KR20130038254A - 표적화된 피롤로벤조디아제핀 접합체 - Google Patents

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KR20130038254A
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스캇 제프리
패트릭 벌크
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스피로즌 살
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Abstract

본 발명은 표적화제에 접합된 PBD를 포함하는 접합체 및 이러한 PBD를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

표적화된 피롤로벤조디아제핀 접합체{TARGETED PYRROLOBENZODIAZEPINE CONJUGATES}
본 발명은 표적화된 피롤로벤조디아제핀(PBD) 접합체, 특히 단량체들 중 하나의 C2 위치를 통해 표적화제에 접합된 피롤로벤조디아제핀 이량체에 관한 것이다.
일부 피롤로벤조디아제핀(PBD)은 DNA의 특이적인 서열을 인지하고 이에 결합하는 능력을 가지며, 바람직한 서열은 PuGPu이다. 제1 PBD 항종양 항생제인 안트라마이신은 1965년에 발견되었다[문헌(Leimgruber, et al., J. Am . Chem . Soc ., 87, 5793-5795 (1965); Leimgruber, et al., J. Am . Chem . Soc ., 87, 5791-5793(1965))]. 그 이후로, 다수의 천연 생성 PBD가 보고되었으며, 다양한 유사체에 대한 10 가지 이상의 합성 경로가 개발되었다[문헌(Thurston, et al., Chem . Rev . 1994, 433-465 (1994))]. 패밀리 멤버는 아베마이신[문헌(Hochlowski, et al., J. Antibiotics, 40, 145-148 (1987))], 치카마이신[문헌(Konishi, et al., J. Antibiotics, 37, 200-206 (1984))], DC-81[문헌(일본 특허 58-180 487; Thurston, et al., Chem . Brit ., 26, 767-772 (1990); Bose, et al., Tetrahedron, 48, 751-758 (1992))], 마제트라마이신[문헌(Kuminoto, et al., J. Antibiotics, 33, 665-667 (1980))], 네오트라마이신 A 및 B[문헌(Takeuchi, et al., J. Antibiotics, 29, 93-96 (1976))], 포로트라마이신[문헌(Tsunakawa, et al., J. Antibiotics, 41, 1366-1373(1988))], 프로트라카르신[문헌(Shimizu, et al, J. Antibiotics, 29, 2492-2503(1982); Langley and Thurston, J. Org . Chem ., 52, 91-97 (1987))], 시바노미신(DC-102)[문헌(Hara, et al., J. Antibiotics, 41, 702-704 (1988); Itoh, et al., J. Antibiotics, 41, 1281-1284 (1988))], 시비로마이신[문헌(Leber, et al., J. Am . Chem . Soc ., 110, 2992-2993(1988))] 및 토마마이신[문헌(Arima, et al., J. Antibiotics, 25, 437-444 (1972))]을 포함한다. PBD는 하기의 일반적인 구조를 갖는다:
Figure pct00001
이들은 이의 방향족 A 고리 및 피롤로 C 고리에서의 치환기의 수, 유형 및 위치가, 그리고 C 고리의 포화도가 상이하다. B 고리에는 DNA의 알킬화를 담당하는 친전자성 중심인 N10-C11 위치에 이민(N=C), 카르비놀아민(NH-CH(OH)) 또는 카르비놀아민 메틸 에테르(NH-CH(OMe))가 존재한다. 공지된 천연 생성물 모두는 C 고리로부터 A 고리를 향하여 볼 때 이들에게 오른손 방향의 트위스트를 제공하는 키랄 C11a 위치에 (S)-배향을 갖는다. 이는 B형 DNA의 작은 홈(minor groove)을 갖는 이소나선성(isohelicity)에 적절한 3차원 형상을 제공하여, 결합 부위에 적절히 맞도록 한다[문헌(Kohn, In Antibiotics Ⅲ. Springer-Verlag, New York, pp. 3-11 (1975); Hurley and Needham-VanDevanter, Acc . Chem . Res ., 19, 230-237 (1986))]. 작은 홈에서 부가물을 형성하는 PBD의 능력이 이것이 DNA 처리를 방해할 수 있게 하여 항종양제로서 사용 가능하게 한다.
이들 분자의 생물학적 활성은 가요성 알킬렌 링커에 의해 이의 C8/C'-히드록실 작용기를 통해 2개의 PBD 단위가 함께 결합됨으로써 강력해 질 수 있다[문헌(Bose, D.S., et al., J. Am . Chem . Soc ., 114, 4939-4941 (1992); Thurston, D.E., et al., J. Org . Chem ., 61, 8141-8147 (1996))]. PBD 이량체는 이들의 생물학적 활성을 주로 담당하는 것으로 여겨지는 재발성 5'-Pu-GATC-Py-3' 가닥간(interstrand) 가교[문헌(Smellie, M., et al., Biochemistry, 42, 8232-8239 (2003); Martin, C., et al., Biochemistry, 44, 4135-4147)]와 같은 서열 선택적 DNA 병변을 형성하는 것으로 여겨진다. PBD 이량체의 일례는 하기 화학식의 SG2000(SJG-136)이다:
Figure pct00002
[문헌(Gregson, S., et al., J. Med . Chem ., 44, 737-748 (2001); Alley, M.C., et al., Cancer Research, 64, 6700-6706 (2004); Hartley, J.A., et al., Cancer Research, 64, 6693-6699 (2004))].
이러한 매우 효능있는 화합물이 DNA 가교에서 작용하는 방식으로 인해, PBD 이량체는 대칭적으로, 즉 이량체의 양쪽 단량체가 동일하게 제조되어 왔다. 이러한 합성 경로는, 이미 형성된 이량체 결합을 갖는 PBD 이량체 부분을 동시에 구성하거나, 또는 이량체 결합 기를 갖는 이미 구성된 PBD 단량체 부분을 반응시킴으로써, 직접적인 합성을 제공한다. 이러한 합성 접근법은 PBD를 포함하는 표적화된 접합체의 제조에 대한 선택권을 제한한다. 그러나, PBD 이량체의 관찰된 효능으로 인하여, 표적화 치료에 사용하기 위하여 표적화제에 접합 가능한 PBD 이량체가 필요하다.
본 발명은 PBD 단량체가 표적화제에 화합물을 결합시키기 위한 고정 수단을 제공하는 C2 위치의 치환기를 갖는, 표적화제에 접합된 PBD 이량체를 포함하는 접합체(conjugate)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이량체의 PBD 단량체가 상이한, 표적화제에 접합된 PBD 이량체를 포함하는 접합체에 관한 것이다. PBD 단량체 중의 하나는 표적화제에 화합물을 결합시키기 위한 고정 수단을 제공하는 C2 위치의 치환기를 갖는다. 본 발명에 개시된 접합체는, 암 세포 또는 면역 세포와 같은, 표적 분자를 발현하는 세포에 대한 강력한 세포 독성 및/또는 세포 억제 활성을 갖는다. 이들 접합체는 상응하는 PBD 이량체가 없는 약물 화합물과 대비하여, 독성은 감소하면서 우수한 효능을 나타낸다.
몇몇의 구현예에서, 본 발명의 접합체는 하기 화학식 I을 갖는다:
Figure pct00003
상기 식에서, L은 리간드 단위(즉, 표적화제)이고, LU는 링커 단위이며 D는 PBD 이량체를 포함하는 약물 단위이다. 아래 첨자 p는 1 내지 20의 정수이다. 따라서, 상기 접합체는 링커 단위에 의해 적어도 하나의 약물 단위와 공유결합되는 리간드 단위를 포함한다. 이하에서 더욱 충분하게 기술되는 리간드 단위는 표적 부분에 결합하는 표적화제이다. 예컨대, 리간드 단위는 세포 성분(세포 결합제)에 특이적으로 결합하거나 또는 중요한 다른 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 예컨대 다양한 암 및 자가면역 질환의 치료 방법을 제공한다. 이러한 방법은 상기 접합체의 사용을 포함하며, 여기서 리간드 단위는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 표적화제이다. 리간드 단위는 예컨대, 항체, 항체의 항원-결합 단편과 같은 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드, 또는 Fc 융합 단백질과 같은 다른 결합제일 수 있다.
첫 번째 양태로서, 본 접합체는 하기 화학식 I(상기)의 접합체를 포함하며, 여기서 약물 단위는 하기 화학식 Ⅱ의 PBD 이량체를 포함한다:
Figure pct00004
상기 식에서,
R2는 하기 화학식 Ⅲ의 구조를 가지며:
Figure pct00005
상기 식에서, A는 C5 -7 아릴기이고, X는 링커 단위에 대한 접합을 활성화할 수 있는 기이며, 여기서 X는 -O-, -S-, -C(O)O-, -C(O)-, -NHC(O)-, 및 -N(RN)-을 포함하는 군에서 선택되고, 여기서 RN은 H, C1 -4 알킬 및 (C2H4O)mCH3를 포함하는 군에서 선택되며, 여기서 m은 1 내지 3이고,
(i) Q1은 단일 결합이고, Q2는 단일 결합 및 -Z-(CH2)n-에서 선택되며, 여기서 Z는 단일 결합, O, S 및 NH에서 선택되고, n은 1 내지 3이거나; 또는
(ii) Q1은 -CH=CH-이고, Q2는 단일 결합이고;
R12는 할로, 니트로, 시아노, 에테르, C1 -7 알킬, C3 -7 헤테로시클일 및 비스-옥시-C1 -3 알킬렌을 포함하는 군에서 선택되는 1 이상의 치환기로 임의로 치환된 C5 -10 아릴기이고;
R6 및 R9는 독립적으로 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', 니트로, Me3Sn 및 할로에서 선택되고;
여기서, R 및 R'는 독립적으로 임의로 치환된 C1 -12 알킬, 임의로 치환된 C3 -20 헤테로시클일 및 임의로 치환된 C5 -20 아릴기에서 선택되며;
R7은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NHRR', 니트로, Me3Sn 및 할로에서 선택되고;
(a) R10은 H이고, R11은 OH 또는 ORA이고, 여기서 RA는 C1 -4 알킬이거나;
(b) R10 및 R11은 이들이 결합된 질소 원자와 탄소 원자 사이에 질소-탄소 이중 결합을 형성하거나; 또는
(c) R10은 H이고, R11은 SOzM이고, 여기서 z는 2 또는 3이고, M은 1가의 약학적으로 허용되는 양이온이고;
R"는 사슬에 1 이상의 헤테로 원자, 예컨대 O, S, NRN2(식 중, RN2는 H 또는 C1 -4 알킬임), 및/또는 방향족 고리, 예컨대 벤젠 또는 피리딘이 개재할 수 있는 C3 -12 알킬렌기이며;
Y 및 Y'는 O, S 또는 NH에서 선택되며;
R6', R7', R9'는 각각 R6, R7 및 R9와 동일한 기에서 선택되고, R10' 및 R11'는 R10 및 R11과 동일하며, 여기서 R11 및 R11'가 SOzM일 경우, M은 2가의 약학적으로 허용되는 양이온을 나타낼 수 있다.
두 번째 양태로서, 본 발명은 증식 질환 또는 자가면역 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 화학식 I의 접합체의 용도를 제공한다. 관련된 세 번째 양태로서, 증식 질환 또는 자가면역 질환의 치료를 위한 화학식 I의 접합체의 용도를 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 표적 위치에 PBD 이량체, 또는 이의 염 또는 용매화물을 제공하기 위한 화학식 I의 접합체의 용도를 제공한다.
당해 분야에서 통상의 기술자는 후보 접합체가 임의의 특정 세포 유형에 대한 증식 병태를 치료하는지 여부를 용이하게 판단할 수 있다. 예컨대, 특정 화합물에 의해 제공된 활성을 평가하는 데에 통상적으로 사용될 수 있는 분석이 하기 실시예에 기재된다.
용어 "증식 질환"은 시험관내에서던지 또는 생체내에서던지 간에 신생물 성장 또는 증식 성장과 같은 바람직하지 않은 과잉 또는 비정상 세포의 원하지 않거나 또는 제어되지 않는 세포 증식에 관한 것이다.
증식 병태의 예는, 이에 한정되지 않지만, 신생물 및 종양[예컨대 조직구종, 신경아교종, 별아교세포종(astrocyoma), 골종], 암(예컨대 폐암, 소세포 폐암, 위장암, 대장암, 결장암, 유방암, 난소암, 전립샘암, 고환암, 간암, 신장암, 방광암, 췌장암, 뇌암, 육종, 골육종, 카포시 육종, 흑색종), 백혈병, 건선, 골 질환, 섬유 증식 장애(예컨대 결합 조직의 섬유 증식 장애) 및 죽상 동맥 경화증을 포함하나 이에 한정되지 않는 양성, 예비 악성 및 악성 세포 증식을 포함한다. 중요한 다른 암은 백혈병, 및 DLBCL, 변연부 림프종, 외투층 림프종 및 여포성 림프종과 같은 비호지킨 림프종 및 아형, 호지킨 림프종과 같은 림프종과 같은 혈액암, AML, 및 B 또는 T 세포 기원의 다른 암을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
자가면역 질환의 예로는 하기를 포함한다: 류마티스 관절염, 자가면역 탈수초성 질환(예컨대, 다발성 경화증, 알러지성 뇌척수염), 건선성 관절염, 내분비성 안질환, 포도막염, 전신 홍반성 루푸스, 중증 근무력증, 그레이브스병, 사구체신염, 자가면역 간질환(autoimmune hepatological disorder), 염증성 장 질환(예컨대, 크론씨병), 아나필락시스, 알러지 반응, 쇼그렌 증후군, 제1형 당뇨병, 원발성 담즙성 간경변증, 웨게너 육아종증, 섬유근육통, 다발성 근염, 피부 근염, 다발성 내분비 부전, 슈미트 증후군, 자가면역 포도막염, 애디슨병, 부신염, 갑상선염, 하시모토 갑상선염, 자가면역 갑상선 질환, 악성 빈혈, 위 위축(gastric atrophy), 만성 간염, 루포이드 간염, 죽상경화증, 아급성 피부형 홍반성 루푸스, 부갑상선 기능 저하증, 드레슬러 증후군, 자가면역 혈소판감소증, 특발성 혈소판감소성 자반병, 용혈성 빈혈, 심상성 천포창, 천포창, 포진성 피부염, 원형 탈모증, 유천포창, 경피증, 진행성 전신성 경화증, CREST 증후군(석회화증, 레이노드 현상, 식도 운동 장애, 손발가락 경화증, 및 모세혈관 확장증), 남성 및 여성 자가면역 불임, 강직성 척추염, 궤양성 대장염, 혼합성 결합조직 질환, 결절성 다발동맥염, 전신성 궤사성 혈관염, 아토피 피부염, 아토피 비염, 굿파스튜어 증후군, 샤가스병, 유육종증, 류마티스성 열, 천식, 습관성 유산, 항인지질 증후군, 농부 폐, 다형 홍반, 심장절개술후 증후군, 쿠싱 증후군, 자가면역성 만성 활동성 간염, 새 사육가 폐, 독성 표피 괴사융해증, 알포트 증후군, 폐포염, 알러지성 폐포염, 섬유화 폐포염, 간질성 폐 질환, 결절 홍반, 괴저성 농피증, 수혈 반응, 타카야수 동맥염, 류마티스성 다발성 근육통, 측두 동맥염, 주혈흡충증, 거대세포 동맥염, 회충증, 아스페르길루스증, 샘터 증후군(Sampter's syndrome), 습진, 림프종양 육아종증, 베체트병, 카플란 증후군, 가와사키병, 뎅기열, 뇌척수염, 심장 내막염, 심내막 섬유화증, 안내염, 장기 융기성 홍반, 건선, 태아적아구증, 호산구성 근막염, 슐만 증후군, 펠티 증후군, 필라리아증, 모양체염, 만성 모양체염, 이색소성 모양체염, 푹스 모양체염, IgA 신증, 헤노흐-쇤라인 자반증, 이식편대 숙주 질환, 이식 거부, 심근증, 이튼-람베르트 증후군, 재발성 다발연골염, 한랭글로불린혈증, 발덴스트룀 거대글로불린혈증, 에반스 증후군, 및 자가면역성 생식샘 부전.
몇몇의 구현예에서, 자가면역 질환은 B 림프구의 질환(예컨대, 전신 홍반성 루푸스, 굿파스튜어 증후군, 류마티스 관절염, 및 제1형 당뇨병), Th1-림프구의 질환(예컨대, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 건선, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 원발성 담즙성 간경변증, 웨게너 육아종증, 결핵, 또는 이식편대 숙주 질환), 또는 Th2-림프구의 질환(예컨대, 아토피 피부염, 전신 홍반성 루푸스, 아토피성 천식, 비결막염, 알러지성 비염, 오멘 증후군, 전신성 경화증, 또는 만성 이식편대 숙주 질환)이다. 일반적으로, 수지상 세포를 수반하는 질환은 Th1-림프구 또는 Th2-림프구의 질환을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 자가면역 질환은 T 세포-매개 면역 질환이다.
네 번째 양태로서, 본 발명은 화학식 I의 접합체를 제조하는 방법을 포함한다.
본 발명에서 사용하기 위한 이량체 PBD 화합물은 대칭 이량체 PBD 화합물을 제조함에 있어서 이전에 이용되었던 것들과는 상이한 전략에 의해 제조된다. 특히, 본 발명자들은 별도의 방법의 단계에서 C2 아릴 치환기를 대칭 PBD 이량체 코어에 첨가하는 것을 수반하는 방법을 개발하였다. 따라서, 여섯 번째 양태로서, 본 발명은 하기 기재된 방법의 단계 중 1 이상을 포함하는, 화학식 I의 접합체의 제조 방법을 제공한다.
도 1 내지 도 6은 종양에서 본 발명의 접합체의 효과를 도시한다.
정의
본 명세서에서 상품명(trade name)이 사용된 경우, 문맥상 달리 지시되지 않는한, 상품명에 대한 인용은 상품명 제품의 제품 조형, 제네릭 약물, 및 활성 약제학적 성분을 또한 지칭한다.
결합제 및 표적화제
본 명세서에서 사용된 바의 용어 "결합제" 및 "표적화제"는 표적 분자에 특이적으로 결합하는, 예컨대 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드와 같은 분자를 지칭한다. 예로는 전장의 항체(full length antibody), 전장의 항체의 항원 결합 단편, 표적 분자에 특이적으로 결합하는 항체 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 다른 제제(단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드), 또는 표적 분자에 결합하고 항체의 Fc 영역, 도메인 또는 이의 일부에 접합되는 단백질, 펩티드, 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하는 Fc 융합 단백질을 포함할 수 있다.
특이적 결합
용어 "특이적으로 결합하다" 및 "특이적 결합"은 소정의 분자(예컨대, 항원)에 대한 항체 또는 다른 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 결합을 지칭한다. 전형적으로, 항체 또는 다른 분자는 적어도 약 1×107 M-1의 친화도로 결합하며, 소정의 분자 또는 밀접하게 관련된 분자를 제외한 비특이적 분자(예컨대, BSA, 카제인)에 대한 결합을 위한 친화도보다 적어도 2배 더 큰 친화도를 갖는 소정의 분자에 결합한다.
약학적으로 허용되는 양이온
약학적으로 허용되는 1가 및 2가 양이온의 예는 본 명세서에서 참고로 인용하는 문헌[Berge, et al., J. Pharm . Sci ., 66, 1-19 (1977)]에 논의되어 있다.
약학적으로 허용되는 양이온은 무기 또는 유기 양이온일 수 있다.
약학적으로 허용되는 1가 무기 양이온의 예는 Na+ 및 K+와 같은 알칼리 금속 이온을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 약학적으로 허용되는 2가 무기 양이온의 예는 Ca2 + 및 Mg2 +와 같은 알칼리 토금속 양이온을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 약학적으로 허용되는 유기 양이온의 예는 암모늄 이온(즉, NH4 +) 및 치환된 암모늄 이온(예컨대, NH3R+, NH2R2 +, NHR3 +, NR4 +)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 적절한 치환된 암모늄 이온의 예는 에틸아민, 디에틸아민, 디시클로헥실아민, 트리에틸아민, 부틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진, 벤질아민, 페닐벤질아민, 콜린, 멜구민 및 트로메타민 뿐 아니라, 리신 및 아르기닌과 같은 아미노산으로부터 유도된 것들이다. 통상적인 4급 암모늄 이온의 예는 N(CH3)4 +이다.
치환기
본 명세서에서 사용된 표현 "임의로 치환된"은 비치환될 수 있거나 또는 치환될 수 있는 모기(parent group)에 관한 것이다.
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 용어 "치환된"은 1 이상의 치환기를 갖는 모기에 관한 것이다. 용어 "치환기"는 본 명세서에서 통상적인 의미로 사용되며, 모기에 공유 결합되거나 또는 적절한 경우 모기에 융합된 화학적 부분을 지칭한다. 매우 다양한 치환기가 공지되어 있으며, 이를 형성시키는 방법 및 다양한 모기에 도입하는 방법도 잘 알려져 있다.
치환기의 예를 하기에 더욱 상세히 설명한다.
C1 -12 알킬: 본 명세서에서 사용된 바의 용어 "C1 -12 알킬"은 지방족 또는 지환족일 수 있고 포화 또는 불포화(예컨대, 부분 불포화, 완전 불포화)될 수 있는 1 내지 12 개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소 화합물의 탄소 원자로부터 수소 원자를 제거하여 얻어진 1가 부분에 관한 것이다. 따라서, 용어 "알킬"은 하기에 논의되는 하위 부류 알케닐, 알키닐, 시클로알킬 등을 포함한다.
포화 알킬기의 예는 메틸(C1), 에틸(C2), 프로필(C3), 부틸(C4), 펜틸(C5), 헥실(C6) 및 헵틸(C7)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
포화 직쇄형 알킬기의 예는 메틸(C1), 에틸(C2), n-프로필(C3), n-부틸(C4), n-펜틸(아밀)(C5), n-헥실(C6) 및 n-헵틸(C7)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
포화 분지쇄형 알킬기의 예는 이소프로필(C3), 이소부틸(C4), 세크-부틸(C4), 터트-부틸(C4), 이소펜틸(C5) 및 네오펜틸(C5)을 포함한다.
C2 -12 알케닐: 본 명세서에서 사용된 바의 용어 "C2 -12 알케닐"은 1개 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 알킬기에 관한 것이다.
불포화 알케닐기의 예는 에테닐(비닐, -CH=CH2), 1-프로페닐(-CH=CH-CH3), 2-프로페닐(알릴, -CH-CH=CH2), 이소프로페닐(1-메틸비닐, -C(CH3)=CH2), 부테닐(C4), 펜테닐(C5) 및 헥세닐(C6)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
C2 -12 알키닐: 본 명세서에서 사용된 바의 용어 "C2 -12 알키닐"은 1개 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 알킬기에 관한 것이다.
불포화 알키닐기의 예는 에티닐(-C≡CH) 및 2-프로피닐(프로파르길, -CH2-C≡CH)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
C3 -12 시클로알킬: 본 명세서에서 사용된 바의 용어 "C3 -12 시클로알킬"은 시클일기이기도 한 알킬기, 즉 부분이 3 내지 7 개의 고리 원자를 비롯한 3 내지 7 개의 탄소 원자를 갖는 환식 탄화수소(탄소환식) 화합물의 지환족 고리 원자로부터 수소 원자를 제거하여 얻어진 1가 부분에 관한 것이다.
시클로알킬기의 예는 하기로부터 유도된 것들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다:
포화 단환식 탄화수소 화합물:
시클로프로판(C3), 시클로부탄(C4), 시클로펜탄(C5), 시클로헥산(C6), 시클로헵탄(C7), 메틸시클로프로판(C4), 디메틸시클로프로판(C5), 메틸시클로부탄(C5), 디메틸시클로부탄(C6), 메틸시클로펜탄(C6), 디메틸시클로펜탄(C7) 및 메틸시클로헥산(C7);
불포화 단환식 탄화수소 화합물:
시클로프로펜(C3), 시클로부텐(C4), 시클로펜텐(C5), 시클로헥센(C6), 메틸시클로프로펜(C4), 디메틸시클로프로펜(C5), 메틸시클로부텐(C5), 디메틸시클로부텐(C6), 메틸시클로펜텐(C6), 디메틸시클로펜텐(C7) 및 메틸시클로헥센(C7); 및
포화 다환식 탄화수소 화합물:
노르카란(C7), 노르피난(C7), 노르보르난(C7).
