)의 구성원에 대한 세포-표면 수용체이다(NCBI 참조번호: NP_005219). EGFR은 폐암, 두경부암 및 대장암에서의 그의 역할에 대하여 알려져 있다.
암배아 항원(CEA)은 세포 부착에 수반되는 당단백질이다(NCBI 참조번호: AAA66186). 대장 암종, 위 암종, 췌장 암종, 폐 암종 및 유방 암종을 갖는 개체 및 갑상선 수질 암종이 있는 개체 유래의 혈청이 건강한 개체보다 더 높은 수준의 CEA를 갖는 것이 관찰되었다(2.5 ng/㎖ 초과).
EPH 수용체 A2(에프린 A형 수용체 2)는 인간에서 EPHA2 유전자에 의해 인코딩된 단백질이다(NCBI 참조번호: AAH37166). 예를 들어, 문헌[Kinch MS, Carles-Kinch K (2003). Clin. Exp. Metastasis 20 (1): 59-68]으로부터 암에서의 EPHA2의 역할이 알려져 있다. 연구에 의해, EphA2가 피부 흑색종을 포함하는 많은 암 유형에서 과발현되는 것으로 보고되어 있다. EphA2는 리간드-독립적인 방식으로 신경교종 및 전립선 암 세포의 이동을 촉진시키는 것으로 보고되었다(문헌[Udayakumar et al (2011), Oncogene 30: 4921-4929]).
흑색종-관련 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸(MCSP) 또는 뉴런-신경아교 항원 2(NG2)로도 알려져 있는 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 4(NCBI 참조번호: NP_001888)는 인간에서 CSPG4 유전자에 의해 인코딩된 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸이다. CSPG4는 내피 기저막상의 흑색종 세포 확산의 조기 사건 동안 세포-하층 상호작용의 안정화에서 역할을 수행한다. 그것은 인간 악성 흑색종 세포에 의해 발현되는 내재막 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸을 나타낸다.
인슐린-유사 성장 인자 1(IGF-1) 수용체(NCBI 참조번호: P08069)는 인간 세포의 표면 상에 발견되는 단백질이다. 그것은 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF-1)로 칭해지는 호르몬에 의해, 그리고 IGF-2로 칭해지는 관련 호르몬에 의해 활성화되는 막횡단 수용체이다. IGF-1R은 유방, 전립선 및 폐암을 포함하는 몇몇 암에 연루된다.
CD33 또는 Siglec-3은 골수 계통의 세포 상에 발현되는 막횡단 수용체이다. CD33은 급성 골수성 백혈병의 치료를 위한 표적으로 사용될 수 있다. 인간 CD33은 NCBI 서열 참조번호: NP_001763.3으로 표현되며, 예를 들어, 문헌[Raponi et al. (2011) Leuk. Lymphoma 52(6):1098-1107]에 당업계에 기재되어 있다.
세프라제(seprase) 또는 170 kDa 흑색종 막-결합 겔라티나제로도 알려져 있는 섬유아세포 활성화 단백질(NCBI 참조번호: AAB49652), 알파(FAP)는 인간에서 FAP 유전자에 의해 인코딩된 단백질이다. 그것은 상피암의 반응성 기질 섬유아세포, 치유 상처의 육아 조직, 및 골 및 연조직 육종의 악성 세포에서 선택적으로 발현된다.
전립선 줄기 세포 항원(NCBI 참조 번호: AAC39607)은 인간에서 PSCA 유전자에 의해 인코딩된 단백질이다. 이러한 유전자는 대부분의 전립선암에서 상향-조절되며, 방광 및 췌장의 암에서도 검출된다.
c-Met(MET 또는 MNNG HOS 형질전환 유전자)는 간세포 성장 인자 수용체(HGFR)로도 알려져 있는 단백질을 인코딩하는 원암 유전자이다(NCBI 참조번호: NP_000236). 암에서의 비정상적인 MET 활성화는 불량한 예후와 관련이 있으며, 비정상적 활성 MET는 종양 성장, 종양에 영양분을 공급하는 신규 혈관의 형성 및 다른 기관으로의 암 확산을 촉발시킨다. MET는 폐암, 신장암, 간암, 위암, 유방암 및 뇌암을 포함하는 많은 유형의 인간 악성종양에서 비조절된다.
상피 세포 부착 분자(EpCAM)는 인간에서 EPCAM 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. EpCAM은 거의 모든 암종 상에 발현되는 범-상피 분화 항원이다. 인간 EpCAM은 UniProtKB/스위스-프로트(Swiss-Prot) 수탁 번호: P16422.2(공개일: 2012년 2월 22일)로 표시되며, 예를 들어, 문헌[Strnad et al. (1989) Cancer Res. 49(2):314-317]에서 당업계에 기술되어 있다.
전립선-특이적 막 항원(PSMA)(글루타메이트 카복시펩티다제 II로도 알려져 있음)(NCBI 참조번호: AAA60209)은 전립선 조직 및 소수의 기타 조직에서 관찰되는 2형 내재막 당단백질이다. 그것은 전립선 암을 위한 치료 표적이다.
상기로부터 입증된 바와 같이, HER2, CD19, EGFR, CEA, EPHA2, 흑색종-관련 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸, IGFR1, CD33, 섬유아세포-활성화 단백질 알파, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), c-MET, EpCAM 또는 PSMA는 각각 특정 암 유형의 발병 및 치료에 연루된다. 본 발명의 결합 분자가 HER2, CD19, EGFR, CEA, EPHA2, 흑색종-관련 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸, IGFR1, CD33, 섬유아세포-활성화 단백질 알파, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), c-MET, EpCAM 또는 PSMA에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하는 경우에, 각각의 결합 분자가 각각 HER2, CD19, EGFR, CEA, EPHA2, 흑색종-관련 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸, IGFR1, CD33, 섬유아세포-활성화 단백질 알파, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), c-MET, EpCAM 또는 PSMA의 과발현과 관련된 암의 치료에 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 결합 분자는 HER2에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리페티드를 포함할 수 있으며, 여기서, (i) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 N-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 N-말단에 연결되거나(즉, 다시 말하면, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 카피는 상기 항체의 제1 중쇄의 N-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 카피는 상기 항체의 제2 중쇄의 N-말단에 연결됨), (ii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 C-말단에 연결되거나, (iii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 N-말단에 연결되고, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 N-말단에 연결되거나, (iv) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 C-말단에 연결된다.
상기 옵션과 관련하여, 결합 분자가 HER2에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하는 것이 바람직하며, 여기서, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 N-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 N-말단에 연결된다.
HER2로의 특이적인 결합은, 본 발명의 폴리펩티드가 HER2에 특이적으로 결합하나, 기타 관련 단백질, 예를 들어, EGFR에 특이적으로 결합하지 않는 것을 의미한다. "HER2에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드"는 바람직하게는 "HER2의 활성을 억제하는 폴리펩티드"이다. 그러한 폴리펩티드는 HER2의 활성을 감소시키거나 완전히 없애는 능력을 가지며, 상기 활성은 본원에 상기에서 상세히 기재되어 있다. 이와 관련하여, HER2 활성의 억제가 수용체의 리간드로의 수용체의 결합의 억제를 의미하는 것이 바람직하다. 추가로, 폴리펩티드가 HER2의 활성을 선호도 증가 순으로, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 억제하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드에 의한 HER2의 억제에 대한 IC50 값이 선호도 증가 순으로, 1000 nM 이하, 500 nM 이하, 400 nM 이하, 300 nM 이하, 200 nM 이하, 100 nM 이하 또는 75 nM 이하인 것이 바람직하다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 FACS에 의해 결정시, 10-7 내지 10-12 M, 더욱 바람직하게는 10-8 내지 10-12 M, 가장 바람직하게는 10-9 내지 10-12 M의 EC50 값으로 HER2에 결합한다.
HER2에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드는 바람직하게는 HER2의 동일한 에피토프에 결합한다. 본원에 하기 실시예로부터 명백한 바와 같이, 본 발명을 예시하기 위하여 항-HER2 결합 Fynomer® C12(SEQ ID NO: 4)를 사용하였다. 따라서, 결합 분자가 SEQ ID NO: 4의 2개 카피를 포함하는 것이 바람직하다.
따라서, HER2에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열(Fynomer® C12)에 대하여 선호도 증가 순으로, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 것이 바람직하다.
더욱 바람직하게는, HER2에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드는 하기의 화학식 I을 갖되, 단, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 가지며, 동일성의 결정은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 12 내지 17 및 31 및 34에 상응하는 아미노산 위치를 배제한다.
Figure pct00002
상기 식에서,
X1 내지 X7 및 X11 내지 X13 및 X17 내지 X21은 각각 독립적으로 G, V, T, L, F, A, Y, D, S, H, K, E, Q, I, W, R, M, P, N 및 C로부터; 더욱 바람직하게는 G, V, T, L, F, A, Y, D, S, H, K, E, Q, I, W, R, M, P 및 N으로부터 선택되고; X8 내지 X10 및 X14 내지 X16은 각각 독립적으로 G, V, T, L, F, A, Y, D, S, H, K, E, Q, I, W, R, M, P, N 및 C로부터; 더욱 바람직하게는 G, V, T, L, F, A, Y, D, S, H, K, E, Q, I, W, R, M, P 및 N으로부터 선택되거나; X8 내지 X10 및 X14 내지 X16 중 하나 이상은 부재이다(각각 SEQ ID NO: 5 또는 바람직하게는 SEQ ID NO: 168). 또한, 본 발명의 결합 분자가 SEQ ID NO: 5의 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3의 항-CD3 항체를 포함하거나 이로 이루어지는 것이 바람직하며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 N-말단에 연결되고, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 N-말단에 연결된다. 마찬가지로, 본 발명의 결합 분자가 SEQ ID NO: 168의 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3의 항-CD3 항체를 포함하거나 이로 이루어진 것이 바람직하며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 N-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 N-말단에 연결된다.
더더욱 바람직하게는,
X1은 T, E, D, Q, Y, V, W, N, S, F 또는 K로부터 선택되고,
X2는 S, A, R 또는 T로부터 선택되고,
X3은 Y, R, H, T, N, V, W 또는 S로부터 선택되고,
X4는 N, D, M, Y, R, P, E, L, H, T, G 또는 F로부터 선택되고,
X5는 T, S, P, Q, R, K, G, A, D, M, N, L, F, Y 또는 E로부터 선택되고,
X6은 R, M, K, D, F, T, G, H, S, P, N, Q, Y, L, A 또는 P로부터 선택되고,
X7은 D, G, V, L, H, N, R, F, S 또는 A로부터 선택되고,
X8은 G, S, E, D, P, Y로부터 선택되거나, 부재이고,
X9는 Q, D, S, H로부터 선택되거나, 부재이고,
X10은 D, V로부터 선택되거나, 부재이고,
X11은 R, K, Q, N, S, G, W, M, H, L, F, E, T, P, A, D 또는 V로부터 선택되고,
X12는 M, R, E, G, N, D, S, A, Q, F, P, K, Y, T, H, V, L 또는 W로부터 선택되고,
X13은 E, W, P, R, K, S, V, N, D, H, G, T, Q, A, Y, L 또는 M으로부터 선택되고,
X14는 D, R, Q, S, A, N, P, I, H, T, Y, E, L, K, M, V, I, W로부터 선택되거나, 부재이고,
X15는 G, S, I, L, A, V, T, E, D, Q, R, P, K, M, H, Y로부터 선택되거나, 부재이고,
X16은 K, G, R, A, T, V, S, I, E, Q, P, D, N, H로부터 선택되거나, 부재이고,
X17은 V, D, T, I 또는 Y로부터 선택되고,
X18은 E, A, R, T 또는 Q로부터 선택되고,
X19는 T, I 또는 V로부터 선택되고,
X20은 Y, L 또는 F로부터 선택되고,
X21은 N 또는 S로부터 선택된다(SEQ ID NO: 6).
추가로, 본 발명의 결합 분자가 SEQ ID NO: 6의 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3의 항-CD3 항체를 포함하거나 이로 이루어진 것이 바람직하며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 N-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 N-말단에 연결된다.
다른 더욱 바람직한 실시형태에서, 화학식 I에서 잔기 X는 하기로부터 독립적으로 선택된다: X1 내지 X10은 TSYNTRD(즉, X8 내지 X10은 부재임; SEQ ID NO: 7)이고/거나; X11 내지 X16은 RMED(즉, X14 내지 X16은 부재임; SEQ ID NO: 8)이고/거나; X17은 V이고/거나; X18은 E이고/거나; X19는 T이고/거나; X20은 Y이고/거나 X21은 N이다. 이에 따라, 추가로, 본 발명의 결합 분자가 화학식 I의 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3의 항-CD3 항체를 포함하거나 이로 이루어지는 것이 바람직하며, 화학식 I에서 잔기 X는 독립적으로 하기로부터 선택된다: X1 내지 X10은 TSYNTRD(즉, X8 내지 X10은 부재임; SEQ ID NO: 7)이고/거나; X11 내지 X16은 RMED(즉, X14 내지 X16은 부재임; SEQ ID NO: 8)이고/거나; X17은 V이고/거나; X18은 E이고/거나; X19는 T이고/거나; X20은 Y이고/거나 X21은 N이며, 여기서, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 N-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 N-말단에 연결된다. 또한, 상기 언급된 특정 잔기 X11 내지 X21이 병용되는 것이 바람직하다.
바람직하게는, SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열에 대하여 선호도 증가 순으로, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 HER2에 특이적으로 결합하는 상기 정의된 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4로 이루어진 결합 (폴리)펩티드의 결합 능력을 유지하거나 본질적으로 유지하며, 다시 말하면, 각각의 표적 에피토프로의 결합 세기(예를 들어, 해리 상수를 통해 측정시)는 유지되거나 본질적으로 유지된다. HER2에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드의 결합 능력은 그의 결합 능력의 적어도 60%가 유지된다면, 본질적으로 유지된다. 바람직하게는 그의 결합 능력의 적어도 75% 또는 더욱 바람직하게는 적어도 80%가 유지된다. 더욱 바람직하게는 결합 능력의 적어도 90%, 예를 들어, 적어도 95%, 더더욱 바람직하게는 적어도 98%, 예를 들어, 적어도 99%가 유지된다. 가장 바람직하게는 결합 능력은 완전히 즉, 100% 유지된다.
Fyn SH3-유래 폴리펩티드 C12(SEQ ID NO: 4)는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 결정시, HER2 상의 그의 특이적 에피토프에 대하여 7×10-8 M의 해리 상수를 갖는다. 이를 위하여, Fyn SH3-유래 폴리펩티드를 예를 들어, BIAcore 센서 칩 상에 고정화된 His-태그 특이적 항체에 의해 포획한다. 특이적 에피토프를 함유하는 항원의 주사 시에, 복합체의 형성을 모니터링하고, 역학적 회합(kon) 및 역학적 해리 상수(koff) 또는 해리 상수(KD)를 BIAcore 평가 소프트웨어를 사용하여 곡선 핏팅에 의해 수득한다. 따라서, SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열에 대하여 선호도 증가 순으로 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 결합 (폴리)펩티드의 결합 능력은 HER2-결합에 대하여 바람직하게는 동일한 조건하에 적어도 1×10-6 M, 바람직하게는 적어도 1×10-7 M의 해리 상수가 유지된다면, 본질적으로 유지된다. 또한, SEQ ID NO: 4로 이루어진 결합 (폴리)펩티드에 비하여 증가된 결합 능력, 즉, 100% 초과의 활성을 갖는 결합 (폴리)펩티드는 본 발명에 따른 것이다. 예를 들어, 적어도 1×10-8 M, 예를 들어, 적어도 1×10-9 M, 더욱 바람직하게는 적어도 1×10-10 M, 예를 들어, 적어도 1×10-11 M, 더더욱 바람직하게는 적어도 1×10-12 M, 가장 바람직하게는 적어도 1×10-13 M의 해리 상수를 갖는 결합 (폴리)펩티드가 본원에 예상된다. 결합 능력의 평가 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 제한 없이, 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술 또는 ELISA를 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에 있어서, Fyn SH3-유래 폴리펩티드(즉, 항-CD3 항체가 없는 폴리펩티드)는 SEQ ID NO: 4 및 9 내지 159로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는다. Fyn SH3-유래 폴리펩티드는 가장 바람직하게는 C12(SEQ ID NO: 4)이다. 따라서, 본 발명의 결합 단백질이 SEQ ID NO: 4 및 9 내지 159(여기서, SEQ ID NO: 4가 가장 바람직하다)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3의 항-CD3 항체로 이루어지는 것도 바람직하며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드가 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 N-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드가 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 N-말단에 연결된다.
Fyn-SH3-유래 폴리펩티드가 HER2에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드인 상기 실시형태에 있어서, 이에 따라, CD3에 특이적으로 결합하는 항체가 SEQ ID NO: 2 및/또는 3을 포함하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에 따르면, CD3에 특이적으로 결합하는 항체 및 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드는 링커에 의해 연결된다. 본 발명의 이중특이적 결합 분자가 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드 및 CD3에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하거나 이로 이루어지는 경우에, 제1 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드는 CD3에 특이적으로 결합하는 항체에 링커에 의해 연결되고, 제2 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드는 CD3에 특이적으로 결합하는 항체에 링커에 의해 연결된다.
본 발명에 따라 사용되는 "링커"라는 용어는 CD3에 특이적으로 결합하는 항체와 본 발명의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 분리하는 연속 아미노산(즉, 펩티드 링커) 및 비-펩티드 링커에 관한 것이다. 본 발명의 결합 분자가 단일의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 경우, 링커가 펩티드 링커임이 인식될 것이다.
