JP2019106997A - 抗腫瘍活性を有する新規な二重特異的結合分子 - Google Patents

Abstract

【課題】ＣＤ３と、癌細胞上の表面標的抗原と、に特異的に結合する二重特異的結合分子の提供。【解決手段】（ａ）ＣＤ３に特異的に結合する抗体と（ｂ）癌細胞上の表面標的抗原に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドとを含み、Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは特定の６３アミノ酸配列からなり、アミノ酸位置１０〜１９内の少なくとも１つのアミノ酸は置換、欠失、又は付加されていること、かつ２９〜３６内の少なくとも１つのアミノ酸は、置換、欠失、又は付加されており、さらに特定の６３アミノ酸配列からなる配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、同一性の決定では、アミノ酸位置１２〜１７および３１〜３４が除外されること、を特徴とする二重特異的結合分子の提供。【選択図】なし

Description

本発明は、（ｉ）ＣＤ３と、（ｉｉ）癌細胞上の表面標的抗原と、に特異的に結合する
二重特異的結合分子に関する。ここで、結合分子は、（ａ）ＣＤ３に特異的に結合する抗
体と、（ｂ）癌細胞上の表面標的抗原に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドと、を
含み、前記Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。た
だし、（ｉ）配列番号１のアミノ酸位置１０〜１９内の少なくとも１つのアミノ酸は、置
換、欠失、または付加されていること、かつ（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸位置２９〜３
６内の少なくとも１つのアミノ酸は、置換、欠失、または付加されていること、を条件と
し、前記ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同
一性を有し、同一性の決定では、配列番号１のアミノ酸位置１２〜１７および３１〜３４
が除外されること、を条件とする。

本明細書には、特許出願および製造業者のマニュアルを含めて、いくつかの文献が引用
されている。これらの文献の開示は、本発明の特許性に関連するとみなされるものではな
いが、これをもってその全体が参照により組み込まれる。より特定的には、参照された文
献はすべて、あたかもそれぞれ個々の文献が具体的かつ個別的に明示されて参照により組
み込まれたのと同程度まで、参照により組み込まれる。

疾患の初期および後期の両方で腫瘍の成長および癌患者の生存をＴ細胞によりコントロ
ール可能であるという証拠が増えている（Ｍｌｅｃｎｉｋ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，（２０１
１），Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ，３０，ｐｐ．５−１２）。しかし
ながら、腫瘍特異的Ｔ細胞反応は、癌患者で開始および維持を行うのが困難であり、免疫
編集時に選択される腫瘍細胞の多数の免疫逃避機序により制限される（Ｂａｕｅｒｌｅ
ＰＡ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６９（１２），ｐｐ．４９４１
−４９４４）。癌療法のためにＴ細胞をエンゲージする代替法は、癌細胞上の表面標的抗
原とＴ細胞上のＣＤ３とに対して二重特異的である抗体である（Ｂａｒｇｏｕ ｅｔ ａ
ｌ．（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２１（５８９１），ｐｐ．９７４−９７７）。これ
により、典型的には、Ｔ細胞レセプター特異性、共刺激、またはペプチド抗原提示に依存
せずに、任意の種類の細胞傷害性Ｔ細胞を癌細胞に結合することが可能である。

ネズミ抗ＣＤ３抗体およびヒト化抗ＣＤ３抗体、たとえば、ムロモナブＣＤ３（Ｎｏｒ
ｍａｎ ＤＪ（１９９５）Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｍｏｎｉｔ １７（６），ｐｐ．６１５
−６２０）、テプリズマブおよびオテリキシズマブ（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ Ｌ．（２０１
０）６（３），ｐｐ．１４９−１５７）、ならびにＣｒｉｓ−７（Ａｌｂｅｒｏｌａ−Ｉ
ｌａ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９１），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４６（４），ｐｐ．１０
８５−１０９２）は、当技術分野で周知である。Ｃｏｎｒａｄらは、ＳＰ３４を含めて、
他の抗ＣＤ３抗体を概説している（Ｃｏｎｒａｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｙｔｏｍ
ｅｔｒｙ，７１（１１），ｐｐ．９２５−９３３）。

記載のごとく、ＣＤ３と癌細胞上の表面標的抗原との両方を認識する二重特異的抗体は
、当技術分野で周知である（Ｍａｙ Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，８４，ｐｐ．１１０５−１１１２も参照されたい）
。歴史的には、有利な薬剤的性質を有するこれらの複雑な分子を設計して、薬剤開発を支
援するのに十分な量および品質を提供することが困難であることが、療法剤として二重特
異的抗体を開発するうえで主要な障害になっていたことに注目することが重要である（Ｃ
ｈａｎ Ａ．ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．（２０１０），Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ，１０（５），ｐｐ．３０１−３１６）。このことは、選択された特異性を有するモノ
クローナル抗体（ｍＡｂ）を発現する２つのユニークなネズミハイブリドーマクローンの
融合から生じるクアドローマの技術を利用したＣＤ３分野の初期の二重特異的手法により
例証される（Ｓｔａｅｒｚ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ ＵＳＡ，８３，ｐｐ．１４５３−１４５７）。この方法により調製される二重特
異的抗体は、ＩｇＧの重鎖および軽鎖のランダム対合に依拠する。抗原を発現する細胞で
いくつかの生物学的効果が観測されたにもかかわらず、この手法は、疾患の臨床経過では
有意な影響をもたらさなかった（Ｋｕｆｅｒ Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｔｒｅｎｄ
ｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２，ｐｐ．２３８−２４４）。上述したように、これらの
第１世代の二重特異的抗体は、大量の均一バッチの生産が困難であることおよびネズミ抗
体フラグメントの有効性が欠如していることを含む２つの主要な限界を呈した。それに加
えて、ほとんどの治療患者でヒト抗マウス抗体反応が見られたため、ネズミ分子の有効性
が大幅に減少し、複数回投与が制限された（Ｍａｙ Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，８４，ｐｐ．１１０５−１１１２）
。

Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒらは、ラットＩｇＧ２ａとマウスＩｇＧ２ｂとの対合により不均一
性レベルを減少させる方法を同定した（Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）
Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５５，ｐｐ．２１９−２２５）。これらのラットおよびマウスの
アイソタイプ特異的ハイブリドーマの融合により、種限定の重鎖／軽鎖対合が優先するた
め、適正に対合した二重特異的抗体の出現率が増加することが、著者らにより見いだされ
た。そのほかに、著者らは、親抗体からの機能性二重特異的抗体の精製を容易にするシー
ケンシャルｐＨ溶出法を同定した。この方法により生成されたハイブリッド抗体では、２
つの異なる抗原、たとえば、ＣＤ３と腫瘍抗原、に対する結合部位が組み込まれ、通常の
抗体と同様に、マクロファージ、ＮＫ細胞、および樹状細胞上に発現されるＦｃγＲレセ
プターに結合可能なそのインタクトなＦｃが保持された。ＴｒｉｏｍＡｂｓ（登録商標）
と称されるこの二重特異的抗体は、Ｆｃレセプター発現細胞と共にＴ細胞を腫瘍に再方向
付けする作用を兼備し、Ｔ細胞媒介溶解とＡＤＣＣとの組合せにより腫瘍細胞を排除する
と報告されてきた（Ｌｉｎｋｅ Ｒ．ｅｔ ａｌ（２０１０）Ｍａｂｓ，２，ｐｐ．１２
９−１３６）。この方式は、臨床試験で評価されてきたいくつかの二重特異的抗体の開発
をもたらした。これらには、カツマキソマブ（抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３）、エルツマキソ
マブ（抗ＨＥＲ２×抗ＣＤ３）、およびＦＢＴＡ０５（抗ＣＤ２０×抗ＣＤ３）が含まれ
る（Ｃｈａｍｅｓ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，（２００９），Ｍａｂｓ，１，ｐｐ．５３９−５
４７にレビューされている）。カツマキソマブは、開発された最初のＴｒｉｏｍＡｂ（登
録商標）であり、第２／３相で生存率の有意な改善が実証されたことにより、カツマキソ
マブは、ＥｐＣＡＭ陽性腫瘍を有する患者において悪性腹水を治療するために２００９年
にＥＵの認可を受けるに至り、臨床使用が認められた最初の二重特異的抗体であった（Ｊ
ａｇｅｒ Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６９，４９４１−４
９４４）。ＨＥＲ２を標的とするＴｒｉｏｍＡｂ（登録商標）エルツマキソマブは、現在
、ＨＥＲ２を発現する進行固形腫瘍を有する患者において臨床試験で研究されている。Ｂ
細胞悪性腫瘍上に発現されるＣＤ２０を標的とするように開発された第３のＴｒｉｏｍＡ
ｂ（登録商標）であるＦＢＴＡ０５は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）患者に由来する
低レベルのＣＤ２０発現を有するＢ細胞系の特異的溶解を媒介することが示された。さら
に、ＦＢＴＡ０５は、リツキシマブと比較して有意に高い根絶率をｉｎ ｖｉｔｒｏで呈
した。同種異系移植後のＣＤ２０陽性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）患者において再発疾
患または難治性疾患の治療のためにドナーリンパ球注入との組合せでＦＢＴＡ０５の安全
性および有効性を評価する第１／２相研究が、進行中である（Ｃｈａｍｅｓ Ｐ．ｅｔ
ａｌ．，（２００９），Ｍａｂｓ，１，ｐｐ．５３９−５４７）。このＴｒｉｏｍＡｂ（
登録商標）方式の主要な限界は、非ヒト化マウス／ラットハイブリッド抗体方式の繰返し
投与に反応して、患者がヒト抗マウスおよび抗ラット抗体を生成することによって存在す
る（Ｌｉｎｋｅ Ｒ．ｅｔ ａｌ（２０１０）Ｍａｂｓ，２，ｐｐ．１２９−１３６）。

ＴｒｉｏｍＡｂ（登録商標）抗体の限界のいくつかは、抗体工学によりおよび新規な方
式に基づく組換え二重特異的分子の生成により対処された（Ｍａｙ Ｃ．ｅｔ ａｌ．（
２０１２），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，８４，ｐｐ．１１０
５−１１１２の概説を参照されたい）。試験されてきた二重特異的抗体設計のうち、Ｂｉ
ＴＥ（登録商標）（二重特異的Ｔ細胞エンゲージャー）と称される方式は、これまでに診
察で最大の成功を収めてきた。ＢｉＴＥ（登録商標）組換え方式は、ペプチドリンカーに
より共有結合された２つの一本鎖抗体に基づく（二重特異的ｓｃＦｖ抗体フラグメント方
式をもたらす）。４つの個別の遺伝子によりコードされる合計４つの可変ドメインが、単
一遺伝子によりコードされる単一ポリペプチド鎖上にアライメントされる。ＢｉＴＥ（登
録商標）は、ピコモル（ｐＭ）濃度でそのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの選択
的Ｔ細胞活性化に関して、さらにはその作用機序に関して、きわめて詳細に研究されてき
た（Ｂａｅｕｅｒｌｅ ＰＡ ｅｔ ａｌ．，（２００９），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６
９，ｐｐ．４９４１−４９４４）。ＣＤ１９（ほとんどのヒトＢ細胞悪性腫瘍により発現
される（Ｄｒｅｉｅｒ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（２００３），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７０
，ｐｐ．４３９７−４４０２））およびいくつかの固形腫瘍上に発現されるＥｐＣＡＭ（
Ｂｒｉｓｃｈｗｅｉｎ Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，４３
，ｐｐ．１１２９−１１４３）を標的とするＢｉＴＥ（登録商標）は、最先端の分子であ
り、現在、臨床試験で試験されている。組換え抗ＣＤ３×抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥ（登録商
標）分子であるブリナツモマブ（ＭＴ１０３としても知られる）は、再発非ホジキンリン
パ腫（ＮＨＬ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の患者の治療剤として研究され
ている。単一の作用剤としてブリナツモマブに対して最初に確認された反応は、ＮＨＬ患
者で行われた（Ｂａｒｇｏｕ Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２１
，ｐｐ．９７４−９７７）。より最近では、微小残存病変（ＭＲＤ）陽性Ｂ系列ＡＬＬで
ブリナツモマブの有効性を決定するために、相２臨床試験が行われた（Ｔｏｐｐ ＭＳ
ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２９，ｐｐ．２４９３−２４９８
）。０．０１５ｍｇ／ｍ２／日の用量レベルで２１名の患者を治療したところ、１６名の
患者がＭＲＤ陰性になったで。無再発の生存の可能性は、４０５日間のメジアン追跡で７
８％と報告された。ブリナツモマブは、ＭＲＤ陽性Ｂ系列ＡＬＬの患者において有効かつ
耐容性良好であり、治療は、長期にわたる無白血病生存をもたらした。ＣＤ１９およびＥ
ｐＣＡＭに加えて、ＢｉＴＥ（登録商標）抗体はまた、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＥＰＨＡ２、
黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ＩＧＦＲ１、ＣＤ３３、線維芽細胞活
性化タンパク質α、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ｃ−ＭＥＴ、ＰＳＭＡ、およびＨＥ
Ｒ２を発現する腫瘍細胞を特異的に標的としうることが、前臨床試験により示された（Ｂ
ａｅｕｅｒｌｅ ＰＡ ｅｔ ａｌ．，（２００９），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６９，ｐ
ｐ．４９４１−４９４４、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ Ｍ．（２０１２）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ
Ｔｈｅｒ，１１（１２），ｐｐ．２６６４−２６７３）。

ＢｉＴＥ（登録商標）抗体（約５５ｋＤａ）は、サイズが小さいため、短い血清中半減
期により特徴付けられる。たとえば、この薬剤を投与するためには、ポータブルポンプに
よるブリナツモマブの連続的静脈内注入が必要である。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏ半減
期が短いことが、ＢｉＴＥ（登録商標）抗体の主要な限界の１つである（Ｋｏｎｔｅｒｍ
ａｎｎ Ｒ．（２００５）Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ，２
６（１），ｐｐ．１−９）。

ＣＤ３と癌細胞上の表面標的抗原との両方を認識するｓｃＦｖ抗体フラグメントに基づ
く他の二重特異的方式は、当技術分野で公知であり、たとえば、ＤＡＲＴ（商標）プラッ
トフォームは、２つの特異性のそれぞれに対して１つの結合部位を有する共有結合された
ヘテロ二量体複合体を生成するように共発現される２つの個別のポリペプチドからなり（
Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ，（２０１１），Ｂｌｏｏｄ，１１７，ｐｐ．４５４２−４５５
１）、ｔａｎｄａｂ（登録商標）と呼ばれる４価タンデムダイアボディー構造では、２つ
の異なる抗体からの４つの可変ドメインをそれぞれ有する２つのポリペプチドが、ホモ二
量体分子に対して頭−尾に配置される（Ｍφｌｈφｊ Ｍ．ｅｔ ａｌ，（２００７），
Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，４４（８），ｐｐ．１９３５−１９４３）。

ｓｃＦｖベースの二重特異的戦略の半減期がやや短いことに加えて、ｓｃＦｖベースの
構築物は、他の分子からのパートナーとのＶ領域の「ドメイン交換」に起因して凝集体を
形成する傾向を有するか（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ，（２０１１），Ｂｌｏｏｄ，１１７
，ｐｐ．４５４２−４５５１）、またはＤＡＲＴ（商標）プラットフォームで示されるよ
うに、ヘテロ二量体複合体を形成するためにより複雑な発現系に依存する（Ｍｏｏｒｅ
ｅｔ ａｌ，（２０１１），Ｂｌｏｏｄ，１１７，ｐｐ．４５４２−４５５１）。

近年、いくつかの他の二重特異的方式が創出され（Ｃｈａｎ Ａ．ａｎｄ Ｃａｒｔｅ
ｒ Ｐ．（２０１０），Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０（５）ｐｐ．３０１−３
１６およびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ Ｒ．（２０１２），Ｍａｂｓ，４（２），ｐｐ．１８
２−１９７にレビューされている）、そのいくつかは、ＣＤ３と腫瘍細胞表面抗原とを標
的とするように設計されてきた。また、ヒトＩｇＧ様二重特異的技術、たとえば、単一軽
鎖抗体を使用するＢｉｃｌｏｎｉｃｓ（商標）ＥＮＧＡＧＥプラットフォームに基づくＣ
Ｄ３二重特異的抗体（ｗｗｗ．ｍｅｒｕｓ．ｎｌ）、単一重鎖抗体に依拠する「ｋａｐｐ
ａ−ｌａｍｂｄａ−ｂｏｄｙ（商標）」（ｗｗｗ．ｎｏｖｉｍｍｕｎｅ．ｃｏｍ）、およ
び二重特異的ＩｇＧ１／ＩｇＧ２抗体（Ｓｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ Ｍｏ
ｌ Ｂｉｏｌ，４２０，ｐｐ．２０４−２１９）が、この分野で発展してきた。リダイレ
クトＴ細胞死滅のための二重特異的方式の工学技術のこれらの最近の進歩にもかかわらず
、２本の重鎖のいずれかと単一の軽鎖とのもしくは１本の重鎖と２本の軽鎖との共発現お
よびそれに続くより複雑な下流の精製プロセスが必要であること、またはＩｇＧ１／Ｉｇ
Ｇ２二重特異的抗体の場合、ヘテロ二量体化に好適なレドックス条件が必要であることな
ど、これらのより新技術には依然として欠点が存在する。したがって、高レベルの発現、
有利な物理化学的性質（たとえば、高い溶解性および安定性ならびに低い凝集傾向）、長
い血清中半減期などの薬剤的性質を有する二重特異的抗体を創出する大きな医学的必要性
が存在する。二重特異的化合物を検討する科学会議の出現により、改善された二重特異的
抗体の必要性もまた、具体的に示されている。たとえば、第２回世界二重特異的抗体サミ
ット（Ｗｏｒｌｄ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｕｍｍｉｔ）では、産
業上の二重特異的抗体の重要性が増していることが述べられた。二重特異的抗体は、過去
２年間で６５億ドルを超える価値のあるいくつかの印象的な取引きの対象になっていたと
想定されている。一方、利用すべき絶好の機会および膨大な成長の余地が存在するが、こ
の新しいクラスの薬剤がその十分な潜在能力を達成できるようになる前に、依然として、
対処する必要のある多くの課題が存在する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏ
ｍ／ｎａｔｕｒｅｅｖｅｎｔｓ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ｅｖｅｎｔｓ／１４６６７；２ｎｄ＿
Ｗｏｒｌｄ＿Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ＿Ａｎｔｉｂｏｄｙ＿Ｓｕｍｍｉｔ）。

したがって、有利な薬剤的性質を有し、薬剤開発を支援するのに十分な量および品質で
生成可能であり、かつ治療剤として好適である、腫瘍の治療に有用な新規な二重特異的方
式の大きな医学的必要性が存在する。したがって、本発明の目的は、ＣＤ３と腫瘍細胞表
面抗原とを標的とするそのような新規な二重特異的結合分子を提供することである。

したがって、第１の実施形態では、本発明は、（ｉ）ＣＤ３と、（ｉｉ）癌細胞上の表
面標的抗原と、に特異的に結合する二重特異的結合分子に関する。ここで、結合分子は、
（ａ）ＣＤ３に特異的に結合する抗体と、（ｂ）癌細胞上の表面標的抗原に結合するＦｙ
ｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドと、を含み、前記Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、配列
番号１のアミノ酸配列からなる。ただし、（ｉ）配列番号１のアミノ酸位置１０〜１９内
の少なくとも１つのアミノ酸は、置換、欠失、または付加されていること、かつ（ｉｉ）
配列番号１のアミノ酸位置２９〜３６内の少なくとも１つのアミノ酸は、置換、欠失、ま
たは付加されていること、を条件とし、前記ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列
に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、同一性の決定では、配列番号１のアミノ
酸位置１２〜１７および３１〜３４が除外されること、を条件とする。

「（ｉ）ＣＤ３と、（ｉｉ）癌細胞上の表面標的抗原と、に特異的に結合する二重特異
的結合分子」という用語は、本発明に係る結合分子が、ＣＤ３の抗原と、癌細胞上の表面
標的抗原の抗原であって、ＣＤ３とは異なる、抗原と、に特異的に結合可能であることを
意味する。さらに、本発明に係る二重特異的結合分子は、前記２つの標的に同時に結合可
能である。したがって、本発明に係る「ＣＤ３二重特異的結合分子」という用語はまた、
２つの結合特異性を含み、１つ目は、ＣＤ３に対するものであり（「抗ＣＤ３」）、２つ
目は、癌細胞上の異なる表面標的抗原に対するものである（「癌細胞上の抗表面標的抗原
」または「抗腫瘍抗原」）。

本発明によれば、それぞれの分子が類似の構造のエピトープと本質的に交差反応しない
場合、分子は、特異的に結合するとみなされる（本明細書では特異的に相互作用するとし
ても参照される）。研究対象の一群の分子の交差反応性は、たとえば、対象となるエピト
ープに対する、さらにはいくつかの多かれ少なかれ（構造上および／または機能上）関連
性の強いエピトープに対する、通常の条件下での前記一群の分子の結合を評価することに
より、試験されうる。その適合状況で、対象となるエピトープ（たとえば、タンパク質構
造中の特異的モチーフ）には結合するが、他のエピトープのいずれにも本質的に結合しな
い分子のみが、対象となるエピトープに特異的であるとみなされる。対応する方法は、た
とえば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，１９８８またはＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。「類似の
構造のエピトープと本質的に交差反応しない分子」という用語は、本明細書で用いられる
場合、類似の構造のエピトープに対する親和性の少なくとも５倍の親和性で、より好まし
くは少なくとも１０倍の親和性で、たとえば、少なくとも５０倍の親和性などで、より好
ましくは少なくとも１００倍の親和性で、たとえば、少なくとも５００倍の親和性などで
、標的抗原に結合する分子を意味する。さらにより好ましくは、それは、類似の構造のエ
ピトープに対する親和性の少なくとも１．０００倍の親和性で、たとえば、少なくとも１
０．０００倍の親和性などで、最も好ましくは少なくとも１００．０００倍の親和性で、
標的抗原と結合する。

好ましくは、本発明に係る二重特異的結合分子は、５×１０^−７〜１０^−１２Ｍ、より
好ましくは１０^−８〜１０^−１２Ｍ、最も好ましくは１０^−９〜１０^−１２ＭのＫＤで、
ＣＤ３に結合する。同様に、本発明に係る二重特異的結合分子は、１０^−７〜１０^−１２
Ｍ、より好ましくは１０^−８〜１０^−１２Ｍ、最も好ましくは１０^−９〜１０^−１２Ｍの
ＫＤで、癌細胞上の選択された表面標的抗原に結合する。

エピトープは、コンフォメーショナルエピトープまたは連続エピトープでありうる。ポ
リペプチド抗原では、コンフォメーショナル（または不連続）エピトープは、一次配列で
は離れているが、ポリペプチドが天然の三次元構造にフォールディングされてエピトープ
を構成した場合、分子の表面で互いに近接して位置する、２つ以上の個別のアミノ酸残基
が存在することにより特徴付けられる（Ｓｅｌａ，（１９６９）Ｓｃｉｅｎｃｅ １６６
，１３６５ ａｎｄ Ｌａｖｅｒ，（１９９０）Ｃｅｌｌ ６１，５５３−６）。エピト
ープに寄与する２つ以上の個別のアミノ酸残基は、離れたセクション中に存在するか、さ
らには抗原の２つ以上の（ポリ）ペプチド鎖中に存在する。これとは対照的に、線状また
は連続エピトープは、（ポリ）ペプチド鎖の単一の線状セグメント中に近接して位置する
２つ以上の個別のアミノ酸残基からなる。

「癌細胞上の表面標的抗原」という用語は、非腫瘍細胞上で発現されないかまたは非腫
瘍細胞上よりも多量に腫瘍細胞上で発現される抗原を意味する。「癌細胞上の表面標的抗
原」、「腫瘍抗原」、および「腫瘍関連抗原」という用語は、本明細書では同義的に用い
られる。癌細胞上の表面標的抗原は、ＣＤ３抗原ではなく、より好ましくは、Ｔ細胞レセ
プターの成分内の抗原ではない。好ましくは、抗原は、非腫瘍細胞上の少なくとも２倍の
量で、より好ましくは少なくとも５倍の量で、たとえば、少なくとも１０倍の量などで、
さらにより好ましくは少なくとも１００倍の量で、たとえば、少なくとも１０００倍の量
などで、最も好ましくは少なくとも１０．０００倍の量で、腫瘍細胞上に発現される。好
適な標的抗原としては、腫瘍細胞上により強力に発現される任意の抗原が挙げられる。好
ましくは、抗原は、以下で本明細書に定義される抗原の１つである。

「ペプチド」という用語は、３０アミノ酸までの線状分子鎖を意味する。一方、本明細
書で「タンパク質」という用語と同義的に用いられる「ポリペプチド」という用語は、一
本鎖タンパク質またはその断片を含めて、３０アミノ酸超を含有するアミノ酸の線状分子
鎖を記述する。本明細書で用いられる「（ポリ）ペプチド」という用語は、ペプチドおよ
びポリペプチドの両方を意味する。（ポリ）ペプチドは、少なくとも２つの同一または異
なる分子からなるオリゴマーを形成しうる。そのような多量体の対応する高次構造は、そ
れに対応して、ホモまたはヘテロ二量体、ホモまたはヘテロ三量体などと称される。融合
タンパク質のホモ二量体、三量体などもまた、「ポリペプチド」という用語の定義に分類
される。さらに、アミノ酸および／またはペプチド結合が機能的アナログにより置き換え
られた（ポリ）ペプチドのペプチド模倣体もまた、本発明に包含される。そのような機能
的アナログは、２０種の遺伝子コードアミノ酸以外のすべての既知のアミノ酸、たとえば
、セレノシスチンを含む。「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語はまた、たと
えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、および当技術分野で周知の類似の修飾によ
り修飾が行われた天然修飾（ポリ）ペプチドを意味する。

本発明によれば、結合分子は、（ａ）に定義された抗体と、（ｂ）に定義されたＦｙｎ
−ＳＨ３由来ポリペプチドと、を含むかまたはそれからなる。

前記Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドの１つ以上のコピー、たとえば、Ｆｙｎ−ＳＨ３
由来ポリペプチドの２、３、または４つのコピーなどが、本発明に係る二重特異的結合分
子中に存在しうることは、分かるであろう。Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドの２つのコ
ピーが存在することが好ましい。Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドの２つのコピーが存在
する場合、次の好ましい選択肢が利用可能である。すなわち、（ｉ）前記２つのポリペプ
チドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペ
プチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端に結合される（すなわち、別の言
い方をすれば、前記２つのポリペプチドの第１のコピーは、前記抗体の第１の重鎖のＮ末
端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２のコピーは、前記抗体の第２の重鎖の
Ｎ末端に結合される）か、（ｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの
重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つ
の重鎖の第２のＣ末端に結合されるか、（ｉｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前
記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、
前記抗体の２つの軽鎖の第２のＮ末端に結合されるか、または（ｉｖ）前記２つのポリペ
プチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリ
ペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＣ末端に結合される。