C3 -20 헤테로시클일: 본 명세서에서 사용된 바의 용어 "C3 -20 헤테로시클일"은 부분이 3 내지 20 개의 고리 원자를 갖고 이의 1 내지 10 개가 고리 헤테로 원자인 복소환식 화합물의 고리 원자로부터 수소 원자를 제거하여 얻어진 1가 부분에 관한 것이다. 바람직하게는, 각각의 고리는 3 내지 7 개의 고리 원자를 갖고 이의 1 내지 4 개가 고리 헤테로 원자이다.
본 문맥에서, 접두사(예컨대, C3 -20, C3 -7, C5 -6 등)는 탄소 원자던지 헤테로 원자던지 간에 고리 원자의 수 또는 고리 원자의 수의 범위를 지칭한다. 예컨대, 본 명세서에서 사용된 바의 용어 "C5 - 6헤테로시클일"은 5 또는 6 개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클일기에 관한 것이다.
단환식 헤테로시클일기의 예는 하기로부터 유도된 것들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다:
N1: 아지리딘(C3), 아제티딘(C4), 피롤리딘(테트라히드로피롤)(C5), 피롤린(예컨대, 3-피롤린, 2,5-디히드로피롤)(C5), 2H-피롤 또는 3H-피롤(이소피롤, 이소아졸)(C5), 피페리딘(C6), 디히드로피리딘(C6), 테트라히드로피리딘(C6), 아제핀(C7);
O1: 옥시란(C3), 옥세탄(C4), 옥솔란(테트라히드로푸란)(C5), 옥솔(디히드로푸란)(C5), 옥산(테트라히드로피란)(C6), 디히드로피란(C6), 피란(C6), 옥세핀(C7);
S1: 티이란(C3), 티에탄(C4), 티올란(테트라히드로티오펜)(C5), 티안(테트라히드로티오피란)(C6), 티에판(C7);
O2: 디옥솔란(C5), 디옥산(C6) 및 디옥세판(C7);
O3: 트리옥산(C6);
N2: 이미다졸리딘(C5), 피라졸리딘(디아졸리딘)(C5), 이미다졸린(C5), 피라졸린(디히드로피라졸)(C5), 피페라진(C6);
N1O1: 테트라히드로옥사졸(C5), 디히드로옥사졸(C5), 테트라히드로이속사졸(C5), 디히드로이속사졸(C5), 모르폴린(C6), 테트라히드로옥사진(C6), 디히드로옥사진(C6), 옥사진(C6);
N1S1: 티아졸린(C5), 티아졸리딘(C5), 티오모르폴린(C6);
N2O1: 옥사디아진(C6);
O1S1: 옥사티올(C5) 및 옥사티안(티옥산)(C6); 및
N1O1S1: 옥사티아진(C6).
치환된 단환식 헤테로시클일기의 예는 환식 형태의 당류로부터 유도된 것들, 예컨대, 아라비노푸라노오스, 릭소푸라노오스(lyxofuranose), 리보푸라노오스 및 크실로푸라노오스와 같은 푸라노오스(C5); 및 알로피라노오스, 알트로피라노오스, 글루코피라노오스, 만노피라노오스, 글루오피라노오스, 이도피라노오스, 갈락토피라노오스 및 탈로피라노오스와 같은 피라노오스(C6)를 포함한다.
C5 -20 아릴: 본 명세서에서 사용된 바의 용어 "C5 -20 아릴"은 부분이 3 내지 20 개의 고리 원자를 갖는 방향족 화합물의 방향족 고리 원자로부터 수소 원자를 제거하여 얻어진 1가 부분에 관한 것이다. 바람직하게는, 각각의 고리는 5 내지 7 개의 고리 원자를 갖는다.
본 문맥에서, 접두사(예컨대, C3 -20, C5 -7, C5 -6 등)는 탄소 원자이던 헤테로 원자이던 간에 고리 원자의 수 또는 고리 원자의 수의 범위를 지칭한다. 예컨대, 본 명세서에서 사용된 바의 용어 "C5 -6 아릴"은 5 또는 6 개의 고리 원자를 갖는 아릴기에 관한 것이다.
고리 원자는 "카르보아릴기"에서와 같이 모두 탄소 원자일 수 있다.
카르보아릴기의 예는 벤젠(즉, 페닐)(C6), 나프탈렌(C10), 아줄렌(C10), 안트라센(C14), 페난트렌(C14), 나프타센(C18) 및 피렌(C16)으로부터 유도된 것들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
적어도 하나가 방향족 고리인 융합 고리를 포함하는 아릴기의 예는 인단(예컨대, 2,3-디히드로-1H-인덴)(C9), 인덴(C9), 이소인덴(C9), 테트랄린(1,2,3,4-테트라히드로나프탈렌)(C10), 아세나프텐(C12), 플루오렌(C13), 페날렌(C13), 아세페난트렌(C15) 및 아세안트렌(C16)으로부터 유도된 기를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
대안적으로, 고리 원자는 "헤테로아릴기"에서와 같이 1 이상의 헤테로 원자를 포함할 수 있다. 단환식 헤테로아릴기의 예는 하기로부터 유도된 것들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다:
N1: 피롤(아졸)(C5), 피리딘(아진)(C6);
O1: 푸란(옥솔)(C5);
S1: 티오펜(티올)(C5);
N1O1: 옥사졸(C5), 이속사졸(C5), 이속사진(C6);
N2O1: 옥사디아졸(푸라잔)(C5);
N3O1: 옥사트리아졸(C5);
N1S1: 티아졸(C5), 이소티아졸(C5);
N2: 이미다졸(1,3-디아졸)(C5), 피라졸(1,2-디아졸)(C5), 피리다진(1,2-디아진)(C6), 피리미딘(1,3-디아진)(C6)(예컨대, 시토신, 티민, 우라실), 피라진(1,4-디아진)(C6);
N3: 트리아졸(C5), 트리아진(C6); 및
N4: 테트라졸(C5).
융합 고리를 포함하는 헤테로아릴의 예는 하기를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다:
벤조푸란(O1), 이소벤조푸란(O1), 인돌(N1), 이소인돌(N1), 인돌리진(N1), 인돌린(N1), 이소인돌린(N1), 푸린(N4)(예컨대 아데닐, 구아닌), 벤즈이미다졸(N2), 인다졸(N2), 벤즈옥사졸(N1O1), 벤즈이속사졸(N1O1), 벤조디옥솔(O2), 벤조푸란(N2O1), 벤조트리아졸(N3), 벤조티오푸란(S1), 벤조티아졸(N1S1), 벤조티아디아졸(N2S)로부터 유도된 C9(2개의 융합 고리를 가짐);
크로멘(O1), 이소크로멘(O1), 크로만(O1), 이소크로만(O1), 벤조디옥산(O2), 퀴놀린(N1), 이소퀴놀린(N1), 퀴놀리진(N1), 벤족사진(N1O1), 벤조디아진(N2), 피리도피리딘(N2), 퀴녹살린(N2), 퀴나졸린(N2), 신놀린(N2), 프탈라진(N2), 나프티리딘(N2), 프테리딘(N4)으로부터 유도된 C10(2개의 융합 고리를 가짐);
벤조디아제핀(N2)으로부터 유도된 C11(2개의 융합 고리를 가짐);
카르바졸(N1), 디벤조푸란(O1), 디벤조티오펜(S1), 카르볼린(N2), 페리미딘(N2), 피리도인돌(N2)로부터 유도된 C13(3개의 융합 고리를 가짐); 및
아크리딘(N1), 크산텐(O1), 티오크산텐(S1), 옥산트렌(O2), 페녹사티인(O1S1), 페나진(N2), 페녹사진(N1O1), 페노티아진(N1S1), 티안트렌(S2), 페난트린(N1), 페난트롤린(N2), 페나진(N2)으로부터 유도된 C14(3개의 융합 고리를 가짐).
상기 기들은 단독이던지 또는 다른 치환기의 일부이던 간에 그 자체로 임의로 그 자신 및 하기 기재한 추가의 치환기에서 선택되는 1 이상의 기로 치환될 수 있다.
할로: -F, -Cl, -Br 및 -I.
히드록시: -OH.
에테르: -OR[여기서 R은 에테르 치환기, 예컨대 C1 -7 알킬기(하기 논의되는 C1-7 알콕시기로도 지칭됨), C3 -20 헤테로시클일기(C3 -20 헤테로시클일옥시기로도 지칭됨) 또는 C5 -20 아릴기(C5 -20 아릴옥시기로도 지칭됨), 바람직하게는 C1 -7 알킬기임].
알콕시: -OR[여기서 R은 알킬기, 예컨대 C1 -7 알킬기임]. C1 -7 알콕시기의 예는 -OMe(메톡시), -OEt(에톡시), -O(nPr)(N-프로폭시), -O(iPr)(이소프로폭시), -O(nBu)(n-부톡시), -O(sBu)(세크-부톡시), -O(iBu)(이소부톡시) 및 -O(tBu)(터트-부톡시)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
아세탈: -CH(OR1)(OR2)[여기서 R1 및 R2는 독립적으로 아세탈 치환기, 예컨대 C1-7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 C1 -7 알킬기, 또는 "환식" 아세탈기의 경우, R1 및 R2는 이들이 부착된 2개의 산소 원자 및 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 4 내지 8 개의 고리 원자를 갖는 복소환식 고리를 형성함]. 아세탈기의 예는 -CH(OMe)2, -CH(OEt)2 및 -CH(OMe)(OEt)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
헤미아세탈: -CH(OH)(OR1)(여기서 R1은 헤미아세탈 치환기, 예컨대 C1 -7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 C1 -7 알킬기임). 헤미아세탈기의 예는 -CH(OH)(OMe) 및 -CH(OH)(OEt)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
케탈: -CR(OR1)(OR2)(여기서 R1 및 R2는 아세탈에 대해 정의된 바와 같고, R은 수소 이외의 케탈 치환기, 예컨대 C1 -7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 C1 -7 알킬기임). 케탈기의 예는 -C(Me)(OMe)2, -C(Me)(OEt)2, -C(Me)(OMe)(OEt), -C(Et)(OMe)2, -C(Et)(OEt)2 및 -C(Et)(OMe)(OEt)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
헤미케탈: -CR(OH)(OR1)(여기서 R1은 헤미아세탈에 대해 정의된 바와 같고, R은 수소 이외의 헤미케탈 치환기, 예컨대 C1 -7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 C1 -7 알킬기임). 헤미케탈기의 예는 -C(Me)(OH)(OMe), -C(Et)(OH)(OMe), -C(Me)(OH)(OEt) 및 -C(Et)(OH)(OEt)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
옥소(케토, -온): =O.
티온(티오케톤): =S.
이미노(이민): =NR(여기서 R은 이미노 치환기, 예컨대 수소, C1 -7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 수소 또는 C1 -7 알킬기임). 이미노기의 예는 =NH, =NMe, =NEt 및 =NPh를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
포르밀(카르발데히드, 카르복스알데히드): -C(=O)H.
아실(케토): -C(=O)R[여기서 R은 아실 치환기, 예컨대 C1 -7 알킬기(C1 -7 알킬아실 또는 C1 -7 알카노일로도 지칭됨), C3 -20 헤테로시클일기(C3 -20 헤테로시클일아실로도 지칭됨) 또는 C5 -20 아릴기(C5 -20 아릴아실로도 지칭됨), 바람직하게는 C1 -7 알킬기임]. 아실기의 예는 -C(=O)CH3(아세틸), -C(=O)CH2CH3(프로피오닐), -C(=O)C(CH3)3(t-부티릴) 및 -C(=O)Ph(벤조일, 페논)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
카르복시(카르복실산): -C(=O)OH.
티오카르복시(티오카르복실산): -C(=S)SH.
티올로카르복시(티올로카르복실산): -C(=O)SH.
티오노카르복시(티오노카르복실산): -C(=S)OH.
이미드산: -C(=NH)OH.
히드록삼산: -C(=NOH)OH.
에스테르(카르복실레이트, 카르복실산 에스테르, 옥시카르보닐): -C(=O)OR(여기서 R은 에스테르 치환기, 예컨대 C1 -7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 C1 -7 알킬기임). 에스테르기의 예는 -C(=O)OCH3, -C(=O)OCH2CH3, -C(=O)OC(CH3)3 및 -C(=O)OPh를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
아실옥시(역 에스테르): -OC(=O)R(여기서 R은 아실옥시 치환기, 예컨대 C1 -7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 C1 -7 알킬기임). 아실옥시기의 예는 -OC(=O)CH3(아세톡시), -OC(=O)CH2CH3, -OC(=O)C(CH3)3, -OC(=O)Ph 및 -OC(=O)CH2Ph를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
옥시카르보닐옥시: -OC(=O)OR(여기서 R은 에스테르 치환기, 예컨대 C1 -7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 C1 -7 알킬기임). 옥시카르보닐옥시기의 예는 -OC(=O)OCH3, -OC(=O)OCH2CH3, -OC(=O)OC(CH3)3 및 -OC(=O)OPh를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
아미노: -NR1R2[여기서 R1 및 R2는 독립적으로 아미노 치환기, 예컨대 수소, C1-7 알킬기(C1 -7 알킬아미노 또는 디-C1 -7 알킬아미노로도 지칭됨), C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 H 또는 C1 -7 알킬기이거나, 또는 "환식" 아미노기의 경우, R1 및 R2는 이들이 부착되는 질소 원자와 함께 4 내지 8 개의 고리 원자를 갖는 복소환식 고리를 형성함]. 아미노기는 1급(-NH2), 2급(-NHR1) 또는 3급(-NHR1R2)일 수 있고, 양이온 형태에서는 4급(-+NR1R2R3)일 수 있다. 아미노기의 예는 -NH2, -NHCH3, -NHC(CH3)2, -N(CH3)2, -N(CH2CH3)2 및 -NHPh를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 환식 아미노기의 예는 아지리디노, 아제티디노, 피롤리디노, 피페리디노, 피페라지노, 모르폴리노 및 티오모르폴리노를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
아미도(카르바모일, 카르바밀, 아미노카르보닐, 카르복사미드): -C(=O)NR1R2(여기서 R1 및 R2는 독립적으로 아미노기에 대해 정의된 바의 아미노 치환기임). 아미도기의 예는 -C(=O)NH2, -C(=O)NHCH3, -C(=O)N(CH3)2, -C(=O)NHCH2CH3 및 -C(=O)N(CH2CH3)2 뿐 아니라, R1 및 R2가 이들이 부착된 질소 원자와 함께 예컨대 피페리디노카르보닐, 모르폴리노카르보닐, 티오모르폴리노카르보닐 및 피페라지노카르보닐에서와 같이 복소환식 구조를 형성하는 아미도기도 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
티오아미도(티오카르바밀): -C(=S)NR1R2(여기서 R1 및 R2는 독립적으로 아미노기에 대해 정의된 바의 아미노 치환기임). 아미도기의 예는 -C(=S)NH2, -C(=S)NHCH3, -C(=S)N(CH3)2 및 -C(=S)NHCH2CH3을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
아실아미도(아실아미노): -NR1C(=O)R2(여기서 R1은 아미드 치환기, 예컨대 수소, C1 -7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 수소 또는 C1-7 알킬기이고, R2는 아실 치환기, 예컨대 C1 -7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5-20아릴기, 바람직하게는 수소 또는 C1 -7 알킬기임). 아실아미드기의 예는 -NHC(=O)CH3, -NHC(=O)CH2CH3 및 -NHC(=O)Ph를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. R1 및 R2는 함께 예컨대 숙신이미딜, 말레이미딜 및 프탈이미딜에서와 같이 환식 구조를 형성할 수 있다:
Figure pct00006
아미노카르보닐옥시: -OC(=O)NR1R2(여기서 R1 및 R2는 독립적으로 아미노기에 대해 정의된 바의 아미노 치환기임). 아미노카르보닐옥시기의 예는 -OC(=O)NH2, -OC(=O)NHMe, -OC(=O)NMe2 및 -OC(=O)NEt2를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
우레이도: -N(R1)CONR2R3(여기서 R2 및 R3은 독립적으로 아미노기에 대해 정의된 바의 아미노 치환기이고, R1은 우레이도 치환기, 예컨대 수소, C1 -7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 수소 또는 C1 -7 알킬기임). 우레이도기의 예는 -NHCONH2, -NHCONHMe, -NHCONHEt, -NHCONMe2, -NHCONEt2, -NMeCONH2, -NMeCONHMe, -NMeCONHEt, -NMeCONMe2 및 -NMeCONEt2를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
구아니디노: -NH-C(=NH)NH2.
테트라졸일: 4개의 질소 원자 및 1개의 탄소 원자를 갖는 5원 방향족 고리.
Figure pct00007
이미노: =NR(여기서 R은 이미노 치환기, 예컨대 예컨대 수소, C1 -7 알킬기, C3-20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 H 또는 C1 -7 알킬기임). 이미노기의 예는 =NH, =NMe 및 =NEt를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
아미딘(아미디노): -C(=NR)NR2(여기서 각각의 R은 아미딘 치환기, 예컨대 수소, C1 -7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 H 또는 C1 -7 알킬기임). 아미딘기의 예는 -C(=NH)NH2, -C(=NH)NMe2 및 -C(=NMe)NMe2를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
니트로: -NO2.
니트로소: -NO.
아지도: -N3.
시아노(니트릴, 카르보니트릴): -CN.
이소시아노: -NC.
시아네이토: -OCN.
이소시아네이토: -NCO.
티오시아노(티오시아네이토): -SCN.
이소티오시아노(이소티오시아네이토): -NCS.
설프히드릴(티올, 머캅토): -SH.
티오에테르(설피드): -SR[여기서 R은 티오에테르 치환기, 예컨대 C1 -7 알킬기(C1 -7 알킬티오기로도 지칭됨), C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 C1 -7 알킬기임]. C1 -7 알킬티오기의 예는 -SCH3 및 -SCH2CH3을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
디설피드: -SS-R[여기서 R은 디설피드 치환기, 예컨대 C1 -7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 C1 -7 알킬기(본 명세서에서 C1 -7 알킬 디설피드로도 지칭됨)임]. C1 -7 알킬 디설피드기의 예는 -SSCH3 및 -SSCH2CH3을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
설핀(설피닐, 설폭시드): -S(=O)R(여기서 R은 설핀 치환기, 예컨대 C1 -7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 C1 -7 알킬기임). 설핀기의 예는 -S(=O)CH3 및 -S(=O)CH2CH3을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
설폰(설포닐): -S(=O)2R[여기서 R은 설폰 치환기, 예컨대 C1 -7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 C1 -7 알킬기(예컨대 플루오르화 또는 퍼플루오르화 C1 -7 알킬기 포함)임]. 설폰기의 예는 -S(=O)2CH3(메탄설포닐, 메실), -S(=O)2CF3(트리플일), -S(=O)2CH2CH3(에실), -S(=O)2C4F9(나노플일), -S(=O)2CH2CF3(트레실), -S(=O)2CH2CH2NH2(타우릴), -S(=O)2Ph(페닐설포닐, 베실), 4-메틸페닐설포닐(토실), 4-클로로페닐설포닐(클로실), 4-브로모페닐설포닐(브로실), 4-니트로페닐(노실), 2-나프탈렌설포네이트(납실) 및 5-디메틸아미노-나프탈렌-1-일설포네이트(단실)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
설핀산(설피노): -S(=O)OH, -SO2H.
설폰산(설포): -S(=O)2OH, -SO3H.
설피네이트(설핀산 에스테르): -S(=O)OR(여기서 R은 설피네이트 치환기, 예컨대 C1 -7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 C1 -7 알킬기임). 설피네이트기의 예는 -S(=O)OCH3(메톡시설피닐; 메틸 설피네이트) 및 -S(=O)OCH2CH3(에톡시설피닐; 에틸 설피네이트)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
설포네이트(설폰산 에스테르): -S(=O)2OR(여기서 R은 설포네이트 치환기, 예컨대 C1 -7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 C1 -7 알킬기임). 설포네이트기의 예는 -S(=O)2OCH3(메톡시설포닐; 메틸 설포네이트) 및 -S(=O)2OCH2CH3(에톡시설포닐; 에틸 설포네이트)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
설피닐옥시: -OS(=O)R(여기서 R은 설피닐옥시 치환기, 예컨대 C1 -7 알킬기, C3-20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 C1 -7 알킬기임). 설피닐옥시기의 예는 -OS(=O)CH3 및 -OS(=O)CH2CH3을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
설포닐옥시: -OS(=O)2R(여기서 R은 설포닐옥시 치환기, 예컨대 C1 -7 알킬기, C3-20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 C1 -7 알킬기임). 설포닐옥시기의 예는 -OS(=O)2CH3(메실레이트) 및 -OS(=O)2CH2CH3(에실레이트)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
설페이트: -OS(=O)2OR(여기서 R은 설페이트 치환기, 예컨대 C1 -7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 C1 -7 알킬기임). 설페이트기의 예는 -OS(=O)2OCH3 및 -SO(=O)2OCH2CH3을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
설파밀(설파모일; 설핀산 아미드; 설핀아미드): -S(=O)NR1R2(여기서 R1 및 R2는 독립적으로 아미노기에 대해 정의된 바의 아미노 치환기임). 설파밀기의 예는 -S(=O)NH2, -S(=O)NH(CH3), -S(=O)N(CH3)2, -S(=O)NH(CH2CH3), -S(=O)N(CH2CH3)2 및 -S(=O)NHPh를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
설폰아미도(설핀아모일; 설폰산 아미드; 설폰아미드): -S(=O)2NR1R2(여기서 R1 및 R2는 독립적으로 아미노기에 대해 정의된 바의 아미노 치환기임). 설폰아미도기의 예는 -S(=O)2NH2, -S(=O)2NH(CH3), -S(=O)2N(CH3)2, -S(=O)2NH(CH2CH3), -S(=O)2N(CH2CH3)2 및 -S(=O)2NHPh를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
설파미노: -NR1S(=O)2OH(여기서 R1은 아미노기에 대해 정의된 바의 아미노 치환기임). 설파미노기의 예는 -NHS(=O)2OH 및 -N(CH3)S(=O)2OH를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
설폰아미노: -NR1S(=O)2R(여기서 R1은 아미노기에 대해 정의된 바의 아미노 치환기이고, R은 설폰아미노 치환기, 예컨대 C1 -7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 C1 -7 알킬기임). 설폰아미노기의 예는 -NHS(=O)2CH3 및 -N(CH3)S(=O)2C6H5를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
설핀아미노: -NR1S(=O)R(여기서 R1은 아미노기에 대해 정의된 바의 아미노 치환기이고, R은 설핀아미노 치환기, 예컨대 C1 -7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5-20 아릴기, 바람직하게는 C1 -7 알킬기임). 설핀아미노기의 예는 -NHS(=O)CH3 및 -N(CH3)S(=O)C6H5를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
포스피노(포스핀): -PR2(여기서 R은 포스피노 치환기, 예컨대 -H, C1 -7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 -H, C1 -7 알킬기 또는 C5 -20 아릴기임). 포스피노기의 예는 -PH2, -P(CH3)2, -P(CH2CH3)2, -P(t-Bu)2 및 -P(Ph)2를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
포스포: -P(=O)2.
포스피닐(포스핀 옥시드): -P(=O)R2(여기서 R은 포스피닐 치환기, 예컨대 C1 -7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 C1 -7 알킬기 또는 C5 -20 아릴기임). 포스피닐기의 예는 -P(=O)(CH3)2, -P(=O)(CH2CH3)2, -P(=O)(t-Bu)2 및 -P(=O)(Ph)2를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
포스폰산(포스포노): -P(=O)(OH)2.
포스포네이트(포스포노 에스테르): -P(=O)(OR)2(여기서 R은 포스포네이트 치환기, 예컨대 -H, C1 -7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 -H, C1 -7 알킬기 또는 C5 -20 아릴기임). 포스포네이트기의 예는 -P(=O)(OCH3)2, -P(=O)(OCH2CH3)2, -P(=O)(O-t-Bu)2 및 -P(=O)(OPh)2를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
인산(포스포노옥시): -OP(=O)(OH)2.
포스페이트(포스포노옥시 에스테르): -OP(=O)(OR)2(여기서 R은 포스페이트 치환기, 예컨대 -H, C1 -7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 -H, C1 -7 알킬기 또는 C5 -20 아릴기임). 포스페이트기의 예는 -OP(=O)(OCH3)2, -OP(=O)(OCH2CH3)2, -OP(=O)(O-t-Bu)2 및 -OP(=O)(OPh)2를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
아인산: -OP(OH)2.