링커의 성질, 즉, 길이 및/또는 조성(예를 들어, 아미노산 서열)은 이중특이적 분자의 안정성 및/또는 용해도를 변형시키거나 증진시킬 수 있고/거나, 그것은 생성된 결합 분자의 유연성을 증진시킬 수 있고/거나 입체 장애를 감소시킴으로써 표적 항원으로의 결합을 향상시킬 수 있다. 링커의 길이 및 조성은 본 발명의 결합 분자의 각각의 결합 (폴리)펩티드의 조성에 좌우된다. 당업자는 상이한 링커의 적합성을 시험하는 방법을 잘 알고 있다. 예를 들어, 결합 분자의 특성은 상이한 유형의 링커를 사용하는 경우, 그의 결합 친화성을 분석함으로써 용이하게 시험될 수 있다. 또한, 단독의 각각의 결합 (폴리)펩티드에 대한 각각의 측정을 수행하고, 결합 분자의 결합 친화성과 비교할 수 있다. 생성된 분자의 안정성은 당업계에 알려져 있는 방법에 의해, 예를 들어, 몇몇 기간 동안 37℃에서 인간 혈청에서의 인큐베이션 후에 분자의 잔류 결합 능력을 결정하기 위한 ELISA 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 "비-펩티드 링커"라는 용어는 2개 이상의 반응성 기를 갖지만, 펩티드 링커를 배제한 연결기를 말한다. 예를 들어, 비-펩티드 링커는, 본 발명의 분자의 결합 부분의 반응성 기, 예를 들어, 아미노 말단, 라이신 잔기, 히스티딘 잔기 또는 시스테인 잔기에 각각 결합하는, 양 말단에 반응성 기를 갖는 폴리머, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다. 비-펩티드 링커의 반응성 기는 하이드록실기, 알데히드기, 프로피온산 알데히드기, 부틸 알데히드기, 말레이미드기, 케톤기, 비닐 설폰기, 티올기, 하이드라지드기, 카보닐디이미다졸(CDI)기, 니트로페닐 카보네이트(NPC)기, 트리실레이트기, 이소시아네이트기 및 석신이미드 유도체를 포함한다. 석신이미드 유도체의 예는 석신이미딜 프로피오네이트(SPA), 석신이미딜 부탄산(SBA), 석신이미딜 카복시메틸레이트(SCM), 석신이미딜 석신아미드(SSA), 석신이미딜 석시네이트(SS), 석신이미딜 카보네이트 및 N-하이드록시 석신이미드(NHS)를 포함한다. 비-펩티드 폴리머의 양 말단에서의 반응성 기는 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 비-펩티드 폴리머는 하나의 말단에 말레이미드기와, 다른 말단에 알데히드기를 가질 수 있다. 바람직하게는, 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜이다.
펩티딕(또는 펩티드) 링커, 더욱 구체적으로는 2 내지 30개 아미노산의 길이를 갖는 올리고펩티드가 바람직하다. 단일의 아미노산의 이용도 또한 신중하게 예상된다. 펩티드 링커의 바람직한 길이 범위는 5 내지 15개 아미노산이다. 다른 바람직한 길이는 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산이다.
적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100%의 작은 아미노산, 예를 들어, 글리신, 세린 및 알라닌으로 이루어진 펩티드인 링커가 특히 바람직하다. 글리신 및 세린만으로 이루어진 링커가 특히 바람직하다. SEQ ID NO: 160 내지 162의 링커가 가장 바람직하며, SEQ ID NO: 162의 서열로 이루어진 펩티드인 링커가 특히 바람직하다.
본 발명의 더욱 바람직한 실시형태에 따르면, 링커는 펩티드-링커이다. 본 발명의 더더욱 바람직한 실시형태에 따르면, 링커는 SEQ ID NO: 162, 160 및 161로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는다. SEQ ID NO: 162의 링커가 가장 바람직하다.
Fyn-SH3-유래 폴리펩티드가 HER2에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드인 상기 실시형태에 있어서, CD3에 특이적으로 결합하는 항체 및 HER2에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 162를 포함하는 링커를 통해 연결되는 것도 특히 바람직하다.
본원에 하기 실시예로부터 명백한 바와 같이, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3을 포함하는 항체는 SEQ ID NO: 162를 갖는 링커를 통해 Fynomer® C12(SEQ ID NO: 4)에 융합된다. 상기 항체의 중쇄의 N-말단(COVA420) 및 C-말단(COVA422)으로의 융합을 생성하였다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시형태에 따르면, 결합 분자는 EGFR에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하며, (i) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 N-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 N-말단에 연결되거나, (ii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 C-말단에 연결되거나, (iii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 N-말단에 연결되고, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 N-말단에 연결되거나, (iv) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 C-말단에 연결된다.
EGFR로의 특이적인 결합은, 본 발명의 폴리펩티드가 EGFR에 특이적으로 결합하나, 기타 관련 단백질, 예를 들어, HER2에 특이적으로 결합하지 않는 것을 의미한다. "EGFR에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드"는 바람직하게는 "EGFR의 활성을 억제하는 폴리펩티드"이다. 그러한 폴리펩티드는 EGFR의 활성을 감소시키거나 완전히 없애는 능력을 가지며, 상기 활성은 본원에 상기에서 상세히 기재되어 있다. 이와 관련하여, EGFR 활성의 억제가 수용체의 리간드로의 수용체의 결합의 억제를 의미하는 것이 바람직하다. 추가로, 폴리펩티드가 EGFR의 활성을 선호도 증가 순으로, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 억제하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드에 의한 EGFR의 억제에 대한 IC50 값이 선호도 증가 순으로, 1000 nM 이하, 500 nM 이하, 400 nM 이하, 300 nM 이하, 200 nM 이하, 100 nM 이하 또는 75 nM 이하인 것이 바람직하다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 FACS에 의해 결정시, 10-7 내지 10-12 M, 더욱 바람직하게는 10-8 내지 10-12 M, 가장 바람직하게는 10-9 내지 10-12 M의 EC50 값으로 EGFR에 결합한다.
EGFR에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드는 바람직하게는 EGFR의 동일한 에피토프에 결합한다. 본원에 하기 실시예로부터 명백한 바와 같이, 본 발명을 예시하기 위하여 항-EGFR 결합 Fynomer® ER7L2D6(SEQ ID NO: 169) 및 ER9L3D7(SEQ ID NO: 187)을 사용하였다. 따라서, 결합 분자가 SEQ ID NO: 169 또는 SEQ ID NO: 187의 2개 카피를 포함하는 것이 바람직하다.
EGFR에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 169(Fynomer® ER7L2D6) 또는 ER9L3D7(SEQ ID NO: 187)의 아미노산 서열에 대하여 선호도 증가 순으로, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 또한, EGFR에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드는 (a)
Figure pct00003
(여기서, 아미노산 위치 X1 내지 X8은 임의의 아미노산 서열일 수 있으며, 아미노 위치 X4 내지 X8 중 하나는 선택적으로 부재임) 및 (b) (a)의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열로서, 동일성 결정은 아미노산 위치 X3 내지 X7을 배제하되, 단, 화학식 (II)의 아미노산 위치 12 내지 20에서, 아미노산 서열 EARGLX2RX3F(SEQ ID NO: 209)(X2는 바람직하게는 N 또는 H이며, X3은 바람직하게는 M 또는 L임(SEQ ID NO: 204))가 보존되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것이 바람직하다.
더욱 바람직하게는, EGFR에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드는 하기의 화학식 II를 갖되, 단, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 가지며, 동일성의 결정은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 12 내지 17 및 31 내지 34에 상응하는 아미노산 위치를 배제한다. 이와 관련하여, 하기 화학식 II에서, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 12 내지 17은 SEQ ID NO: 1의 RT 루프로의 3개 아미노산의 부가 때문에, 아미노산 위치 12 내지 20에 해당하는 것을 주목한다.
Figure pct00004
상기 식에서,
X1 내지 X7은 각각 독립적으로, G, V, T, L, F, A, Y, D, S, H, K, E, Q, I, W, R, M, P, N 및 C로부터; 더욱 바람직하게는 G, V, T, L, F, A, Y, D, S, H, K, E, Q, I, W, R, M, P 및 N으로부터 선택되고; X8은 각각 독립적으로, G, V, T, L, F, A, Y, D, S, H, K, E, Q, I, W, R, M, P, N 및 C로부터; 더욱 바람직하게는 G, V, T, L, F, A, Y, D, S, H, K, E, Q, I, W, R, M, P 및 N으로부터 선택되거나; X8은 부재이다(각각 SEQ ID NO: 201 또는 바람직하게는 SEQ ID NO: 202). 또한, 본 발명의 결합 분자는 SEQ ID NO: 201의 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO: 171 및 SEQ ID NO: 172의 항-CD3 항체를 포함하거나 이로 이루어지는 것이 바람직하며, (i) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 N-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 N-말단에 연결되거나, (ii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 C-말단에 연결되거나, (iii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 N-말단에 연결되고, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 N-말단에 연결되거나, (iv) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 C-말단에 연결된다. 마찬가지로, 본 발명의 결합 분자가 SEQ ID NO: 202의 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO: 171 및 SEQ ID NO: 172의 항-CD3 항체를 포함하거나 이로 이루어지는 것이 바람직하며, (i) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 N-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 N-말단에 연결되거나, (ii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 C-말단에 연결되거나, (iii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 N-말단에 연결되고, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 N-말단에 연결되거나, (iv) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 C-말단에 연결된다.
더더욱 바람직하게는,
X1은 L 또는 V로부터 선택되고,
X2는 N 또는 H로부터 선택되고,
X3은 M 또는 L로부터 선택되고,
X4는 S, N, Q, A, D, T 또는 L로부터 선택되고,
X5는 F, T, R 또는 P로부터 선택되고,
X6은 S, E, T 또는 Q로부터 선택되고,
X7은 E, T, S 또는 N으로부터 선택되고,
X8은 S이거나, 부재이다(SEQ ID NO: 203).
따라서, 추가로, 본 발명의 결합 분자가 SEQ ID NO: 203의 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO: 171 및 SEQ ID NO: 172의 항-CD3 항체를 포함하거나 이로 이루어지는 것이 바람직하며, (i) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 N-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 N-말단에 연결되거나, (ii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 C-말단에 연결되거나, (iii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 N-말단에 연결되고, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 N-말단에 연결되거나, (iv) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 C-말단에 연결된다.
바람직하게는, SEQ ID NO: 169 또는 SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열에 대하여, 선호도 증가 순으로, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 EGFR에 특이적으로 결합하는 상기 정의된 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 169 또는 SEQ ID NO: 187로 이루어진 결합 (폴리)펩티드의 결합 능력을 유지하거나 본질적으로 유지하며, 다시 말하면, 각각의 표적 에피토프에 대한 결합의 세기(예를 들어, EC50 값을 통해 결정시)는 유지되거나 본질적으로 유지된다. EGFR에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드의 결합 능력은 그의 결합 능력의 적어도 60%가 유지된다면, 본질적으로 유지된다. 바람직하게는 그의 결합 능력의 적어도 75% 또는 더욱 바람직하게는 적어도 80%가 유지된다. 더욱 바람직하게는 결합 능력의 적어도 90%, 예를 들어, 적어도 95%, 더더욱 바람직하게는 적어도 98%, 예를 들어, 적어도 99%가 유지된다. 가장 바람직하게는 결합 능력은 완전히 즉, 100% 유지된다.
Fyn SH3-유래 폴리펩티드 ER7L2D6(SEQ ID NO: 169)은 FACS 실험에서 EGFR 상의 그의 특이적 에피토프에 대한 결합에 대하여 3.3 nM의 EC50 값을 가지며, ER9L3D7(SEQ ID NO: 187)은 15.0 nM의 EC50 값을 갖는다. 이들 EC50 값의 결정을 위하여, 0.46 nM 내지 333 nM의 농도에서 정제된 Fynomer를 EGFR 양성 MDA-MB-468 세포와 인큐베이션시켰다. 결합된 Fynomer를 마우스 항-myc 태그 항체 9E10(3:2의 Fynomer : 9E10의 몰비로 Fynomer와 동시-인큐베이션시킴)의 수단에 이어서, 항-마우스 IgG Alex488 컨쥬게이트에 이어서, 세포계수기에서의 분석에 의해 검출하였다. 평균 형광 세기 값을 결정하고, Fynomer 농도의 log10 값에 대하여 플롯팅하여, 곡선 핏팅 소프트웨어 그래프패드(GraphPad) 프리즘을 사용하여 EC50 값을 결정하였다. 따라서, SEQ ID NO: 169 또는 187의 아미노산 서열에 대하여 선호도 증가 순으로 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 결합 (폴리)펩티드의 결합 능력은 EGFR-결합에 대하여 바람직하게는 동일한 조건하에 적어도 1×10-6 M, 바람직하게는 적어도 1×10-7 M의 해리 상수가 유지된다면, 본질적으로 유지된다. 또한, SEQ ID NO: 169 또는 SEQ ID NO: 187로 이루어진 결합 (폴리)펩티드에 비하여 증가된 결합 능력, 즉, 100% 초과의 활성을 갖는 결합 (폴리)펩티드는 본 발명에 따른 것이다. 예를 들어, 적어도 1×10-8 M, 예를 들어, 적어도 1×10-9 M, 더욱 바람직하게는 적어도 1×10-10 M, 예를 들어, 적어도 1×10-11 M, 더더욱 바람직하게는 적어도 1×10-12 M, 가장 바람직하게는 적어도 1×10-13 M의 해리 상수를 갖는 결합 (폴리)펩티드가 본원에 예상된다. 결합 능력의 평가 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 제한 없이, 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술 또는 ELISA를 포함한다.
또한, 본 발명의 결합 분자가 SEQ ID NO: 169 또는 SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열에 대하여 선호도 증가 순으로, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 EGFR에 특이적으로 결합하는 상기 정의된 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드 중 2개, 및 SEQ ID NO: 171 및 SEQ ID NO: 172의 항-CD3 항체를 포함하거나 이로 이루어지는 것이 바람직하며, (i) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 N-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 N-말단에 연결되거나, (ii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 C-말단에 연결되거나, (iii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 N-말단에 연결되고, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 N-말단에 연결되거나, (iv) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 C-말단에 연결된다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에 있어서, Fyn SH3-유래 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 169 및 187 내지 197로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는다. Fyn SH3-유래 폴리펩티드는 가장 바람직하게는 ER7L2D6(SEQ ID NO: 169)이다. 이에 따라, 또한, 본 발명의 결합 분자가 SEQ ID NO: 169 및 187 내지 197(여기서, SEQ ID NO: 169가 가장 바람직함)로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO: 171 및 SEQ ID NO: 172의 항-CD3 항체를 포함하는 것이 바람직하며, (i) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 N-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 N-말단에 연결되거나, (ii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 C-말단에 연결되거나, (iii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 N-말단에 연결되고, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 N-말단에 연결되거나, (iv) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 C-말단에 연결된다.
Fyn-SH3-유래 폴리펩티드가 EGFR에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드인 상기 실시형태에 있어서, 이에 따라, CD3에 특이적으로 결합하는 항체가 SEQ ID NO: 171 및/또는 172를 포함하는 것이 특히 바람직하다.
언급된 바와 같이, 본 발명의 다른 바람직한 실시형태에 따르면, CD3에 특이적으로 결합하는 항체 및 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드는 링커에 의해 연결된다. 본 발명의 더욱 바람직한 실시형태에 따르면, 링커는 펩티드-링커이다. 본 발명의 더더욱 바람직한 실시형태에 따르면, 링커는 SEQ ID NO: 162, 160 및 161로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는다.
Fyn-SH3-유래 폴리펩티드가 EGFR에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드인 상기 실시형태에 있어서, CD3에 특이적으로 결합하는 항체 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드는 또한, SEQ ID NO: 162를 포함하는 링커를 통해 연결되는 것이 특히 바람직하다.
본원에서 하기 실시예에 입증된 바와 같이, SEQ ID NO: 171 및 SEQ ID NO: 172를 포함하는 항-CD3 항체는 SEQ ID NO: 162를 갖는 링커를 통해 Fynomer® ER7L2D6(SEQ ID NO: 169)에 융합된다. 상기 항체의 경쇄의 N-말단으로의 융합을 생성하였다(즉, SEQ ID NO: 171 및 198로 이루어진 COVA494).
본 발명은 처음으로 EGFR에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 제공하기 때문에, 본 발명은 일 실시형태에서, EGFR에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드에 관한 것이기도 하며, 상기 폴리펩티드는 (a)
Figure pct00005
(여기서, 아미노산 위치 X1 내지 X8은 임의의 아미노산 서열일 수 있으며, 아미노 위치 X4 내지 X8 중 하나는 선택적으로 부재임) 및 (b) (a)의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열로서, 동일성 결정은 아미노산 위치 X3 내지 X7을 배제하되, 단, 화학식 (II)의 아미노산 위치 12 내지 20에서, 아미노산 서열 EARGLX2RX3F(SEQ ID NO: 209)(X2는 바람직하게는 N 또는 H이며, X3은 바람직하게는 M 또는 L임(SEQ ID NO: 204))가 보존되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본원에 사용되는 "동일성 결정은 아미노산 위치 X4 내지 X7을 배제한다"라는 어구는 화학식 (II)와 관련하여 서열 동일성의 계산에 아미노산 위치 X4 내지 X7을 고려하지 않고, SEQ ID NO: 1의 나머지의 아미노산 위치에 제한됨을 명시한다. 본원에 사용되는 "단, 화학식 (II)의 아미노산 위치 12 내지 20에서, 아미노산 서열 EARGLX2RX3F(SEQ ID NO: 209)(X2는 바람직하게는 N 또는 H이며, X3은 바람직하게는 M 또는 L임(SEQ ID NO: 204))가 보존된다"라는 조건은 아미노산 변화가 아미노산 위치 12 내지 20으로 도입될 수 없음을 명시한다. 다시 말하면, 본 발명의 상기 실시형태 및 하기의 그의 바람직한 실시형태의 범주에 속하는 모든 폴리펩티드에서, 화학식 (II)의 아미노산 위치 12 내지 20에 상응하는 아미노산 위치는 서열 EARGLX2RX3F(SEQ ID NO: 209)를 가지며, X2는 바람직하게는 N 또는 H이고, X3은 바람직하게는 M 또는 L이다(SEQ ID NO: 204).
EGFR에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드의 바람직한 실시형태에 있어서,
X1은 L 또는 V로부터 선택되고,
X2는 N 또는 H로부터 선택되고,
X3은 M 또는 L로부터 선택되고,
X4는 S, N, Q, A, D, T 또는 L로부터 선택되고,
X5는 F, T, R 또는 P로부터 선택되고,
X6은 S, E, T 또는 Q로부터 선택되고,
X7은 E, T, S 또는 N으로부터 선택되고,
X8은 S로부터 선택되거나 부재이다(SEQ ID NO: 203).