本明細書では「Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）」という用語と同義的に用いられる「Ｆｙ
ｎＳＨ３由来ポリペプチド」という用語は、ヒトＦｙｎＳＨ３ドメインに由来する非免疫
グロブリン由来結合ポリペプチド（たとえば、いわゆる足場）を意味する。ＦｙｎＳＨ３
由来ポリペプチドは、当技術分野で周知であり、たとえば、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ ｅ
ｔ ａｌ．（２００７）ＪＢＣ，２８２，ｐ．３１９６−３２０４、国際公開第２００８
／０２２７５９号パンフレット、Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２０（２）：５７−６８、Ｇｅｂａｕｅｒ ａ
ｎｄ Ｓｋｅｒｒａ（２００９）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｂｉｏｌｏｇｙ １３：２４５−２５５、またはＳｃｈｌａｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２
０１２），ＭＡｂｓ ４：４，１−１２に記載されている。

ＦｙｎキナーゼのＳＨ３ドメイン（ＦｙｎＳＨ３）は、６３残基、すなわち、Ｓｅｍｂ
ａ ｅｔ ａｌ．（１９８６）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３
（１５）：５４５９−６３）およびＫａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６）（Ｍｏ
ｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６（１２）：４１９５−２０１）により報告された配列のアミ
ノ酸８３〜１４５を含み、配列番号１に示されるように、配列
を有する。Ｆｙｎは、チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーの５９ｋＤａメンバーである
。選択的スプライシングの結果として、Ｆｙｎタンパク質は、そのキナーゼドメインが異
なる２つの異なるアイソフォームで存在し、一方のフォームは、胸腺細胞、脾細胞、およ
びいくつかの血液リンパ細胞系に見いだされるが、第２フォームは、主に脳内で蓄積する
（Ｃｏｏｋｅ ａｎｄ Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒ（１９８９），Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．１（１
）：６６−７４）。細胞内タンパク質であるＦｙｎの生物学的機能は、多様であり、Ｔ細
胞レセプターを介するシグナリング、脳機能の調節、さらには接着媒介シグナリングを含
む（Ｒｅｓｈ（１９９８）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３０（１
１）：１１５９−６２）。他のＳＨ３ドメインとまったく同様に、ＦｙｎＳＨ３は、２つ
の逆平行βシートで構成され、他のタンパク質と相互作用するために２つのフレキシブル
ループ（ＲＴ−Ｓｒｃループおよびｎ−Ｓｒｃループ）を含有する。２つのフレキシブル
ループ（ＲＴ−Ｓｒｃループおよびｎ−Ｓｒｃループと呼ばれる）の配列は、それぞれ、
配列番号１に下線および二重下線が付されている。配列番号１のＦｙｎＳＨ３のアミノ酸
配列は、ヒト、マウス、ラット、およびサル（ギボン）の間で完全に保存される。

当技術分野で示されているように（国際公開第２００８／０２２７５９号パンフレット
、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）ＪＢＣ，２８２，ｐ．３１９６−
３２０４）、ＦｙｎＳＨ３ドメインは、結合ポリペプチド、すなわち、Ｆｙｎｏｍｅｒ（
登録商標）を生成するためのとくに魅力的な足場である。この理由は、Ｆｙｎｏｍｅｒ（
登録商標）が、（ｉ）多量に可溶形で細菌中で発現可能であり、（ｉｉ）溶液中に保存し
たときに凝集することがなく、（ｉｉｉ）非常に安定であり（Ｔ_ｍ７０．５℃）、（ｉｖ
）システイン残基がなく、かつ（ｖ）マウスからヒトまで完全に保存されたアミノ酸配列
を特徴として、最初からヒトに由来するものであるため、望ましくない免疫原性反応が低
減されていることにある。

本発明に係るＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標）は、好ましくは、天然に存在するまたは天然
から単離されたタンパク質を含有する天然ＳＨ３ドメインではない。言い換えれば、本発
明の範囲は、好ましくは、野生型ＳＨ３ドメイン含有タンパク質を除外する。天然には豊
富なＳＨ３ドメイン含有タンパク質が存在する。これらの天然ＳＨ３タンパク質は、天然
リガンドへの結合親和性を有する。これらの天然ＳＨ３リガンドのほとんどは、ＰｘｘＰ
モチーフを有する。本発明に係るＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標）は、野生型ＳＨ３ドメイン
の標的とは異なる非天然標的への親和性を有するように設計された工学操作タンパク質で
ある、ＳＨ３ドメインの非天然標的は、前記標的が天然に存在する野生型ＳＨ３ドメイン
の天然（すなわち野生型）細胞内リガンドでないかぎり、任意の標的でありうる。たとえ
ば、ＳＨ３ドメインの非天然標的は、前記標的が天然に存在する野生型ＳＨ３ドメインの
天然細胞内リガンドでないかぎり、天然に存在する、好ましくは哺乳動物に存在する、よ
り好ましくはヒトに存在する、任意の標的でありうる。より好ましくは、本発明に係るＦ
ｙｎｏｍｅｒ（登録商標）は、任意の天然細胞内ＳＨ３結合リガンド、最も好ましくは、
ＰｘｘＰモチーフを有する任意の天然細胞内ＳＨ３結合リガンドへの結合親和性を本質的
に有していない。

特定の標的抗原に特異的に結合するＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドの誘導については、
当技術分野で記載されてきた。たとえば、以上の配列番号１に示される配列が改変された
異なるＦｙｎＳＨ３のライブラリーを作製することが可能である。好ましくは、改変は、
（ｉ）ＲＴループ（以上の配列番号１に下線付きで示される）に相当する配列で、もしく
は任意選択で前記配列（すなわち配列番号１中の配列ＤＹＥＡＲＴＥＤＤＬ）に２アミノ
酸まで近接した位置で、または（ｉｉ）Ｓｃｒループ（以上の配列番号１に二重下線付き
で示される）で、もしくは任意選択で前記配列（すなわち配列番号１中の配列ＩＬＮＳＳ
ＥＧＤ）に２アミノ酸まで近接した位置で、または（ｉｉｉ）両方の配列で同時に、行わ
れる。好ましくは、改変は、当技術分野で記載されるように、置換、欠失、または付加で
ある（たとえば、国際公開第２００８／０２２７５９号パンフレット、Ｇｒａｂｕｌｏｖ
ｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）ＪＢＣ，２８２，ｐ．３１９６−３２０４を参照され
たい）。アミノ酸配列を改変する手段および方法は、当技術分野で周知であり、たとえば
、当技術分野でＧｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）ＪＢＣ，２８２，ｐ
．３１９６−３２０４に記載されている。

続いて、このＦｙｎＳＨ３ライブラリーは、ファージミドベクター、たとえば、ｐＨＥ
Ｎ１（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．“Ｍｕｌｔｉ−ｓｕｂｕｎｉｔ ｐｒｏｔｅ
ｉｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ：
ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｆａ
ｂ）ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ，１９（１５）：４１３３−７，１９９１）中にクローニング可能であり、続いて
、ライブラリーは、ファージ上に提示され、そしてパニング、好ましくは、パニングのラ
ウンドの繰返し、たとえば、それぞれの抗原に対して少なくとも２ラウンド、より好まし
くは少なくとも３ラウンドのパニングなどに付されうる。次いで、確立された技術、たと
えば、モノクロナールファージＥＬＩＳＡなどにより、結合（ポリ）ペプチドのスクリー
ニングを行うことが可能である。次いで、こうして同定されたクローンの配列決定を利用
して、富化配列を明らかにしうる。こうして同定された結合（ポリ）ペプチドは、たとえ
ば、同定された配列の改変に基づいて追加のライブラリーを作製することにより、さらな
る成熟工程、ならびにファージディスプレイ工程およびパニング工程の繰返しに付されう
る。最後に、得られたＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドの交差反応性および免疫原性を分析
し、標的抗原に特異的なＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドを選択することが可能である。

ファージディスプレイスクリーニングおよび結合（ポリ）ペプチド最適化の方法は、当
技術分野で広く知られている。

本発明との関連では、ＦｙｎキナーゼＳＨ３ドメイン（ＲＴ−Ｓｒｃループと称される
こともある）のＲＴループは、配列番号１の位置１２〜１７に位置するアミノ酸「ＥＡＲ
ＴＥＤ」からなる。ＲＴループでまたはそれに近接して置換、欠失、および／または付加
、すなわち、突然変異される位置は、本発明によれば、アミノ酸１０〜１９、好ましくは
１１〜１８、より好ましくは１２〜１７である。

同様に、本発明との関連では、ＦＹＮキナーゼ（ｎ−Ｓｒｃループと称されることもあ
る）のｓｒｃループは、配列番号１の位置３１〜３４に位置するアミノ酸ＮＳＳＥからな
る。ｓｒｃループでまたはそれに近接して置換、欠失、および／または付加、すなわち、
突然変異される位置は、本発明によれば、アミノ酸２９〜３６、好ましくは３０〜３５、
より好ましくは３１〜３４である。

挙げられた少なくとも８５％の配列同一性は、任意のより高値の配列同一性を包含する
。配列同一性の想定される値は、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８
％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少な
くとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９
７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、および１００％である。配列同一性を決定
する場合、指定のアミノ酸位置（１２〜１７および３１〜３４）（それらの位置は配列番
号１からなる配列との関連で定義される）は、無視されるべきである。別の言い方をすれ
ば、主要な実施形態のアイテム（ｉ）および（ｉｉ）は、配列番号１の野生型ＳＨ３ドメ
イン配列に対して異なることが必要であり、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）配列の残りの部
分は、野生型に対して８５％〜１００％の配列同一性を有する。そのような定義された配
列同一性の決定は、たとえば、ペアワイズ配列アライメントを行い、アライメントプログ
ラムにより報告された配列同一性を無視し、配列番号１の位置３１〜３４および１２〜１
７が考慮されないように配列同一性の程度を再評価することにより、行われうる。配列同
一性のそのような再評価は、当業者であれば、これらの決定指示を考慮してさらなる労力
をかけることなく行うことが可能である。記載のごとく、１２〜１７および３１〜３４の
範囲は、以上の配列番号１の配列の表示で下線が付されている。両側に２つのフランキン
グアミノ酸を含む場合、１０〜１９および２９〜３６の範囲（常に、配列番号１からなる
配列のアミノ酸に基づく）が得られ、主要な実施形態のアイテム（ｉ）および（ｉｉ）に
係る領域は、いずれの場合も、１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸の置換、欠失
、または付加が行われるべきである。

本明細書で用いられる場合、アミノ酸配列間の「アミノ酸配列同一性」という用語は、
生化学分野の当業者の一般に広く使用されるアライメントおよび比較の技術に関すること
を意味する。２つのアミノ酸配列のアミノ酸配列同一性は、通常のアライメントの方法お
よびツールにより決定可能である。たとえば、配列番号１のアミノ酸配列に対する任意の
ポリペプチドのアミノ酸配列同一性の程度を決定するために、好ましくは、ＳＩＭ局所類
似性プログラムが利用される（Ｘｉａｏｑｕｉｎ Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｗｅｂｂ Ｍｉ
ｌｌｅｒ（１９９１），Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉ
ｃｓ，ｖｏｌ．１２：３３７−３５７）。これは、著者らおよびその研究所から自由に入
手可能である（世界的なウェブ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏ
ｌｓ／ｓｉｍ−ｐｒｏｔ．ｈｔｍｌも参照されたい）。多重アライメント分析については
、好ましくは、ＣｌｕｓｔａｌＷが使用される（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９
９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−４６８０）。
配列番号１のアミノ酸配列に対するポリペプチドのアミノ酸配列同一性の程度は、配列番
号１の位置１２〜１７および３１〜３４を除いて、配列番号１の全配列に対して決定され
る。

置換は、保存的置換または非保存的置換でありうるが、好ましくは保存的置換である。
いくつかの実施形態では、置換はまた、天然に存在するアミノ酸と天然に存在しないアミ
ノ酸との交換を含む。保存的置換は、置換されるアミノ酸に類似した化学的性質を有する
他のアミノ酸によるアミノ酸の置換を含む。好ましくは、保存的置換は、（ｉ）異なる塩
基性アミノ酸による塩基性アミノ酸の置換、（ｉｉ）異なる酸性アミノ酸による酸性アミ
ノ酸の置換、（ｉｉｉ）異なる芳香族アミノ酸による芳香族アミノ酸の置換、（ｉｖ）異
なる非極性脂肪族アミノ酸による非極性脂肪族アミノ酸の置換、および（ｖ）異なる極性
非荷電アミノ酸による極性非荷電アミノ酸の置換からなる群から選択される置換である。
塩基性アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、およびリシンからなる群から選択される。
酸性アミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタメートから選択される。芳香族アミノ酸は
、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択される。非極
性脂肪族アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、およびイソ
ロイシンからなる群から選択される。極性非荷電アミノ酸は、セリン、トレオニン、シス
テイン、プロリン、アスパラギン、およびグルタミンからなる群から選択される。保存的
アミノ酸置換とは対照的に、非保存的アミノ酸置換は、以上に概説された保存的置換（ｉ
）〜（ｖ）に分類されない任意のアミノ酸による１つのアミノ酸の交換である。

ＣＤ３（分化クラスター３）Ｔ細胞コレセプターまたは本明細書では単純に「ＣＤ３」
として参照されるものは、タンパク質複合体であり、４つの個別の鎖で構成される。哺乳
動物では、複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、および２つのＣＤ３ε鎖を含有する。こ
れらの鎖は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）として知られる分子およびζ鎖に会合して、Ｔ
リンパ球中に活性化シグナルを生成する。ＴＣＲ、ζ鎖、およびＣＤ３分子は、一緒にな
ってＴＣＲ複合体を構成する。以上で考察したように、ネズミ抗ＣＤ３抗体およびヒト化
抗ＣＤ３抗体、たとえば、ムロモナブＣＤ３（Ｎｏｒｍａｎ ＤＪ（１９９５）Ｔｈｅｒ
Ｄｒｕｇ Ｍｏｎｉｔ １７（６），ｐｐ．６１５−６２０）、テプリズマブおよびオ
テリキシズマブ（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ Ｌ．（２０１０）６（３），ｐｐ．１４９−１５
７）、ならびにＣｒｉｓ−７（Ａｌｂｅｒｏｌａ−Ｉｌａ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９１
），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４６（４），ｐｐ．１０８５−１０９２）、さらにはＳＰ３
４などの他のもの（Ｃｏｎｒａｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，７１
（１１），ｐｐ．９２５−９３３）は、当技術分野で周知である。それに加えて、癌患者
を治療するためのＣＤ３と癌細胞上の表面標的抗原との両方を認識するいくつかの二重特
異的抗体方式が、文献に記載されてきた。しかしながら、記載のごとく、多くの二重特異
的ＣＤ３方式は、生成の容易性、生成収量、生成物の溶解性、および生成物の薬動学的パ
ラメーターが満足すべきものではないなど、不十分な薬剤的性質を呈する。

本発明に従って用いられる「抗体」という用語は、たとえば、ポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体を含む。さらにまた、依然として結合特異性を保持するその誘導体
または断片は、「抗体」という用語に含まれる。抗体のフラグメントまたは誘導体は、と
くに、ＦａｂまたはＦａｂ’フラグメント、Ｆｄ、Ｆ（ａｂ’）_２、ＦｖまたはｓｃＦｖ
フラグメント、単一ドメインＶ_ＨまたはＶ様ドメイン、たとえば、ＶｈＨまたはＶ−ＮＡ
Ｒドメイン、さらには多量体方式、たとえば、ミニボディー、ダイアボディー、トリボデ
ィー、テトラボディー、または化学的コンジュゲートＦａｂ’多量体を含む（たとえば、
Ａｌｔｓｈｕｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０．，Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓ
ｏｎ，２００５を参照されたい）。「抗体」という用語はまた、キメラ抗体（ヒト定常ド
メイン、非ヒト可変ドメイン）、一本鎖抗体、およびヒト化抗体（非ヒトＣＤＲを除いて
ヒト抗体）などの実施形態を含む。２つの重鎖と２つの軽鎖とからなるヒト化全長ＩｇＧ
抗体が最も好ましい。したがって、「全長抗体」という用語は、２つの重鎖と２つの軽鎖
とからなる抗体を意味する。

「抗体のＦｃ部分」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて定
義される。その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、次のクラ
ス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに分類され、これらのい
くつかは、サブクラス（アイソタイプ）、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、お
よびＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）にさらに分類される。重鎖定常領域に従って、
異なるクラスの免疫グロブリンは、それぞれ、［α］、［δ］、［ε］、［γ］、および
［μ］と呼ばれる。抗体のＦｃ部分は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、およびＦｃレセプター
結合に基づいて、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）およびＣＤＣ（補体依存性
細胞傷害）を直接関与する。４つのヒトＩｇＧアイソタイプは、異なるレセプター、たと
えば、新生児Ｆｃレセプター、活性化Ｆｃγレセプター、ＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲＩＩａ、
およびＦｃｇＲＩＩＩａ、阻害レセプターＦｃｇＲＩＩｂ、ならびにＣ１ｑに結合して、
非常に異なる活性を生成する。ヒト抗体のＦｃ部分の活性化レセプターおよび阻害レセプ
ターへの親和性は、工学操作して改変可能であることが知られている（Ｓｔｒｏｈｌ Ｗ
．（２００９）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０，ｐ．６８５−６９１
を参照されたい）。

本発明に係る二重特異的結合分子内のＣＤ３特異的結合抗体は、好ましくは、本発明に
係る二重特異的結合分子のｉｎ ｖｉｖｏ半減期の延長を可能にするＦｃ部分を含む。そ
のようなＦｃ部分は、好ましくは、ヒト起源、より好ましくは、ＩｇＧ１抗体のヒトＦｃ
部分、さらにより好ましくは、活性化またはサイレンシングのエフェクター機能を有する
ＩｇＧ１の工学操作ヒトＦｃ部分に由来するものであり、サイレンシングエフェクター機
能は、活性化エフェクター機能よりも好ましい。最も好ましくは、そのようなＦｃ部分は
、カバットＥＵインデックス（Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｇ．ａｎｄ Ｗｕ Ｔ．Ｔ．（２０００
）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８ ｐ ２１４−２１８を参照されたい）に
基づいて番号付けしてＬ２３４およびＬ２３５に突然変異を有するサイレンシングエフェ
クター機能を備えたＩｇＧ１の工学操作ヒトＦｃ部分である。構築物ＣＯＶＡ４２０、Ｃ
ＯＶＡ４２２、およびＣＯＶＡ４６７の調製のために以下の本明細書の実施例で使用され
ている配列番号２および３を有する抗体は、サイレンシングエフェクター機能ならびに位
置Ｌ２３４およびＬ２３５に突然変異を有する抗ＣＤ３抗体である。また、構築物ＣＯＶ
Ａ４９３、ＣＯＶＡ４９４、ＣＯＶＡ４９７、およびＣＯＶＡ４９９の調製のために以下
の本明細書の実施例で使用されている配列番号１７１および１７２を有する抗体は、カバ
ットＥＵインデックス（Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬ．ｅｔ ａｌ（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２７６ ｐ．６５９１−６６０４を参照されたい）に基づいて番号付けして位
置Ｄ２６５およびＰ３２９にサイレンシングエフェクター突然変異を有する抗ＣＤ３抗体
である

抗体およびそのフラグメントを生成するための種々の技術は、当技術分野で周知で記載
であり、たとえば、Ａｌｔｓｈｕｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０に記載されている。し
たがって、ポリクローナル抗体は、添加剤およびアジュバントとの混合物で抗原により免
疫化した後、動物の血液から取得可能であり、モノクローナル抗体は、連続細胞系培養に
より生成された抗体を提供する任意の技術により生成可能である。そのような技術の例は
、たとえば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）および（１９９９）に記載さ
れており、Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５により最初に記載され
たハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（たとえば、Ｋ
ｏｚｂｏｒ，１９８３、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００６を参照されたい）、およびヒトモ
ノクローナル抗体を生成するＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９
８５）を含む。さらに、組換え抗体は、モノクローナル抗体から取得されうるか、または
ファージ、リボソーム、ｍＲＮＡ、細胞ディスプレイなどの種々のディスプレイ方法を用
いて、ｄｅ ｎｏｖｏで調製可能である。組換え体（ヒト化）抗体またはそのフラグメン
トを発現するのに好適な系は、たとえば、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物細胞系、またはト
ランスジェニック動物もしくは植物から選択されうる（たとえば、米国特許第６，０８０
，５６０号明細書、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，２００５を参照されたい
）。さらに、一本鎖抗体の生成のために記載された技術（とくに、米国特許第４，９４６
，７７８号明細書を参照されたい）は、本発明に係る標的に特異的な一本鎖抗体を生成す
るのに適合しうる。ＢＩＡｃｏｒｅシステムで利用される表面プラズモン共鳴を用いて、
ファージ抗体の効率を増加させることが可能である。

本発明に係る二重特異的結合タンパク質は、明快な有機合成戦略、固相支援合成技術な
どの多くの従来の周知の技術のいずれかによりまたは市販の自動合成装置により、調製さ
れうる。一方、従来型の組換え技術単独でまたは従来の合成技術との組合せにより、調製
することも可能である。本発明に係る二重特異的結合分子は、以下で本明細書の（ａ）お
よび（ｂ）に定義された化合物を組み合わせることにより取得されうる。

上述したように、ＣＤ３と癌細胞上の表面標的抗原との両方を認識するいくつかの二重
特異的抗体は、非常に強力な抗腫瘍死滅活性を呈する。したがって、ＢｉＴＥ（登録商標
）抗体は、標的腫瘍抗原を発現する細胞のリダイレクト溶解の高い効力を呈する。ＢｉＴ
Ｅ（登録商標）抗体のＥＣ_５０値は、０．１〜５０ｐＭの範囲である（Ｂａｕｅｒｌｅ
ＰＡ ａｎｄ Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ Ｃ．（２００９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６９（１
２），ｐｐ．４９４１−４９４４）。腫瘍細胞の強力な細胞死滅は、薬理学的に望ましい
効果を発揮するために必要とされる。レビューでは、ＢｉＴＥ（登録商標）方式の強力な
死滅能力は、（１）標的とエフェクター細胞とをごく近接させることにより細胞溶解シナ
プスの形成を可能にするその小サイズ、および（２）標的細胞の不在下でエフェクター細
胞の全身性活性化を予防するＴＣＲ複合体のその１価エンゲージメント、に帰属されると
、Ｒａｄｅｒ Ｃ．により報告されている（Ｒａｄｅｒ Ｃ，（２０１１），Ｂｌｏｏｄ
，１１７（１７），ｐｐ．４４０３−４４０４）。それに加えて、ＢｉＴＥ（登録商標）
クラスの二重特異的抗体は、典型的には、他のＣＤ３二重特異的方式および完全モノクロ
ーナルＩｇＧ１抗体と対比して腫瘍細胞溶解に関して１００〜１０，０００倍の有効性を
有すると、先行技術により記載されている（Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｄｒｕｇ
Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ １０（１８），ｐｐ．１２３７−１２４４）。完全抗体は
また、本発明に係る二重特異的結合分子の一部を形成する。より小さい１価ＢｉＴＥ（登
録商標）方式（５５ｋＤａ）は、より大きい２価ｔａｎｄａｂ（登録商標）方式（約１１
５ｋＤａ）よりもかなり強力であることが、Ｍφｌｈφｊ Ｍ．らによりさらに示された
（特定のアッセイでは２０００倍超）（Ｍφｌｈφｊ Ｍ．ｅｔ ａｌ，（２００７），
Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，４４（８），ｐｐ．１９３５−１９４３）。ＣＤ３へのＢｉＴ
Ｅ（登録商標）の１価結合は、ＢｉＴＥ（登録商標）分子の強力な死滅活性に寄与するこ
とが、著者らにより指摘されている。

要約すると、小さい１価抗ＣＤ３×抗腫瘍抗原の二重特異的抗体方式（たとえば、Ｂｉ
ＴＥ（登録商標）方式）は、大きい２価ＣＤ３二重特異的方式よりも強力なリダイレクト
Ｔ細胞死滅活性を呈することが、先行技術により教示される。したがって、強力な抗腫瘍
死滅は、典型的には、小さい１価ＣＤ３二重特異的方式で取得されるため、先行技術では
、大きい２価ＣＤ３二重特異的方式を使用しないことが推奨される。

驚くべきことに、完全抗ＣＤ３抗体とＦｙｎｏｍｅｒの２つのコピーとからなる二重特
異的結合分子は、腫瘍関連抗原に結合して、強力なリダイレクトＴ細胞死滅活性を媒介し
うることが、本発明との関連で見いだされた。注目すべきこととして、本発明に係る二重
特異的結合分子は、約１６５ｋＤａのサイズを有する。本発明に係る大きい二重特異的結
合分子のＴ細胞媒介細胞傷害性は、予想外なことに、以上で考察された先行技術の教示と
は対照的に、小さい１価ＣＤ３二重特異的分子、すなわち、ＢｉＴＥ（登録商標）方式で
典型的に見られるのと同等の範囲内である。本発明に係るＣＤ３二重特異的結合分子およ
び先行技術の１価ＣＤ３二重特異的分子の両方の非常に強力な抗腫瘍死滅活性を実証する
比較データが、本明細書の実施例に提供される。より特定的には、抗ＣＤ３抗体と、３つ
の異なる腫瘍関連抗原に結合するＦｙｎｏｍｅｒと、からなる融合タンパク質の例が、示
されている。実施例１および図５に示されるように、本発明に係るＣＤ３／ＨＥＲ２二重
特異的分子ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）は、小さい１価二重特異的ｓ
ｃＦｖ対照（配列番号１６７）の細胞傷害有効性と同程度に良好な細胞傷害有効性を示し
、両方とも、２桁のｐＭ範囲内のＥＣ_５０値を有する（それぞれ、８７ｐＭおよび６０ｐ
ＭのＥＣ_５０値）。本発明に係るＥＧＦＲ／ＣＤ３二重特異的分子ＣＯＶＡ４９３（配列
番号１７０および１７２）、ＣＯＶＡ４９４（配列番号１７１および１９８）、ＣＯＶＡ
４９７（配列番号１９９および１７２）、ＣＯＶＡ４９９（配列番号１７１および２００
）が記載されている実施例２、さらには本発明に係るＣＤ３３／ＣＤ３二重特異的分子Ｃ
ＯＶＡ４６７（配列番号２および１７５）が記載されている実施例３は、本発明に係る二
重特異的分子の強力なリダイレクトＴ細胞死滅活性を追加的に示している。それに加えて
、図６は、メディエーターとして富化Ｔ細胞を用いた死滅アッセイで、本発明に係る二重
特異的分子ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）およびＣＯＶＡ４２２（配列
番号１６５および１６６）の両方から、ピコモルのＥＣ_５０値が得られたことを示してい
る（それぞれ、８ｐＭおよび１７５ｐＭ）。さらに、本明細書の実施例より示されるよう
に、本発明に係るＦｙｎｏｍｅｒ−抗体融合体は、二重特異的ｓｃＦｖ対照抗体方式（配
列番号１６７、配列番号１７３、および配列番号１７６）にほぼ匹敵する非常に有利な発
現収量（ＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクション後、２桁のｍｇ／ｌ範囲内）を示す。
それに加えて、本発明に係るＦｙｎｏｍｅｒ−抗体融合体は、有利な生物物理学的性質を
有し、かつ凝集することがなく（図３、図１１、および図１５．Ａ）、しかもｉｎ ｖｉ
ｖｏで長いＩｇＧ様半減期を呈する（図８）。半減期が増加すれば、持続注入の必要がな
く、かつ／または逐次治療の間隔を長くすることができることから、健康管理システムの
コスト負担の低減にも役立つため、その有意な便益が患者に直接もたらされる。毎週２回
の注入後、ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）は、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍モデ
ルで有意な腫瘍成長遅延を呈し、これが、ｓｃＦｖ対照分子（ＣＯＶＡ４４６（配列番号
１６７）、毎日１回注入）と比較して優れていたことから、ＣＯＶＡ４２０の強力な抗腫
瘍有効性がさらに実証される（図９）。

