KR20130066576A - 시료 중의 분석 대상 물질을 측정하기 위한 검사 기구 및 그것을 사용한 분석 대상 물질의 측정 방법 - Google Patents

시료 중의 분석 대상 물질을 측정하기 위한 검사 기구 및 그것을 사용한 분석 대상 물질의 측정 방법 Download PDF

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Abstract

액상 시료 중의 분석 대상 물질을 귀금속 콜로이드 응집 측정법에 의해 측정하기 위한 검사 기구로서 ； 적어도 액상 시료를 시약과 반응시키는 반응실을 가지고, 반응실을 구성하는 면의 적어도 일부에 시약이 건조 부착되어 있고, 또한, 시약이, 분석 대상 물질을 귀금속 콜로이드 응집 측정법으로 측정 가능한 시약이며 ； 또한, 액상 시료를 공급하기 위한 공급부 ； 및 그 공급부에 공급된 액상 시료를 반응실까지 이송하기 위한 유로를 구비하고 ； 공급부에 공급된 액상 시료를 유로를 경유하여 반응실 내로 이송시켜 건조 부착된 시약을 액상 시료에 접촉시켜 액상 시료 중에 분산시키기 위한 공급부와 반응실에 압력차를 발생시킬 수 있는 검사 기구를 사용함으로써, 가시부에서의 흡광도에 기초한 측정이 가능하고, 단시간에 분석 대상물을 정확하게 측정할 수 있어 POCT 분야에 바람직한 측정이 가능하다.

Description

시료 중의 분석 대상 물질을 측정하기 위한 검사 기구 및 그것을 사용한 분석 대상 물질의 측정 방법{TEST INSTRUMENT FOR MEASURING ANALYTE IN SAMPLE, AND METHOD FOR MEASURING ANALYTE USING SAME}
본 발명은 시료 중의 분석 대상 물질을 측정하기 위한 검사 기구 및 그것을 사용한 분석 대상 물질의 측정 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 주로 임상 검사 분야에서 적용되며, 특히, 환자의 베드 사이드나 구급 현장 등의 모든 장소에서 신속하고 간편하게 검사할 수 있는 소위 POCT 분야에 바람직한 액상 시료 중의 분석 대상 물질을 귀금속 콜로이드 응집 측정법에 의해 측정하기 위한 검사 기구 및 그것을 사용한 분석 대상 물질의 측정 방법에 관한 것이다.
최근, 분석 기술의 진보에 따라, 여러 가지 생체 성분을 측정하는 것이 가능해졌다. 특히, 임상 검사 분야에 있어서는, 항원과 항체가 특이적으로 반응한다는 원리에 기초하는 면역 측정법의 개발에 의해, 병태에 관련된 체액 중의 여러 가지 생체 성분이 측정되고 있다. 그와 같은 면역 측정법 분야에 있어서는, 최근, 검체를 채취하고 나서 검사 결과가 얻어지기까지의 시간을 단축할 수 있는 점, 또, 장치가 간편하다는 점, 간단하게 측정할 수 있는 점에서, 포인트·오브·케어·테스팅 (이하, POCT 라고도 한다) 분야가 주목받고 있다.
이와 같은 면역 측정법의 검사 기구는 BF 분리를 수반하는 검사 기구가 대부분이다.
그와 같은 검사 기구로서, 임노크로마토 검사 기구가 알려져 있다 (특허문헌 1). 이 검사 기구는, 예를 들어, 액체가 모관 현상에 의해 이동 가능한 다공질재인 시트 상에, 시료 용액 중에 존재할 수 있는 분석 대상 물질에 대한 제 1 항체를 크로마토그래프 매체에 고정시킨 것을 사용한다. 그 검사 기구의 크로마토의 말단으로부터 그 분석 대상 물질에 대한 표지화된 제 2 항체, 예를 들어 금 콜로이드로 표지화된 제 2 항체를 함유하는 그 시료 용액을 전개시키고, 이어서, 고정화된 제 1 항체 부위에, 제 1 항체와 분석 대상 물질과 표지 제 2 항체의 복합체를 포착시킨다. 미반응의 표지 항체는 하류로 이동되기 때문에, 고정화 항체 부위에는, 분석 대상 물질이 시료 중에 존재하는 경우에만, 금 콜로이드 등에 의한 착색이 관찰된다. 그러나, 이 방법은 원래 금 콜로이드 등의 착색이 있는지의 여부를 육안으로 분석 대상 물질의 유무를 판단할 뿐으로, 정량적으로 측정할 수는 없다는 문제가 있었다.
또, 분석 대상 물질을 정량하기 위해, 펌프 흡인에 의해 시료를 공간 유로 경유로 이송시키는 검사 기구도 알려져 있다 (특허문헌 2). 이 기구는 시료 공급구, 표지 항체가 구비된 시료 처리실, 고정화 항체가 구비된 측정실, 폐액실 및 펌프 접속구가 있으며, 각각 유로에 의해 연통되어 있다. 시료를 시료 공급구에 부여하고, 그 시료를 흡인에 의해 시료 처리실로 이송하여, 거기에서 표지 항체를 유리시킴과 함께 시료 중의 분석 대상 물질과 표지 항체를 반응시키고, 이어서, 다시 흡인하여 시료를 측정실로 이송하여, 고정화 항체와 분석 대상 물질과 표지 항체의 결합물을 생성시키고, 거기에서 일정 시간 정지시켜, 시료 중의 분석 대상물 이외의 성분을 흡인하여 폐액실로 이송한다. 그리고 측정실에 있는 분석 대상 물질 유래의 결합물을 측광함으로써 시료에 함유되는 분석 대상 물질의 정량 측정을 실시할 수 있다. 그러나, 이 기구는, 펌프에 의한 시료 이송이 복수의 단계로 이루어지기 때문에, 제어하는 것이 비교적 어렵고, 측정 결과가 조건에 따라 큰 영향을 받는다는 문제가 있었다.
그 문제를 해결하기 위해, 동일한 측정 원리에 있어서, 유로 개폐 가능한 폐색 부재와 펌프 가압을 조합하는 방법도 알려져 있다 (특허문헌 3). 그러나, 이 방법은 검사 기구의 구조가 복잡해진다는 문제가 있었다.
한편, BF 분리가 불필요한 라텍스 면역 응집 반응에 기초하는 측정 대상 물질을 정량할 수 있는 검사 기구도 POCT 분야에서는 개발예가 적지만, 알려져 있다 (특허문헌 4). 이 방법은, 항체 감작 (感作) 라텍스 등을 드라이화 (건조) 한 것을 검사 기구에 장착하는 것인데, 그와 같은 경우, 미리 액체 시약을 간단한 자연 건조가 아니라, 시간이 걸리는 번잡한 동결 건조를 시켜 제조해야 한다. 또, 항체 감작 입자는 원래 완전히 물에 녹는 것이 아니라 분산되어 있을 뿐이므로, 드라이화한 항체 감작 입자는 재분산되기 어렵다는 난점이 있다. 그러나, 라텍스 면역 응집 반응 방법에서는, BF 분리를 수반하는 방법과는 상이하여, 항체 감작 입자를 완전히 재분산시키는 것이 필요하다. 그 때문에, 드라이 케미스트리에 의해 라텍스 면역 응집 측정법을 사용하는 경우, 라텍스를 재분산시키기 위해 회전, 진동 등의 공간 처리 수단을 추가하여 면역 에세이시켜야 하고, 그 결과, 검사 기구가 복잡해지기 쉽다는 문제가 있었다.