포스파이트: -OP(OR)2(여기서 R은 포스파이트 치환기, 예컨대 -H, C1 -7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 -H, C1 -7 알킬기 또는 C5 -20 아릴기임). 포스파이트기의 예는 -OP(OCH3)2, -OP(OCH2CH3)2, -OP(O-t-Bu)2 및 -OP(OPh)2를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
포스포르아미다이트: -OP(OR1)-NR2 2[여기서 R1 및 R2는 포스포르아미다이트 치환기, 예컨대 -H, (임의로 치환된) C1 -7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 -H, C1 -7 알킬기 또는 C5 -20 아릴기임]. 포스포르아미다이트기의 예는 -OP(OCH2CH3)-N(CH3)2, -OP(OCH2CH3)-N(i-Pr)2 및 -OP(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
포스포르아미데이트: -OP(=O)(OR1)-NR2 2[여기서 R1 및 R2는 포스포르아미데이트 치환기, 예컨대 -H, (임의로 치환된) C1 -7 알킬기, C3 -20 헤테로시클일기 또는 C5 -20 아릴기, 바람직하게는 -H, C1 -7 알킬기 또는 C5 -20 아릴기임]. 포스포르아미데이트기의 예는 -OP(=O)(OCH2CH3)-N(CH3)2, -OP(=O)(OCH2CH3)-N(i-Pr)2 및 -OP(=O)(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
알킬렌
C3 -12 알킬렌: 본 명세서에서 사용된 바의 용어 "C3 -12 알킬렌"은 지방족 또는 지환족일 수 있고 포화, 부분 불포화 또는 완전 불포화일 수 있는, 3 내지 12 개의 탄소 원자(달리 명시되지 않는 한)를 갖는 탄화수소 화합물의 2개의 수소 원자를 둘 다 동일한 탄소 원자로부터, 또는 2개의 상이한 탄소 원자 각각으로부터 제거하여 얻어진 두자리(bidentate) 부분에 관한 것이다. 따라서, 용어 "알킬렌"은 하기 논의되는 하위 부류인 알케닐렌, 알키닐렌, 시클로알킬렌 등을 포함한다.
직쇄형 포화 C3 -12 알킬렌기의 예는 -(CH2)n-(여기서 n은 3 내지 12의 정수임), 예컨대 -CH2CH2CH2-(프로필렌), -CH2CH2CH2CH2-(부틸렌), -CH2CH2CH2CH2CH2-(펜틸렌) 및 -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-(헵틸렌)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
분지쇄형 포화 C3 -12 알킬렌기의 예는 -CH(CH3)CH2-, -CH(CH3)CH2CH2-, -CH(CH3)CH2CH2CH2-, -CH2CH(CH3)CH2-, -CH2CH(CH3)CH2CH2-, -CH(CH2CH3)-, -CH(CH2CH3)CH2- 및 -CH2CH(CH2CH3)CH2-를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
직쇄형 부분 불포화 C3 -12 알킬렌기(C3 -12 알케닐렌 및 알키닐렌 기)의 예는 -CH=CH-CH2-, -CH2-CH=CH2-, -CH=CH-CH2-CH2-, -CH=CH-CH2-CH2-CH2-, -CH=CH-CH=CH-, -CH=CH-CH=CH-CH2-, -CH=CH-CH=CH-CH2-CH2-, -CH=CH-CH2-CH=CH-, -CH=CH-CH2-CH2-CH=CH- 및 -CH2-C≡C-CH2-를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
분지쇄형 부분 불포화 C3 -12 알킬렌기(C3 -12 알케닐렌 및 알키닐렌 기)의 예는 -C(CH3)=CH-, -C(CH3)=CH-CH2-, -CH=CH-CH(CH3) 및 -C≡C-CH(CH3)-을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
지환식 포화 C3 -12 알킬렌기(C3-12 시클로알킬렌)의 예는 시클로펜틸렌(예컨대 시클로펜트-1,3-일렌) 및 시클로헥실렌(예컨대 시클로헥스-1,4-일렌)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
지환식 부분 불포화 C3 -12 알킬렌기(C3-12 시클로알킬렌)의 예는 시클로펜테닐렌(예컨대 4-시클로펜텐-1,3-일렌), 시클로헥세닐렌(예컨대 2-시클로헥센-1,4-일렌; 3-시클로헥센-1,2-일렌; 2,5-시클로헥사디엔-1,4-일렌)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
산소 보호기: 용어 "산소 보호기"는 히드록시기를 차폐(mask)하는 부분을 지칭하고, 이들은 당업계에 잘 알려져 있다. 다수의 적절한 기는 본 명세서에서 참고로 인용하는 문헌(Greene, T.W. and Wuts, G.M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1999)의 23 내지 200 페이지에 기재되어 있다. 특별히 중요한 부류는 실릴 에테르(예컨대 TMS, TBDMS), 치환된 메틸 에테르(예컨대 THP) 및 에스테르(예컨대 아세테이트)를 포함한다.
카르바메이트 질소 보호기: 용어 "카르바메이트 질소 보호기"는 이민 결합 내 질소를 차폐하는 부분에 관한 것이며, 이는 당업계에 잘 알려져 있다. 이 기는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00008
여기서 R'10은 상기 정의된 바의 R이다. 다수의 적절한 기는 본 명세서에서 참고로 인용하는 문헌(Greene, T.W. and Wuts, G.M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1999)의 503 내지 549 페이지에 기재되어 있다.
헤미아민 질소 보호기: 용어 "헤미아민 질소 보호기"는 하기 구조를 갖는 기에 관한 것이다:
Figure pct00009
여기서 R'10은 상기 정의된 바의 R이다. 다수의 적절한 기는 본 명세서에서 참고로 인용하는 문헌(Greene, T.W. and Wuts, G.M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1999)의 633 내지 647 페이지에 아미드 보호기로서 기재되어 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 링커 단위를 통해 리간드 단위에 연결된 PBD 이량체를 포함하는 접합체를 제공한다. 하나의 구현예에서, 링커 단위는 신장 단위(Stretcher unit)(A), 특이성 단위(Specificity unit)(L1), 및 스페이서 단위(Spacer unit)(L2)를 포함한다. 링커 단위는 일 말단에서 리간드 단위에 연결되고 다른 말단에서 PBD 이량체 화합물에 연결된다.
하나의 양태에서, 이러한 접합체는 하기 화학식 Ia로 나타낸다:
Figure pct00010
상기 식에서,
L은 리간드 단위이고;
-A1 a-L1 s-L2 y-는 링커 단위(LU)이며,
여기에서,
-A1-은 신장 단위이고,
a는 1 또는 2이며,
L1-은 특이성 단위이고,
s는 1 내지 12 범위의 정수이며,
-L2-는 스페이서 단위이고,
y는 0, 1 또는 2이며;
-D는 PBD 이량체이고;
p는 1 내지 20이다.
약물 탑재량은 리간드 단위(예컨대 항체) 당 약물 분자의 수인 p로 나타낸다. 약물 탑재량은 리간드 단위(예컨대 Ab 또는 mAb) 당 1 내지 20개 범위의 약물 단위(D)일 수 있다. 조성물에서, p는 조성물 중 접합체의 평균 약물 탑재량을 나타내며, p는 1 내지 20의 범위이다.
몇몇의 구현예에서, p는 리간드 단위 당 약 1개 내지 약 8개의 약물 단위이다. 몇몇의 구현예에서, p는 1이다. 몇몇의 구현예에서, p는 2이다. 몇몇의 구현예에서, p는 리간드 단위 당 약 2개 내지 약 8개의 약물 단위이다. 몇몇의 구현예에서, p는 리간드 단위 당 약 2개 내지 약 6개, 2개 내지 약 5개, 또는 2개 내지 약 4개의 약물 단위이다. 몇몇의 구현예에서, p는 리간드 단위 당 약 2개, 약 4개, 약 6개 또는 약 8개의 약물 단위이다.
접합 반응 유래의 조제물 중 리간드 단위 당 약물 단위의 평균 수는 질량 분석, ELISA 분석, 및 HPLC와 같은 통상적인 수단으로 특성화할 수 있다. p에 관한 접합체의 정량적 분포도 또한 결정할 수 있다. 몇몇의 경우에, 다른 약물 탑재량을 갖는 접합체로부터, p가 특정 값인 균질한 접합체의 분리, 정제 및 특성화는 역상 HPLC 또는 전기영동과 같은 수단으로 달성할 수 있다.
다른 양태에서, 이러한 접합체는 하기 화학식 Ib로 나타낸다:
Figure pct00011
또한 하기와 같이 도시됨:
Figure pct00012
상기 식에서,
L은 리간드 단위이고;
-A1 a-L1 s(L2 y)-는 링커 단위(LU)이며,
여기에서,
-A1-은 신장 단위 (L2)에 연결된 신장 단위이고,
a는 1 또는 2이며,
L1 -은 신장 단위 (L2)에 연결된 특이성 단위이고,
s는 0 내지 12 범위의 정수이며,
-L2-는 스페이서 단위이고,
y는 0, 1 또는 2이며;
-D는 PBD 이량체이고;
p는 1 내지 20이다.
선호하는 것
하기 선호하는 것들은 상기 기재된 바의 본 발명의 모든 양태에 적용될 수 있거나, 또는 단일의 양태에 관련될 수 있다. 선호하는 것들은 임의의 조합으로 함께 결합될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 접합체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00013
상기 식에서, L, A1, a, L1 , s, L2, D 및 p는 상기 기재된 바와 같다.
하나의 구현예에서, 리간드 단위 (L)은 표적 세포의 표면 상에서 표적 분자에 특이적으로 결합하는 세포 결합제(CBA)이다. 대표적인 화학식은 하기에 도시한다:
Figure pct00014
상기 식에서, 별표는 약물 단위 (D)에 대한 부착 지점을 나타내고, CBA는 세포 결합제이며, L1은 특이성 단위이고, A1은 세포 결합제에 L1을 연결하는 신장 단위이며, L2는 공유 결합이거나 자가-희생 기(self-immolative group)이거나 또는 -OC(=O)-와 함께 자가-희생 기를 형성하는 스페이서 단위이고, L2는 임의적이다.
또 다른 구현예에서, 리간드 단위 (L)은 표적 세포의 표면 상에서 표적 분자에 특이적으로 결합하는 세포 결합제(CBA)이다. 대표적인 화학식은 하기에 도시한다:
Figure pct00015
상기 식에서, 별표는 약물 단위 (D)에 대한 부착 지점을 나타내고, CBA는 세포 결합제이며, L1은 특이성 단위이고, A1은 세포 결합제에 L1을 연결하는 신장 단위이며, L2는 공유 결합이거나 자가-희생 기인 스페이서 단위이고, a는 1 또는 2이며, s는 0, 1 또는 2이고, y는 0 또는 1 또는 2이다.
상기 기재된 구현예에서, L1은 분열가능한 특이성 단위일 수 있고, 분열되는 경우, 자가-희생 기(들)이 존재할 때, 자가-희생 기(또는 자가-희생 기들) L2를 활성화하는 "기폭제(trigger)"로서 언급될 수 있다. 특이성 단위 L1이 분열되거나, 또는 L1 및 L2 사이의 결합이 분열되는 경우, 자가-희생 기가 약물 단위 (D)를 방출한다.
또 다른 구현예에서, 리간드 단위 (L)은 표적 세포의 표면 상에서 표적 분자에 특이적으로 결합하는 세포 결합제(CBA)이다. 대표적인 화학식은 하기에 도시한다:
Figure pct00016
상기 식에서, 별표는 약물 단위 (D)에 대한 부착 지점을 나타내고, CBA는 세포 결합제이며, L1은 L2에 연결된 특이성 단위이고, A1은 세포 결합제에 L2를 연결하는 신장 단위이며, L2는 자가-희생 기이고, a는 1 또는 2이며, s는 1 또는 2이고, y는 1 또는 2이다.
본 명세서에서 논의되는 다양한 구현예에서, L1 및 L2의 특성은 광범위하게 변화할 수 있다. 이들 기들은 접합체가 전달되는 부위에서의 조건에 의하여 일부 영향을 받을 수 있는 이들의 특성에 기초하여 선택한다. 특이성 단위 L1이 분열가능한 경우, L1의 구조 및/또는 서열은 표적 부위(예컨대 표적 세포)에 존재하는 효소의 작용으로 분열되도록 선택한다. pH 변화(예컨대 산 또는 염기 반응성), 온도 또는 빛 조사 하(예컨대 광반응성)에 분열가능한 L1 단위를 또한 사용할 수 있다. 환원 또는 산화 조건 하에 분열가능한 L1 단위를 또한 접합체에 사용할 수 있다.
몇몇의 구현예에서, L1은 하나의 아미노산 또는 아미노산의 연속 서열을 포함할 수 있다. 아미노산 서열은 효소에 대한 표적 기질일 수 있다.
하나의 구현예에서, L1은 효소의 작용으로 분열가능하다. 하나의 구현예에서, 효소는 에스터라제 또는 펩티다제이다. 예컨대, L1은 카텝신과 같은 리소좀 프로테아제에 의해 분열될 수 있다.
하나의 구현예에서, L2는 존재하고 -C(=O)O-와 함께 자가-희생 기 또는 자가-희생 기들을 형성한다. 몇몇의 구현예에서, -C(=O)O-는 또한 자가-희생 기이다.
하나의 구현예에서, L1이 효소의 작용으로 분열가능하고 L2가 존재하는 경우, 효소는 L1 및 L2 사이의 결합을 분열시키며, 이에 따라 자가-희생 기(들)가 약물 단위를 방출한다.
존재하는 경우, L1 및 L2는 하기로부터 선택되는 결합으로 연결될 수 있다:
-C(=O)NH-,
-C(=O)O-,
-NHC(=O)-,
-OC(=O)-,
-OC(=O)O-,
-NHC(=O)O-,
-OC(=O)NH-,
-NHC(=O)NH, 및
-O- (글리코시드 결합).
L2에 연결하는 L1의 아미노기는 아미노산의 N-말단이거나 또는 예컨대 라이신 아미노산 측쇄와 같은 아미노산 측쇄의 아미노기로부터 유래할 수 있다.
L2에 연결하는 L1의 카르복실기는 아미노산의 C-말단이거나 또는 예컨대 글루탐산 아미노산 측쇄와 같은 아미노산 측쇄의 카르복실기로부터 유래할 수 있다.
L2에 연결하는 L1의 히드록시기는 예컨대 세린 아미노산 측쇄와 같은 아미노산 측쇄의 히드록시기로부터 유래할 수 있다.
하나의 구현예에서, -C(=O)O- 및 L2는 함께 하기 기를 형성한다:
Figure pct00017
상기 식에서, 별표는 약물 단위에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 L1에 대한 부착 지점을 나타내며, Y는 -N(H)-, -O-, -C(=O)N(H)- 또는 -C(=O)O-이고, n은 0 내지　3이다. 페닐렌 고리는 임의로 본 명세서에 기재된 바의 1개, 2개 또는 3개의 치환기로 치환된다.
하나의 구현예에서, Y는 NH이다.
하나의 구현예에서, n은 0 또는 1이다. 바람직하게는, n은 0이다.
Y가 NH이고 n이 0인 경우, 자가-희생 기는 p-아미노벤질카르보닐 링커(PABC)로서 언급될 수 있다.
자가-희생 기는 하기 나타낸 라인(n=0의 경우)에 따라 진행되어 링커 내 원격 부위가 활성화되는 경우 약물 단위(즉, 비대칭 PBD)의 방출을 가능하게 할 것이다:
Figure pct00018
상기 식에서, 별표는 약물 단위에 대한 부착 지점을 나타내고, L*는 링커의 나머지 부분의 활성화된 형태이며, 방출된 약물 단위는 미도시되었다. 이들 기들은 약물로부터 활성화 부위를 분리시키는 장점을 갖는다.
또 다른 구현예에서, -C(=O)O- 및 L2는 함께 하기로부터 선택되는 기를 형성한다:
Figure pct00019
상기 식에서, 별표, 파선, Y 및 n은 상기 정의된 바와 같다. 각각의 페닐렌 고리는 임의로 본 명세서에 기재된 바의 1개, 2개 또는 3개의 치환기로 치환된다. 하나의 구현예에서, Y 치환기를 갖는 페닐렌 고리는 임의로 치환되고 Y 치환기를 갖지 않는 페닐렌 고리는 비치환된다.
또 다른 구현예에서, -C(=O)O- 및 L2는 함께 하기로부터 선택되는 기를 형성한다:
Figure pct00020
상기 식에서, 별표, 파선, Y 및 n은 상기 정의된 바와 같고, E는 O, S 또는 NR이며, D는 N, CH, 또는 CR이고, F는 N, CH, 또는 CR이다.
하나의 구현예에서, D는 N이다.
하나의 구현예에서, D는 CH이다.
하나의 구현예에서, E는 O 또는 S이다.
하나의 구현예에서, F는 CH이다.
바람직한 구현예에서, L1 및 L2 사이의 공유 결합은 카텝신 반응성(예컨대 분열가능한) 결합이다.
하나의 구현예에서, L1은 디펩티드이다. 디펩티드 내 아미노산은 천연 아미노산 및 비천연 아미노산의 임의의 조합일 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 디펩티드는 천연 아미노산을 포함한다. 링커가 카텝신 반응성 링커인 경우, 디펩티드는 카텝신-매개 분열의 작용 부위이다. 이때 디펩티드는 카텝신의 인지 부위이다.
하나의 구현예에서, 디펩티드 -NH-X1-X2-CO- 내 -X1-X2- 기는 하기로부터 선택된다:
-Phe-Lys-,
-Val-Ala-,
-Val-Lys-,
-Ala-Lys-,
-Val-Cit-,
-Phe-Cit-,
-Leu-Cit-,
-Ile-Cit-,
-Phe-Arg-, 및
-Trp-Cit-;
상기에서, Cit는 시트룰린이다. 이러한 디펩티드에서, -NH-는 X1의 아미노기이고, CO는 X2의 카르보닐기이다.
바람직하게는, 디펩티드 -NH-X1-X2-CO- 내 -X1-X2- 기는 하기로부터 선택된다:
-Phe-Lys-,
-Val-Ala-,
-Val-Lys-,
-Ala-Lys-, 및
-Val-Cit-.
가장 바람직하게는, 디펩티드 -NH-X1-X2-CO- 내 -X1-X2- 기는 -Phe-Lys-, Val-Cit 또는 -Val-Ala-이다.
중요한 다른 디펩티드 조합은 하기를 포함한다:
-Gly-Gly-,
-Pro-Pro-, 및
-Val-Glu-.
본 명세서에서 참고로 인용하는 문헌(Dubowchik et　al.)에 기재된 것들을 포함하여, 다른 디펩티드 조합을 사용할 수 있다.
하나의 구현예에서, 아미노산 측쇄는 적절한 경우 화학적으로 보호된다. 측쇄 보호기는 하기에서 논의되는 바와 같은 기일 수 있다. 보호된 아미노산 서열은 효소에 의해 분열 가능하다. 예컨대 Boc 측쇄-보호된 Lys 잔기를 포함하는 디펩티드 서열이 카텝신에 의해 분열 가능하다.
아미노산의 측쇄를 위한 보호기는 당업계에 잘 알려져 있으며 노바바이오켐 카달로그(Novabiochem Catalog)에 기재되어 있다. 추가적인 보호기 전략이 문헌(Protective groups in Organic Synthesis, Greene and Wuts)에 기술되어 있다.
반응성 측쇄 작용기를 갖는 아미노산을 위한 가능한 측쇄 보호기를 하기에 나타낸다:
Arg: Z, Mtr, Tos;
Asn: Trt, Xan;
Asp: Bzl, t-Bu;
Cys: Acm, Bzl, Bzl-OMe, Bzl-Me, Trt;
Glu: Bzl, t-Bu;
Gln: Trt, Xan;
His: Boc, Dnp, Tos, Trt;
Lys: Boc, Z-Cl, Fmoc, Z;
Ser: Bzl, TBDMS, TBDPS;
Thr: Bz;
Trp: Boc;
Tyr: Bzl, Z, Z-Br.
하나의 구현예에서, -X2-는 약물 단위에 간접적으로 연결된다. 이러한 구현예에서, 스페이서 단위 L2가 존재한다.
하나의 구현예에서, 디펩티드는 자가-희생 기(들)(스페이서 단위)와 조합하여 사용한다. 자가-희생 기(들)는 -X2-에 연결될 수 있다.
자가-희생 기가 존재하는 경우, -X2-는 자가-희생 기에 직접적으로 연결된다. 하나의 구현예에서, -X2-는 자가-희생 기의 Y 기에 연결된다. 바람직하게는 Y가 NH인 경우, -X2-CO- 기는 Y에 연결된다.
-X1-는 A1에 직접적으로 연결된다. 하나의 구현예에서, -X1-은 A1에 직접적으로 연결된다. 바람직하게는 NH-X1- 기(X1의 아미노 말단)는 A1에 연결된다. A1은 작용기 -CO-를 포함하여 -X1-과 함께 아미드 결합을 형성할 수 있다.
하나의 구현예에서, -OC(=O)-와 함께 L1 및 L2는 -X1-X2-PABC- 기를 포함한다. PABC 기는 약물 단위에 간접적으로 연결된다. 일례로, 자가-희생 기 및 디펩티드는 함께, 하기에 도시된, -Phe-Lys-PABC- 기를 형성한다:
Figure pct00021
상기 식에서, 별표는 약물 단위에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 L1의 나머지 부분에 대한 부착 지점 또는 A1에 대한 부착 지점을 나타낸다. 바람직하게는 파선은 A1에 대한 부착 지점을 나타낸다.
대안적으로, 자가-희생 기 및 디펩티드는 함께, 하기에 도시된, -Val-Ala-PABC- 기를 형성한다:
Figure pct00022
상기 식에서, 별표 및 파선은 상기에서 정의된 바와 같다.
또 다른 구현예에서, -OC(=O)-와 함께 L1 및 L2는 하기를 나타낸다:
Figure pct00023
또는
Figure pct00024
상기 식에서, 별표는 약물 단위에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 A1에 대한 부착 지점을 나타내며, Y는 공유 결합 또는 작용기이고, E는 분열에 민감하여 자가-희생 기를 활성화하는 기이다.
E는 예컨대 빛 또는 효소 작용에 의하여, 분열에 민감하도록 선택한다. E는 -NO2 또는 글루쿠론산(예컨대 β-글루쿠론산)일 수 있다. 전자는 니트로리덕타제의 작용에 민감할 수 있고, 후자는 β-글루쿠로니다제의 작용에 민감할 수 있다.
Y 기는 공유 결합일 수 있다.
Y 기는 하기로부터 선택되는 작용기일 수 있다:
-C(=O)-
-NH-
-O-
-C(=O)NH-,
-C(=O)O-,
-NHC(=O)-,
-OC(=O)-,
-OC(=O)O-,
-NHC(=O)O-,
-OC(=O)NH-,
-NHC(=O)NH-,
-NHC(=O)NH,
-C(=O)NHC(=O)-,
SO2, 및
-S-.
Y 기는 바람직하게는 -NH-, -CH2-, -O-, 및 -S-이다.
몇몇의 구현예에서, -OC(=O)-와 함께 L1 및 L2는 하기를 나타낸다:
Figure pct00025
또는
Figure pct00026
상기 식에서, 별표는 약물 단위에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 A에 대한 부착 지점을 나타내며, Y는 공유 결합 또는 작용기이고, E는 글루쿠론산(예컨대 β-글루쿠론산)이다. Y는 바람직하게는 -NH-로부터 선택되는 작용기이다.
몇몇의 구현예에서, L1 및 L2는 함께 하기를 나타낸다:
Figure pct00027
또는
Figure pct00028
상기 식에서, 별표는 L2의 나머지 또는 약물 단위에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 A1에 대한 부착 지점을 나타내며, Y는 공유 결합 또는 작용기이고, E는 글루쿠론산(예컨대 β-글루쿠론산)이다. Y는 바람직하게는 -NH-, -CH2-, -O-, 및 -S-로부터 선택되는 작용기이다.
몇몇의 추가의 구현예에서, Y는 상기에서 설명한 바와 같은 작용기이고, 상기 작용기는 아미노산에 연결되며, 상기 아미노산은 신장 단위 A1에 연결된다. 몇몇의 구현예에서, 아미노산은 β-알라닌이다. 이러한 구현예에서, 아미노산은 신장 단위의 일부로 동등하게 여겨진다.