さらに記載のごとく、サイズが小さいため、１価ＣＤ３二重特異的分子は、わずか数時
間の短い血清中半減期により特徴付けられる。したがって、多くの場合、治療される患者
には便利でないポータブルミニポンプを用いて連続静脈内注入により小サイズ１価ＣＤ３
二重特異的分子を投与することが必要である。有利なことに、本発明に係る二重特異的分
子は、全長抗体で典型的に得られるのとほぼ同一の血清中半減期を有し（実施例参照）、
血清中半減期は、１価ＣＤ３二重特異的分子の血清中半減期よりも優れている。１価ＣＤ
３二重特異的分子の他の主要な限界は、Ｆｃレセプターへの結合などの機能性に関連付け
られ抗体の定常領域が欠如していることである。本発明に係る二重特異的分子は、抗ＣＤ
３抗体の定常領域を含む。

したがって、本発明に係るＣＤ３二重特異的結合分子は、１価ＣＤ３二重特異的分子お
よび完全抗ＣＤ３抗体の利点を兼備している。

１価ＣＤ３二重特異的分子、とくにＢｉＴＥ（登録商標）抗体よりも優れた、本発明に
係るＣＤ３二重特異的結合分子の他の利点は、癌細胞で過剰発現される多くの表面標的抗
原が、有意により低レベルであるが、非腫瘍細胞でも発現されるという周知の以上で考察
された事実に基づく。強力なリダイレクトＴ細胞死滅活性を媒介する二重特異的分子は、
理想的には、高レベルの表面抗原を有する癌細胞に対しては選択的にその活性を発揮する
が、低レベルの表面抗原を有する正常細胞に対しては発揮しない。

したがって、ＢｉＴＥ（登録商標）抗体は、腫瘍抗原を発現する細胞のリダイレクト溶
解の高い効力を呈するが、ＢｉＴＥ（登録商標）抗体の主要な欠点の１つは、より低レベ
ルで腫瘍抗原を発現する非腫瘍細胞をかなりの程度まで死滅させることである。たとえば
、抗ＣＤ３／ＥＧＦＲ ＢｉＴＥ（登録商標）は、注入開始の５６時間後以内に３１およ
び１５４μｇ／ｋｇ／ｄの用量でサルにおいて重度の毒性徴候を示すことが、Ｌｕｔｔｅ
ｒｂｕｅｓｅらにより報告された（Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２０１
０）ＰＮＡＳ，ｖｏｌ １０７，ｎｏ．２８，ｐｐ．１２６０５−１２６１０）。３１ま
たは１５４μｇ／ｋｇ／ｄでＣ−ＢｉＴＥを摂取した動物の組織病理学的分析では、肝毒
性および腎毒性の徴候が示された。それは、これらの臓器で低レベルのＥＧＦＲを発現す
る細胞のリダイレクト溶解の結果であると思われる。さらに、著者らは、ＥＧＦＲを発現
することが知られているすべての組織、すなわち、唾液腺、肝臓、胃、小腸、結腸、直腸
、腎臓、副腎、尿管、膀胱、前立腺、および精巣上体での細胞死に注目している。

二重特異的ｓｃＦｖ抗体フラグメントによるＥＧＦＲ発現細胞の非選択的死滅もまた、
以下の本明細書の実施例で確認される。乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞は、ＥＧＦＲをか
なり過剰発現するが、結腸癌ＨＴ２９細胞は、非腫瘍細胞にほとんど等しいＥＧＦＲの発
現レベルを有している（Ｙｉｎｇｊｉｅ ｅｔ ａｌ（２００５）；Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｔｈｅｒ，４（３）：４３５−４４２）。実施例２．３に示されるように、二重特異
的抗ＣＤ３／ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ抗体フラグメント（配列番号１７３）は、高ＥＧＦＲ発
現レベル（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞）さらには低ＥＧＦＲ発現レベル（ＨＴ２９細胞）
を有する細胞の強力なリダイレクト溶解を媒介した。ＥＣ_５０値は、ＭＤＡ−ＭＢ−４６
８細胞およびＨＴ２９細胞の死滅に対して、それぞれ、０．２ｐＭおよび２．５ｐＭであ
った（すなわち、１２．５倍差にすぎない）。したがって、ＥＧＦＲで例示されるように
、二重特異的ｓｃＦｖ抗体フラグメントは、表面腫瘍抗原を過剰発現する細胞に対して選
択的に強力なリダイレクトＴ細胞死滅活性を媒介することができない。非腫瘍細胞のかな
りの望ましくない細胞死滅副作用は、本発明者により、さらには以上で考察された文献Ｌ
ｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ Ｒ．らにより、観測された。

これとは対照的に、驚くべきことに、抗ＣＤ３抗体と、腫瘍関連抗原に結合するＦｙｎ
ｏｍｅｒと、からなる二重特異的結合分子は、抗原を過剰発現する細胞に対して強力なリ
ダイレクトＴ細胞死滅活性を選択的に媒介可能であるが、より低レベルの抗原を有する細
胞は、高濃度であっても死滅されないことを見いだした。実施例２．３に示されるように
、抗ＣＤ３抗体と、ＥＧＦＲに結合するＦｙｎｏｍｅｒの２つのコピーと、からそれぞれ
なる４つの異なる二重特異的結合分子では、高および低ＥＧＦＲ発現細胞間の死滅活性差
は、５８０倍〜＞３’５００倍の範囲内であった。

それに加えて、ＣＤ３とＨＥＲ２発現細胞とを標的とする二重特異的ｓｃＦｖ抗体フラ
グメントはまた、高レベルでさらには低レベルでＨＥＲ２を発現する細胞の両方を非選択
的に死滅させることは、本発明の実施例１．７から明らかである。卵巣癌ＳＫＯＶ−３細
胞は、ＨＥＲ２をかなり過剰発現するが、乳癌ＭＣＦ−７細胞は、かなり低いＨＥＲ２発
現レベルを有する（Ｌａｔｔｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｏｎｃｏｌｏｇｙ
Ｒｅｐｏｒｔｓ，１９：８１１−８１７）。実施例１．７に示されるように、二重特異的
抗ＣＤ３／ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ抗体フラグメント（配列番号１６７）は、高いＨＥＲ２発
現レベル（ＳＫＯＶ−３細胞）さらには低いＨＥＲ２発現レベル（ＭＣＦ−７細胞）を有
する細胞の強力なリダイレクト溶解を媒介した。ＥＣ_５０値は、ＳＫＯＶ−３細胞および
ＭＣＦ−７細胞の死滅に対して、それぞれ、２．３ｐＭおよび５３ｐＭであった（すなわ
ち、２３倍差にすぎない）。したがって、ＣＤ３およびＨＥＲ２に対する二重特異的ｓｃ
Ｆｖ抗体フラグメントもまた、表面腫瘍抗原を過剰発現する細胞に対して選択的に強力な
リダイレクトＴ細胞死滅活性を媒介することができない。この場合も、非腫瘍細胞のかな
りの望ましくない細胞死滅副作用が、本発明者らにより観測されたことから、ＣＤ３およ
びＥＧＦＲに対する二重特異的ｓｃＦｖ抗体フラグメントと関連で得られた結果が確認さ
れる。

この場合もまた、驚くべきことに、抗ＣＤ３抗体と、腫瘍関連抗原すなわちＨＥＲ２に
結合するＦｙｎｏｍｅｒと、からなる二重特異的結合分子は、抗原を過剰発現する細胞に
対して強力なリダイレクトＴ細胞死滅活性を選択的に媒介可能であるが、より低レベルの
抗原を有する細胞は、高濃度であっても死滅されないことを見いだした。抗ＣＤ３抗体と
、ＨＥＲ２に結合するＦｙｎｏｍｅｒの２つのコピーと、からなる二重特異的結合分子（
配列番号１６３および１６４）に関して、実施例１．７および図１０に示されるように、
高および低ＨＥＲ２発現細胞間の死滅活性差は、＞４３１０倍であった。

抗原を過剰発現する腫瘍細胞は選択的死滅を受けるが、正常抗原レベルを有する細胞は
損傷を受けないことから、ＣＤ３ベースの手法の治療ウィンドウが改善されるため、有意
な便益が患者に直接もたらされる。したがって、非腫瘍細胞の望ましくない細胞死滅副作
用は、本発明に係る二重特異的抗体構築物の使用により、最小限に抑えることが可能であ
るか、さらには回避可能である。

本発明の好ましい実施形態によれば、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、テプリズマブ
、オテリキシズマブ、Ｃｒｉｓ−７、またはＳＰ３４である。

抗体のテプリズマブ、オテリキシズマブ（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ Ｌ．（２０１０）６（
３），ｐｐ．１４９−１５７）、Ｃｒｉｓ−７（Ａｌｂｅｒｏｌａ−Ｉｌａ Ｊ．ｅｔ
ａｌ．（１９９１），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４６（４），ｐｐ．１０８５−１０９２）
、およびＳＰ３４は、先行技術から公知である。ＭＧＡ０３１およびｈＯＫＴ３−γ１（
Ａｌａ−Ａｌａ）とも呼ばれるテプリズマブ（ＣＡＳ−Ｎｒ：８７６３８７−０５−２）
は、ヒト化抗ＣＤ３モノクローナル抗体である。テプリズマブは、成熟Ｔリンパ球上に発
現されるＣＤ３ε鎖のエピトープに結合し、そうすることにより、複数の自己免疫疾患の
根底をなす病理学的免疫反応をモジュレートしうる。特定的には、テプリズマブは、望ま
しくないエフェクターＴ細胞を阻害し、有益な調節性Ｔ細胞機能を促進することにより、
免疫寛容を促進しうる。ＴＲＸ_４としても知られるオテリキシズマブ（ＣＡＳ Ｎｒ ８
８１１９１−４４−２）は、同様にＣＤ３のε鎖を標的とする。モノクローナル抗体Ｃｒ
ｉｓ−７は、成熟ヒトＴ細胞上のＣＤ３抗原を認識する。ＣＤ３抗原は、Ｔ細胞レセプタ
ー（ＴＣＲ）およびζ鎖と会合してＴリンパ球中に活性化シグナルを生成する４つの個別
の鎖（ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、および２つのＣＤ３ε）で構成されるタンパク質複合体であ
る。この抗体は、ＢＭＡ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬＳから取得可能である。ＳＰ３４は、Ｂ
Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから取得可能である。

本発明によれば、ＣＤ３に特異的に結合する抗体としてＣｒｉｓ−７またはＳＰ３４の
ヒト化型を使用することが好ましい。

抗体をヒト化する手段および方法は、当技術分野で十分に確立されている。たとえば、
Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ ３３２（６１６２）：
３３２−３２３またはＫａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（１）：
２５−３４を参照されたい。

抗体のテプリズマブおよびオテリキシズマブは、サイレンシングエフェクター機能を有
する抗体である。ＣＤ３に特異的に結合する抗体としてサイレンシングエフェクター機能
を有するＣｒｉｓ−７またはＳＰ３４の改変型を使用されることもまた、好ましい。本明
細書で以下にさらに詳述されるように、サイレンシングエフェクター機能を有する抗体は
、カバットＥＵインデックスに従って番号付けしてＬ２３４とＬ２３５または位置Ｄ２６
５とＰ３２９に突然変異を有することが最も好ましい。ＣＤ３に特異的に結合する抗体と
して、サイレンシングエフェクター機能を有するＣｒｉｓ−７またはＳＰ３４のヒト化型
を利用することが好ましいことをも、理解すべきである。

本発明の好ましい実施形態によれば、抗ＣＤ３抗体は、配列番号２および／または配列
番号３を含むか、または配列番号２および配列番号３を含むかもしくはそれらからなる。

本明細書全体を通して、配列番号２および配列番号３は、それぞれ、抗ＣＤ３抗体のＶ
_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域であることを理解すべきである。本発明に係る抗ＣＤ３抗体が配列
番号２のＶ_Ｈ領域を含むが、配列番号３のＶ_Ｌ領域を同時に含まない場合、抗ＣＤ３抗体
は、配列番号３以外の抗ＣＤ３抗体のＶ_Ｌ領域を含むことを理解すべきである。同様に、
本発明に係る抗ＣＤ３抗体が配列番号３のＶ_Ｌ領域を含むが、配列番号２のＶ_Ｈ領域を同
時に含まない場合、抗ＣＤ３抗体は、配列番号２以外の抗ＣＤ３抗体のＶ_Ｈ領域を含むこ
とを理解すべきである。

本発明の他の好ましい実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、配列番号１７１および／または
配列番号１７２を含むか、または配列番号１７１および配列番号１７２を含むかもしくは
それらからなる。

本明細書全体を通して、配列番号１７１および配列番号１７２は、それぞれ、抗ＣＤ３
抗体のＶ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域であることを理解すべきである。本発明に係る抗ＣＤ３抗
体が配列番号１７１のＶ_Ｈ領域を含むが、配列番号１７２のＶ_Ｌ領域を同時に含まない場
合、抗ＣＤ３抗体は、配列番号１７２以外の抗ＣＤ３抗体のＶ_Ｌ領域を含むことを理解す
べきである。同様に、本発明に係る抗ＣＤ３抗体が配列番号１７２のＶ_Ｌ領域を含むが、
配列番号１７１のＶ_Ｈ領域を同時に含まない場合、抗ＣＤ３抗体は、配列番号１７１以外
の抗ＣＤ３抗体のＶ_Ｈ領域を含むことを理解すべきである。

以下の本明細書の実施例から明らかなように、配列番号２および配列番号３を含む抗Ｃ
Ｄ３抗体ならびに配列番号１７１および配列番号１７２を含む抗ＣＤ３抗体は、本発明を
例示するために使用されている。

本発明のさらなる好ましい実施形態によれば、結合分子は、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＥＧ
ＦＲ、ＣＥＡ、ＥＰＨＡ２、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ＩＧＦＲ
１、ＣＤ３３、線維芽細胞活性化タンパク質α、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ｃ−Ｍ
ＥＴ、ＥｐＣＡＭ、またはＰＳＭＡに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペ
プチドを含む。このリスト内では、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、およびＣＤ３３が最も好ましい
。３つの標的のこのリスト中では、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２が好ましく、ＥＧＦＲが最も
好ましい。

したがって、本発明に係る好ましい結合分子は、ＨＥＲ２に特異的に結合する２つのＦ
ｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号２および／または配列番号３を含む
か、ＣＤ１９に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配
列番号２および／または配列番号３を含むか、ＥＧＦＲに特異的に結合する２つのＦｙｎ
−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号２および／または配列番号３を含むか、
ＣＥＡに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号
２および／または配列番号３を含むか、ＥＰＨＡ２に特異的に結合する２つのＦｙｎ−Ｓ
Ｈ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号２および／または配列番号３を含むか、黒色
腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカンに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由
来ポリペプチドを含み、かつ配列番号２および／または配列番号３を含むか、ＩＧＦＲ１
に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号２およ
び／または配列番号３を含むか、ＣＤ３３に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来
ポリペプチドを含み、かつ配列番号２および／または配列番号３を含むか、線維芽細胞活
性化タンパク質αに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、か
つ配列番号２および／または配列番号３を含むか、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）に特異
的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号２および／ま
たは配列番号３を含むか、ｃ−ＭＥＴに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリ
ペプチドを含み、かつ配列番号２および／または配列番号３を含むか、ＥｐＣＡＭに特異
的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号２および／ま
たは配列番号３を含むか、またはＰＳＭＡに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来
ポリペプチドを含み、かつ配列番号２および／または配列番号３を含む。

同様に、本発明に係る好ましい結合分子は、ＨＥＲ２に特異的に結合する２つのＦｙｎ
−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号１７１および／または配列番号１７２を
含むか、ＣＤ１９に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、か
つ配列番号１７１および／または配列番号１７２を含むか、ＥＧＦＲに特異的に結合する
２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号１７１および／または配列
番号１７２を含むか、ＣＥＡに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチド
を含み、かつ配列番号１７１および／または配列番号１７２を含むか、ＥＰＨＡ２に特異
的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号１７１および
／または配列番号１７２を含むか、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカンに特
異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号１７１およ
び／または配列番号１７２を含むか、ＩＧＦＲ１に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ
３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号１７１および／または配列番号１７２を含むか
、ＣＤ３３に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列
番号１７１および／または配列番号１７２を含むか、線維芽細胞活性化タンパク質αに特
異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号１７１およ
び／または配列番号１７２を含むか、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）に特異的に結合する
２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号１７１および／または配列
番号１７２を含むか、ｃ−ＭＥＴに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプ
チドを含み、かつ配列番号１７１および／または配列番号１７２を含むか、ＥｐＣＡＭに
特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号１７１お
よび／または配列番号１７２を含むか、またはＰＳＭＡに特異的に結合する２つのＦｙｎ
−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、かつ配列番号１７１および／または配列番号１７２を
含む。

以上で考察されたタンパク質および抗原は、癌細胞上に発現される表面標的抗原である
かまたはそれを含むことが、当技術分野で十分に特徴付けられている。

Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２、ＣＤ３４０（分化クラスター３４０）、またはｐ１８５として
も知られるＨＥＲ２（ヒト表皮成長因子レセプター２）は、ヒトにおいてＥＲＢＢ２遺伝
子によりコードされるタンパク質である。ＨＥＲ２は、１９８４年に初めて記載された１
８５ｋＤａレセプターである（Ｓｃｈｌｅｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｎａｔｕ
ｒｅ ３１２：５１３−５１６）。ＨＥＲ２は、表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ／Ｅ
ｒｂＢ）ファミリーのメンバーである。ヒトＨＥＲ２は、ＮＣＢＩ参照：ＮＰ＿００４４
３９により表される。この遺伝子の増幅または過剰発現は、特定の侵攻性タイプの乳癌の
病理発生および進行で重要な役割を果たすことが示されてきており、近年、発展して疾患
に対する重要なバイオマーカーおよび療法標的になってきた。他のＨＥＲ２陽性腫瘍とし
ては、卵巣癌および胃癌が挙げられる。

Ｂリンパ球抗原ＣＤ１９またはＣＤ１９（分化クラスター１９）は、ヒトにおいてＣＤ
１９遺伝子によりコードされるタンパク質である（ＮＣＢＩ参照：ＮＰ＿００１１７１５
６９）。ＣＤ１９は、Ｂ細胞の顕著な特徴であるため、このタンパク質は、Ｂ−ＡＬＬお
よび非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含めて、このタイプの細胞から生じる癌、とくに、
Ｂ細胞性リンパ腫を診断するためにおよびその治療標的として使用されてきた。

表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−１、ヒトではＨＥＲ１）は、細胞外タ
ンパク質リガンドの表皮成長因子ファミリー（ＥＧＦファミリー）のメンバーに対する細
胞表面レセプターである（ＮＣＢＩ参照：ＮＰ＿００５２１９）。ＥＧＦＲは、肺癌、頭
頸部癌、および結腸直腸癌でのその役割が知られている。

癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、細胞接着に関与する糖タンパク質である（ＮＣＢＩ参照：
ＡＡＡ６６１８６）。結腸直腸癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、および乳癌の個体、さらには髄
様甲状腺癌の個体からの血清は、健常者よりも高レベルのＣＥＡを有する（２．５ｎｇ／
ｍｌ超）ことが判明した。

ＥＰＨレセプターＡ２（エフリンＡ型レセプター２）は、ヒトにおいてＥＰＨＡ２遺伝
子によりコードされるタンパク質である（ＮＣＢＩ参照：ＡＡＨ３７１６６）。癌におけ
るＥＰＨＡ２の役割は、たとえば、Ｋｉｎｃｈ ＭＳ，Ｃａｒｌｅｓ−Ｋｉｎｃｈ Ｋ（
２００３）．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ２０（１）：５９−６８から公
知である。ＥｐｈＡ２は、皮膚黒色腫を含めて多くの癌タイプで過剰発現されることが、
研究で報告されてきた。ＥｐｈＡ２は、リガンド非依存的に神経膠腫細胞および前立腺癌
細胞の移動を促進することが報告された（Ｕｄａｙａｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ（２０１１
），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３０：４９２１−４９２９）。

黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）またはニューロン−グリ
ア抗原２（ＮＧ２）としても知られるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＮＣＢＩ
参照：ＮＰ＿００１８８８）は、ヒトにおいてＣＳＰＧ４遺伝子によりコードされるコン
ドロイチン硫酸プロテオグリカンである。ＣＳＰＧ４は、内皮基底膜上に広がる黒色腫細
胞の初期イベント時に細胞基質間相互作用を安定化させる役割を果たす。それは、ヒト悪
性黒色腫細胞により発現される内在性膜コンドロイチン硫酸プロテオグリカンである。

インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）レセプター（ＮＣＢＩ参照：Ｐ０８０６９）は
、ヒト細胞表面上に見いだされるタンパク質である。それは、インスリン様成長因子１（
ＩＧＦ−１）と呼ばれるホルモンおよびＩＧＦ−２と呼ばれる関連ホルモンにより活性化
される膜貫通レセプターである。ＩＧＦ−１Ｒは、乳癌、前立腺癌、および肺癌を含めて
、いくつかの癌に関与する。

ＣＤ３３またはＳｉｇｌｅｃ−３は、骨髄系列の細胞上に発現される膜貫通レセプター
である。ＣＤ３３は、急性骨髄性白血病の治療標的として使用可能である。ヒトＣＤ３３
は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１７６３．３）により表され、当技術分野では、たと
えば、Ｒａｐｏｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ ５２（６
）：１０９８−１１０７に記載されている。

セプラーゼまたは１７０ｋＤａ黒色腫膜結合ゼラチナーゼとしても知られる線維芽細胞
活性化タンパク質（ＮＣＢＩ参照：ＡＡＢ４９６５２）α（ＦＡＰ）は、ヒトにおいてＦ
ＡＰ遺伝子によりコードされるタンパク質である。それは、上皮癌の反応性間質線維芽細
胞、創傷治癒の肉芽組織、ならびに骨肉腫および軟部組織肉腫の悪性細胞で選択的に発現
される。

前立腺幹細胞抗原（ＮＣＢＩ参照番号：ＡＡＣ３９６０７）は、ヒトにおいてＰＳＣＡ
遺伝子によりコードされるタンパク質である。この遺伝子は、大部分の前立腺癌でアップ
レギュレートされ、膀胱癌および膵臓癌でも検出される。

ｃ−Ｍｅｔ（ＭＥＴまたはＭＮＮＧ ＨＯＳトランスフォーミング遺伝子）は、肝細胞
成長因子レセプター（ＨＧＦＲ）として知られるタンパク質をコードする癌原遺伝子であ
る（ＮＣＢＩ参照：ＮＰ＿０００２３６）。癌での異常なＭＥＴ活性化は、予後不良と相
関し、異常に活性なＭＥＴは、腫瘍成長、栄養素を腫瘍に供給する新しい血管の形成、お
よび他の器官への癌の広がりをトリガーする。ＭＥＴは、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、胃癌、
乳癌、および脳癌を含めて、多くのタイプのヒト悪性腫瘍でデレギュレートされる。

上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）は、ヒトにおいてＥＰＣＡＭ遺伝子によりコードされ
るタンパク質である。ＥｐＣＡＭは、ほとんどすべての癌腫上に発現される汎上皮分化抗
原である。ヒトＥｐＣＡＭは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号：Ｐ
１６４２２．２（刊行日２０１２年２月２２日）により表され、当技術分野では、たとえ
ば、Ｓｔｒｎａｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４９（２）：３１
４−３１７に記載されている。

前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）（グルタメートカルボキシペプチダーゼＩＩとしても
知られる）（ＮＣＢＩ参照：ＡＡＡ６０２０９）は、前立腺組織および少数の他の組織に
見いだされる２型内在性膜糖タンパク質である。それは、前立腺癌の治療標的である。

以上から明らかなように、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＥＰＨＡ２、黒色
腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ＩＧＦＲ１、ＣＤ３３、線維芽細胞活性化
タンパク質α、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ｃ−ＭＥＴ、ＥｐＣＡＭ、またはＰＳＭ
Ａのそれぞれは、特定の癌タイプの病理発生および治療に関与する。本発明に係る結合分
子が、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＥＰＨＡ２、黒色腫関連コンドロイチン
硫酸プロテオグリカン、ＩＧＦＲ１、ＣＤ３３、線維芽細胞活性化タンパク質α、前立腺
幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ｃ−ＭＥＴ、ＥｐＣＡＭ、またはＰＳＭＡに特異的に結合する
２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含む場合、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、Ｃ
ＥＡ、ＥＰＨＡ２、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ＩＧＦＲ１、ＣＤ
３３、線維芽細胞活性化タンパク質α、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ｃ−ＭＥＴ、Ｅ
ｐＣＡＭ、またはＰＳＭＡの過剰発現に関連付けられる癌をそれぞれ治療するために、そ
れぞれの結合分子を使用することが好ましい。

本発明に係る結合分子は、ＨＥＲ２に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリ
ペプチドを含みうる。ただし、（ｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つ
の重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２
つの重鎖の第２のＮ末端に結合される（すなわち、別の言い方をすれば、前記２つのポリ
ペプチドの第１のコピーは、前記抗体の第１の重鎖のＮ末端に結合され、かつ前記２つの
ポリペプチドの第２のコピーは、前記抗体の第２の重鎖のＮ末端に結合される）か、（ｉ
ｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され
、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＣ末端に結合さ
れるか、（ｉｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ
末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２の
Ｎ末端に結合されるか、または（ｉｖ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２
つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の
２つの軽鎖の第２のＣ末端に結合される。

以上の選択肢との関連では、結合分子は、ＨＥＲ２に特異的に結合する２つのＦｙｎ−
ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重
鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの
重鎖の第２のＮ末端に結合されることが好ましい。