일본 공개특허공보 평4-299262호 일본 공개특허공보 평9-196920호 일본 공개특허공보 2009-270878호 일본 공개특허공보 2007-114162호
본 발명의 과제는 드라이 케미스트리에 의해 시료 중의 분석 대상 물질을 정확하게 측정 가능하고 또한 간편한 검사 기구 및 그것을 사용한 단시간에 측정할 수 있는 분석 대상 물질의 측정 방법으로서, POCT 분야에 바람직한 검사 기구 및 측정 방법을 제공하는 것에 있다. 나아가서는, 가시부에서의 흡광도에 기초하는 측정이 가능하기 때문에, 범용되고 있는 가시 분광 광도계를 사용한 장치에 적용할 수 있고, 또한, 분석 대상 물질을 정확하게 측정할 수 있는 검사 기구 및 그것을 사용하는 측정 방법을 제공하는 것에 있다.
이와 같은 상황하에서, 본 발명자들은 분석 대상 물질을 측정할 수 있는 간편한 검사 기구를 개발하는 것을 검토하였다. 그 결과, 항체를 감작하기 위한 입자로서 귀금속 콜로이드를 사용하고, 그것을 유로계의 검사 기구의 반응실에 부착 건조시켜 두고, 혈구 분리막을 사용하여 전혈로부터 혈구를 제거하는 정도로 가압하면, 건조 시약이 재분산되기 쉽고, 그 결과, 회전 조작이나 진동 등의 그 밖의 공간 이동 처리 수단을 추가하지 않고 분석 대상 물질을 정확하게 측정할 수 있는 것을 알아내었다. 본 발명은 이러한 지견에 기초하여 더욱 연구를 거듭하여 완성시킨 것이다.
즉, 본 발명은
[1] 액상 시료 중의 분석 대상 물질을 귀금속 콜로이드 응집 측정법에 의해 측정하기 위한 검사 기구로서 ； 적어도 액상 시료를 시약과 반응시키는 반응실을 가지고, 반응실을 구성하는 면의 적어도 일부에 시약이 건조 부착되어 있고, 또한, 시약이, 분석 대상 물질을 귀금속 콜로이드 응집 측정법으로 측정 가능한 시약이며 ； 또한 액상 시료를 공급하기 위한 공급부 ； 및 그 공급부에 공급된 액상 시료를 반응실까지 이송하기 위한 유로를 구비하고 ； 공급부에 공급된 액상 시료를 유로를 경유하여 반응실 내로 이송시켜 건조 부착된 시약을 액상 시료에 접촉시켜 액상 시료 중에 분산시키기 위한 공급부와 반응실에 압력차를 발생시킬 수 있는 검사 기구 ；
[2] 분석 대상 물질을 귀금속 콜로이드 응집 측정법으로 측정 가능한 시약이, 분석 대상 물질에 특이적으로 결합하는 파트너 감작 귀금속 콜로이드를 함유하는 시약, 또는 그 파트너와 그 분석 대상 물질과 동일한 물질 감작 귀금속 콜로이드를 함유하는 시약인, 상기 [1] 에 기재된 검사 기구 ；
[3] 반응실은, 제 1 평면, 이것에 대향하는 제 2 평면, 및 제 1 평면 및 제 2 평면 각각에 접하고 제 1 평면과 제 2 평면 사이에 공간을 형성하는 제 3 면으로 형성되어 있고, 분석 대상 물질에 특이적으로 결합하는 파트너 감작 귀금속 콜로이드를 함유하는 시약이, 제 1 평면 또는 이것에 대향하는 제 2 평면에 건조 부착되거나, 혹은 그 파트너와 그 분석 대상 물질과 동일한 물질 감작 귀금속 콜로이드를 함유하는 시약에 있어서, 그 파트너가 제 1 평면 또는 이것에 대향하는 제 2 평면 중 어느 것에 건조 부착되고, 그 밖의 평면에 그 분석 대상 물질과 동일한 물질 감작 귀금속 콜로이드가 건조 부착된, 상기 [1] 또는 [2] 에 기재된 검사 기구 ；
[4] 귀금속 콜로이드가 금 콜로이드 또는 팔라듐 콜로이드인, 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 검사 기구 ；
[5] 유로 및 반응실은, 통기성이 있고 또한 비통액상성의 다공성막을 개재하여 검사 기구 외부와 접속되어 있는, 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 검사 기구 ；
[6] 가압에 의해 압력차를 발생시키는, 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 검사 기구 ；
[7] 공급부에 공급된 액상 시료를 가압부에 의해 가압하여 반응실 내로 이송 가능한, 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 검사 기구 ；
[8] 액상 시료가 생체 시료이고, 분석 대상 물질이 생체 성분인, 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 검사 기구 ；
[9] 공급부와 유로 사이에, 액상 시료로부터 고체를 분리하기 위한 막을 갖는, 상기 [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 검사 기구 ；
[10] 분석 대상 물질을 함유하는 것으로 의심되는 액상 시료를 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 검사 기구의 공급부에 공급하고, 이어서, 공급부와 반응실에 압력차를 발생시켜 유로를 경유하여 액상 시료를 반응실로 이송시키고, 반응실 중의 시약에 액상 시료를 접촉시켜 시약을 액상 시료 중에 분산시키고, 액상 시료 중의 분석 대상 물질을 시약과 반응시켜, 얻어지는 혼합액에 광을 조사하여 투과광 또는 반사광 유래의 흡광도 변화에 기초하여 액상 시료 중의 분석 대상 물질을 측정하는 액상 시료 중의 분석 대상 물질의 측정 방법 ；
[11] 혼합액에 광을 조사할 때, 반응실에 조사하는, 상기 [10] 에 기재된 측정 방법 ；
[12] 조사하는 광의 파장이 340 ∼ 800 ㎚ 범위 내인, 상기 [10] 또는 [11] 에 기재된 측정 방법 ；
[13] 조사하는 광의 파장이 390 ∼ 420 ㎚ 범위 내인, 상기 [12] 에 기재된 측정 방법 ； 및
[14] 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 검사 기구에 추가하여, 반응실에 광을 조사하여 투과광 또는 반사광을 판독하기 위한 가시 부분광 광도계를 조합한 액상 시료 중의 분석 대상 물질을 측정하기 위한 장치에 관한 것이다.
본 발명에 있어서는, 드라이 케미스트리에 의해 간편한 검사 기구를 사용하여 액상 시료 중의 분석 대상 물질을 정확하게 측정 가능하다. 나아가서는, 가시부에서의 흡광도에 기초하는 측정이 가능하기 때문에, 범용되고 있는 가시 분광 광도계를 사용한 장치에 적용할 수 있고, 또한, 단시간에 분석 대상물을 정확하게 측정할 수 있어, 본 발명의 검사 기구 및 측정 방법은 POCT 분야에 바람직한 것이다.
도 1 은 본 발명에서 사용하는 검사 기구의 일례를 나타내는 종단면도이다.
도 2 는 본 발명에서 사용하는 검사 기구의 일례를 나타내는 상면도이다.
도 3 은 본 발명에서 사용하는 검사 기구의 일례를 나타내는 분해 사시도이다.
도 4 는 본 발명의 금 콜로이드를 사용한 드라이 케미스트리에 의한 측정 방법과 기존의 액상 시약법에 의한 측정 방법으로 인간 CRP 를 측정했을 때의 상관성을 나타낸 도면이다.
