KR20140064899A

KR20140064899A - 방광암 세포의 검출 방법, 방광암 세포의 검출 방법에 사용하는 프라이머 및 방광암 마커

Info

Publication number: KR20140064899A
Application number: KR1020147007424A
Authority: KR
Inventors: 다카시 시미즈; 히로무 스즈키; 미노루 도요타; 다이지 츠카모토
Original assignee: 엘에스아이피 환도 운에이고우도우가이샤
Priority date: 2011-09-16
Filing date: 2012-03-14
Publication date: 2014-05-28
Also published as: CA2848999A1; EP2757154A1; CN103857796A; WO2013038737A1; EP2757154A4; JPWO2013038737A1; US20150024389A1

Abstract

방광암에 대한 특이도가 높으며, 또한 악성도가 낮은 방광암 조직을 검출할 수 있는 검출 감도(感度)가 높은 방광암의 검출 방법 및 방광암 마커를 제공한다. miR-124, miR-9 및 miR-137에서 선택되는 1개 이상의 miRNA로 이루어지는 방광암 마커의 발현량을 피험자로부터 채취된 피험자 샘플로부터 검출하는 것을 포함하는 방광암 세포의 검출 방법, 방광암 세포의 검출 방법에 사용하는 프라이머 및 방광암 마커이다.

Description

방광암 세포의 검출 방법, 방광암 세포의 검출 방법에 사용하는 프라이머 및 방광암 마커{METHOD FOR DETECTING BLADDER CANCER CELLS, PRIMER USED IN METHOD FOR DETECTING BLADDER CANCER CELLS, AND BLADDER CANCER MARKER}

본 발명은 피험자로부터 얻어진 샘플로부터 피험자의 암을 검출하는 방법, 특히 방광암 세포를 검출하는 방법 및 그 방법에 사용하는 프라이머, 방광암 마커가 되는 물질에 관한 것이다.

현재, 방광암의 검출에는, 요세포진이 가장 널리 사용되고 있다. 요세포진은, 방광으로부터 박리하여 요(尿) 내에 탈락한 방광의 세포를 요 내로부터 채취하고, 그 형상을 현미경으로 관찰함으로써, 암 세포를 검출한다.

한편으로, 조직에 대하여, 유전자 제어를 행하는 짧은 RNA인 마이크로 RNA(이하, 「마이크로 RNA」는 「miRNA」나 「miR」, 「hsa-miRNA」와 각각 교환 가능하게 사용할 경우가 있음)의 발현량을 검출함으로써, 암 조직의 검출을 행하는 방법에 대해서 연구가 진행되고 있다. 이러한 기술로서, 특허문헌 1에는, 검체에 있어서 miR-9 및 miR-137을 함유하는 miRNA의 유전자 발현의 저하를 지표로서 검체의 암화를 검출하는 암의 검출 방법 및 이들을 발현시키는 것에 의한 암 억제 방법 및 암 억제제가 개시되어 있다.

특허문헌 2에는, 대상으로부터의 시험 샘플 중의 miRNA 유전자 산물의 레벨을 측정하고, 유방암을 갖고 있는지, 또는 발생할 리스크의 유무에 대해서 검출하는 방법이 개시되어 있다.

특허문헌 3에는, BCL2 관련암의 항암 치료의 효력을 증가시키는 방법으로서, 대상에 적어도 1개의 항암 치료를 투여하는 것 및 대상에 적어도 1개의 miR 유전자 산물로 BCL2 유전자 전사체 중의 뉴클레오티드 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 miR 유전자 산물을 투여하는 것에 의한 BCL2 관련암의 진단 및 요법을 위한 방법이 개시되어 있다. 구체적으로는, 암 중 만성 임파구성 백혈병에 있어서의, miR 유전자 중 miR-15 및 miR-16의 투여에 대한 검증 결과가 개시되어 있다. miRNA의 발현이 감소하고 있을 가능성이 있는 암 조직으로서, 방광이 기재되어 있다. 또한 BCL2 관련암의 진단 및 요법에 사용할 수 있는 miRNA로서 miR-137 및 miR-9가 예시되어 있다.

특허문헌 4에는, miR-137을 함유하는 마이크로 RNA를 부인과암의 바이오 마커로서 사용하는 부인과암의 판정 방법이 개시되어 있다. 부인과암의 판정 방법으로서는, miRNA의 발현량을 직접 검출하는 방법이 기재되어 있다.

특허문헌 5에는, 암 환자의 치료 후 생존을 예측하는 방법으로서, 치료를 받은 암 환자의 hsa-miR137을 함유하는 마이크로 RNA의 발현 레벨을 검출하고, 이 마이크로 RNA의 발현 레벨에 의거하여 환자의 리스크 스코어를 계산하는 것, 및 리스크 스코어의 값에 의거하여 치료 후 생존의 전망을 결정하는 것으로 이루어지는 암 환자의 치료 후 생존 예측의 방법이 개시되어 있다. 예측하는 암의 예로서는 폐암, 백혈병, 유방암, 취장암, 선암, 편평 상피암, 결장암 또는 간세포암이 기재되어 있다.

특허문헌 6에는, 적어도 1종의 miR 유전자 산물의 레벨을 측정하고, 피험자는 고형암을 갖는지 또는 그것을 발생할 위험성이 있는지 중 어느 하나를 판단하는 방법이 개시되어 있다.

비특허문헌 1에는, miR-137의 대장암에서의 발현에 대해서 기재되어 있다. 비특허문헌 2에는, miR-137을 함유하는 miRNA의 구강암에서의 발현에 대해서 기재되어 있다. 비특허문헌 3에는, miR-137의 대장암에서의 발현에 대해서 기재되어 있다.

일본국 특개2009-171876호 공보 일본국 특표2009-505639호 공보 일본국 특표2009-507918호 공보 일본국 특개2010-154843호 공보 일본국 특표2010-523156호 공보 일본국 특표2009-531019호 공보

F. Balaguer et al, Cancer Res 2010; 70:6609-6618. K. Kozaki et al, Cancer Res 2008; 68:2094-2105. M. Liu et al, Int. J. Cancer:128,1269-1279(2011).

현재, 방광암의 검출에 널리 사용되고 있는 요세포진에서는, 방광암의 검출의 감도(感度)에 문제가 있었다. 즉, 요세포진은 현미경으로 세포의 형상을 관찰하므로, 그 형상으로부터 분명히 종양 세포라고 파악할 수 있는 세포를 검출할 수 있으면 특이적으로 방광암 세포를 검출할 수 있지만, 형상으로부터 파악할 수 없는 악성도가 낮은 종양 세포에 대해서는 검출할 수 없다. 그 때문에, 악성도가 낮은 종양을 검출하는 것이 곤란했다.

그래서 본 발명자들은, 암 세포에 대한 특이도와 악성도가 낮은 종양을 검출할 수 있는 검출 감도를 구하기 위해, 유전자학적으로 암 세포를 검출하는 방법, 특히 miRNA의 검출에 의한 암의 검출 방법에 착목했다. 또, 특허문헌 1에는, miRNA의 검출에 의한 암의 검출 방법 및 이들을 발현시키는 것에 의한 암 억제 방법 및 암 억제제에 대해서 기재되어 있지만, 개시되어 있는 것은 구강 편평 상피암에 대한 것으로, 방광암의 조직에 대해서는 검증되고 있지 않다.

특허문헌 2에는, 유방암 또는 유방암이 발생할 리스크에 대해서 검출하는 방법 및 조성물에 대해서 기재되어 있지만, 방광암의 조직에 대해서는 검증되고 있지 않다.

특허문헌 3에서는, miRNA의 발현이 일반적으로 감소하고 있어도 되는 것으로서 다수 예시된 암 조직 중 하나에 방광이 포함되어 있지만, 방광암에 있어서 발현이 저하하고 있는 유전자에 대해서는 구체적으로 검증을 행하고 있지 않고, 방광암에 적용할 수 있다는 근거도 나타나 있지 않다. 투여하는 miRNA 유전자로서 miR-137 및 miR-9가 예시되어 있지만, BCL2 유전자의 발현을 저하시키는 것이 암의 치료에 연결된다는 가설 하, 그 BCL2 유전자의 발현을 이론적으로 저하시킬 가능성이 있는 다수의 miRNA의 후보 중의 하나로서 예시하고 있음에 지나지 않고, 이들에 의해 실제로 BCL2 유전자 발현이 저하하는지의 여부는 검증되고 있지 않다. 또한, 이 방법은 BCL2 유전자 및/또는 유전자 산물의 과잉 발현에 관련하는 암의 치료 가능성에 한정되어, miR-137 및 miR-9의 투여가 실제로 암의 치료에 연결되는지의 여부에 대해서도 일체 검증하고 있지 않다.

특허문헌 4에는, 소위 부인과암의 판정 방법 및 판정 키트에 대해서 기재되어 있지만, 방광암에 대해서는 기재되어 있지 않다. 또한, 자궁체암으로는, miR-137의 발현이 반대로 상승하고 있는 것이 확인되고 있다.

특허문헌 5에는, 암 환자의 치료 후의 생존을 예측하는 방법이 개시되어 있지만, 암 환자인지의 여부의 검출 방법에 대해서는 기재되어 있지 않다. 또한, 암에 대해서, 방광암은 기재되어 있지 않다.

특허문헌 6에서는, 6종의 암(유방, 대장, 폐, 췌장, 전립선, 위)에 있어서, miR-137의 발현은 변화하고 있지 않다. miR-137은, 측정되는 유전자로서 선택되지 않는 것(단락 [0037]) 중에 예시되고, 특히 상술한 6종의 암의 측정에 대해서도 각각 선택되지 않는 것으로 예시되고 있다.

비특허문헌 1∼3에서는, miR-137을 함유하는 miRNA의 발현과, 대장암, 구강암의 발증이나, 대장암의 침윤과의 관련에 대해서 각각 기재되어 있지만, 방광암에 대해서는 검증되고 있지 않다.

상기에 있는 바와 같이, 암종이나 암의 상태에 따라 관련하는 miRNA나, 그 발현 레벨에 다양한 차이가 있어, 복잡한 기구를 나타내고 있는 바, 본 발명자들은, 방광암에 있어서 발현 억제되어 있는 miRNA를 탐색했다. 그 결과, 방광암에 있어서 발현 억제되어 있는 miRNA를 알아내고, 그 발현량을 측정하는 것에 의한 방광암의 검출 방법을 찾아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서 본 발명의 목적은, 방광암에 대한 특이도가 높으며, 또한 악성도가 낮은 방광암 조직을 검출할 수 있는 검출 감도가 높은 방광암 세포의 검출 방법, 이 방법에 사용하는 프라이머 및 방광암 마커를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 방광암 세포의 검출 방법은, miR-124, miR-9 및 miR-137에서 선택되는 1개 이상의 miRNA로 이루어지는 방광암 마커의 발현량을 피험자로부터 채취된 피험자 샘플로부터 검출하는 것을 포함한다.

방광암의 조직에 있어서, 정상 조직과 비교하여 특이적으로 발현량이 다른 miRNA를 방광암 마커로서 검출한다. 조직 내의 miRNA는, 리얼 타임 reverse-transcription PCR(리얼 타임 역전사 PCR, 리얼 타임 RT-PCR, 정량 RT-PCR) 등의 수단으로 신속하며 또한 정확하게 발현의 유무 및 그 양을 정량적으로 검출할 수 있으므로, miR-124, miR-9 및 miR-137에서 선택되는 1개 이상의 miRNA의 발현량을 검출함으로써 특이적으로 방광암 세포를 검출할 수 있으며, 또한 악성도가 낮은 방광암 조직이어도 검출할 수 있다.