EGFR에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드의 더욱 바람직한 실시형태에 있어서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 169 및 187 내지 197 중 어느 하나로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본원에서 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, SEQ ID NO: 169 및 187 내지 197은 EGFR에 특이적으로 결합하는 것으로 관찰되었다.
추가로, 본 발명은 일 실시형태에서, 추가의 화합물에 융합된 본 발명의 EGFR에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하는 융합 작제물에 관한 것이며, 상기 추가의 화합물은 바람직하게는 항-CD3 항체가 아니다. 추가의 화합물은 바람직하게는 약제학적 활성 화합물, 전구약물, 약제학적으로 허용가능한 담체, 진단적 활성 화합물, 세포 투과 증진제 및/또는 혈청 반감기를 조절하는 화합물이다. 더욱 상세하게, 추가의 화합물은 바람직하게는 (a) 형광 염료, (b) 광감작제, (c) 방사성 핵종, (d) 의료 영상화를 위한 조영제, (e) 사이토카인, (f) 독성 화합물, (g) 케모카인, (h) 향응고 인자(pro-coagulant factor), (i) 전구약물 활성화를 위한 효소, (k) 알부민 결합제, (l) 알부민, (m) IgG 결합제 또는 (n) 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 추가의 화합물은 항체 경쇄, 항체 중쇄, 항체의 Fc 도메인, 항체 또는 그들의 조합으로 이루어지거나 이들을 포함한다. 이러한 목록에서, 항체가 가장 바람직하다. 항체는 바람직하게는 본 발명의 EGFR에 특이적으로 결합하는 2개 카피의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드에 융합된다.
추가로, 본 발명은 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 EGFR에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자, 및 적용가능한 경우, 융합 작제물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 일 실시형태에서, 본 발명의 EGFR에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드 및/또는 본 발명의 EGFR에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자 및/또는 추가의 화합물에 융합된 본 발명의 EGFR에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하는 융합 작제물을 포함하는 약제학적 또는 진단적 조성물에 관한 것이다. 약제학적 조성물은 바람직하게는 암의 치료 또는 예방 방법에 사용된다.
본 발명은 (i) CD3 및 (ii) 암 세포 상의 표면 표적 항원에 특이적으로 결합하는 결합 분자의 추가의 바람직한 실시형태에서, CD33에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하는 결합 분자에 관한 것이며, (i) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 N-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 N-말단에 연결되거나, (ii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 C-말단에 연결되거나, (iii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 N-말단에 연결되고, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 N-말단에 연결되거나, (iv) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 C-말단에 연결된다.
상기 옵션과 관련하여, 결합 분자가 CD33에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하는 것이 바람직하며, 여기서, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 C-말단에 연결된다.
CD33으로의 특이적인 결합은, 본 발명의 폴리펩티드가 CD33에 특이적으로 결합하나, 기타 관련 단백질, 예를 들어, Siglec 과의 다른 구성원에는 특이적으로 결합하지 않는 것을 의미한다. "CD33에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드"는 바람직하게는 "CD33의 활성을 억제하는 폴리펩티드"이다. 그러한 폴리펩티드는 CD33의 활성을 감소시키거나 완전히 없애는 능력을 가지며, 상기 활성은 본원에서 상기에 상세히 기재되어 있다. 이와 관련하여, CD33 활성의 억제가 수용체의 리간드로의 수용체의 결합의 억제를 의미하는 것이 바람직하다. 추가로, 폴리펩티드가 CD33의 활성을 선호도 증가 순으로, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 억제하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드에 의한 CD33 억제에 대한 IC50 값이 선호도 증가 순으로, 1000 nM 이하, 500 nM 이하, 400 nM 이하, 300 nM 이하, 200 nM 이하, 100 nM 이하 또는 75 nM 이하인 것이 바람직하다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 FACS에 의해 결정시, 10-7 내지 10-12 M, 더욱 바람직하게는 10-8 내지 10-12 M, 가장 바람직하게는 10-9 내지 10-12 M의 EC50 값으로 CD33에 결합한다.
CD33에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드는 바람직하게는 CD33의 동일한 에피토프에 결합한다. 본원에 하기 실시예로부터 명백한 바와 같이, 본 발명을 예시하기 위하여 항-CD33 결합 Fynomer® EE1L1B3(SEQ ID NO: 174)을 사용하였다. 따라서, 결합 분자가 2개 카피의 SEQ ID NO: 174를 포함하는 것이 바람직하다.
CD33에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 174(Fynomer® EE1L1B3)의 아미노산 서열에 대하여 선호도 증가 순으로, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 것이 바람직하다. 또한, CD33에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드가 (a)
Figure pct00006
(여기서, 아미노산 위치 X1 내지 X6은 임의의 아미노산 서열일 수 있으며, 아미노산 위치 X1 내지 X6 중 1개 또는 2개는 선택적으로 부재임) 및 (b) (a)의 아미노산 서열에 대하여 적어도 85% 동일한, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열로서, 동일성 결정은 아미노산 위치 X1 내지 X4를 배제하되, 단, 화학식 (III)의 아미노산 위치 12 내지 18에서 아미노산 서열 EALGAHE(SEQ ID NO: 208)가 보존되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것이 바람직하다.
더욱 바람직하게는, CD33에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드는 하기의 화학식 III을 갖되, 단, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 가지며, 동일성의 결정은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 12 내지 17 및 31 내지 34에 상응하는 아미노산 위치를 배제한다:
Figure pct00007
상기 식에서,
X1 내지 X4는 각각 독립적으로 G, V, T, L, F, A, Y, D, S, H, K, E, Q, I, W, R, M, P, N 및 C로부터; 더욱 바람직하게는 G, V, T, L, F, A, Y, D, S, H, K, E, Q, I, W, R, M, P 및 N으로부터 선택되고; X5 및 X6은 각각 독립적으로 G, V, T, L, F, A, Y, D, S, H, K, E, Q, I, W, R, M, P, N 및 C로부터; 더욱 바람직하게는 G, V, T, L, F, A, Y, D, S, H, K, E, Q, I, W, R, M, P 및 N으로부터 선택되거나; X5 및 X6은 부재이다(각각 SEQ ID NO: 205 또는 바람직하게는 SEQ ID NO: 206). 또한, 본 발명의 결합 분자가 SEQ ID NO: 205의 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3의 항-CD3 항체를 포함하거나 이로 이루어지는 것이 바람직하며, (i) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 N-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 N-말단에 연결되거나, (ii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 C-말단에 연결되거나, (iii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 N-말단에 연결되고, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 N-말단에 연결되거나, (iv) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 C-말단에 연결된다. 마찬가지로, 본 발명의 결합 분자는 SEQ ID NO: 206의 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3의 항-CD3 항체를 포함하거나 이로 이루어지는 것이 바람직하며, (i) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 N-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 N-말단에 연결되거나, (ii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 C-말단에 연결되거나, (iii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 N-말단에 연결되고, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 N-말단에 연결되거나, (iv) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 C-말단에 연결된다.
더더욱 바람직하게는,
X1은 N, R, S, L, M, D 또는 Y로부터 선택되고,
X2는 S, G, P, R, M 또는 V로부터 선택되고,
X3은 L, T, G, S, V, R 또는 A로부터 선택되고,
X4는 S, A, L, Q, D, V, K 또는 E로부터 선택되고,
X5는 E, V, Q, L, A, R로부터 선택되거나 부재이고,
X6은 L, G로부터 선택되거나 부재이다(SEQ ID NO: 207).
추가로, 본 발명의 결합 분자가 SEQ ID NO: 207의 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3의 항-CD3 항체를 포함하거나 이로 이루어지는 것이 바람직하며, (i) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 N-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 N-말단에 연결되거나, (ii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 C-말단에 연결되거나, (iii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 N-말단에 연결되고, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 N-말단에 연결되거나, (iv) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 C-말단에 연결된다.
바람직하게는, SEQ ID NO: 174의 아미노산 서열에 대하여, 선호도 증가 순으로, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CD33에 특이적으로 결합하는 상기 정의된 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 174로 이루어진 결합 (폴리)펩티드의 결합 능력을 유지하거나 본질적으로 유지하며, 다시 말하면, 각각의 표적 에피토프에 대한 결합의 세기(예를 들어, EC50 값을 통해 결정시)는 유지되거나 본질적으로 유지된다. CD33에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드의 결합 능력은 그의 결합 능력의 적어도 60%가 유지된다면, 본질적으로 유지된다. 바람직하게는 그의 결합 능력의 적어도 75% 또는 더욱 바람직하게는 적어도 80%가 유지된다. 더욱 바람직하게는 결합 능력의 적어도 90%, 예를 들어, 적어도 95%, 더더욱 바람직하게는 적어도 98%, 예를 들어, 적어도 99%가 유지된다. 가장 바람직하게는 결합 능력은 완전히 즉, 100% 유지된다.
Fyn SH3-유래 폴리펩티드 EE1L1B3(SEQ ID NO: 174)은 FACS 실험에서 CD33 상의 그의 특이적 에피토프에 대한 결합에 대하여 5.7 nM의 EC50 값을 갖는다. EC50 값의 결정을 위하여, 300 nM 내지 0.41 nM의 농도의 정제된 Fynomer를 Fc 수용체 블로킹 작용제로 사전처리된 CD33 양성 U937 세포와 인큐베이션시켰다. 결합된 Fynomer를 마우스 항-myc 태그 항체 9E10(4:1의 Fynomer : 9E10의 몰비로 Fynomer와 동시-인큐베이션시킴)의 수단에 이어서, 항-마우스 IgG Alex488 컨쥬게이트에 이어서, 세포계수기에서의 분석에 의해 검출하였다. 평균 형광 세기 값을 결정하고, Fynomer 농도의 log10 값에 대하여 플롯팅하여, 곡선 핏팅 소프트웨어 그래프패드 프리즘을 사용하여 EC50 값을 결정하였다. 따라서, SEQ ID NO: 174의 아미노산 서열에 대하여 선호도 증가 순으로 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 결합 (폴리)펩티드의 결합 능력은 바람직하게는 동일한 조건하에 CD33-결합에 대하여 적어도 1×10-6 M, 바람직하게는 적어도 1×10-7 M의 해리 상수가 유지된다면, 본질적으로 유지된다. 또한, SEQ ID NO: 174로 이루어진 결합 (폴리)펩티드에 비하여 증가된 결합 능력, 즉, 100% 초과의 활성을 갖는 결합 (폴리)펩티드는 본 발명에 따른 것이다. 예를 들어, 적어도 1×10-8 M, 예를 들어, 적어도 1×10-9 M, 더욱 바람직하게는 적어도 1×10-10 M, 예를 들어, 적어도 1×10-11 M, 더더욱 바람직하게는 적어도 1×10-12 M, 가장 바람직하게는 적어도 1×10-13 M의 해리 상수를 갖는 결합 (폴리)펩티드가 본원에 예상된다. 결합 능력의 평가 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 제한 없이, 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술 또는 ELISA를 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에 있어서, Fyn SH3-유래 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 174 및 177 내지 186으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는다. Fyn-SH3-유래 폴리펩티드는 가장 바람직하게는 EE1L1B3이다(SEQ ID NO: 174). 따라서, 본 발명의 결합 분자가 SEQ ID NO: 174 및 177 내지 186(SEQ ID NO: 174가 가장 바람직함)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3의 항-CD3 항체를 포함하는 것도 또한 바람직하며, (i) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 N-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 N-말단에 연결되거나, (ii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 C-말단에 연결되거나, (iii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 N-말단에 연결되고, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 N-말단에 연결되거나, (iv) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드는 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 C-말단에 연결된다.
Fyn-SH3-유래 폴리펩티드가 CD33에 선택적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드인 상기 실시형태에 있어서, 이에 따라, CD3에 특이적으로 결합하는 항체가 SEQ ID NO: 2 및/또는 3을 포함하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에 따르면, CD3에 특이적으로 결합하는 항체 및 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드는 링커에 의해 연결된다. 언급된 바와 같이, 본 발명의 더욱 바람직한 실시형태에 따르면, 링커는 펩티드-링커이다. 본 발명의 더더욱 바람직한 실시형태에 따르면, 링커는 SEQ ID NO: 162, 160 및 161로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는다.
Fyn-SH3-유래 폴리펩티드가 CD33에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드인 상기 실시형태에 있어서, CD3에 특이적으로 결합하는 항체 및 CD33에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드는 또한, SEQ ID NO: 162를 포함하는 링커를 통해 연결되는 것이 특히 바람직하다.
본원에서 하기 실시예로부터 명백한 바와 같이, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3을 포함하는 항체는 SEQ ID NO: 162를 갖는 링커를 통해 EE1L1B3(SEQ ID NO: 174)에 융합된다. 상기 항체의 경쇄의 C-말단으로의 융합을 생성하였다(즉, SEQ ID NO: 2 및 175로 이루어진 COVA467).
본 발명은 처음으로 CD33에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 제공하기 때문에, 본 발명은 추가로, 일 실시형태에서, CD33에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드에 관한 것이며, 상기 폴리펩티드는 (a)
Figure pct00008
(여기서, 아미노산 위치 X1 내지 X6은 임의의 아미노산 서열일 수 있으며, 아미노산 위치 X1 내지 X6 중 1개 또는 2개는 선택적으로 부재임) 및 (b) (a)의 아미노산 서열에 대하여 적어도 85% 동일한, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열로서, 동일성 결정은 아미노산 위치 X1 내지 X4를 배제하되, 단, 화학식 (III)의 아미노산 위치 12 내지 18에서 아미노산 서열 EALGAHE(SEQ ID NO: 208)가 보존되는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본원에 사용되는 "동일성 결정은 아미노산 위치 X1 내지 X4를 배제한다"라는 어구는 화학식 (III)과 관련하여 서열 동일성의 계산에 아미노산 위치 X1 내지 X4를 고려하지 않고, SEQ ID NO: 1의 나머지의 아미노산 위치에 제한됨을 명시한다. 본원에 사용되는 "단, 화학식 (III)의 아미노산 위치 12 내지 18에서, 아미노산 서열 EALGAHE(SEQ ID NO: 208)가 보존된다"라는 조건은 아미노산 변화가 아미노산 위치 12 내지 18로 도입될 수 없음을 명시한다. 다시 말하면, 본 발명의 상기 실시형태 및 하기의 그의 바람직한 실시형태의 범주에 속하는 모든 폴리펩티드에서, 화학식 (III)의 아미노산 위치 12 내지 18에 상응하는 아미노산 위치는 서열 EALGAHE(SEQ ID NO: 208)를 갖는다.
CD33에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드의 바람직한 실시형태에 있어서,
X1은 N, R, S, L, M, D 또는 Y로부터 선택되고,
X2는 S, G, P, R, M 또는 V로부터 선택되고,
X3은 L, T, G, S, V, R 또는 A로부터 선택되고,
X4는 S, A, L, Q, D, V, K 또는 E로부터 선택되고,
X5는 E, V, Q, L, A, R로부터 선택되거나, 부재이고,
X6은 L, G로부터 선택되거나 부재이다(SEQ ID NO: 207).
CD33에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드의 더욱 바람직한 실시형태에 있어서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 174 및 177 내지 186 중 어느 하나로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본원에서 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, SEQ ID NO: 174 및 177 내지 186은 CD33에 특이적으로 결합하는 것으로 관찰되었다.
추가로, 본 발명은 일 실시형태에서, 추가의 화합물에 융합된 본 발명의 CD33에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하는 융합 작제물에 관한 것이며, 상기 추가의 화합물은 바람직하게는 항-CD3 항체가 아니다. 추가의 화합물은 바람직하게는 약제학적 활성 화합물, 전구약물, 약제학적으로 허용가능한 담체, 진단적 활성 화합물, 세포 투과 증진제 및/또는 혈청 반감기를 조절하는 화합물이다. 더욱 상세하게, 추가의 화합물은 바람직하게는 (a) 형광 염료, (b) 광감작제, (c) 방사성 핵종, (d) 의료 영상화를 위한 조영제, (e) 사이토카인, (f) 독성 화합물, (g) 케모카인, (h) 향응고 인자, (i) 전구약물 활성화를 위한 효소, (k) 알부민 결합제, (l) 알부민, (m) IgG 결합제 또는 (n) 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 추가의 화합물은 항체 경쇄, 항체 중쇄, 항체의 Fc 도메인, 항체 또는 그들의 조합으로 이루어지거나 이들을 포함한다. 이러한 목록에서, 항체가 가장 바람직하다. 항체는 바람직하게는 본 발명의 CD33에 특이적으로 결합하는 2개 카피의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드에 융합된다.
추가로, 본 발명은 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 CD33에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자, 및 적용가능한 경우, 융합 작제물에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 일 실시형태에서, 본 발명의 CD33에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드 및/또는 본 발명의 CD33에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자 및/또는 추가의 화합물에 융합된 본 발명의 CD33에 특이적으로 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하는 융합 작제물을 포함하는 약제학적 또는 진단적 조성물에 관한 것이다. 약제학적 조성물은 바람직하게는 암의 치료 또는 예방 방법에 사용된다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명의 이중특이적 결합 분자는 SEQ ID NO: 163 및/또는 164를 포함하거나, SEQ ID NO: 163 및 164를 포함하거나 이로 이루어진다.
본원에 하기 실시예로부터 명백한 바와 같이, 본 발명을 예시하기 위하여 SEQ ID NO: 163 및 164로 이루어진 이중특이적 결합 분자(COVA420)를 생성하였다. 본원에 하기 실시예에 기재된 화합물 COVA420은 SEQ ID NO: 2 및 3의 항체로 이루어지며, SEQ ID NO: 4의 HER2에 특이적으로 결합하는 하나의 카피의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 162를 갖는 링커를 통해 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 및 제2 N-말단에 연결된다. 실시예에 제공된 HER2를 표적으로 하는 화합물 중에, COVA420은 가장 높은 발현 수율, 가장 낮은 EC50 값 및 최적의 종양 세포 선택성과, 이에 따른 최적의 종양 세포 사멸 특성을 보였다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 이중특이적 결합 분자는 SEQ ID NO: 171 및/또는 198을 포함한다.