도 5 는 본 발명의 금 콜로이드를 사용한 드라이 케미스트리에 의한 측정 방법과 기존의 액상 시약법에 의한 측정 방법으로 인간 시스타틴 C 를 측정했을 때의 상관성을 나타낸 도면이다.
도 6 은 본 발명의 팔라듐 콜로이드를 사용한 드라이 케미스트리에 의한 측정 방법과 기존의 액상 시약법에 의한 측정 방법으로 인간 CRP 을 측정했을 때의 상관성을 나타낸 도면이다.
본 발명의 측정 방법은, 드라이 케미스트리의 기술에 의한 것이다. 본 명세서에 있어서는, 드라이 케미스트리란, 분석 대상 물질을 측정하기 위한 시약이 건조 상태로 검사 기구에 있어서 준비되어 있고, 거기에 액체상의 시료가 첨가되면, 시료 중의 수분을 용매로 하여 시약이 분산되어, 액체상의 시료와 분산된 시약이 검사 기구의 반응실 중에서 반응하는 것을 말하는 것으로 한다.
본 발명의 검사 기구는, 액상 시료 중의 분석 대상 물질을 귀금속 콜로이드 응집 측정법에 의해 측정하기 위한 검사 기구로서 ； 적어도 액상 시료를 시약과 반응시키는 반응실을 가지고, 반응실을 구성하는 면의 적어도 일부에 시약이 건조 부착되어 있고, 또한, 시약이, 분석 대상 물질을 귀금속 콜로이드 응집 측정법으로 측정 가능한 시약, 예를 들어, 그 분석 대상 물질에 특이적으로 결합하는 파트너 감작 귀금속 콜로이드, 또는 그 파트너와 그 분석 대상 물질과 동일한 물질 감작 귀금속 콜로이드를 함유하는 시약이며 ； 또한 액상 시료를 공급하기 위한 공급부 ； 및 그 공급부에 공급된 액상 시료를 반응실까지 이송하기 위한 유로를 구비하고 ； 공급부에 공급된 액상 시료를 유로를 경유하여 반응실 내로 이송시켜 건조 부착된 시약을 액상 시료에 접촉시켜 액상 시료 중에 분산시키기 위한 공급부와 반응실에 압력차를 발생시킬 수 있는 검사 기구이다.
본 발명의 검사 기구는, 예를 들어, 액상 시료를 공급하기 위한 공급부 ； 검사 기구 내에 형성되어, 액상 시료를 시약과 반응시키는 반응실 ； 및 공급부에 공급된 액상 시료를 반응실까지 이송하기 위한 유로를 구비하고,
유로 및 반응실은, 통기성이 있고 또한 비통액상성의 다공성막을 개재하여 검사 기구 외부와 접속되어 있고,
반응실은, 제 1 평면, 이것에 대향하는 제 2 평면, 및 제 1 평면 및 제 2 평면 각각에 접하고 제 1 평면과 제 2 평면 사이에 공간을 형성하는 제 3 면으로 형성되어 있고,
유로와 반응실이란, 제 3 면에 연결공이 형성됨으로써 연결되어 있고,
평면 중 적어도 하나의 면에 시약이 건조 부착되어 있고,
공급부에 공급된 액상 시료를 공급부에 형성된 가압부에 의해 가압하여, 반응실 내로 이송하는 검사 기구이다.
본 발명에 있어서 액상 시료란, 액체를 함유하는 것이면 되는데, 생체 시료가 바람직하고, 예를 들어, 혈액 시료, 소변, 골수액 등을 예시할 수 있다.
혈액 시료로서는, 혈청, 혈장, 전혈 등을 예시할 수 있다. 본 발명에 있어서 공급부와 유로 사이에, 액상 시료로부터 고체를 분리하기 위한 막을 갖는 것이 바람직하다. 특히 액상 시료가 전혈 등이고, 혈구 등의 고형 성분을 함유하는 경우에는, 고액 분리를 하기 위해, 본 발명에 있어서 공급부와 유로 사이에, 액상 시료로부터 고체를 분리하기 위한 막을 갖는 것이 바람직하다.
막을 사용하는 경우, 액상 시료를 공급부에 적용한 후, 압력차, 바람직하게는 압압을 이용하여 막 분리, 예를 들어, 혈구 등의 고형분을 분리 제거하면서, 액상 시료만을 유로를 경유하여 반응실로 보낸다. 그 결과, 액상 시료를 건조 부착된 시약에 충돌시켜 용해시킴으로써 귀금속 콜로이드를 액상 시료 중에 분산시켜 액상 시료 중의 분석 대상 물질을 귀금속 콜로이드 응집법으로 측정할 수 있다. 일반적으로, 전혈은, 다량의 복잡한 생체 성분이나 혈구 등의 고체를 함유하고 있으므로 그 중의 분석 대상 물질만을 정확하게 측정하는 것은 통상 곤란하다. 그러나, 본 발명에 있어서는 압력차에 의한 막 분리를 사용하는 경우, 손가락끝 등으로부터 간단하게 채취 가능한 전혈을 희석하지 않고 전혈 중의 분석 대상 물질을 측정할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 검사 기구에 있어서는, 액상 시료를 시약 등으로 희석하지 않고 적용할 수 있는 장점을 갖는다. 즉, 액상 시료가, 혈액 시료 등의 생체 시료인 경우, 그 시료의 점성이 높아져 콜로이드를 분산시키기 어려움에도 불구하고, 본 발명에 있어서는, 귀금속 콜로이드 등을 사용함으로써 시료를 희석하지 않고 분석 대상 물질을 측정 가능하다.
본 명세서에 있어서, 귀금속 콜로이드 응집 측정법이란, 라텍스 응집 측정법의 라텍스 대신에 귀금속 콜로이드를 사용한 방법이며, 예를 들어, 특정 성분이 감작되어 있는 귀금속 콜로이드 시약과, 시료를 혼합하여 응집 반응을 일으켜, 그 응집 정도로부터 그 분석 대상 물질을 측정하는 방법을 말한다.
본 발명에 있어서, 시약은, 분석 대상 물질을 귀금속 콜로이드 응집 측정법으로 측정 가능한 시약이면 특별히 한정하지 않는다.
그와 같은 시약으로서, 분석 대상 물질에 특이적으로 결합하는 파트너 감작 귀금속 콜로이드를 함유하는 시약, 그 파트너와 그 분석 대상 물질과 동일한 물질 감작 귀금속 콜로이드를 함유하는 시약을 예시할 수 있다. 분석 대상 물질에 특이적으로 결합하는 파트너란, 분석 대상 물질이 항원인 경우에는 그 항원에 대한 항체, 분석 대상 물질이 항체인 경우에는, 그 항체에 대한 항원을 예시할 수 있다. 분석 대상 물질과 그것에 특이적으로 결합하는 파트너의 다른 조합으로는, 예를 들어, 비오틴과 아비딘이나 스트렙토아비딘, 렉틴과 렉틴 결합성 당류, 호르몬과 호르몬 리셉터, 사이토카인과 사이토카인 리셉터, 프로테인 A 와 IgG, DNA 혹은 RNA 와 그것들에 상보적인 DNA 혹은 RNA 등의 조합을 들 수 있다.
이하, 분석 대상 물질이 CRP 나 시스타틴 C 등의 항원, 그 파트너가 항 CRP 항체나 항시스타틴 C 항체 등의 항체인 경우를 예로 들어 시약을 설명한다. 또한, 분석 대상 물질이 항체인 경우에는, 설명 중, 항원과 항체를 반대로 하면 된다.