특이성 단위 L1 및 리간드 단위는 신장 단위를 통해 간접적으로 연결된다.
L1 및 A1은 하기로부터 선택되는 결합으로 연결될 수 있다:
-C(=O)NH-,
-C(=O)O-,
-NHC(=O)-,
-OC(=O)-,
-OC(=O)O-,
-NHC(=O)O-,
-OC(=O)NH-, 및
-NHC(=O)NH-.
하나의 구현예에서, A1 기는 하기이다:
Figure pct00029
상기 식에서, 별표는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 내지 6이다. 하나의 구현예에서, n은 5이다.
하나의 구현예에서, A1 기는 하기이다:
Figure pct00030
상기 식에서, 별표는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 내지 6이다. 하나의 구현예에서, n은 5이다.
하나의 구현예에서, A1 기는 하기이다:
Figure pct00031
상기 식에서, 별표는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이다. 바람직한 구현예에서, n은 1이고 m은 0 내지 10, 1 내지 8, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는　8이다.
하나의 구현예에서, A1 기는 하기이다:
Figure pct00032
상기 식에서, 별표는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이다. 바람직한 구현예에서, n은 1이고 m은 0 내지 10, 1 내지 8, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는　8이다.
하나의 구현예에서, A1 기는 하기이다:
Figure pct00033
상기 식에서, 별표는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 내지 6이다. 바람직한 구현예에서, n은 5이다.
하나의 구현예에서, A1 기는 하기이다:
Figure pct00034
상기 식에서, 별표는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 내지 6이다. 바람직한 구현예에서, n은 5이다.
하나의 구현예에서, A1 기는 하기이다:
Figure pct00035
상기 식에서, 별표는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이다. 바람직한 구현예에서, n은 1이고 m은 0 내지 10, 1 내지 8, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는　8이다.
하나의 구현예에서, A1 기는 하기이다:
Figure pct00036
상기 식에서, 별표는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이다. 바람직한 구현예에서, n은 1이고 m은 0 내지 10, 1 내지 8, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는　8이다.
하나의 구현예에서, 리간드 단위 및 A1 사이의 연결은 리간드 단위의 티올 잔기 및 A1의 말레이미드 기를 통한다.
하나의 구현예에서, 리간드 단위 및 A1 사이의 연결은 하기와 같다:
Figure pct00037
상기 식에서, 별표는 A1, L1, L2 또는 D의 나머지 부분에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위의 나머지 부분에 대한 부착 지점을 나타낸다. 이러한 구현예에서, S 원자는 전형적으로 리간드 단위로부터 유래한다.
상기 각각의 구현예에서, 대안적인 작용기가 하기에 나타낸 말레이미드-유래 기 대신에 사용될 수 있다:
Figure pct00038
상기 식에서, 파선은 이전과 같이 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내고, 별표는 A1 기의 나머지 부분, 또는 L1, L2 또는 D에 대한 결합을 나타낸다.
하나의 구현예에서, 말레이미드-유래 기는 하기 기로 대체된다:
Figure pct00039
상기 식에서, 파선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내고, 별표는 A1 기의 나머지 부분, 또는 L1, L2 또는 D에 대한 결합을 나타낸다.
하나의 구현예에서, 말레이미드-유래 기는, 임의로 리간드 단위(예컨대 세포 결합제)와 함께, 하기로부터 선택되는 기로 대체된다:
-C(=O)NH-,
-C(=O)O-,
-NHC(=O)-,
-OC(=O)-,
-OC(=O)O-,
-NHC(=O)O-,
-OC(=O)NH-,
-NHC(=O)NH-,
-NHC(=O)NH,
-C(=O)NHC(=O)-,
-S-,
-S-S-,
-CH2C(=O)-
-C(=O)CH2-,
=N-NH-, 및
-NH-N=.
하나의 구현예에서, 말레이미드-유래 기는, 임의로 리간드 단위와 함께, 하기로부터 선택되는 기로 대체된다:
Figure pct00040
상기 식에서, 파선은 리간드 단위에 대한 부착 지점 또는 A1 기의 나머지 부분에 대한 결합을 나타내고, 별표는 리간드 단위에 대한 다른 부착 지점 또는 A1 기의 나머지 부분에 대한 결합을 나타낸다.
세포 결합제에 L1을 연결하기 위한 적절한 다른 기는 WO　2005/082023에 기재되어 있다.
하나의 구현예에서, 신장 단위 A1은 존재하고, 특이성 단위 L1은 존재하며 스페이서 단위 L2는 존재하지 않는다. 따라서, L1 및 약물 단위가 결합을 통해 간접적으로 연결된다. 동등하게 이러한 구현예에서, L2는 결합이다.
L1 및 D는 하기로부터 선택되는 결합으로 연결될 수 있다:
-C(=O)NH-,
-C(=O)O-,
-NHC(=O)-,
-OC(=O)-,
-OC(=O)O-,
-NHC(=O)O-,
-OC(=O)NH-, 및
-NHC(=O)NH-.
하나의 구현예에서, L1 및 D는 바람직하게는 하기로부터 선택되는 결합으로 연결된다:
-C(=O)NH-, 및
-NHC(=O)-.
하나의 구현예에서, L1은 디펩티드를 포함하고 디펩티드의 일 말단은 D에 결합된다. 상기에서 기재한 바와 같이, 디펩티드 내 아미노산은 천연 아미노산 및 비천연 아미노산의 임의의 조합일 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 디펩티드는 천연 아미노산을 포함한다. 링커가 카텝신 반응성 링커인 경우, 디펩티드는 카텝신-매개 분열을 위한 작용 부위이다. 이때 디펩티드는 카텝신을 위한 인지 부위이다.
하나의 구현예에서, 디펩티드 -NH-X1-X2-CO- 내 -X1-X2- 기는 하기로부터 선택된다:
-Phe-Lys-,
-Val-Ala-,
-Val-Lys-,
-Ala-Lys-,
-Val-Cit-,
-Phe-Cit-,
-Leu-Cit-,
-Ile-Cit-,
-Phe-Arg-, 및
-Trp-Cit-;
상기에서, Cit는 시트룰린이다. 이러한 디펩티드에서, -NH-는 X1의 아미노기이고, CO는 X2의 카르보닐기이다.
바람직하게는, 디펩티드 -NH-X1-X2-CO- 내 -X1-X2- 기는 하기로부터 선택된다:
-Phe-Lys-,
-Val-Ala-,
-Val-Lys-,
-Ala-Lys-, 및
-Val-Cit-.
가장 바람직하게는, 디펩티드 -NH-X1-X2-CO- 내 -X1-X2- 기는 -Phe-Lys- 또는 -Val-Ala-이다.
중요한 다른 디펩티드 조합은 하기를 포함한다:
-Gly-Gly-,
-Pro-Pro-, 및
-Val-Glu-.
다른 디펩티드 조합은 상기 기재된 것들을 포함하여 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, L1-D는 하기이다:
Figure pct00041
상기 식에서, -NH-X1-X2-CO는 디펩티드이고, -NH-는 약물 단위의 일부이며, 별표는 약물 단위의 나머지에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 L1의 나머지 부분에 대한 부착 지점 또는 A1에 대한 부착 지점을 나타낸다. 바람직하게는 파선은 A1에 대한 부착 지점을 나타낸다.
하나의 구현예에서, 디펩티드는 발린-알라닌이고 L1-D는 하기이다:
Figure pct00042
상기 식에서, 별표, -NH- 및 파선은 상기에서 정의한 바와 같다.
하나의 구현예에서, 디펩티드는 페닐알라닌-리신이고 L1-D는 하기이다:
Figure pct00043
상기 식에서, 별표, -NH- 및 파선은 상기에서 정의한 바와 같다.
하나의 구현예에서, 디펩티드는 발린-시트룰린이다.
하나의 구현예에서, A1-L1 기는 하기이다:
Figure pct00044
상기 식에서, 별표는 L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 내지 6이다. 하나의 구현예에서, n은 5이다.
하나의 구현예에서, A1-L1 기는 하기이다:
Figure pct00045
상기 식에서, 별표는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 내지 6이다. 하나의 구현예에서, n은 5이다.
하나의 구현예에서, A1-L1 기는 하기이다:
Figure pct00046
상기 식에서, 별표는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이다. 바람직한 구현예에서, n은 1이고 m은 0 내지 10, 1 내지 8, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는　8이다.
하나의 구현예에서, A1-L1 기는 하기이다:
Figure pct00047
상기 식에서, 별표는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이다. 바람직한 구현예에서, n은 1이고 m은 0 내지 10, 1 내지 7, 바람직하게는 3 내지 7, 가장 바람직하게는 3 또는　7이다.
하나의 구현예에서, A1-L1 기는 하기이다:
Figure pct00048
상기 식에서, 별표는 L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 내지 6이다. 하나의 구현예에서, n은 5이다.
하나의 구현예에서, A1-L1 기는 하기이다:
Figure pct00049
상기 식에서, 별표는 L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 내지 6이다. 하나의 구현예에서, n은 5이다.
하나의 구현예에서, A1-L1 기는 하기이다:
Figure pct00050
상기 식에서, 별표는 L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이다. 바람직한 구현예에서, n은 1이고 m은 0 내지 10, 1 내지 8, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는　8이다.
하나의 구현예에서, A1-L1 기는 하기이다:
Figure pct00051
상기 식에서, 별표는 L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이다. 바람직한 구현예에서, n은 1이고 m은 0 내지 10, 1 내지 8, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는　8이다.
하나의 구현예에서, L- A1-L1 기는 하기이다:
Figure pct00052
상기 식에서, 별표는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, S는 리간드 단위의 황 기이며, 파선은 리간드 단위의 나머지에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 내지 6이다. 하나의 구현예에서, n은 5이다.
하나의 구현예에서, L-A1-L1 기는 하기이다:
Figure pct00053
상기 식에서, 별표는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, S는 리간드 단위의 황 기이며, 파선은 리간드 단위의 나머지에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 내지 6이다. 하나의 구현예에서, n은 5이다.
하나의 구현예에서, L-A1-L1 기는 하기이다:
Figure pct00054
상기 식에서, 별표는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, S는 리간드 단위의 황 기이며, 파선은 리간드 단위의 나머지에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이다. 바람직한 구현예에서, n은 1이고 m은 0 내지 10, 1 내지 8, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는　8이다.
하나의 구현예에서, L- A1-L1 기는 하기이다:
Figure pct00055
상기 식에서, 별표는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이다. 바람직한 구현예에서, n은 1이고 m은 0 내지 10, 1 내지 7, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는　8이다.
하나의 구현예에서, L- A1-L1 기는 하기이다:
Figure pct00056
상기 식에서, 별표는 L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위의 나머지에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 내지 6이다. 하나의 구현예에서, n은 5이다.
하나의 구현예에서, L-A1-L1 기는 하기이다:
Figure pct00057
상기 식에서, 별표는 L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위의 나머지에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 내지 6이다. 하나의 구현예에서, n은 5이다.
하나의 구현예에서, L-A1-L1 기는 하기이다:
Figure pct00058
상기 식에서, 별표는 L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위의 나머지에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이다. 바람직한 구현예에서, n은 1이고 m은 0 내지 10, 1 내지 8, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는　8이다.
하나의 구현예에서, L- A1-L1 기는 하기이다:
Figure pct00059
상기 식에서, 별표는 L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위의 나머지에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이다. 바람직한 구현예에서, n은 1이고 m은 0 내지 10, 1 내지 8, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는　8이다.
하나의 구현예에서, 신장 단위는 하기 화학식을 갖는 아세트아미드 단위이다:
Figure pct00060
상기 식에서, 별표는 신장 단위, L1 또는 D의 나머지에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타낸다.
다른 구현예에서, 링커-약물 화합물은 리간드 단위에 대한 접합을 위하여 제공된다. 하나의 구현예에서, 링커-약물 화합물은 세포 결합제에 대한 연결을 위하여 설계된다.
하나의 구현예에서, 약물 링커 화합물은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00061
상기 식에서, 별표는 약물 단위에 대한 부착 지점을 나타내고, G1은 리간드 단위에 대한 결합을 형성하기 위한 신장 단위 (A1)이며, L1은 특이성 단위이고, L2(스페이서 단위)는 공유 결합이거나 -OC(=O)-와 함께 자가-희생 기(들)를 형성한다.
또 다른 구현예에서, 약물 링커 화합물은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00062
상기 식에서, 별표는 약물 단위에 대한 부착 지점을 나타내고, G1은 리간드 단위에 대한 결합을 형성하기 위한 신장 단위 (A1)이며, L1은 특이성 단위이고, L2(스페이서 단위)는 공유 결합이거나 자가-희생 기(들)이다.
또 다른 구현예에서, 약물 링커 화합물은 하기 화학식을 갖는다:
L1 및 L2는 상기에서 정의한 바와 같다. A1에 대한 연결에 관한 언급은 본 명세서에서 G1에 대한 연결을 언급하는 것과 같이 해석될 수 있다.
하나의 구현예에서, L1이 아미노산을 포함하는 경우, 그 아미노산의 측쇄는 보호될 수 있다. 임의의 적절한 보호기가 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 측쇄 보호기는, 존재하는 경우, 화합물 내의 다른 보호기로 제거 가능하다. 다른 구현예에서, 보호기는 존재하는 경우, 분자 내의 다른 보호기에 대해 직각일 수 있다.
아미노산 측쇄를 위한 적절한 보호기는 노바바이오켐 카달로그 2006/2007에 기재된 기들을 포함한다. 카텝신 반응성 링커에 사용하기 위한 보호기는 또한 문헌(Dubowchik et al)에 논의되어 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, L1 기는 Lys 아미노산 잔기를 포함한다. 이러한 아미노산의 측쇄는 Boc 또는 Alloc 보호기로 보호될 수 있다. Boc 보호기가 가장 바람직하다.
G1 작용기는 리간드 단위(예컨대 세포 결합제)와 반응하여 연결기를 형성한다.
하나의 구현예에서, G1 작용기는 리간드 단위 상에서 적절한 기와 반응하기 위한 아미노, 카르복실산, 히드록시, 티올, 또는 말레이미드 기이거나 또는 이를 포함한다. 바람직한 구현예에서, G1은 말레이미드 기를 포함한다.
하나의 구현예에서, G1 기는 알킬 말레이미드 기이다. 이러한 기는, 세포 결합제에 존재하는, 예컨대 항체에 존재하는, 티올 기, 특히 시스테인 티올 기와 반응하기에 적합하다.
하나의 구현예에서, G1 기는 하기이다:
Figure pct00063
상기 식에서, 별표는 L1, L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, n은 0 내지 6이다. 하나의 구현예에서, n은 5이다.
하나의 구현예에서, G1 기는 하기이다:
Figure pct00064
상기 식에서, 별표는 L1, L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, n은 0 내지 6이다. 하나의 구현예에서, n은 5이다.
하나의 구현예에서, G1 기는 하기이다:
Figure pct00065
상기 식에서, 별표는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지　30이다. 바람직한 구현예에서, n은 1이고 m은 0 내지 10, 1 내지 2, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는　8이다.
하나의 구현예에서, G1 기는 하기이다:
Figure pct00066
상기 식에서, 별표는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지　30이다. 바람직한 구현예에서, n은 1이고 m은 0 내지 10, 1 내지 8, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는　8이다.
하나의 구현예에서, G1 기는 하기이다:
Figure pct00067
상기 식에서, 별표는 L1, L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, n은 0 내지 6이다. 하나의 구현예에서, n은 5이다.
하나의 구현예에서, G1 기는 하기이다:
Figure pct00068
상기 식에서, 별표는 L1, L2 또는 D에 대한 부착 지점을 나타내고, n은 0 내지 6이다. 하나의 구현예에서, n은 5이다.
하나의 구현예에서, G1 기는 하기이다:
Figure pct00069
상기 식에서, 별표는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지　30이다. 바람직한 구현예에서, n은 1이고 m은 0 내지 10, 1 내지 2, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는　8이다.
하나의 구현예에서, G1 기는 하기이다:
Figure pct00070
상기 식에서, 별표는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지　30이다. 바람직한 구현예에서, n은 1이고 m은 0 내지 10, 1 내지 8, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는　8이다.
상기 각각의 구현예에서, 대안적인 작용기가 하기에 나타낸 말레이미드 기 대신에 사용될 수 있다:
Figure pct00071
상기 식에서, 별표는 G 기의 나머지 부분에 대한 결합을 나타낸다.
하나의 구현예에서, 말레이미드-유래 기는 하기 기로 대체된다:
Figure pct00072
상기 식에서, 별표는 G 기의 나머지 부분에 대한 결합을 나타낸다.
하나의 구현예에서, 말레이미드 기는 하기로부터 선택되는 기로 대체된다:
-C(=O)OH,
-OH,
-NH2,
-SH,
-C(=O)CH-2X, 여기에서 X는 Cl, Br 또는 I임,
-CHO,
-NHNH2
-C=CH, 및
-N3 (azide).
하나의 구현예에서, L1은 존재하고, G1은 -NH2, -NHMe, -COOH, -OH 또는 -SH이다.
하나의 구현예에서, L1은 존재하고, G1은 -NH2 또는 -NHMe이다. 어느 하나의 기가 L1 아미노산 서열의 N-말단일 수 있다.
하나의 구현예에서, L1은 존재하고, G1은 -NH2이며, L1은 상기에서 정의한 바와 같은 아미노산 서열 -X1-X2-이다.
하나의 구현예에서, L1은 존재하고, G1은 COOH이다. 이러한 기는 L1 아미노산 서열의 C-말단일 수 있다.
하나의 구현예에서, L1은 존재하고, G1은 OH이다.
하나의 구현예에서, L1은 존재하고, G1은 SH이다.
G1 기는 하나의 작용기로부터 다른 작용기로 전환 가능할 수 있다. 하나의 구현예에서, L1은 존재하고, G1은 -NH2이다. 이러한 기는 말레이미드 기를 포함하는 또 다른 G1 기로 전환 가능하다. 예컨대 -NH2 기는 산, 또는 상기에 나타낸 말레이미드를 포함하는 G1 기의 활성화된 산(예컨대 N-숙신이미드 형태)과 반응할 수 있다.
G1 기는 그러므로 리간드 단위와 반응하기에 더욱 적합한 작용기로 전환될 수 있다.
상기에서 언급한 바와 같이, 하나의 구현예에서, L1은 존재하고, G1은 -NH2, -NHMe, -COOH, -OH 또는 -SH이다. 추가의 구현예에서, 이들 기는 화학적으로 보호된 형태로 제공된다. 화학적으로 보호된 형태는 그러므로 작용기를 제공받는 링커에 대한 전구체이다.
하나의 구현예에서, G1은 화학적으로 보호된 형태의 -NH2이다. 상기 기는 카르바메이트 보호기로 보호될 수 있다. 카르바메이트 보호기는 하기로 이루어진 기로부터 선택될 수 있다:
Alloc, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Cbz 및 PNZ.
바람직하게는 G1이 -NH2인 경우, Alloc 또는 Fmoc 기로 보호된다.
하나의 구현예에서, G1이 -NH2인 경우, Fmoc 기로 보호된다.
하나의 구현예에서, 상기 보호기는 캡핑기(capping group)의 카르바메이트 보호기와 동일하다.
하나의 구현예에서, 상기 보호기는 캡핑기의 카르바메이트 보호기와 동일하지 않다. 이러한 구현예에서, 상기 보호기는 캡핑기의 카르바메이트 보호기를 제거하지 않는 조건 하에서 제거 가능한 것이 바람직하다.
화학적 보호기는 리간드 단위에 대한 연결을 형성하기 위한 작용기를 제공하기 위하여 제거될 수 있다. 임의로, 이러한 작용기는 그 다음 상기에 기재된 바와 같은 또 다른 작용기로 전환될 수 있다.
하나의 구현예에서, 활성기는 아민이다. 이러한 아민은 바람직하게는 펩티드의 N-말단 아민이고, 본 발명의 바람직한 디펩티드의 N-말단 아민일 수 있다.
활성기는 리간드 단위에 대한 연결을 형성하도록 의도되는 작용기를 산출하기 위하여 반응할 수 있다.
다른 구현예에서, 링커 단위는 활성기를 갖는 링커 단위의 전구체이다. 이러한 구현예에서, 링커 단위는 보호기를 통해 보호되는 활성기를 포함한다. 상기 보호기는 활성기를 갖는 링커 단위를 제공하도록 제거될 수 있다.
활성기가 아민인 경우, 보호기는 문헌(Green and Wuts)에 기재된 것들과 같은 아민 보호기일 수 있다.
보호기는 바람직하게는, 존재하는 경우, 링커 단위 내 다른 보호기에 대해 직각이다.
하나의 구현예에서, 보호기는 캡핑기에 대해 직각이다. 따라서, 활성기 보호기는 캡핑기를 유지하면서 제거 가능하다. 다른 구현예에서, 보호기 및 캡핑기는 캡핑기를 제거하는데 사용되는 것과 동일한 조건 하에서 제거 가능하다.
하나의 구현예에서, 링커 단위는 하기이다:
Figure pct00073
상기 식에서, 별표는 약물 단위에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 적절한 경우 링커 단위의 나머지 부분에 대한 부착 지점 또는 G1에 대한 부착 지점을 나타낸다. 바람직하게는 파선은 G1에 대한 부착 지점을 나타낸다.
하나의 구현예에서, 링커 단위는 하기이다:
Figure pct00074
상기 식에서, 별표 및 파선은 상기에서 정의한 바와 같다.
L1 및 세포 결합제 사이의 연결을 형성하는데 사용하기에 적절한 다른 작용기는 WO　2005/082023에 기재되어 있다.
리간드 단위
리간드 단위는 임의의 종류일 수 있고, 표적 분자에 특이적으로 결합하는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 및 비-펩티드성 제제를 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 리간드 단위는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드일 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 리간드 단위는 시클릭 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 리간드 단위는 항체 또는 적어도 하나의 표적 분자-결합 부위를 포함하는 항체의 단편, 림포카인, 호르몬, 성장 인자, 또는 표적에 특이적으로 결합하는 임의의 다른 세포 결합 분자 또는 물질을 포함할 수 있다.
리간드 단위의 예는 본 명세서에서 인용하는 WO　2007/085930에 사용하기 위해 기재된 제제들을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 리간드 단위는 세포 상에서 세포 외 표적에 결합하는 세포 결합제이다. 이러한 세포 결합제는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 비-펩티드성 제제일 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 세포 결합제는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드일 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 세포 결합제는 시클릭 폴리펩티드일 수 있다. 세포 결합제는 또한 항체 또는 항체의 항원-결합 단편일 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명은 항체-약물 접합체(ADC)를 제공한다.
하나의 구현예에서, 항체는 단일클론 항체; 키메릭 항체; 인간화 항체; 완전한 인간 항체; 또는 단일 사슬 항체이다. 하나의 구현예에서, 항체는 생물학적 활성을 갖는 이들 항체들 중 하나의 단편이다. 이러한 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편을 포함한다.
항체는 디아바디(diabody), 도메인 항체(DAB) 또는 단일 사슬 항체일 수 있다.
하나의 구현예에서, 항체는 단일클론 항체이다.
본 발명에 사용하기 위한 항체는 본 명세서에서 인용하는 WO　2005/082023에 기재된 항체들을 포함한다. 특히 바람직하게는 종양-연관 항원을 위한 항체이다. 당업계에 알려진 이들 항원의 예는 WO　2005/082023에 기술된 종양-연관 항원을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, 페이지 41-55를 참고한다.
몇몇의 구현예에서, 접합체는 세포 표면 항원을 통해 표적 종양 세포에 대해 설계된다. 항원은 비정상적인 시간 또는 세포 타입에서 과다 발현되거나 또는 발현되는 세포 표면 항원일 수 있다. 바람직하게는 표적 항원은 증식성 세포(바람직하게는 종양 세포) 상에서만 발현되나; 이는 실제로 드물게 관찰된다. 결과적으로, 표적 항원은 일반적으로 증식성 조직 및 건강한 조직 간의 상이한 발현에 기초하여 선택된다.
항체는 하기를 포함하는 표적 특이 종양 관련 항원에 대해 야기된다:
Cripto, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, 당단백질 NMB, CanAg, Her2(ErbB2/Neu), CD56 (NCAM), CD70, CD79, CD138, PSCA, PSMA(전립선 특이 막 항원), BCMA, E-셀렉틴, EphB2, 멜라노트랜스페린, Muc16 및 TMEFF2.