ＨＥＲ２への特異的結合とは、本発明に係るポリペプチドがＨＥＲ２には特異的に結合
するが、ＥＧＦＲなどの他の関連タンパク質には特異的に結合しないことを意味する。「
ＨＥＲ２に特異的に結合するポリペプチド」は、好ましくは、「ＨＥＲ２の活性を阻害す
るポリペプチド」である。そのようなポリペプチドは、ＨＥＲ２の活性を低減するかまた
は完全に消失する能力を有する。その活性については、本明細書の以上に詳細に記載され
ている。これに関連して、ＨＥＲ２活性を阻害するとは、レセプターのそのリガンドへの
結合を阻害することを意味することが好ましい。好ましい順に、ポリペプチドは、ＨＥＲ
２の活性を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％
、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なく
とも９０％、少なくとも９５％、または１００％阻害することがさらに好ましい。また、
好ましい順に、本発明に係るポリペプチドによるＨＥＲ２の阻害に対するＩＣ５０値は、
１０００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下
、１００ｎＭ以下、または７５ｎＭ以下であることが好ましい。好ましくは、本発明に係
るポリペプチドは、ＦＡＣＳにより決定したときに１０^−７〜１０^−１２Ｍ、より好まし
くは１０^−８〜１０^−１２Ｍ、最も好ましくは１０^−９〜１０^−１２ＭのＥＣ_５０値でＨ
ＥＲ２に結合する。

ＨＥＲ２に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、好ましくは、
ＨＥＲ２の同一エピトープに結合する。以下の本明細書の実施例から明らかなように、抗
ＨＥＲ２結合Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）Ｃ１２（配列番号４）は、本発明を例示するた
めに使用されている。したがって、結合分子は、配列番号４の２つのコピーを含むことが
好ましい。

したがって、ＨＥＲ２に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、好まし
い順に、配列番号４（Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）Ｃ１２）のアミノ酸配列に対して、少
なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも
８５％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％の配列同一性を有することが好まし
い。

より好ましくは、ＨＥＲ２に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、以
下の式Ｉを有する。ただし、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なく
とも８５％の配列同一性を有し、同一性の決定では、配列番号１のアミノ酸位置１２〜１
７および３１〜３４が除外されること、を条件とする。

ＧＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０ＬＳＦＨＫＧＥ
ＫＦＱＩＬＸ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６ＧＸ_１７ＷＷＸ_１８ＡＲＳＬＴＴＧＥ
Ｘ_１９ＧＸ_２０ＩＰＳＸ_２１ＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（式Ｉ）
式中、Ｘ_１〜Ｘ_７、Ｘ_１１〜Ｘ_１３、およびＸ_１７〜Ｘ_２１は、それぞれ独立して、Ｇ
、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｐ、Ｎ、および
Ｃから、より好ましくは、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、
Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｐ、およびＮから選択され、かつＸ_８〜Ｘ_１０およびＸ_１４〜Ｘ_１６は、そ
れぞれ独立して、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、
Ｍ、Ｐ、Ｎ、およびＣから、より好ましくは、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ
、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｐ、およびＮから選択され、またはＸ_８〜Ｘ_１０および
Ｘ_１４〜Ｘ_１６の１つ以上は、不在である（それぞれ、配列番号５または好ましくは配列
番号１６８）。また、本発明に係る結合分子は、配列番号５の２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来
ポリペプチドを含むかまたはそれからなり、前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体
の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗
体の２つの重鎖の第２のＮ末端ならびに配列番号２および配列番号３の抗ＣＤ３抗体に結
合されることが好ましい。同様に、本発明に係る結合分子は、配列番号１６８の２つのＦ
ｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含むかまたはそれからなり、前記２つのポリペプチドの
第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチド
の第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端ならびに配列番号２および配列番号３の
抗ＣＤ３抗体に結合されることが好ましい。

さらにより好ましくは、
Ｘ_１は、Ｔ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｙ、Ｖ、Ｗ、Ｎ、Ｓ、Ｆ、またはＫから選択され、
Ｘ_２は、Ｓ、Ａ、Ｒ、またはＴから選択され、
Ｘ_３は、Ｙ、Ｒ、Ｈ、Ｔ、Ｎ、Ｖ、Ｗ、またはＳから選択され、
Ｘ_４は、Ｎ、Ｄ、Ｍ、Ｙ、Ｒ、Ｐ、Ｅ、Ｌ、Ｈ、Ｔ、Ｇ、またはＦから選択され、
Ｘ_５は、Ｔ、Ｓ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｍ、Ｎ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、またはＥから選
択され、
Ｘ_６は、Ｒ、Ｍ、Ｋ、Ｄ、Ｆ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、Ｓ、Ｐ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｌ、Ａ、またはＰか
ら選択され、
Ｘ_７は、Ｄ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｈ、Ｎ、Ｒ、Ｆ、Ｓ、またはＡから選択され、
Ｘ_８は、Ｇ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、もしくはＹから選択されるかまたは不在であり、
Ｘ_９は、Ｑ、Ｄ、Ｓ、Ｈから選択されるかまたは不在であり、
Ｘ_１０は、Ｄ、Ｖから選択されるかまたは不在であり、
Ｘ_１１は、Ｒ、Ｋ、Ｑ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ｗ、Ｍ、Ｈ、Ｌ、Ｆ、Ｅ、Ｔ、Ｐ、Ａ、Ｄ、また
はＶから選択され、
Ｘ_１２は、Ｍ、Ｒ、Ｅ、Ｇ、Ｎ、Ｄ、Ｓ、Ａ、Ｑ、Ｆ、Ｐ、Ｋ、Ｙ、Ｔ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、
またはＷから選択され、
Ｘ_１３は、Ｅ、Ｗ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、Ｖ、Ｎ、Ｄ、Ｈ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ａ、Ｙ、Ｌ、また
はＭから選択され、
Ｘ_１４は、Ｄ、Ｒ、Ｑ、Ｓ、Ａ、Ｎ、Ｐ、Ｉ、Ｈ、Ｔ、Ｙ、Ｅ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｖ、Ｉ、
Ｗから選択されるかまたは不在であり、
Ｘ_１５は、Ｇ、Ｓ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｔ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｐ、Ｋ、Ｍ、Ｈ、Ｙから選
択されるかまたは不在であり、
Ｘ_１６は、Ｋ、Ｇ、Ｒ、Ａ、Ｔ、Ｖ、Ｓ、Ｉ、Ｅ、Ｑ、Ｐ、Ｄ、Ｎ、Ｈから選択される
かまたは不在であり、
Ｘ_１７は、Ｖ、Ｄ、Ｔ、Ｉ、またはＹから選択され、
Ｘ_１８は、Ｅ、Ａ、Ｒ、Ｔ、またはＱから選択され、
Ｘ_１９は、Ｔ、Ｉ、またはＶから選択され、
Ｘ_２０は、Ｙ、Ｌ、またはＦから選択され、かつ
Ｘ_２１は、ＮまたはＳから選択される（配列番号６）。

同様に、本発明に係る結合分子は、配列番号６の２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチ
ドを含むかまたはそれからなり、前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重
鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの
重鎖の第２のＮ末端ならびに配列番号２および配列番号３の抗ＣＤ３抗体に結合されるこ
とがさらに好ましい。

他のより好ましい実施形態では、式Ｉ中の残基Ｘは、独立して、次のものから選択され
る。すなわち、Ｘ_１〜Ｘ_１０は、ＴＳＹＮＴＲＤであり（すなわち、Ｘ_８〜Ｘ_１０は、不
在である；配列番号７）、Ｘ_１１〜Ｘ_１６は、ＲＭＥＤであり（すなわち、Ｘ_１４〜Ｘ_１
６は、不在である；配列番号８）、Ｘ_１７は、Ｖであり、Ｘ_１８は、Ｅであり、Ｘ_１９は
、Ｔであり、Ｘ_２０は、Ｙであり、かつ／またはＸ_２１は、Ｎである。したがって、本発
明に係る結合分子は、式Ｉの２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含むかまたはそれ
からなり、式Ｉ中の残基Ｘは、独立して、次のものから選択されることがさらに好ましい
。すなわち、Ｘ_１〜Ｘ_１０は、ＴＳＹＮＴＲＤであり（すなわち、Ｘ_８〜Ｘ_１０は、不在
である；配列番号７）、Ｘ_１１〜Ｘ_１６は、ＲＭＥＤであり（すなわち、Ｘ_１４〜Ｘ_１６
は、不在である；配列番号８）、Ｘ_１７は、Ｖであり、Ｘ_１８は、Ｅであり、Ｘ_１９は、
Ｔであり、Ｘ_２０は、Ｙであり、かつ／またはＸ_２１は、Ｎであり、前記２つのポリペプ
チドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペ
プチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端ならびに配列番号２および配列番
号３の抗ＣＤ３抗体に結合される。また、上述した特定の残基Ｘ_１１〜Ｘ_２１は、組み合
わせて使用されることが好ましい。

好ましくは、配列番号４のアミノ酸配列に対して、好ましい順に、少なくとも６５％、
少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくと
も９０％、および少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれ
らからなる、ＨＥＲ２に特異的に結合する以上に定義されたＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプ
チドは、配列番号４からなる結合（ポリ）ペプチドの結合能を保持するかまたは本質的に
保持する。すなわち、それぞれの標的エピトープに結合する強度（たとえば、解離定数に
より決定される）は、保持されるかまたは本質的に保持される。ＨＥＲ２に特異的に結合
するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドの結合能は、その結合能の少なくとも６０％が保持
されるのであれば、本質的に保持される。好ましくは、その結合能の少なくとも７５％、
より好ましくは少なくとも８０％は、保持される。より好ましくは、結合能の少なくとも
９０％、たとえば、少なくとも９５％、さらにより好ましくは、少なくとも９８％、たと
えば、少なくとも９９％が保持される。最も好ましくは、結合能は、完全に、すなわち、
１００％保持される。

ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドＣ１２（配列番号４）は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ
）により決定したとき、ＨＥＲ２上のその特異的エピトープに対して７×１０^−８Ｍの解
離定数を有する。このために、たとえば、ＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップ上に固定されて
いるＨｉｓタグ特異的抗体により、ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドを捕獲する。特異的エ
ピトープを含有する抗原を注入した後、複合体の形成をモニターし、ＢＩＡｃｏｒｅ評価
ソフトウェアを用いて曲線当てはめを行うことにより、会合速度定数（ｋ_ｏｎ）または解
離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）または解離定数（Ｋ_Ｄ）を取得する。したがって、配列番号４の
アミノ酸配列に対して、好ましい順に、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくと
も７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、および少なくとも
９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれらからなる結合（ポリ）ペプ
チドの結合能は、ＨＥＲ２結合に対して、好ましくは同一の条件下で、少なくとも１×１
０^−６Ｍ、好ましくは少なくとも１×１０^−７Ｍの解離定数が保持されるのであれば、本
質的に保持される。また、配列番号４からなる結合（ポリ）ペプチドと比較して増加した
結合能、すなわち、１００％超の活性を有する結合（ポリ）ペプチド）も、本発明に係る
ものである。たとえば、本明細書では、少なくとも１×１０^−８Ｍ、たとえば、少なくと
も１×１０^−９Ｍなど、より好ましくは少なくとも１×１０^−１０Ｍ、たとえば、少なく
とも１×１０^−１１Ｍなど、さらにより好ましくは少なくとも１×１０^−１２Ｍ、最も好
ましくは少なくとも１×１０^−１３Ｍの解離定数を有する結合（ポリ）ペプチドが、想定
される。結合能を評価する方法は、当技術分野で周知であり、限定されるものではないが
、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術またはＥＬＩＳＡを含む。

本発明の他の好ましい実施形態では、ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチド（すなわち、抗Ｃ
Ｄ３抗体を含まないポリペプチド）は、配列番号４および９〜１５９からなる群から選択
される配列を有する。ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドは、最も好ましくは、Ｃ１２（配列
番号４）である。したがって、本発明に係る結合分子はまた、配列番号４および９〜１５
９（配列番号４が最も好ましい）からなる群から選択される２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポ
リペプチドを含み、前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ
末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２の
Ｎ末端ならびに配列番号２および配列番号３の抗ＣＤ３抗体に結合されることが好ましい
。

したがって、Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドが、ＨＥＲ２に特異的に結合するＦｙｎ
−ＳＨ３由来ポリペプチドである、以上の実施形態では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体
は、配列番号２および／または３を含むことがとくに好ましい。

本発明の他の好ましい実施形態によれば、ＣＤ３に特異的に結合する抗体およびＦｙｎ
−ＳＨ３由来ポリペプチドは、リンカーにより結合される。本発明に係る二重特異的結合
分子が２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドとＣＤ３特異的結合抗体とを含むかまたは
それからなる場合、第１のＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、ＣＤ３特異的結合抗体に
リンカーにより結合され、かつ第２のＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、ＣＤ３特異的
結合抗体にリンカーにより結合される。

本発明に従って用いられる「リンカー」という用語は、ＣＤ３特異的結合抗体と本発明
に係るＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドとを分離する一連のアミノ酸（すなわち、ペプチ
ドリンカー）さらには非ペプチドリンカーを意味する。本結合分子が単一ポリペプチド鎖
を含む場合、リンカーがペプチドリンカーであることは、分かるであろう。

リンカーの性質、すなわち、長さおよび／または組成（たとえば、アミノ酸配列など）
は、二重特異的分子の安定性および／または溶解性の改変または向上を行いうる。それは
、得られた結合分子の可撓性の向上および／または立体障害の低減による標的抗原への結
合の改善を行いうる。リンカーの長さおよび組成は、本発明に係る結合分子のそれぞれの
結合（ポリ）ペプチドの組成に依存する。当業者であれば、さまざまなリンカーの適合性
の試験方法を熟知している。たとえば、結合分子の性質は、さまざまなタイプのリンカー
を使用したときのその結合親和性を分析することにより、容易に試験可能である。それに
加えて、各結合（ポリ）ペプチドに対してそれぞれの測定を単独で行って、結合分子への
結合親和性を比較しうる。得られた分子の安定性は、当技術分野で公知の方法により、た
とえば、ヒト血清中３７℃で種々の時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡ法を用いて分
子の残留結合能を決定するなどにより、測定可能である。

本発明に従って用いられる「非ペプチドリンカー」という用語は、ペプチドリンカーを
除いて２つ以上の反応基を有する結合基を意味する。たとえば、非ペプチドリンカーは、
本発明に係る分子の結合部分の反応基、たとえば、アミノ末端、リシン残基、ヒスチジン
残基、またはシステイン残基に個別に結合する反応基を両末端に有するポリマー、たとえ
ば、ポリエチレングリコールなどでありうる。非ペプチドリンカーの反応基としては、ヒ
ドロキシル基、アルデヒド基、プロピオン酸のアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレ
イミド基、ケトン基、ビニルスルホン基、チオール基、ヒドラジド基、カルボニルジミダ
ゾール（ＣＤＩ）基、ニトロフェニルカーボネート（ＮＰＣ）基、トリシレート基、イソ
シアネート基、およびスクシンイミド誘導体が挙げられる。スクシンイミド誘導体の例と
しては、スクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ）、スクシンイミジルブタン酸（ＳＢ
Ａ）、スクシンイミジルカルボキシメチラート（ＳＣＭ）、スクシンイミジルスクシンア
ミド（ＳＳＡ）、スクシンイミジルスクシネート（ＳＳ）、スクシンイミジルカーボネー
ト、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）が挙げられる。非ペプチドポリマー
の両末端の反応基は、同一であっても異なっていてもよい。たとえば、非ペプチドポリマ
ーは、一方の末端にマレイミド基および他方の末端にアルデヒド基を有しうる。好ましく
は、ポリマーはポリエチレングリコールである。

好ましい選択肢としては、ペプチド性（またはペプチド）リンカー、より特定的には、
２〜３０アミノ酸の長さを有するオリゴペプチドが挙げられる。単一のアミノ酸の使用も
また、意図的に想定される。ペプチドリンカーの好ましい長さ範囲は、５〜１５アミノ酸
である。他の好ましい長さは、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４
、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸である。

とくに好ましいのは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少な
くとも８０％、少なくとも９０％、または１００％の小アミノ酸、たとえば、グリシン、
セリン、およびアラニンに一致するペプチドのリンカーである。とくに好ましいのは、グ
リシンおよびセリンのみからなるリンカーである。最も好ましいのは、配列番号１６０〜
１６２のリンカーであり、とくに好ましいリンカーは、配列番号１６２の配列からなるペ
プチドのリンカーである。

本発明のより好ましい実施形態によれば、リンカーはペプチドリンカーである。本発明
のさらにより好ましい実施形態によれば、リンカーは、配列番号１６２、１６０、および
１６１からなる群から選択される配列を有する。配列番号１６２のリンカーが最も好まし
い。

Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドが、ＨＥＲ２に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来
ポリペプチドである、以上の実施形態では、それに加えて、ＣＤ３に特異的に結合する抗
体およびＨＥＲ２に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、配列番
号１６２を含むリンカーにより結合されることが、とくに好ましい。

以下の本明細書の実施例から明らかなように、配列番号１６２を有するリンカーを介し
て、配列番号２および配列番号３を含む抗体をＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標）Ｃ１２（配列
番号４）に融合させた。前記抗体の重鎖のＣ末端（ＣＯＶＡ４２２）さらにはＮ末端（Ｃ
ＯＶＡ４２０）への融合体を生成した。

本発明のさらなる好ましい実施形態によれば、結合分子は、ＥＧＦＲに特異的に結合す
る２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含む。ただし、（ｉ）前記２つのポリペプチ
ドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプ
チドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端に結合されるか、（ｉｉ）前記２つ
のポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２
つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＣ末端に結合されるか、（ｉ
ｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に結合さ
れ、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＮ末端に結合
されるか、または（ｉｖ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第
１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の
第２のＣ末端に結合される。

ＥＧＦＲへの特異的結合とは、本発明に係るポリペプチドがＥＧＦＲには特異的に結合
するが、ＨＥＲ２などの他の関連タンパク質には特異的に結合しないことを意味する。「
ＥＧＦＲに特異的に結合するポリペプチド」は、好ましくは、「ＥＧＦＲの活性を阻害す
るポリペプチド」である。そのようなポリペプチドは、ＥＧＦＲの活性を低減するかまた
は完全に消失する能力を有する。その活性については、本明細書の以上に詳細に記載され
ている。これに関連して、ＥＧＦＲ活性を阻害するとは、レセプターのそのリガンドへの
結合を阻害することを意味することが好ましい。好ましい順に、ポリペプチドは、ＥＧＦ
Ｒの活性を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％
、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なく
とも９０％、少なくとも９５％、または１００％阻害することがさらに好ましい。また、
好ましい順に、本発明に係るポリペプチドによるＥＧＦＲの阻害に対するＩＣ５０値は、
１０００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下
、１００ｎＭ以下、または７５ｎＭ以下であることが好ましい。好ましくは、本発明に係
るポリペプチドは、ＦＡＣＳにより決定したときに１０^−７〜１０^−１２Ｍ、より好まし
くは１０^−８〜１０^−１２Ｍ、最も好ましくは１０^−９〜１０^−１２ＭのＥＣ_５０値でＥ
ＧＦＲに結合する。

ＥＧＦＲに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、好ましくは、
ＥＧＦＲの同一エピトープに結合する。以下の本明細書の実施例から明らかなように、抗
ＥＧＦＲ結合Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）ＥＲ７Ｌ２Ｄ６（配列番号１６９）およびＥＲ
９Ｌ３Ｄ７（配列番号１８７）は、本発明を例示するために使用されている。したがって
、結合分子は、配列番号１６９または配列番号１８７の２つのコピーを含むことが好まし
い。

ＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、好ましい順に、配列
番号１６９（Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）ＥＲ７Ｌ２Ｄ６）またはＥＲ９Ｌ３Ｄ７（配列
番号１８７）のアミノ酸配列に対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくと
も７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、および少なくとも
９５％の配列同一性を有することが好ましい。また、ＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ
−ＳＨ３由来ポリペプチドは、（ａ）ＧＶＴＬＦＶＡＸ_１ＹＤＹＥＡＲＧＬＸ_２ＲＸ_３Ｆ
ＤＬＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬＸ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８ＧＤＷＷＥＡＲＳＬＴＴＧＥＴＧＹＩ
ＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（式ＩＩ）（式中、アミノ酸位置Ｘ_１〜Ｘ_８は、任意のアミノ
酸配列であり、かつアミノ位置Ｘ_４〜Ｘ_８の１つは、任意選択で不在である）、および（
ｂ）（ａ）のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、よ
り好ましくは少なくとも９５％の同一性であるアミノ酸配列であって、同一性の決定では
、アミノ酸位置Ｘ_３〜Ｘ_７が除外され、ただし、式（ＩＩ）のアミノ酸位置１２〜２０中
、アミノ酸配列ＥＡＲＧＬＸ_２ＲＸ_３Ｆ（配列番号２０９）、好ましくはＮまたはＨであ
るＸ_２、および好ましくはＭまたはＬであるＸ_３（配列番号２０４）は、保存されること
を条件とする、アミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそ
れからなることが好ましい。

より好ましくは、ＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、次
式ＩＩを有する。ただし、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくと
も８５％の配列同一性を有し、同一性の決定では、配列番号１のアミノ酸位置１２〜１７
および３１〜３４が除外されること、を条件とする。これに関連して、以下の式ＩＩ中、
配列番号１のアミノ酸位置１２〜１７は、配列番号１のＲＴループ中への３つのアミノ酸
の付加に起因してアミノ酸位置１２〜２０に対応することに留意されたい。

ＧＶＴＬＦＶＡＸ_１ＹＤＹＥＡＲＧＬＸ_２ＲＸ_３ＦＤＬＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬＸ_４Ｘ
_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８ＧＤＷＷＥＡＲＳＬＴＴＧＥＴＧＹＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（式ＩＩ
）、
式中、
Ｘ_１〜Ｘ_７は、それぞれ独立して、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、
Ｑ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｐ、Ｎ、およびＣから、より好ましくは、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ａ
、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｐ、およびＮから選択され、
かつＸ_８は、それぞれ独立して、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｑ
、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｐ、Ｎ、およびＣから、より好ましくは、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ａ、
Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｐ、およびＮから選択され、またはＸ_８
は、不在である（それぞれ、配列番号２０１または好ましくは配列番号２０２）。また、
本発明に係る結合分子は、配列番号２０１の２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含
むかまたはそれからなることが好ましい。ただし、（ｉ）前記２つのポリペプチドの第１
は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第
２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端に結合されるか、（ｉｉ）前記２つのポリペ
プチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリ
ペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＣ末端に結合されるか、（ｉｉｉ）前
記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ
前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＮ末端に結合されるか
、または（ｉｖ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＣ末
端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＣ
末端ならびに配列番号１７１および配列番号１７２の抗ＣＤ３抗体に結合される。同様に
、本発明に係る結合分子は、配列番号２０２の２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを
含むかまたはそれからなることが好ましい。ただし、（ｉ）前記２つのポリペプチドの第
１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの
第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端に結合されるか、（ｉｉ）前記２つのポリ
ペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポ
リペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＣ末端に結合されるか、（ｉｉｉ）
前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に結合され、か
つ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＮ末端に結合される
か、または（ｉｖ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＣ
末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２の
Ｃ末端ならびに配列番号１７１および配列番号１７２の抗ＣＤ３抗体に結合される。

さらにより好ましくは、
Ｘ_１は、ＬまたはＶから選択され、
Ｘ_２は、ＮまたはＨから選択され、
Ｘ_３は、ＭまたはＬから選択され、
Ｘ_４は、Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｔ、またはＬから選択され、
Ｘ_５は、Ｆ、Ｔ、Ｒ、またはＰから選択され、
Ｘ_６は、Ｓ、Ｅ、Ｔ、またはＱから選択され、
Ｘ_７は、Ｅ、Ｔ、Ｓ、またはＮから選択され、かつ
Ｘ_８は、Ｓから選択されるか、または不在である（配列番号２０３）。

したがって、本発明に係る結合分子は、配列番号２０３の２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポ
リペプチドを含むかまたはそれからなることがさらに好ましい。ただし、（ｉ）前記２つ
のポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２
つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端に結合されるか、（ｉ
ｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され
、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＣ末端に結合さ
れるか、（ｉｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ
末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２の
Ｎ末端に結合されるか、または（ｉｖ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２
つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の
２つの軽鎖の第２のＣ末端ならびに配列番号１７１および配列番号１７２の抗ＣＤ３抗体
に結合される。

好ましくは、配列番号１６９または配列番号１８７のアミノ酸配列に対して、好ましい
順に、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少
なくとも８５％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％の配列同一性を有するアミ
ノ酸配列を含むまたはそれらからなる、ＥＧＦＲに特異的に結合する以上に定義されたＦ
ｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、配列番号１６９または配列番号１８７からなる結合（
ポリ）ペプチドの結合能を保持するかまたは本質的に保持する。すなわち、それぞれの標
的エピトープに結合する強度（たとえば、ＥＣ５０値により決定される）は、保持される
かまたは本質的に保持される。ＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプ
チドの結合能は、その結合能の少なくとも６０％が保持されるのであれば、本質的に保持
される。好ましくは、その結合能の少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％
は、保持される。より好ましくは、結合能の少なくとも９０％、たとえば、少なくとも９
５％、さらにより好ましくは、少なくとも９８％、たとえば、少なくとも９９％が保持さ
れる。最も好ましくは、結合能は、完全に、すなわち、１００％保持される。

ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドＥＲ７Ｌ２Ｄ６（配列番号１６９）は、ＦＡＣＳ実験で
ＥＧＦＲ上のその特異的エピトープへの結合に対して３．３ｎＭのＥＣ_５０値を有し、Ｅ
Ｒ９Ｌ３Ｄ７（配列番号１８７）は、１５．０ｎＭのＥＣ_５０値を有する。これらのＥＣ
_５０値を決定するために、０．４６ｎＭ〜３３３ｎＭの濃度の精製ＦｙｎｏｍｅｒをＥＧ
ＦＲ陽性ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞と共にインキュベートした。マウス抗ｍｙｃタグ抗体
９Ｅ１０を利用して（３：２のＦｙｎｏｍｅｒ：９Ｅ１０のモル比でＦｙｎｏｍｅｒと共
に共インキュベートした）、次いで、抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘ４８８コンジュゲートに
より、続いて、サイトメーター分析により、結合されたＦｙｎｏｍｅｒを検出した。平均
蛍光強度値を決定し、Ｆｙｎｏｍｅｒ濃度のｌｏｇ１０値に対してプロットし、曲線当て
はめソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍを用いてＥＣ_５０値を決定した。したが
って、配列番号１６９または１８７のアミノ酸配列に対して、好ましい順に、少なくとも
６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、
少なくとも９０％、および少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むま
たはそれらからなる結合（ポリ）ペプチドの結合能は、ＥＧＦＲ結合に対して、好ましく
は同一の条件下で、少なくとも１×１０^−６Ｍ、好ましくは少なくとも１×１０^−７Ｍの
解離定数が保持されるのであれば、本質的に保持される。また、配列番号１６９または配
列番号１８７からなる結合（ポリ）ペプチドと比較して増加した結合能、すなわち、１０
０％超の活性を有する結合（ポリ）ペプチド）も、本発明に係るものである。たとえば、
本明細書では、少なくとも１×１０^−８Ｍ、たとえば、少なくとも１×１０^−９Ｍなど、
より好ましくは少なくとも１×１０^−１０Ｍ、たとえば、少なくとも１×１０^−１１Ｍな
ど、さらにより好ましくは少なくとも１×１０^−１２Ｍ、最も好ましくは少なくとも１×
１０^−１３Ｍの解離定数を有する結合（ポリ）ペプチドが、想定される。結合能を評価す
る方法は、当技術分野で周知であり、限定されるものではないが、表面プラズモン共鳴（
ＳＰＲ）技術またはＥＬＩＳＡを含む。