방광암 마커의 발현량의 검출은, 방광암 마커 유전자의 메틸화(메틸화 시토신)의 검출에 의해 상기 방광암 마커의 발현량의 저하를 검출하는 것이 바람직하다. 방광암 세포에 있어서는 miR-124, miR-9 및 miR-137 등의 발현이, 각각이 코드되어 있는 게놈 유전자상에 있어서 메틸화에 의해 억제되어 있기 때문에, miR-124에 대해서는 miR-124-2 유전자 및 miR-124-3 유전자, miR-9에 대해서는 miR-9-3 유전자, miR137에 대해서는 miR-137 유전자에 있어서의 메틸화의 검출에 의해, 방광암 세포에 있어서의 이들 miRNA의 발현량의 저하와 방광암 세포를 검출할 수 있다. 대상 miRNA를 다량으로 발현하고 있는 정상 조직 중에 암 조직이 포함되어 있을 경우, 발현량을 직접적으로 검출한다는 수단에서는, 정상 조직에서의 발현이 검출되게 되므로 암 조직에 있어서의 대상 miRNA에 대해서 검출하는 것이 곤란할 경우가 있지만, 발현량의 저하를 메틸화라는 양성의 시그널로서 검출함으로써, 그 존재를 명확하며 또한 확실하게 검출할 수 있다.

또, 방광암 세포의 검출 방법은, miR-137 유전자, miR-124-2 유전자, miR-124-3 유전자, 및 miR-9-3 유전자에서 선택되는 1개 이상의 유전자의 메틸화의 레벨을 피험자로부터 채취된 피험자 샘플로부터 검출하는 것을 포함한다. 이 검출 방법에 있어서, 메틸화의 레벨을 문턱값과 비교하는 것이 바람직하다. 암 조직이 아닌 것이 판명되고 있는 다른 조직이나 다른 부위의 조직 등에 있어서의 상술한 유전자의 메틸화의 레벨을 문턱값으로 하고, 이 문턱값에 대하여 검출 대상으로 하는 조직에 있어서의 상술한 유전자의 메틸화의 레벨을 비교함으로써, 방광암 세포를 검출할 수 있다. 피험자 샘플에 있어서의 메틸화의 레벨이 문턱값에 비해 높을 경우, 피험자 샘플이 암 조직인 것을 판정할 수 있다.

메틸화의 검출은 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의해 행하는 것이 바람직하다. 본 방법에 의해, 대상으로 하는 miRNA의 검출을 정밀하며 또한 정량적으로 행할 수 있으므로, 방광암 세포의 조직의 검출을 확실하게 행할 수 있다.

방광암 마커가 적어도 miR-137을 함유하는 것이 바람직하다. miR-137은 방광암 세포에 있어서 정상 조직과 비교하여 발현량에 특히 현저한 차이가 보이므로, miR-137에 의해 가장 확실성이 높게 방광암 세포를 검출할 수 있다.

피험자 샘플에 있어서의 방광암 마커의 발현량을 문턱값과 비교하는 것이 바람직하다. 암 조직이 아닌 것이 판명되고 있는 다른 조직이나 다른 부위의 조직 등의 miRNA의 발현량을 문턱값으로 하여, 비교함으로써 암 조직을 검출할 수 있다. 피험자 샘플에 있어서의 방광암 마커의 발현량이 문턱값에 비해 낮을 경우, 피험자 샘플이 암 조직인 것을 판정할 수 있다.

문턱값은, 정상 조직으로부터 채취된 컨트롤 샘플에 있어서의 상기 방광암 마커의 발현량인 것이 바람직하다. 방광암 세포에 있어서는 miR-124, miR-9 및 miR-137 등의 발현이 억제되어 있기 때문에, 정상 조직과 비교한 발현량의 저하에 의해 방광암 세포를 검출할 수 있다.

문턱값은, 피험자로부터 다른 시기에 채취된 또는 피험자의 다른 조직으로부터 채취된 컨트롤 샘플에 있어서의 상기 방광암 마커의 발현량인 것이 바람직하다. 피험자로부터 다른 시기에 채취된 컨트롤 샘플과 비교함으로써, 암을 발증하고 있지 않을 때나 암을 절제했을 때와의 비교로 방광암 세포를 검출할 수 있다. 방광암 세포의 발현에 대한 시간적인 데이터를 얻을 수 있으므로, 암의 발생이나 치료 성과를 판정할 수 있다. 피험자의 다른 조직으로부터 채취된 컨트롤 샘플과 비교함으로써, 암을 발증하고 있지 않은 조직과의 비교로 방광암 세포를 검출할 수 있다. 부위마다 샘플을 채취함으로써, 암이 발생하고 있는 조직의 부위를 검출할 수 있다.

피험자 샘플이 요 샘플인 것이 바람직하다. 요 샘플은 수술 등에 상관없이 침습성도 없어 안전하고, 간편하며 또한 신속하게 빈회(頻回)를 채취할 수 있다. 요 샘플은, 요 중에 박리 탈락한 요로 상피 세포가 검출되므로, 혈액 샘플이나 절제 채취한 샘플에 비해 함유되는 miRNA의 양이 적지만, 본 실시형태에서는 바이설파이트 파이로시퀀싱법 등에 의한 메틸화의 검출을 행하므로, 요 샘플에 의해 충분히 특이도와 감도가 높은 검출이 가능하다.

방광암 마커의 메틸화의 검출에 의한 발현량의 검출에 있어서, 방광암 세포의 검출 방법에 사용하는 프라이머는, 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의한 miR-137 유전자의 증폭에 사용하는 프라이머의 서열이 서열번호 1에 나타내는 포워드 프라이머(GGGTTTAGYGAGTAGTAAGAGTTTTG) 및 서열번호 2에 나타내는 리버스 프라이머(CCCCCTACCRCTAATACTCTCCTC)인 것이 바람직하고, 시퀀스 반응에 사용하는 프라이머의 서열이 서열번호 3에 나타내는 GGTATTTTTGGGTGGATAAT인 것이 바람직하다.

방광암 마커의 메틸화의 검출에 의한 발현량의 검출에 있어서, 방광암 세포의 검출 방법에 사용하는 프라이머는, 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의한 miR-124-2 유전자의 증폭에 사용하는 프라이머의 서열이 서열번호 4에 나타내는 포워드 프라이머(GTTGGGATTGTATAGAAGGATTATTTG) 및 서열번호 5에 나타내는 리버스 프라이머(ACTACRAAAATCCAAAAAAAAATACATAC)인 것이 바람직하고, 시퀀스 반응에 사용하는 프라이머의 서열이 서열번호 6에 나타내는 YGTTTTTATTGTTTTAGTTT인 것이 바람직하다.

방광암 마커의 메틸화의 검출에 의한 발현량의 검출에 있어서, 방광암 세포의 검출 방법에 사용하는 프라이머는, 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의한 miR-124-3 유전자의 증폭에 사용하는 프라이머의 서열이 서열번호 7에 나타내는 포워드 프라이머(AAAAGAGAYGAGTTTTTATTTTTGAGTAT) 및 서열번호 8에 나타내는 리버스 프라이머(TCCTCCRCAACTACCTTCCCCTA)인 것이 바람직하고, 시퀀스 반응에 사용하는 프라이머의 서열이 서열번호 9에 나타내는 GAGATTYGTTTTTTTAAT인 것이 바람직하다.

방광암 마커의 메틸화의 검출에 의한 발현량의 검출에 있어서, 방광암 세포의 검출 방법에 사용하는 프라이머는, 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의한 miR-9-3 유전자의 증폭에 사용하는 프라이머의 서열이 서열번호 10에 나타내는 포워드 프라이머(GATTTGAATGGGAGTTTGTGATTGGT) 및 서열번호 11에 나타내는 리버스 프라이머(TCCCRAAACTCACRTAAAACACCC)인 것이 바람직하고, 시퀀스 반응에 사용하는 프라이머의 서열이 서열번호 12에 나타내는 TTGGATTGAYGTTATTTT인 것이 바람직하다.

메틸화의 검출은 메틸화 특이적 PCR법(MSP법)에 의해 행하는 것도 바람직하다. 본 방법에 의해, 대상으로 하는 miRNA 유전자의 메틸화의 검출을 신속하고, 간편하며, 또한 소량의 DNA 샘플로부터 행할 수 있으므로, 방광암의 조직의 검출을 확실하게 행할 수 있다.

메틸화 특이적 PCR법에 있어서, 방광암 세포의 검출 방법에 사용하는 프라이머는, miR-137 유전자의 메틸화의 검출에 사용하는 프라이머의 서열이, 메틸화 알렐(allele) 특이적 프라이머로서 서열번호 13에 나타내는 포워드 프라이머(GTAGCGGTAGTAGCGGTAGCGGT) 및 서열번호 14에 나타내는 리버스 프라이머(GCTAATACTCTCCTCGACTACGCG), 비(非)메틸화 알렐 특이적 프라이머로서 서열번호 15에 나타내는 포워드 프라이머(TGGTAGTGGTAGTAGTGGTAGTGGT) 및 서열번호 16에 나타내는 리버스 프라이머(CCACTAATACTCTCCTCAACTACACA)인 것이 바람직하다.

메틸화 특이적 PCR법에 있어서, 방광암 세포의 검출 방법에 사용하는 프라이머는, miR-124-2 유전자의 메틸화의 검출에 사용하는 프라이머의 서열이, 메틸화 알렐 특이적 프라이머로서 서열번호 17에 나타내는 포워드 프라이머(AGGGGCGTATTTTGGGGTTTTTGC) 및 서열번호 18에 나타내는 리버스 프라이머(CCCCTACGACGTAATCGACCCG), 비메틸화 알렐 특이적 프라이머로서 서열번호 19에 나타내는 포워드 프라이머(TTTAGGGGTGTATTTTGGGGTTTTTGT) 및 서열번호 20에 나타내는 리버스 프라이머(CATCCCCTACAACATAATCAACCCA)인 것이 바람직하다.

메틸화 특이적 PCR법에 있어서, 방광암 세포의 검출 방법에 사용하는 프라이머는, miR-124-3 유전자의 메틸화의 검출에 사용하는 프라이머의 서열이, 메틸화 알렐 특이적 프라이머로서 서열번호 21에 나타내는 포워드 프라이머(GTTTTAGTGATAATCGGTCGGTGTC) 및 서열번호 22에 나타내는 리버스 프라이머(TCCACGAAATCCACGCTACAAACG), 비메틸화 알렐 특이적 프라이머로서 서열번호 23에 나타내는 포워드 프라이머(TGTGTTTTAGTGATAATTGGTTGGTGTT) 및 서열번호 24에 나타내는 리버스 프라이머(ATATCCACAAAATCCACACTACAAACA)인 것이 바람직하다.