리간드 단위는 링커 단위에 연결된다. 하나의 구현예에서, 리간드 단위는 존재하는 경우 링커 단위의 A에 연결된다.
하나의 구현예에서, 리간드 단위 및 링커 단위 사이의 연결은 티오에테르 결합을 통한다.
하나의 구현예에서, 리간드 단위 및 링커 단위 사이의 연결은 디설파이드 결합을 통한다.
하나의 구현예에서, 리간드 단위 및 링커 단위 사이의 연결은 아미드 결합을 통한다.
하나의 구현예에서, 리간드 단위 및 링커 단위 사이의 연결은 에스테르 결합을 통한다.
하나의 구현예에서, 리간드 단위 및 링커 사이의 연결은 리간드 단위의 시스테인 잔기의 티올 기와 링커 단위의 말레이미드 기 사이에 형성된다.
리간드 단위의 시스테인 잔기는 연결을 형성하기 위한 링커 단위의 작용기와의 반응에 이용가능할 수 있다. 다른 구현예에서, 예컨대 리간드 단위가 항체인 경우, 항체의 티올 기는 사슬간 디설파이드 결합에 관여할 수 있다. 이들 사슬간 결합은 링커 단위의 작용기와의 반응에 앞서 예컨대 항체를 DTT로 처리함으로써 유리 티올 기로 전환될 수 있다.
몇몇의 구현예에서, 시스테인 잔기는 항체의 중쇄 또는 경쇄 내로 도입된다. 항체 중쇄 또는 경쇄 내 치환에 의한 시스테인 삽입의 위치는 본 명세서에서 인용하는 미국공개특허 제2007-0092940호 및 국제특허공개 WO2008070593에 기술되어 있는 것들을 포함한다.
치료 방법
본 발명의 접합체는 요법 방법에 사용될 수 있다. 화학식 I의 접합체의 치료 유효량을 치료가 필요한 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법도 제공된다. 용어 "치료 유효량"은 환자에게 이익을 나타나게 하기에 충분한 양이다. 이러한 이익은 적어도 1 이상의 증상의 개량일 수 있다. 접합체의 실제 투여량 및 투여의 속도 및 시간 경과에 따른 과정(time-course)은 치료되는 질병의 상태 및 심각도에 따라 달라진다. 치료의 처방, 예컨대 용량에 대한 결정은 일반 개원 의사 및 다른 의사의 책임 범위 내에 있다.
몇몇의 구현예에서, 접합체의 투여량은 단위 투약 당 약 0.01 내지 약 10 mg/kg의 범위이다. 몇몇의 구현예에서, 접합체의 투여량은 단위 투약 당 약 0.01 내지 약 5 mg/kg의 범위이다. 몇몇의 구현예에서, 접합체의 투여량은 단위 투약 당 약 0.05 내지 약 5 mg/kg의 범위이다. 몇몇의 구현예에서, 접합체의 투여량은 단위 투약 당 약 0.1 내지 약 5 mg/kg의 범위이다. 몇몇의 구현예에서, 접합체의 투여량은 단위 투약 당 약 0.1 내지 약 4 mg/kg의 범위이다. 몇몇의 구현예에서, 접합체의 투여량은 단위 투약 당 약 0.05 내지 약 3 mg/kg의 범위이다. 몇몇의 구현예에서, 접합체의 투여량은 단위 투약 당 약 0.1 내지 약 3 mg/kg의 범위이다. 몇몇의 구현예에서, 접합체의 투여량은 단위 투약 당 약 0.1 내지 약 2 mg/kg의 범위이다. 몇몇의 구현예에서, 접합체의 투여량은 단위 투약 당 약 0.01 내지 약 1 mg/kg의 범위이다.
접합체는 치료되는 병태에 따라 단독으로, 또는 동시에 또는 순차적으로 다른 치료와 조합하여 투여될 수 있다. 치료 및 요법의 예는 화학 요법(예컨대 약물; 수술; 및 방사선 요법을 비롯한 활성 제제의 투여)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따르며, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물은 활성 성분, 즉 화학식 I의 접합체 외에 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 당업자에게 잘 알려진 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 비독성이어야 하며, 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 경구 또는 주사, 예컨대 피부, 피하 또는 정맥내 주사에 의할 수 있는 투여 경로에 따라 달라진다.
경구 투여용 약학적 조성물은 정제, 캡슐, 분말 또는 액체 형태일 수 있다. 정제는 고상 담체 또는 보조제를 포함할 수 있다. 액상 약학적 조성물은 일반적으로 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 광유 또는 합성 오일과 같은 액상 담체를 포함한다. 생리 식염수 용액, 덱스트로오스 또는 다른 당류 용액 또는 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다. 캡슐은 젤라틴과 같은 고상 담체를 포함할 수 있다.
정맥내, 피부 또는 피하 주사 또는 병이 있는 부위에의 주사를 위해, 활성 성분은 무발열이고 적절한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구로 허용 가능한 수용액의 형태일 수 있다. 당업자는 예컨대 염화나트륨 주사액, 링거액, 락테이트 링거액과 같은 등장성 비히클을 사용하여 적절한 용액을 잘 제조할 수 있다. 보존제, 안정화제, 완충제, 산화 방지제 및/또는 다른 첨가제도 필요할 경우 포함될 수 있다.
다른 형태 포함
달리 명시하지 않는 한, 이들 치환기의 잘 알려진 이온, 염, 용매화물 및 보호된 형태가 상기에 포함된다. 예컨대, 카르복실산(-COOH)에 대한 지칭은 이의 음이온(카르복실레이트) 형태(-COO-), 염 또는 용매화물 뿐 아니라, 통상적인 보호된 형태도 포함한다. 유사하게, 아미노기에 대한 지칭은 아미노기의 양성자화된 형태(-N+HR1R2), 염 또는 용매화물, 예컨대 염산염 뿐 아니라 아미노기의 통상적인 보호된 형태를 포함한다. 유사하게, 히드록실기에 대한 지칭은 이의 음이온 형태(-O-), 염 또는 용매화물 뿐 아니라 통상적인 보호된 형태도 포함한다.
염
활성 화합물(접합체)의 대응하는 염, 예컨대 약학적으로 허용되는 염을 제조, 정제 및/또는 취급하는 것이 편리하거나 또는 바람직할 수 있다. 약학적으로 허용되는 염의 예는 문헌[Berge, et al., J. Pharm . Sci ., 66, 1-19 (1977)]에 논의되어 있다.
예컨대, 화합물이 음이온이거나 또는 음이온일 수 있는 작용기를 갖는 경우(예컨대 -COOH는 -COO-일 수 있음), 적절한 양이온으로 염을 형성할 수 있다. 적절한 무기 양이온의 예는 Na+ 및 K+과 같은 알칼리 금속 이온, Ca2 + 및 Mg2 +과 같은 알칼리 토금속 양이온, 및 Al+3과 같은 다른 양이온을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 적절한 유기 양이온의 예는 암모늄 이온(즉, NH4 +) 및 치환된 암모늄 이온(예컨대 NH3R+, NH2R2 +, NHR3 +, NR4 +)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 적절한 치환된 암모늄 이온의 예는 하기로부터 유도된 것들이다: 에틸아민, 디에틸아민, 디시클로헥실아민, 트리에틸아민, 부틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진, 벤질아민, 페닐벤질아민, 콜린, 메글루민 및 트로메타민 뿐 아니라, 아미노산, 예컨대 리신 및 아르기닌. 통상적인 4급 암모늄 이온의 예는 N(CH3)4 +이다.
접합체가 양이온이거나 또는 양이온일 수 있는 작용기를 갖는 경우(예컨대 -NH2는 -NH3 +일 수 있음), 적절한 음이온으로 염을 형성할 수 있다. 적절한 무기 음이온의 예는 하기 무기 산으로부터 유도된 것들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 아황산, 질산, 아질산, 인산 및 아인산.
적절한 유기 음이온의 예는 하기 유기산으로부터 유도된 것들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: 2-아세티옥시벤조산, 아세트산, 아스코르브산, 아스파르트산, 벤조산, 캠퍼설폰산, 신남산, 시트르산, 에데트산, 에탄디설폰산, 에탄설폰산, 푸마르산, 글루쳅톤산, 글루콘산, 글루탐산, 글리콜산, 히드록시말레산, 히드록시나프탈렌 카르복실산, 이세티온산, 락트산, 락토비온산, 라우르산, 말레산, 말산, 메탄설폰산, 점액산, 올레산, 옥살산, 팔미트산, 팜산, 판토텐산, 페닐아세트산, 페닐설폰산, 프로피온산, 피루브산, 살리실산, 스테아르산, 숙신산, 설파닐산, 타르타르산, 톨루엔설폰산 및 발레르산. 적절한 중합체 유기 음이온의 예는 하기 중합체 산으로부터 유도된 것들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: 타닌산, 카르복시메틸 셀룰로오스.
용매화물
접합체(들)의 대응하는 용매화물을 제조, 정제 및/또는 취급하는 것이 편리하거나 또는 바람직할 수 있다. 용어 "용매화물"은 본 명세서에서 용질(예컨대 활성 접합체, 활성 접합체의 염) 및 용매의 착체를 지칭하기 위해 통상적인 의미로 사용된다. 용매가 물인 경우, 용매화물을 편리하게 수화물, 예컨대 일수화물, 이수화물, 삼수화물 등으로 지칭할 수 있다.
카르비놀아민
본 발명은, 용매가 물 또는 알콜(RAOH, 여기서 RA는 C1-4 알킬임)인 경우 PBD 단량체에 대하여 하기에 도시된, PBD 부분의 이민 결합을 거쳐 용매가 첨가되는 접합체를 포함한다:
Figure pct00075
이들 형태는 PBD의 카르비놀아민 및 카르비놀아민 에테르 형태로 지칭할 수 있다. 이들 평형의 균형은 화합물이 발견되는 조건 뿐 아니라 이의 부분의 성질에 따라 달라진다.
이들 특정 화합물은 예컨대 동결 건조에 의해 고체 형태로 분리할 수 있다.
이성체
특정 화합물은 시스 및 트랜스 형태; E 및 Z 형태; c, t 및 r 형태; 엔도 및 엑소 형태; R, S 및 메소 형태; D 및 L 형태; d 및 l 형태; (+) 및 (-) 형태; 케토, 에놀 및 에놀레이트 형태; syn- 및 anti-형태; 양쪽 경사 및 반대 방향 경사 형태; α 및 β 형태; 축 및 적도선상(equatorial) 형태; 보트, 의자, 트위스트, 봉투 및 반의자 형태; 및 이의 조합[이하, 이들을 "이성체"(또는 "이성체 형태")로 총칭함]을 포함하나 이에 한정되지 않는 1 이상의 특별한 기하 이성체, 광학 이성체, 거울상 이성체, 부분 입체 이성체, 에피머, 아트로프(atropic), 입체 이성체, 호변 이성체, 입체(conformational) 또는 아노머 형태로 존재할 수 있다
하기에서 호변 이성체 형태에 대해 논의되는 것을 제외하고는, 본 명세서에서 사용된 바의 용어 "이성체"로부터 구조(또는 구성) 이성체(즉, 공간에서 원자의 위치에 의해서만이 아니라 원자 사이의 연결이 상이한 이성체)는 특히 배제된다. 예컨대, 메톡시기, -OCH3에 대한 지칭은 이의 구조 이성체인 히드록시메틸기, -CH2OH에 대한 지칭으로 이해되어서는 안 된다. 유사하게, 오르토-클로로페닐에 대한 지칭은 이의 구조 이성체인 메타-클로로페닐에 대한 지칭으로 이해되어서는 안 된다. 그러나, 구조의 부류에 대한 지칭은 부류 내에 들어가는 구조 이성체 형태를 완전히 포함할 수 있다(예컨대 C1 -7 알킬은 n-프로필 및 이소프로필을 포함하고; 부틸은 n-, 이소-, 세크- 및 터트-부틸을 포함하며; 메톡시페닐은 오르토-, 메타- 및 파라-메톡시페닐을 포함함).
상기 배제는 예컨대 하기 호변 이성체 쌍에서와 같은 호변 이성체 형태, 예컨대 케토, 에놀 및 에놀레이트 형태에 관한 것은 아니다: 케토/에놀(하기 도시됨), 이민/엔아민, 아미드/이미노 알콜, 아미딘/아미딘, 니트로소/옥심, 티오케톤/엔티올, N-니트로소/히드록시아조 및 니트로/아시-니트로(aci-nitro).
Figure pct00076
1 이상의 동위 원소 치환을 갖는 화합물이 용어 "이성체"에 특히 포함된다. 예컨대 H는 1H, 2H(D) 및 3H(T)를 비롯한 임의의 동위 원소 형태로 존재할 수 있고; C는 12C, 13C 및 14C를 비롯한 동위 원소 형태로 존재할 수 있으며; O는 16O 및 18O를 비롯한 임의의 동위 원소 형태로 존재할 수 있는 것 등이다.
달리 명시하지 않는 한, 특정 화합물 또는 접합체에 대한 지칭은 이의 (전부 또는 부분) 라세미 및 다른 혼합물을 비롯한 모든 이러한 이성체 형태를 포함한다. 이러한 이성체 형태의 제조(예컨대 비대칭 합성) 및 분리(예컨대 분별 결정 및 크로마토그래프 수단) 방법은 당업자에게 공지되어 있거나, 또는 공지된 방식으로 본 명세서에 교시된 방법 또는 공지된 방법을 채용하여 용이하게 얻어진다.
일반적인 합성 경로
PBD 이량체 화합물의 합성은 하기 참고 문헌에 광범위하게 논의되어 있으며, 이들 논의를 본 명세서에서 참고로 인용한다:
a) WO 00/12508(페이지 14 내지 30);
b) WO 2005/023814(페이지 3 내지 10);
c) WO 2004/043963(페이지 28 내지 29); 및
d) WO 2005/085251(페이지 30 내지 39).
합성 경로
본 발명의 접합체(식 중, R10 및 R11은 이들이 결합되는 질소 원자와 탄소 원자 사이에서 질소-탄소 이중 결합을 형성함)는 표준 방법에 의해 이민 결합을 탈보호함으로써 하기 화학식 2의 화합물로부터 합성할 수 있다:
화학식 2
Figure pct00077
상기 화학식에서, R2, R6, R7, R9, R6', R7', R9', R12, X, X' 및 R"는 화학식 Ⅱ의 화합물에 대해 정의된 바와 같고, ProtN은 합성을 위한 질소 보호기이며, ProtO는 합성을 위한 보호된 산소기 또는 옥소기이다.
제조된 화합물은 사용된 용매에 따라 이의 카르비놀아민 또는 카르비놀아민 에테르 형태로 존재할 수 있다. 예컨대 ProtN이 Alloc이고 ProtO가 합성을 위한 산소 보호기일 경우, N10 보호기를 제거하기 위해 팔라듐을 사용하여 탈보호를 실시한 후, 합성을 위한 산소 보호기를 제거한다. ProtN이 Troc이고 ProtO가 합성을 위한 산소 보호기인 경우, Cd/Pb 커플을 사용하여 탈보호를 실시하여 화학식 I의 화합물을 얻는다. ProtN이 SEM 또는 유사 기이고 ProtO가 옥소기일 경우, 옥소기를 환원에 의해 제거할 수 있으며, 이에 따라 보호된 카르비놀아민 중간체가 생성되고, 그 다음 이를 처리하여 SEM 보호기를 제거한 후 물을 제거할 수 있다. 화학식 2의 화합물의 환원은 예컨대 리튬 테트라보로하이드라이드에 의해 달성할 수 있으며, SEM 보호기를 제거하기 위한 적절한 수단은 실리카 겔을 사용한 처리이다.
화학식 2의 화합물은 유기 붕소 유도체와 같은 R12를 포함하는 유기 금속 유도체를 커플링함으로써 하기 화학식 3a의 화합물로부터 합성할 수 있다:
화학식 3a
Figure pct00078
상기 화학식에서, R2, R6, R7, R9, R6', R7', R9', X, X' 및 R"는 화학식 2의 화합물에 대해 정의된 바와 같다. 유기 붕소 유도체는 보로네이트 또는 보론산일 수 있다.
화학식 2의 화합물은 유기 붕소 유도체와 같은 R2를 포함하는 유기 금속 유도체를 커플링함으로써 하기 화학식 3b의 화합물로부터 합성할 수 있다:
화학식 3b
Figure pct00079
상기 화학식에서, R12, R6, R7, R9, R6', R7', R9', X, X' 및 R"는 화학식 2의 화합물에 대해 정의된 바와 같다. 유기 붕소 유도체는 보로네이트 또는 보론산일 수 있다.
화학식 3a 및 3b의 화합물은 약 1 당량(예컨대 0.9 또는 1 내지 1.1 또는 1.2 당량)의 R2 또는 R12를 포함하는 유기 붕소 유도체와 같은 유기 금속 유도체를 커플링함으로써 하기 화학식 4의 화합물로부터 합성할 수 있다:
화학식 4
Figure pct00080
상기 화학식에서, R2, R6, R7, R9, R6', R7', R9', X, X' 및 R"는 화학식 2의 화합물에 대해 정의된 바와 같다.
상기 설명한 커플링은 일반적으로 예컨대 Pd(PPh3)4, Pd(OCOCH3)2, PdCl2, 또는 Pd2(dba)3과 같은 팔라듐 촉매의 존재 하에 실시한다. 커플링은 표준 조건 하에서 실시할 수 있거나, 또는 마이크로파 조건 하에서 실시할 수도 있다.
2 가지 커플링 단계를 일반적으로 순차적으로 실시한다. 이들은 2 가지 단계 사이에 정제를 실시하거나 실시하지 않고 실시할 수 있다. 정제를 실시하지 않을 경우, 2 가지 단계를 동일한 반응 용기에서 실시할 수 있다. 정제는 일반적으로 제2 커플링 단계 후에 필요하다. 원하지 않는 부산물로부터의 화합물의 정제는 컬럼 크로마토그래피 또는 이온 교환 분리에 의해 실시할 수 있다.
화학식 4(식 중, ProtO는 옥소기이고, ProtN은 SEM임)의 화합물의 합성은 본 명세서에서 참고로 인용하는 WO 00/12508에 상세히 설명되어 있다. 특히, 페이지 24의 반응식 7을 참조하며, 여기서 상기 화합물은 중간체 P로서 지정되어 있다. 이 합성 방법은 WO 2004/043963에도 설명되어 있다.
화학식 4(식 중, ProtO는 합성을 위한 보호된 산소기임)의 화합물의 합성은 WO 2005/085251에 설명되어 있으며, 이 합성은 본 명세서에서 참고로 인용한다.
화학식 I(식 중, R10 및 R10'는 H이고, R11 및 R11'는 SOzM임)의 화합물은 적절한 비설파이트 염 또는 설피네이트 염의 첨가 후 적절한 정제 단계에 의해 화학식 I(식 중, R10 및 R11은 이들이 결합되는 질소 원자와 탄소 원자 사이에 질소-탄소 이중 결합을 형성함)의 화합물로부터 합성할 수 있다. 추가의 방법은 본 명세서에서 참고로 인용하는 GB 2 053 894에 설명되어 있다.
합성을 위한 질소 보호기
합성을 위한 질소 보호기는 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명에서, 특히 중요한 보호기는 카르바메이트 질소 보호기 및 헤미아민 질소 보호기이다.
카르바메이트 질소 보호기는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00081
상기 화학식에서, R'10은 상기 정의된 바의 R이다. 다수의 적절한 기가 본 명세서에서 참고로 인용하는 문헌(Greene, T.W. and Wuts, G.M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1999)의 503 내지 549 페이지에 기재되어 있다.
특히 바람직한 보호기는 Troc, Teoc, Fmoc, BOC, Doc, Hoc, TcBOC, 1-Adoc 및 2-Adoc을 포함한다.
다른 가능한 기는 니트로벤질옥시카르보닐(예컨대 4-니트로벤질옥시카르보닐) 및 2-(페닐설포닐)에톡시카르보닐이다.
팔라듐 촉매화에 의해 제거될 수 있는 보호기, 예컨대 Alloc은 바람직하지 않다.
헤미아민 질소 보호기는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00082
상기 화학식에서, R'10은 상기 정의된 바의 R이다. 다수의 적절한 기가 본 명세서에서 참고로 인용하는 문헌(Greene, T.W. and Wuts, G.M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1999)의 633 내지 647 페이지에 아미드 보호기로서 기재되어 있다. 본 명세서에 개시된 기를 본 발명의 화합물에 적용할 수 있다. 이러한 기는 SEM, MOM, MTM, MEM, BOM, 니트로 또는 메톡시 치환된 BOM, Cl3CCH2OCH2-를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
합성을 위한 보호된 산소기
합성을 위한 보호된 산소기는 당업계에 잘 알려져 있다. 다수의 적절한 산소 보호기가 본 명세서에서 참고로 인용하는 문헌(Greene, T.W. and Wuts, G.M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1999)의 23 내지 200 페이지에 기재되어 있다.
특히 중요한 부류는 실릴 에테르, 메틸 에테르, 알킬 에테르, 벤질 에테르, 에스테르, 아세테이트, 벤조에이트, 카르보네이트 및 설포네이트를 포함한다.
바람직한 산소 보호기는 아세테이트, TBS 및 THP를 포함한다.
추가의 선호하는 것
하기 선호하는 것은 상기 설명한 바의 본 발명의 모든 양태에 적용될 수 있거나, 또는 단일 양태와 관련될 수 있다. 이 선호하는 것을 임의로 조합으로 함께 조합할 수 있다.
몇몇의 구현예에서, R6', R7', R9', R10', R11' 및 Y'는 바람직하게는 각각 R6, R7, R9, R10, R11 및 Y와 동일하다.
이량체 결합
Y 및 Y'는 바람직하게는 O이다.
R"는 바람직하게는 치환기가 없는 C3 -7 알킬렌기이다. 더욱 바람직하게는, R"는 C3, C5 또는 C7 알킬렌이다.
R 6 내지 R 9
R9는 바람직하게는 H이다.
R6은 바람직하게는 H, OH, OR, SH, NH2, 니트로 및 할로에서 선택되고, 더욱 바람직하게는 H 또는 할로이고, 가장 바람직하게는 H이다.
R7은 바람직하게는 H, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR' 및 할로에서 선택되고, 더욱 바람직하게는 독립적으로 H, OH 및 OR(여기서 R은 바람직하게는 임의로 치환된 C1 -7 알킬, C3 -10 헤테로시클일 및 C5 -10 아릴기에서 선택됨)에서 선택된다. R은 더욱 바람직하게는 치환 또는 비치환될 수 있는 C1 -4 알킬기일 수 있다. 중요한 치환기는 C5 -6 아릴기(예컨대 페닐)이다. 특히 바람직한 7 위치의 치환기는 OMe 및 OCH2Ph이다.
이들 선호하는 것은 각각 R9', R6' 및 R7'에 적용된다.
R 2
R2에서 A는 페닐기 또는 C5 -7 헤테로아릴기, 예컨대 푸라닐, 티오페닐 및 피리딜일 수 있다. 몇몇의 구현예에서, A는 바람직하게는 페닐이다. 다른 구현예에서, A는 바람직하게는 티오페닐, 예컨대 티오펜-2-일 및 티오펜-3-일이다.
X는 하기를 포함하는 목록에서 선택되는 기이다: -O-, -S-, -C(O)O-, -C(O)-, -NH(C=O)- 및 -N(RN)-(여기서 RN은 H 및 C1 -4 알킬을 포함하는 군에서 선택됨). X는 바람직하게는 -O-, -S-, -C(O)O-, -NH(C=O)- 또는 -NH-일 수 있고, 더욱 바람직하게는 -O-, -S-, 또는 -NH-일 수 있으며, 가장 바람직하게는 -NH-이다.
Q2-X는 C5 -7 아릴기의 이용 가능한 고리 원자 중 임의의 것 상에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 화합물의 나머지에 대한 결합에 인접하지 않은 고리 원자 상에 존재한다. 즉, 이것은 바람직하게는 화합물의 나머지에 대한 결합에 대해 β 또는 γ 위치에 존재한다. 따라서, C5 -7 아릴기(A)가 페닐일 경우, 치환기(Q2-X)는 바람직하게는 메타 또는 파라 위치에 존재하고, 더욱 바람직하게는 파라 위치에 존재한다.