また、本発明に係る結合分子は、配列番号１６９または配列番号１８７のアミノ酸配列
に対して、好ましい順に、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少
なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％の配列
同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれらからなる、ＥＧＦＲに特異的に結合する
２つの以上に定義されたＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含むかまたはそれからなるこ
とが好ましい。ただし、（ｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖
の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重
鎖の第２のＮ末端に結合されるか、（ｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体
の２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗
体の２つの重鎖の第２のＣ末端に結合されるか、（ｉｉｉ）前記２つのポリペプチドの第
１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの
第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＮ末端に結合されるか、または（ｉｖ）前記２つ
のポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２
つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＣ末端ならびに配列番号１７
１および配列番号１７２の抗ＣＤ３抗体に結合される。

本発明の他の好ましい実施形態では、ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドは、配列番号１６
９および１９７からなる群から選択される配列を有する。ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチド
は、最も好ましくは、ＥＲ７Ｌ２Ｄ６（配列番号１６９）である。したがって、また、本
発明に係る結合分子は、配列番号１６９および１８７〜１９７（配列番号１６９が最も好
ましい）からなる群から選択される２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含むことが
好ましい。ただし、（ｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第
１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の
第２のＮ末端に結合されるか、（ｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２
つの重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の
２つの重鎖の第２のＣ末端に結合されるか、（ｉｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は
、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２
は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＮ末端に結合されるか、または（ｉｖ）前記２つのポ
リペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つの
ポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＣ末端ならびに配列番号１７１お
よび配列番号１７２の抗ＣＤ３抗体に結合される。

したがって、Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドが、ＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ
−ＳＨ３由来ポリペプチドである、以上の実施形態では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体
は、配列番号１７１および／または１７２を含むことがとくに好ましい。

記載のごとく、本発明の他の好ましい実施形態によれば、ＣＤ３に特異的に結合する抗
体およびＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、リンカーにより結合される。本発明のより
好ましい実施形態によれば、リンカーはペプチドリンカーである。本発明のさらにより好
ましい実施形態によれば、リンカーは、配列番号１６２、１６０、および１６１からなる
群から選択される配列を有する。

Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドが、ＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来
ポリペプチドである、以上の実施形態では、それに加えて、ＣＤ３に特異的に結合する抗
体およびＥＧＦＲに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、配列番
号１６２を含むリンカーにより結合されることが、とくに好ましい。

以下の本明細書の実施例から明らかなように、配列番号１６２を有するリンカーを介し
て、配列番号１７１および配列番号１７２を含む抗ＣＤ３抗体をＦｙｎｏｍｅｒ（登録商
標）ＥＲ７Ｌ２Ｄ６（配列番号１６９）に融合させた。前記抗体の軽鎖のＮ末端への融合
体を生成させた（すなわち、配列番号１７１および１９８からなるＣＯＶＡ４９４）。

本発明は、ＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを初めて提供
するため、本発明はまた、一実施形態では、ＥＧＦＲに特異的に結合するポリペプチドに
関する。ただし、ポリペプチドは、（ａ）ＧＶＴＬＦＶＡＸ_１ＹＤＹＥＡＲＧＬＸ_２ＲＸ
_３ＦＤＬＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬＸ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８ＧＤＷＷＥＡＲＳＬＴＴＧＥＴＧ
ＹＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（式ＩＩ）（式中、アミノ酸位置Ｘ_１〜Ｘ_８は、任意のア
ミノ酸配列であり、かつアミノ位置Ｘ_４〜Ｘ_８の１つは、任意選択で不在である）、およ
び（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％
、より好ましくは少なくとも９５％の同一性であるアミノ酸配列であって、同一性の決定
では、アミノ酸位置Ｘ_３〜Ｘ_７が除外され、ただし、式（ＩＩ）のアミノ酸位置１２〜２
０中、アミノ酸配列ＥＡＲＧＬＸ_２ＲＸ_３Ｆ（配列番号２０９）、好ましくはＮまたはＨ
であるＸ_２、および好ましくはＭまたはＬであるＸ_３（配列番号２０４）は、保存される
ことを条件とする、アミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまた
はそれからなる。

本明細書で用いられる「同一性の決定ではアミノ酸位置Ｘ_４〜Ｘ_７が除外されるという
語句は、式（ＩＩ）に対する配列同一性の計算では、アミノ酸位置Ｘ_４〜Ｘ_７は考慮され
ないが、配列番号１のアミノ酸位置の残りの部分は制約を受けることを明記している。本
明細書で用いられる「ただし、式（ＩＩ）のアミノ酸位置１２〜２０中、アミノ酸配列Ｅ
ＡＲＧＬＸ_２ＲＸ_３Ｆ（配列番号２０９）、好ましくはＮまたはＨであるＸ_２、および好
ましくはＭまたはＬであるＸ_３（配列番号２０４）は、保存されることを条件とする」と
いう条件は、アミノ酸位置１２〜２０中にアミノ酸変化を導入してはならないことを明記
している。別の言い方をすれば、本発明の以上の実施形態および以下のその好ましい実施
例の範囲内に入るすべてのポリペプチド中、式（ＩＩ）のアミノ酸位置１２〜２０に対応
するアミノ酸位置は、配列ＥＡＲＧＬＸ_２ＲＸ_３Ｆ（配列番号２０９）を有し、Ｘ_２は、
好ましくはＮまたはＨであり、かつＸ_３は、好ましくはＭまたはＬである（配列番号２０
４）。

ＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドの好ましい実施形態では
、
Ｘ_１は、ＬまたはＶから選択され、
Ｘ_２は、ＮまたはＨから選択され、
Ｘ_３は、ＭまたはＬから選択され、
Ｘ_４は、Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｔ、またはＬから選択され、
Ｘ_５は、Ｆ、Ｔ、Ｒ、またはＰから選択され、
Ｘ_６は、Ｓ、Ｅ、Ｔ、またはＱから選択され、
Ｘ_７は、Ｅ、Ｔ、Ｓ、またはＮから選択され、かつ
Ｘ_８は、Ｓから選択されるか、または不在である（配列番号２０３）。

ＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドのより好ましい実施形態
では、ポリペプチドは、配列番号１６９および１８７〜１９７のいずれか１つからなる群
から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

以下の本明細書の実施例に示されるように、配列番号１６９および１８７〜１９７は、
ＥＧＦＲに特異的に結合することが見いだされた。

本発明はさらに、一実施形態では、さらなる化合物に融合された本発明に係るＥＧＦＲ
に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含む融合構築物に関し、前記さら
なる化合物は、好ましくは、抗ＣＤ３抗体ではない。さらなる化合物は、好ましくは、医
薬活性化合物、プロドラッグ、薬学的に許容可能な担体、診断活性化合物、細胞透過性エ
ンハンサー、および／または、血清中半減期モジュレート化合物である。より詳細には、
さらなる化合物は、好ましくは、（ａ）蛍光色素、（ｂ）光増感剤、（ｃ）放射性核種、
（ｄ）メディカルイメージングコントラスト剤、（ｅ）サイトカイン、（ｆ）毒性化合物
、（ｇ）ケモカイン、（ｈ）凝血促進因子、（ｉ）プロドラッグ活性化酵素、（ｋ）アル
ブミンバインダー、（ｌ）アルブミン、（ｍ）ＩｇＧバインダー、または（ｎ）ポリエチ
レングリコールからなる群から選択される。最も好ましくは、さらなる化合物は、抗体軽
鎖、抗体重鎖、抗体Ｆｃドメイン、抗体、またはそれらの組合せからなるかまたはそれら
を含む。このリスト内では、抗体が最も好ましい。抗体は、好ましくは、本発明に係るＥ
ＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドの２つのコピーに融合される
。

本発明はさらに、一実施形態では、本発明に係るＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ−
ＳＨ３由来ポリペプチドをコードする核酸分子、適用可能な場合、融合構築物に関する。

本発明はまた、一実施形態では、本発明に係るＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ−Ｓ
Ｈ３由来ポリペプチド、および／または本発明に係るＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ
−ＳＨ３由来ポリペプチドコードする核酸分子、および／またはさらなる化合物に融合さ
れた本発明に係るＥＧＦＲに特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含む融
合構築物、を含む医薬組成物または診断組成物に関する。医薬組成物は、好ましくは、癌
を治療または予防する方法で使用される。

本発明は、（ｉ）ＣＤ３と（ｉｉ）癌細胞上の表面標的抗原とに特異的に結合する結合
分子のさらなる好ましい実施形態では、ＣＤ３３に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ
３由来ポリペプチドを含む結合分子に関する。ただし、（ｉ）前記２つのポリペプチドの
第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチド
の第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端に結合されるか、（ｉｉ）前記２つのポ
リペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つの
ポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＣ末端に結合されるか、（ｉｉｉ
）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に結合され、
かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＮ末端に結合され
るか、または（ｉｖ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１の
Ｃ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２
のＣ末端に結合される。

以上の選択肢との関連では、結合分子は、ＣＤ３３に特異的に結合する２つのＦｙｎ−
ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽
鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの
軽鎖の第２のＣ末端に結合されることが好ましい。

ＣＤ３３への特異的結合とは、本発明に係るポリペプチドがＣＤ３３には特異的に結合
するが、Ｓｉｇｌｅｃファミリーの他のメンバーなどの他の関連タンパク質には特異的に
結合しないことを意味する。「ＣＤ３３に特異的に結合するポリペプチド」は、好ましく
は、「ＣＤ３３の活性を阻害するポリペプチド」である。そのようなポリペプチドは、Ｃ
Ｄ３３の活性を低減するかまたは完全に消失する能力を有する。その活性については、本
明細書の以上に詳細に記載されている。これに関連して、ＣＤ３３活性を阻害するとは、
レセプターのそのリガンドへの結合を阻害することを意味することが好ましい。好ましい
順に、ポリペプチドは、ＣＤ３３の活性を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なく
とも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０
％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％阻害する
ことがさらに好ましい。また、好ましい順に、本発明に係るポリペプチドによるＣＤ３３
の阻害に対するＩＣ_５０値は、１０００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３
００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、または７５ｎＭ以下であることが好ま
しい。好ましくは、本発明に係るポリペプチドは、ＦＡＣＳにより決定したときに１０^−
７〜１０^−１２Ｍ、より好ましくは１０^−８〜１０^−１２Ｍ、最も好ましくは１０^−９〜
１０^−１２ＭのＥＣ_５０値でＣＤ３３に結合する。

ＣＤ３３に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、好ましくは、
ＣＤ３３の同一エピトープに結合する。以下の本明細書の実施例から明らかなように、抗
ＣＤ３３結合Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）ＥＥ１Ｌ１Ｂ３（配列番号１７４）は、本発明
を例示するために使用されている。したがって、結合分子は、配列番号１７４の２つのコ
ピーを含むことが好ましい。

ＣＤ３３に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、好ましい順に、配列
番号１７４（Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）ＥＥ１Ｌ１Ｂ３）のアミノ酸配列に対して、少
なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも
８５％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％の配列同一性を有することが好まし
い。また、ＣＤ３３に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、（ａ）ＧＶ
ＴＬＦＶＡＬＹＤＹＥＡＬＧＡＨＥＬＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６
ＧＰＦＷＥＡＨＳＬＴＴＧＥＴＧＷＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（式ＩＩＩ）（式中、ア
ミノ酸位置Ｘ_１〜Ｘ_６は、任意のアミノ酸配列であり、かつアミノ位置Ｘ_１〜Ｘ_６の１つ
または２つは、任意選択で不在である）、および（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列に対して少
なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一
性であるアミノ酸配列であって、アミノ酸配列、からなる群から選択されアミノ酸配列を
含むかまたはそれからなることが好ましい。同一性の決定では、アミノ酸位置Ｘ_１〜Ｘ_４
が除外され、ただし、式（ＩＩＩ）のアミノ酸位置１２〜１８中のアミノ酸配列ＥＡＬＧ
ＡＨＥ（配列番号２０８）は、保存されることを条件とする。

より好ましくは、ＣＤ３３に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、次
式ＩＩＩを有する。ただし、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なく
とも８５％の配列同一性を有し、同一性の決定では、配列番号１のアミノ酸位置１２〜１
７および３１〜３４が除外されること、を条件とする。

ＧＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹＥＡＬＧＡＨＥＬＳＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ
_５Ｘ_６ＧＰＦＷＥＡＨＳＬＴＴＧＥＴＧＷＩＰＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（式ＩＩＩ）
式中、Ｘ_１〜Ｘ_４は、それぞれ独立して、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、
Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｐ、Ｎ、およびＣから、より好ましくは、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ｌ
、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｐ、およびＮから選択され、
かつＸ_５およびＸ_６は、それぞれ独立して、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、
Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｐ、Ｎ、およびＣから、より好ましくは、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ｌ
、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｑ、Ｉ、Ｗ、Ｒ、Ｍ、Ｐ、およびＮから選択され、
またはＸ_５およびＸ_６は、不在である（それぞれ、配列番号２０５または好ましくは配列
番号２０６）。また、本発明に係る結合分子は、配列番号２０５の２つのＦｙｎ−ＳＨ３
由来ポリペプチドを含むかまたはそれからなることが好ましい。ただし、（ｉ）前記２つ
のポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２
つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端に結合されるか、（ｉ
ｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され
、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＣ末端に結合さ
れるか、（ｉｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ
末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２の
Ｎ末端に結合されるか、または（ｉｖ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２
つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の
２つの軽鎖の第２のＣ末端ならびに配列番号２および配列番号３の抗ＣＤ３抗体に結合さ
れる。同様に、本発明に係る結合分子は、配列番号２０６の２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポ
リペプチドを含むかまたはそれからなることが好ましい。ただし、（ｉ）前記２つのポリ
ペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポ
リペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端に結合されるか、（ｉｉ）前
記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ
前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＣ末端に結合されるか
、（ｉｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に
結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＮ末端
に結合されるか、または（ｉｖ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽
鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの
軽鎖の第２のＣ末端ならびに配列番号２および配列番号３の抗ＣＤ３抗体に結合される。

さらにより好ましくは、
Ｘ_１は、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｍ、Ｄ、またはＹから選択され、
Ｘ_２は、Ｓ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｍ、またはＶから選択され、
Ｘ_３は、Ｌ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｖ、Ｒ、またはＡから選択され、
Ｘ_４は、Ｓ、Ａ、Ｌ、Ｑ、Ｄ、Ｖ、Ｋ、またはＥから選択され、
Ｘ_５は、ＥおよびＶ、Ｑ、Ｌ、Ａ、Ｒから選択されるかまたは不在であり、かつ
Ｘ_６は、Ｌ、Ｇから選択されるかまたは不在である（配列番号２０７）。

本発明に係る結合分子は、配列番号２０７の２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを
含むかまたはそれからなることがさらに好ましい。ただし、（ｉ）前記２つのポリペプチ
ドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプ
チドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＮ末端に結合されるか、（ｉｉ）前記２つ
のポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２
つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの重鎖の第２のＣ末端に結合されるか、（ｉ
ｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に結合さ
れ、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＮ末端に結合
されるか、または（ｉｖ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第
１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の
第２のＣ末端ならびに配列番号２および配列番号３の抗ＣＤ３抗体に結合される。

好ましくは、配列番号１７４のアミノ酸配列に対して、好ましい順に、少なくとも６５
％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少な
くとも９０％、および少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたは
それらからなる、ＣＤ３３に特異的に結合する以上に定義されたＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリ
ペプチドは、配列番号１７４からなる結合（ポリ）ペプチドの結合能を保持するかまたは
本質的に保持する。すなわち、それぞれの標的エピトープに結合する強度（たとえば、Ｅ
Ｃ_５０値により決定される）は、保持されるかまたは本質的に保持される。ＣＤ３３に特
異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドの結合能は、その結合能の少なくとも６
０％が保持されるのであれば、本質的に保持される。好ましくは、その結合能の少なくと
も７５％、より好ましくは少なくとも８０％は、保持される。より好ましくは、結合能の
少なくとも９０％、たとえば、少なくとも９５％、さらにより好ましくは、少なくとも９
８％、たとえば、少なくとも９９％が保持される。最も好ましくは、結合能は、完全に、
すなわち、１００％保持される。

ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドＥＥ１Ｌ１Ｂ３（配列番号１７４）は、ＦＡＣＳ実験で
ＣＤ３３上のその特異的エピトープへの結合に対して５．７ｎＭのＥＣ_５０値を有する。
ＥＣ_５０値を決定するために、Ｆｃレセプターブロック剤で前処理されたＣＤ３３陽性Ｕ
９３７細胞と共に、３００ｎＭ〜０．４１ｎＭの濃度の精製Ｆｙｎｏｍｅｒをインキュベ
ートした。マウス抗ｍｙｃタグ抗体９Ｅ１０を利用して（４：１のＦｙｎｏｍｅｒ：９Ｅ
１０のモル比でＦｙｎｏｍｅｒと共に共インキュベートした）、続いて、抗マウスＩｇＧ
Ａｌｅｘ４８８コンジュゲートにより、続いて、サイトメーター分析により、結合され
たＦｙｎｏｍｅｒを検出した。平均蛍光強度値を決定し、Ｆｙｎｏｍｅｒ濃度のｌｏｇ１
０値に対してプロットし、曲線当てはめソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍを用
いてＥＣ_５０値を決定した。したがって、配列番号１７４のアミノ酸配列に対して、好ま
しい順に、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％
、少なくとも８５％、少なくとも９０％、および少なくとも９５％の配列同一性を有する
アミノ酸配列を含むまたはそれらからなる結合（ポリ）ペプチドの結合能は、ＣＤ３３結
合に対して、好ましくは同一の条件下で、少なくとも１×１０^−６Ｍ、好ましくは少なく
とも１×１０^−７Ｍの解離定数が保持されるのであれば、本質的に保持される。また、配
列番号１７４からなる結合（ポリ）ペプチドと比較して増加した結合能、すなわち、１０
０％超の活性を有する結合（ポリ）ペプチド）も、本発明に係るものである。たとえば、
本明細書では、少なくとも１×１０^−８Ｍ、たとえば、少なくとも１×１０^−９Ｍなど、
より好ましくは少なくとも１×１０^−１０Ｍ、たとえば、少なくとも１×１０^−１１Ｍな
ど、さらにより好ましくは少なくとも１×１０^−１２Ｍ、最も好ましくは少なくとも１×
１０^−１３Ｍの解離定数を有する結合（ポリ）ペプチドが、想定される。結合能を評価す
る方法は、当技術分野で周知であり、限定されるものではないが、表面プラズモン共鳴（
ＳＰＲ）技術またはＥＬＩＳＡを含む。

本発明の他の好ましい実施形態では、ＦｙｎＳＨ３由来ポリペプチドは、配列番号１７
４および１７７〜１８６からなる群から選択される配列を有する。ＦｙｎＳＨ３由来ポリ
ペプチドは、最も好ましくは、ＥＥ１Ｌ１Ｂ３（配列番号１７４）である。したがって、
また、本発明に係る結合分子は、配列番号１７４および１７７〜１８６（配列番号１７４
が最も好ましい）からなる群から選択される２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含
むことが好ましい。ただし、（ｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの
重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つ
の重鎖の第２のＮ末端に結合されるか、（ｉｉ）前記２つのポリペプチドの第１は、前記
抗体の２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２は、前
記抗体の２つの重鎖の第２のＣ末端に結合されるか、（ｉｉｉ）前記２つのポリペプチド
の第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチ
ドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＮ末端に結合されるか、または（ｉｖ）前記
２つのポリペプチドの第１は、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前
記２つのポリペプチドの第２は、前記抗体の２つの軽鎖の第２のＣ末端ならびに配列番号
２および配列番号３の抗ＣＤ３抗体に結合される。

したがって、Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドが、ＣＤ３３に特異的に結合するＦｙｎ
−ＳＨ３由来ポリペプチドである、以上の実施形態では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体
は、配列番号２および／または３を含むことがとくに好ましい。

本発明の他の好ましい実施形態によれば、ＣＤ３に特異的に結合する抗体およびＦｙｎ
−ＳＨ３由来ポリペプチドは、リンカーにより結合される。記載のごとく、本発明のより
好ましい実施形態によれば、リンカーはペプチドリンカーである。本発明のさらにより好
ましい実施形態によれば、リンカーは、配列番号１６２、１６０、および１６１からなる
群から選択される配列を有する。

Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドが、ＣＤ３３に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来
ポリペプチドである、以上の実施形態では、それに加えて、ＣＤ３に特異的に結合する抗
体およびＣＤ３３に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドは、配列番
号１６２を含むリンカーにより結合されることが、とくに好ましい。

以下の本明細書の実施例から明らかなように、配列番号１６２を有するリンカーを介し
て、配列番号２および配列番号３を含む抗体をＥＥ１Ｌ１Ｂ３（配列番号１７４）に融合
させた。前記抗体の軽鎖のＣ末端への融合体を生成させた（すなわち、配列番号２および
１７５からなるＣＯＶＡ４６７）。

本発明は、ＣＤ３３に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを初めて提供
するため、本発明はさらに、一実施形態では、ＣＤ３３に特異的に結合するポリペプチド
に関する。ただし、ポリペプチドは、（ａ）ＧＶＴＬＦＶＡＬＹＤＹＥＡＬＧＡＨＥＬＳ
ＦＨＫＧＥＫＦＱＩＬＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６ＧＰＦＷＥＡＨＳＬＴＴＧＥＴＧＷＩＰ
ＳＮＹＶＡＰＶＤＳＩＱ（式ＩＩＩ）（式中、アミノ酸位置Ｘ_１〜Ｘ_６は、任意のアミノ
酸配列であり、かつアミノ位置Ｘ_１〜Ｘ_６の１つまたは２つは、任意選択で不在である）
、および（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも
９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性であるアミノ酸配列であって、同一性
の決定では、アミノ酸位置Ｘ_１〜Ｘ_４が除外され、ただし、式（ＩＩＩ）のアミノ酸位置
１２〜１８中のアミノ酸配列ＥＡＬＧＡＨＥ（配列番号２０８）は、保存されることを条
件とする、アミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれか
らなる。

本明細書で用いられる「同一性の決定ではアミノ酸位置Ｘ_１〜Ｘ_４が除外される」とい
う語句は、式（ＩＩＩ）に対する配列同一性の計算では、アミノ酸位置Ｘ_１〜Ｘ_４は考慮
されないが、配列番号１のアミノ酸位置の残りの部分は制約を受けることを明記している
。本明細書で用いられる「ただし、式（ＩＩＩ）のアミノ酸位置１２〜１８中のアミノ酸
配列ＥＡＬＧＡＨＥ（配列番号２０８）は、保存されることを条件とする」という条件は
、アミノ酸位置１２〜１８中にアミノ酸変化を導入してはならないことを明記している。
別の言い方をすれば、本発明の以上の実施形態および以下のその好ましい実施例の範囲内
に入るすべてのポリペプチド中、式（ＩＩＩ）のアミノ酸位置１２〜１８に対応するアミ
ノ酸位置は、配列ＥＡＬＧＡＨＥ（配列番号２０８）を有する。

ＣＤ３３に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドの好ましい実施形態では
、
Ｘ_１は、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｍ、Ｄ、またはＹから選択され、
Ｘ_２は、Ｓ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｍ、またはＶから選択され、
Ｘ_３は、Ｌ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｖ、Ｒ、またはＡから選択され、
Ｘ_４は、Ｓ、Ａ、Ｌ、Ｑ、Ｄ、Ｖ、Ｋ、またはＥから選択され、
Ｘ_５は、ＥおよびＶ、Ｑ、Ｌ、Ａ、Ｒから選択されるかまたは不在であり、かつ
Ｘ_６は、Ｌ、Ｇから選択されるかまたは不在である（配列番号２０７）。

ＣＤ３３に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドのより好ましい実施形態
では、ポリペプチドは、配列番号１７４および１７７〜１８６のいずれか１つからなる群
から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

以下の本明細書の実施例に示されるように、配列番号１７４および１７７〜１８６は、
ＣＤ３３に特異的に結合することが見いだされた。

本発明はさらに、一実施形態では、さらなる化合物に融合された本発明に係るＣＤ３３
に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含む融合構築物に関し、前記さら
なる化合物は、好ましくは、抗ＣＤ３抗体ではない。さらなる化合物は、好ましくは、医
薬活性化合物、プロドラッグ、薬学的に許容可能な担体、診断活性化合物、細胞透過性エ
ンハンサー、および／または、血清中半減期モジュレート化合物である。より詳細には、
さらなる化合物は、好ましくは、（ａ）蛍光色素、（ｂ）光増感剤、（ｃ）放射性核種、
（ｄ）メディカルイメージングコントラスト剤、（ｅ）サイトカイン、（ｆ）毒性化合物
、（ｇ）ケモカイン、（ｈ）凝血促進因子、（ｉ）プロドラッグ活性化酵素、（ｋ）アル
ブミンバインダー、（ｌ）アルブミン、（ｍ）ＩｇＧバインダー、または（ｎ）ポリエチ
レングリコールからなる群から選択される。最も好ましくは、さらなる化合物は、抗体軽
鎖、抗体重鎖、抗体Ｆｃドメイン、抗体、またはそれらの組合せからなるかまたはそれら
を含む。このリスト内では、抗体が最も好ましい。抗体は、好ましくは、本発明に係るＣ
Ｄ３３に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドの２つのコピーに融合される
。

本発明はさらに、一実施形態では、本発明に係るＣＤ３３に特異的に結合するＦｙｎ−
ＳＨ３由来ポリペプチドをコードする核酸分子、適用可能な場合、融合構築物に関する。

本発明はさらに、一実施形態では、本発明に係るＣＤ３３に特異的に結合するＦｙｎ−
ＳＨ３由来ポリペプチド、および／または本発明に係るＣＤ３３に特異的に結合するＦｙ
ｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドをコードする核酸分子、／またはさらなる化合物に融合され
た本発明に係るＣＤ３３に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含む融合
構築物、を含む医薬用または診断用組成物に関する。医薬組成物は、好ましくは、癌を治
療または予防する方法で使用される。

本発明の他の好ましい実施形態によれば、本発明に係る二重特異的結合分子は、配列番
号１６３および／もしくは１６４を含むか、または配列番号１６３および１６４を含むか
もしくはそれらからなる。

以下の本明細書の実施例から明らかなように、配列番号１６３および１６４からなる二
重特異的結合分子（ＣＯＶＡ４２０）は、本発明を例示するために生成された。以下の本
明細書の実施例に記載の化合物ＣＯＶＡ４２０は、配列番号２および３の抗体からなり、
配列番号４のＨＥＲ２に特異的に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドのコピーは、
配列番号１６２を有するリンカーを介して前記抗体の２つの重鎖の第１および第２のＮ末
端に結合される。実施例に提供されたＨＥＲ２を標的とする化合物のうち、ＣＯＶＡ４２
０は、最高の発現収量、最低のＥＣ_５０値、および最適な腫瘍細胞選択性、したがって、
最良の腫瘍細胞死滅性を示した。