시약으로서 분석 대상 물질 (항원) 에 특이적으로 결합하는 파트너 (항체) 감작 귀금속 콜로이드를 사용하는 경우에는, 반응 중에서 생성되는 면역 응집 복합체 (항원 항체 복합체) 가, 분석 대상 물질 (항원) 의 양에 따라 커진다. 그 커지는 정도로부터 분석 대상 물질 (항원) 의 농도를 측정할 수 있다.
한편, 시약으로서 그 파트너 (항체) 와 그 분석 대상 물질 (항원) 과 동일한 물질 (항원) 감작 귀금속 콜로이드의 양방을 함유하는 시약을 사용하는 경우, 반응 중에서 생성되는 면역 응집 복합체 (항원 항체 복합체) 가 분석 대상 물질 (항원) 의 양에 따라 작아진다. 이것은 일반적으로 면역 응집 저지법이라고도 불리며, 시약으로서의 귀금속 콜로이드에 감작된 항원과, 시약의 항체를 응집 반응시키는 방법이다. 이 방법에서는, 시료의 항원이 측정계 내에 들어가면, 시약의 항원 감작 귀금속 콜로이드와 시약의 항체 응집 반응은 저해되고, 결과적으로 응집이 작아져, 그 양이 감소한다.
분석 대상 물질과 그것에 특이적으로 결합하는 파트너로서, 예를 들어, 비오틴과 아비딘이나 스트렙토아비딘, 렉틴과 렉틴 결합성 당류, 호르몬과 호르몬 리셉터, 사이토카인과 사이토카인 리셉터, 프로테인 A 와 IgG, DNA 혹은 RNA 와 그것들에 상보적인 DNA 혹은 RNA 등의 조합을 사용하는 경우에도, 상기한 항원 혹은 항체와 항체 혹은 항원의 조합과 동일하게 하여, 귀금속 콜로이드 응집 측정법에 의해 측정할 수 있다.
본 발명에 사용하는 시약에는, 부형제, 안정화제, 완충제, 계면활성제를 첨가해도 된다.
상기 부형제로서는, 예를 들어, 알부민 등의 단백질, 글리신 등의 아미노산, 만니톨 등의 알코올류, 글루코오스 등의 탄화수소 화합물을 예시할 수 있다.
안정화제로서는, 물을 분자로 유지하기 쉬운 물질, 소르비톨 등의 당류가 일반적으로는 바람직하다.
시약으로서의 항체 감작 귀금속 콜로이드나 항원 감작 귀금속 콜로이드 등의 물질 감작 귀금속 콜로이드 시약은, 예를 들어, 이하와 같이 하여 조제할 수 있다. 귀금속 콜로이드 용액에, 항체 등의 감작 대상 물질을 첨가하여 완충액으로 조제하여 실온에서 정치 (靜置) 한 후, BSA 코트 용액을 첨가한다. 이어서, 원심 분리를 행하여, 상청을 폐기하고 침전물을 회수한다. 이 침전물에 BSA 코트 용액을 첨가하여 침전물을 현탁하고, 초음파 처리를 실시하여 완전히 분산시킨다. 이어서 원심 분리를 실시하여 얻어진 침전물에 현탁액을 첨가하여 현탁하여, 물질 감작 귀금속 콜로이드를 얻는다. 이어서, 얻어진 물질 감작 귀금속 콜로이드에 소르비톨, 계면활성제 등을 첨가하고, 경우에 따라 그 밖에 필요한 성분을 첨가함으로써 분석 대상 물질을 귀금속 콜로이드 응집 측정법으로 측정 가능한 시약을 조제할 수 있다.
본 발명의 검사 기구를 제조하기 위해, 분석 대상 물질을 귀금속 콜로이드 응집 측정법으로 측정 가능한 시약을 반응실을 구성하는 면의 적어도 일부에 건조 부착시킨다. 이 경우, 예를 들어, 액상의 그 시약을, 반응실을 구성하는 면의 적어도 일부에 도포하고, 이어서 건조시키면 된다. 그 액상 시약의 건조로서는, 예를 들어, 자연 건조나 동결 건조를 들 수 있는데, 본 발명에 있어서는, 라텍스 시약과 상이하여, 시약 안정성으로부터 자연 건조법이 바람직하다.
분석 대상 물질을 측정하기 위한 시약은, 하나의 시약으로 합하여, 검사 기구의 반응실을 구성하는 면에 건조 부착시켜도 되지만, 시약의 안정성 등을 고려하여 2 시약으로 나누어, 제 1 평면 및 제 2 평면에 각각 부착시켜도 된다. 시약으로서 분석 대상 물질에 대한 파트너와 분석 대상 물질과 동일한 물질 감작 귀금속 콜로이드를 함유하는 시약을 사용하는 경우에는, 제 1 평면과 제 2 평면에, 각각을 나누어 건조 부착하는 것이 바람직하다.
응집 측정법은, 통상, 입자로서 라텍스를 사용하는데, 본 발명에 있어서는 귀금속 콜로이드를 사용한다. 귀금속 콜로이드에 사용하는 귀금속으로서는, 금, 은, 백금, 팔라듐 등을 예시할 수 있는데, 금, 은 또는 팔라듐이 바람직하고, 금 또는 팔라듐이 보다 바람직하고, 금이 더욱 바람직하다. 금 콜로이드 또는 팔라듐 콜로이드, 특히 금 콜로이드를 사용하는 경우에, 본 발명의 검사 기구를 사용하여 분석 대상 물질을 매우 정확하게 측정하는 것이 가능하기 때문이다. 금 콜로이드의 흡수 파장의 극대 파장은 500 ㎚ 이상이지만, 본 발명에 있어서 귀금속 콜로이드로서 금 콜로이드를 사용하는 경우, 면역 응집 반응 등의 응집 반응 후에 얻어지는 혼합액에 광을 조사하여, 투과광 또는 반사광 유래의 흡광도 변화에 기초하여 액상 시료 중의 물질을 측정할 때에, 파장이 390 ∼ 420 ㎚ 여도 측정 가능하다. 또, 팔라듐 콜로이드의 흡수 파장의 극대 파장은 250 ㎚ 이하이지만, 본 발명에 있어서 귀금속 콜로이드로서 팔라듐 콜로이드를 사용하는 경우, 면역 응집 반응 등의 응집 반응 후에 얻어지는 혼합액에 광을 조사하여, 투과광 또는 반사광 유래의 흡광도 변화에 기초하여 액상 시료 중의 물질을 측정할 때에, 파장이 390 ∼ 420 ㎚ 여도 측정 가능하다. 이 경우, 광을 조사하기 위한 광원 (LED) 이 입수되기 쉽기 때문에 바람직하다.
본 발명에 있어서, 귀금속 콜로이드의 입경은, 통상, 1 ∼ 200 ㎚, 바람직하게는 20 ∼ 150 ㎚ 이다. 귀금속 콜로이드로서는, 압력차에 의해 액상 시료와 접촉 또는 충돌했을 때, 분산 용이한 것이 바람직하고, 귀금속 미립자가 보호 성분에 의해 보호되어 있어도 된다.