메틸화 특이적 PCR법에 있어서, 방광암 세포의 검출 방법에 사용하는 프라이머는, miR-9-3 유전자의 메틸화의 검출에 사용하는 프라이머의 서열이, 메틸화 알렐 특이적 프라이머로서 서열번호 25에 나타내는 포워드 프라이머(GATTGACGTTATTTTTTCGCGGGGC) 및 서열번호 26에 나타내는 리버스 프라이머(CGAAACTCACGTAAAACACCCGCG), 비메틸화 알렐 특이적 프라이머로서 서열번호 27에 나타내는 포워드 프라이머(TTGGATTGATGTTATTTTTTTGTGGGGT) 및 서열번호 28에 나타내는 리버스 프라이머(CCCAAAACTCACATAAAACACCCACA)인 것이 바람직하다.

본 발명의 방광암 마커는, miR-124, miR-9 및 miR-137에서 선택되는 1개 이상의 miRNA를 함유한다.

방광암 마커의 발현량을 피험자로부터 채취된 피험자 샘플로부터 검출함으로써, 방광암의 조직에 있어서, 정상 조직과 비교하여 특이적으로 발현량이 다른 miRNA를 방광암 마커로서 검출한다. 조직 내의 miRNA의 발현량이나 당해 유전자의 메틸화 레벨은, 리얼 타임 PCR이나 바이설파이트 파이로시퀀싱법 등의 수단으로 신속하며 또한 정확하게 발현의 유무 및 그 양을 정량적으로 검출할 수 있으므로, miR-124, miR-9 및 miR-137에서 선택되는 1개 이상의 miRNA의 발현량이나 당해 유전자의 메틸화 레벨을 검출함으로써 특이적으로 방광암 세포를 검출할 수 있으며, 또한 악성도가 낮은 방광암 조직이어도 검출할 수 있다.

본 발명의 방광암 마커는, 방광암 마커의 발현량을 피험자로부터 채취된 피험자 샘플로부터 검출하는 것을 포함하는 방광암 세포의 검출 방법에 사용한다. 이 방광암 마커의 발현량의 검출은, 상기 방광암 마커가 코드되어 있는 게놈 유전자의 메틸화의 검출에 의해 상기 방광암 마커의 발현량의 저하를 검출하는 것을 포함하는 방광암 세포의 검출 방법에 사용한다.

본 발명의 방광암 세포의 검출 방법은, 심달도(深達度) pTa 또는 이형도(異型度) G1/G2의 피험자로부터 채취된 피험자 샘플로부터 검출을 행한다. 초기암의 환자에 대하여, miRNA의 유전자의 메틸화 레벨을 검출함으로써 초기암의 검출을 유효하게 행할 수 있다.

본 발명의 핵산 분자는, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 또는 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 이들 분자를 방광암 세포의 검출의 방법에 사용할 수 있다.

본 발명에 의하면, 방광암의 조직에 있어서, 정상 조직과 비교하여 특이적으로 발현량이 다른 miRNA를 방광암 마커로서 검출한다. 조직 내의 miRNA의 발현량이나 당해 유전자의 메틸화 레벨은, 리얼 타임 PCR이나 바이설파이트 파이로시퀀싱법 등의 수단으로 신속하며 또한 정확하게 정량적 검출을 할 수 있으므로, miR-124, miR-9 및 miR-137에서 선택되는 1개 이상의 miRNA의 발현량이나 당해 유전자의 메틸화 레벨을 검출함으로써 특이적으로 방광암 세포를 검출할 수 있으며, 또한 악성도가 낮은 방광암 조직이어도 검출할 수 있다.

도 1은 방광암 세포주이고, miRNA를 코드하는 각 게놈 유전자 서열에 대해서 메틸화 특이적 PCR법에 의해 메틸화의 상태를 해석한 결과를 나타내는 도면.
도 2는 도 1의 miRNA 중 miR-9-1, miR-9-3, miR-10b, miR-34b에 대해서 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의해 메틸화 상태를 해석한 결과를 나타내는 그래프.
도 3은 도 1의 miRNA 중 miR-124-1, miR-124-2, miR-124-3, miR-137에 대해서 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의해 메틸화 상태를 해석한 결과를 나타내는 그래프.
도 4는 도 1의 miRNA 중 miR-200b, miR-203, miR-409, miR-675에 대해서 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의해 메틸화 상태를 해석한 결과를 나타내는 그래프.
도 5는 각 방광암 세포주에 대해서 miR-137의 miRNA 발현량(a) 및 miR-137 유전자의 메틸화(b)를 해석한 결과를 나타내는 그래프.
도 6은 암부 조직(T) 및 정상이라고 생각되는 조직(DN)에 있어서의 miR-137의 발현을 해석한 결과를 나타내는 그래프.
도 7은 암부 조직(T) 및 정상이라고 생각되는 조직(DN)에서의 miR-137의 발현량을 해석한 결과(a) 및 메틸화를 해석한 결과(b)를 나타내는 그래프.
도 8은 NMIBC(비침윤성, 표재성(表在性))(a), MIBC(침윤성)(b) 증례의 암부 조직(T), 정상이라고 생각되는 조직(DN) 및 암부(T의 채취 조직)으로부터 5㎜ 떨어진 조직(AN; Adjacent Normal-appearing bladder tissue)의 각각으로부터 채취한 조직에서의 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의한 miR-137의 메틸화를 해석한 결과를 나타내는 그래프.
도 9는 miR-137 유전자에 대해서 NMIBC(비침윤성, 표재성), MIBC(침윤성), 그 양쪽의 케이스의 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의한 메틸화 해석 및 그 ROC 곡선을 해석한 결과를 나타내는 그래프.
도 10은 miR-124-2 유전자에 대해서 NMIBC(비침윤성, 표재성), MIBC(침윤성), 그 양쪽의 케이스의 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의한 메틸화 해석 및 그 ROC 곡선을 해석한 결과를 나타내는 그래프.
도 11은 miR-124-3 유전자에 대해서 NMIBC(비침윤성, 표재성), MIBC(침윤성), 그 양쪽의 케이스의 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의한 메틸화 해석 및 그 ROC 곡선을 해석한 결과를 나타내는 그래프.
도 12는 miR-9-3 유전자에 대해서 NMIBC(비침윤성, 표재성), MIBC(침윤성), 그 양쪽의 케이스의 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의한 메틸화 해석 및 그 ROC 곡선을 해석한 결과를 나타내는 그래프.
도 13은 암 조직 적출 수술의 수술 전 및 암 조직 적출 후에 대해서 요검체의 miR-137 유전자의 메틸화(a) 및 그 ROC 곡선(b)을 해석한 결과를 나타내는 그래프.
도 14는 암 조직 적출 수술의 수술 전 및 수술 후(a), 비(非)암 환자의 수술 전 및 수술 후(b)의 요검체에 있어서의 miR-137 유전자의 메틸화를 해석한 결과를 나타내는 그래프.
도 15는 암 조직 적출 수술의 수술 전 및 암 조직 적출 후에 대해서 요검체의 miR-124-2 유전자의 메틸화(a) 및 그 ROC 곡선(b)을 해석한 결과를 나타내는 그래프.
도 16은 암 조직 적출 수술의 수술 전 및 수술 후(a), 비암 환자의 수술 전 및 수술 후(b)의 요검체에 있어서의 miR-124-2 유전자의 메틸화를 해석한 결과를 나타내는 그래프.
도 17은 암 조직 적출 수술의 수술 전 및 암 조직 적출 후에 대해서 요검체의 miR-124-3 유전자의 메틸화(a) 및 그 ROC 곡선(b)을 해석한 결과를 나타내는 그래프.
도 18은 암 조직 적출 수술의 수술 전 및 수술 후(a), 비암 환자의 수술 전 및 수술 후(b)의 요검체에 있어서의 miR-124-3 유전자의 메틸화를 해석한 결과를 나타내는 그래프.
도 19는 암 조직 적출 수술의 수술 전 및 암 조직 적출 후에 대해서 요검체의 miR-9-3 유전자의 메틸화(a) 및 그 ROC 곡선(b)을 해석한 결과를 나타내는 그래프.
도 20은 암 조직 적출 수술의 수술 전 및 수술 후(a), 비암 환자의 수술 전 및 수술 후(b)의 요검체에 있어서의 miR-9-3 유전자의 메틸화를 해석한 결과를 나타내는 그래프.
도 21은 패널 검출법의 트레이닝 세트에 대해서 나타내는 개략도.
도 22는 패널 검출법의 테스트 세트에 대해서 나타내는 개략도.
도 23은 Tree도에 의한 검출법의 트레이닝 세트에 대해서 나타내는 개략도.
도 24는 Tree도에 의한 검출법의 테스트 세트에 대해서 나타내는 개략도.
도 25는 방광암 세포주에 miR-137을 강제 발현시켜 방광암의 억제 효과를 해석한 결과를 나타내는 그래프.
도 26은 miR-137 유전자 및 그 근방의 게놈 DNA 서열, 및 본 실시형태의 바이설파이트 파이로시퀀싱법 및 메틸화 특이적 PCR(MSP)법으로 사용한 프라이머의 서열을 나타내는 도면.
도 27은 miR-124-2 유전자 및 그 근방의 게놈 DNA 서열, 및 본 실시형태의 바이설파이트 파이로시퀀싱법 및 메틸화 특이적 PCR(MSP)법으로 사용한 프라이머의 서열을 나타내는 도면.
도 28은 miR-124-3 유전자 및 그 근방의 게놈 DNA 서열, 및 본 실시형태의 바이설파이트 파이로시퀀싱법 및 메틸화 특이적 PCR(MSP)법으로 사용한 프라이머의 서열을 나타내는 도면.
도 29는 miR-9-3 유전자 및 그 근방의 게놈 DNA 서열, 및 본 실시형태의 바이설파이트 파이로시퀀싱법 및 메틸화 특이적 PCR(MSP)법으로 사용한 프라이머의 서열을 나타내는 도면.
도 30은 pTa, G1/G2의 환자에 대하여 miR-137, miR-124-2, miR-124-3 및 miR-9-3 유전자의 메틸화를 해석한 결과를 나타내는 도면.
도 31은 도 30의 결과에 의거하는 패널 검출법 및 Tree도에 의한 검출법을 나타내는 도면.

이하, 실시형태를 나타내어 본 발명을 상세하게 설명한다.

(방광암 세포의 검출 방법)

본 실시형태에 있어서의 방광암이란, 요로 상피암(이행 상피암), 편평 상피암 또는 선암과 같은 암으로 방광에 발생하는 것을 가리킨다.

본 실시형태에서는, 1 이상의 miR-124, miR-9 및 miR-137에서 선택되는 1개 이상의 miRNA를 방광암 마커로서 사용한다. miRNA는, 후술하는 서열을 갖는 10염기대 이상의 단쇄(短鎖) 1본쇄(本鎖) RNA이고, 5'-인산, 3'-OH의 구조를 갖고, 3'말단은 2염기 돌출하고 있을 경우가 있다. 본 실시형태에서는, 인공적으로 화학 합성된 것이나, 생물 내에서 합성된 것 모두 가리킨다.