몇몇의 구현예에서, Q1은 단일 결합이다. 이들 구현예에서, Q2는 단일 결합 및 -Z-(CH2)n-에서 선택되며, 여기서 Z는 단일 결합, O, S 및 NH에서 선택되고, n은 1 내지 3이다. 이들 구현예 중 일부에서, Q2는 단일 결합이다. 다른 구현예에서, Q2는 -Z-(CH2)n-이다. 이들 구현예에서, Z는 O 또는 S일 수 있고, n은 1일 수 있거나 또는 n은 2일 수 있다. 이들 구현예 중 나머지에서, Z는 단일 결합일 수 있고, n은 1일 수 있다.
다른 구현예에서, Q1은 -CH=CH-이다.
몇몇의 구현예에서, R2은 -A-CH2-X 및 -A-X일 수 있다. 이들 구현예에서, X는 -O-, -S-, -C(O)O-, -C(O)- 및 -NH-일 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, X는 NH-일 수 있다.
R 12
R12는 C5 -7 아릴기일 수 있다. C5 -7 아릴기는 페닐기 또는 C5 -7 헤테로아릴기, 예컨대 푸라닐, 티오페닐 및 피리딜일 수 있다. 몇몇의 구현예에서, R12는 바람직하게는 페닐이다. 다른 구현예에서, R12는 바람직하게는 티오페닐, 예컨대 티오펜-2-일 및 티오펜-3-일이다.
R12는 C8 -10 아릴, 예컨대 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐 기일 수 있다. 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐 기는 이용 가능한 고리 위치를 통해 PBD 코어에 결합될 수 있다. 예컨대, 퀴놀리닐은 퀴놀린-2-일, 퀴놀린-3-일, 퀴놀린-4-일, 퀴놀린-5-일, 퀴놀린-6-일, 퀴놀린-7-일 및 퀴놀린-8-일일 수 있다. 이들 중에서, 퀴놀린-3-일 및 퀴놀린-6-일이 바람직할 수 있다. 이소퀴놀리닐은 이소퀴놀린-1-일, 이소퀴놀린-3-일, 이소퀴놀린-4-일, 이소퀴놀린-5-일, 이소퀴놀린-6-일, 이소퀴놀린-7-일 및 이소퀴놀린-8-일일 수 있다. 이들 중에서, 이소퀴놀린-3-일 및 이소퀴놀린-6-일이 바람직할 수 있다.
R12는 임의의 수의 치환기를 보유할 수 있다. 이는 바람직하게는 1 내지 3 개의 치환기를 보유할 수 있으며, 1 및 2 개가 더욱 바람직하고, 단일 치환된 기가 가장 바람직하다. 치환기는 임의의 위치에 존재할 수 있다.
R12가 C5 -7 아릴기일 경우, 단일 치환기는 바람직하게는 화합물의 나머지에 대한 결합에 인접하지 않은 고리 원자 상에 존재한다. 즉, 이것은 바람직하게는 화합물의 나머지에 대한 결합에 대해 β 또는 γ 위치에 존재한다. 따라서, C5 -7 아릴기가 페닐일 경우, 치환기는 바람직하게는 메타 또는 파라 위치에 존재하고, 더욱 바람직하게는 파라 위치에 존재한다.
R12가 C8 -10 아릴기, 예컨대 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐일 경우, 이는 퀴놀린 또는 이소퀴놀린 고리의 임의의 위치에 임의의 수의 치환기를 보유할 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 이는 1, 2 또는 3 개의 치환기를 보유하며, 이들은 근위 및 원위 고리 상에 또는 양쪽 상에(1 이상의 치환기의 경우) 존재할 수 있다.
R 12 치환기
R12 상의 치환기가 할로일 경우, 이는 바람직하게는 F 또는 Cl, 더욱 바람직하게는 Cl이다.
R12 상의 치환기가 에테르일 경우, 이는 몇몇의 구현예에서 알콕시기, 예컨대 C1 -7 알콕시기(예컨대 메톡시, 에톡시)일 수 있거나, 또는 이는 몇몇의 구현예에서 C5 -7 아릴옥시기(예컨대 페녹시, 피리딜옥시, 푸라닐옥시)일 수 있다. 알콕시기는 그 자체로 예컨대 아미노기(예컨대 디메틸아미노)로 추가로 치환될 수 있다.
R12 상의 치환기가 C1 -7 알킬일 경우, 이는 바람직하게는 C1 -4 알킬기(예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 부틸)일 수 있다.
R12 상의 치환기가 C3 -7 헤테로시클일일 경우, 이는 몇몇의 구현예에서 C6 질소 함유 헤테로시클일기, 예컨대 모르폴리노, 티오모르폴리노, 피페리디닐, 피페라지닐일 수 있다. 이들 기는 질소 원자를 통해 PBD 부분의 나머지에 결합될 수 있다. 이들 기는 예컨대 C1 -4 알킬기로 추가로 치환될 수 있다. C6 질소 함유 헤테로시클일기가 피페라지닐일 경우, 상기 추가의 치환기는 제2 질소 고리 원자 상에 존재할 수 있다.
R12 상의 치환기가 비스-옥시-C1 -3 알킬렌일 경우, 이는 바람직하게는 비스-옥시-메틸렌 또는 비스-옥시-에틸렌이다.
R12에 대한 특히 바람직한 치환기는 메톡시, 에톡시, 플루오로, 클로로, 시아노, 비스-옥시-메틸렌, 메틸-피페라지닐, 모르폴리노 및 메틸-티오페닐을 포함한다. 다른 R12에 대한 특히 바람직한 치환기는 디메틸아미노프로필옥시이다.
R 12 기
특히 바람직한 치환된 R12 기는 4-메톡시-페닐, 3-메톡시페닐, 4-에톡시-페닐, 3-에톡시-페닐, 4-플루오로-페닐, 4-클로로-페닐, 3,4-비스옥시메틸렌-페닐, 4-메틸티오페닐, 4-시아노페닐, 4-페녹시페닐, 퀴놀린-3-일 및 퀴놀린-6-일, 이소퀴놀린-3-일 및 이소퀴놀린-6-일, 2-티에닐, 2-푸라닐, 메톡시나프틸 및 나프틸을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 가능한 치환된 R12 기는 4-니트로페닐이다.
M 및 z
M 및 M'는 1가의 약학적으로 허용되는 양이온인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 Na+이다.
z는 바람직하게는 3이다.
실시예
일반적인 실험 방법
ADP 220 편광계(Bellingham Stanley Ltd.) 상에서 광학 회전을 측정하고, 농도(c)를 g/100 ㎖로 제공하였다. 융점은 디지털 융점 장치(Electrothermal)를 이용하여 측정하였다. IR 스펙트럼을 Perkin-Elmer Spectrum 1000 FT IR 분광계 상에 기록하였다. 각각 400 및 100 MHz에서 Bruker Avance NMR 분광계를 이용하여 300 K에서 1H 및 13C NMR 스펙트럼을 얻었다. TMS(δ = 0.0 ppm)에 대한 화학적 이동을 기재하고, 신호를 헤르츠(Hz)로 주어지는 커플링 상수와 함께, s(단일항), d(이중항), t(삼중항), dt(이중 삼중항), dd(이중항의 이중항), ddd(이중항의 이중 이중항) 또는 m(다중항)으로 나타내었다. Waters 2996 PDA와 함께 Waters 2695 HPLC에 결합된 Waters Micromass ZQ 기기를 이용하여 질량 분광학(MS) 데이터를 수집하였다. 사용된 Waters Micromass ZQ 변수는 하기와 같다: 모세관(kV), 3.38; 원뿔(V), 35; 추출기(V), 3.0; 소스 온도(℃), 100; 탈용매화 온도(℃), 200; 원뿔 유속(L/h), 50; 탈용매화 유속(L/h), 250. 샘플을 기기에 도입하기 위한 금속 코팅 붕규사염 유리 팁(tip)을 이용하여 포지티브 W 모드의 Waters Micromass QTOF Global 상에서 고해상도 질량 분광학(HRMS) 데이터를 기록하였다. 실리카 겔 알루미늄 플레이트(Merck 60, F254) 상에서 박층 크로마토그래피(TLC)를 수행하고, 실리카 겔(Merck 60, 230-400 메쉬 ASTM)을 사용하여 플래쉬 크로마토그래피를 수행하였다. HOBt(NovaBiochem) 및 고체 지지 시약(Argonaut)을 제외하고는, 모든 다른 화학 물질 및 용매는 시그마-알드리치로부터 구입하고, 추가의 정제 없이 공급된 대로 사용하였다. 적절한 건조제의 존재 하에 건조 질소 분위기 하에서 증류에 의해 무수 용매를 제조하고, 4Å 분자체 또는 나트륨 와이어 상에 보관하였다. 석유 에테르는 40-60℃에서 비등하는 분획을 지칭한다.
화합물 1b는 본 명세서에서 참고로 인용하는 WO 00/012508(화합물 210)에 기재되어 있다.
일반적인 LC/MS 조건: 물(A)(포름산 0.1%) 및 아세토니트릴(B)(포름산 0.1%)의 이동상을 이용하여 HPLC(Waters Alliance 2695)를 구동하였다. 구배: 초기 조성 1.0 분에 걸쳐 5% B, 그 다음 3 분 내에 5% B에서 95% B. 95% B에서 0.5 분 동안 조성을 유지한 후, 0.3 분 내에 5% B로 되돌렸다. 총 구배 구동 시간은 5 분에 상당하였다. 유속 3.0 ㎖/분, 400 ㎕를 질량 분광계에 통과하는 제로 무효 부피 T형 조각(zero dead volume tee piece)을 통해 흘렸다. 파장 검출 범위: 220 내지 400 ㎚. 기능 유형: 다이오드 어레이(535 스캔). 컬럼: Phenomenex? Onyx Monolithic C18 50×4.60 ㎜.
Troc 및 TBDMS 기 모두에 의해 보호되는 화합물에 특이적인 LC/MS 조건: Troc 및 TBDMS 보호된 화합물의 크로마토그래프 분리를 Phenomenex Corp 제조의 Onyx Monolithic 역상 컬럼(3 ㎛ 입자, 50×4.6 ㎜)을 이용하는 Waters Alliance 2695 HPLC 시스템 상에서 수행하였다. 이동상 A는 0.1% 포름산을 함유하는 5% 아세토니트릴-95% 물로 구성되었고, 이동상 B는 0.1% 포름산을 함유하는 95% 아세토니트릴-5% 물로 구성되었다. 5% B에서 1 분 후, B의 비율은 다음 2.5 분에 걸쳐 95% B로 상승시키고, 추가 1 분 동안 95% B에서 유지시킨 후, 10 초 내에 95% A로 되돌리고, 추가 50 초 동안 재평형 상태로 유지시켜 총 5.0 분의 구동 시간을 제공하였다. 유속은 3.0 ㎖/분으로 유지시켰다.
화합물 33에 특이적인 LC/MS 조건: Waters 2996 포토다이오드 어레이 검출기 및 Waters ZQ 단일 4중 질량 분광계와 연결된 Waters 2767 샘플 매니저 상에서 LC를 구동하였다. 사용된 컬럼은 Luna 페닐-헥실 150×4.60 ㎜, 5 ㎛, Part no. 00F-4257-E0(Phenomenex)이었다. 이용한 이동상은 하기와 같았다:
이동상 A: 100%의 HPLC 등급 물(0.05% 트리에틸아민), pH=7
이동상 B: 20%의 HPLC 등금 물 및 80%의 HPLC 등급 아세토니트릴(0.05% 트리에틸아민), pH=7
사용된 구배는 하기와 같았다:
시간 유속 %A %B
(분) (㎖/분)
초기 1.50 90 10
1.0 1.50 90 10
16.0 1.50 64 36
30.0 1.50 5 95
31.0 1.50 90 10
32.0 1.50 90 10
포지티브 이온 모드 및 SIR(선택적인 이온 모니터)에서 질량 분석법을 실시하였고, 모니터링된 이온은 m/z = 727.2이었다.
주요 중간체의 합성
Figure pct00083

(a) 1,1'-[[(프로판-1,3- 디일 ) 디옥시 ] 비스 [(5- 메톡시 -2-니트로-1,4- 페닐렌 )카르보닐]] 비스 [(2S,4R)- 메틸 -4- 히드록시피롤리딘 -2- 카르복실레이트 ]( 2a )
방법 A: 촉매량의 DMF(2 방울)를 무수 THF(20 ㎖) 중 니트로산(nitro-acid) 1a(1.0 g, 2.15 mmol) 및 염화옥살일(0.95 ㎖, 1.36 g, 10.7 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 상온에서 16 시간 동안 교반시키고, 용매를 진공 증발시켜 제거하였다. 생성된 잔류물을 무수 THF(20 ㎖)에 재용해시키고, 산 염화물 용액을 질소 분위기 하에서 -30℃(드라이 아이스/에틸렌 글리콜)에서 THF(10 ㎖) 중 (2S,4R)-메틸-4-히드록시피롤리딘-2-카르복실레이트 염산염(859 mg, 4.73 mmol) 및 TEA(6.6 ㎖, 4.79 g, 47.3 mmol)의 교반된 혼합물에 적가하였다. 반응 혼합물을 상온으로 승온시키고, 추가 3 시간 동안 교반시켰고, 이 시점 이후 TLC(95:5 v/v CHCl3/MeOH) 및 LC/MS[2.45 분 (ES+) m/z (상대적인 세기) 721 ([M + H]+., 20)]에 의해 생성물의 형성이 나타났다. 과량의 THF를 회전 증발에 의해 제거하고, 생성된 잔류물을 DCM(50 ㎖)에 용해시켰다. 유기층을 1N HCl(2×15 ㎖), 포화 NaHCO3(2×15 ㎖), H2O(20 ㎖), 염수(30 ㎖)로 세척하고, 건조시켰다(MgSO4). 용매를 여과 및 증발시켜 암색의 오일을 미정제 생성물로서 얻었다. 플래쉬 크로마토그래피(구배 용리: 100% CHCl3에서 96:4 v/v CHCl3/MeOH)로 정제하여 순수한 아미드 2a를 오렌지색 유리질로서 단리하였다(840 mg, 54%).
방법 B: 염화옥살일(9.75 ㎖, 14.2 g, 111 mmol)을 무수 DCM(200 ㎖) 중 니트로산 1a(17.3 g, 37.1 mmol) 및 DMF(2 ㎖)의 교반된 현탁액에 첨가하였다. 초기 비등 후, 반응 현탁액은 용액이 되었고, 혼합물을 16 시간 동안 상온에서 교반시켰다. 반응 혼합물의 샘플을 MeOH로 처리하여 산 염화물로의 전환을 확인하였고, 생성된 비스-메틸 에스테르를 LC/MS에 의해 관찰하였다. 대부분의 용매를 진공 증발에 의해 제거하고, 생성된 농축액을 최소량의 무수 DCM에 재용해시키고, 디에틸 에테르로 분쇄하였다. 생성된 황색 침전을 여과에 의해 수집하고, 냉 디에틸 에테르로 세척하고, 40℃ 진공 오븐에서 1 시간 동안 건조시켰다. 고상 산 염화물을 -40℃(드라이 아이스/CH3CN)에서 DCM(150 ㎖) 중 (2S,4R)-메틸-4-히드록시피롤리딘-2-카르복실레이트 염산염(15.2 g, 84.0 mmol) 및 TEA(25.7 ㎖, 18.7 g, 185 mmol)의 교반된 현탁액에 25 분의 기간에 걸쳐 일부씩 첨가하였다. LC/MS[2.47 분 (ES+) m/z (상대적인 세기) 721 ([M + H]+., 100)]에 의해 판단시 즉시 반응이 완결되었다. 혼합물을 DCM(150 ㎖)으로 희석하고, 1N HCl(300 ㎖), 포화 NaHCO3(300 ㎖), 식염수(300 ㎖)로 세척하고, (상 분리기를 통해) 여과하고, 용매를 진공 증발시켜 순수한 생성물 2a를 오렌지색 고체로서 얻었다(21.8 g, 82%).
분석 데이터: [α]22 D = -46.1°(c = 0.47, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) (회전 이성체) δ 7.63 (s, 2H), 6.82 (s, 2H), 4.79-4.72 (m, 2H), 4.49-4.28 (m, 6H), 3.96 (s, 6H), 3.79 (s, 6H), 3.46-3.38 (m, 2H), 3.02 (d, 2H, J = 11.1 Hz), 2.48-2.30 (m, 4H), 2.29-2.04 (m, 4H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) (회전 이성체) δ 172.4, 166.7, 154.6, 148.4, 137.2, 127.0, 109.7, 108.2, 69.7, 65.1, 57.4, 57.0, 56.7, 52.4, 37.8, 29.0; IR (ATR, CHCl3) 3410 (br), 3010, 2953, 1741, 1622, 1577, 1519, 1455, 1429, 1334, 1274, 1211, 1177, 1072, 1050, 1008, 871 cm-1; MS (ES+) m/z (상대적인 세기) 721 ([M + H]+., 47), 388 (80); HRMS [M + H]+. 이론치 C31H36N4O16 m/z 721.2199, 실측치 (ES+) m/z 721.2227.
(a) 1,1'-[[(펜탄-1,5- 디일 ) 디옥시 ] 비스 [(5- 메톡시 -2-니트로-1,4- 페닐렌 )카르보닐]] 비스 [(2S,4R)- 메틸 -4- 히드록시피롤리딘 -2- 카르복실레이트 ]( 2b )
방법 B에 따라 1b로부터 제조하여 순수한 생성물을 오렌지색 폼(foam)으로서 얻었다(75.5 g, 82%).
분석 데이터: (ES+) m/z (상대적인 세기) 749 ([M + H]+., 100).
(b) 1,1'-[[(프로판-1,3- 디일 ) 디옥시 ] 비스 (11 aS ,2R)-2-(히드록시)-7- 메톡시 -1,2,3,10,11,11a-헥사히드로-5H- 피롤로 [2,1-c][1,4]-벤조디아제핀-5,11- 디온 ]( 3a )
방법 A: DMF(40 ㎖) 중 10% Pd/C(7.5 g, 10% w/w)의 현탁액을 DMF(360 ㎖) 중 니트로-에스테르 2a(75 g, 104 mmol)의 용액에 첨가하였다. 상기 현탁액을 8 시간에 걸쳐 Parr 수소화 장치에서 수소화시켰다. 수소 흡입이 중지된 후, 반응의 진행을 LC/MS[2.12 분 (ES+) m/z (상대적인 세기) 597 ([M+H]+., 100), (ES-) m/z (상대적인 세기) 595 ([M + H]+., 100]에 의해 모니터링하였다. 고상 Pd/C를 여과에 의해 제거하고, 여액을 40℃에서 진공(10 mbar 이하) 하에서 회전 증발에 의해 농축시켜 미량의 DMF 및 잔류 목탄을 함유하는 암색 오일을 얻었다. 잔류물을 수조(회전 증발기 조) 상에서 40℃에서 EtOH(500 ㎖)에 침지시키고, 생성된 현탁액을 셀라이트를 통해 여과하고, 에탄올(500 ㎖)로 세정하여 투명한 여액을 얻었다. 히드라진 수화물(10 ㎖, 321 mmol)을 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 가열 환류하였다. 20 분 후, 백색 침전의 형성이 관찰되었고, 추가 30 분 동안 계속 환류시켰다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 여과에 의해 침전을 회수하고, 이를 디에틸 에테르(침전의 2*1 부피)로 세척하고, 진공 데시케이터에서 건조시켜 3a를 얻었다(50 g, 81%).
방법 B: MeOH(300 ㎖) 중 니트로-에스테르 2a(6.80 g, 9.44 mmol)의 용액을 3구 둥근 바닥 플라스크에서 Raney™ 니켈(H2O 중 ~50% 슬러리의 4 큰 스파툴라 끝) 및 충돌 방지(anti-bumping) 과립에 첨가하였다. 혼합물을 가열 환류한 후, MeOH(50 ㎖) 중 히드라진 수화물(5.88 ㎖, 6.05 g, 188 mmol)의 용액으로 적가 처리하였고, 이 시점에서 격렬한 비등이 관찰되었다. 첨가가 완료되었을 때(~30 분), 비등이 정지하고 반응 혼합물의 초기 황색이 사라질 때까지 추가의 Raney™ 니켈을 조심스레 첨가하였다. TLC[90:10 v/v CHCl3/MeOH) 및 LC/MS (2.12 분 (ES+) m/z (상대적인 세기) 597 ([M + H]+., 100)]에 의해 반응이 완결된 것으로 생각되는 시점인 추가 30 분 동안 혼합물을 환류 가열하였다. 반응 혼합물을 약 40℃로 냉각시킨 후, 과량의 니켈을 진공 흡입 없이 소결 깔때기(sinter funnel)를 통한 여과에 의해 제거하였다. 진공에서 증발에 의해 여액의 부피를 감소시켰고, 이 시점에서 형성된 무색 침전을 여과에 의해 수집하고, 진공 데시케이터에서 건조시켜 3a를 얻었다(5.40 g, 96%).
분석 데이터: [α]27 D = +404°(c = 0.10, DMF); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.2 (s, 2H, NH), 7.26 (s, 2H), 6.73 (s, 2H), 5.11 (d, 2H, J = 3.98 Hz, OH), 4.32-4.27 (m, 2H), 4.19-4.07 (m, 6H), 3.78 (s, 6H), 3.62 (dd, 2H, J = 12.1, 3.60 Hz), 3.43 (dd, 2H, J = 12.0, 4.72 Hz), 2.67-2.57 (m, 2H), 2.26 (p, 2H, J = 5.90 Hz), 1.99-1.89 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ 169.1, 164.0, 149.9, 144.5, 129.8, 117.1, 111.3, 104.5, 54.8, 54.4, 53.1, 33.5, 27.5; IR [ATR, 순수물(neat)] 3438, 1680, 1654, 1610, 1605, 1516, 1490, 1434, 1379, 1263, 1234, 1216, 1177, 1156, 1115, 1089, 1038, 1018, 952, 870 cm-1; MS (ES+) m/z (상대적인 세기) 619 ([M + Na]+., 10), 597 ([M + H]+., 52), 445 (12), 326 (11); HRMS [M + H]+. 이론치 C29H32N4O10 m/z 597.2191, 실측치 (ES+) m/z 597.2205.
(b) 1,1'-[[(펜탄-1,5- 디일 ) 디옥시 ] 비스 (11 aS ,2R)-2-(히드록시)-7- 메톡시 -1,2,3,10,11,11a-헥사히드로-5H- 피롤로 [2,1-c][1,4]-벤조디아제핀-5,11- 디온 ]( 3b )
방법 A에 따라 2b로부터 제조하여 생성물을 백색 고체로서 얻었다(22.1 g, 86%).
분석 데이터: MS (ES-) m/z (상대적인 세기) 623.3 ([M - H]-., 100);
(c) 1,1'-[[(프로판-1,3- 디일 ) 디옥시 ] 비스 (11 aS ,2R)-2-( 터트 - 부틸디메틸실릴 옥시)-7- 메톡시 -1,2,3,10,11,11a- 헥사히드로 -5H- 피롤로 [2,1-c][1,4]-벤조디아제핀-5,11-디온]( 4a )
TBSCl(317 mg, 2.1 mmol) 및 이미다졸(342 mg, 5.03 mmol)을 무수 DMF(6 ㎖) 중 테트라락탐 3a(250 mg, 0.42 mmol)의 흐린 용액에 첨가하였다. LC/MS[3.90 분 (ES+) m/z (상대적인 세기) 825 ([M + H]+., 100)]에 의해 판단시 반응이 완결된 것으로 간주되는 시간 이후인 3 시간 동안 혼합물을 질소 분위기 하에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 얼음(~25 ㎖)에 붓고, 교반하면서 상온으로 승온시켰다. 생성된 백색 침전물을 진공 여과에 의해 수집하고, H2O, 디에틸 에테르로 세척하고, 진공 데시케이터에서 건조시켜 순수한 4a를 얻었다(252 mg, 73%).