그와 같은 귀금속 콜로이드로서는, 본 발명의 압력차에 의해 액상 시료와 접촉했을 때에 분산 가능하면 특별히 한정되지 않지만, 4 급 암모늄염형 귀금속 착물 화합물 (일본 공개특허공보 2001-192712호), 고분자 안료 분산제로 보호된 귀금속 콜로이드 (일본 공개특허공보 평11-76800호, 일본 공개특허공보 평11-80647호), 분산제로서 시트르산나트륨을 사용한 귀금속 콜로이드 (일본 공개특허공보 평10-66861호), 펩티드 산화물이나 글루코사민 화합물의 산화물로 보호된 귀금속 콜로이드 (국제 공개 WO2005/023468호 팜플렛), 아미노산과 같은 아미노기와 카르복실기를 갖는 화합물로 보호된 귀금속 콜로이드 (일본 공개특허공보 2002-245854호) 를 예시할 수 있다.
본 발명에 있어서, 압력차를 실현하기 위해, 유로 및 반응실은, 통기성이 있고 또한 비통액상성의 다공성막을 개재하여 검사 기구 외부와 접속되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 압력차를 내기 위한 수단으로서는, 반응실과 공급부에 압력차가 발생하고, 그 결과, 액상 시료가 공급부로부터 유로를 경유하여 반응실로 보내져 건조 시약을 분산시킬 수 있는 정도의 수단이면 된다. 구체적으로는, 가압 수단, 인압 수단을 예시할 수 있는데, 검사 기구를 간단한 구조로 하기 위해, 가압 수단을 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 공급부에 공급된 시료를 공급부에 형성된 가압부에 의해 가압하여, 반응실 내로 이송 가능하게 하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 인압 수단을 사용할 때에는, 예를 들어, 반응실에 가스는 통과시키지만, 액체는 통과시키지 않는 막 또는 물질을 통과시켜 펌프로 당김으로써 압력차를 발생시킬 수 있다.
본 발명에 있어서는, 혼합액에 광을 조사할 때, 반응실에 조사하는 것이 바람직하다. 그 때문에, 반응실의 상하의 면은, 투명한 것이 바람직하다. 즉, 반응실은 측정실을 겸용하고 있는 것이 바람직하다.
이 경우, 혼합액에 광을 조사할 때, 반응실에 조사하기 때문에, 가시 부분광 광도계를 사용하는 것이 바람직하다. 그 때문에, 반응실의 상하의 면 중 적어도 일부는, 투명한 것이 바람직하다. 이 경우, 위로부터 광을 조사하여 투과광 또는 반사광 유래의 흡광도 변화를 판독하는 가시 부분광 광도계를 사용하여, 반응 후의 흡광도 변화를 측정하고, 그 변화의 증감에 기초하여 분석 대상 물질을 정량할 수 있다.
본 발명의 측정 방법은, 본 발명의 검사 기구에 추가하여, 반응실에 광을 조사하여 투과광 또는 반사광을 판독하기 위한 가시 부분광 광도계 2 개를 조합하여 장치로서 사용해도 된다. 이 장치에는, 예를 들어, 공급부를 가압하는 가압 수단을 구성하는 펌프를 구비하고 있어도 된다.
본 발명의 측정 방법은, 이상에 상세하게 설명한 본 발명의 검사 기구를 사용하여, 액상 시료를 본 발명의 검사 기구의 공급부에 공급하고, 이어서, 공급부와 반응실에 압력차를 발생시켜 유로를 경유하여 반응실로 이송시키고, 반응실 중의 시약에 액상 시료를 접촉시켜 시약을 액상 시약 중에 분산시키고, 액상 시료 중의 분석 대상 물질을 시약과 반응시켜, 얻어지는 혼합액에 광을 조사하여 투과광 또는 반사광 유래의 흡광도 변화에 기초하여 액상 시료 중의 분석 대상 물질을 측정하는 액상 시료 중의 분석 대상 물질의 측정 방법이다.
본 발명에 있어서는, 감작 귀금속 콜로이드 상태가 항원 항체 반응 등에 의해 상태가 변화되고, 그 결과, 반응 전후에 광을 조사하면, 투과광 또는 반사광 유래의 흡광도 변화가 일어난다. 반응 전의 데이터는, 시료로서 분석 대상 물질을 함유하지 않는 시료를 사용하여 측정할 수 있고, 반응 전후의 흡광도의 차로부터 분석 대상 물질의 농도를 구할 수 있다.
본 발명의 측정 방법에 있어서, 조사하는 광의 파장은, 340 ∼ 800 ㎚ 인 것이 바람직하고, 390 ∼ 420 ㎚ 인 것이 더욱 바람직하다. 390 ∼ 420 ㎚ 에서는 드라이 케미스트리에 사용하는 광원으로서 범용성이 있기 때문이다.
이하, 분석 대상 물질로서 항원을 측정하기 위해, 항체 감작 귀금속 콜로이드를 사용한 경우를 예로 들어 설명한다 (항체 측정인 경우에는, 항원과 항체를 반대로 하면 된다). 귀금속 콜로이드가 금 콜로이드인 경우, 시약의 항체 감작 금 콜로이드 용액은, 통상, 극대 흡수 파장이 500 ㎚ 이상이다. 항체 감작 금 콜로이드 용액은, 극대 흡수 파장 부근에서는, 그 항원 (분석 대상 물질) 과 반응하면, 흡광도의 큰 변화가 일어난다. 한편, 390 ∼ 420 ㎚ 에서도, 항체 감작 금 콜로이드 용액은, 항원과 반응하면 흡광도의 변화가 일어난다. 또, 귀금속 콜로이드가 팔라듐 콜로이드인 경우, 항체 감작 팔라듐 콜로이드 용액의 극대 흡수 파장은 통상 250 ㎚ 이하이며, 그 항원과 반응했을 때에는 이 극대 흡수 파장 부근에서 흡광도의 큰 변화가 일어나지만, 390 ∼ 420 ㎚ 에서도, 항체 감작 팔라듐 콜로이드 용액과 항원이 반응하면 흡광도의 변화가 일어난다. 본 발명에 있어서는, 항원 항체 반응 등의 액상 시료와 시약의 반응에 의한 흡광도의 변화의 정도로부터 항원의 농도를 정량할 수 있다.
분석 대상 물질과 그것에 특이적으로 결합하는 파트너로서, 그 밖의 조합을 사용하는 경우에도, 상기한 바와 같이 동일하게 하여, 귀금속 콜로이드 응집 측정법에 의해 측정할 수 있다.
반응실에서는, 액상 시료에 의해, 그 시약을 용해시켜 반응시킬 때에는, 예를 들어, 20 ∼ 40 ℃, 바람직하게는 37 ℃ 부근에서 반응시킴으로써 실시할 수 있다.
본 발명의 측정 방법에 있어서는, 검사 기구를 회전 조작이나 진동 조작을 가하지 않고, 즉, 특히 공간 이동을 시키지 않고 실시할 수 있다. 즉, 본 발명에 있어서는, 검사 기구의 공급부와 반응실에 압력차를 발생시키는 것 이외에는 특히 외부로부터의 물리적 이동이나 조작을 가하지 않고 검사 기구 자체를 움직이지 않고 건조 시약을 분산시켜 면역 반응 등의 반응을 실시할 수 있다. 또, 본 발명의 측정 방법에 있어서는, BF 분리를 할 필요가 없다. 그 결과, 매우 간단한 검사 기구를 사용하여 시료 중의 분석 대상 물질을 정확하게 측정할 수 있다.
이하에, 도면에 기초하여, 본 발명의 측정 방법 및 그것에 사용하는 검사 기구에 대하여, 더욱 구체적으로 설명한다.