본 발명에서 사용하는 miRNA의 서열 정보 및 각 miRNA를 코드하는 게놈 유전자의 서열은 miR BASE(http://microrna.sanger.ac.uk/)에 등록되어 있다. 서열과 Accession 번호는 각각 이하와 같다.

miR-137(5'-uuauugcuuaagaauacgcguag-3')(MIMAT0000429)(서열번호 29)

miR-124(5'-uaaggcacgcggugaaugcc-3')(MIMAT0000422)(서열번호 30)

miR-9(5'-ucuuugguuaucuagcuguauga-3')(MIMAT0000441)(서열번호 31)

miR-137 유전자(5'-ggtcctctgactctcttcggtgacgggtattcttgggtggataatacggattacgttgttattgcttaagaatacgcgtagtcgaggagagtaccagcggca-3')(MI0000454)(서열번호 32)

miR-124-2 유전자(5'-atcaagattagaggctctgctctccgtgttcacagcggaccttgatttaatgtcatacaattaaggcacgcggtgaatgccaagagcggagcctacggctgcacttgaa-3')(MI0000444)(서열번호 33)

miR-124-3 유전자(5'-tgagggcccctctgcgtgttcacagcggaccttgatttaatgtctatacaattaaggcacgcggtgaatgccaagagaggcgcctcc-3')(MI0000445)(서열번호 34)

miR-9-3 유전자(5'-ggaggcccgtttctctctttggttatctagctgtatgagtgccacagagccgtcataaagctagataaccgaaagtagaaatgattctca-3')(MI0000468)(서열번호 35)

본 발명자들은, 방광암에 있어서는 상술한 것 중 miR-137이 방광암 세포의 명확한 지표로 할 수 있음을 알아내고 있다. 또한, 상술한 miRNA 중 복수를 검출하여 그 결과를 비교 검증해도 된다. 복수의 miRNA를 비교 검증함으로써 또한 특이도와 감도가 높은 검출이 가능해진다.

본 실시형태의 방광암 마커의 발현량의 검출, 즉 상술한 miRNA의 검출의 방법으로서는, 방광암 세포를 검출하는 대상인 피검자로부터 채취한 피검자 샘플의 miRNA의 발현량을 검출하는 방법을 취할 수 있다. 피검자 샘플로서는 방광암의 조직 또는 조직을 포함하는 생체 샘플을 채취하여 행할 수 있고, 요 샘플, 혈액 샘플 또는 내시경에 의해 절제 채취한 샘플 등으로부터의 검출을 행할 수 있다. 본 실시형태에서는, 내시경에 의해 절제 채취한 샘플 혹은, 방광 전적(全摘) 표본으로부터 채취한 샘플을 사용하고 있다.

목적으로 하는 방광암 마커의 발현량의 검출은, 방광암 세포를 검출하는 대상인 피검자로부터 채취한 피험자 샘플에서의 방광암 마커의 발현량과, 문턱값을 비교함으로써 행한다. 피험자 샘플에서의 방광암 마커의 발현량이 문턱값과 비교하여 감소하고 있을 경우, 피험자 샘플의 조직은 방광암이라고 판정할 수 있다. 문턱값은, 정상 조직으로부터 채취한 컨트롤 샘플에 대해서 행하고, 발현량을 비교한다. 이 컨트롤 샘플은, 방광암이 의심되는 피험자와는 다른 정상인 피험자의 정상 조직의 것이어도 되고, 방광암이 의심되는 피험자가 건강할 때 또는 건강한 조직으로부터 채취한 동일 피험자의 것이어도 된다. 본 실시형태에서는, 동일한 피험자의, 암이 발생하고 있을 우려가 있는 조직으로부터 충분히 떨어진 정상 조직을 컨트롤 샘플로 하는 것으로 한다.

방광암 세포에 있어서의 상술한 방광암 마커의 발현량의 검출은, 목적으로 하는 miRNA를 코드하는 게놈 서열의 메틸화를 검출, 비교함으로써 행하는 것이 바람직하다. 피험자 샘플이 컨트롤 샘플에 대하여 목적으로 하는 miRNA를 코드하는 게놈 서열의 메틸화의 도수(度數)가 높을 경우, 목적으로 하는 miRNA의 발현량이 저하하고 있다. 그 때문에, 피험자 샘플의 목적으로 하는 miRNA를 코드하는 게놈 서열의 메틸화의 도수가 높을 때에는, 방광암 세포의 존재를 판정할 수 있다. 메틸화의 검출에 의하면, 조직에 있어서의 miRNA 발현량의 백그라운드에 상관없이 높은 정밀도로 검출을 행할 수 있다. 메틸화의 검출에는, 각종의 메틸화 검출 수단을 이용할 수 있고, 바이설파이트 시퀀스법, 메틸화 특이적 PCR(MSP)법, 정량적 MSP법, COBRA(코브라)법, 바이설파이트 파이로시퀀싱법 등을 이용할 수 있다. 이들 방법은, 어느 하나를 단독으로 사용해도 되고, 2개 이상을 조합하여 사용해도 된다. 상기 중, 바이설파이트 파이로시퀀싱법은, 대상으로 하는 miRNA의 검출을 정밀하며 또한 정량적으로 행할 수 있다는 점에서 바람직하게 사용되고, 메틸화 특이적 PCR법(MSP법)은 신속하고, 간편하며, 또한 소량의 DNA 샘플로부터 메틸화의 검출을 행할 수 있다는 점에서 바람직하게 사용된다.

또, MSP법은 Methods Mol Med. 2005; 113:279-91 및 스즈키 히로무, 도요타 미노루, 이마이 코조 : bisulfite PCR법 신 유전자 공학 핸드북 개정 제4판(무라마츠 마사미·야마모토 타다시 편), 요도사, pp99-106, 2003, 바이설파이트 시퀀스법은, Methods. 2002 Jun; 27(2):101-7 및 스즈키 히로무, 도요타 미노루, 이마이 코조 : bisulfite PCR법. 신 유전자 공학 핸드북 개정 제4판(무라마츠 마사미·야마모토 타다시 편), 요도사, pp99-106, 2003, 바이설파이트 파이로시퀀싱법은, Nat Protoc. 2007; 2(9):2265-75, 코브라법은 Methods Mol Biol. 2002; 200:71-85 및 스즈키 히로무, 도요타 미노루, 이마이 코조 : bisulfite PCR법. 신 유전자 공학 핸드북 개정 제4판(무라마츠 마사미·야마모토 타다시 편), 요도사, pp99-106, 2003, 메틸라이트법은 Methods. 2001 Dec; 25(4):456-62 등에 기재되어 있는 방법, 또는 이들을 적의(適宜) 변경하여 사용할 수 있다. 또, 바이설파이트 파이로시퀀싱법은, 일반적으로 파이로시퀀싱법으로 생략할 경우가 있고, 그 경우의 파이로시퀀싱법과 본 명세서에 있어서의 바이설파이트 파이로시퀀싱법은 동일한 방법을 가리킨다.

유전자의 발현량의 검출은, miRNA의 발현량을 직접 검출함으로써 행할 수도 있다. miRNA의 발현량을 직접 검출하기 위해서는, 리얼 타임 RT-PCR법, 노던블로트법 등의 miRNA의 검출 수단을 적의 사용할 수 있다. 이들 방법은, 어느 하나를 단독으로 사용해도 되고, 2개 이상을 조합하여 사용해도 된다. 상기 중, 리얼 타임 RT-PCR법에 의한 검출이, 간이성이나 감도의 면으로부터 호적(好適)하다.

방광암 세포의 검출은, 목적으로 하는 miRNA의 발현량의 직접 검출과 목적으로 하는 miRNA를 코드하는 게놈 서열의 메틸화의 검출 중 어느 한쪽을 사용하여 행할 수도, 양쪽을 병용(倂用)하여 행할 수도 있다.

miR-137 유전자, miR-124-2 유전자, miR-124-3 유전자, miR-9-3 유전자에 대해서는, 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의한 메틸화의 검출에 사용하는 프라이머 및 MSP법에 의한 메틸화의 검출에 사용하는 프라이머와 그 바탕이 되는 서열을 각각 도 26, 도 27, 도 28 및 도 29에 나타낸다. 도면에는 각각, miR-137 유전자, miR-124-2 유전자, miR-124-3 유전자, miR-9-3 유전자의 상류의 서열(서열번호 36, 38, 40, 42), 바이설파이트 변환 후의 서열(하선부에 프라이머에 사용한 서열을 나타냄)(서열번호 37, 39, 41, 43), 메틸화 알렐과 비메틸화 알렐을 동시 증폭할 때의 PCR에 사용하는 포워드 프라이머와 리버스 프라이머, 및 PCT 증폭 후의 시퀀스 반응에 사용하는 프라이머, 및 MSP법에 의한 검출에 사용하는 메틸화 알렐 특이적 포워드 프라이머와 리버스 프라이머, 및 비메틸화 알렐 특이적 포워드 프라이머와 리버스 프라이머의 조합의 일례를 나타내고 있다.

miR-137 유전자에 대해서, 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의한 PCR 증폭에 사용하는 프라이머로서는, 포워드 프라이머를 GGGTTTAGYGAGTAGTAAGAGTTTTG, 리버스 프라이머를 CCCCCTACCRCTAATACTCTCCTC를 사용한다. 시퀀스 반응에 사용하는 프라이머로서는, GGTATTTTTGGGTGGATAAT를 사용한다.

miR-124-2 유전자에 대해서, 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의한 PCR 증폭에 사용하는 프라이머로서는, 포워드 프라이머에 GTTGGGATTGTATAGAAGGATTATTTG, 리버스 프라이머에 ACTACRAAAATCCAAAAAAAAATACATAC를 사용한다. 시퀀스 반응에 사용하는 프라이머로서는, YGTTTTTATTGTTTTAGTTT를 사용한다.

miR-124-3 유전자에 대해서, 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의한 PCR 증폭에 사용하는 프라이머로서는, 포워드 프라이머에 AAAAGAGAYGAGTTTTTATTTTTGAGTAT, 리버스 프라이머에 TCCTCCRCAACTACCTTCCCCTA를 사용한다. 시퀀스 반응에 사용하는 프라이머로서는, GAGATTYGTTTTTTTAAT를 사용한다.

miR-9-3 유전자에 대해서, 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의한 PCR 증폭에 사용하는 프라이머로서는, 포워드 프라이머에 GATTTGAATGGGAGTTTGTGATTGGT, 리버스 프라이머에 TCCCRAAACTCACRTAAAACACCC를 사용한다. 시퀀스 반응에 사용하는 프라이머로서는, TTGGATTGAYGTTATTTT를 사용한다.

메틸화 특이적 PCR법(MSP법)에 있어서는, 이하의 프라이머를 사용한다. miR-137의 검출에 사용하는 프라이머의 서열은, 메틸화 알렐 특이적 프라이머로서 포워드 프라이머에 GTAGCGGTAGTAGCGGTAGCGGT, 리버스 프라이머에 GCTAATACTCTCCTCGACTACGCG, 비메틸화 알렐 특이적 프라이머로서는 포워드 프라이머에 TGGTAGTGGTAGTAGTGGTAGTGGT, 리버스 프라이머에 CCACTAATACTCTCCTCAACTACACA를 사용한다.

miR-124-2의 검출에 사용하는 프라이머의 서열은, 메틸화 알렐 특이적 프라이머로서 포워드 프라이머에 AGGGGCGTATTTTGGGGTTTTTGC, 리버스 프라이머에 CCCCTACGACGTAATCGACCCG, 비메틸화 알렐 특이적 프라이머로서 포워드 프라이머에 TTTAGGGGTGTATTTTGGGGTTTTTGT, 리버스 프라이머에 CATCCCCTACAACATAATCAACCCA를 사용한다.

miR-124-3의 검출에 사용하는 프라이머의 서열은, 메틸화 알렐 특이적 프라이머로서 포워드 프라이머에 GTTTTAGTGATAATCGGTCGGTGTC, 리버스 프라이머에 TCCACGAAATCCACGCTACAAACG, 비메틸화 알렐 특이적 프라이머로서 포워드 프라이머에 TGTGTTTTAGTGATAATTGGTTGGTGTT, 리버스 프라이머에 ATATCCACAAAATCCACACTACAAACA를 사용한다.

miR-9-3의 검출에 사용하는 프라이머의 서열은, 메틸화 알렐 특이적 프라이머로서 포워드 프라이머에 GATTGACGTTATTTTTTCGCGGGGC, 리버스 프라이머에 CGAAACTCACGTAAAACACCCGCG, 비메틸화 알렐 특이적 프라이머로서 포워드 프라이머에 TTGGATTGATGTTATTTTTTTGTGGGGT, 리버스 프라이머에 CCCAAAACTCACATAAAACACCCACA를 사용한다.