분석 데이터: [α]23 D = +234°(c = 0.41, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.65 (s, 2H, NH), 7.44 (s, 2H), 6.54 (s, 2H), 4.50 (p, 2H, J = 5.38 Hz), 4.21-4.10 (m, 6H), 3.87 (s, 6H), 3.73-3.63 (m, 4H), 2.85-2.79 (m, 2H), 2.36-2.29 (m, 2H), 2.07-1.99 (m, 2H), 0.86 (s, 18H), 0.08 (s, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170.4, 165.7, 151.4, 146.6, 129.7, 118.9, 112.8, 105.3, 69.2, 65.4, 56.3, 55.7, 54.2, 35.2, 28.7, 25.7, 18.0, -4.82 및 -4.86; IR (ATR, CHCl3) 3235, 2955, 2926, 2855, 1698, 1695, 1603, 1518, 1491, 1446, 1380, 1356, 1251, 1220, 1120, 1099, 1033 cm-1; MS (ES+) m/z (상대적인 세기) 825 ([M + H]+., 62), 721 (14), 440 (38); HRMS [M + H]+. 이론치 C41H60N4O10Si2 m/z 825.3921, 실측치 (ES+) m/z 825.3948.
(c) 1,1'-[[(펜탄-1,5- 디일 ) 디옥시 ] 비스 (11 aS ,2R)-2-( 터트 - 부틸디메틸실릴옥시 )-7- 메톡시 -1,2,3,10,11,11a- 헥사히드로 -5H- 피롤로 [2,1-c][1,4]-벤조디아제핀-5,11-디온]( 4b )
상기 방법에 따라 3b로부터 제조하여 생성물을 백색 고체로서 얻었다(27.3 g, 93%).
분석 데이터: MS (ES+) m/z (상대적인 세기) 853.8 ([M + H]+., 100), (ES-) m/z (상대적인 세기) 851.6 ([M - H]-., 100.
(d) 1,1'-[[(프로판-1,3- 디일 ) 디옥시 ] 비스 (11 aS ,2R)-2-(터트- 부틸디메틸실릴옥시 )-7- 메톡시 -10-((2-( 트리메틸실릴 ) 에톡시 ) 메틸 )-1,2,3,10,11,11a- 헥사히드로 -5H-피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀-5,11- 디온 ]( 5a )
무수 THF(10 ㎖) 중 n-BuLi의 용액(헥산 중 4.17 ㎖의 1.6 M 용액, 6.67 mmol)을 질소 분위기 하에서 -30℃(드라이 아이스/에틸렌 글리콜)에서 무수 THF(30 ㎖) 중 테트라락탐 4a(2.20 g, 2.67 mmol)의 교반된 현탁액에 적가하였다. 반응 혼합물을 1 시간 동안 이 온도에서 교반시켰고(이때 적색이 나는 오렌지색), 이 시점에서 무수 THF(10 ㎖) 중 SEMCl의 용액(1.18 ㎖, 1.11 g, 6.67 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 천천히 상온으로 승온시키고, 질소 분위기 하에서 16 시간 동안 교반하였다. TLC(EtOAc) 및 LC/MS[4.77 분 (ES+) m/z (상대적인 세기) 1085 ([M + H]+., 100)]에 의해 판단시 반응이 완결된 것으로 간주되었다. 진공에서 증발시켜 THF를 제거하고, 생성된 잔류물을 EtOAc(60 ㎖)에 용해시키고, H2O(20 ㎖), 식염수(20 ㎖)로 세척하고, 건조시키고(MgSO4), 여과하고, 진공에서 증발시켜 미정제 생성물을 얻었다. 플래쉬 크로마토그래피(80:20 v/v 헥산/EtOAc)에 의한 정제로 순수한 N10-SEM 보호된 테트라락탐 5a를 오일로서 얻었다(2.37 g, 82%).
분석 데이터: [α]23 D = +163°(c = 0.41, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.33 (s, 2H), 7.22 (s, 2H), 5.47 (d, 2H, J = 9.98 Hz), 4.68 (d, 2H, J = 9.99 Hz), 4.57 (p, 2H, J = 5.77 Hz), 4.29-4.19 (m, 6H), 3.89 (s, 6H), 3.79-3.51 (m, 8H), 2.87-2.81 (m, 2H), 2.41 (p, 2H, J = 5.81 Hz), 2.03-1.90 (m, 2H), 1.02-0.81 (m, 22H), 0.09 (s, 12H), 0.01(s, 18H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170.0, 165.7, 151.2, 147.5, 133.8, 121.8, 111.6, 106.9, 78.1, 69.6, 67.1, 65.5, 56.6, 56.3, 53.7, 35.6, 30.0, 25.8, 18.4, 18.1, -1.24, -4.73; IR (ATR, CHCl3) 2951, 1685, 1640, 1606, 1517, 1462, 1433, 1360, 1247, 1127, 1065 cm-1; MS (ES+) m/z (상대적인 세기) 1113 ([M + Na]+., 48), 1085 ([M + H]+., 100), 1009 (5), 813 (6); HRMS [M + H]+. 이론치 C53H88N4O12Si4 m/z 1085.5548, 실측치 (ES+) m/z 1085.5542.
(d) 1,1'-[[(펜탄-1,5- 디일 ) 디옥시 ] 비스 (11 aS ,2R)-2-(터트- 부틸디메틸실릴옥시 )-7-메 톡 시-10-((2-( 트리메틸실릴 ) 에톡시 ) 메틸 )-1,2,3,10,11,11a- 헥사히드로 -5H-피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀-5,11- 디온 ]( 5b )
상기 방법에 따라 4b로부터 제조하여 생성물을 옅은 오렌지색 폼으로서 얻었고(46.9 g, 100%), 이를 추가의 정제 없이 사용하였다.
분석 데이터: MS (ES+) m/z (상대적인 세기) 1114 ([M + H]+., 90), (ES-) m/z (상대적인 세기) 1158 ([M + 2Na]-., 100).
(e) 1,1'-[[(프로판-1,3- 디일 ) 디옥시 ] 비스 (11 aS ,2R)-2-히드록시-7- 메톡시 -10-((2-(트 리 메틸실릴) 에톡시 ) 메틸 )-1,2,3,10,11,11a- 헥사히드로 -5H- 피롤로 [2,1-c][1,4]-벤조디아제핀-5,11- 디온 ]( 6a )
TBAF(THF 중 5.24 ㎖의 1.0 M 용액, 5.24 mmol)의 용액을 상온에서 THF(40 ㎖) 중 비스-실릴 에테르 5a(2.58 g, 2.38 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 3.5 시간 동안 교반한 후, TLC(95:5 v/v CHCl3/MeOH)에 의한 반응 혼합물의 분석으로 반응의 완결이 드러났다. 반응 혼합물을 포화 NH4Cl의 용액(100 ㎖)에 붓고, EtOAc(3×30 ㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 식염수(60 ㎖)로 세척하고, 건조시키고(MgSO4), 여과하고, 진공에서 증발시켜 미정제 생성물을 얻었다. 플래쉬 크로마토그래피(구배 용리: 100% CHCl3에서 96:4 v/v CHCl3/MeOH)에 의한 정제로 순수한 테트라락탐 6a를 백색 폼으로서 얻었다(1.78 g, 87%).
분석 데이터: [α]23 D = +202°(c = 0.34, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.28 (s, 2H), 7.20 (s, 2H), 5.44 (d, 2H, J = 10.0 Hz), 4.72 (d, 2H, J = 10.0 Hz), 4.61-4.58 (m, 2H), 4.25 (t, 4H, J = 5.83 Hz), 4.20-4.16 (m, 2H), 3.91-3.85 (m, 8H), 3.77-3.54 (m, 6H), 3.01 (br s, 2H, OH), 2.96-2.90 (m, 2H), 2.38 (p, 2H, J = 5.77 Hz), 2.11-2.05 (m, 2H), 1.00-0.91 (m, 4H), 0.00 (s, 18H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 169.5, 165.9, 151.3, 147.4, 133.7, 121.5, 111.6, 106.9, 79.4, 69.3, 67.2, 65.2, 56.5, 56.2, 54.1, 35.2, 29.1, 18.4, -1.23; IR (ATR, CHCl3) 2956, 1684, 1625, 1604, 1518, 1464, 1434, 1361, 1238, 1058, 1021 cm-1; MS (ES+) m/z (상대적인 세기) 885 ([M + 29]+., 70), 857 ([M + H]+., 100), 711 (8), 448 (17); HRMS [M + H]+. 이론치 C41H60N4O12Si2 m/z 857.3819, 실측치 (ES+) m/z 857.3826.
(e) 1,1'-[[(펜탄-1,5- 디일 ) 디옥시 ] 비스 (11 aS ,2R)-2-히드록시-7- 메톡시 -10-((2-(트 리메틸 실릴) 에톡시 ) 메틸 )-1,2,3,10,11,11a- 헥사히드로 -5H- 피롤로 [2,1-c][1,4]-벤조디아제핀-5,11- 디온 ]( 6b )
상기 방법에 따라 5b로부터 제조하여 생성물을 백색 폼으로서 얻었다(15.02 g).
분석 데이터: MS (ES+) m/z (상대적인 세기) 886 ([M + H]+., 10), 739.6 (100), (ES-) m/z (상대적인 세기) 884 ([M - H]-., 40).
(f) 1,1'-[[(프로판-1,3- 디일 ) 디옥시 ] 비스 [(11 aS )-11- 설포 -7- 메톡시 -2-옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)1,2,3,10,11,11a-헥사히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11-디온]](7a)
방법 A: 0.37 M 차아염소산나트륨 용액(142.5 ㎖, 52.71 mmol, 2.4 당량)을 0℃에서 DCM(115 ㎖) 중 디올 6a(18.8 g, 21.96 mmol, 1 당량), TEMPO(0.069 g, 0.44 mmol, 0.02 당량) 및 0.5 M 브롬화칼륨 용액(8.9 ㎖, 4.4 mmol, 0.2 당량)의 격렬하게 교반된 혼합물에 적가하였다. 첨가 속도를 조정하여 온도를 0 내지 5℃로 유지시켰다. 생성된 황색 에멀션을 1 시간 동안 0 내지 5℃에서 교반하였다. TLC(EtOAc) 및 LC/MS[3.53 분. (ES+) m/z (상대적인 세기) 875 ([M + Na]+., 50), (ES-) m/z (상대적인 세기) 852 ([M + H]-., 100)]가 반응이 완결되었음을 나타내었다.
반응 혼합물을 여과하고, 분리된 유기층 및 수층을 DCM(×2)으로 역류 세척하였다. 화합한 유기 물질 부분을 식염수(×1)로 세척하고, 건조시키고(MgSO4), 증발시켜 황색 폼을 얻었다. 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(구배 용리 35/65 v/v n-헥산/EtOAC, 30/70에서 25/75 v/v n-헥산/EtOAC)에 의한 정제로 비스-케톤 7a를 백색 폼으로서 얻었다(14.1 g, 75%).
차아염소산나트륨 용액(시약 등급, 염소 10 내지 13%로서 입수 가능)을 사용하였다. 이는 10%(100 g 중 10 g NaClO)로 추정되었고, NaClO 중 1.34 M로 계산되었다. 이를 물로 0.37 M로 희석하여 이로부터 모액(stock solution)을 제조하였다. 이로써 약 pH 14의 용액이 얻어졌다. 고상 NaHCO3을 첨가하여 pH를 9.3 내지 9.4로 조정하였다. 그 다음, 분취량(aliquot)의 이 모액을 사용하여 반응을 위해 2.4 mol 당량을 제공하였다.
표백액을 첨가하자 온도의 초기 증가가 관찰되었다. 첨가 속도를 조절하여 온도를 0 내지 5℃로 유지시켰다. 반응 혼합물은 진한, 레몬색의 에멀션을 형성하였다.
산화는 문헌(Thomas Fey et al, J. Org . Chem ., 2001, 66, 8154-8159)에 기재된 과정의 변형이었다.
방법 B: 고상 TCCA(10.6 g, 45.6 mmol)를 0℃(얼음/아세톤)에서 무수 DCM(700 ㎖) 중 알코올 6a(18.05 g, 21.1 mmol) 및 TEMPO(123 mg, 0.78 mmol)의 교반된 용액에 일부씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 15 분 동안 질소 분위기 하에서 0℃에서 교반하고, 그 시간 후 TLC(EtOAc) 및 LC/MS[3.57 분 (ES+) m/z (상대적인 세기) 875 ([M + Na]+., 50)]는 반응의 완결을 드러냈다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 여액을 포화 NaHCO3 수용액(400 ㎖), 식염수(400 ㎖)로 세척하고, 건조시키고(MgSO4), 여과하고 진공에서 증발시켜 미정제 생성물을 얻었다. 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(80:20 v/v EtOAc/헥산)에 의한 정제로 비스-케톤 7a를 폼으로서 얻었다(11.7 g, 65%).
방법 C: 무수 DCM(18 ㎖) 중 무수 DMSO(0.72 ㎖, 0.84 g, 10.5 mmol)의 용액을 -60℃(액상 N2/CHCl3)에서 질소 분위기 하에서 염화옥살일의 교반된 용액(DCM 중 2.63 ㎖의 2.0 M 용액, 5.26 mmol)에 25 분의 기간에 걸쳐 적가하였다. 20 분 동안 -55℃에서 교반한 후, 무수 DCM(36 ㎖) 중 기질 6a(1.5 g, 1.75 mmol)의 슬러리를 반응 혼합물에 30 분의 기간에 걸쳐 첨가하였다. -55℃에서 추가 50 분 동안 교반한 후, 무수 DCM(18 ㎖) 중 TEA(3.42 ㎖, 2.49 g; 24.6 mmol)의 용액을 반응 혼합물에 20 분의 기간에 걸쳐 적가하였다. 교반된 반응 혼합물을 상온(~1.5 시간)으로 승온시킨 후, DCM(50 ㎖)으로 희석하였다. 유기 용액을 1 N HCl(2×25 ㎖), H2O(30 ㎖), 식염수(30 ㎖)로 세척하고, 건조시켰다(MgSO4). 여과하고 용매를 진공에서 증발시켜 미정제 생성물을 얻었고, 이를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(80:20 v/v EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 비스-케톤 7a를 폼으로서 얻었다(835 mg, 56%).
분석 데이터: [α]20 D = +291°(c = 0.26, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.32 (s, 2H), 7.25 (s, 2H), 5.50 (d, 2H, J = 10.1 Hz), 4.75 (d, 2H, J = 10.1 Hz), 4.60 (dd, 2H, J = 9.85, 3.07 Hz), 4.31-4.18 (m, 6H), 3.89-3.84 (m, 8H), 3.78-3.62 (m, 4H), 3.55 (dd, 2H, J = 19.2, 2.85 Hz), 2.76 (dd, 2H, J = 19.2, 9.90 Hz), 2.42 (p, 2H, J = 5.77 Hz), 0.98-0.91 (m, 4H), 0.00 (s, 18H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 206.8, 168.8, 165.9, 151.8, 148.0, 133.9, 120.9, 111.6, 107.2, 78.2, 67.3, 65.6, 56.3, 54.9, 52.4, 37.4, 29.0, 18.4, -1.24; IR (ATR, CHCl3) 2957, 1763, 1685, 1644, 1606, 1516, 1457, 1434, 1360, 1247, 1209, 1098, 1066, 1023 cm-1; MS (ES+) m/z (상대적인 세기) 881 ([M + 29]+., 38), 853 ([M + H]+., 100), 707 (8), 542 (12); HRMS [M + H]+. 이론치 C41H56N4O12Si2 m/z 853.3506, 실측치 (ES+) m/z 853.3502.
(f) 1,1'-[[(펜탄-1,5- 디일 ) 디옥시 ] 비스 [(11 aS )-11- 설포 -7- 메톡시 -2-옥소-10-((2-(트 리 메틸실릴) 에톡시 ) 메틸 )1,2,3,10,11,11a- 헥사히드로 -5H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -5,11- 디온 ]]( 7b )
방법 C에 따라 6b로부터 제조하여 생성물을 백색 폼으로서 얻었다(10.5 g, 76%).
분석 데이터: MS (ES+) m/z (상대적인 세기) 882 ([M + H]+., 30), 735 (100), (ES-) m/z (상대적인 세기) 925 ([M + 45]-., 100), 880 ([M - H]-., 70).
(g) 1,1'-[[(프로판-1,3- 디일 ) 디옥시 ] 비스 (11 aS )-7- 메톡시 -2-[[( 트리플루오 로메틸) 설포닐 ] 옥시 ]-10-((2-( 트리메틸실릴 ) 에톡시 ) 메틸 )-1,10,11,11a- 테트라히드로 -5H- 피롤로 [2,1-c][1,4]-벤조디아제핀-5,11- 디온 ]( 8a )
무수 2,6-루티딘(5.15 ㎖, 4.74 g, 44.2 mmol)을 질소 분위기 하에서 -45℃(드라이 아이스/아세토니트릴 냉각조)에서 무수 DCM(180 ㎖) 중 비스-케톤 7a(6.08 g, 7.1 mmol)의 격렬하게 교반된 용액에 일부분씩 주입하였다. 온도를 -40℃ 이하로 유지시키면서 새롭게 개봉된 앰플로부터 취한 무수 트리플산 무수물(7.2 ㎖, 12.08 g, 42.8 mmol)을 빠르게 적가 주입하였다. 반응 혼합물을 1 시간 동안 -45℃에서 교반시켰고, 이 시점에서 TLC(50/50 v/v n-헥산/EtOAc)는 출발 물질의 완전한 소비를 나타내었다. 냉 반응 혼합물을 DCM(200 ㎖)으로 즉시 희석시키고, 격렬하게 진탕시키면서 물(1×100 ㎖), 5% 시트르산 용액(1×200 ㎖), 포화 NaHCO3(200 ㎖), 식염수(100 ㎖)로 세척하고, 건조시켰다(MgSO4). 여과하고 용매를 진공에서 증발시켜 미정제 생성물을 얻었고, 이를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(구배 용리: 90:10 v/v n-헥산/EtOAc에서 70:30 v/v n-헥산/EtOAc)에 의해 정제하여 비스-에놀 트리플레이트 8a를 황색 폼으로서 얻었다(5.5 g, 70%).
분석 데이터: [α]24 D = +271°(c = 0.18, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.33 (s, 2H), 7.26 (s, 2H), 7.14 (t, 2H, J = 1.97 Hz), 5.51 (d, 2H, J = 10.1 Hz), 4.76 (d, 2H, J = 10.1 Hz), 4.62 (dd, 2H, J = 11.0, 3.69 Hz), 4.32-4.23 (m, 4H), 3.94-3.90 (m, 8H), 3.81-3.64 (m, 4H), 3.16 (ddd, 2H, J = 16.3, 11.0, 2.36 Hz), 2.43 (p, 2H, J = 5.85 Hz), 1.23-0.92 (m, 4H), 0.02 (s, 18H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 167.1, 162.7, 151.9, 148.0, 138.4, 133.6, 120.2, 118.8, 111.9, 107.4, 78.6, 67.5, 65.6, 56.7, 56.3, 30.8, 29.0, 18.4, -1.25; IR (ATR, CHCl3) 2958, 1690, 1646, 1605, 1517, 1456, 1428, 1360, 1327, 1207, 1136, 1096, 1060, 1022, 938, 913 cm-1; MS (ES+) m/z (상대적인 세기) 1144 ([M + 28]+., 100), 1117 ([M + H]+., 48), 1041 (40), 578 (8); HRMS [M + H]+. 이론치 C43H54N4O16Si2S2F6 m/z 1117.2491, 실측치 (ES+) m/z 1117.2465.
(g) 1,1'-[[(펜탄-1,5- 디일 ) 디옥시 ] 비스 (11 aS )-7- 메톡시 -2-[[( 트리플루오로메틸)설포닐]옥시]-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-1,10,11,11a-테트라히드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]-벤조디아제핀-5,11-디온](8b)
상기 방법에 따라 7b로부터 제조하여 비스-에놀 트리플레이트를 옅은 황색 폼으로서 얻었다(6.14 g, 82%).
분석 데이터: (ES+) m/z (상대적인 세기) 1146 ([M + H]+., 85).
실시예 1
Figure pct00084

(a) (S)-2-(4- 아미노페닐 )-7- 메톡시 -8-(3-((S)-7- 메톡시 -2-( 트리플루오로메틸설포닐 )-5,11- 디옥소 -10-((2-( 트리메틸실릴 ) 에톡시 ) 메틸 )-5,10,11,11a- 테트라히 드로-1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -8- 일옥시 ) 프로폭시 )-10-((2-( 트리메틸실릴 ) 에톡시 ) 메틸 )-1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -5,11(10H,11 aH )- 디온 ( 9 )
고상 Pd(PPh3)4(20.18 mg, 17.46 mmol)를 톨루엔(13 ㎖), EtOH(6.5 ㎖) 및 H2O(6.5 ㎖) 중 트리플레이트 8a(975 mg, 0.87 mmol), 4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보랄란-2-일)아닐린(172 mg, 0.79 mmol) 및 Na2CO3(138 mg, 3.98 mol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 암색 용액을 24 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반시켰고, 이 시점 이후 TLC(EtOAc) 및 LC/MS에 의한 분석은 소정의 모노 커플링 생성물의 형성 뿐 아니라 미반응 출발 물질의 존재도 나타내었다. 감압 하에서 회전 증발에 의해 용매를 제거하고, 생성된 잔류물을 H2O(100 ㎖)와 EtOAc(100 ㎖) 간에 분배하고, 층의 최종적인 분리 후, 수상을 EtOAc(2×25 ㎖)로 재차 추출하였다. 화합한 유기층을 H2O(50 ㎖), 식염수(60 ㎖)로 세척하고, 건조시키고(MgSO4), 여과하고 진공에서 증발시켜 미정제 스즈키 생성물을 얻었다. 미정제 스즈키 생성물을 플래쉬 크로마토그래피(40% EtOAc/60% 헥산→70% EtOAc, 30% 헥산) 처리하였다. 감압 하에서 회전 증발에 의해 과량의 용리액을 제거하여 소정의 생성물 9(399 mg)을 43% 수율로 얻었다.
1H-NMR: (CDCl3, 400 MHz) δ 7.40 (s, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.27 (bs, 3H), 7.24 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.15 (t, 1H, J = 2.0 Hz), 6.66 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 5.52 (d, 2H, J = 10.0 Hz), 4.77 (d, 1H, J = 10.0 Hz), 4.76 (d, 1H, J = 10.0 Hz), 4.62 (dd, 1H, J = 3.7, 11.0 Hz), 4.58 (dd, 1H, J = 3.4, 10.6 Hz), 4.29 (t, 4H, J = 5.6 Hz), 4.00-3.85 (m, 8H), 3.80-3.60 (m, 4H), 3.16 (ddd, 1H, J = 2.4, 11.0, 16.3 Hz), 3.11 (ddd, 1H, J = 2.2, 10.5, 16.1 Hz), 2.43 (p, 2H, J = 5.9 Hz), 1.1-0.9 (m, 4H), 0.2 (s, 18H). 13C-NMR: (CDCl3, 100 MHz) δ 169.8, 168.3, 164.0, 162.7, 153.3, 152.6, 149.28, 149.0, 147.6, 139.6, 134.8, 134.5, 127.9 (메틴), 127.5, 125.1, 123.21, 121.5, 120.5 (메틴), 120.1 (메틴), 116.4 (메틴), 113.2 (메틴), 108.7 (메틴), 79.8 (메틸렌), 79.6 (메틸렌), 68.7 (메틸렌), 68.5 (메틸렌), 67.0 (메틸렌), 66.8 (메틸렌), 58.8 (메틴), 58.0 (메틴), 57.6 (메톡시), 32.8 (메틸렌), 32.0 (메틸렌), 30.3 (메틸렌), 19.7 (메틸렌), 0.25 (메틸).
(b) (S)-2-(4- 아미노페닐 )-7- 메톡시 -8-(3-((S)-7- 메톡시 -2-(4- 메톡시페닐 )-5,11-디옥소-10-((2-( 트리메틸실릴 ) 에톡시 ) 메틸 )-5,10,11,11a- 테트라히드로 -1H- 피 롤로[ 2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -8- 일옥시 ) 프로폭시 )-10-((2-( 트리메틸실릴 ) 에톡시 )메틸)-1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -5,11(10H,11 aH )- 디온 ( 10 )
고상 Pd(PPh3)4(10 mg, 8.69 μmol)를 상온에서 H2O(1.5 ㎖) 중 4-메톡시페닐 붕산(43 mg, 0.28 mmol), Na2CO3(37 mg, 0.35 mmol)과 함께 톨루엔(3 ㎖), EtOH(10 ㎖) 중 모노-트리플레이트 9(230 mg, 0.22 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 20 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반시켰고, 이 시점에서 LC/MS 및 TLC(EtOAc)로 판단시 반응이 완결된 것으로 간주되었다. 진공에서 감압 하에 회전 증발에 의해 용매를 제거하고, 생성된 잔류물을 EtOAc(75 ㎖)와 H2O(75 ㎖) 간에 분배하였다. 수상을 EtOAc(3×30 ㎖)로 추출하고, 화합한 유기층을 H2O(30 ㎖), 식염수(40 ㎖)로 세척하고, 건조시키고(MgSO4), 여과하고 증발시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 플래쉬 크로마토그래피(60% 헥산:40% EtOAc → 80% EtOAc:20% 헥산)에 의해 정제하여 순수한 이량체를 오렌지색 폼으로서 얻었다. 감압 하에서 과량의 용리액을 제거하여 소정의 생성물 10(434 mg)을 74% 수율로 얻었다.