본 발명에 관련된 검사 기구의 바람직한 일 실시형태로서 검사 기구를 도면에 기초하여 설명한다. 도 1 에 검사 기구의 종단면도, 도 2 에 검사 기구의 상면도, 도 3 에 검사 기구의 분해 사시도를 각각 나타낸다.
검사 기구는, 도 1 내지 3 에 나타내는 바와 같이, 제 1 플레이트 (1), 인쇄면 (1) (도면 중 부호 2), 다공성막으로 형성되는 중간 플레이트 (6), 인쇄면 (2) (도면 중 부호 3) 및 제 2 플레이트 (4) 가, 상하 방향으로 적층되어 일체화된 구조를 갖는다. 상층측의 제 1 플레이트 (1) 에는, 원형의 시료 공급부 (7) 가 형성되어 있다. 또한, 인쇄면은 검게 칠해진 층으로 되어 있는데, 드라이 시약을 바르기 위한 부분에는 인쇄면이 없기 때문에 움푹한 곳을 형성하여, 그 움푹한 곳에 드라이 시약을 도포할 수 있도록 설정되어 있다. 인쇄면 1 (인쇄면 2) 은, 제 1 플레이트 (1) (제 2 플레이트 (4)) 또는 중간 플레이트 (6) 의 일면에 코팅이나 스크린 인쇄 등에 의해 형성되어도 되고, 이들 플레이트와는 독립된 필름으로서 형성된 후에 이들 플레이트 사이에 적층되어도 된다. 시료 공급부 (7) 의 상부 주위에는, 바닥이 있는 원통 형상의 마개체 (8) 가 착탈 가능하게 형성되어 있다. 제 1 플레이트 (1) 및 제 2 플레이트 (4) 에는, 가공 용이한 수지 재료가 사용되며, 예를 들어, 스티렌·아크릴로니트릴 수지 (ABS 수지) 등이 사용된다. 중간 플레이트 (6) 에는, 비통액상성으로 통기성의 다공질재, 예를 들어, 사불화 에틸렌 수지 (PTFE 수지) 등이 사용된다.
제 1 플레이트 (1) 와 제 2 플레이트 (4) 사이에, 중간 플레이트 (6) 가 형성되고, 인쇄면 1 (2) 및 인쇄면 2 (3) 를 개재하여 접착되어 있다. 중간 플레이트 (6) 에는, 액상 시약의 유로 (10) 가 형성되고, 유로 (10) 를 통해 반응실 (11) 이 형성되어 있다. 시료 공급부 (7) 와 유로 (10) 사이에는, 통기성이 있고 또한 통액상성의 다공성막 (9) 이 형성되어 있다.
반응실 (11) 의 제 1 평면 및 제 2 평면 중 어느 것, 혹은 양방에 시약이 소정량 도포되고 건조 부착되어, 드라이 시약 (1) (도면 중 부호 5) 및/또는 드라이 시약 (2) (도면 중 부호 12) 을 형성하고 있다.
실제로 측정을 실시하는 경우에는, 시료 공급부 (7) 로부터 액상 시료를 공급한다. 그리고, 마개체 (8) 를 시료 공급부 (7) 에 씌워, 예를 들어, 손가락으로 마개체 (8) 를 가압한다. 이로써, 반응실 (11) 이나 유로 (10) 내의 공기가, 중간 플레이트 (6) 로부터 외부로 배출되어, 액상 시료가 반응실 (11) 내로 보내진다. 반응실 (11) 의 제 1 평면 및 제 2 평면 중 어느 것, 혹은 양방에, 시약이 건조 부착되어 있고, 반응실 (11) 의 공간 내로 액상 시료가 반송되면, 액상 시료 중에 시약이 분산되어, 액상 시료와 시약의 반응이 개시된다. 하나의 공간 내에서 시료와 시약이 혼합되므로 균일하게 혼합된다.
반응실 (11) 에서의 액상 시료와 시약의 반응 후의 혼합액의 측정은, 투과광 또는 반사광을 사용하여 측정할 수 있다. 투과광 또는 반사광을 사용하는 광 학 측정은, 제 1 플레이트 (1) 및 제 2 플레이트 (4) 전체를 광 투과성이 있는 수지로 형성하고, 반응실 (11) 에서 시약과 액상 시료의 반응 후에 혼합액에, 예를 들어, 제 2 플레이트 (4) 의 하방으로부터 제 1 플레이트 (1) 를 향하여 예를 들어, 파장 405 ㎚ 의 투과광을 조사하여, 반응실 (11) 에서의 투과광의 흡수에 의해 측정하면 된다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예 및 비교예를 사용하여 더욱 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이들 예에 한정되지 않는다.
실시예 1
본 발명에 의한 금 콜로이드를 사용한 인간 CRP 의 측정 방법
1. 방법
1) 항인간 CRP 항체 감작 금 콜로이드의 조제
금 콜로이드에 대한 항인간 CRP 항체의 감작은 이하와 같이 실시하였다.
평균 입경 50 ㎚ 의 금 콜로이드 용액 (나카라이사 판매, 보호 금 콜로이드 용액) 10 ㎖ 에, 항인간 CRP 항체를 Tris 완충액으로 0.2 ㎎/㎖ 가 되도록 조정한 용액 10 ㎖ 를 첨가하여 실온에서 15 분간 정치한 후, BSA 코트 용액을 10 ㎖ 첨가하였다. 그 후, 15,000 rpm 으로 10 분간 원심 분리를 실시하여, 상청을 폐기하고 침전물을 회수하였다. 이 침전물에 BSA 코트 용액을 20 ㎖ 첨가하여 침전물을 현탁하고, 30 초간 초음파 처리를 실시하여 완전히 분산시켰다. 이어서 원심 분리를 실시하여 얻어진 침전물에 현탁액을 1 ㎖ 첨가하여 현탁하여, 항인간 CRP 항체 감작 금 콜로이드를 얻었다.
2) 드라이 시약의 조제
상기 1) 에서 얻어진 항인간 CRP 항체 감작 금 콜로이드에 소르비톨을 종농도 2 ％, 계면활성제를 종농도 0.1 ％ 가 되도록 첨가하였다.
3) 검사 기구의 제작 및 그 조작
상기와 같이 조제한 시약은, 2 장의 PET 시트 상에, 0.375 ㎕, 0.5 ㎕ 가 되도록 각각 도포하여 자연 방치에 의해 건조시켰다. 건조 후, 도포된 시트는, 검체 유로를 포함하는 시트를 끼워 첩합 (貼合) 하여, 도 1 내지 3 에 나타내는 구성의 검사 기구를 제조하였다. 시료는 반응 셀 체적 2.5 용 (容) 중에 1 용이 되도록 공급부에 도입하고, 압압에 의해 유로를 경유하여 반응실에 도입하여 시약을 용해시켰다. 측정은 시료 도입 후, 10 분간, 37 ℃ 에서 반응시키고, 시약이 도포된 부분에 대해 파장 405 ㎚ 로 측광하여, 반응 후의 흡광도를 구하였다.
사용한 시약, 및 시료는, 구체적으로는 이하와 같다.
금 콜로이드 조제용 시약 ：
B SA 코트 용액
Tris 10 mM pH 9.2
BSA (소 혈청 알부민) 1.0 ％
PEG (평균 분자량 20,000) 0.1 ％
Tris 완충액
Tris 10 mM pH 9.2
현탁액
Tris 100 mM pH 9.2
시료 ：
인폼드 컨센트 (informed consent) 가 얻어진 인간 혈청 (n=30) 을 사용하였다.