본 실시형태의 변경 태양으로서, miR-137 유전자, miR-124-2 유전자, miR-124-3 유전자, miR-9-3 유전자의 프라이머로서는, 도 26, 27, 28 및 29에 나타내는 바이설파이트 변환 후의 서열 중에서 선택되는 다른 서열을 선택해도 된다.

(요 샘플을 피험자 샘플로 하는 진단 방법)

본 발명의 다른 실시형태에서는, 피험자 샘플은 피험자로부터 채취한 요 샘플이다. 컨트롤 샘플로서는, 방광암에 대한 치료, 예를 들면 방광의 절제 수술을 행한 후의 요 샘플을 사용한다. miRNA의 발현량의 검출은, 상술한 실시형태와 같은 메틸화의 검출에 의해 행한다. 그 밖의 점은 상술한 실시형태와 같다.

컨트롤 샘플이 피험자 샘플에 대하여 메틸화의 도수가 낮을 경우, 치료에 의해 방광암의 조직이 제거된 것을 판정할 수 있다.

본 실시형태에서는, 요 샘플은 피험자에의 침습성이 없고 고통이 최소한이어서, 매우 용이하게 빈회를 채취할 수 있으므로 바람직하다. 요 샘플은, 요 중에 박리 탈락한 요로 상피 세포가 검출되므로, 혈액 샘플이나 절제 채취한 샘플에 비해 함유되는 miRNA의 양이 적지만, 본 실시형태에서는 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의한 메틸화의 검출을 행하므로, 요 샘플에 의해 충분히 특이도와 감도가 높은 검출이 가능하다.

(방광암 억제제)

본 발명의 다른 실시형태는, miR-124, miR-9 및 miR-137에서 선택되는 1 이상의 miRNA를 함유하는 방광암 억제제이다. 본 발명자들은, 방광암의 암 세포에 있어서 발현이 억제되어 있는 이들 유전자를 암 조직에 대하여 투여, 또는 발현시킴으로써, 방광암을 억제할 수 있는 것을 알아내고 있다.

방광암 억제제는, 예를 들면 유전자 치료제로서, 상술한 miRNA를 유효 성분으로 하고, 이 유효 성분을 유전자 치료제에 사용하는 기제에 배합한다. 예로서, 완충액이나 아미노산 그 밖의 영양제를 첨가하고, 용액 또는 분말화 등 한 주사제로 할 수 있다. 또는, 액제나 서방제(徐放劑) 등으로 하기 위해 적의 필요한 기재에 배합할 수 있다.

세포에 상술한 miRNA를 도입하고, 암 세포에 발현시키기 위한 약제로 할 수도 있다. 예를 들면, 상술한 miRNA를 리포솜 등에 포섭시켜 조직에 핵산 분자를 도입시키기 위한 약제, 마이크로인젝션법 등으로 핵산 분자를 세포에 도입하는 방법을 위한 약제, 바이러스 벡터를 통해 생체에 투여하여 세포 내에 상술한 miRNA를 도입하기 위한 약제로 할 수 있다.

[실시예]

(암 세포주에 있어서의 miRNA 발현의 해석)

방광암 세포주(T24 및 UM-UC-3)를 DNA 메틸화 효소 저해제 5-aza-2'-deoxycytidine(5-aza-dC) 및 HDAC 저해제 4-phenylbutyric acid(4-PBA)로 처리했다. 처리 후의 시료와 처리하지 않은 컨트롤의 발현 프로파일을, TaqMan miRNA Low Density Array System(어플라이드 바이오 시스템)을 이용하여 각각 해석했다. 처리 후의 시료로 컨트롤보다도 발현이 상승하고 있는 miRNA를 스크리닝했다.

그 결과, T24 및 UM-UC-3의 2개의 세포주로 공통적으로 약제 처리 후에 발현이 상승한 miRNA가 146 발견되었다. 그것들의 miRNA 중, CpG 아일랜드가 pre-miRNA의 상류 5kb 이내의 영역에 존재하고 있는 것은 이하의 23종이었다(상술한 miR BASE에 등록되어 있음). 이들 유전자는, 메틸화를 저해했을 경우에 발현이 상승하고 있기 때문에, 이들 세포주에 있어서 메틸화에 의해 발현이 억제되어 있을 가능성이 있는 것이다.

hsa-miR-10b, hsa-miR-124, hsa-miR-132, hsa-miR-137, hsa-miR-147b, hsa-miR-148a, hsa-miR-152, hsa-miR-185a, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-200b, hsa-miR-200b*, hsa-miR-203, hsa-miR-22, hsa-miR-330-5p, hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-409-3p, hsa-miR-409-5p, hsa-miR-449b, hsa-miR-545*, hsa-miR-636, hsa-miR-639, hsa-miR-675, hsa-miR-9.

이들 miRNA에 대해서, 방광암 세포주인 T24 및 UM-UC-3, HT1197, HT-1376, SW780을 사용하여 Methylation-specific PCR(MSP)법을 행한 바, 이하의 12의 miRNA 유전자에 대해서 메틸화를 인정했다.

miR-34b, miR-9-1, miR-9-3, miR-124-1, miR-124-2, miR-124-3, miR-203, miR-10b, miR-675, miR-200b, miR-137, miR-409. 이들 MSP법의 결과에 대해서 도 1에 나타낸다. 도면 중, U는 메틸화하지 않은 DNA(Unmethylated), M은 메틸화한 DNA(Methylated)를 나타낸다.

이들 유전자에 대한 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의해 메틸화 상태를 더 해석한 결과에 대해서 도 2, 도 3, 도 4에 나타낸다. 도면 중의 종축의 Methylation(％)(메틸화％)이 메틸화의 정도를 나타내고 있다. 원발 방광암 조직(Primary Bladder Cancer Tissue)은 수술에서 적출한 방광암 조직 유래의 DNA, 방광암 세포주(Bladder Cancer Cell Lines)는 방광암 조직의 세포주(T24, UM-UC3, HT1197, HT-1376, SW780) 유래의 DNA, SV-HUC-1은 정상 요로 상피 세포주 유래의 DNA, Normal Urothelium은 정상 요로 상피 유래의 DNA(BioChain사로부터 구입)에 대해서 해석한 결과를 나타내고 있다.

이들 결과로부터, 방광암 조직 및 방광암 세포주에 있어서 메틸화되어 있는 12종류의 miRNA를 찾아냈다.

(방광암 세포주에 있어서의 miR-137의 발현의 해석)

상술한 miRNA 중 miR-137에 대해서, 방광암 세포주인 T24, UM-UC-3, HT1197, HT-1376, SW780, 정상 요로 상피 세포주 SV-HUC-1에 있어서의 발현량에 대해서 TaqMan RT-PCR(Applied Biosystems사)을 사용하여 리얼 타임 RT-PCR 해석한 것을 도 5(a)에 나타낸다. 이 결과는, miR-137이 HT1197, SW780에 있어서 발현이 낮은 것을 나타내고 있다.

이들 방광암 세포주에 대해서 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의해 miR-137 유전자의 메틸화를 해석한 결과를 도 5(b)에 나타낸다. 이 결과는, miR-137 유전자가 UM-UC-3, HT1197, HT-1376, SW780에 있어서 메틸화되어 있는 것을 나타내고 있다. 도 5(a), (b)의 결과는, 방광암 세포주에 있어서 miR-137의 발현이 저하하고, 그 저하가 메틸화에 의거하고 있을 가능성을 나타내고 있다.

(암 부위마다의 miRNA의 발현의 해석)

암부 조직(T) 및 암 적출시에 얻어진, 암으로부터 충분히 떨어져 정상이라고 생각되는 조직(DN; Distant Normal-appearing tissue)으로부터 RNA를 추출하고, miR-137의 발현량을 리얼 타임 RT-PCR 해석한 결과를 도 6에 나타낸다. 이 결과에서는, 암부(T)에서 발현량이 낮은 경향이 인정된다. 발현량의 레벨에서의 비교가 가능할 만큼의 차이는 인정되지 않지만, 이는 T에 대해서 정상 조직도 혼입하므로 발현량이 저하한 유전자를 검출하는 것이 곤란하기 때문이라고 생각된다.

이어서, 도 6에서 사용한 일부의 샘플(091218-2, 100204-1, 100217B-1)의 T, DN을 사용하여, miR-137에 대해서 리얼 타임 RT-PCR에서 발현량을 해석한 결과를 도 7(a), 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의해 miR-137 유전자의 메틸화를 해석한 결과를 도 7(b)에 나타낸다. 이 결과로부터, miRNA의 발현량과 그 코드되어 있는 게놈 유전자에 있어서의 메틸화와의 사이에 역(逆)상관이 있는, 즉 게놈상의 유전자 CpG 아일랜드의 메틸화에 의해 miRNA의 발현량이 내려가는 것이 인정된다. 이들 결과로부터, miR-137 유전자의 메틸화를 해석함으로써 발현량의 저하를 검출하고, 즉 암 세포인지의 여부를 검출하는 것이 가능한 것이 나타났다.

NMIBC(비침윤성, 표재성) 및 MIBC(침윤성)의 암 조직의 각각으로부터 채취한 T, 암부(T의 채취 조직)로부터 5㎜ 떨어진 조직(AN; Adjacent Normal-appearing bladder tissue), DN에 대해서, miR-137 유전자의 메틸화를 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의해 해석한 결과를 도 8(NMIBC(a), MIBC(b))에 나타낸다. 또, 동일 개체로부터의 결과를 선으로 잇고 있다.

또한, miR-137 유전자의 NMIBC 및 MIBC, 그 양쪽의 케이스에서의 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의해 메틸화의 해석 및 검출의 감도(Sensitivity)와 특이도(Specificity)에 대한 ROC(receiver operating characteristic) 곡선을 해석한 결과를 도 9에 나타낸다. 같은 해석을 miR-124-2 유전자(도 10), miR-124-3 유전자(도 11), miR-9-3 유전자(도 12)에 대해서 행한 결과도 나타낸다. miR-9-3 유전자 이외의 miRNA에 대해서 NMIBC 및 MIBC에서는 모두 T와 AN간 및 T와 DN간에서 유의차가 보이고, T, AN, DN의 순으로 메틸화가 내려가고 있는 것이 나타났다. miR-9-3 유전자에서는 MIBC의 T와 AN간에서 유의차는 보이지 않았지만, 메틸화가 내려가는 경향은 보였다. 또, 도면에는 나타나지 않지만, miR-9-1 유전자에 대해서도 메틸화의 해석을 행했지만, 메틸화의 빈도는 극히 낮았다. 이들 결과로부터, 이들 miRNA에 대해서 암부는 비암부보다 고(高)메틸화되고, 메틸화의 경향에 의해 암 부위를 특정하는 것에 도움이 된다고 생각된다. 또한, 동일한 miRNA를 코드하고 있는 게놈 유전자 서열이어도, 메틸화의 빈도에는 차이가 있는 것이 판명되었다.