본원에 하기 실시예로부터 명백한 바와 같이, SEQ ID NO: 171 및 SEQ ID NO: 172를 포함하는 항 CD-3 항체는 SEQ ID NO: 162를 갖는 링커를 통해 Fynomer® ER7L2D6(SEQ ID NO: 169)에 융합된다. 더욱 상세하게, 상기 항체의 경쇄의 N-말단으로 융합이 이루어져, 이에 의해, 화합물 COVA494(SEQ ID NO: 171 및 198)가 생성된다. 실시예에 제공된 EGFR을 표적으로 하는 화합물 중에, COVA494는 유리한 생물물리학적 특성을 가졌으며, 최적의 종양 선택성과 이에 따른 최적의 종양 세포 사멸 특성을 보였다.
본 발명의 더욱 바람직한 실시형태에 따르면, 이중특이적 결합 분자는 SEQ ID NO: 2 및/또는 175를 포함한다.
본원에 하기 실시예로부터 명백한 바와 같이, SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3을 포함하는 항체는 SEQ ID NO: 162를 갖는 링커를 통해 EE1L1B3(SEQ ID NO: 174)에 융합된다. 더욱 상세하게, 상기 항체의 경쇄의 C-말단으로 융합이 이루어져, 이에 의해, 화합물 COVA467(SEQ ID NO: 2 및 175)이 생성된다. 상기 화합물은 유리한 생물물리학적 특성 및 종양 세포 사멸 특성을 보였다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 결합 분자를 인코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명의 결합 분자가 하나(또는 그 이상)의 카피의 2개의 별개의 분자의 복합체일 수 있기 때문에, 본 발명의 결합 분자의 구성성분은 1개 또는 2개(또는 2개 초과)의 핵산 분자에 의해 인코딩될 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 하나의 핵산 분자는 완전한 단쇄 분자를 인코딩한다.
추가의 실시형태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 핵산은 DNA, RNA, PNA 및 그들의 임의의 다른 유사체일 수 있다. 벡터 및 단리된 세포, 특히 숙주 세포는 예를 들어 유전자 치료법을 위한, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 융합 단백질, 치료적으로 유용한 벡터 및 단리된 세포의 생성의 목적에 적합한 임의의 통상의 유형일 수 있다. 당업자는 수많은 선행 기술로부터 그러한 핵산, 벡터 및 단리된 세포를 선택할 수 있을 것이며 원하는 목적에 특히 적합한지를 통상적인 방법에 의해 과도한 실험 없이 확인할 수 있을 것이다.
전형적으로, 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결되며, 바람직하게는 T5 프로모터/lac 오퍼레이터 요소, T7 프로모터/lac 오퍼레이터 요소를 포함하는 원핵생물 프로모터의 군 또는 hEF1-HTLV, CMV enh/hFerL 프로모터를 포함하는 진핵생물 프로모터의 군으로부터 선택되는 프로모터에 연결된다.
또한, 본 발명의 벡터가 본 발명의 핵산을 포함하며, 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 생성할 수 있는 것임이 이해된다. 그러한 벡터는 바람직하게는 pQE 벡터, pET 벡터, pFUSE 벡터, pUC 벡터, YAC 벡터, 파지미드 벡터, 파지 벡터, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스와 같이 유전자 치료법에 사용되는 벡터로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
또한, 본 발명은 일 실시형태에서 본 발명의 벡터를 지니는 숙주 세포 또는 비-인간 숙주에 관한 것이다.
상기 숙주 또는 숙주 세포는 본 발명의 벡터를 숙주 또는 숙주 세포로 도입함으로써 생성될 수 있으며, 이에 따라, 그의 존재는 벡터에 의해 인코딩된 결합 분자의 발현을 매개한다.
본 발명에 따르면, 숙주는 본 발명의 벡터로 트랜스펙션되고/거나 그를 발현하는 트랜스제닉 비-인간 동물일 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 트랜스제닉 동물은 비-인간 포유류, 예를 들어, 햄스터, 소, 고양이, 돼지, 개 또는 말이다.
숙주 세포, 예를 들어, 세포 배양물의 일부일 수 있는 단리된 세포가 바람직하다.
적합한 원핵 숙주 세포는 예를 들어, 에스케리키아(Escherichia), 바실러스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium) 속의 박테리아를 포함한다. 적합한 진핵 숙주 세포는 예를 들어, 진균 세포, 특히, 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 곤충 세포, 예를 들어, 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포돕테라(Spodoptera) Sf9 세포 및 식물 세포, 및 포유류 세포이다. 상기 기재된 숙주 세포에 적절한 배양 배지 및 조건은 당업계에 알려져 있다.
포유류 숙주 세포는 제한 없이, 인간 Hela, HEK293, H9 및 Jurkat 세포, 마우스 NIH3T3 및 C127 세포, COS 1, COS 7 및 CV1, 메추라기 QC1-3 세포, 마우스 L 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 및 바우스(Bowes) 흑색종 세포를 포함한다. 본 발명의 결합 분자는 염색체 내로 통합된 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 유전자 작제물을 함유하는 적합한 세포주에서 발현될 수 있다.
다른 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 세포는 일차 세포 또는 일차 세포주이다. 일차 세포는 유기체로부터 직접 수득된 세포이다. 적합한 일차 세포는 예를 들어, 마우스 배아 섬유아세포, 마우스 일차 간세포, 심근세포 및 신경 세포, 및 마우스 근육 줄기 세포(위성(satellite) 세포) 및 그들로부터 유래된 안정한 불멸화 세포주이다.
본 발명의 추가의 실시형태는 청구범위 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 결합 분자를 포함하는 약제학적 조성물, 본 발명의 핵산 분자, 본 발명의 벡터 및/또는 본 발명의 숙주 세포 또는 비-인간 숙주에 관한 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 임의의 통상적인 방식으로 제조될 수 있다. 하기 나타낸 질병을 앓고 있는 대상체의 치료의 시행에서, 본 발명의 적어도 하나의 화합물은 경구 또는 비경구 경로를 포함하는, 유효량의 활성제를 생체이용가능하게 만드는 임의의 형태 또는 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 피하, 근육내, 정맥내, 복강내, 흡입 등에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게는 주마다 또는 격주로 또는 1개월 1회의 피하 주사가 바람직하다.
제형의 제조 분야의 당업자는 선택된 산물의 특정 특징, 치료할 질병 또는 질환, 질병 또는 질환의 단계 및 기타 관련 환경에 따라, 적절한 투여 형태 및 방식을 용이하게 선택할 수 있다(예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd ed., Pharmaceutical Press, (2012) (1990)] 참조).
적합한 담체 또는 부형제는 활성 성분을 위한 비히클 또는 매질로 소용될 수 있는 액체 물질일 수 있다. 적합한 담체 또는 부형제는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 안정화제, 산화방지제, pH-조절 물질, 방출 조절 부형제 등을 포함한다. 본 발명에 따른 조성물은 동결건조 형태로 제공될 수 있다. 즉시 투여를 위하여, 그것은 적합한 수성 담체, 예를 들어, 주사용 멸균수 또는 멸균 완충 생리학적 염수에 용해된다. 볼루스 주사로서 보다 주입에 의한 투여를 위해 더 큰 부피를 생성하는 것이 바람직하다면, 최종 제형화 시에 인간 혈청 알부민 또는 환자 자신의 헤파린처리된 혈액을 용매로 혼입시키는 것이 바람직하다. 대안적으로, 제형은 피하 투여될 수 있다. 과잉의 생리학적 비활성 단백질, 예를 들어, 인간 혈청 알부민의 존재는 주입 용액에 사용된 용기 및 튜빙(tubing)의 벽으로의 흡수에 의한 약제학적으로 유효한 폴리펩티드의 소실을 방지한다. 알부민이 사용된다면, 적합한 농도는 염수 용액의 0.5 내지 4.5 중량%이다.
질병 또는 의학적 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 본 발명의 화합물, 즉, 융합 단백질, 이중특이적 작제물, 핵산, 벡터 및 단리된 세포의 투여량 및 방식은 물론, 본 발명의 특정 화합물, 개별 환자 군 또는 환자, 추가의 의학적 활성 화합물의 존재 및 치료 중인 질환의 성질 및 중증도에 따라 달라질 것이다.
그러나, 예방 및/또는 치료적 이용을 위하여, 체중 ㎏당 약 0.0001 ㎎ 내지 약 20 ㎎, 바람직하게는 체중 ㎏당 약 0.001 ㎎ 내지 약 5 ㎎의 용량이 투여되어야 하는 것이 본 발명에서 바람직하다.
바람직하게는, 예방 및/또는 치료적 이용을 위한 투여의 빈도는 주마다 약 2회 내지 3개월마다 약 1회, 바람직하게는 대략 주마다 내지 10주마다 약 1회, 더욱 바람직하게는 1주 1회 내지 1개월 1회의 범위에 있다.
바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 암의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 것이다.
본원에 상기 더욱 상세히 설명된 바와 같이, CD3은 다양한 암 유형의 치료를 위한 재지향된 T-세포 사멸을 위한 고유 표적이다. 추가로, 청구된 이중특이적 결합 분자의 특이성 및 유효성은 암 세포 상의 표면 표적 항원, 특히, EGFR, HER2 또는 CD33을 표적으로 함으로써 달성된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 더욱 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 암은 유방암, 혈액 악성종양, 예를 들어, NHL, B-ALL, CML, 기타 암, 예를 들어, 전립선암, 흑색종, 폐암, 위암, 난소암, NHL, B-ALL, AML, 두경부암, 대장암, 췌장암, 갑상선암, 신경교종, 방광암, 신장암, 간암 또는 악성 복수로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 목록에서, 유방암이 가장 바람직하다.
암 세포 상의 표면 표적 항원의 수많은 비제한적인 예는 본원에서 상기 예시되어 있다. 본원에 상기 명세서로부터 명백한 바와 같이, 암 세포 상의 이들 표면 표적 항원은 본 발명의 상기 실시형태에 열거된 암 유형에 연루된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 더욱 바람직한 실시형태에서, 상기 암은 본 발명의 결합 분자에 의해 특이적으로 결합되고/거나 본 발명의 핵산 분자 인코딩된 결합 분자에 의해 특이적으로 결합되고/거나 본 발명의 벡터에 의해 발현되는 결합 분자에 의해 특이적으로 결합되고/거나 본 발명의 숙주 세포 또는 비-인간 숙주에 의해 발현되는 결합 분자에 의해 특이적으로 결합되는 표면 표적 항원을 비-종양 세포에서 발현되는 양보다 적어도 2배 더 많은 양으로 발현한다.
바람직하게는, 항원은 비-종양 세포에 비하여, 적어도 5배 더 많은 양, 예를 들어, 적어도 10배 더 많은 양, 더더욱 바람직하게는 적어도 100배 더 많은 양, 예를 들어, 적어도 1000배 더 많은 양, 가장 바람직하게는 적어도 10,000배 더 많은 양으로 암 세포 상에 발현된다.
또한, 본 발명은 (a) 상기 정의된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 (b) 생성된 이중특이적 결합 분자를 단리하는 단계를 포함하는 이중특이적 결합 분자의 생성 방법을 제공한다.
바람직한 단리된 세포는 CHO 세포를 포함하는 숙주 세포이다. 배양 조건은 사용된 특정 숙주 세포에 따라 선택될 수 있으며, 이는 추가의 노력 없이, 당업자에 의해 행해질 수 있다.
요망되는 생성물, 즉, 본 발명의 이중특이적 결합 분자의 단리는 정제 방법에 의해 야기될 수 있으며, 상기 단리된 세포를 파괴하는 것이 선행될 수 있다. 적합한 방법이 당업계에 잘 알려져 있으며, 당업자의 재량에 있다.
본 명세서, 특히 청구범위에서 특성화된 실시형태 및 바람직한 특징과 관련하여, 종속항에 언급된 각각의 실시형태 또는 바람직한 특징은 상기 종속항이 인용하는 각 청구범위(독립항 또는 종속항)의 각각의 실시형태와 조합되는 것으로 의도된다. 예를 들어, 3개의 대안, A, B 및 C를 열거한 독립항 제1항, 3개의 대안 D, E 및 F를 열거한 종속항 제2항, 및 3개의 대안 G, H 및 I를 열거하는 제1항 및 제2항을 인용하는 제3항의 경우에, 특별히 다르게 언급되지 않는 한, 명세서가 조합 A, D, G; A, D, H; A, D, I; A, E, G; A, E, H; A, E, I; A, F, G; A, F, H; A, F, I; B, D, G; B, D, H; B, D, I; B, E, G; B, E, H; B, E, I; B, F, G; B, F, H; B, F, I; C, D, G; C, D, H; C, D, I; C, E, G; C, E, H; C, E, I; C, F, G; C, F, H; C, F, I에 상응하는 실시형태를 분명하게 개시하는 것으로 이해해야 한다. 유사하게, 그리고 독립항 및/또는 종속항이 대안을 열거하지 않는 경우에, 종속항이 다시 복수의 선행 청구항을 인용하면, 그에 의해 포괄되는 대상의 임의의 조합이 명시적으로 개시되는 것으로 고려됨이 이해된다. 예를 들어, 독립항 제1항, 제1항을 다시 인용하는 종속항 제2항 및 제2항 및 제1항 둘 모두를 다시 인용하는 종속항 제3항의 경우에, 그에 따라, 제3항, 제2항 및 제1항의 대상의 조합과 같이, 제3항 및 제1항의 대상의 조합이 명백하게 그리고 분명하게 개시된다. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항을 인용한 추가의 종속항 제4항이 제시되는 경우에, 그에 따라, 제4항 및 제1항의, 제4항, 제2항 및 제1항의, 제4항, 제3항 및 제1항의, 및 제4항, 제3항, 제2항 및 제1항의 대상의 조합이 명백하게 그리고 분명하게 개시된다. 또한, 종속항이 다시 보다 상위의 청구항(독립항 및/또는 종속항)을 직접 인용하지 않는 경우에, 청구범위에 의해 포괄되는 임의의 가능한 대상의 조합이 본 출원에 의해 명시적으로 개시되는 것으로 고려됨이 이해된다. 예를 들어, 독립항 제1항 및 차례로 독립항 제1항을 다시 인용하는 종속항 제2항을 다시 인용하는 종속항 제3항의 경우에, 제3항 및 제1항의 대상의 조합이 명백하게 그리고 분명하게 개시된다. 상기 고려 사항은 본 명세서에 특성화된 모든 첨부된 청구범위, 실시형태 및 바람직한 특징에 필요한 부분만 약간 수정하여 적용된다.
마지막으로, 본 발명은 상기 본원에 언급된 화합물 또는 약제학적 조성물 중 하나 이상을 투여함에 의한 본원에 상기 언급된 질병 중 임의의 것을 앓고 있는 환자의 치료에 관한 것이다.
도면에는 다음이 나타나 있다:
도 1은 본 발명의 Fynomer®-항체 융합 단백질 및 대조군 단백질의 SDS-PAGE 특성화를 보여준다. A: 비-환원 조건하에 전개된 겔; B: 환원 조건하에 전개된 겔. 레인(lane) M: 분자량 표준; 레인 1: 항-CD3 항체(SEQ ID NO: 2 및 3); 레인 2: COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164); 레인 3: COVA446(SEQ ID NO: 167).
도 2는 본 발명의 Fynomer®-항체 융합 단백질의 SDS-PAGE 특성화를 보여준다. A: 비-환원 조건하에 전개된 겔; B: 환원 조건하에 전개된 겔. 레인 M: 분자량 표준; 레인 1: COVA422(SEQ ID NO: 165 및 166).
도 3은 Fynomer®-항체 융합 단백질의 크기 배제(SEC) 프로파일을 보여준다. A: FPLC 시스템에서의 COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164)의 SEC 프로파일; B: HPLC 시스템에서의 COVA422(SEQ ID NO: 165 및 166)의 SEC 프로파일.
도 4는 HER2 양성 세포(패널 A), CD3 양성 세포(패널 B) 및 HER2 또는 CD3을 발현하지 않는 세포(패널 C)에서의 Fynomer®-항체 융합 단백질 COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164); COVA422(SEQ ID NO: 165 및 166), 및 이중특이적 scFv-대조군 COVA446(SEQ ID NO: 167)의 유세포계수 결합 분석을 보여준다. 신호는 이차 검출 항체만으로 수득된 백그라운드 신호(회색 음영 히스토그램)와 비교한다.
도 5는 HER2 양성 SKBR-3 종양 세포에서의 COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164) 및 단쇄 Fv 형식의 이중특이적 항-CD3 × 항-HER2 대조군(COVA446, SEQ ID NO: 167)의 재지향된 세포 사멸 활성을 보여준다. 또한, HER2 음성 MDA-MB-468 세포에서의 COVA420의 임의의 사멸 활성의 부재가 나타나 있으며, 이는 HER2 양성 세포에 대한 특이적인 사멸 활성을 나타낸다. PBMC를 이펙터 세포로서 사용하였다.
도 6은 이펙터 세포로서 CD8+ 풍부 T-세포를 사용한, HER2 양성 SKOV-3 종양 세포에 대한 COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164) 및 COVA422(SEQ ID NO: 165 및 166)의 재지향된 세포 사멸 활성을 보여준다.
도 7은 CD8+ 풍부 T-세포의 존재 또는 부재하에, 표기된 항체 Fynomer® 융합 단백질의 인큐베이션시의 세포 배양 상청액으로의 그랜자임(Granzyme) B의 방출을 도시한 것이다.
도 8은 마우스에서의 정맥내 주사 후의 COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164)의 혈청 농도를 보여준다.