4) 검사 기구에 의한 측정
기존법과의 상관성은 인폼드 컨센트가 얻어진 인간 혈청 (n=30) 을 사용하여, 기존법 (라텍스법) 과의 상관성을 확인하였다.
상관성의 확인에는 기존법으로서, N-에세이 LA CRP D-type (닛토보 메디칼사 제조) 을 사용하여, 히타치 7180 형 자동 분석 장치로 측정을 실시하였다. 또, 드라이 시약의 검량선은, CRP 농도 기지 (旣知) 의 관리 혈청을 사용하여 제조하였다.
2. 결과
기존법을 X, 본 발명법을 Y 로 하여 상관성을 확인하였다. 도 4 에 나타낸 바와 같이, Y=0.9849X＋0.007, 상관 계수 0.9925 로 양호한 결과가 얻어졌다. 이것으로부터 본 발명의 측정 방법은 금 콜로이드를 사용하여 인간 CRP 가 정확하게 측정되었다고 할 수 있다.
실시예 2
본 발명에 의한 금 콜로이드를 사용한 인간 시스타틴 C 의 측정 방법
1. 방법
1) 항인간 시스타틴 C 항체 감작 금 콜로이드의 조제
금 콜로이드에 대한 항인간 시스타틴 C 항체의 감작은 이하와 같이 실시하였다. 평균 입경 50 ㎚ 의 금 콜로이드 용액 (와인 레드 케미컬사 제조) 9 ㎖ 에, 항인간 시스타틴 C 항체를 Tris 완충액으로 150 ㎍/㎖ 가 되도록 조정한 용액 3 ㎖ 를 첨가하여 실온에서 15 분간 정치한 후, BSA 코트 용액을 9 ㎖ 첨가하였다. 그 후, 15,000 rpm 으로 10 분간 원심 분리를 실시하여, 상청을 폐기하고 침전물을 회수하였다. 이 침전물에 BSA 코트 용액을 9 ㎖ 첨가하여 침전물을 현탁하고, 30 초간 초음파 처리를 실시하여 완전히 분산시켰다. 이어서 원심 분리를 실시하여 얻어진 침전물에 현탁액을 705 ㎕ 첨가하여 현탁하여, 항인간 시스타틴 C 항체 감작 금 콜로이드를 얻었다.
2) 드라이 시약의 조제
상기 1) 에서 얻어진 항인간 시스타틴 C 항체 감작 금 콜로이드에 소르비톨을 종농도 2 ％, 계면활성제를 종농도 0.1 ％ 가 되도록 첨가하였다.
3) 검사 기구의 제작 및 그 조작
상기와 같이 조제한 시약은, 2 장의 PET 시트 상에, 0.375 ㎕, 0.5 ㎕ 가 되도록 각각 도포하여 건조시켰다. 건조 후, 도포된 시트는, 검체 유로를 포함하는 시트를 끼워 첩합하였다. 시료는 반응 셀 체적 2.5 용 중에 1 용이 되도록 도입하여, 시약을 용해시켰다. 측정은 시료 도입 후, 7 분간, 37 ℃ 에서 반응시켜, 시약이 도포된 부분에 대해 파장 405 ㎚, 800 ㎚ 로 측광하여, 반응 후의 흡광도를 구하였다.
사용한 시약, 및 시료는, 구체적으로는 이하와 같다.
금 콜로이드 조제용 시약 ：
BSA 코트 용액
Tris 10 mM pH 9.2
BSA (소 혈청 알부민) 1.0 ％
PEG (평균 분자량 20,000) 0.1 ％
Tris 완충액
Tris 10 mM pH 9.2
현탁액
Tris 100 mM pH 9.2
시료 ：
인폼드 컨센트가 얻어진 인간 혈청 (n=28) 을 사용하였다.
4) 검사 기구에 의한 측정
기존법과의 상관성은 인폼드 컨센트가 얻어진 인간 혈청 (n=28) 을 사용하여, 기존법 (라텍스법) 과의 상관성을 확인하였다.
상관성의 확인에는 기존법으로서, N-에세이 LA 시스타틴 C (닛토보 메디칼사 제조) 를 사용하여, 히타치 7180 형 자동 분석 장치로 측정을 실시하였다. 또, 드라이 시약의 검량선은, 시스타틴 C 농도 기지의 관리 혈청을 사용하여 작성하였다.
2. 결과
기존법을 X, 본 발명법을 Y 로 하여 상관성을 확인하였다. 도 5 에 나타낸 바와 같이, Y=0.9429X＋0.0635, 상관 계수 0.9710 으로 양호한 결과를 얻을 수 있었다. 이것으로부터 본 발명의 측정 방법은 금 콜로이드를 사용하여 인간 시스타틴 C 가 정확하게 측정되었다고 할 수 있다.
실시예 3
본 발명에 의한 팔라듐 콜로이드를 사용한 인간 CRP 의 측정 방법
1. 방법
1) 항인간 CRP 항체 감작 팔라듐 콜로이드의 조제
팔라듐 콜로이드에 대한 항인간 CRP 항체의 감작은 이하와 같이 실시하였다.
평균 입경 76 ㎚ 의 팔라듐 콜로이드 용액 (와인 레드 케미컬사 제조) 8 ㎖ 에, 단백 농도 0.2 ㎎/㎗ 이 되도록 Tris 완충액으로 조정한 항인간 CRP 항체 용액을 8 ㎖ 첨가하여, 실온에서 15 분간 정치한 후, BSA 코트 용액을 8 ㎖ 첨가하여, 15 분 정치하였다. 그 후, 15,000 rpm 으로 20 분간 원심 분리를 실시하여, 상청을 폐기하고 침전물을 회수하였다. 이 침전물에 BSA 코트 용액을 16 ㎖ 첨가하여 침전물을 현탁하고, 60 초간 초음파 처리를 실시하여 완전히 분산시켰다. 이어서, 15,000 rpm 으로 20 분간 원심 분리를 실시하여, 얻어진 침전물에 현탁액을 600 ㎕ 첨가하여 현탁하여, 항인간 CRP 항체 감작 팔라듐 콜로이드를 얻었다.
2) 드라이 시약의 조제
상기 1) 에서 얻어진 항인간 CRP 항체 감작 팔라듐 콜로이드에 글루코오스를 종농도 2 ％, 계면활성제를 종농도 0.6 ％ 가 되도록 첨가하였다.
3) 검사 기구의 제작 및 그 조작
상기와 같이 조제한 시약은, 1 장의 PET 시트 상에, 0.5 ㎕ 가 되도록 도포하여 건조시켰다. 건조 후, 시약을 도포한 PET 시트와 시약을 도포하지 않은 다른 한 장의 PET 시트에, 검체 유로를 포함하는 시트를 끼워 첩합하였다. 시료는 반응 셀 체적 2.5 용 중에 1 용이 되도록 도입하여, 시약을 용해시켰다. 측정은 시료 도입 후, 10 분간, 37 ℃ 에서 반응시켜, 시약이 도포된 부분에 대해 파장 405 ㎚ 로 측광하여, 반응 후의 흡광도를 구하였다.
사용한 시약, 및 시료는, 구체적으로는 이하와 같다.
팔라듐 콜로이드 조제용 시약 ：
BSA 코트 용액
Tris 10 mM pH 9.2
BSA (소 혈청 알부민) 1.0 ％
PEG (평균 분자량 20,000) 0.1 ％
Tris 완충액
Tris 10 mM pH 9.2
현탁액
Tris 200 mM pH 9.2
시료 ：
인폼드 컨센트가 얻어진 인간 혈장 (n=21) 을 사용하였다.