(요검체에서의 miR-137 유전자의 메틸화 상태의 해석)

피험자의 암 조직 적출 수술의 수술 전(Pre-OP) 및 암 조직 적출 후(Post-OP)의 요검체에 대해서, 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의한 miR-137 유전자의 메틸화의 해석을 행했다. 그 결과(a)와 ROC 곡선(b)을 도 13에 나타낸다. 또, Post-OP에 대해서는, 개복 수술의 경우에는 방광을 전적하므로 내시경 절제예의 요검체만 얻을 수 있기 때문에, N수가 적어지고 있다. 수술 후에 miR-137 유전자의 메틸화가 감소하고 있는 경향이 보인다.

도 13(a)의 결과에 대해서, ROC 곡선을 작성하고, 감도(Sensitivity)와 특이도(Specificity)의 양쪽이 최량이 되도록 컷오프치를 조정하면, 컷오프치가 5.2％에 있어서, 감도＝78％, 특이도＝78％, PPV＝0.89, NPV＝0.60의 감도에서의 검출이 가능해졌다.

도 14에, 암 조직의 적출 수술의 수술 전 및 수술 후(a), 암이 아닌 피험자의 적출 수술(적출 후에 암이 아니었다고 판명된 예)의 수술 전 및 수술 후(b)의 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의한 miR-137 유전자의 메틸화의 해석의 결과를 나타낸다. 또, 동일 개체로부터의 결과를 선으로 잇고 있다. 암 조직의 적출에 의해 miR-137 유전자의 메틸화는 감소하고, 암이 아니었던 경우에는 변화가 없어, 도 13(a)에 나타내는 요검체에 있어서의 결과와 상관하고 있다. 이들 결과로부터, 요검체 중의 miR-137 유전자의 메틸화는 방광암 세포의 진단 마커로서 유용하다고 생각되고, 요 중의 메틸화의 해석이 암 조직의 유무의 검사에 응용할 수 있는 것이 나타났다.

(요검체에서의 miR-124-2 유전자의 메틸화 상태의 해석)

피험자의 암 조직 적출 수술의 수술 전(Pre-OP) 및 암 조직 적출 후(Post-OP)의 요검체에 대해서, 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의한 miR-124-2 유전자의 메틸화의 해석을 행했다. 그 결과(a)와 ROC 곡선(b)을 도 15에 나타낸다. 수술 후에 miR-124-2 유전자의 메틸화가 감소하고 있는 경향이 보인다.

도 15(a)의 결과에 대해서, ROC 곡선을 작성하고, 감도와 특이도의 양쪽이 최량이 되는 컷오프치를 조정하면, 컷오프치가 5.2％에 있어서, 감도＝70％, 특이도＝89％, PPV＝0.94, NPV＝0.55의 감도에서의 검출이 가능해졌다.

도 16에, 암 조직의 적출 수술의 수술 전 및 수술 후(a), 암이 아닌 피험자의 적출 수술의 수술 전 및 수술 후(b)의 결과를 나타낸다. 또, 동일 개체로부터의 결과를 선으로 잇고 있다. 암 조직의 적출에 의해 miR-124-2 유전자의 메틸화는 감소하고, 암이 아니었던 경우에는 변화가 없어, 도 15(a)에 나타내는 요검체에 있어서의 결과와 상관하고 있다. 이들 결과로부터, 요검체 중의 miR-124-2 유전자의 메틸화는 방광암의 진단 마커로서 유용하다고 생각되고, 요 중의 메틸화의 해석이 암 조직의 유무의 검사에 응용할 수 있는 것이 나타났다.

(요검체에서의 miR-124-3 유전자의 메틸화 상태의 해석)

피험자의 암 조직 적출 수술의 수술 전(Pre-OP) 및 암 조직 적출 후(Post-OP)의 요검체에 대해서, 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의한 miR-124-3 유전자의 메틸화의 해석을 행했다. 그 결과(a)와 ROC 곡선(b)을 도 17에 나타낸다. 수술 후에 miR-124-3 유전자의 메틸화가 감소하고 있는 경향이 보인다.

도 17(a)의 결과에 대해서, ROC 곡선을 작성하고, 감도와 특이도의 양쪽이 최량이 되도록 컷오프치를 조정하면, 컷오프치가 12％에 있어서, 감도＝65％, 특이도＝97％, PPV＝0.98, NPV＝0.54의 감도에서의 검출이 가능해졌다.

도 18에, 암 조직의 적출 수술의 수술 전 및 수술 후(a), 암이 아닌 피험자의 적출 수술의 수술 전 및 수술 후(b)의 결과를 나타낸다. 또, 동일 개체로부터의 결과를 선으로 잇고 있다. 암 조직의 적출에 의해 miR-124-3 유전자의 메틸화는 감소하고, 암이 아니었던 경우에는 변화가 없어, 도 17(a)에 나타내는 요검체에 있어서의 결과와 상관하고 있다. 이들 결과로부터, 요검체 중의 miR-124-3 유전자의 메틸화는 방광암의 진단 마커로서 유용하다고 생각되고, 요 중의 메틸화의 해석이 암 조직의 유무의 검사에 응용할 수 있는 것이 나타났다.

(요검체에서의 miR-9-3 유전자의 메틸화 상태의 해석)

피험자의 암 조직 적출 수술의 수술 전(Pre-OP) 및 암 조직 적출 후(Post-OP)의 요검체에 대해서, 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의한 miR-9-3 유전자의 메틸화의 해석을 행했다. 그 결과(a)와 ROC 곡선(b)을 도 19에 나타낸다. 수술 후에 miR-9-3 유전자의 메틸화가 감소하고 있는 경향이 보인다.

도 19(a)의 결과에 대해서, ROC 곡선을 작성하고, 감도와 특이도의 양쪽이 최량이 되도록 컷오프치를 조정하면, 컷오프치가 7.2％에 있어서, 감도＝69％, 특이도＝86％, PPV＝0.92, NPV＝0.54의 감도에서의 검출이 가능해졌다.

도 20에, 암 조직의 적출 수술의 수술 전 및 수술 후(a), 암이 아닌 피험자의 적출 수술의 수술 전 및 수술 후(b)의 결과를 나타낸다. 또, 동일 개체로부터의 결과를 선으로 잇고 있다. 암 조직의 적출에 의해 miR-9-3 유전자의 메틸화는 감소하고, 암이 아니었던 경우에는 변화가 없어, 도 19(a)에 나타내는 요검체에 있어서의 결과와 상관하고 있다. 이들 결과로부터, 요검체 중의 miR-9-3 유전자의 메틸화는 방광암의 진단 마커로서 유용하다고 생각되고, 요 중의 메틸화의 해석이 암 조직의 유무의 검사에 응용할 수 있는 것이 나타났다.

또한, miR-137 유전자, miR-124-2 유전자, miR-124-3 유전자 및 miR-9-3 유전자의 4종류의 유전자에 대해서, 각각의 메틸화 검출 결과를 조합하고, 요검체를 사용한 방광암 진단의 방법에 대해서 검토 및 해석을 행했다.

우선, 패널 검출법에 대해서, 도 21 및 도 22에 나타낸다. 본 방법에서는, 상기에 있는 감도(sensitivity, Sens)와 특이도(specificity, Spec)의 양쪽이 최량이 되는 수치를 컷오프치로 하고, 각각 miR-137 유전자에 대해서는 5.2％, miR-124-2 유전자에 대해서는 5.2％, miR-124-3 유전자에 대해서는 12％, miR-9-3 유전자에 대해서는 7.2％로 설정하고, 이 수치를 충족시켰을 경우에 각 유전자에 대해서 1점씩 가산한다(Summing the number of “Yes”). 그것을 miRscore로 하고, 각 점수에 있어서 ROC 곡선을 작성했다. 그 결과, 0-1점간에서 감도가 94％, 특이도가 64％가 되었다. 1-2점간에서, 감도가 81％, 특이도가 89％가 되었다. 2-3점간에서 감도가 65％, 특이도가 97％가 되었다. 또한, 이를 도 21에 나타내는 트레이닝 세트(Training Set)로 하고, 새로 다른 요검체를 사용하여 도 22에 나타내는 테스트 세트(Test set)로서 재검토를 행했다. 그 결과, 0-1점간에서 감도가 94％, 특이도가 64％가 되었다. 1-2점간에서, 감도가 82％, 특이도가 91％가 되었다. 2-3점간에서 감도가 71％, 특이도가 91％가 되었다. 이 결과로부터, 이 검출법에 대해서 재현성이 확인되었다.

다음으로, Tree도에 의한 검출법에 대해서, 도 23 및 도 24에 나타낸다. 본 방법에서는, 각 4개의 유전자 중, 특이도가 100％에 있어서 가장 감도가 높아지는 miR-137 유전자의 메틸화가 9.8％라는 컷오프치로 나눈다(감도는 57％). 이것이 충족될 경우, 카테고리 3으로서 분류한다. 이것이 충족되지 않았을 경우, 또한 miR-9-3 유전자의 메틸화가 6.7％라는 컷오프치로 나눈다. 이 값은 miR-137 유전자의 메틸화가 9.8％ 이하였을 경우에 있어서, miR-124-2 유전자, miR-124-3 유전자 및 miR-9-3 유전자의 각각에서 ROC 곡선을 작성했을 경우에, 가장 감도, 특이도가 높아진 값이며, 각각 87％ 및 75％였다. 이를 충족시킬 경우에 카테고리 2로 분류하고, 이를 충족시키지 않았을 경우에 카테고리 1로 분류한다. 또한, 이를 도 23에 나타내는 트레이닝 세트로 하고, 새로 다른 요검체를 사용하여 도 24에 나타내는 테스트 세트로서 재검토를 행했다. 그 결과, 카테고리 3에 대해서 특이도 100％, 감도 68％가 되고, 카테고리 1과 2의 분류에 있어서는 특이도 55％, 감도 91％였다. 이 결과로부터, 이 검출법에 대해서 재현성이 확인되었다. 또, 카테고리 3은 특이도 100％이어서, 이로 분류되었을 경우에는 상당한 확률로 암인 것이 판정된다. 카테고리 1로 분류되었을 경우에는 암일 가능성이 낮은 것으로, 카테고리 2로 분류되었을 경우에는 아마 암인 것으로 판정된다.

상기 패널법 및 Tree도법으로부터, miR-137 유전자, miR-124-2 유전자, miR-124-3 유전자 및 miR-9-3 유전자를 조합한 암의 검출 방법의 유용성이 나타났다. 또, 상기의 수치는 일례이며, 스크리닝이나 수술 후 팔로우 등 각각의 장면, 목적에 따라 필요해지는 감도, 특이도를 나타내는 컷오프치의 변경 등 행하여, 구별하여 사용할 수 있다.

상기의 실시예(도 13, 도 15, 도 17 및 도 19)로부터 얻어진 요검체에 있어서의 감도와 특이도의 양쪽이 최량이 되는 각 유전자의 컷오프치, 및 당해 컷오프치를 사용했을 경우의 감도와 특이도를 표 1에 나타낸다.