도 9는 활성화 및 증량된 인간 T-세포로 재구성된 생체내 SKOV-3 이종이식 모델에서의 COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164)의 항-종양 활성을 보여준다. 종양 체적은 RTV(치료법 시작일에 대한 상대적인 종양 체적)로 제시되어 있다. 0.5 ㎎/㎏ COVA420 및 비히클 처리를 주 2회 시행하였으며(6, 9, 13, 15일), 등몰 용량의 COVA446(SEQ ID NO: 167)(0.16 ㎎/㎏)을 매일 정맥내(i.v.) 볼루스 주사에 의해 투여하였다. 흑색 화살표는 투여 간격을 보여준다.
도 10은 높은 수준의 HER2를 발현하는 SKOV-3 종양 세포 및 낮은 수준의 HER2를 발현하는 MCF-7 종양 세포에 대한 COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164) 및 단쇄 Fv 형식의 이중특이적 항-CD3 × 항-HER2 대조군(COVA446, SEQ ID NO: 167)의 재지향된 세포 사멸 활성을 보여준다. CD8+ 풍부 T-세포를 이펙터 세포로 사용하였다. 잔류 표적 세포 생존력의 백분율이 나타나 있다.
도 11은 Fynomer-항체 융합 단백질의 크기 배제(SEC) 프로파일을 보여준다. 도 11a: COVA493(SEQ ID NO: 170 및 172)의 SEC 프로파일; 도 11b: COVA494(SEQ ID NO: 171 및 198)의 SEC 프로파일; 도 11c: COVA497(SEQ ID NO: 199 및 172)의 SEC 프로파일; 도 11d: COVA499(SEQ ID NO: 171 및 200)의 SEC 프로파일; 도 11e: COVA489(SEQ ID NO: 171 및 172)의 SEC 프로파일.
도 12는 EGFR 양성 세포(MDA-MB-468, 상부 패널) 및 CD3 양성 세포(Jurkat E6-1, 하부 패널)에 대한 항-CD3 항체(COVA489, SEQ ID NO: 171 및 172), Fynomer®-항체 융합 단백질 COVA493(SEQ ID NO: 170 및 172), COVA494(SEQ ID NO: 171 및 198), COVA497(SEQ ID NO: 199 및 172), COVA499(SEQ ID NO: 171 및 200) 및 단쇄 Fv 형식의 이중특이적 항-CD3 × 항-EGFR 대조군(COVA445, SEQ ID NO: 173)의 유세포계수 결합 분석을 보여준다. 신호는 이차 검출 항체만으로 수득된 백그라운드 신호(회색 음영 히스토그램)와 비교한다.
도 13은 높은 수준의 EGFR을 발현하는 MDA-MB-468 종양 세포 및 낮은 수준의 EGFR을 발현하는 HT-29 종양 세포에 대한, COVA493(SEQ ID NO: 170 및 172), COVA494(SEQ ID NO: 171 및 198), COVA497(SEQ ID NO: 199 및 172), COVA499(SEQ ID NO: 171 및 200) 및 단쇄 Fv 형식의 이중특이적 항-CD3 × 항-EGFR 대조군(COVA445, SEQ ID NO: 173)의 재지향된 세포 사멸 활성을 보여준다. 또한, 5 nM의 가장 높은 농도에서 항-CD3 항체(COVA489, SEQ ID NO: 171 및 172)의 임의의 사멸 활성의 부재가 나타났다. CD8+ 풍부 T-세포를 이펙터 세포로 사용하였다. 잔류 표적 세포 생존력의 백분율이 나타나 있다.
도 14는 이펙터 T-세포의 존재 또는 부재하에 각각 높은 수준 및 낮은 수준의 EGFR을 발현하는 MDA-MB-468 및 HT-29 종양 세포에 대한, COVA493(SEQ ID NO: 170 및 172), COVA494(SEQ ID NO: 171 및 198), COVA497(SEQ ID NO: 199 및 172), COVA499(SEQ ID NO: 171 및 200) 및 단쇄 Fv 형식의 이중특이적 항-CD3 × 항-EGFR 대조군(COVA445, SEQ ID NO: 173)의 재지향된 세포 사멸 활성을 보여준다. (n.d).: 측정되지 않음.
도 15 도 15a는 Fynomer-항체 융합 단백질 COVA467(SEQ ID NO: 2 및 175)의 크기 배제(SEC) 프로파일을 보여주며, 도 15b는 CD33 양성 U937 종양 세포에 대한 COVA467(SEQ ID NO: 2 및 175) 및 단쇄 Fv 형식의 이중특이적 항-CD3 × 항-CD33 대조군(COVA463, SEQ ID NO: 176)의 재지향된 세포 사멸 활성을 보여준다. 또한, 비변형된 항-CD3 항체(COVA419, SEQ ID NO: 2 및 3)의 임의의 사멸 활성의 부재가 나타나 있다. CD8+ 풍부 T-세포를 이펙터 세포로서 사용하였다. 표적 세포 용해의 백분율이 나타나 있다.
실시예는 본 발명을 예시한다.
실시예
실시예 1 - HER2 양성 종양 세포에 대한 재지향된 T -세포 매개의 세포독성 분석
실시예 1.1. - 항-CD3 항체 항- HER2 Fynomer ® 융합 단백질의 발현 및 정제
HER2 결합 Fynomer® C12(Seq ID NO: 4)를 15개 아미노산 링커(SEQ ID NO: 162)를 통해 항 CD3 결합 항체(SEQ ID NO: 2 및 3)에 유전학적으로 융합시켜, 본 발명의 이중특이적 항체 Fynomer® 융합 단백질을 제공하였다. COVA420에서, Fynomer® C12를 항 CD3 항체(SEQ ID NO: 2 및 3)의 중쇄의 N-말단에 융합시켰다. COVA422에서, Fynomer® C12를 항 CD3 항체(SEQ ID NO: 2 및 3)의 중쇄의 C-말단에 융합시켰다.
항-CD3 항체(SEQ ID NO: 2 및 3), COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164), COVA422(SEQ ID NO: 165 및 166) 및 항-CD3 × 항-HER2 scFv 대조군(SEQ ID NO: 167)(헥사-his 태그 지님)을 FreeStyle CHO-S 세포로 일시적으로 트랜스펙션시키고, 혈청 미함유/동물 성분-미함유 배지에서 6일 동안 발현시켰다. 항-CD3 항체 및 본 발명의 이중특이적 단백질을 AKTA 퓨리파이어(Purifier) 기기(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))를 사용한 단백질 A 친화성 크로마토그래피(지이-헬쓰케어 카탈로그 번호 89928)에 의해 상청액으로부터 정제하였다. HIStrap Excel 컬럼(지이 헬쓰케어)을 통한 고정화 금속 이온 친화성 크로마토그래피에 의해 항-CD3 × 항-HER2 scFv 대조군(COVA446, SEQ ID NO: 167)의 정제를 달성하였다. 농도를 280 nm에서 흡광도 측정에 의해 결정하였다. 수율은 표 1에 열거되어 있다.
결과
본 발명의 항체 Fynomer® 융합 단백질 및 대조군 항체를 단일 단계에서 발현 및 정제할 수 있다. 95% 초과의 순도가 도 1 및 2에 나타낸 바와 같이 SDS-PAGE 분석에 의해 입증될 수 있다. 표 1은 CHO 세포로의 일시적인 트랜스펙션 및 37℃에서 6일 동안의 단백질 발현 후의 발현 수율을 요약한 것이다.
[표 1]
Figure pct00009

정제 후에, AKTA FPLC 시스템 및 슈퍼덱스(Superdex) G200, 30/100 GL 컬럼(지이 헬쓰케어) 또는 아질런트(Agilent) HPLC 12/60 시스템 및 바이오(Bio) SEC5, 5 ㎛; 300 Å; 4.6×300 ㎜ 컬럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 본 발명의 이중특이적 단백질은 단일의 단량체 피크로서 용리되었으며, 이는 본 발명의 항체 Fynomer® 융합 단백질이 매우 유리한 생물물리학적 특성을 갖는 것을 보여준다(도 3).
실시예 1.2 - 본 발명의 항- HER2 Fynomer ® 항-CD3 항체 융합 단백질을 사용한 FACS 실험
단백질 COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164), COVA422(SEQ ID NO: 165 및 166) 및 COVA446(SEQ ID NO: 167)을 PBS/1% BSA/0.2% 아지드화나트륨 중 (i) 1 × 105개 Jurkat E6-1 세포(CD3 양성 세포), (ii) 1 × 105개 BT474 HER2 양성 유방암 세포, (iii) 1 × 105개 HER2 또는 CD3 음성 MDA MB 468 세포 중 어느 하나를 함유하는 총 100 ㎕의 부피 중에, 100 nM의 농도로 인큐베이션시켰다. 음성 대조군으로서, 동일한 세포를 단백질 대신에 오직 PBS/1% BSA/0.2% 아지드화나트륨(PBS 대조군)과 함께 인큐베이션시켰다.
얼음 상에서의 60분 인큐베이션 후에, 세포를 150 ㎕ PBS-1% BSA 완충제로 2회 세척하고, 5 ㎍/㎖의 염소 항 인간-알렉사(Alexa) 488 컨쥬게이트(인비트로겐(Invitrogen))를 암 중에 40분 동안 첨가함으로써 결합된 항체를 검출하였다. 헥사 his 태그를 지니는 이중특이적 scFv 대조군 COVA446(SEQ ID NO: 167)에 있어서, 5 ㎍/㎖의 마우스 항 HIS 태그 항체(피셔 사이언티픽(Fisher Scientific))를 첨가하고, 4℃에서 40분 동안 인큐베이션시킨 후에 추가의 세척 단계 후에 4℃에서 40분 동안 5 ㎍/㎖의 염소 항 마우스 알렉사 488 컨쥬게이트(인비트로겐)와 다시 인큐베이션시킴으로써, 결합을 검출하였다.
마지막으로, 세포를 3회 세척하고, 100 ㎕ PBS-1% BSA 중에 재현탁화시킨 다음, 염색된 세포를 구아바(Guava) easyCyte™ 유세포측정기(밀리포어(Millipore))에서 분석하였다.
결과
Fynomer®-항체 융합 단백질의 결합 특성을 유세포측정을 통해 평가하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164), COVA422(SEQ ID NO: 165 및 166) 및 이중특이적 scFv 대조군(COVA446, SEQ ID NO: 167)은 HER2 발현 BT474 세포(패널 A) 및 CD3 발현 Jurkat E6 세포(패널 B)에 특이적으로 결합된다. 비-특이적 결합은 CD3 또는 HER2 중 어느 하나를 발현하지 않는 세포주에서 관찰되지 않았다(패널 C).
실시예 1.3 - HER2를 발현하는 세포에 대한 재지향된 T -세포 매개의 세포독성 분석
폴리펩티드 COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164), 및 이중특이적 scFv 대조군(SEQ ID NO: 167)을 문헌[Jager et al (2009) Cancer Research, 69 (10):4270-6]으로부터 조정된 프로토콜을 사용하여 재지향된 T-세포 매개의 세포독성 분석법에서 시험하였다.
약술하면, 인간 PBMC를 이펙터 세포로 사용하였다. 실험 전날, PBMC를 표준 절차를 사용하여 피콜 플라크 플러스(Ficoll Plaque plus)(지이 헬쓰케어) 및 밀도 기울기 원심분리에 의해 블루트슈펜테 취리히(Blutspende Zurich)로부터 수득된 신선한 버피 코트(buffy coat) 제제로부터 분리하였다. 그 다음, 단리된 PBMC를 10% FCS, RPMI 및 37℃, 5% CO2에서 4×106개 세포/㎖의 세포 농도로 하룻밤 인큐베이션시켰다. 그 다음, 단리된 PBMC는 재지향된 세포독성 분석법에서 이펙터 세포로 소용될 수 있다.
또한, 실험 전날 밤에, 적절한 양의 표적 세포를 아큐타제(Accutase) 처리에 의해 탈리시키고, 표적 세포를 10% FCS가 보충된 100 ㎕ 완전 세포 배양 배지 중에 웰당 3000 내지 5000개 세포 범위의 세포 밀도로 96 웰 플레이트에 씨딩하였다. 분석법 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이션시켰다. 사용된 표적 종양 세포는 SKBR-3(ATCC 카탈로그 번호 HTB-30™) 및 MDA-MB-468(ATCC 카탈로그 번호: HTB-132™)이었다.
세포 사멸 실험 전에, 적절한 양의 PBMC를 원심분리하고, 10% FCS, RPMI 중에 재현탁화시켰다. 사용되는 표적 세포의 개수에 따라, 세포 농도를 1.5 내지 2.5×106개 세포/㎖ 범위로 조정하고, 세포를 추가로 사용할 때까지 실온에서 보관하였다.
재지향된 T-세포 매개의 세포독성을 이펙터 세포로서 농축된 CD8+ T-세포 및 표적 종양 세포로서 SKOV-3(ATCC 카탈로그 번호 HTB-77™)을 사용하여 추가로 모니터링하였다. 이들 분석법을 위하여, 단리된 PBMC를 추가로 정제하여, 농축된 CD8+ T-세포를 수득하였다. 제조처의 권고에 따라 Dynbead® Untouched™ 인간 CD8 T-세포 키트(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies) 카탈로그 번호: 11348D)를 사용하여 CD8+ T 세포를 단리하였다. 그 다음, 정제 후에, 세포를 ㎖당 6×105개 내지 1×107개 범위의 농도로 10% FCS, RPMI 중에 재현탁화시켰다.
실험 일에, 이펙터 분자를 10% FCS, RPMI 중에 150 nM의 최대 농도로 희석하고, 1/10 희석의 일련의 희석물을 제조하였다.
마지막으로, 소모된 배지를 분석법 플레이트로부터 제거하고, 웰마다 50 ㎕의 신선한 배지로 대체하였다. 그 다음, 적절한 양의 이펙터 분자 및 이펙터 세포를 첨가하였다. 최종 이펙터 세포 대 표적 세포 비는 PBMC 분석법에 대하여 25/1이었으며, CD8+ T-세포가 이펙터 세포로 사용된 분석법에 대하여 10/1이었다. 이펙터 분자의 최종 최대 농도는 50 nM이었다. 최종 분석법 부피는 웰마다 150 ㎕였다.
분석법 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 24시간 내지 72시간 인큐베이션시켰다. 그 다음, 세포 배양 상청액을 제거하고, 이후의 분석법(그랜자임 방출 분석법, 하기 실시예 1.4 참조)을 위하여 -80℃에서 보관하였다. 현상 용액의 첨가 전에, 각 웰을 PBS로 2회 세척하였다. 세포 생존력을 제조처의 권고에 따라 XTT-시약(시그마(Sigma) 카탈로그 번호: X4626)을 사용하여 평가하였다. 표적 세포를 1% 트리톤(Triton)-X100(시그마)으로 처리함으로써 100% 용해 대조군을 포함시키고, 표적 세포를 오직 이펙터 세포만으로 처리함으로써 자발적인 용해에 대한 값을 수득하였다("자발적 용해"). XTT 기질의 첨가 후 2.5 내지 4시간에 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 모든 측정을 3벌로 행하였다.
세포 생존력 백분율을 하기의 식을 사용하여 계산하였다:
생존력% = (값-100% 용해)/(자발적 용해-100% 용해)*100.
그 다음, 세포 생존력%를 이펙터 분자 농도에 대하여 플롯팅하고, S자형 용량-반응을 핏팅시킴으로써 데이터를 프리즘(Prism) 5(그래프패드 소프트웨어)를 사용하여 평가하였다.
결과
HER2 발현 SKBR-3 세포에 대한 COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164)의 용량 의존적 세포독성이 관찰될 수 있음이 입증될 수 있었다(도 5). 이러한 대표적인 분석법에서, COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164)은 87 pM의 EC50 값을 가졌다. 중요한 것은, 도 5에 나타난 바와 같이, 세포독성이 HER2 음성 MDA-MB-468에서 관찰되지 않았기 때문에, 세포독성 효과가 항원 의존적이라는 점이다.
동일한 분석법 조건하에서, 60 pM의 EC50 값이 이중특이적 항-HER2 × 항-CD3 scFv-scFv 대조군 분자(SEQ ID NO: 167)에 대하여 수득되었다. 2가 및 전장 IgG 기반의 Fynomer-항체 융합 단백질이 재지향된 사멸 분석법에서 현재 사용되는 scFv-scFv 단백질과 동일한 범위인 효능을 보이나, 준최적의 생물물리학적 특성 및 짧은 생체내 반감기의 단점으로 불리해지지 않음이 놀랍게도 관찰되었다.
표 2는 시험된 단백질에 대하여 수득된 EC50 값을 요약한 것이다:
[표 2]
Figure pct00010

본 발명의 Fynomer-항체 융합 단백질이 T-세포의 결합을 통해(ADCC 매개의 활성을 통하지 않고) 사멸 활성을 가하는 것을 입증하기 위하여, ADCC를 통해 세포 사멸을 매개할 수 없는 CD8+ 풍부 T-세포를 사용한 재지향된 세포 사멸 실험을 수행하였다.
도 6은 세포 사멸이 이펙터 세포로서 CD8+ 풍부 T-세포를 사용하여 확인될 수 있음을 보여준다. 본원에서, COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164)은 8 pM의 EC50 값을 보였으며, COVA422(SEQ ID NO: 165 및 166)의 EC50 값은 175 pM이었다. 이들 결과에 의해, COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164) 및 COVA22(SEQ ID NO: 165 및 166)의 강력한(하위-nM) 사멸 활성이 확인된다.
실시예 1.4 - 표적 세포의 존재 및 부재하의 그랜자임 B 방출의 분석
항원 양성 표적 세포 및 CD8+ 풍부 T-세포의 존재 및 부재하에서의 COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164) 및 대조군으로서 항-CD3 항체(SEQ ID NO: 2 및 3)의 인큐베이션시에 세포 배양 배지로의 그랜자임 B의 방출을 평가하였다. 그랜자임 B의 방출은 문헌[Haas A. et.al. Immunobiology, 2009, 214 (6): 441-53]에 기술된 바와 같이, BiTE® 유사 작용제에 의해 유도되는 T-세포 매개의 세포독성 활성의 주요 지표이다.
Fynomer®-항체 융합 단백질의 세포독성 활성을 평가하기 위하여, 시료를 상기 기술된 바와 같이 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 기간의 마지막에, 세포 배양 상청액을 수집하고, 그랜자임 B의 농도를 제조처의 권고에 따라 그랜자임 B ELISA 키트(알앤디 시스템즈(R&D Systems))를 사용함으로써 평가하였다.