4) 검사 기구에 의한 측정
기존법과의 상관성은 인폼드 컨센트가 얻어진 인간 혈청 (n=21) 을 사용하여, 기존법 (라텍스법) 과의 상관성을 확인하였다.
상관성의 확인에는 기존법으로서, N-에세이 LA CRP D-type (닛토보 메디칼사 제조) 을 사용하여, 히타치 7180 형 자동 분석 장치로 측정을 실시하였다. 또, 드라이 시약의 검량선은, CRP 농도 기지의 관리 혈장을 사용하여 작성하였다.
2. 결과
기존법을 X, 본 발명법을 Y 로 하여 상관성을 확인하였다. 도 6 에 나타낸 바와 같이, Y=1.0207X＋0.252, 상관 계수 0.9817 로 양호한 결과가 얻어졌다. 이것으로부터 본 발명의 측정 방법은 팔라듐 콜로이드를 사용하여 인간 CRP 가 정확하게 측정되었다고 할 수 있다.
비교예 1
귀금속 콜로이드 이외를 사용한 인간 CRP 의 측정
귀금속 콜로이드 대신에 라텍스를 사용한 항인간 CRP 항체 감작 라텍스 (폴리스티렌 중합체) 시약을 조제하여, 실시예 1 과 동일한 실험을 실시하였다.
라텍스 시약에서는 측광시의 탁도에 의해 발생한 흡광도는 라텍스의 산란광에 의해 저해되어, 농도 의존적으로 흡광도를 얻을 수 없었다. 또한, 라텍스 시약은 분산, 확산성이 부족하여, 검체 공급 후에 건조 상태의 입자를 완전히 분산, 확산시키는 것은 불가능하였다.
분산, 확산성의 문제는 산란광을 발생시키기 어려운 착색 라텍스 입자를 사용해도 동일하여, 드라이 시약으로서 적응시킬 수 없었다.
또, TIA 법을 사용한 드라이 시약의 검토에서는, 얻어지는 흡광도 변화가 극단적으로 작아, CRP 와 같은 저농도의 단백질을 정량할 수 없었다.
산업상 사용가능성
본 발명의 검사 기구 및 그것을 사용한 분석 대상 물질의 측정 방법에 있어서는, 드라이 케미스트리에 의해 간편한 검사 기구를 사용하여 액상 시료 중의 분석 대상 물질을 정확하게 측정 가능하다. 나아가서는, 가시부에서의 흡광도에 기초하는 측정이 가능하기 때문에, 범용되고 있는 가시 분광 광도계를 사용한 장치에 적용할 수 있고, 또한, 단시간에 분석 대상물을 정확하게 측정할 수 있어, 본 발명의 검사 기구 및 측정 방법은 POCT 분야에 바람직한 것이다.
1 : 제 1 플레이트
2 : 인쇄면 1
3 : 인쇄면 2
4 : 제 2 플레이트
5 : 드라이 시약 1
6 : 중간 플레이트
7 : 공급부
8 : 마개체
9 : 막
10 : 유로
11 : 반응실
12 : 드라이 시약 2

Claims (14)

  1. 액상 시료 중의 분석 대상 물질을 귀금속 콜로이드 응집 측정법에 의해 측정하기 위한 검사 기구로서 ；
    적어도 액상 시료를 시약과 반응시키는 반응실을 가지고, 반응실을 구성하는 면의 적어도 일부에 시약이 건조 부착되어 있고, 또한, 시약이, 분석 대상 물질을 귀금속 콜로이드 응집 측정법으로 측정 가능한 시약이며 ； 또한, 액상 시료를 공급하기 위한 공급부 ； 및 그 공급부에 공급된 액상 시료를 반응실까지 이송하기 위한 유로를 구비하고 ；
    공급부에 공급된 액상 시료를 유로를 경유하여 반응실 내로 이송시켜 건조 부착된 시약을 액상 시료에 접촉시켜 액상 시료 중에 분산시키기 위한 공급부와 반응실에 압력차를 발생시킬 수 있는, 검사 기구.
  2. 제 1 항에 있어서,
    분석 대상 물질을 귀금속 콜로이드 응집 측정법으로 측정 가능한 시약이, 분석 대상 물질에 특이적으로 결합하는 파트너 감작 (感作) 귀금속 콜로이드를 함유하는 시약, 또는 그 파트너와 그 분석 대상 물질과 동일한 물질 감작 귀금속 콜로이드를 함유하는 시약인, 검사 기구.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    반응실은, 제 1 평면, 이것에 대향하는 제 2 평면, 및 제 1 평면 및 제 2 평면 각각에 접하고 제 1 평면과 제 2 평면 사이에 공간을 형성하는 제 3 면으로 형성되어 있고, 분석 대상 물질에 특이적으로 결합하는 파트너 감작 귀금속 콜로이드를 함유하는 시약이, 제 1 평면 또는 이것에 대향하는 제 2 평면에 건조 부착되거나, 혹은 그 파트너와 그 분석 대상 물질과 동일한 물질 감작 귀금속 콜로이드를 함유하는 시약에 있어서, 그 파트너가 제 1 평면 또는 이것에 대향하는 제 2 평면 중 어느 것에 건조 부착되고, 그 밖의 평면에 그 분석 대상 물질과 동일한 물질 감작 귀금속 콜로이드가 건조 부착된, 검사 기구.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    귀금속 콜로이드가 금 콜로이드 또는 팔라듐 콜로이드인, 검사 기구.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유로 및 반응실은, 통기성이 있고 또한 비통액상성의 다공성막을 개재하여 검사 기구 외부와 접속되어 있는, 검사 기구.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    가압에 의해 압력차를 발생시키는, 검사 기구.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    공급부에 공급된 액상 시료를 가압부에 의해 가압하여 반응실 내로 이송 가능한, 검사 기구.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    액상 시료가 생체 시료이고, 분석 대상 물질이 생체 성분인, 검사 기구.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    공급부와 유로 사이에, 액상 시료로부터 고체를 분리하기 위한 막을 갖는, 검사 기구.
  10. 분석 대상 물질을 함유하는 것으로 의심되는 액상 시료를 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 검사 기구의 공급부에 공급하고, 이어서, 공급부와 반응실에 압력차를 발생시켜 유로를 경유하여 액상 시료를 반응실로 이송시키고, 반응실 중의 시약에 액상 시료를 접촉시켜 시약을 액상 시료 중에 분산시키고, 액상 시료 중의 분석 대상 물질을 시약과 반응시켜, 얻어지는 혼합액에 광을 조사하여 투과광 또는 반사광 유래의 흡광도 변화에 기초하여 액상 시료 중의 분석 대상 물질을 측정하는, 액상 시료 중의 분석 대상 물질의 측정 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    혼합액에 광을 조사할 때, 반응실에 조사하는, 액상 시료 중의 분석 대상 물질의 측정 방법.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
    조사하는 광의 파장이 340 ∼ 800 ㎚ 범위 내인, 액상 시료 중의 분석 대상 물질의 측정 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    조사하는 광의 파장이 390 ∼ 420 ㎚ 의 범위 내인, 액상 시료 중의 분석 대상 물질의 측정 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 검사 기구에 추가하여, 반응실에 광을 조사하여 투과광 또는 반사광을 판독하기 위한 가시 부분광 광도계를 조합한, 액상 시료 중의 분석 대상 물질을 측정하기 위한 장치.
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