本発明の好ましい実施形態によれば、二重特異的結合分子は、配列番号１７１および／
または１９８を含む。

以下の本明細書の実施例から明らかなように、配列番号１６２を有するリンカーを介し
て、配列番号１７１および配列番号１７２を含む抗ＣＤ−３抗体をＦｙｎｏｍｅｒ（登録
商標）ＥＲ７Ｌ２Ｄ６（配列番号１６９）に融合させた。より詳細には、融合は、前記抗
体の軽鎖のＮ末端に対して行われ、それにより、化合物ＣＯＶＡ４９４（配列番号１７１
および１９８）が生成される。ＥＧＦＲを標的とする化合物のうち、実施例に提供された
、ＣＯＶＡ４９４は、有利な生物物理学的性質を有し、最良の腫瘍選択性、したがって、
最良の腫瘍細胞死滅性を示した。

本発明のさらなる好ましい実施形態によれば、二重特異的結合分子は、配列番号２およ
び／または１７５を含む。

以下の本明細書の実施例から明らかなように、配列番号１６２を有するリンカーを介し
て、配列番号２および配列番号３を含む抗体をＥＥ１Ｌ１Ｂ３（配列番号１７４）に融合
させた。より詳細には、融合は、前記抗体の軽鎖のＣ末端に対して行われ、それにより、
化合物ＣＯＶＡ４６７（配列番号２および１７５）が生成される。前記化合物は、有利な
生物物理学的性質および腫瘍細胞死滅性を示した。

他の実施形態では、本発明は、本発明に係る結合分子をコードする核酸分子に関する。

本発明に係る結合分子は、２つの個別の分子の１つ（またはそれ以上）のコピーの複合
体でありうるため、本発明に係る結合分子の成分は、１つまたは２つのいずれか（または
それ以上）の核酸分子によりコードされうる。好ましい実施形態では、１つの核酸分子が
完全一本鎖分子をコードする。

さらなる実施形態では、本発明は、本発明に係る核酸分子を含むベクターに関する。

本発明に係る核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、およびそれらの任意の他のアナログで
ありうる。ベクターおよび単離された細胞、特定的には宿主細胞は、目的に合った任意の
従来型のもの、たとえば、本発明に係るポリペプチドおよび／または融合タンパク質の生
成に適したもの、治療上有用な、たとえば、遺伝子療法に供される、ベクターおよび単離
された細胞でありうる。当業者であれば、豊富な先行技術から核酸、ベクター、および単
離された細胞を選択して、過度な負担なしに慣用的方法により所望の目的に対するそれら
の特定の適合性を確認することが可能であろう。

典型的には、核酸は、機能可能にプロモーターに連結され、好ましくは、Ｔ５プロモー
ター／ｌａｃオペレーターエレメント、Ｔ７プロモーター／ｌａｃオペレーターエレメン
を含む原核生物プロモーターの群から、またはｈＥＦ１−ＨＴＬＶ、ＣＭＶ ｅｎｈ／ｈ
ＦｅｒＬプロモーターを含む真核生物プロモーターの群から、選択されるプロモーターに
連結される。

また、本発明に係るベクターは、本発明に係る核酸を含むものであり、好ましくは、本
発明に係るポリペプチドまたは融合タンパク質を生成可能なものであると理解される。好
ましくは、そのようなベクターは、ｐＱＥベクター、ｐＥＴベクター、ｐＦＵＳＥベクタ
ー、ｐＵＣベクター、ＹＡＣベクター、ファージミドベクター、ファージベクター、遺伝
子療法に使用されるベクター、たとえば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴
ウイルスからなる群から選択される。

本発明はまた、一実施形態では、本発明に係るベクターを保有する宿主細胞または非ヒ
ト宿主に関する。

前記宿主または宿主細胞は、ベクターの存在時にベクターによりコードされる結合分子
の発現を媒介する宿主または宿主細胞に本発明に係るベクターを導入することにより、生
成されうる。

本発明によれば、宿主は、本発明に係るベクターでトランスフェクトされたおよび／ま
たはそれを発現するトランスジェニック非ヒト動物でありうる。好ましい実施形態では、
トランスジェニック動物は、非ヒト哺乳動物、たとえば、ハムスター、ウシ、ネコ、ブタ
、イヌ、またはウマである。

好ましいのは、宿主細胞、たとえば、細胞培養物の一部分でありうる単離された細胞で
ある。

好適な原核宿主細胞は、たとえば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチ
ルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の細
菌、およびサルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉ
ｕｍ）を含む。好適な真核宿主細胞は、たとえば、菌類細胞、とくに、酵母、たとえば、
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
もしくはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、または昆虫細胞、た
とえば、ドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２細胞およびスポドプテラ属（Ｓｐ
ｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞、ならびに植物細胞、さらには哺乳動物細胞である。以上
に記載の宿主細胞に適した培養培地および培養条件は、当技術分野で公知である。

哺乳動物宿主細胞は、限定されるものではないが、ヒトＨｅｌａ、ＨＥＫ２９３、Ｈ９
、およびＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３およびＣ１２７細胞、ＣＯＳ１、ＣＯＳ
７、およびＣＶ１、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、チャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ）細胞、およびボーズ黒色腫細胞を含む。本発明に係る結合分子は、染色体に組
み込まれた本発明に係る核酸分子またはベクターを包含する遺伝子構築物を含有する安定
細胞系で発現可能である。

他の好ましい実施形態では、前記細胞は、初代細胞または初代細胞系である。初代細胞
は、生物から直接取得される細胞である。好適な初代細胞は、たとえば、マウス胚性線維
芽細胞、マウス初代肝細胞、心筋細胞、およびニューロン細胞、ならびにマウス筋幹細胞
（サテライト細胞）、さらにはそれらに由来する安定不死化細胞系である。

本発明のさらなる実施形態は、請求項１〜８のいずれか一項に記載の結合分子本発明に
係る核酸分子、本発明に係るベクター、および／または本発明に係る宿主細胞もしくは非
ヒト宿主を含む医薬組成物に関する。

本発明に係る医薬組成物は、任意の従来方式で製造されうる。以下に示される疾患に罹
患している被験体の治療を行う際、経口経路または非経口経路を含めて、活性剤を有効量
で生物学的に利用可能にする任意の形態またはモードで、少なくとも本発明に係る少なく
とも１種の化合物を投与することが可能である。たとえば、本発明に係る組成物は、皮下
、筋肉内、静脈内、腹腔内、吸入などによりに投与可能である。好ましい選択肢は、皮下
注射であり、好ましくは、１週間に１回、２週間に１回、または１ヶ月に１回である。

製剤調製分野の当業者であれば、選択される製品の特定の特徴、治療される疾患または
病態、疾患または病態の病期、および他の関連状況に依存して、投与の適正な形態および
モードを容易に選択することが可能である（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ ｅｄ．
，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，（２０１２）（１９９０）を参照された
い）。

好適な担体または賦形剤は、活性成分の媒体または培地として機能しうる液体材料であ
りうる。好適な担体または賦形剤は、当技術分野で周知であり、たとえば、安定化剤、抗
酸化剤、ｐＨ調整物質、制御放出賦形剤などを含む。本発明に係る組成物は、凍結乾燥形
態で提供されうる。即時投与に供する場合、好適な水性担体、たとえば、注射用無菌水、
無菌緩衝生理食塩水に溶解させる。ボーラス注射としてではなく、注入による投与に供す
るために、より大量に生成することが望ましいのであれば、製剤化の最終段階で、ヒト血
清アルブミンまたは患者自身のヘパリン処理血液を溶媒に導入することが有利である。他
の選択肢として、製剤を皮下投与することが可能である。ヒト血清アルブミンなどの生理
学的に不活性なタンパク質が過剰に存在すると、注入溶液に使用される容器およびチュー
ブの壁上への吸着による薬学的に有効なポリペプチドの損失が防止される。アルブミンを
使用する場合、好適な濃度は、生理食塩水溶液を基準にして０．５〜４．５重量％である
。

疾患または病態を治療および／または予防するための、本発明に係る化合物、すなわち
、融合タンパク質、二重特異的構築物、核酸、ベクター、および単離された細胞の投与量
および投与モードは、当然ながら、本発明に係る特定の化合物、個別の患者グループまた
は患者、さらなる医学的活性化合物の存在、および治療される病態の性質および重症度に
依存して、変化するであろう。

しかしながら、現在のところ、予防的および／または治療的な使用では、約０．０００
１ｍｇ〜約２０ｍｇ／キログラム体重、好ましくは約０．００１ｍｇ〜約５ｍｇ／キログ
ラム体重の投与量を投与すべきとするのが好ましい。

好ましくは、予防的および／または治療的な使用での投与頻度は、１週間に約２回〜３
ヶ月に約１回、好ましくは、１週間に約１回〜１０週間に約１回、より好ましくは、１週
間に１回〜１ヶ月に１回の範囲内である。

好ましい実施形態では、本発明に係る医薬組成物は、癌を治療または予防する方法に使
用される。

本明細書の以上で詳細に説明されるように、ＣＤ３は、種々の癌タイプを治療するため
のリダイレクトＴ細胞死滅の真正標的である。さらに、特許請求された二重特異的結合分
子の特異性および有効性は、表面標的抗原、特定的には癌細胞上のＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、
またはＣＤ３３を標的とすることにより達成される。

本発明に係る医薬組成物のより好ましい実施形態では、前記癌は、乳癌、血液学的悪性
疾患、たとえば、ＮＨＬ、Ｂ−ＡＬＬ、ＣＭＬ、他の癌、たとえば、前立腺癌、黒色腫、
肺癌、胃癌、卵巣癌、ＮＨＬ、Ｂ−ＡＬＬ、ＡＭＬ、頭頸部癌、結腸直腸癌、膵臓癌、甲
状腺癌、神経膠腫、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、または悪性腹水からなる群から選択される
。このリスト内では、乳癌が最も好ましい。

癌細胞上の表面標的抗原のいくつかの例を本明細書の以上に具体的に示してきたが、こ
れらに限定されるものではない。本明細書の以上から明らかなように、癌細胞上のこれら
の表面の標的抗原は、本発明の以上の実施形態に列挙された癌タイプに関与する。

本発明に係る医薬組成物のより好ましい実施形態では、前記癌は、本発明に係る結合分
子により特異的に結合される、本発明に係る核酸分子によりコードされる結合分子により
特異的に結合される、本発明に係るベクターにより発現される結合分子により特異的に結
合される、および／または本発明に係る宿主細胞もしくは非ヒト宿主により発現される結
合分子により特異的に結合される、表面標的抗原を、非腫瘍細胞上に発現される量の少な
くとも２倍の量で発現する。

好ましくは、抗原は、非腫瘍細胞と比較して、少なくとも５倍量、たとえば、少なくと
も１０倍量など、さらにより好ましくは、少なくとも１００倍量、たとえば、少なくとも
１０００倍量など、最も好ましくは、少なくとも１０．０００倍量で癌細胞上に発現され
る。

本発明はまた、二重特異的結合分子の生成方法を提供する。この方法は、（ａ）以上に
定義された宿主細胞を培養することと、（ｂ）生成された二重特異的結合分子を単離する
ことと、を含む。

好ましい単離された細胞は、ＣＨＯ細胞を含む宿主細胞である。培養条件は、使用され
る特定の宿主細胞に依存して、選択されうる。当業者であれば、さらなる労力をかけるこ
となく実施可能である。

所望の生成物（すなわち、本発明に係る二重特異的結合分子）の単離は、精製方法によ
り行うことが可能であり、それに先行して、前記単離された細胞を破壊してもよい。好適
な方法は、当技術分野で周知であり、当業者の裁量に委ねられる。

本明細書で、とくに、特許請求の範囲で、特徴付けられた実施形態および好ましい特徴
に関して、従属請求項または好ましい特徴に挙げられた各実施形態は、前記従属請求項が
従属すると各請求項（独立または従属）の各実施形態と組み合わされることが意図される
。たとえば、独立請求項１が３つの選択肢Ａ、Ｂ、およびＣを挙げ、従属請求項２が３つ
の選択肢Ｄ、ＥおよびＦを挙げ、かつ請求項１および２に従属する請求項３が３つの選択
肢をＧ、ＨおよびＩを挙げた場合、とくに具体的な記載がないかぎり、明細書では、組合
せ、すなわち、Ａ、Ｄ、Ｇ；Ａ、Ｄ、Ｈ；Ａ、Ｄ、Ｉ；Ａ、Ｅ、Ｇ；Ａ、Ｅ、Ｈ；Ａ、Ｅ
、Ｉ；Ａ、Ｆ、Ｇ；Ａ、Ｆ、Ｈ；Ａ、Ｆ、Ｉ；Ｂ、Ｄ、Ｇ；Ｂ、Ｄ、Ｈ；Ｂ、Ｄ、Ｉ；Ｂ
、Ｅ、Ｇ；Ｂ、Ｅ、Ｈ；Ｂ、Ｅ、Ｉ；Ｂ、Ｆ、Ｇ；Ｂ、Ｆ、Ｈ；Ｂ、Ｆ、Ｉ；Ｃ、Ｄ、Ｇ
；Ｃ、Ｄ、Ｈ；Ｃ、Ｄ、Ｉ；Ｃ、Ｅ、Ｇ；Ｃ、Ｅ、Ｈ；Ｃ、Ｅ、Ｉ；Ｃ、Ｆ、Ｇ；Ｃ、Ｆ
、Ｈ；Ｃ、Ｆ、Ｉに対応する実施形態が一義的に開示されると理解すべきである。同様に
また、独立および／または従属請求項が選択肢を挙げない場合、従属請求項が複数の先行
請求項に戻って参照するとき、それにより包含される主題の任意の組合せが明示的に開示
されたものとみなされると理解される。たとえば、独立請求項１、請求項１に戻って参照
する従属請求項２、および請求項２および１の両方に戻って参照する従属請求項３の場合
、請求項３および１の主題の組合せは、請求項３、２、および１の主題の組合せとして、
明確にかつ一義的に開示されることになる。請求項１〜３のいずれか一項を参照するさら
なる従属請求項４が存在する場合、請求項４および１、請求項４、２、および１、請求項
４、３、および１、さらには請求項４、３、２、および１の主題の組合せが明確にかつ一
義的に開示されることになる。また、従属請求項がより上位の請求項（独立および／また
は従属請求項）に戻って直接参照しない場合、請求項により包含される主題の任意の可能
な組合せが、本出願により明示的に開示されたものとみなされると理解される。たとえば
、独立請求項１、および独立請求項１に戻って参照する従属請求項２に戻って参照する従
属請求項３の場合、請求項３および１の主題の組合せが明確にかつ一義的に開示される。
以上の要件は、しかるべき変更を加えて、本明細書で特徴付けられた添付の特許請求の範
囲、実施形態、および好ましい特徴のすべてに適用される。

最後に、本発明は、本明細書の以上で参照した１種以上の化合物または医薬組成物を投
与することにより、本明細書の以上で参照した疾患のいずれかに罹患している患者を治療
することに関する。

図１は、本発明に係るＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標）−抗体融合タンパク質および対照タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ特性解析を示している。Ａ：非還元条件下のゲル泳動、Ｂ：還元条件下でのゲル泳動。レーンＭ：分子量標準、レーン１：抗ＣＤ３抗体（配列番号２および３）、レーン２：ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）、レーン３：ＣＯＶＡ４４６（配列番号１６７）。 図２は、本発明に係るＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標）−抗体融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ特性解析を示す。Ａ：非還元条件下のゲル泳動、Ｂ：還元条件下でのゲル泳動。レーンＭ：分子量標準、レーン１：ＣＯＶＡ４２２（配列番号１６５および１６６）。 図３は、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）−抗体融合タンパク質のサイズ排除（ＳＥＣ）プロファイルを示している。Ａ：ＦＰＬＣシステムでのＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）のＳＥＣプロファイル、Ｂ：ＨＰＬＣシステムでのＣＯＶＡ４２２（配列番号１６５および１６６）のＳＥＣプロファイル。 図４は、ＨＥＲ２陽性細胞（パネルＡ）、ＣＤ３陽性細胞（パネルＢ）、およびＨＥＲ２もＣＤ３も発現しない細胞（パネルＣ）での、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）−抗体融合タンパク質ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）、ＣＯＶＡ４２２（配列番号１６５および１６６）、および二重特異的ｓｃＦｖ対照ＣＯＶＡ４４６（配列番号１６７）のフローサイトメトリー結合分析を示している。シグナルは、二次検出抗体のみで得られたバックグラウンドシグナル（灰色調色ヒストグラム）と比較される。 図５は、ＨＥＲ２陽性ＳＫＢＲ−３腫瘍細胞に対するＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）および一本鎖Ｆｖ方式二重特異的抗ＣＤ３×抗ＨＥＲ２対照（ＣＯＶＡ４４６、配列番号１６７）のリダイレクト細胞死滅活性を示している。それに加えて、ＨＥＲ２陰性ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞に対するＣＯＶＡ４２０の死滅活性がなんら存在しないことが示されることから、ＨＥＲ２陽性細胞に対する特異的死滅活性が実証される。ＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用した。 図６は、エフェクター細胞としてＣＤ８＋富化Ｔ細胞を用いてＨＥＲ２陽性ＳＫＯＶ−３腫瘍細胞に対するＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）およびＣＯＶＡ４２２（配列番号１６５および１６６）のリダイレクト細胞死滅活性を示している。 図７は、ＣＤ８＋富化Ｔ細胞の存在下および不在下での指定の抗体Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）融合タンパク質のインキュベーション時の細胞培養上清中へのグランザイムＢの放出を示している。 図８は、マウスにおける静脈内注射後のＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）の血清中濃度を示している。 図９は、活性化拡大ヒトＴ細胞で再構成されたｉｎ ｖｉｖｏ ＳＫＯＶ−３異種移植モデルでのＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）の抗腫瘍活性を示している。腫瘍体積は、ＲＴＶ（対療法開始日の相対腫瘍体積）として表されている。０．５ｍｇ／ｋｇのＣＯＶＡ４２０および媒体の治療剤を１週間に２回投与し（６、９、１３、１５日目）、等モル用量のＣＯＶＡ４４６（配列番号１６７）（０．１６ｍｇ／ｋｇ）を毎日１回静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラス注射により投与した。黒矢印により投与間隔を可視化している。 図１０は、高レベルのＨＥＲ２を発現するＳＫＯＶ−３腫瘍細胞および低レベルのＨＥＲ２を発現するＭＣＦ−７腫瘍細胞に対するＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）および一本鎖Ｆｖ方式二重特異的抗ＣＤ３×抗ＨＥＲ２対照（ＣＯＶＡ４４６、配列番号１６７）のリダイレクト細胞死滅活性を示している。ＣＤ８＋富化Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用した。残留標的細胞生存パーセントが示されている。 図１１は、Ｆｙｎｏｍｅｒ−抗体融合タンパク質のサイズ排除（ＳＥＣ）プロファイルを示している。Ａ：ＣＯＶＡ４９３（配列番号１７０および１７２）のＳＥＣプロファイル、Ｂ：ＣＯＶＡ４９４（配列番号１７１および１９８）のＳＥＣプロファイル、Ｃ：ＣＯＶＡ４９７（配列番号１９９および１７２）のＳＥＣプロファイル、Ｄ：ＣＯＶＡ４９９（配列番号１７１および２００）のＳＥＣプロファイル、Ｅ：ＣＯＶＡ４８９（配列番号１７１および１７２）のＳＥＣプロファイル。 図１２は、ＥＧＦＲ陽性細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、上側パネル）およびＣＤ３陽性細胞（Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６−１、下側パネル）に対する、抗ＣＤ３抗体（ＣＯＶＡ４８９、配列番号１７１および１７２）、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）−抗体融合タンパク質ＣＯＶＡ４９３（配列番号１７０および１７２）、ＣＯＶＡ４９４（配列番号１７１および１９８）、ＣＯＶＡ４９７（配列番号１９９および１７２）、ＣＯＶＡ４９９（配列番号１７１および２００）、および一本鎖Ｆｖ方式二重特異的抗ＣＤ３×抗ＥＧＦＲ対照（ＣＯＶＡ４４５、配列番号１７３）のフローサイトメトリー結合分析を示している。シグナルは、二次検出抗体のみで得られたバックグラウンドシグナル（灰色調色ヒストグラム）と比較される。 図１３は、高レベルのＥＧＦＲを発現するＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍細胞および低レベルのＥＧＦＲを発現するＨＴ−２９腫瘍細胞に対する、ＣＯＶＡ４９３（配列番号１７０および１７２）、ＣＯＶＡ４９４（配列番号１７１および１９８）、ＣＯＶＡ４９７（配列番号１９９および１７２）、ＣＯＶＡ４９９（配列番号１７１および２００）、および一本鎖Ｆｖ方式二重特異的抗ＣＤ３×抗ＥＧＦＲ対照（ＣＯＶＡ４４５、配列番号１７３）のリダイレクト細胞死滅活性を示している。それに加えて、５ｎＭの最高濃度で抗ＣＤ３抗体（ＣＯＶＡ４８９、配列番号１７１および１７２）の死滅活性がなんら存在しないことが示されている。ＣＤ８＋富化Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用した。残留標的細胞生存パーセントが示されている。 図１４は、エフェクターＴ細胞の存在下または不在下での、高レベルおよび低レベルのＥＧＦＲをそれぞれ発現するＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞およびＨＴ−２９腫瘍細胞に対する、ＣＯＶＡ４９３（配列番号１７０および１７２）、ＣＯＶＡ４９４（配列番号１７１および１９８）、ＣＯＶＡ４９７（配列番号１９９および１７２）、ＣＯＶＡ４９９（配列番号１７１および２００）、および一本鎖Ｆｖ方式二重特異的抗ＣＤ３×抗ＥＧＦＲ対照（ＣＯＶＡ４４５、配列番号１７３）のリダイレクト細胞死滅活性を示している。（ｎ．ｄ）．：未測定。 図１５（Ａ）は、Ｆｙｎｏｍｅｒ−抗体融合タンパク質ＣＯＶＡ４６７（配列番号２および１７５）のサイズ排除（ＳＥＣ）プロファイルを示しており、（Ｂ）は、ＣＤ３３陽性Ｕ９３７腫瘍細胞に対するＣＯＶＡ４６７（配列番号２および１７５）および一本鎖Ｆｖ方式二重特異的抗ＣＤ３×抗ＣＤ３３対照（ＣＯＶＡ４６３、配列番号１７６）のリダイレクト細胞死滅活性を示している。それに加えて、非修飾抗ＣＤ３抗体（ＣＯＶＡ４１９、配列番号２および３）の死滅活性がなんら存在しないことが示されている。ＣＤ８＋富化Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用した。標的細胞溶解パーセントが示されている。

実施例により本発明を例示する。

実施例１ − ＨＥＲ２陽性腫瘍細胞に対するリダイレクトＴ細胞媒介細胞傷害性分析
実施例１．１．− 抗ＣＤ３抗体抗ＨＥＲ２ Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）融合タンパク
質の発現および精製
１５アミノ酸リンカー（配列番号１６２）を介してＨＥＲ２結合Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録
商標）Ｃ１２（配列番号４）を抗ＣＤ３結合抗体（配列番号２および３）に遺伝子融合し
て、本発明に係る二重特異的抗体Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）融合タンパク質を生成した
。ＣＯＶＡ４２０では、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）Ｃ１２を抗ＣＤ３抗体（配列番号２
および３）の重鎖のＮ末端に融合した。ＣＯＶＡ４２２では、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標
）Ｃ１２を抗ＣＤ３抗体（配列番号２および３）の重鎖のＣ末端に融合した。

抗ＣＤ３抗体（配列番号２および３）、ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４
）、ＣＯＶＡ４２２（配列番号１６５および１６６）、および抗ＣＤ３×抗ＨＥＲ２ ｓ
ｃＦｖ対照（配列番号１６７）（ヘキサｈｉｓタグを有する）をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｃ
ＨＯ−Ｓ細胞に一過性トランスフェクトして、無血清／動物成分フリー培地で６日間発現
させた。ＡＥＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてプ
ロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ
番号８９９２８）により、抗ＣＤ３抗体および本発明に係る二重特異的タンパク質を上清
から精製した。ＨＩＳｔｒａｐ Ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を介
して固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーにより、抗ＣＤ３×抗ＨＥＲ２
ｓｃＦｖ対照（ＣＯＶＡ４４６、配列番号１６７）の精製を達成した。２８０ｎｍでの
吸光度測定により濃度を決定した。収量を表１に列挙する。

結果
本発明に係る抗体Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）融合タンパク質および対照抗体は、単一
工程で発現および精製を行うことが可能であった。図１および２に示されるように、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ解析により＞９５％の純度を実証可能であった。表１には、ＣＨＯ細胞への
一過性トランスフェクションおよび３７℃で６日間のタンパク質発現を行った後の発現収
量がまとめられている。

精製後、ＡＥＫＴＡ ＦＰＬＣシステムおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｇ２００，３０／１
００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、またはＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ１２
／６０システムおよびＢｉｏ ＳＥＣ５、５μｍ、３００Å、４．６×３００ｍｍカラム
を用いて、サイズ排除クロマトグラフィーを行った。本発明に係る二重特異的タンパク質
は、単一モノマーピークとして溶出したことから、本発明に係る抗体Ｆｙｎｏｍｅｒ（登
録商標）融合タンパク質は、非常に有利な生物物理学的性質を有することが実証される（
図３）。

実施例１．２ − 本発明に係る抗ＨＥＲ２ Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）抗ＣＤ３抗体
融合タンパク質を用いたＦＡＣＳ実験
ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．２％アジ化ナトリウム中、（ｉ）１×１０^５Ｊｕｒｋａｔ
Ｅ６−１細胞（ＣＤ３陽性細胞）、（ｉｉ）１×１０^５ＢＴ４７４ ＨＥＲ２陽性乳癌細
胞、（ｉｉｉ）１×１０^５ＨＥＲ２またはＣＤ３陰性ＭＤＡ ＭＢ４６８細胞のいずれか
を含有する１００μｌの全体積で、タンパク質ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１
６４）、ＣＯＶＡ４２２（配列番号１６５および１６６）、およびＣＯＶＡ４４６（配列
番号１６７）を１００ｎＭの濃度でインキュベートした。陰性対照として、タンパク質の
代わりにＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．２％アジ化ナトリウムのみを用いて、同一の細胞をイ
ンキュベートした（ＰＢＳ対照）。

氷上で６０分間インキュベートした後、１５０μＬ ＰＢＳ−１％ＢＳＡ緩衝液で細胞
を２回洗浄し、５μｇ／ｍＬヤギ抗ヒト−Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）を暗所で４０分間添加することにより、結合された抗体を検出した。ヘキサ
ｈｉｓタグを有する二重特異的ｓｃＦｖ対照ＣＯＶＡ４４６（配列番号１６７）では、５
μｇ／ｍｌマウス抗ＨＩＳタグ抗体（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の添加、お
よび４℃で４０分間のインキュベーション、続いて、追加の洗浄工程、続いて、５μｇ／
ｍＬヤギ抗マウスＡｌｅｘａ４８８コンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた同
様に４℃で４０分間のインキュベーションを行うことにより、結合を検出した。最後に、
細胞を３回洗浄し、１００μｌ ＰＢＳ−１％ＢＳＡ中に再懸濁させ、次いで、Ｇｕａｖ
ａ ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）フローサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で染色細胞
を分析した。