결과:
도 7은 CD8+ T-세포의 존재 및 표기된 농도의 항원 양성 표적 세포의 존재 및 부재하에 COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164)의 3일의 인큐베이션 후의 그랜자임 B의 발현 수준을 도시한 것이다. T-세포가 표적 세포의 부재하에 오직 50 nM COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164)과 인큐베이션된다면, 그랜자임 B의 비특이적인 방출이 검출될 수 없었다. 표적 세포 COVA420(SEQ ID No: 163 및 164) 및 T-세포가 존재하는 경우, 그랜자임 B 발현의 두드러진 증가가 관찰되었다. COVA420(SEQ ID No: 163 및 164)이 세포독성 효과가 검출가능하지 않은 농도로 사용되는 경우, 실질적인 그랜자임 B 발현은 검출될 수 없으며, 이는 세포독성 활성과 그랜자임 B 방출(0.5 pM)간의 상관관계를 나타낸다. 대조군 항-CD3 항체(SEQ ID NO: 2 및 3)(50 nM)는 예상된 바와 같이, 종양 표적 및 이펙터 세포의 존재하에 그랜자임 B 방출을 촉발시키지 않았다.
실시예 1.5 - 약동학적 분석
C57BL/6 마우스(찰스 리버(Charles River))에서 COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164)의 약동학적 프로파일을 조사하였다. 5마리의 C57BL/6 마우스에 200 ㎍ COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164)을 정맥내 주사하였다. 10분, 6시간, 24시간, 48시간, 96시간, 120시간, 144시간 및 168시간 후에, 혈액을 EDTA 코팅된 마이크로큐벳(Sarstedt)에 수집하고, 9300 g에서 10분 동안 원심분리하고, COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164)의 혈청 수준을 ELISA에 의해 결정하였다. 블랙 맥시소르프(black maxisorp) 마이크로타이터 플레이트(넌크(Nunc))를 50 nM HER2 ECD(벤더 메드시스템즈(Bender MedSystems))로 코팅하였다. PBS 중 2% BSA(시그마)로 블로킹한 후에, 40 ㎕의 PBS 및 10 ㎕의 적절하게 희석된 혈청을 적용하였다. 1시간 동안의 인큐베이션 후에, 웰을 PBS로 세척하고, 결합된 COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164)을 항-hIgG-HRP(잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch))로 검출하였다. 분석법을 QuantaRed 형광원 기질(피어스(Pierce))을 사용하여 현상하고, 형광 세기를 544 nm(여기) 및 590 nm(방출)에서 5분 후에 측정하였다. COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164)의 혈청 수준을 COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164)(333 내지 0.5 ng/㎖로 희석)의 표준 곡선을 사용하여 측정하였다. 상이한 시점에 혈청에서 결정된 농도 및 제거 단계(반-대수 스케일로 플롯팅)의 생성된 기울기 k로부터, 반감기를 식 t1/2 = ln2/-k를 사용하여 계산하였다.
결과:
도 8은 마우스에서의 정맥내 볼루스 주사 후의 COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164)의 혈청 농도를 보여준다. 제거 단계(베타 단계, 시점 24시간 내지 168시간)로부터 결정시, COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164)에 대한 반감기 값은 140시간이었다. 이러한 관찰은 반감기가 마우스에서 다른 인간 항체(예를 들어, 아달리무맙: 102 내지 193시간, Humira® 약물 승인 패키지(약물 승인 패키지, Humira®, FDA 신청 번호: 125057s0110, 약리학 검토, 01/18/2008))에 대하여 수득된 반감기와 유사하였기 때문에, COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164)이 IgG-유사 생체내 PK 특성을 갖는 것을 입증한다.
실시예 1.6 - 인간 T-세포로 재구성된 HER2 -과발현 SKOV -3 종양을 지니는 마우스에서의 COVA420의 생체내 효능.
COVA420의 항-종양 활성을 HER2-발현 인간 SKOV-3 종양 이종이식편을 지니는 조사된 NOD.CB17 Prkdc 마우스에서 조사하였다.
방법:
3 × 106개 SKOV-3(ATCC 카탈로그 번호 HTB-77™) 세포를 2 Gy-조사된 NOD.CB17 Prkdc 마우스(찰스 리버)에 피하(s.c.) 주사하였다. 종양이 약 50 ㎣의 평균 크기에 도달하는 경우, 동물을 인간 T-세포 주사 1일 전에, 항-아시알로 GM1 토끼 항체(WAKO, 독일)의 단일의 정맥내(i.v.) 볼루스 주사로 처리하였다. 단일의 건강한 공여자의 버피 코트로부터 단리된 시험관내 활성화 및 증량된(22일) 인간 T-세포(밀테니이 바이오테크(Miltenyi Biotech), 독일)를 복막강으로 주사하였다(마우스마다 1.6 × 107개). T-세포 주사 3일 후에, 마우스를 무작위화시키고, 주 2회(6일, 9일, 13일, 15일) 0.5 ㎎/㎏ COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164; n=8), 비히클(PBS; n=7) 처리 또는 매일의 등몰 용량(= 0.16 ㎎/㎏)의 COVA446(SEQ ID NO: 167; n=8)을 총 15일 동안 정맥내 볼루스 주사에 의해 꼬리 측정맥에 제공하였다. 치료 효능을 종양 성장 억제에 의해 평가하였다. 종양 크기를 외용 캘리퍼 측정에 의해 측정하고, 체적을 표준 반-타원형 식을 사용하여 계산하였다: 체적 = (너비)2 × 길이 × 0.5. 6일(치료법의 개시)에 대한 상대적 종양 체적(RTV)은 평균 ± SEM으로 제시되어 있다.
그래프패드 프리즘 6 소프트웨어, 버전 6a를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 비대응, 비모수 t-검정(Mann-Whitney)을 사용함으로써 항-종양 효능의 통계적 유의성을 계산하였다. 16일에 COVA420 대 비히클 처리의 항-종양 효능을 처리군 대 대조군 비(T/C)로서 표현되는 비히클 대조군에 비한 종양 체적 억제로서 추가로 평가하였다: T/C(%) = RTV(16일)/RTV(6일)(문헌[Wu (2010), Journal of Biopharmaceutical Statistics, 20:5, 954-964]).
결과:
COVA420은 T-세포를 종양에 활발히 동원함으로써 SKOV-3 종양 성장을 상당히 감소시킨다(도 9). COVA420 처리에 의해, 0.5 ㎎/㎏ COVA420의 4회의 투여 후에, 16일에, 비히클 대조군에 비하여 상당한 성장 억제가 야기되었다(P=0.0059). 또한, COVA420 처리는 매일 주사되는 0.16 ㎎/㎏ COVA446 대조군에 비하여 상당히 더 효율적이었다(P=0.04). 같은 날 T/C 비는 비히클 처리에 비하여 COVA420의 55% 성장 억제 및 COVA446의 79%와 같다. 결과는 COVA420이 약리학적으로 활성이며, 인간 T-세포를 종양에 효율적으로 동원하여, 비히클-처리된 대조군에 비하여 억제된 종양 성장을 야기함으로써 그의 항-종양 활성을 가하는 것을 입증한다.
실시예 1.7 - 선택적으로 높은 수준의 HER2를 발현하는 종양 세포에 대한 재 지향된 T-세포 매개의 세포독성의 분석
폴리펩티드 COVA420(SEQ ID NO: 163 및 164) 및 이중특이적 scFv 대조군 COVA446(SEQ ID NO: 167)을 문헌[Jager et al (2009) Cancer Research, 69 (10):4270-6]으로부터 조정된 프로토콜을 사용하여 재지향된 T-세포 매개의 세포독성 분석법에서 시험하였다.
약술하면, 실시예 1.3에 기재된 바와 같이 인간 PBMC를 실험 전날에 신선한 버피 코트로부터 단리하고, CD8+ T-세포를 실험 일에 단리하였다.
실험 전날 밤에, 적절한 개수의 표적 세포를 아큐타제 처리에 의해 탈리시키고, 표적 세포를 10% FCS가 보충된 150 ㎕의 적절한 성장 배지 중에 웰당 5000개 세포의 세포 밀도로 96 웰 플레이트에 씨딩하였다. 분석법 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이션시켰다. 사용된 표적 종양 세포는 높은 수준의 HER2를 발현하는 SKOV-3(ATCC® HTB-77™)(대략 1.7 × 106개 HER2 분자/세포) 및 낮은 수준의 HER2를 발현하는 MCF-7(ATCC® HTB-22™)(대략 1 × 104개 HER2 분자/세포)였다. HER2 표면 발현을 제조처의 권고에 따라 Qifikit(Dako K0078)를 사용하여 정량화하였다. 약술하면, 세포를 포화 농도의 항-HER2 항체(알앤디 MAB1129) 또는 아이소타입 일치되는 대조군 IgG 후에 항-마우스-FITC 이차 항체로 염색한 다음, 유세포계수 분석을 행하였다. 동시에, 상이한 잘 정의된 양의 마우스 모노클로널 항체 분자로 코팅된 비드를 이차 항체로 염색하고, 분석하고, 표준 곡선을 분자/세포에 대하여 참조로서 플롯팅하였다.
실험 일에, 이펙터 분자를 10% FCS, RPMI 중에 150 nM의 최대 농도로 희석하고, 1/10 희석의 일련의 희석물을 제조하였다.
적절한 양의 T-세포를 원심분리하고, 10% FCS, RPMI에서 재현탁화시켰다. 세포 농도를 1×106개 세포/㎖로 조정하였다.
마지막으로, 소모된 배지를 분석법 플레이트로부터 제거하고, 웰마다 50 ㎕의 신선한 10% FCS, RPMI로 대체하였다. 그 다음, 50 ㎕의 이펙터 분자 및 50 ㎕의 이펙터 T-세포를 첨가하였다. 최종 이펙터 세포 대 표적 세포 비는 10:1이었다. 이펙터 분자의 최종 최대 농도는 50 nM이었다. 최종 분석법 부피는 웰마다 150 ㎕였다.
분석법 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 60시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 세포 배양 상청액을 제거하고, 각각의 웰을 PBS로 1회 세척하였다. 세포 생존력을 제조처의 권고에 따라 XTT-시약(시그마 X4626)을 사용하여 평가하였다. 표적 세포를 1% 트리톤-X100(시그마)으로 처리함으로써 100% 용해 대조군을 포함시키고, 표적 세포를 오직 이펙터 세포와 인큐베이션시킴으로써 자발적인 용해에 대한 값을 수득하였다("자발적 용해"). XTT 기질의 첨가 후 2시간에 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 측정을 3벌로 행하였다.
세포 생존력 백분율을 하기의 식을 사용하여 계산하였다:
생존력% = (값-100% 용해)/(자발적 용해-100% 용해)*100.
그 다음, 세포 생존력%를 이펙터 분자 농도에 대하여 플롯팅하고, S자형 용량-반응을 핏팅시킴으로써 데이터를 프리즘 5(그래프패드 소프트웨어)를 사용하여 평가하였다.
결과
높은 수준의 HER2를 발현하는 SKOV-3 표적 세포에 대한 COVA420의 용량 의존적 재지향된 T-세포 세포독성이 관찰될 수 있다(도 10). 표 3은 시험된 단백질에 대하여 수득된 EC50 값을 요약한 것이다.
추가로, 낮은 수준의 HER2를 발현하는 MCF-7 표적 세포에 대한 이중특이적 항-CD3 × 항-HER2 scFv 대조군 분자 COVA446의 용량 의존적 재지향된 T-세포 세포독성이 관찰될 수 있다. 이러한 대표적인 분석법에서, COVA446은 53 pM의 EC50 값을 가졌다. 놀랍게도, COVA420은 낮은 수준의 HER2를 발현하는 MCF-7 표적 세포에 대한 상당한 재지향된 T-세포 세포독성을 나타내지 않았다(표 3).
[표 3]
Figure pct00011

실시예 2 - EGFR 양성 종양 세포에 대한 재지향된 T -세포 매개의 세포독성 분석
실시예 2.1. - 항-CD3 항체 항- EGFR Fynomer 융합 단백질의 발현 및 정제
SEQ ID NO: 169 및 187 내지 197에 나타낸 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 박테리아 발현 벡터 pQE12 내로 클로닝하여, 생성된 작제물이 Grabulovski 등에 의해 기재된 바와 같이(문헌[Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204]) C-말단 myc-헥사히스티딘 태그를 지니게 하였다. 폴리펩티드를 200 ㎕ 스케일 배양에서 에스케리키아 콜라이 박테리아의 세포질에서 발현시켰다. 폴리펩티드를 함유하는 맑아진 용해물을 10 ㎍/㎖ 항-myc 마우스 항체 9E10(로슈(Roche))을 함유하는 PBS/1% FCS/0.2% 아지드화나트륨 완충제 중에 5:1 희석하고, 1×105개 MDA-MB-468 세포(ATCC® HTB-132™)에 첨가하였다. 얼음에서의 60분 인큐베이션 후에, 세포를 세척하고, 결합된 서열을 항-마우스 IgG - 알렉사488 컨쥬게이트(인비트로겐)에 의해 검출하였다. 그 다음, 염색된 세포를 FACS 분석기에서 분석하였다. 특이적 결합제의 DNA 서열을 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다. Fyn SH3 유래의 EGFR 결합제의 아미노산 서열은 서열 목록에 첨부된 바와 같이 SEQ ID NO: 169 및 187 내지 197에 제시되어 있다.
EGFR 결합 Fynomer ER7L2D6(SEQ ID NO: 169)을 15개 아미노산 링커(SEQ ID NO: 162)를 통해 CD3 결합 항체(COVA489, SEQ ID NO: 171 및 172)의 중쇄(SEQ ID NO: 171)의 N-말단에 유전학적으로 융합시켜, 이중특이적 항체 Fynomer 융합 단백질 COVA493(SEQ ID NO: 170 및 172)을 제공하였다. 또한, ER7L2D6(SEQ ID NO: 1)을 항체 경쇄의 N-말단에 융합시켜, 이중특이적 항체 Fynomer 융합 단백질 COVA494(SEQ OD NO: 171 및 198)를 생성하였다.
EGFR 결합 Fynomer ER9L3D7(SEQ ID NO: 187)을 15개 아미노산 링커(SEQ ID NO: 162)를 통해 항-CD3 결합 항체(COVA489, SEQ ID NO: 171 및 172)의 항체 중쇄(SEQ ID NO: 171)의 N-말단에 유전학적으로 융합시켜, 이중특이적 항체 Fynomer 융합 단백질 COVA497(SEQ ID NO: 199 및 172)을 제공하였다. 또한, ER9L3D7(SEQ ID NO: 2)을 항체 경쇄(SEQ ID NO: 172)의 C-말단에 융합시켜, 이중특이적 항체 Fynomer 융합 단백질 COVA499(SEQ OD NO: 171 및 200)를 생성하였다.
항-CD3 항체 COVA489, 이중특이적 단백질 COVA493, COVA494, COVA497, COVA499 및 항-CD3 × 항-EGFR scFv 대조군 COVA445(SEQ ID NO: 173)(헥사-his 태그를 지님)를 FreeStyle CHO-S 세포로 일시적으로 트랜스펙션시키고, 혈청 미함유/동물 성분-미함유 배지에서 6일 동안 발현시켰다. 항-CD3 항체 및 본 발명의 이중특이적 단백질을 AKTA 퓨리파이어 기기(지이 헬쓰케어)를 사용한 단백질 A 친화성 크로마토그래피(지이-헬쓰케어 카탈로그 번호 89928)에 의해 상청액으로부터 정제하였다. HIStrap Excel 컬럼(지이 헬쓰케어)을 통한 고정화 금속 이온 친화성 크로마토그래피에 의해 항-CD3 × 항-EGFR scFv 대조군(COVA445, SEQ ID NO: 173)의 정제를 달성하였다. 농도를 280 nm에서 흡광도 측정에 의해 결정하였다. 수율은 표 4에 열거되어 있다.
정제 후에, 분석적 크기 배제 크로마토그래피를 아질런트 HPLC 12/60 시스템에서 실리카-기반의 SEC-5 컬럼(아질런트; 5 ㎛; 300 Å)을 사용하여 수행하였다.
결과
본 발명의 항체 Fynomer 융합 단백질 및 대조군 항체를 단일 단계에서 발현 및 정제할 수 있다. 표 1은 CHO 세포로의 일시적인 트랜스펙션 및 37℃에서 6일 동안의 단백질 발현 후의 정제 수율을 요약한 것이다.
[표 4]
Figure pct00012

본 발명의 이중특이적 단백질은 크기 배제 컬럼으로부터 단일의 단량체 피크로서 용리되었으며, 이는 본 발명의 항체 Fynomer 융합 단백질이 매우 유리한 생물물리학적 특성을 가짐을 입증한다(도 11). 본 발명의 이중특이적 작제물은 적어도 비변형 항-CD3 항체만큼 우수하게 발현되었으며, SEC 분석으로 나타낸 바와 같이 정제 후에 응집하지 않았다.
실시예 2.2 - 본 발명의 항- EGFR Fynomer ® 항-CD3 항체 융합 단백질을 사용한 FACS 분석법 실험
COVA489, COVA493, COVA494, COVA497, COVA499 및 COVA445를 PBS/1% BSA/0.2% 아지드화나트륨 중에 (i) 100 ㎕의 총 부피 중 30 nM 농도로 1 × 105개 Jurkat E6-1 세포(CD3 양성 세포; ATCC® TIB-152™)와 인큐베이션시키거나, (ii) 100 ㎕의 총 부피 중 100 nM 농도로 1 × 105개 EGFR-과발현 MDA-MB-468 유방암 세포(ATCC® HTB-132™)와 인큐베이션시켰다. 음성 대조군으로서, 동일한 세포를 단백질 대신에 오직 PBS/1% BSA/0.2% 아지드화나트륨(PBS 대조군)과 인큐베이션시켰다.