[표 1]

또한, 상기의 요검체에 있어서의 요세포진의 결과를 표 2에 나타낸다.

[표 2]

표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 종래의 요세포진에서는, 양성(ClassⅣ, Ⅴ)을 19％만 검출할 수 있고, 의양성(擬陽性)(ClassⅢ)의 17％를 합계해도 36％만 방광암을 검출할 수 있었다. 이에 대하여, 표 1에서 나타내는 바와 같이, 동일한 요검체를 사용했을 경우에도 메틸화 해석에 의한 감도의 값은 어느 유전자라도 0.65 이상을 나타내고 있으며, 4종류의 miRNA를 각각 단독으로 사용했을 경우에도, 요세포진보다도 높은 감도가 얻어진다.

(miRNA에 의한 방광암의 억제 효과의 해석)

miR-137이 방광암에 있어서 발현이 저하하고 있기 때문에, miR-137을 강제 발현시킴으로써, 암을 제어하는 인자로서 작용하는지를 해석했다. 방광암 세포(SW780)에 대하여 miR-137을 트랜젼트(transient)로 도입하여 강제 발현하여, miR-cont(랜덤 서열을 발현하는 것)에 대하여 세포 생존성을 비교한 결과를 도 25에 나타낸다. 도면 중의 viability가 세포 생존성을 나타내고 있다. 트랜젼트 도입을 위해 장시간에서는 miR-137의 발현량이 저하하기 때문에, 72시간까지의 24시간마다 해석했다. miR-137의 발현에 의해, 암 세포의 세포 생존성이 저하하고 있다는 결과가 얻어졌다. 이 결과로부터, miR-137은 방광암의 억제제로서 사용할 수 있을 가능성이 나타났다.

(초기암의 검출 정밀도의 해석)

표 1로부터, 초기암으로 분류되는 심달도 pTa, 이형도 G1/G2였던 환자의 데이터만을 추출한 결과를, 표 3에 나타낸다.

[표 3]

또한, 이들 유전자에서의 결과를 조합하여, 도 21-24와 같은 패널 검출법 및 Tree도에서 해석하고, ROC 곡선을 작성한 검출법에 대해서 도 31에 나타낸다. 이들 결과에 의해, 각 유전자의 메틸화의 해석에 의해, 각 유전자 단독 혹은 조합 모두 pTa, G1/G2의 환자의 초기 방광암을 검출할 수 있는 것이 분명해졌다.

또한, 상기의 초기암 환자의 요검체에 있어서의 요세포진의 결과를 표 4에 나타낸다.

[표 4]

표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 초기암이었던 pTa, G1/G2의 환자에 대해서는, 요세포진에서는 14％가 의양성으로서 검출할 수 있었을 뿐으로, 양성으로서 검출할 수는 없었다. 그에 대하여, 상술한 유전자의 메틸화를 해석함으로써, 요세포진에서는 양성으로서는 검출할 수 없었던 low grade나 low stage의 방광암도 검출할 수 있는 것이 나타났다.

이상 기술한 실시형태 및 실시예는 모두 본 발명을 예시적으로 나타내는 것으로서 한정적으로 나타내는 것이 아니라, 본 발명은 다른 각종의 변형 태양 및 변경 태양으로 실시할 수 있다. 따라서 본 발명의 범위는 특허청구범위 및 그 균등 범위에 의해서만 규정되는 것이다.

본 발명은 암의 치료 및 예방에 의해 의료 및 약사(藥事) 분야에 널리 응용할 수 있는 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> LSIP, LLC <120> METHOD FOR DETECTING BLADDER CANCER CELLS, PRIMER USED IN METHOD FOR DETECTING BLADDER CANCER CELLS, AND BLADDER CANCER MARKER <130> - <150> JP2011-203705 <151> 2011-09-16 <160> 43 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for PCR amprification <400> 1 gggtttagyg agtagtaaga gttttg 26 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for PCR amprification <400> 2 ccccctaccr ctaatactct cctc 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for sequencing <400> 3 ggtatttttg ggtggataat 20 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for PCR amprification <400> 4 gttgggattg tatagaagga ttatttg 27 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for PCR amprification <400> 5 actacraaaa tccaaaaaaa aatacatac 29 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for sequencing <400> 6 ygtttttatt gttttagttt 20 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for PCR amprification <400> 7 aaaagagayg agtttttatt tttgagtat 29 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for PCR amprification <400> 8 tcctccrcaa ctaccttccc cta 23 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for sequencing <400> 9 gagattygtt tttttaat 18 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for PCR amprification <400> 10 gatttgaatg ggagtttgtg attggt 26 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for PCR amprification <400> 11 tcccraaact cacrtaaaac accc 24 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for sequencing <400> 12 ttggattgay gttatttt 18 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for MSP <400> 13 gtagcggtag tagcggtagc ggt 23 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for MSP <400> 14 gctaatactc tcctcgacta cgcg 24 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for MSP <400> 15 tggtagtggt agtagtggta gtggt 25 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for MSP <400> 16 ccactaatac tctcctcaac tacaca 26 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for MSP <400> 17 aggggcgtat tttggggttt ttgc 24 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for MSP <400> 18 cccctacgac gtaatcgacc cg 22 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for MSP <400> 19 tttaggggtg tattttgggg tttttgt 27 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for MSP <400> 20 catcccctac aacataatca accca 25 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for MSP <400> 21 gttttagtga taatcggtcg gtgtc 25 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for MSP <400> 22 tccacgaaat ccacgctaca aacg 24 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for MSP <400> 23 tgtgttttag tgataattgg ttggtgtt 28 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for MSP <400> 24 atatccacaa aatccacact acaaaca 27 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for MSP <400> 25 gattgacgtt attttttcgc ggggc 25 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for MSP <400> 26 cgaaactcac gtaaaacacc cgcg 24 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for MSP <400> 27 ttggattgat gttatttttt tgtggggt 28 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer for MSP <400> 28 cccaaaactc acataaaaca cccaca 26 <210> 29 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 29 uuauugcuua agaauacgcg uag 23 <210> 30 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 30 uaaggcacgc ggugaaugcc 20 <210> 31 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 31 ucuuugguua ucuagcugua uga 23 <210> 32 <211> 102 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 ggtcctctga ctctcttcgg tgacgggtat tcttgggtgg ataatacgga ttacgttgtt 60 attgcttaag aatacgcgta gtcgaggaga gtaccagcgg ca 102 <210> 33 <211> 109 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 atcaagatta gaggctctgc tctccgtgtt cacagcggac cttgatttaa tgtcatacaa 60 ttaaggcacg cggtgaatgc caagagcgga gcctacggct gcacttgaa 109 <210> 34 <211> 87 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 tgagggcccc tctgcgtgtt cacagcggac cttgatttaa tgtctataca attaaggcac 60 gcggtgaatg ccaagagagg cgcctcc 87 <210> 35 <211> 90 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 ggaggcccgt ttctctcttt ggttatctag ctgtatgagt gccacagagc cgtcataaag 60 ctagataacc gaaagtagaa atgattctca 90 <210> 36 <211> 595 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 ccacatcttc cctcctcact ggaaagacag cactcttctg tgttaagtat ttgattttgt 60 gatttgtctt tcagaattgg aaatagagcg gccatttgga tttgggcagg aagcagccga 120 gcacagcttt ggatccttct ttagggaaat cgagttatgg atttatggtc ccggtcaagc 180 tcagcccatc cccaggcagg ggcgggctca gcgagcagca agagttctgg tggcggcggc 240 ggcggcagta gcagcggcag cggtagcagc ggcagcggta gcagcggcag cggcagcttg 300 gtcctctgac tctcttcggt gacgggtatt cttgggtgga taatacggat tacgttgtta 360 ttgcttaaga atacgcgtag tcgaggagag taccagcggc aggggggcag cggccgccct 420 ccccagccca ccagctggcc actaaacgcc cgtggttgcc aaggtagcac tttcttgttc 480 ttttcatttc ctcgggtgtt ttcgcactgg ttccaccgga aaggctgtgc gctgcgcctc 540 tggtgaccag gactggaaaa tgggttcgcg cagggggcgg ggggcgaggt gaagg 595 <210> 37 <211> 595 <212> DNA <213> Artificial (bisulfite) <220> <223> for bisulfite <400> 37 ttatattttt tttttttatt ggaaagatag tatttttttg tgttaagtat ttgattttgt 60 gatttgtttt ttagaattgg aaatagagcg gttatttgga tttgggtagg aagtagtcga 120 gtatagtttt ggattttttt ttagggaaat cgagttatgg atttatggtt tcggttaagt 180 ttagtttatt tttaggtagg ggcgggttta gcgagtagta agagttttgg tggcggcggc 240 ggcggtagta gtagcggtag cggtagtagc ggtagcggta gtagcggtag cggtagtttg 300 gttttttgat ttttttcggt gacgggtatt tttgggtgga taatacggat tacgttgtta 360 ttgtttaaga atacgcgtag tcgaggagag tattagcggt aggggggtag cggtcgtttt 420 ttttagttta ttagttggtt attaaacgtt cgtggttgtt aaggtagtat ttttttgttt 480 tttttatttt ttcgggtgtt ttcgtattgg ttttatcgga aaggttgtgc gttgcgtttt 540 tggtgattag gattggaaaa tgggttcgcg tagggggcgg ggggcgaggt gaagg 595 <210> 38 <211> 340 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 cgatcgtttc gattctcttg ccggtcttgc agtttgcagg gtcctaaacg aagaggggtg 60 gagattcgag agtgcgggtc tggcgtgtgg tccaagggag ggggtgaggc tgggaaaggg 120 ggtgcagaat gcgggaacgg ctgggactgc acagaaggac catctgcgga ctcgttttca 180 ctgctccagc tcccgaaatc gtttctctgg acgcggcagt atccgcagcg catgcaccct 240 cctctggact tccgcagccc agacctgcgc ttacagtcat cgcgccaccc cctccccccg 300 ggctgcgggc cccgcgctcc gtgggctcag ggtcccctcc 340 <210> 39 <211> 340 <212> DNA <213> Artificial (bisulfite) <220> <223> for bisulfite <400> 39 cgatcgtttc gatttttttg tcggttttgt agtttgtagg gttttaaacg aagaggggtg 60 gagattcgag agtgcgggtt tggcgtgtgg tttaagggag ggggtgaggt tgggaaaggg 120 ggtgtagaat gcgggaacgg ttgggattgt atagaaggat tatttgcgga ttcgttttta 180 ttgttttagt tttcgaaatc gtttttttgg acgcggtagt attcgtagcg tatgtatttt 240 tttttggatt ttcgtagttt agatttgcgt ttatagttat cgcgttattt ttttttttcg 300 ggttgcgggt ttcgcgtttc gtgggtttag ggtttttttc 340 <210> 40 <211> 340 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 tctgggtctc cccgtctttc tctccacgaa cagctcgagc gccttctcgc gggcccgctg 60 cgcgcggaga ggacgagctc gctgggttgt aaaaagagac gagttttcat ctttgagcat 120 cgagattcgt tcttttaacc gcattcggtg cgcgctcctg ggtcggcacg ggcagggcga 180 cggcagggga aggcagctgc ggaggagctc gcgccgccca gtcggagcgg ttctgcgccc 240 ctcggagccc cgcgggaggc ggccgggtgc gcacgcgctc accaccccca cccccggaat 300 ccgtcttcgc gattcccggg cgccccagct ccaggaacgc 340 <210> 41 <211> 340 <212> DNA <213> Artificial (bisulfite) <220> <223> for bisulfite <400> 41 tttgggtttt ttcgtttttt tttttacgaa tagttcgagc gttttttcgc gggttcgttg 60 cgcgcggaga ggacgagttc gttgggttgt aaaaagagac gagtttttat ttttgagtat 120 cgagattcgt ttttttaatc gtattcggtg cgcgtttttg ggtcggtacg ggtagggcga 180 cggtagggga aggtagttgc ggaggagttc gcgtcgttta gtcggagcgg ttttgcgttt 240 ttcggagttt cgcgggaggc ggtcgggtgc gtacgcgttt attattttta ttttcggaat 300 tcgttttcgc gattttcggg cgttttagtt ttaggaacgt 340 <210> 42 <211> 425 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 tcagacggtg cgcagccctg aggcttctga gggcagaggg tgcgcttcct tgccctcggg 60 gcggggaagc cgtgaacgcc gaggccattg taaggctggg tggtgcggag cgcgggaagg 120 gggctgggat ttgaatggga gcctgtgatt ggccgatccc tggactgacg tcacttcccc 180 gcggggcgat tagcctgcga gaggagggcc ggcggtccag tgcgctgggg gcggccgggg 240 cgctcgaggc tctctaagcg ctccgcgcgg gtgccctacg tgagccccgg gacgccgtcg 300 aggcaggccg gcagcgccgg tgccaggacg cacggaacgg ggagcagggg agaaatgcgc 360 cgggagggcg agggaggaag ggaactgggc gggggctgcg ggcctaggtg gcgggagtca 420 gcgtg 425 <210> 43 <211> 425 <212> DNA <213> Artificial (bisulfite) <220> <223> for bisulfite <400> 43 ttagacggtg cgtagttttg aggtttttga gggtagaggg tgcgtttttt tgttttcggg 60 gcggggaagt cgtgaacgtc gaggttattg taaggttggg tggtgcggag cgcgggaagg 120 gggttgggat ttgaatggga gtttgtgatt ggtcgatttt tggattgacg ttattttttc 180 gcggggcgat tagtttgcga gaggagggtc ggcggtttag tgcgttgggg gcggtcgggg 240 cgttcgaggt tttttaagcg tttcgcgcgg gtgttttacg tgagtttcgg gacgtcgtcg 300 aggtaggtcg gtagcgtcgg tgttaggacg tacggaacgg ggagtagggg agaaatgcgt 360 cgggagggcg agggaggaag ggaattgggc gggggttgcg ggtttaggtg gcgggagtta 420 gcgtg 425