結果
フローサイトメトリーを介してＦｙｎｏｍｅｒ（登録商標）−抗体融合タンパク質の結
合性を評価した。図４に示されるように、（ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６
４）、ＣＯＶＡ４２２（配列番号１６５および１６６）、および二重特異的ｓｃＦｖ対照
（ＣＯＶＡ４４６、配列番号１６７）は、ＨＥＲ２発現ＢＴ４７４細胞（パネルＡ）およ
びＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６細胞（パネルＢ）に特異的に結合した。ＣＤ３またはＨ
ＥＲ２のいずれも発現しない細胞系では、非特異的結合では観測されなかった（パネルＣ
）。

実施例１．３ − ＨＥＲ２を発現する細胞に対するリダイレクトＴ細胞媒介細胞傷害性
分析
Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６９ １０
）：４２７０−６から採用したプロトコルを用いて、リダイレクトＴ細胞媒介細胞傷害性
アッセイで、ポリペプチドＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）および二重特
異的ｓｃＦｖ対照（配列番号１６７）を試験した。

簡潔に述べると、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを使用した。実験の前日、標準
的手順を用いてＦｉｃｏｌｌ Ｐｌａｑｕｅ ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
および密度勾配遠心分離により、Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅ Ｚｕｅｒｉｃｈから取得された
新鮮なバフィーコート調製物からＰＢＭＣを単離した。次いで、１０％ＦＣＳ、ＲＰＭＩ
中、３７℃、５％ＣＯ_２で、単離されたＰＢＭＣを４×１０^６細胞／ｍｌの細胞濃度で一
晩インキュベートした。次いで、単離されたＰＢＭＣをリダイレクト細胞傷害性アッセイ
でエフェクター細胞として機能することが可能であった。

また、実験の前夜、Ａｃｃｕｔａｓｅ処理により適切な量の標的細胞を取り出し、９６
ウェルプレート中の１０％ＦＣＳが追加された１００μＬ完全細胞培養培地中に３０００
〜５０００細胞／ウェルの範囲内の細胞密度で標的細胞を接種した。３７℃および５％Ｃ
Ｏ_２でアッセイプレートを一晩インキュベートした。使用した標的腫瘍細胞は、ＳＫＢＲ
−３（ＡＴＣＣカタログ番号ＨＴＢ−３０（商標））およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＡＴ
ＣＣカタログ番号：ＨＴＢ−１３２（商標））であった。細胞死滅実験前、適切な量のＰ
ＢＭＣを遠心分離して１０％ＦＣＳ、ＲＰＭＩ中に再懸濁させた。使用した標的細胞の数
に依存して、細胞濃度を１．５〜２．５×１０^６細胞／ｍＬの範囲内で調整し、さらなる
使用時まで室温で細胞を貯蔵した。

エフェクター細胞として富化ＣＤ８＋Ｔ細胞および標的腫瘍細胞としてＳＫＯＶ−３（
ＡＴＣＣカタログ番号ＨＴＢ−７７（商標））を用いて、リダイレクトＴ細胞媒介細胞傷
害性をさらにモニターした。これらのアッセイのために、単離されたＰＢＭＣをさらに精
製して、富化ＣＤ８＋Ｔ細胞を得た。製造業者の推奨に従って、Ｄｙｎｂｅａｄ（登録商
標）Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ（商標）ヒトＣＤ８ Ｔ細胞キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓカタログ番号１１３４８Ｄ）を用いて、ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。次いで、
精製後、細胞を６×１０^５〜１×１０^７／ｍｌの範囲内の濃度で１０％ＦＣＳ、ＲＰＭＩ
中に再懸濁させた。実験日、エフェクター分子を１０％ＦＣＳ、ＲＰＭＩ中に１５０ｎＭ
の最大濃度に希釈して、１／１０希釈の希釈系列を調製した。最後に、アッセイプレート
から消費培地を取り出して、５０μｌ／ウェルの新鮮培地で置換した。次いで、適切な量
のエフェクター分子およびエフェクター細胞を添加した。最終エフェクター細胞対標的細
胞比は、ＰＢＭＣアッセイでは２５／１、およびＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞とし
て機能するアッセイでは１０／１であった。エフェクター分子の最終最大濃度は、５０ｎ
Ｍであった。最終アッセイ体積は、１５０μＬ／ウェルであった。アッセイプレートを３
７℃、５％ＣＯ_２で２４時間〜７２時間インキュベートした。次いで、細胞培養上清を取
り出して、後続のアッセイ（グランザイム放出アッセイ、以下の実施例１．４を参照され
たい）のために−８０℃で貯蔵した。発色溶液を添加する前に、各ウェルをＰＢＳで２回
洗浄した。製造業者の推奨に従ってＸＴＴ試薬（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｘ４６２６）を
用いて、細胞生存能を評価した。標的細胞を１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）
で処理することにより１００％溶解対照を組み込み、エフェクター細胞のみで標的細胞を
処理することにより自然溶解に対する値を得た。ＸＴＴ基質添加の２．５〜４時間後、４
５０ｎｍで吸光度を測定した。すべての測定をトリプリケート方式で行った。次式：
生存％＝（値−１００％溶解）／（自然溶解−１００％溶解）＊１００
を用いて細胞生存パーセントを計算した。次いで、細胞生存％をエフェクター分子濃度に
対してプロットし、Ｐｒｉｓｍ ５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて用
量−反応シグモイドに当てはめることにより、データを評価した。

結果
ＨＥＲ２発現ＳＫＢＲ３細胞に対するＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）
の用量依存的細胞傷害性を観測可能であることを実証可能であった（図５）。この代表的
なアッセイでは、ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）は、８７ｐＭのＥＣ_５
０値を有していた。重要なこととして、図５に示されるようにＨＥＲ２陰性ＭＤＡ−ＭＢ
−４６８では細胞傷害性が観測されなかったため、細胞傷害作用は抗原依存的であった。

同一のアッセイ条件下で、二重特異的抗ＨＥＲ２×抗ＣＤ３ ｓｃＦｖｓｃＦｖ対照分
子（配列番号１６７）では、６０ｐＭのＥＣ_５０値が得られた。驚くべきことに、２価お
よび全長ＩｇＧベースのＦｙｎｏｍｅｒ−抗体融合タンパク質は、現在使用されているｓ
ｃＦｖｓｃＦｖタンパク質と同一範囲内のリダイレクト死滅アッセイの効力を示すが、最
適とは言えない生物物理学的性質および短いｉｎ ｖｉｖｏ半減期という欠点を有してい
ないことが見いだされた。

表２には、試験したタンパク質で得られたＥＣ_５０値がまとめられている。

本発明に係るＦｙｎｏｍｅｒ−抗体融合タンパク質が、Ｔ細胞のエンゲージメント（Ａ
ＤＣＣ媒介性活性によるものではない）により死滅活性を発揮することを実証するために
、ＡＤＣＣによる細胞死滅を媒介できないＣＤ８＋富化Ｔ細胞を用いたリダイレクト細胞
死滅実験を行った。

図６は、エフェクター細胞としてＣＤ８＋富化Ｔ細胞を用いて細胞死滅を確認できたこ
とを示している。ここで、ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）は、８ｐＭの
ＥＣ_５０値を示し、ＣＯＶＡ４２２（配列番号１６５および１６６）のＥＣ_５０値は、１
７５ｐＭであった。これらの結果から、ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）
およびＣＯＶＡ２２（配列番号１６５および１６６）の強力な（サブｎＭ）死滅活性が確
認される。

実施例１．４ − 標的細胞の存在下および不在下でのグランザイムＢ放出の分析
抗原陽性標的細胞およびＣＤ８＋富化Ｔ細胞の存在下および不在下で、ＣＯＶＡ４２０
（配列番号１６３および１６４）および対照として抗ＣＤ３抗体（配列番号２および３）
のインキュベーション時の細胞培養培地中へのグランザイムＢの放出を評価した。Ｈａａ
ｓ Ａ．ｅｔ．ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，２１４（６）：４４１−
５３により記載されるように、グランザイムＢの放出は、ＢｉＴＥ（登録商標）様作用剤
により誘導されるＴ細胞媒介細胞傷害活性の主要インジケーターである。Ｆｙｎｏｍｅｒ
（登録商標）−抗体融合タンパク質の細胞傷害活性の評価に対して以上に記載したように
、サンプルをインキュベートした。インキュベーションの終了時、細胞培養上清を捕集し
、製造業者の推奨に従ってグランザイムＢ ＥＬＩＳＡキット（研究開発システム）を用
いて、グランザイムＢの濃度を評価した。

結果：
図７は、指定の濃度でＣＤ８＋Ｔ細胞の存在下ならびに抗原陽性標的細胞の存在下およ
び不在下でＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）のインキュベーションを行っ
た３日後のグランザイムＢの発現レベルを示している。標的細胞の不在下で５０ｎＭのＣ
ＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）のみを用いてＴ細胞をインキュベートした
場合、グランザイムＢの非特異的な放出が検出されうる。標的細胞ＣＯＶＡ４２０（配列
番号１６３および１６４）およびＴ細胞が存在した場合、グランザイムＢ発現の顕著な増
加が観測された。細胞傷害作用が検出できない濃度でＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３お
よび１６４）を用いた場合、実質的なグランザイムＢ発現を検出できなかったことから、
細胞傷害活性とグランザイムＢ放出（０．５ｐＭ）との間の相関が示唆される。対照抗Ｃ
Ｄ３抗体（配列番号２および３）（５０ｎＭ）は、予想どおり、腫瘍標的およびエフェク
ター細胞の存在下でグランザイムＢ放出をトリガーしなかった。

実施例１．５ − 薬動学的分析
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）においてＣＯＶＡ４２０（配列
番号１６３および１６４）の薬動学的プロファイルを調べた。５匹のＣ５７ＢＬ／６マウ
スに２００μｇのＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）を静脈内注射した。１
０分後、６、２４、４８、９６、１２０、１４４、および１６８時後、ＥＤＴＡ被覆ｍｉ
ｃｒｏｖｅｔｔｅｓ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）中に血液を捕集し、９３００ｇで１０分間遠心
分離し、そしてＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）の血清中レベルをＥＬＩ
ＳＡにより決定した。黒色ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）を５
０ｎＭ ＨＥＲ２ ＥＣＤ（ベンダーＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ）で被覆した。ＰＢＳ中２％
ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）でブロックした後、４０μｌのＰＢＳおよび適切な希釈度の１０μ
ｌの血清を適用した。１時間のインキュベーション後、ウェルをＰＢＳで洗浄し、結合さ
れたＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）を抗−ｈＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋ
ｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で検出した。アッセイをＱｕａｎｔａＲｅｄ蛍
光原基質（Ｐｉｅｒｃｅ）で発色させ、５４４ｎｍ（励起）および５９０ｎｍ（発光）で
５分後に蛍光強度を測定した。ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）（３３３
〜０．５ｎｇ／ｍｌに希釈）の標準曲線を用いて、ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３およ
び１６４）の血清中レベルを決定した。さまざまな時間点で決定された血清中に濃度およ
び排出相（片対数スケールの中でプロットされた）の得られた傾きｋから、式ｔ_１／２＝
ｌｎ２／−ｋを用いて、半減期を計算した。

結果：
図８は、マウスにおける静脈内ボーラス注射後のＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３およ
び１６４）の血清中濃度を示している。排出相（β相、時間点２４ｈ〜１６８ｈ）から決
定されるＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）の半減期値は、１４０時間であ
った。半減期がマウスにおける他のヒト抗体で得られる半減期に匹敵するため、この知見
からＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）は、ＩｇＧ様ｉｎ ｖｉｖｏ ＰＫ
特性を有することが示される（たとえば、アダリムマブ：１０２〜１９３時間、Ｈｕｍｉ
ｒａ（登録商標）Ｄｒｕｇ Ａｐｐｒｏｖａｌ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｄｒｕｇ Ａｐｐｒｏ
ｖａｌ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、ＦＤＡ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
Ｎｏ．：１２５０５７ｓ０１１０，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗ，０１／
１８／２００８）。

実施例１．６ − ヒトＴ細胞で再構成されたＨＥＲ２を過剰発現するＳＫＯＶ−３腫瘍
を有するマウスにおけるＣＯＶＡ４２０のｉｎ ｖｉｖｏ有効性
ＨＥＲ２発現ヒトＳＫＯＶ−３腫瘍異種移植片を有する照射ＮＯＤ．ＣＢ１７ Ｐｒｋ
ｄｃマウスにおいてＣＯＶＡ４２０の抗腫瘍活性を調べた。

方法：
３×１０^６ＳＫＯＶ−３（ＡＴＣＣカタログ番号ＨＴＢ−７７（商標））細胞を２Ｇｙ
照射ＮＯＤ．ＣＢ１７ Ｐｒｋｄｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）に皮下注射（
ｓ．ｃ．）した。ヒトＴ細胞注射の前日、腫瘍が約５０ｍｍ^３の平均サイズに達した時、
動物に抗アシアロＧＭ１ウサギ抗体（ＷＡＫＯ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の単回静脈内（ｉ．ｖ
．）ボーラス注射を施した。１名の健常ドナーのバフィーコートから単離されたｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ活性化拡大（２２日間）ヒトＴ細胞（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｅ
ｒｍａｎｙ）を腹膜腔注射した（１．６×１０^７／マウス）。Ｔ細胞注射の３日後、マウ
スをランダム化し、合計１５日間にわたり側方尾静脈に静脈内ボーラス注射を行うことに
より、０．５ｍｇ／ｋｇ ＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４、ｎ＝８）、媒
体（ＰＢＳ、ｎ＝７）処理、２回／週（６、９、１３、１５日目）、または１日１回等モ
ル用量（＝０．１６ｍｇ／ｋｇ）のＣＯＶＡ４４６（配列番号１６７、ｎ＝８）に施した
。腫瘍成長阻害により治療有効性を評価した。腫瘍サイズは、外側カリパス測定および標
準的半楕円式：体積＝（幅）^２×長さ×０．５を用いて計算される体積により測定した。
６日目（療法開始）に対する相対腫瘍体積（ＲＴＶ）を平均±ＳＥＭとして表す。Ｇｒａ
ｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェア、バージョン６ａを用いて統計解析を行った。
対応のないノンパラメトリックｔ検定（マン・ホイットニー）を用いて、抗腫瘍有効性の
統計的有意性を計算した。処理対媒体対照比（Ｔ／Ｃ）：Ｔ／Ｃ（％）＝ＲＴＶ（１６日
目）／ＲＴＶ（６日目）として表される、媒体対照と対比した腫瘍体積阻害として、１６
日目のＣＯＶＡ４２０対媒体処理の抗腫瘍有効性をさらに評価した（Ｗｕ（２０１０），
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，
２０：５，９５４−９６４）。

結果：
ＣＯＶＡ４２０は、Ｔ細胞を腫瘍に積極的に動員することにより、ＳＫＯＶ−３腫瘍成
長を有意に低減する（図９）。ＣＯＶＡ４２０処理では、０．５ｍｇ／ｋｇ ＣＯＶＡ４
２０を４回投与した後、１６日目、媒体対照と比較して、有意な成長阻害をもたらした（
Ｐ＝０．００５９）。ＣＯＶＡ４２０処理ではまた、１日１回注射０．１６ｍｇ／ｋｇ
ＣＯＶＡ４４６対照と比較しても、有意により有効であった（Ｐ＝０．０４）。同一日で
のＴ／Ｃ比は、媒体処理と比較して、ＣＯＶＡ４２０の成長阻害では５５％およびＣＯＶ
Ａ４４６では７９％に等しい。ＣＯＶＡ４２０は、薬理学的に活性であり、ヒトＴ細胞を
効率的に腫瘍に動員することにより、その抗腫瘍活性を発揮し、その結果、媒体処理対照
と比較して腫瘍成長阻害をもたらすことが、結果からが実証される。

実施例１．７ − 高レベルのＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞に対して選択的なリダイレク
トＴ細胞媒介細胞傷害性の分析
Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６９ １０
）：４２７０−６から採用したプロトコルを用いて、リダイレクトＴ細胞媒介細胞傷害性
アッセイで、ポリペプチドＣＯＶＡ４２０（配列番号１６３および１６４）および二重特
異的ｓｃＦｖ対照ＣＯＶＡ４４６（配列番号１６７）を試験した。簡潔に述べると、実施
例１．３に記載したように、前日に、新鮮なバフィーコートからヒトＰＢＭＣを単離し、
実験日にＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。実験の前夜、Ａｃｃｕｔａｓｅ処理により適切な数
の標的細胞を取り出し、９６ウェルプレート中の１０％ＦＣＳが追加された１５０μｌの
適切な成長培地中に５０００細胞／ウェルの細胞密度で標的細胞を接種した。３７℃およ
び５％ＣＯ_２でアッセイプレートを一晩インキュベートした。使用した標的腫瘍細胞は、
高レベルのＨＥＲ２（約１．７×１０^６ＨＥＲ２分子／細胞）を発現するＳＫＯＶ−３（
ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−７７（商標））、および低レベルのＨＥＲ２（約１×１０
^４ＨＥＲ２分子／細胞）を発現するＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−２２（商
標））であった。製造業者の推奨に従ってＱｉｆｉｋｉｔ（Ｄａｋｏ Ｋ００７８）を用
いて、ＨＥＲ２表面発現を定量した。簡潔に述べると、飽和濃度の抗ＨＥＲ２抗体（Ｒ＆
Ｄ ＭＡＢ１１２９）またはアイソタイプが一致した対照ＩｇＧ、続いて、抗マウスＦＩ
ＴＣ二次抗体で細胞を染色し、そしてフローサイトメトリー分析に付した。同時に、さま
ざまな明確に規定された量のマウスモノクローナル抗体分子で被覆されたビーズを二次抗
体で染色し、分析し、分子／細胞の参照として標準曲線をプロットした。

実験日、エフェクター分子を１０％ＦＣＳ、ＲＰＭＩ中に１５０ｎＭの最大濃度に希釈
して、１／１０希釈の希釈系列を調製した。適切な量のＴ細胞を遠心分離し、１０％ＦＣ
Ｓ、ＲＰＭＩ中に再懸濁させた。細胞濃度を１×１０^６細胞／ｍＬに調整した。最後に、
アッセイプレートから消費培地を取り出して、５０μｌ／ウェルの新鮮１０％ＦＣＳ、Ｒ
ＰＭＩで置換した。次いで、５０μｌのエフェクター分子および５０μｌのエフェクター
Ｔ細胞を添加した。最終エフェクター細胞対標的細胞比は、１０：１であった。エフェク
ター分子の最終最大濃度は、５０ｎＭであった。最終アッセイ体積は、１５０μｌ／ウェ
ルであった。

アッセイプレートを３７℃、５％ＣＯ_２で６０時間インキュベートした。次いで、細胞
培養上清を除去し、各ウェルをＰＢＳで１回洗浄した。製造業者の推奨に従ってＸＴＴ試
薬（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｘ４６２６）を用いて、細胞生存能を評価した。１％Ｔｒｉ
ｔｏｎ−Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）で標的細胞を処理することにより１００％溶解対照を含
め、エフェクター細胞のみを用いて標的細胞をインキュベートすることにより自然溶解の
値を得た（「自然溶解」）。ＸＴＴ基質添加の２時間後、４５０ｎｍで吸光度を測定した
。すべての測定をトリプリケート方式で行った。次式：
生存％＝（値−１００％溶解）／（自然溶解−１００％溶解）＊１００
を用いて細胞生存パーセントを計算した。次いで、細胞生存％をエフェクター分子濃度に
対してプロットし、Ｐｒｉｓｍ ５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて用
量−反応シグモイドに当てはめることにより、データを評価した。

結果
高レベルのＨＥＲ２を発現するＳＫＯＶ−３標的細胞に対するＣＯＶＡ４２０の用量依
存的リダイレクトＴ細胞傷害性を観測可能であった（図１０）。表３には、試験したタン
パク質で得られたＥＣ_５０値がまとめられている。

さらに、低レベルのＨＥＲ２を発現するＭＣＦ−７標的細胞に対する二重特異的抗ＣＤ
３×抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ対照分子ＣＯＶＡ４４６の用量依存的リダイレクトＴ細胞傷害
性もまた観測可能であった。この代表的なアッセイでは、ＣＯＶＡ４４６は、５３ｐＭの
ＥＣ_５０値を有していた。驚くべきことに、ＣＯＶＡ４２０は、低レベルのＨＥＲ２（表
３）を発現するＭＣＦ−７標的細胞に対する有意なリダイレクトＴ細胞傷害性を示さなか
った。

実施例２ − ＥＧＦＲ陽性腫瘍細胞に対するリダイレクトＴ細胞媒介細胞傷害性分析
実施例２．１．− 抗ＣＤ３抗体抗ＥＧＦＲ Ｆｙｎｏｍｅｒ融合タンパク質の発現およ
び精製
Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉら（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）ＪＢ
Ｃ，２８２，ｐ．３１９６−３２０４）に記載されるように、得られる構築物がＣ末端ｍ
ｙｃ−ヘキサヒスチジンタグを有するように、配列番号１６９および１８７〜１９７に示
されるポリペプチドをコードするＤＮＡを細菌発現ベクターｐＱＥ１２中にクローニング
した。２００μｌスケールの培養でＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌のサイトゾル中でポリ
ペプチドを発現させた。１０μｇ／ｍｌの抗ｍｙｃマウス抗体９Ｅ１０（Ｒｏｃｈｅ）を
含有するＰＢＳ／１％ＦＣＳ／０．２％アジ化ナトリウム緩衝液中に、ポリペプチドを含
有する透明化溶解液を５：１に希釈し、１×１０^５ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（ＡＴＣＣ
（登録商標）ＨＴＢ−１３２（商標））に添加した。氷上で６０分間インキュベートした
後、細胞を洗浄し、結合された配列を抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により検出した。次いで、染色された細胞をＦＡＣＳアナライ
ザーで分析した。ＤＮＡ配列決定により特異的バインダーのＤＮＡ配列を検証した。Ｆｙ
ｎＳＨ３由来ＥＧＦＲバインダーのアミノ酸配列は、配列リスト中に添付されるように配
列番号１６９および１８７〜１９７で示される。

１５アミノ酸リンカー（配列番号１６２）を介して、ＥＧＦＲ結合Ｆｙｎｏｍｅｒ Ｅ
Ｒ７Ｌ２Ｄ６（配列番号１６９）をＣＤ３結合抗体（ＣＯＶＡ４８９、配列番号１７１お
よび１７２）の重鎖（配列番号１７１）のＮ末端に遺伝子融合して、二重特異的抗体Ｆｙ
ｎｏｍｅｒ融合タンパク質ＣＯＶＡ４９３（配列番号１７０および１７２）を生成した。
それに加えて、ＥＲ７Ｌ２Ｄ６（配列番号１）を抗体軽鎖のＮ末端に融合して、二重特異
的抗体Ｆｙｎｏｍｅｒ融合タンパク質ＣＯＶＡ４９４（配列番号１７１および１９８）を
生成した。

１５アミノ酸リンカー（配列番号１６２）を介して、ＥＧＦＲ結合Ｆｙｎｏｍｅｒ Ｅ
Ｒ９Ｌ３Ｄ７（配列番号１８７）を抗ＣＤ３結合抗体（ＣＯＶＡ４８９、配列番号１７１
および１７２）の抗体重鎖（配列番号１７１）のＮ末端に遺伝子融合して、二重特異的抗
体Ｆｙｎｏｍｅｒ融合タンパク質ＣＯＶＡ４９７（配列番号１９９および１７２）を生成
した。それに加えて、ＥＲ９Ｌ３Ｄ７（配列番号２）を抗体軽鎖（配列番号１７２）のＣ
末端に融合して、二重特異的抗体Ｆｙｎｏｍｅｒ融合タンパク質ＣＯＶＡ４９９（配列番
号１７１および２００）をした。

抗ＣＤ３抗体ＣＯＶＡ４８９、二重特異的タンパク質ＣＯＶＡ４９３、ＣＯＶＡ４９４
、ＣＯＶＡ４９７、ＣＯＶＡ４９９、および抗ＣＤ３×抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ対照ＣＯＶ
Ａ４４５（配列番号１７３）（ヘキサｈｉｓタグを有する）をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＣＨ
Ｏ−Ｓ細胞に一過的にトランスフェクして、無血清／動物成分フリー培地で６日間発現さ
せた。ＡＥＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてプロ
テインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番
号８９９２８）により、抗ＣＤ３抗体および本発明に係る二重特異的タンパク質を上清か
ら精製した。ＨＩＳｔｒａｐ Ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を介し
て固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーにより、抗ＣＤ３×抗ＥＧＦＲ
ｓｃＦｖ対照（ＣＯＶＡ４４５、配列番号１７３）の精製を達成した。２８０ｎｍでの吸
光度測定により濃度を決定した。収量を表４に列挙する。

精製後、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １２／６０システムでシリカ系ＳＥＣ−５カラム
（Ａｇｉｌｅｎｔ、５μｍ、３００Å）を用いて、分析サイズ排除クロマトグラフィーを
行った。

結果
本発明に係る抗体Ｆｙｎｏｍｅｒ融合タンパク質および対照抗体は、単一工程で発現お
よび精製を行うことが可能であった。表１には、ＣＨＯ細胞への一過性トランスフェクシ
ョンおよび３７℃で６日間のタンパク質発現を行った後の精製収量がまとめられている。

本発明に係る二重特異的タンパク質は、サイズ排除カラムから単一モノマーピークとし
て溶出したことから、本発明に係る抗体Ｆｙｎｏｍｅｒ融合タンパク質は、非常に有利な
生物物理学的性質を有することが実証される（図１１）。本発明に係る二重特異的構築物
は、非修飾抗ＣＤ３抗体と少なくとも同程度に良好に発現され、ＳＥＣ分析より示される
ように、精製後、凝集しなかった。

実施例２．２ − 本発明に係る抗ＥＧＦＲ Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）抗ＣＤ３抗体
融合タンパク質のＦＡＣＳアッセイ実験
ＣＯＶＡ４８９、ＣＯＶＡ４９３、ＣＯＶＡ４９４、ＣＯＶＡ４９７、ＣＯＶＡ４９９
、およびＣＯＶＡ４４５を、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．２％アジ化ナトリウム中で、（ｉ
）３０ｎＭの濃度で、１００μｌの全体積で、１×１０^５Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６−１細胞（
ＣＤ３陽性細胞、ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−１５２（商標））と共に、または（ｉｉ
）１００ｎＭの濃度で、１００μｌの全体積で、１×１０^５ＥＧＦＲ過剰発現ＭＤＡ−Ｍ
Ｂ−４６８乳癌細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−１３２（商標））と共に、インキュ
ベートした。陰性対照として、タンパク質の代わりにＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．２％アジ
化ナトリウムのみを用いて、同一の細胞をインキュベートした（ＰＢＳ対照）。