얼음 상에서의 45분 인큐베이션 후에, 세포를 150 ㎕ PBS-1% BSA 완충제로 2회 세척하고, 4 ㎍/㎖의 염소 항-인간-알렉사 488 컨쥬게이트(인비트로겐)를 4℃에서 40분 동안 첨가함으로써 결합된 항체를 검출하였다. 헥사 his 태그를 지니는 이중특이적 scFv 대조군 COVA445에 있어서, 1:4(항-HIS 태그 항체 : COVA445)의 몰비로, COVA445와 마우스 항 HIS 태그 항체(피셔 사이언티픽)의 동시의 인큐베이션 후에, 추가의 세척 단계 후에, 4℃에서 40분 동안의 4 ㎍/㎖ 염소 항-마우스-알렉사 488 컨쥬게이트(인비트로겐)와의 인큐베이션에 의해 결합을 검출하였다.
마지막으로, 세포를 3회 세척하고, 100 ㎕ PBS-1% BSA 중에 재현탁화시킨 다음, 염색된 세포를 구아바 easyCyte™ 유세포측정기(밀리포어)에서 분석하였다.
결과
모든 작제물은 인간 CD3을 발현하는 Jurkat E6-1 세포에 결합되고, 모든 Fynomer-항체 융합 및 항-CD3 × 항-EGFR scFv 대조군 COVA445는 MDA-MB-468에 결합되었다(도 12). 예상되는 바와 같이, MDA-MB-468에 대한 특이적인 결합이 항-CD3 항체 COVA489에 대하여 관찰되지 않았다.
실시예 2.3 - 선택적으로 높은 수준의 EGFR을 발현하는 종양 세포에 대 한 재지향된 T-세포 매개의 세포독성의 분석
폴리펩티드 COVA493, COVA494, COVA497, COVA499, 이중특이적 scFv 대조군 COVA445 및 항-CD3 항체(COVA489, SEQ ID No: 171 및 172)를 문헌[Jager et al (2009) Cancer Research, 69 (10):4270-6]으로부터 조정된 프로토콜을 사용하여 재지향된 T-세포 매개의 세포독성 분석법에서 시험하였다.
약술하면, 실험 전날 밤에, 적절한 개수의 표적 세포를 아큐타제 처리에 의해 탈리시키고, 표적 세포를 10% FCS가 보충된 150 ㎕의 적절한 성장 배지 중에 웰당 3000 내지 5000개 세포의 세포 밀도로 96 웰 플레이트에 씨딩하였다. 분석법 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이션시켰다. 사용된 표적 종양 세포는 높은 수준의 EGFR을 발현하는 MDA-MB-468(ATCC® HTB-132™)(대략 1.5 × 106개 EGFR 분자/세포) 및 낮은 수준의 EGFR을 발현하는 HT-29(ATCC® HTB-38™)(대략 5 × 104개 EGFR 분자/세포)였다. EGFR 표면 발현을 실시예 1.7에 기재된 바와 같이, 그러나 포화 농도의 항-EGFR 항체(밀리포어 MABF120)를 사용하여 정량화하였다.
실험 일에, 이펙터 분자를 10% FCS, RPMI 중에 15 nM의 최대 농도로 희석하고, 1/20 희석의 일련의 희석물을 제조하였다.
인간 CD8+ 풍부 T-세포를 이펙터 세포로 사용하였다. CD8+ 풍부 T-세포를 제조처에 의해 권고된 바와 같이, MACSxpress 분리기(밀테니(Milteny) 130-098-309) 및 적혈구 용해 용액(밀테니 130-094-183)과 함께, MACSxpress 인간 CD8+ 단리 키트(밀테니이 130-098-194)를 사용하여 블루트슈펜테 베른으로부터 수득된 신선한 버피 코트 제제로부터 단리하였다.
적절한 양의 T-세포를 원심분리하고, 10% FCS, RPMI 중에 재현탁화시켰다. 세포 농도를 1×106개 세포/㎖로 조정하였다.
마지막으로, 소모된 배지를 분석법 플레이트로부터 제거하고, 웰마다 50 ㎕의 신선한 10% FCS, RPMI로 대체하였다. 그 다음, 50 ㎕의 이펙터 분자 및 50 ㎕의 이펙터 T-세포를 첨가하였다. 최종 이펙터 세포 대 표적 세포 비는 10:1이었다. 이펙터 분자의 최종 최대 농도는 5 nM이었다. 최종 분석법 부피는 웰마다 150 ㎕였다.
본 발명의 Fynomer-항체 융합 단백질이 T-세포의 결합을 통해 사멸 활성을 가하는지 입증하기 위하여, 표적 세포를 5 nM의 농도에서 또한, T-세포의 부재하에 COVA493, COVA494, COVA497, COVA499 및 COVA445와 인큐베이션시켰다.
분석법 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 64시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 세포 배양 상청액을 제거하고, 각 웰을 PBS로 1회 세척하였다. 세포 생존력을 제조처의 권고에 따라 XTT-시약(시그마: X4626)을 사용하여 평가하였다. 표적 세포를 1% 트리톤-X100(시그마)으로 처리함으로써 100% 용해 대조군을 포함시키고, 표적 세포를 오직 이펙터 세포와 인큐베이션시킴으로써 자발적인 용해에 대한 값을 수득하였다("자발적 용해"). XTT 기질의 첨가 후 5시간에 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 측정을 3벌로 행하였다.
세포 생존력 백분율을 하기의 식을 사용하여 계산하였다:
생존력% = (값-100% 용해)/(자발적 용해-100% 용해)*100.
그 다음, 세포 생존력%를 이펙터 분자 농도에 대하여 플롯팅하고, S자형 용량-반응을 핏팅시킴으로써 데이터를 프리즘 5(그래프패드 소프트웨어)를 사용하여 평가하였다.
결과
높은 수준의 EGFR을 발현하는 MDA-MB-468 표적 세포에 대한 COVA493, COVA494, COVA497 및 COVA499의 용량 의존적 재지향된 T-세포 세포독성이 관찰될 수 있다(도 13, 표 5는 시험된 단백질에 대하여 수득된 EC50 값을 요약한 것이다).
추가로, 낮은 수준의 EGFR을 발현하는 HT-29 표적 세포에 대한 COVA493 및 이중특이적 항-CD3 × 항-EGFR scFv 대조군 분자의 용량 의존적 재지향된 T-세포 세포독성이 관찰될 수 있다. 이러한 대표적인 분석법에서, COVA493은 117.3 pM의 EC50 값을 가졌으며, COVA445는 2.5 pM의 EC50 값을 가졌다. 놀랍게도, COVA494, COVA497 및 COVA499는 심지어 5 nM의 가장 높은 농도에서도 낮은 수준의 EGFR을 발현하는 HT-29 표적 세포에 대한 상당한 재지향된 T-세포 세포독성을 나타내지 않았다(표 5).
세포독성이 항-CD3 항체(COVA489, SEQ ID NO: 13 및 14, 5 nM의 가장 높은 농도에서 측정)에서 관찰되지 않았기 때문에, 세포독성 효과는 항-EGFR Fynomer의 존재에 좌우되었다.
[표 5]
Figure pct00013

표적 세포가 COVA493, COVA494, COVA497, COVA499 및 이중특이적 항-CD3 × 항-EGFR scFv 대조군 분자(COVA445)와 인큐베이션되는 경우, 세포독성이 관찰되지 않았기 때문에, 세포독성 효과는 이펙터 T-세포의 존재에 좌우되었다(도 14).
실시예 3 - CD33 양성 종양 세포에 대한 재지향된 T -세포 매개의 세포독성 분석
실시예 3.1. - 항-CD3 항체 항-CD33 Fynomer 융합 단백질의 발현 및 정제
SEQ ID NO: 174 및 177 내지 186에 나타낸 아미노산을 인코딩하는 DNA를 Grabulovski 등에 의해 기재된 바와 같이(문헌[Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204]), 박테리아 발현 벡터 pQE12로 클로닝하여, 생성된 작제물이 C-말단 myc-헥사히스티딘 태그를 지니게 하였다. 폴리펩티드를 200 ㎕ 스케일 배양에서 에스케리키아 콜라이 박테리아의 세포질에서 발현시켰다. 맑아진 모노클로널 용해물을 ELISA를 위해 사용하였다: 인간 재조합 CD33(인간 Fcγ1으로의 융합체로서 알앤디로부터 구매)을 맥시소르프 웰(넌크) 상에 고정화시키고, PBS 중 4% 밀크(milk)(스위스 미그로스 소재의 라필라이트(Rapilait))를 사용한 블로킹 후에, 50 ㎍/㎖ 마우스 항-myc 마우스 항체 9E10(로슈)을 함유하는 PBS 중 10% 밀크 12.5㎕ 및 50 ㎕의 맑아진 용해물을 적용하였다. 1시간 동안 인큐베이션시킨 후에, 미결합 Fynomer를 세척해내고, 결합된 Fynomer를 항-마우스 IgG - HRP 항체 컨쥬게이트(시그마)로 검출하였다. BM 블루(blue) POD 기질(로슈)을 첨가함으로써 퍼옥시다제 활성의 검출을 행하고, 1M H2SO4를 첨가함으로써 반응을 중단시켰다. ELISA 양성 클론을 인간 IgG(시그마)에 대한 및 비코팅된 맥시소르프 웰에 대한 교차 반응성의 부재에 대하여 동일한 ELISA에 의해 시험하였다. 추가로, SEQ ID NO: 174 및 177 내지 186에 나타낸 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 Grabulovski 등에 기재된 바와 같이(문헌[Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204]), 고정화 금속 친화성 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 박테리아 용해물로부터 정제하였다. 93 nM의 정제된 Fynomer를 23 nM 마우스 항-myc 항체 9E10을 함유하는 100 ㎕ PBS/1% FCS/0.2% 아지드화나트륨 중 1×105개 U937 세포(ATCC CRL-1593.2™)와 인큐베이션시켰다. 얼음에서의 60분 인큐베이션 후에, 세포를 세척하고, 결합된 서열을 항-마우스 IgG - 알렉사488 컨쥬게이트(인비트로겐)에 의해 검출하였다. 그 다음, 염색된 세포를 FACS 분석기에서 분석하였다. 특이적 결합제의 DNA 서열을 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다. Fyn SH3 유래의 CD33 결합제의 아미노산 서열은 서열 목록에 첨부된 바와 같이 SEQ ID NO: 174 및 177 내지 186에 제시되어 있다.
CD33 결합 Fynomer EE1L1B3(Seq ID NO: 174)은 15개 아미노산 링커(SEQ ID NO: 162)를 통해 항-CD3 결합 항체(SEQ ID NO: 2 및 3)의 경쇄(SEQ ID NO: 3)의 C-말단에 유전학적으로 융합되어, 본 발명의 이중특이적 항체 Fynomer 항체 융합 단백질 COVA467(SEQ ID NO: 2 및 175)을 제공한다. 특허 출원 WO 2010/037835호에 기재된 COVA467 및 항-CD3 × 항-CD33 scFv 대조군 COVA463(SEQ ID NO: 176)을 실시예 1에 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. COVA467은 비변형 항-CD3 항체만큼 우수하게 발현되었으며(수율: COVA467에 대한 56 ㎎/ℓ 대 모체 항-CD3 항체 COVA419에 대한 46 ㎎/ℓ), SEC 분석, 도 15a에 의해 나타낸 바와 같이 정제 후에 응집하지 않았다.
실시예 3.2 - CD33을 발현하는 종양 세포에 대한 재지향된 T -세포 매개의 세포독성의 분석
폴리펩티드 COVA467(SEQ ID NO: 2 및 175), 및 이중특이적 scFv 대조군 COVA463(SEQ ID NO: 176)을 문헌[Jager et al (2009) Cancer Research, 69 (10):4270-6]으로부터 조정된 프로토콜을 사용하여 재지향된 T-세포 매개의 세포독성 분석법에서 시험하였다.
약술하면, U937(ATCC 카탈로그 번호 CRL-1593.2™) 표적 세포를 10% FCS가 보충된 50 ㎕의 RPMI 배지 중에 웰당 10000개 세포의 세포 밀도로 둥근 바닥 96 웰 플레이트에 씨딩하였다. 이펙터 분자를 10% FCS, RPMI 중에 15 nM의 최대 농도로 희석하고, 1/10 희석의 일련의 희석물을 제조하였다. 인간 CD8+ 풍부 T-세포를 이펙터 세포로 사용하였다. CD8+ 풍부 T-세포를 실시예 3에 기재된 바와 같이 단리하고, 2×106개 세포/㎖의 농도로 조정하였다. 그 다음, 표기된 농도의 50 ㎕의 이펙터 분자 및 50 ㎕의 이펙터 T-세포를 첨가하였다. 최종 이펙터 세포 대 표적 세포 비는 10:1이었다. 최종 분석법 부피는 웰당 150 ㎕였다.
분석법 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포 용해를 제조처의 권고에 따라 사이토톡스-플루오르(CytoTox-Fluor)™ 세포독성 분석법(프로메가 G9260)을 사용하여 평가하였다. 표적 세포를 0시간 인큐베이션에 2% 사포닌(Saponin)(시그마)으로 처리함으로써 100% 용해 대조군을 포함시켰다. 표적 세포를 오직 이펙터 T-세포와 인큐베이션시킴으로써 자발적인 용해를 측정하였다("자발적 용해"). 24시간 인큐베이션 후에, 분석법 플레이트를 400 xg에서 10분 동안 회전 하강시키고, 100 ㎕의 상청액을 블랙 96 웰 플레이트로 옮겼다. 사이토톡스-플루오르™ 시약 및 분석법 완충제를 실온에서 해동시키고, 60 ㎕의 시약을 30 ㎖ 분석법 완충제에 희석시켰다. 이후에, 50 ㎕의 이러한 혼합물을 분석법 플레이트 상청액의 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시키고, 형광을 485 nm 여기/520 nm 방출에서 기록하였다. 모든 측정을 3벌로 행하였다.
세포 생존력 백분율을 하기의 식을 사용하여 계산하였다:
세포 용해% = (값-자발적 용해)/(100% 용해-자발적 용해)*100.
그 다음, 세포 용해%를 이펙터 분자 농도에 대하여 플롯팅하고, S자형 용량-반응을 핏팅시킴으로써 데이터를 프리즘 5(그래프패드 소프트웨어)를 사용하여 평가하였다.
결과
CD33 발현 U937 세포에 대한 COVA467(SEQ ID NO: 2 및 175)의 용량 의존적 세포독성이 관찰될 수 있음을 입증할 수 있다(도 15b). 이러한 대표적인 분석법에서, COVA467(SEQ ID NO: 2 및 175)은 2.1 pM의 EC50 값을 가졌다. 중요한 것은, 세포독성이 항-CD3 항체(COVA419, SEQ ID NO: 2 및 3)에서 관찰되지 않았기 때문에, 세포독성 효과가 항-CD33 Fynomer의 존재에 좌우된다는 점이다.
동일한 분석법 조건하에, 1.6 pM의 EC50 값을 이중특이적 항-CD33 × 항-CD3 scFv-scFv 대조군 분자(SEQ ID NO: 176)에 대하여 수득하였다. 놀랍게도, 2가 및 전장 IgG 기반의 Fynomer-항체 융합 단백질이 재지향된 사멸 분석법에서, 현재 사용되는 scFv-scFv 단백질과 동일한 범위인 효력을 보이나, 준최적의 생물물리학적 특성 및 짧은 생체내 반감기의 단점으로 불리해지지 않음이 관찰되었다.