Claims

miR-124, miR-9 및 miR-137에서 선택되는 1개 이상의 miRNA로 이루어지는 방광암 마커의 발현량을 피험자로부터 채취된 피험자 샘플로부터 검출하는 것을 포함하는 방광암 세포의 검출 방법.
제1항에 있어서,
상기 방광암 마커의 발현량의 검출은, 상기 방광암 마커가 코드되어 있는 게놈 유전자의 메틸화의 검출에 의해 상기 방광암 마커의 발현량의 저하를 검출하는 것을 특징으로 하는 방광암 세포의 검출 방법.
제2항에 있어서,
상기 메틸화의 검출은 바이설파이트 파이로시퀀싱법에 의해 행하는 것을 특징으로 하는 방광암 세포의 검출 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방광암 마커가 적어도 miR-137을 함유하는 것을 특징으로 하는 방광암 세포의 검출 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 피험자 샘플에 있어서의 상기 방광암 마커의 발현량을 문턱값과 비교하는 것을 특징으로 하는 방광암 세포의 검출 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 문턱값은, 정상 조직으로부터 채취된 컨트롤 샘플에 있어서의 상기 방광암 마커의 발현량인 것을 특징으로 하는 방광암 세포의 검출 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 문턱값은, 피험자로부터 다른 시기에 채취된 또는 피험자의 다른 조직으로부터 채취된 컨트롤 샘플에 있어서의 상기 방광암 마커의 발현량인 것을 특징으로 하는 방광암 세포의 검출 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 피험자 샘플이 요(尿) 샘플인 것을 특징으로 하는 방광암 세포의 검출 방법.
상기 방광암 마커의 발현량의 검출에 있어서, miR-137 유전자의 증폭에 사용하는 프라이머의 서열이 서열번호 1에 나타내는 포워드 프라이머(GGGTTTAGYGAGTAGTAAGAGTTTTG) 및 서열번호 2에 나타내는 리버스 프라이머(CCCCCTACCRCTAATACTCTCCTC)인 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 방광암 세포의 검출 방법에 사용하는 프라이머.
상기 방광암 마커의 발현량의 검출에 있어서, miR-137의 시퀀스 반응에 사용하는 프라이머의 서열이 서열번호 3에 나타내는 GGTATTTTTGGGTGGATAAT인 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 방광암 세포의 검출 방법에 사용하는 프라이머.
상기 방광암 마커의 발현량의 검출에 있어서, miR-124-2의 증폭에 사용하는 프라이머의 서열이 서열번호 4에 나타내는 포워드 프라이머(GTTGGGATTGTATAGAAGGATTATTTG) 및 서열번호 5에 나타내는 리버스 프라이머(ACTACRAAAATCCAAAAAAAAATACATAC)인 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 방광암 세포의 검출 방법에 사용하는 프라이머.
상기 방광암 마커의 발현량의 검출에 있어서, miR-124-2의 시퀀스 반응에 사용하는 프라이머의 서열이 서열번호 6에 나타내는 YGTTTTTATTGTTTTAGTTT인 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 방광암 세포의 검출 방법에 사용하는 프라이머.
상기 방광암 마커의 발현량의 검출에 있어서, miR-124-3의 증폭에 사용하는 프라이머의 서열이 서열번호 7에 나타내는 포워드 프라이머(AAAAGAGAYGAGTTTTTATTTTTGAGTAT) 및 서열번호 8에 나타내는 리버스 프라이머(TCCTCCRCAACTACCTTCCCCTA)인 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 방광암 세포의 검출 방법에 사용하는 프라이머.
상기 방광암 마커의 발현량의 검출에 있어서, miR-124-3의 시퀀스 반응에 사용하는 프라이머의 서열이 서열번호 9에 나타내는 GAGATTYGTTTTTTTAAT인 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 방광암 세포의 검출 방법에 사용하는 프라이머.
상기 방광암 마커의 발현량의 검출에 있어서, miR-9-3의 증폭에 사용하는 프라이머의 서열이 서열번호 10에 나타내는 포워드 프라이머(GATTTGAATGGGAGTTTGTGATTGGT) 및 서열번호 11에 나타내는 리버스 프라이머(TCCCRAAACTCACRTAAAACACCC)인 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 방광암 세포의 검출 방법에 사용하는 프라이머.
상기 방광암 마커의 발현량의 검출에 있어서, miR-9-3의 시퀀스 반응에 사용하는 프라이머의 서열이 서열번호 12에 나타내는 TTGGATTGAYGTTATTTT인 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 방광암 세포의 검출 방법에 사용하는 프라이머.
제2항에 있어서,
상기 메틸화의 검출은 메틸화 특이적 PCR법에 의해 행하는 것을 특징으로 하는 방광암 세포의 검출 방법.
상기 메틸화 특이적 PCR법에 있어서, miR-137의 검출에 사용하는 프라이머의 서열이, 메틸화 알렐 특이적 프라이머로서 서열번호 13에 나타내는 포워드 프라이머(GTAGCGGTAGTAGCGGTAGCGGT) 및 서열번호 14에 나타내는 리버스 프라이머(GCTAATACTCTCCTCGACTACGCG), 비메틸화 알렐 특이적 프라이머로서 서열번호 15에 나타내는 포워드 프라이머(TGGTAGTGGTAGTAGTGGTAGTGGT) 및 서열번호 16에 나타내는 리버스 프라이머(CCACTAATACTCTCCTCAACTACACA)인 것을 특징으로 하는 제17항에 기재된 방광암 세포의 검출 방법에 사용하는 프라이머.
상기 메틸화 특이적 PCR법에 있어서, miR-124-2의 검출에 사용하는 프라이머의 서열이, 메틸화 알렐 특이적 프라이머로서 서열번호 17에 나타내는 포워드 프라이머(AGGGGCGTATTTTGGGGTTTTTGC) 및 서열번호 18에 나타내는 리버스 프라이머(CCCCTACGACGTAATCGACCCG), 비메틸화 알렐 특이적 프라이머로서 서열번호 19에 나타내는 포워드 프라이머(TTTAGGGGTGTATTTTGGGGTTTTTGT) 및 서열번호 20에 나타내는 리버스 프라이머(CATCCCCTACAACATAATCAACCCA)인 것을 특징으로 하는 제17항에 기재된 방광암 세포의 검출 방법에 사용하는 프라이머.
상기 메틸화 특이적 PCR법에 있어서, miR-124-3의 검출에 사용하는 프라이머의 서열이, 메틸화 알렐 특이적 프라이머로서 서열번호 21에 나타내는 포워드 프라이머(GTTTTAGTGATAATCGGTCGGTGTC) 및 서열번호 22에 나타내는 리버스 프라이머(TCCACGAAATCCACGCTACAAACG), 비메틸화 알렐 특이적 프라이머로서 서열번호 23에 나타내는 포워드 프라이머(TGTGTTTTAGTGATAATTGGTTGGTGTT) 및 서열번호 24에 나타내는 리버스 프라이머(ATATCCACAAAATCCACACTACAAACA)인 것을 특징으로 하는 제17항에 기재된 방광암 세포의 검출 방법에 사용하는 프라이머.
상기 메틸화 특이적 PCR법에 있어서, miR-9-3의 검출에 사용하는 프라이머의 서열이, 메틸화 알렐 특이적 프라이머로서 서열번호 25에 나타내는 포워드 프라이머(GATTGACGTTATTTTTTCGCGGGGC) 및 서열번호 26에 나타내는 리버스 프라이머(CGAAACTCACGTAAAACACCCGCG), 비메틸화 알렐 특이적 프라이머로서 서열번호 27에 나타내는 포워드 프라이머(TTGGATTGATGTTATTTTTTTGTGGGGT) 및 서열번호 28에 나타내는 리버스 프라이머(CCCAAAACTCACATAAAACACCCACA)인 것을 특징으로 하는 제17항에 기재된 방광암 세포의 검출 방법에 사용하는 프라이머.
miR-124, miR-9 및 miR-137에서 선택되는 1개 이상의 miRNA를 함유하는 방광암 마커.
제22항에 있어서,
상기 방광암 마커의 발현량을 피험자로부터 채취된 피험자 샘플로부터 검출하는 것을 포함하는 방광암 세포의 검출 방법에 사용하는 방광암 마커.
제23항에 있어서,
상기 방광암 마커의 발현량의 검출은, 상기 방광암 마커가 코드되어 있는 게놈 유전자의 메틸화의 검출에 의해 상기 방광암 마커의 발현량의 저하를 검출하는 것을 포함하는 방광암 세포의 검출 방법에 사용하는 방광암 마커.
제2항에 있어서,
심달도(深達度) pTa 또는 이형도(異型度) G1/G2의 피험자로부터 채취된 피험자 샘플로부터 검출을 행하는 것을 특징으로 하는 방광암 세포의 검출 방법.
서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 또는 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자.