氷上で４５分間インキュベートした後、１５０μＬ ＰＢＳ−１％ＢＳＡ緩衝液で細胞
を２回洗浄し、４μｇ／ｍＬヤギ抗ヒト−Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）を４℃で４０分間添加することにより、結合された抗体を検出した。ヘキサ
ｈｉｓタグを有する二重特異的ｓｃＦｖ対照ＣＯＶＡ４４５では、ＣＯＶＡ４４５をマウ
ス抗ＨＩＳタグ抗体（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に１：４のモル比（抗
ＨＩＳタグ抗体：ＣＯＶＡ４４５）で同時にインキュベートし、続いて、追加の洗浄工程
を行った後、４μｇ／ｍＬヤギ抗マウス−Ａｌｅｘａ ４８８コンジュゲート（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）と共に４℃で４０分間インキュベートすることにより、結合を検出した。
最後に、細胞を３回洗浄し、１００μｌ ＰＢＳ−１％ＢＳＡ中に再懸濁させ、次いで、
Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）フローサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で
染色細胞を分析した。

結果
構築物はすべて、ヒトＣＤ３を発現するＪｕｒｋａｔ Ｅ６−１細胞に結合し、かつＦ
ｙｎｏｍｅｒ−抗体融合体さらには抗ＣＤ３×抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ対照ＣＯＶＡ４４５
は、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８に結合した（図１２）。予想どおり、抗ＣＤ３抗体ＣＯＶＡ４
８９では、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８に対する特異的結合は、観測されなかった。

実施例２．３ − 高レベルのＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞に対して選択的なリダイレク
トＴ細胞媒介細胞傷害性の分析
Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６９（１０
）：４２７０−６から採用したプロトコルを用いて、リダイレクトＴ細胞媒介細胞傷害性
アッセイで、ポリペプチドＣＯＶＡ４９３、ＣＯＶＡ４９４、ＣＯＶＡ４９７、ＣＯＶＡ
４９９、二重特異的ｓｃＦｖ対照ＣＯＶＡ４４５、および抗ＣＤ３抗体（ＣＯＶＡ４８９
、配列番号１７１および１７２）を試験した。簡潔に述べると、実験の前夜、Ａｃｃｕｔ
ａｓｅ処理により適切な数の標的細胞を取り出し、９６ウェルプレート中の１０％ＦＣＳ
が追加された１５０μｌの適切な成長培地中に３０００〜５０００細胞／ウェルの細胞密
度で標的細胞を接種した。３７℃および５％ＣＯ_２でアッセイプレートを一晩インキュベ
ートした。使用した標的腫瘍細胞は、高レベルのＥＧＦＲ（約１．５×１０^６ＥＧＦＲ分
子／細胞）を発現するＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−１３２（商
標））、および低レベルのＥＧＦＲ（約５×１０^４ＥＧＦＲ分子／細胞）を発現するＨＴ
−２９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−３８（商標））であった。実施例１．７に記載さ
れるようにＥＧＦＲ表面発現を定量した。ただし、飽和濃度の抗ＥＧＦＲ抗体（Ｍｉｌｌ
ｉｐｏｒｅ ＭＡＢＦ１２０）を使用した。

実験日、エフェクター分子を１０％ＦＣＳ、ＲＰＭＩ中に１５ｎＭの最大濃度に希釈し
て、１／２０希釈の希釈系列を調製した。ヒトＣＤ８＋富化Ｔ細胞をエフェクター細胞と
して使用した。製造業者により推奨されるように、ＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓ Ｓｅｐａｒａ
ｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙ １３０−０９８−３０９）および赤血球溶解液（Ｍｉｌｔｅｎ
ｙ １３０−０９４−１８３）と一緒にＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓヒトＣＤ８＋単離キット（
Ｍｉｌｔｅｎｙｉ １３０−０９８−１９４）を用いて、Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅ Ｂｅｒ
ｎから入手した新鮮なバフィーコート調製物からＣＤ８＋富化Ｔ細胞を単離した。適切な
量のＴ細胞を遠心分離し、１０％ＦＣＳ、ＲＰＭＩ中に再懸濁させた。細胞濃度を１×１
０^６細胞／ｍＬに調整した。最後に、アッセイプレートから消費培地を取り出して、５０
μｌ／ウェルの新鮮１０％ＦＣＳ、ＲＰＭＩで置換した。次いで、５０μｌのエフェクタ
ー分子および５０μｌのエフェクターＴ細胞を添加した。最終エフェクター細胞対標的細
胞比は、１０：１であった。エフェクター分子の最終最大濃度は、５ｎＭであった。最終
アッセイ体積は、１５０μｌ／ウェルであった。本発明に係るＦｙｎｏｍｅｒ−抗体融合
タンパク質がＴ細胞のエンゲージメントを介して死滅活性を発揮することを実証するため
に、同様にＴ細胞の不在下で、５ｎＭの濃度のＣＯＶＡ４９３、ＣＯＶＡ４９４、ＣＯＶ
Ａ４９７、ＣＯＶＡ４９９、およびＣＯＶＡ４４５と共に、標的細胞をインキュベートし
た。

アッセイプレートを３７℃、５％ＣＯ_２で６４時間インキュベートした。次いで、細胞
培養上清を除去し、各ウェルをＰＢＳで１回洗浄した。製造業者の推奨に従ってＸＴＴ試
薬（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｘ４６２６）を用いて、細胞生存能を評価した。１％Ｔｒｉ
ｔｏｎ−Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）で標的細胞を処理することにより１００％溶解対照を含
め、エフェクター細胞のみを用いて標的細胞をインキュベートすることにより自然溶解の
値を得た（「自然溶解」）。ＸＴＴ基質添加の５時間後、４５０ｎｍで吸光度を測定した
。すべての測定をトリプリケート方式で行った。次式：
生存％＝（値−１００％溶解）／（自然溶解−１００％溶解）＊１００
を用いて細胞生存パーセントを計算した。次いで、細胞生存％をエフェクター分子濃度に
対してプロットし、Ｐｒｉｓｍ ５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて用
量−反応シグモイドに当てはめることにより、データを評価した。

結果
高レベルのＥＧＦＲを発現するＭＤＡ−ＭＢ−４６８標的細胞に対するＣＯＶＡ４９３
、ＣＯＶＡ４９４、ＣＯＶＡ４９７、およびＣＯＶＡ４９９の用量依存的リダイレクトＴ
細胞傷害性を観測可能であった（図１３。表５には、試験したタンパク質で得られたＥＣ
_５０値がまとめられている。

さらに、低レベルのＥＧＦＲを発現するＨＴ−２９標的細胞に対するＣＯＶＡ４９３お
よび二重特異的抗ＣＤ３×抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ対照分子の用量依存的リダイレクトＴ細
胞傷害性を観測可能であった。この代表的なアッセイでは、ＣＯＶＡ４９３は、１１７．
３ｐＭのＥＣ_５０値を有し、ＣＯＶＡ４４５は、２．５ｐＭのＥＣ_５０値を有していた。
驚くべきことに、ＣＯＶＡ４９４、ＣＯＶＡ４９７、およびＣＯＶＡ４９９は、５ｎＭの
最高濃度でさえも、低レベルのＥＧＦＲを発現するＨＴ−２９標的細胞に対する有意なリ
ダイレクトＴ細胞傷害性を示さなかった（表５）。

抗ＣＤ３抗体（ＣＯＶＡ４８９、配列番号１３および１４、５ｎＭの最高濃度で測定し
た）では細胞傷害性が観測されなかったため、細胞傷害作用は、抗ＥＧＦＲ Ｆｙｎｏｍ
ｅｒの存在に依存性した。

ＣＯＶＡ４９３、ＣＯＶＡ４９４、ＣＯＶＡ４９７、ＣＯＶＡ４９９、および二重特異
的抗ＣＤ３×抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ対照分子（ＣＯＶＡ４４５）と共に標的細胞をインキ
ュベートした時、細胞傷害性は観測されなかったため、細胞傷害作用は、エフェクターＴ
細胞の存在に依存性した（図１４）。

実施例３ − ＣＤ３３陽性腫瘍細胞に対するリダイレクトＴ細胞媒介細胞傷害性の分析
実施例３．１．− 抗ＣＤ３抗体抗ＣＤ３３ Ｆｙｎｏｍｅｒ融合タンパク質の発現およ
び精製
Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉら（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）ＪＢ
Ｃ，２８２，ｐ．３１９６−３２０４）に記載されるように、得られる構築物がＣ末端ｍ
ｙｃ−ヘキサヒスチジンタグを有するように、配列番号１７４および１７７〜１８６に示
されるアミノ酸をコードするＤＮＡを細菌発現ベクターｐＱＥ１２中にクローニングした
。２００μｌスケールの培養でＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌のサイトゾル中でポリペプ
チドを発現させた。モノクローナル透明化ライセートをＥＬＩＳＡに使用した。すなわち
、ヒト組換えＣＤ３３（ヒトＦｃγ１への融合体としてＲ＆Ｄからまで購入した）をＭａ
ｘｉＳｏｒｐウェル（Ｎｕｎｃ）上に固定し、ＰＢＳ中の４％ミルク（Ｒａｐｉｌａｉｔ
，Ｍｉｇｒｏｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）でブロックした後、５０μｇ／ｍｌのマウス
抗ｍｙｃマウス抗体９Ｅ１０（Ｒｏｃｈｅ）を含有するＰＢＳ中の１２．５μｌの１０％
ミルクと５０μｌの透明化ライセートとを適用した。１時間インキュベートした後、結合
されていないＦｙｎｏｍｅｒを洗浄除去し、結合されたＦｙｎｏｍｅｒを抗マウスＩｇＧ
−ＨＲＰ抗体コンジュゲート（Ｓｉｇｍａ）で検出した。ＢＭ ｂｌｕｅ ＰＯＤ基質（
Ｒｏｃｈｅ）を添加することによりペルオキシダーゼ活性の検出を行い、１Ｍ Ｈ_２ＳＯ
_４を添加することにより反応を停止させた。ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）およびコーティン
グされていないＭａｘｉＳｏｒｐウェルに対する交差反応性の不在に関して、同一のＥＬ
ＩＳＡによりＥＬＩＳＡ陽性クローンを試験した。さらに、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ ｅ
ｔ ａｌ．（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）ＪＢＣ，２８２，ｐ．
３１９６−３２０４）に記載されるように、固定化金属アフィニティークロマトグラフィ
ーカラムを用いて、配列番号１７４および１７７〜１８６に示されるポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを細菌ライセートから精製した。２３ｎＭマウス抗ｍｙｃ抗体９Ｅ１０を含
有する１００μｌのＰＢＳ／１％ＦＣＳ／０．２％アジ化ナトリウム中で、９３ｎＭ精製
Ｆｙｎｏｍｅｒを１×１０^５Ｕ９３７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５９３．２（商標））
と共にインキュベートした。氷上で６０分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、結合
された配列を抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
）により検出した。次いで、染色された細胞をＦＡＣＳアナライザーで分析した。ＤＮＡ
配列決定により特異的バインダーのＤＮＡ配列を検証した。ＦｙｎＳＨ３由来ＣＤ３３バ
インダーのアミノ酸配列は、配列リスト中に添付されるように配列番号１７４および１７
７〜１８６で示される。

１５アミノ酸リンカー（配列番号１６２）を介して、ＣＤ３３結合Ｆｙｎｏｍｅｒ Ｅ
Ｅ１Ｌ１Ｂ３（配列番号１７４）を抗ＣＤ３結合抗体（配列番号２および３）の軽鎖（配
列番号３）のＣ末端に遺伝子融合して、本発明に係る二重特異的抗体Ｆｙｎｏｍｅｒ抗体
融合タンパク質ＣＯＶＡ４６７（配列番号２および１７５）を生成した。実施例１に記載
されるように、ＣＯＶＡ４６７および国際公開第２０１０／０３７８３５号パンフレット
に記載の抗ＣＤ３×抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ対照ＣＯＶＡ４６３（配列番号１７６）の発現
および精製を行った。ＣＯＶＡ４６７は、非修飾抗ＣＤ３抗体と同程度に良好に発現し（
収量：親の抗ＣＤ３抗体ＣＯＶＡ４１９では４６ｍｇ／ｌであったのに対してＣＯＶＡ４
６７では５６ｍｇ／ｌ）、かつ図１５ＡのＳＥＣ分析により示されるように、精製後、凝
集しなかった。

実施例３．２ − ＣＤ３３を発現する腫瘍細胞に対するリダイレクトＴ細胞媒介細胞傷
害性の分析
Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６９（１０
）：４２７０−６から採用したプロトコルを用いて、リダイレクトＴ細胞媒介細胞傷害性
アッセイで、ポリペプチドＣＯＶＡ４６７（配列番号２および１７５）および二重特異的
ｓｃＦｖ対照ＣＯＶＡ４６３（配列番号１７６）を試験した。

簡潔に述べると、丸底９６ウェルプレート中の１０％ＦＣＳが追加された５０μＬのＲ
ＰＭＩ培地に、１００００細胞／ウェルの細胞密度でＵ９３７（ＡＴＣＣカタログ番号Ｃ
ＲＬ−１５９３．２（商標））標的細胞を接種した。エフェクター分子を１０％ＦＣＳ、
ＲＰＭＩ中に１５ｎＭの最大濃度に希釈して、１／１０希釈の希釈系列を調製した。ヒト
ＣＤ８＋富化Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用した。実施例３に記載されるようにＣ
Ｄ８＋富化Ｔ細胞を単離し、２×１０^６細胞／ｍＬまでの濃度に調整した。次いで、指示
濃度の５０μｌのエフェクター分子および５０μｌのエフェクターＴ細胞を添加した。最
終エフェクター細胞対標的細胞比は、１０：１であった。最終アッセイ体積は、１５０μ
ｌ／ウェルであった。

アッセイプレートを３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。製造業者の推
奨に従ってＣｙｔｏＴｏｘ−Ｆｌｕｏｒ（商標）細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ
Ｇ９２６０）を用いて、細胞溶解を評価した。０時間インキュベーションで２％サポニン
（Ｓｉｇｍａ）で標的細胞を処理することにより、１００％溶解対照を含めた。エフェク
ターＴ細胞のみで標的細胞をインキュベートすることにより、自然溶解を測定した（「自
然溶解」）。２４時間インキュベートした後、アッセイプレートを４００×ｇで１０分間
遠心沈降し、１００μｌの上清を黒色９６ウェルプレートに移した。ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｆ
ｌｕｏｒ（商標）試薬およびアッセイ緩衝液を室温で解凍し、６０μｌの試薬を３０ｍｌ
のアッセイ緩衝液中に希釈した。続いて、５０μｌのこの混合物をアッセイプレート上清
の各ウェルに添加した。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、４８５ｎｍ励起／
５２０ｎｍ発光で蛍光を記録した。すべての測定をトリプリケート方式で行った。次式：
細胞溶解％＝（値−自然溶解）／（１００％溶解−自然溶解）＊１００
を用いて細胞生存パーセントを計算した。次いで、細胞溶解％をエフェクター分子濃度に
対してプロットし、Ｐｒｉｓｍ ５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて用
量−反応シグモイドに当てはめることにより、データを評価した。

結果
ＣＤ３３発現Ｕ９３７細胞に対するＣＯＶＡ４６７（配列番号２および１７５）の用量
依存的細胞傷害性を観測可能であることを実証可能であった（図１５Ｂ）。この代表的な
アッセイでは、ＣＯＶＡ４６７（配列番号２および１７５）は、２．１ｐＭのＥＣ_５０値
を有していた。重要なこととして、抗ＣＤ３抗体（ＣＯＶＡ４１９、配列番号２および３
）では細胞傷害性が観測されなかったため、細胞傷害作用は、抗ＣＤ３３ Ｆｙｎｏｍｅ
ｒの存在に依存した。同一のアッセイ条件下で、二重特異的抗ＣＤ３３×抗ＣＤ３ ｓｃ
ＦｖｓｃＦｖ対照分子（配列番号１７６）では、１．６ｐＭのＥＣ_５０値が得られた。驚
くべきことに、２価および全長ＩｇＧベースのＦｙｎｏｍｅｒ−抗体融合タンパク質は、
現在使用されているｓｃＦｖｓｃＦｖタンパク質と同一範囲内のリダイレクト死滅アッセ
イの効力を示すが、最適とは言えない生物物理学的性質および短いｉｎ ｖｉｖｏ半減期
という欠点を有していないことが見いだされた。

表６には、試験したタンパク質で得られたＥＣ_５０値がまとめられている。

以下の態様を包含し得る。
［１］ （ｉ）ＣＤ３と、（ｉｉ）癌細胞上の表面標的抗原と、に特異的に結合する二重特異的結合分子であって、
（ａ）ＣＤ３に特異的に結合する抗体と、
（ｂ）癌細胞上の表面標的抗原に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドと、を含み、
前記Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列からなり、ただし、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸位置１０〜１９内の少なくとも１つのアミノ酸が、置換、欠失、または付加されていること、かつ
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸位置２９〜３６内の少なくとも１つのアミノ酸が、置換、欠失、または付加されていること、を条件とし、
前記ポリペプチドが、配列番号１の前記アミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、同一性の決定では、配列番号１のアミノ酸位置１２〜１７および３１〜３４が除外されること、を条件とする、二重特異的結合分子。
［２］ ＣＤ３に特異的に結合する前記抗体が、テプリズマブ、オテリキシズマブ、Ｃｒｉｓ−７、またはＳＰ３４である、上記［１］に記載の結合分子。
［３］ ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＣＥＡ、ＥＰＨＡ２、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ＩＧＦＲ１、線維芽細胞活性化タンパク質α、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ｃ−ＭＥＴ、ＥｐＣＡＭ、またはＰＳＭＡに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含む、上記［１］または［２］に記載の結合分子。
［４］ 前記結合分子が、ＨＥＲ２に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、前記２つのポリペプチドの第１が、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２が、前記抗体の前記２つの重鎖の第２のＮ末端に結合される、上記［１］〜［３］のいずれか一項に記載の結合分子。
［５］ 前記結合分子が、ＥＧＦＲに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、（ｉ）前記２つのポリペプチドの第１が、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２が、前記抗体の前記２つの重鎖の第２のＮ末端に結合されるか、（ｉｉ）前記２つのポリペプチドの前記第１が、前記抗体の前記２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの前記第２が、前記抗体の前記２つの重鎖の第２のＣ末端に結合されるか、（ｉｉｉ）前記２つのポリペプチドの前記第１が、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの前記第２が、前記抗体の前記２つの軽鎖の第２のＮ末端に結合されるか、または（ｉｖ）前記２つのポリペプチドの前記第１が、前記抗体の前記２つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの前記第２が、前記抗体の前記２つの軽鎖の第２のＣ末端に結合される、上記［１］〜［３］のいずれか一項に記載の結合分子。
［６］ 前記結合分子が、ＣＤ３３に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含み、前記２つのポリペプチドの第１が、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２が、前記抗体の前記２つの軽鎖の第２のＣ末端に結合される、上記［１］〜［３］のいずれか一項に記載の結合分子。
［７］ ＣＤ３に特異的に結合する前記抗体と前記Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドとがリンカーにより結合される、上記［１］〜［６］のいずれか一項に記載の結合分子。
［８］ 前記リンカーがペプチドリンカーである、上記［７］に記載の結合分子。
［９］ 前記リンカーが、配列番号１６２、１６０、および１６１からなる群から選択される配列を有する、上記［８］に記載の結合分子。
［１０］ 前記二重特異的結合分子が配列番号１６３および／または１６４を含む、上記［１］〜［４］、［８］、または［９］のいずれか一項に記載の結合分子。
［１１］ 前記二重特異的結合分子が配列番号１７１および／または１９８を含む、上記［１］〜［３］、［５］、［８］、または［９］のいずれか一項に記載の結合分子。
［１２］ 前記二重特異的結合分子が配列番号２および／または１７５を含む、上記［１］〜［３］、［６］、［８］、または［９］のいずれか一項に記載の結合分子。
［１３］ 上記［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の結合分子をコードする核酸分子。
［１４］ 上記［１３］に記載の核酸分子を含むベクター。
［１５］ 上記［１４］に記載のベクターで形質転換された宿主細胞または非ヒト宿主。
［１６］ 上記［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の結合分子、上記［１３］に記載の核酸分子、上記［１４］に記載のベクター、および／または上記［１５］に記載の宿主細胞もしくは非ヒト宿主、を含む医薬組成物。
［１７］ 癌を治療または予防する方法における使用のための、上記［１６］に記載の医薬組成物。
［１８］ 前記癌が、乳癌、血液学的悪性疾患、たとえば、ＮＨＬ、Ｂ−ＡＬＬ、ＡＭＬ、他の癌、たとえば、前立腺癌、黒色腫、肺癌、胃癌、卵巣癌、頭頸部癌、結腸直腸癌、膵臓癌、甲状腺癌、神経膠腫、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、または悪性腹水からなる群から選択される、上記［１７］に記載の使用のための医薬組成物。
［１９］ 前記癌が、上記［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の結合分子により特異的に結合される、上記［１３］に記載の核酸分子によりコードされる結合分子により特異的に結合される、上記［１４］に記載のベクターにより発現される結合分子により特異的に結合される、および／または上記［１５］に記載の宿主細胞もしくは非ヒト宿主により発現される結合分子により特異的に結合される、表面標的抗原を、非腫瘍細胞上に発現される量の少なくとも２倍の量で発現する、上記［１７］または［１８］に記載の使用のための医薬組成物。

Claims (19)

1. （ｉ）ＣＤ３と、（ｉｉ）癌細胞上の表面標的抗原と、に特異的に結合する二重特異的
   結合分子であって、
   （ａ）ＣＤ３に特異的に結合する抗体と、
   （ｂ）癌細胞上の表面標的抗原に結合するＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドと、
   を含み、
   前記Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列からなり、ただし
   、
   （ｉ）配列番号１のアミノ酸位置１０〜１９内の少なくとも１つのアミノ酸が、置換、
   欠失、または付加されていること、かつ
   （ｉｉ）配列番号１のアミノ酸位置２９〜３６内の少なくとも１つのアミノ酸が、置換
   、欠失、または付加されていること、
   を条件とし、
   前記ポリペプチドが、配列番号１の前記アミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列
   同一性を有し、同一性の決定では、配列番号１のアミノ酸位置１２〜１７および３１〜３
   ４が除外されること、を条件とする、二重特異的結合分子。
2. ＣＤ３に特異的に結合する前記抗体が、テプリズマブ、オテリキシズマブ、Ｃｒｉｓ−
   ７、またはＳＰ３４である、請求項１に記載の結合分子。
3. ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＣＥＡ、ＥＰＨＡ２、黒色腫関連コンドロ
   イチン硫酸プロテオグリカン、ＩＧＦＲ１、線維芽細胞活性化タンパク質α、前立腺幹細
   胞抗原（ＰＳＣＡ）、ｃ−ＭＥＴ、ＥｐＣＡＭ、またはＰＳＭＡに特異的に結合する２つ
   のＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドを含む、請求項１または２に記載の結合分子。
4. 前記結合分子が、ＨＥＲ２に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチド
   を含み、前記２つのポリペプチドの第１が、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端に結合
   され、かつ前記２つのポリペプチドの第２が、前記抗体の前記２つの重鎖の第２のＮ末端
   に結合される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合分子。
5. 前記結合分子が、ＥＧＦＲに特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチド
   を含み、（ｉ）前記２つのポリペプチドの第１が、前記抗体の２つの重鎖の第１のＮ末端
   に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの第２が、前記抗体の前記２つの重鎖の第２の
   Ｎ末端に結合されるか、（ｉｉ）前記２つのポリペプチドの前記第１が、前記抗体の前記
   ２つの重鎖の第１のＣ末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの前記第２が、前記
   抗体の前記２つの重鎖の第２のＣ末端に結合されるか、（ｉｉｉ）前記２つのポリペプチ
   ドの前記第１が、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＮ末端に結合され、かつ前記２つのポリ
   ペプチドの前記第２が、前記抗体の前記２つの軽鎖の第２のＮ末端に結合されるか、また
   は（ｉｖ）前記２つのポリペプチドの前記第１が、前記抗体の前記２つの軽鎖の第１のＣ
   末端に結合され、かつ前記２つのポリペプチドの前記第２が、前記抗体の前記２つの軽鎖
   の第２のＣ末端に結合される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合分子。
6. 前記結合分子が、ＣＤ３３に特異的に結合する２つのＦｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチド
   を含み、前記２つのポリペプチドの第１が、前記抗体の２つの軽鎖の第１のＣ末端に結合
   され、かつ前記２つのポリペプチドの第２が、前記抗体の前記２つの軽鎖の第２のＣ末端
   に結合される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合分子。
7. ＣＤ３に特異的に結合する前記抗体と前記Ｆｙｎ−ＳＨ３由来ポリペプチドとがリンカ
   ーにより結合される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結合分子。
8. 前記リンカーがペプチドリンカーである、請求項７に記載の結合分子。
9. 前記リンカーが、配列番号１６２、１６０、および１６１からなる群から選択される配
   列を有する、請求項８に記載の結合分子。
10. 前記二重特異的結合分子が配列番号１６３および／または１６４を含む、請求項１〜４
    、８、または９のいずれか一項に記載の結合分子。
11. 前記二重特異的結合分子が配列番号１７１および／または１９８を含む、請求項１〜３
    、５、８、または９のいずれか一項に記載の結合分子。
12. 前記二重特異的結合分子が配列番号２および／または１７５を含む、請求項１〜３、６
    、８、または９のいずれか一項に記載の結合分子。
13. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の結合分子をコードする核酸分子。
14. 請求項１３に記載の核酸分子を含むベクター。
15. 請求項１４に記載のベクターで形質転換された宿主細胞または非ヒト宿主。
16. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の結合分子、請求項１３に記載の核酸分子、請求
    項１４に記載のベクター、および／または請求項１５に記載の宿主細胞もしくは非ヒト宿
    主、を含む医薬組成物。
17. 癌を治療または予防する方法における使用のための、請求項１６に記載の医薬組成物。
18. 前記癌が、乳癌、血液学的悪性疾患、たとえば、ＮＨＬ、Ｂ−ＡＬＬ、ＡＭＬ、他の癌
    、たとえば、前立腺癌、黒色腫、肺癌、胃癌、卵巣癌、頭頸部癌、結腸直腸癌、膵臓癌、
    甲状腺癌、神経膠腫、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、または悪性腹水からなる群から選択され
    る、請求項１７に記載の使用のための医薬組成物。
19. 前記癌が、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の結合分子により特異的に結合される
    、請求項１３に記載の核酸分子によりコードされる結合分子により特異的に結合される、
    請求項１４に記載のベクターにより発現される結合分子により特異的に結合される、およ
    び／または請求項１５に記載の宿主細胞もしくは非ヒト宿主により発現される結合分子に
    より特異的に結合される、表面標的抗原を、非腫瘍細胞上に発現される量の少なくとも２
    倍の量で発現する、請求項１７または１８に記載の使用のための医薬組成物。