표 6은 시험된 단백질에 대하여 수득된 EC50 값을 요약한 것이다:
[표 6]
Figure pct00014
SEQUENCE LISTING <110> Covagen AG <120> Novel bispecific binding molecules with antitumoral activity <130> W1579 PCT <150> EP 13 16 4555.8 <151> 2013-04-19 <160> 209 <170> BiSSAP 1.2 <210> 1 <211> 63 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Arg Thr Glu 1 5 10 15 Asp Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Asn Ser 20 25 30 Ser Glu Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr Gly Glu Thr 35 40 45 Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser Ile Gln 50 55 60 <210> 2 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD3 antibody <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 3 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD3 antibody <400> 3 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 4 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-HER2 Fynomer C12 <400> 4 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Thr Ser Tyr Asn Thr 1 5 10 15 Arg Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Arg Met 20 25 30 Glu Asp Gly Val Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr Gly Glu Thr 35 40 45 Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser Ile Gln 50 55 60 <210> 5 <211> 68 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-HER2 Fynomer <220> <221> VARIANT <222> 12,13,14,15,16,17,18,34,35,36,41,44,53,55,59 <223> Gly, Val, Thr, Leu, Phe, Ala, Tyr, Asp, Ser, His, Lys, Glu, Gln, Ile, Trp, Arg, Met, Pro, Asn, Cys <220> <221> VARIANT <222> 19,20,21,37,38,39 <223> Gly, Val, Thr, Leu, Phe, Ala, Tyr, Asp, Ser, His, Lys, Glu, Gln, Ile, Trp, Arg, Met, Pro, Asn, Cys <400> 5 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile 20 25 30 Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Trp Trp Xaa Ala Arg Ser Leu 35 40 45 Thr Thr Gly Glu Xaa Gly Xaa Ile Pro Ser Xaa Tyr Val Ala Pro Val 50 55 60 Asp Ser Ile Gln 65 <210> 6 <211> 68 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-HER2 Fynomer <220> <221> VARIANT <222> 12 <223> Thr, Glu, Asp, Gln, Tyr, Val, Trp, Asn, Ser, Phe, Lys <220> <221> VARIANT <222> 13 <223> Ser, Ala, Arg, Thr <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Tyr, Arg, His, Thr, Asn, Val, Trp, Ser <220> <221> VARIANT <222> 15 <223> Asn, Asp, Met, Tyr, Arg, Pro, Glu, Leu, His, Thr, Gly, Phe <220> <221> VARIANT <222> 16 <223> Thr, Ser, Pro, Gln, Arg, Lys, Gly, Ala, Asp, Met, Asn, Leu, Phe, Tyr, Glu <220> <221> VARIANT <222> 17 <223> Arg, Met, Lys, Asp, Phe, Thr, Gly, His, Ser, Pro, Asn, Gln, Tyr, Leu, Ala, Pro <220> <221> VARIANT <222> 19 <223> Asp, Gly, Val, Leu, His, Asn, Arg, Phe, Ser, Ala <220> <221> VARIANT <222> 19 <223> Gly, Ser, Glu, Asp, Pro, Tyr or is absent <220> <221> VARIANT <222> 20 <223> Gln, Asp, Ser, His or is absent <220> <221> VARIANT <222> 21 <223> Asp, Val or is absent <220> <221> VARIANT <222> 34 <223> Arg, Lys, Gln, Asn, Ser, Gly, Trp, Met, His, Leu, Phe, Glu, Thr, Pro, Ala, Asp, Val <220> <221> VARIANT <222> 35 <223> Met, Arg, Glu, Gly, Asn, Asp, Ser, Ala, Gln, Phe, Pro, Lys, Tyr, Thr, His, Val, Leu, Trp <220> <221> VARIANT <222> 36 <223> Glu, Trp, Pro, Arg, Lys, Ser, Val, Asn, Asp, His, Gly, Thr, Gln, Ala, Tyr, Leu, Met <220> <221> VARIANT <222> 37 <223> Asp, Arg, Gln, Ser, Ala, Asn, Pro, Ile, His, Thr, Tyr, Glu, Leu, Lys, Met, Val, Ile, Trp or is absent <220> <221> VARIANT <222> 38 <223> Gly, Ser, Ile, Leu, Ala, Val, Thr, Glu, Asp, Gln, Arg, Pro, Lys, Met, His, Tyr or is absent <220> <221> VARIANT <222> 39 <223> Lys, Gly, Arg, Ala, Thr, Val, Ser, Ile, Glu, Gln, Pro, Asp, Asn, His or is absent <220> <221> VARIANT <222> 41 <223> Val, Asp, Thr, Ile, Tyr <220> <221> VARIANT <222> 44 <223> Glu, Ala, Arg, Thr, Gln <220> <221> VARIANT <222> 53 <223> Thr, Ile, Val <220> <221> VARIANT <222> 55 <223> Tyr, Leu, Phe <220> <221> VARIANT <222> 59 <223> Asn, Ser <400> 6 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile 20 25 30 Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Trp Trp Xaa Ala Arg Ser Leu 35 40 45 Thr Thr Gly Glu Xaa Gly Xaa Ile Pro Ser Xaa Tyr Val Ala Pro Val 50 55 60 Asp Ser Ile Gln 65 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated RT-loop <400> 7 Thr Ser Tyr Asn Thr Arg Asp 1 5 <210> 8 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated SRC-loop <400> 8 Arg Met Glu Asp 1 <210> 9 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-HER2 Fynomer <400> 9 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Arg Asp Ser 1 5 10 15 Met Gly Gly Gln Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile 20 25 30 Leu Lys Arg Trp Arg Gly Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr 35 40 45 Thr Gly Glu Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp 50 55 60 Ser Ile Gln 65 <210> 10 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-HER2 Fynomer <400> 10 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Arg Asp Ser 1 5 10 15 Met Gly Gly Gln Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile 20 25 30 Leu Thr Arg Trp Ala Gln Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr 35 40 45 Thr Gly Glu Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp 50 55 60 Ser Ile Gln 65 <210> 11 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-HER2 Fynomer <400> 11 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Gln Ala Tyr Gly Met 1 5 10 15 Tyr Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Ser Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Gly Tyr Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr Gly Glu 35 40 45 Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser Ile Gln 50 55 60 <210> 12 <211> 66 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-HER2 Fynomer <400> 12 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Arg Glu Phe 1 5 10 15 Met Gly Gly Gln Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile 20 25 30 Leu Thr Met Trp Lys Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr 35 40 45 Gly Glu Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser 50 55 60 Ile Gln 65 <210> 13 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-HER2 Fynomer <400> 13 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Arg Pro Tyr 1 5 10 15 Leu Gly Gly Gln Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile 20 25 30 Leu His Ala Ser Met Leu Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr 35 40 45 Thr Gly Glu Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp 50 55 60 Ser Ile Gln 65 <210> 14 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-HER2 Fynomer <400> 14 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Thr Ser Tyr Asn Gln 1 5 10 15 His Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Gly Asp 20 25 30 Asn Ile Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr Gly Glu Thr 35 40 45 Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser Ile Gln 50 55 60 <210> 15 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-HER2 Fynomer <400> 15 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Arg Leu Ser 1 5 10 15 Ser His Pro His Val Leu Ser Phe His Lys Gly 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<223> anti-EGFR Fynomer ER5L1E2 <400> 188 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Val Tyr Asp Tyr Glu Ala Arg Gly Leu 1 5 10 15 Asn Arg Met Phe Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile 20 25 30 Leu Asn Arg Glu Ser Glu Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr 35 40 45 Gly Glu Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser 50 55 60 Ile Gln 65 <210> 189 <211> 66 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EGFR Fynomer ER5L1E5 <400> 189 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Arg Gly Leu 1 5 10 15 Asn Arg Met Phe Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile 20 25 30 Leu Gln Phe Glu Thr Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr 35 40 45 Gly Glu Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser 50 55 60 Ile Gln 65 <210> 190 <211> 66 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EGFR Fynomer ER5L1H3 <400> 190 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Arg Gly Leu 1 5 10 15 Asn Arg Met Phe Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile 20 25 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EGFR Fynomer ER6L1F9 <400> 193 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Arg Gly Leu 1 5 10 15 Asn Arg Leu Phe Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile 20 25 30 Leu Asp Arg Thr Asn Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr 35 40 45 Gly Glu Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser 50 55 60 Ile Gln 65 <210> 194 <211> 66 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EGFR Fynomer ER7L2E8 <400> 194 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Arg Gly Leu 1 5 10 15 Asn Arg Met Phe Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile 20 25 30 Leu Thr Arg Glu Thr Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr 35 40 45 Gly Glu Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser 50 55 60 Ile Gln 65 <210> 195 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EGFR Fynomer ER8L3G1 <400> 195 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Arg Gly Leu 1 5 10 15 Asn Arg Met Phe Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile 20 25 30 Leu Asp Thr Ser Glu Ser Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr 35 40 45 Thr Gly Glu Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp 50 55 60 Ser Ile Gln 65 <210> 196 <211> 66 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EGFR Fynomer 3D5 <400> 196 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Arg Gly Leu 1 5 10 15 Asn Arg Met Phe Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile 20 25 30 Leu Leu Pro Gln Glu Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr 35 40 45 Gly Glu Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser 50 55 60 Ile Gln 65 <210> 197 <211> 66 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EGFR Fynomer 1C6 <400> 197 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Arg Gly Leu 1 5 10 15 His Arg Met Phe Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile 20 25 30 Leu Asp Arg Thr Asn Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr 35 40 45 Gly Glu Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser 50 55 60 Ile Gln 65 <210> 198 <211> 294 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> COVA494 LC <400> 198 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Arg Gly Leu 1 5 10 15 Asn Arg Met Phe Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile 20 25 30 Leu Ser Phe Glu Thr Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr 35 40 45 Gly Glu Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser 50 55 60 Ile Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 65 70 75 80 Ser Gln Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Phe Pro 85 90 95 Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr 100 105 110 Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile 115 120 125 Tyr Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 130 135 140 Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Thr 145 150 155 160 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro 165 170 175 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg Thr Val Ala Ala 180 185 190 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 195 200 205 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 210 215 220 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 225 230 235 240 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 245 250 255 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 260 265 270 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 275 280 285 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 290 <210> 199 <211> 532 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> COVA497 HC <400> 199 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Arg Gly Leu 1 5 10 15 Asn Arg Met Phe Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile 20 25 30 Leu Ser Thr Glu Asn Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr 35 40 45 Gly Glu Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser 50 55 60 Ile Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 65 70 75 80 Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly 85 90 95 Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg 100 105 110 Ser Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 115 120 125 Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys 130 135 140 Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 145 150 155 160 Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 165 170 175 Cys Ala Ser Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp 180 185 190 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro 195 200 205 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 210 215 220 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 245 250 255 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 260 265 270 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 275 280 285 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 290 295 300 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 305 310 315 320 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 325 330 335 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser 340 345 350 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 355 360 365 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 370 375 380 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 385 390 395 400 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro 405 410 415 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 420 425 430 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 435 440 445 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 450 455 460 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 465 470 475 480 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 485 490 495 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 500 505 510 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 515 520 525 Ser Pro Gly Lys 530 <210> 200 <211> 294 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> COVA499 LC <400> 200 Gln Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Phe Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Thr Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 210 215 220 Gly Gly Gly Ser Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu 225 230 235 240 Ala Arg Gly Leu Asn Arg Met Phe Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu 245 250 255 Lys Phe Gln Ile Leu Ser Thr Glu Asn Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg 260 265 270 Ser Leu Thr Thr Gly Glu Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala 275 280 285 Pro Val Asp Ser Ile Gln 290 <210> 201 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EGFR Fynomer <220> <221> VARIANT <222> 8,17,19,34,35,36,37 <223> Gly, Val, Thr, Leu, Phe, Ala, Tyr, Asp, Ser, His, Lys, Glu, Gln, Ile, Trp, Arg, Met, Pro, Asn, Cys <220> <221> VARIANT <222> 38 <223> Gly, Val, Thr, Leu, Phe, Ala, Tyr, Asp, Ser, His, Lys, Glu, Gln, Ile, Trp, Arg, Met, Pro, Asn, Cys or is absent <400> 201 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Xaa Tyr Asp Tyr Glu Ala Arg Gly Leu 1 5 10 15 Xaa Arg Xaa Phe Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile 20 25 30 Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr 35 40 45 Thr Gly Glu Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp 50 55 60 Ser Ile Gln 65 <210> 202 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EGFR Fynomer <220> <221> VARIANT <222> 8,17,19,34,35,36,37 <223> Gly, Val, Thr, Leu, Phe, Ala, Tyr, Asp, Ser, His, Lys, Glu, Gln, Ile, Trp, Arg, Met, Pro, Asn <220> <221> VARIANT <222> 38 <223> Gly, Val, Thr, Leu, Phe, Ala, Tyr, Asp, Ser, His, Lys, Glu, Gln, Ile, Trp, Arg, Met, Pro, Asn or is absent <400> 202 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Xaa Tyr Asp Tyr Glu Ala Arg Gly Leu 1 5 10 15 Xaa Arg Xaa Phe Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile 20 25 30 Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr 35 40 45 Thr Gly Glu Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp 50 55 60 Ser Ile Gln 65 <210> 203 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EGFR Fynomer <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Leu, Val <220> <221> VARIANT <222> 17 <223> Asn, His <220> <221> VARIANT <222> 19 <223> Met, Leu <220> <221> VARIANT <222> 34 <223> Ser, Asn, Gln, Ala, Asp, Thr, Leu <220> <221> VARIANT <222> 35 <223> Phe, Thr, Arg, Pro <220> <221> VARIANT <222> 36 <223> Ser, Glu, Thr, Gln <220> <221> VARIANT <222> 37 <223> Glu, Thr, Ser, Asn <220> <221> VARIANT <222> 38 <223> Ser or is absent <400> 203 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Xaa Tyr Asp Tyr Glu Ala Arg Gly Leu 1 5 10 15 Xaa Arg Xaa Phe Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile 20 25 30 Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr 35 40 45 Thr Gly Glu Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp 50 55 60 Ser Ile Gln 65 <210> 204 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EGFR Fynomer RT-loop <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Asn, His <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Met, Leu <400> 204 Glu Ala Arg Gly Leu Xaa Arg Xaa Phe 1 5 <210> 205 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD33 Fynomer <220> <221> VARIANT <222> 31,32,33,34 <223> Gly, Val, Thr, Leu, Phe, Ala, Tyr, Asp, Ser, His, Lys, Glu, Gln, Ile, Trp, Arg, Met, Pro, Asn, Cys <220> <221> VARIANT <222> 35,36 <223> Gly, Val, Thr, Leu, Phe, Ala, Tyr, Asp, Ser, His, Lys, Glu, Gln, Ile, Trp, Arg, Met, Pro, Asn, Cys or is absent <400> 205 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Leu Gly Ala 1 5 10 15 His Glu Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Phe Trp Glu Ala His Ser Leu Thr Thr Gly 35 40 45 Glu Thr Gly Trp Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser Ile 50 55 60 Gln 65 <210> 206 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD33 Fynomer <220> <221> VARIANT <222> 31,32,33,34 <223> Gly, Val, Thr, Leu, Phe, Ala, Tyr, Asp, Ser, His, Lys, Glu, Gln, Ile, Trp, Arg, Met, Pro, Asn <220> <221> VARIANT <222> 35,36 <223> Gly, Val, Thr, Leu, Phe, Ala, Tyr, Asp, Ser, His, Lys, Glu, Gln, Ile, Trp, Arg, Met, Pro, Asn or is absent <400> 206 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Leu Gly Ala 1 5 10 15 His Glu Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Phe Trp Glu Ala His Ser Leu Thr Thr Gly 35 40 45 Glu Thr Gly Trp Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser Ile 50 55 60 Gln 65 <210> 207 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD33 Fynomer <220> <221> VARIANT <222> 31 <223> Asn, Arg, Ser, Leu, Met, Asp, Tyr <220> <221> VARIANT <222> 32 <223> Ser, Gly, Pro, Arg, Met, Val <220> <221> VARIANT <222> 33 <223> Leu, Thr, Gly, Ser, Val, Arg, Ala <220> <221> VARIANT <222> 34 <223> Ser, Ala, Leu, Gln, Asp, Val, Lys, Glu <220> <221> VARIANT <222> 35 <223> Glu, Val, Gln, Leu, Ala, Arg or is absent <220> <221> VARIANT <222> 36 <223> Leu, Gly or is absent <400> 207 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Leu Gly Ala 1 5 10 15 His Glu Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Phe Trp Glu Ala His Ser Leu Thr Thr Gly 35 40 45 Glu Thr Gly Trp Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser Ile 50 55 60 Gln 65 <210> 208 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD33 Fynomer RT-loop <400> 208 Glu Ala Leu Gly Ala His Glu 1 5 <210> 209 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EGFR Fynomer RT-loop <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr <400> 209 Glu Ala Arg Gly Leu Xaa Arg Xaa Phe 1 5

Claims (19)

  1. (i) CD3 및 (ii) 암 세포 상의 표면 표적 항원에 특이적으로 결합하는 이중특이적 결합 분자로서,
    상기 결합 분자가
    (a) CD3에 특이적으로 결합하는 항체, 및
    (b) 암 세포 상의 표면 표적 항원에 결합하는 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하며,
    상기 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 이루어지되, 단,
    (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 10 내지 19 내의 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가되고,
    (ii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 29 내지 36 내의 적어도 하나의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가되되,
    단, 상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열에 대하여 적어도 85% 서열 동일성을 갖고, 상기 동일성의 결정이 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 12 내지 17 및 31 내지 34를 배제한 이중특이적 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CD3에 특이적으로 결합하는 항체가 테플리주맙(teplizumab), 오텔릭시주맙(otelixizumab), Cris-7 또는 SP34인 결합 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 결합 분자가 EGFR, HER2, CD33, CD19, CEA, EPHA2, 흑색종-관련 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸, IGFR1, 섬유아세포-활성화 단백질 알파, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), c-MET, EpCAM 또는 PSMA에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하는 결합 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자가 HER2에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드가 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 N-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드가 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 N-말단에 연결되는 결합 분자.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자가 EGFR에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하고, (i) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드가 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 N-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드가 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 N-말단에 연결되거나, (ii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드가 상기 항체의 2개의 중쇄의 제1 C-말단에 연결되며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드가 상기 항체의 2개의 중쇄의 제2 C-말단에 연결되거나, (iii) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드가 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 N-말단에 연결되고, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드가 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 N-말단에 연결되거나, (iv) 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드가 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 C-말단에 연결되고, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드가 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 C-말단에 연결되는 결합 분자.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 분자가 CD33에 특이적으로 결합하는 2개의 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드를 포함하며, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드가 상기 항체의 2개의 경쇄의 제1 C-말단에 연결되고, 상기 2개의 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드가 상기 항체의 2개의 경쇄의 제2 C-말단에 연결되는 결합 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD3에 특이적으로 결합하는 항체 및 상기 Fyn-SH3-유래 폴리펩티드가 링커에 의해 연결되는 결합 분자.
  8. 제7항에 있어서, 상기 링커가 펩티드-링커인 결합 분자.
  9. 제8항에 있어서, 상기 링커가 SEQ ID No: 162, 160 및 161로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 결합 분자.
  10. 제1항 내지 제4항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 결합 분자가 SEQ ID NO: 163 및/또는 164를 포함하는 결합 분자.
  11. 제1항 내지 제3항, 제5항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 결합 분자가 SEQ ID NO: 171 및/또는 198을 포함하는 결합 분자.
  12. 제1항 내지 제3항, 제6항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 결합 분자가 SEQ ID NO: 2 및/또는 175를 포함하는 결합 분자.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 결합 분자를 인코딩하는 핵산 분자.
  14. 제13항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  15. 제14항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포 또는 비-인간 숙주.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 결합 분자, 제13항의 핵산 분자, 제14항의 벡터 및/또는 제15항의 숙주 세포 또는 비-인간 숙주를 포함하는 약제학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 암의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 암이 유방암, 혈액 악성종양, 예를 들어, NHL, B-ALL, AML, 기타 암, 예를 들어, 전립선암, 흑색종, 폐암, 위암, 난소암, 두경부암, 대장암, 췌장암, 갑상선암, 신경교종, 방광암, 신장암, 간암 또는 악성 복수로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 암이 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 결합 분자에 의해 특이적으로 결합되고/거나, 제13항의 핵산 분자 인코딩된 결합 분자에 의해 특이적으로 결합되고/거나, 제14항의 벡터에 의해 발현되는 결합 분자에 의해 특이적으로 결합되고/거나, 제15항의 숙주 세포 또는 비-인간 숙주에 의해 발현되는 결합 분자에 의해 특이적으로 결합되는 표면 표적 항원을 비-종양 세포 상에 발현되는 양보다 적어도 2배 더 많은 양으로 발현하는 약제학적 조성물.
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