1H-NMR: (CDCl3, 400 MHz) δ 7.38 (s, 2H), 7.34 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 7.30 (bs, 1H), 7.26-7.24 (m, 3H), 7.22 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 6.86 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.63 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 5.50 (d, 2H, J = 10.0 Hz), 4.75 (d, 1H, J = 10.0 Hz), 4.74 (d, 1H, J = 10.0 Hz), 4.56 (td, 2 H, J = 3.3, 10.1 Hz), 4.27 (t, 2H, J = 5.7 Hz), 4.00-3.85 (m, 8H), 3.80 (s, 3H), 3.77-3.60 (m, 4H), 3.20-3.00 (m, 2H), 2.42 (p, 2H, J = 5.7 Hz), 0.96 (t, 4H, J = 8.3 Hz), 0.00 (s, 18H). 13C-NMR: (CDCl3, 100 MHz) δ 169.8, 169.7, 162.9, 162.7, 160.6, 152.7, 152.6, 149.0, 147.5, 134.8, 127.8 (메틴), 127.4, 126.8, 125.1, 123.1, 123.0, 121.5 (메틴), 120.4 (메틴), 116.4 (메틴), 115.5 (메틴), 113.1 (메틴), 108.6 (메틴), 79.6 (메틸렌), 68.5 (메틸렌), 66.9 (메틸렌), 58.8 (메틴), 57.6 (메톡시), 56.7 (메톡시), 32.8 (메틸렌), 30.3 (메틸렌), 19.7 (메틸렌), 0.0 (메틸).
(c) (S)-2-(4- 아미노페닐 )-7- 메톡시 -8-(3-((S)-7- 메톡시 -2-(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-5,11a- 디히드로 -1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -8- 일옥시 ) 프로폭시 )-1H-피 롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제 핀-5(11 aH )-온( 11 )
신선한 LiBH4(183 mg, 8.42 mmol)를 상온에서 THF(5 ㎖) 및 EtOH(5 ㎖) 중 SEM-디락탐 10(428 mg, 0.42 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 10 분 후, 지연된 격렬한 비등이 관찰되었는데, 이에 따라 반응 용기를 빙조에 넣을 필요가 있었다. 빙조 제거 후, 혼합물을 1 시간 동안 상온에서 교반시켰다. 이 시점에서의 LC/MS 분석은 매우 적은 단일-환원된(mono-reduced) 생성물과 함께 출발 물질의 완전한 소비를 나타냈다. 반응 혼합물을 얼음(100 ㎖)에 붓고, 교반하면서 상온으로 승온시켰다. 수성 혼합물을 DCM(3×30 ㎖)으로 추출하고, 화합한 유기층을 H2O(20 ㎖), 식염수(30 ㎖)으로 세척하고, 진공에서 농축시켰다. 생성된 잔류물을 DCM(5 ㎖), EtOH(14 ㎖), H2O(7 ㎖) 및 실리카 겔(10 g)로 처리하였다. 점성 혼합물을 3 일 동안 상온에서 교반시켰다. 혼합물을 소결 깔때기를 통해 천천히 여과하고, UV 활성이 용리액으로부터 완전히 사라질 때까지 실리카 잔류물을 90% CHCl3:10% MeOH(~250 ㎖)로 세척하였다. 유기상을 H2O(50 ㎖), 식염수(60 ㎖)로 세척하고, 건조시키고(MgSO4), 여과하고 진공에서 증발시켜 미정제 물질을 얻었다. 미정제 생성물을 플래쉬 크로마토그래피(97% CHCl3:3% MeOH)에 의해 정제하여 순수한 C2/C2'아릴 PBD 이량체 11(185 mg)를 61% 수율로 얻었다.
1H-NMR: (CDCl3, 400 MHz) δ 7.88 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 7.87 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 7.52 (s, 2H), 7.39 (bs, 1H), 7.37-7.28 (m, 3H), 7.20 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 6.89 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.87 (s, 1H), 6.86 (s, 1H), 6.67 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 4.40-4.20 (m, 6H), 3.94 (s, 6H), 3.82 (s, 3H), 3.61-3.50 (m, 2H), 3.40-3.30 (m, 2H), 2.47-2.40 (m, 2H). 13C-NMR: (CDCl3, 100 MHz) δ 162.5 (이민 메틴), 161.3, 161.1, 159.3, 156.0, 151.1, 148.1, 146.2, 140.3, 126.2 (메틴), 123.2, 122.0, 120.5 (메틴), 119.4, 115.2 (메틴), 114.3 (메틴), 111.9 (메틴), 111.2 (메틴), 65.5 (메틸렌), 56.2 (메톡시), 55.4 (메톡시), 53.9 (메틴), 35.6 (메틸렌), 28.9 (메틸렌).
실시예 2
Figure pct00085

(a) (S)-2-(4- 아미노페닐 )-7- 메톡시 -8-(5-((S)-7- 메톡시 -2-(4- 메톡시페닐 )-5,11-디옥소-10-((2-( 트리메틸실릴 ) 에톡시 ) 메틸 )-5,10,11,11a- 테트라히드로 -1H-피롤로[ 2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -8- 일옥시 ) 펜틸옥시 )-10-((2-( 트리메틸실릴 ) 에톡시 )메틸)-1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -5,11(10H,11 aH )- 디온 ( 12 )
고상 Pd(PPh3)4(32 mg, 27.7 μmol)를 30℃에서 H2O(5 ㎖) 중 4-메톡시페닐 붕산(0.202 g, 1.32 mmol), Na2CO3(0.169 g, 1.6 mmol)과 함께 톨루엔(10 ㎖), EtOH(5 ㎖) 중 비스-트리플레이트 8b(1.04 g, 0.91 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 20 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반시켰다. 추가의 고상 4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보랄란-2-일)아닐린(0.203 g, 0.93 mmol) 및 Na2CO3(0.056 g, 0.53 mmol)을 첨가한 후, 고상 Pd(PPh3)4(10 mg, 8.6 μmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 추가 20 시간 동안 질소 분위기 하에서 교반시켰다. LC/MS는 소정 생성물의 형성을 나타내었다. EtOAc(100 ㎖) 및 H2O(100 ㎖)를 첨가하고, 수상을 분리하고, EtOAc(3×30 ㎖)로 추출하였다. 화합한 유기층을 H2O(100 ㎖), 식염수(100 ㎖)로 세척하고, 건조시키고(MgSO4), 여과하고 증발시켜 암갈색 오일을 얻었다. 상기 오일을 DCM에 용해시키고, DCM(1 부피)으로 예비 평형화된 10 g SCX-2 카트리지에 로딩하였다. 카트리지를 DCM(3 부피), MeOH(3 부피)로 세척하고, 미정제 생성물을 MeOH(2 부피) 중 2M NH3로 용리시켰다. 플래쉬 크로마토그래피(50% n-헥산:50% EtOAc→ 20% n-헥산:80% EtOAc)로 순수한 이량체 12를 황색 폼으로서 얻었다(0.16 g, 34%).
분석 데이터: [α]23 D = +388°(c = 0.22, CHCl3); 1H-NMR: (CDCl3, 400 MHz) δ 7.39 (s, 2H), 7.35 (d, 2H, J = 12.8 Hz), 7.32 (bs, 1H), 7.26-7.23 (m, 5H), 6.89 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.66 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 5.55 (d, 2H, J = 10.0 Hz), 4.73 (d, 1H, J = 10.0 Hz), 4.72 (d, 1H, J = 10.0 Hz), 4.62 (td, 2 H, J = 3.2, 10.4 Hz), 4.15-4.05 (m, 4H), 4.00-3.85 (m, 8H), 3.82 (s, 3H), 3.77-3.63 (m, 4H), 3.20-3.05 (m, 2H), 2.05-1.95 (m, 4H), 1.75-1.67 (m, 2H) 1.01-0.95 (m, 4H), 0.03 (s, 18H); MS (ES+) m/z (상대적인 세기) 1047 ([M + H]+., 45).
(b) (S)-2-(4- 아미노페닐 )-7- 메톡시 -8-(5-((S)-7- 메톡시 -2-(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-5,11a- 디히드로 -1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -8- 일옥시 ) 펜틸옥시 )-1H-피 롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제 핀-5(11 aH )-온( 13 )
신선한 LiBH4(66 mg, 3.04 mmol)를 0℃(빙조)에서 THF(3 ㎖) 및 EtOH(3 ㎖) 중 SEM-디락탐 12(428 mg, 0.42 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 빙조를 제거하고, 반응 혼합물을 상온에 이르게 하였다(격렬한 비등). 2 시간 후, LC/MS 분석은 출발 물질의 완전한 소비를 나타내었다. 반응 혼합물을 얼음(50 ㎖)에 붓고, 교반하면서 상온으로 승온시켰다. 수성 혼합물을 DCM(3×50 ㎖)으로 추출하고, 화합한 유기층을 H2O(50 ㎖), 식염수(50 ㎖)로 세척하고, 건조시키고(MgSO4), 진공에서 농축시켰다. 생성된 잔류물을 DCM(2 ㎖), EtOH(5 ㎖), H2O(2.5 ㎖) 및 실리카 겔(3.7 g)로 처리하였다. 점성 혼합물을 3 일 동안 상온에서 교반시켰다. 혼합물을 소결 깔때기를 통해 여과하고, UV 활성이 용리액으로부터 완전히 사라질 때까지 실리카 잔류물을 90% CHCl3:10% MeOH(~250 ㎖)로 세척하였다. 유기상을 건조시키고(MgSO4), 여과하고 진공에서 증발시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 플래쉬 크로마토그래피(0.5%씩 증가시키면서 99.5% CHCl3:0.5% MeOH에서 97.5% CHCl3:2.5% MeOH)에 의해 정제하여 순수한 C2/C2'아릴 PBD 이량체 13을 얻었다(59 mg, 52%).
분석 데이터: [α]28 D = +760°(c = 0.14, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.89 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 7.87 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 7.52 (s, 2H), 7.39 (bs, 1H), 7.37-7.28 (m, 3H), 7.22 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 6.91 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.815 (s, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.68 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 4.45-4.35 (m, 2H), 4.2-4.0 (m, 4H), 3.94 (s, 6H), 3.85-3.7 (s, 3H), 3.65-3.50 (m, 2H), 3.45-3.3 (m, 2H), 2.05-1.9 (m, 4H), 1.75-1.65 (m, 2H); MS (ES+) (상대적인 세기) 754.6 ([M + H]+., 100), (ES-) (상대적인 세기) 752.5 ([M - H]-., 100).
실시예 3
Figure pct00086

(a) (S)-2-(티엔-2-일)-7- 메톡시 -8-(3-((S)-7- 메톡시 -2-( 트리플루오로메탄설포닐옥시 )-5,11- 디옥소 -10-((2-( 트리메틸실릴 ) 에톡시 ) 메틸 )-5,10,11,11a- 테트라히 드로-1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -8- 일옥시 ) 프로필옥시 )-10-((2-( 트리메틸실릴 ) 에톡시 ) 메틸 )-1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -5,11(10H,11 aH )- 디온 ( 14 )
고상 Pd(PPh3 )4(41 mg, 0.036 mmol)를 H2O(5 ㎖) 중 티엔-2-일 붕산(149 mg, 1.16 mmol), Na2CO3(152 mg, 1.43 mmol)과 함께 톨루엔(10 ㎖), EtOH(5 ㎖) 중 비스-트리플레이트 8a(1 g, 0.9 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 하룻밤 동안 질소 분위기 하에서 교반시켰다. 용매를 진공에서 증발에 의해 제거하고, 생성된 잔류물을 H2O(100 ㎖)와 EtOAc(100 ㎖) 간에 분배하였다. 수층을 EtOAc(2×30 ㎖)로 추출하고, 화합한 유기층을 H2O(50 ㎖), 식염수(50 ㎖)로 세척하고, 건조시키고(MgSO4), 여과하고 진공에서 증발시켜 미정제 생성물을 얻었고, 이를 플래쉬 크로마토그래피(80 헥산:20 EtOAc→ 50 헥산:50 EtOAc)에 의해 정제하여 이량체 14(188 mg)를 20% 수율로 얻었다.
분석 데이터: LC-MS RT 4.27 분, 1051 (M + H); 1H-NMR (400 MHZ, CDCl3) δ 7.36 (s, 1H), 7.31 (bs, 1H), 7.27 (bs, 1H), 7.26-7.23 (m, 2H), 7.22-7.17 (m, 1H), 7.12 (bs, 1H), 7.02-6.96 (m, 2H), 5.50 (d, J = 10.0 Hz, 2H), 7.75 (d, J = 10.0 Hz, 2H), 4.65-4.55 (m, 2H), 4.37-4.13 (m, 4H), 4.00-3.85 (m, 8H), 3.8-3.6 (m, 4H), 3.20-3.10 (m, 2H), 2.50-2.35 (m, 2H), 1.0-0.9 (m, 4H), 0 (s, 18H).
(b) (S)-2-(티엔-2-일)-7- 메톡시 -8-(3-((S)-7- 메톡시 -2-( 트리플루오로메탄설포닐옥시 )-5,11- 디옥소 -10-((2-( 트리메틸실릴 ) 에톡시 ) 메틸 )-5,10,11,11a- 테트라히 드로-1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -8- 일옥시 ) 펜틸옥시 )-10-((2-( 트리메틸실릴 ) 에톡시 ) 메틸 )-1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -5,11(10H,11 aH )- 디온 ( 15 )
고상 Pd(PPh3)4(7.66 mg, 6.63 μmol)를 상온에서 톨루엔(2-5 ㎖), EtOH(1.25 ㎖) 및 H2O(125 ㎖) 중 14(174 mg, 0.17 mmol), Na2CO3(28 mg, 0.22 mmol) 및 4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보랄란-2-일)아닐린(47 mg, 0.22 mmol)의 교반된 흐린 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 24 시간 동안 N2 분위기 하에서 교반시켰고, 이 시점에서 LC/MS 주요 피크(@ 3.97 분, FW= 1016, M+Na) 및 TLC(EtOAc)에 의해 반응이 완결된 것으로 간주되었다. 용매를 진공에서 증발에 의해 제거하고, 생성된 잔류물을 EtOAc(60 ㎖)와 H2O(30 ㎖) 간에 분배하였다. 층을 분리하고, 유기상을 H2O(20 ㎖), 식염수(30 ㎖)로 세척하고, 건조시키고(MgSO4), 여과하고 진공에서 증발시켜 미정제 생성물 123 mg을 75% 수율로 얻었다.
분석 데이터: LC-MS RT 3.98 분, 100% 면적, 994 (M + H); 1H-NMR (400 MHZ, CDCl3) δ 7.40 (d, J = 5.3 Hz, 2H), 7.30 (t, J =1.70 Hz, 1H), 7.29-7.27 (m, 3H), 7.25 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.21 (dd, J = 1.4, 4.73 Hz, 1H), 7.03-6.97 (m, 2H), 6.66 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.52 (d, J = 10.0 Hz, 2H), 4.78 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.77 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.62 (dd, J = 3.4, 10.5 Hz, 1H), 4.59 (dd, J = 3.40, 10.6 Hz, 1H), 4.30 (t, J = 5.85 Hz, 4H), 3.85-4.03 (m, 8H), 3.84-3.64 (m, 6H), 3.18 (ddd, J = 2.2, 10.5, 16.0 Hz, 1H), 3.11 (ddd, J = 2.2, 10.5, 16.0 Hz, 1H), 2.44 (p, J = 5.85 Hz, 2H), 0.98 (t, J = 1.5 Hz, 4H), 0 (s, 18H).
(c) (S)-2-(티엔-2-일)-7- 메톡시 -8-(3-((S)-7- 메톡시 -2-(4- 아미노페닐 )-5-옥소-5,11a- 디히드로 -1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -8- 일옥시 ) 프로필옥시 )-1H-피롤로[ 2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -5(11 aH )-온( 16 )
신선한 LiBH4(47 mg, 2,22 mmol)를 0℃(빙조)에서 무수 THF(3 ㎖) 및 EtOH(3 ㎖) 중 SEM-디락탐 15(110 mg, 0.11 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 빙조를 제거하고, 반응 혼합물을 1 시간 동안 N2 분위기 하에서 교반하였다. LC/MS 분석에 의한 반응의 분석은 소정 생성물(Pk @ 2.57 분)(I=69.32, FW= 702, M+H) 및 하프이민(half-imine)의 유의적인 형성을 나타냈다. 반응 혼합물을 추가 1 시간 동안 교반시켰고, 이 시간 후에는 LC/MS에 의해 추가의 반응 진행이 관찰되지 않았다. 반응 혼합물을 얼음에 붓고, 교반하고, 상온으로 승온시켰다. DCM(50 ㎖)과 물(50 ㎖) 간에 분배한 후, 수상을 DCM(3×20 ㎖)으로 추출하였다. 화합한 유기층을 H2O(50 ㎖), 식염수(50 ㎖)로 세척하고, 용매를 감압 하에서 진공에서 증발시켜 제거하였다.
생성된 잔류물을 DCM(5 ㎖), EtOH(15 ㎖) 및 H2O(7 ㎖)에 용해시킨 후, 실리카 겔(5 g)로 처리하였다. 반응물을 48 시간 동안 상온에서 교반시켰다. 실리카를 소결 깔때기를 통해 여과시켜 제거하고, 잔류물을 90:10 CHCl3:MeOH(100 ㎖)로 헹구었다. H2O(50 ㎖)를 여액에 첨가하고, (진탕 후) 층을 분리하였다. 수층을 CHCl3(2×30 ㎖)로 추출하고, H2O(50 ㎖), 식염수(50 ㎖)로 세척하고, 건조시키고(MgSO4), 여과하고 진공에서 증발시켜 미정제 생성물을 얻었다. 플래쉬 크로마토그래피(CHCl3→ 98% CHCl3:2% MeOH)로 생성물을 얻었다(41 mg, 53%).
분석 데이터: LC-MS RT 2.55 분, 702 (M + H)
실시예 4
Figure pct00087

(a) (S)-2-(4- 메톡시페닐 )-7- 메톡시 -8-(3-((S)-7- 메톡시 -2-( 트리플루오로메틸설포닐 )-5,11- 디옥소 -10-((2-( 트리메틸실릴 ) 에톡시 ) 메틸 )-5,10,11,11a- 테트라히 드로-1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -8- 일옥시 ) 프로필옥시 )-10-((2-( 트리메틸실릴 ) 에톡시 ) 메틸 )-1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -5,11(10H,11 aH )- 디온 ( 17 )
고상 4-메톡시벤젠붕산(0.388 g, 2.55 mmol)을 톨루엔(54.8 ㎖), 에탄올(27 ㎖) 및 물(27 ㎖) 중 SEM 보호된 비스 트리플레이트(8a)(3.0 g, 2.69 mmol), 탄산나트륨(426 mg, 4.02 mmol) 및 팔라듐 테트라키스 트리페닐포스핀(0.08 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 3 시간 동안 상온에서 교반시켰다. 그 다음, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트와 물 간에 분배하였다. 유기층을 물 및 식염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 과량의 용매를 감압 하에서 회전 증발에 의해 제거하고, 생성된 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; 구배 용리 EtOAc/헥산 30/70→35/65→40/60→45/55)하여 미반응 비스-트리플레이트(0.6 g)를 제거하였다. 선택된 분획으로부터 과량의 용리액을 제거하여 4-메톡시페닐 커플링된 생성물을 얻었다(1.27 g, 1.18 mmol, 41%).
LC-MS RT 4.30 분, 1076 (M + H); 1H-NMR (400 MHZ, CDCl3) δ 7.41 (s, 1H), 7.39 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.35 (s, 1H), 7.34 (bs, 1H), 7.29 (s, 1H), 7.16 (t, J = 1.9 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.53 (d, J = 10.0 Hz, 2H), 4.79 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.78 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.66-4.60 (m, 2H), 4.30 (t, J = 5.7 Hz, 4H), 4.0-3.94 (m, 2H), 3.93 (s, 3H), 3.92 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.83-3.60 (m, 4H), 3.22-3.10 (m, 2H), 2.45 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 1.05-0.94 (m, 4H), 0 (s, 18H).
(b) (S)-2-(3- 아미노페닐 )-7- 메톡시 -8-(3-((S)-7- 메톡시 -2-(4- 메톡시페닐 )-5,11-디옥소-10-((2-( 트리메틸실릴 ) 에톡시 ) 메틸 )-5,10,11,11a- 테트라히드로 -1H- 피 롤로[ 2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -8- 일옥시 ) 프로필옥시 )-10-((2-( 트리메틸실릴 ) 에톡시 ) 메틸 )-1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -5,11(10H,11 aH )- 디온 ( 18 )
고상 3-아미노벤젠붕산(0.143 g, 0.92 mmol)을 톨루엔(10 ㎖), 에탄올(5 ㎖) 및 물(5 ㎖) 중 모노 트리플레이트(17)(0.619 g, 0.58 mmol), 탄산나트륨(195 mg, 1.84 mmol) 및 팔라듐 테트라키스 트리페닐포스핀(26.6mg, 0.023 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 30℃에서 하룻밤 동안 상온에서 교반시켰다. 그 다음, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트와 물 간에 분배하였다. 유기층을 물 및 식염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 과량의 용매를 감압 하에서 회전 증발에 의해 제거하고, 생성된 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; 구배 용리 EtOAc/헥산 70/30→85/15)하였다. 선택된 분획으로부터 과량의 용리액을 제거하여 소정의 생성물을 얻었다(0.502 g, 0.49 mmol, 85%).
LC-MS RT 4.02 분, 1019 (M + H); 1H-NMR (400 MHZ, CDCl3) δ 7.38-7.35 (m, 4H), 7.33 (bs, 1H), 7.30 (bs, 1H), 7.25 (s, 2H), 7.10 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 6.88-6.80 (m, 3H), 6.72 (bs, 1H), 6.57 (dd, J = 7.9, 1.8 Hz, 1H), 5.50 (d, J = 10.0 Hz, 2H), 4.75 (d, 10.0 Hz, 2H), 4.58 (dd, J = 10.6, 3.3 Hz, 2H), 4.27 (t, J = 5.8 Hz, 4H), 3.95-3.91 (m, 2H), 3.90 (s, 6H), 3.80 (s, 3H), 3.77-3.60 (m. 6H), 3.15-3.05 (m, 2H), 2.41 (p, J = 5.8 Hz, 2H), 0.95 (t, = 8.25 Hz, 4H), 0 (s, 18H).
(c) (S)-2-(3- 아미노페닐 )-7- 메톡시 -8-(3-((S)-7- 메톡시 -2-(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-5,11a-디히드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일옥시)프로필옥시)-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5(11aH)-온(19)
과수소화물(Superhydride)의 용액(0.56 ㎖, 0.56 mmol, THF 중 1.0 M)을 질소 분위기 하 -78℃에서 무수 THF(10 ㎖) 중 SEM 디락탐(18)(0.271 g, 0.27 mmol)의 용액에 적가하였다. 1 시간 후, 추가의 분취량의 과수소화물 용액(0.13 ㎖, 0.13 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 추가 0.5 시간 동안 교반시켰고, 이 시점에서 LC/MS는 환원이 완료되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 물로 희석시키고, 상온으로 승온시켰다. 반응 혼합물을 클로로포름과 물 간에 분배하고, 층을 분리하고, 수층을 추가의 클로로포름(에멀션)으로 추출하였다. 마지막으로, 화합한 유기상을 식염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 환원된 생성물을 메탄올, 클로로름 및 물에 용해시키고, 72 시간 동안 실리카 겔의 존재 하에 교반시켰다. 미정제 생성물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(메탄올/클로로포름 구배) 처리하고, 선택된 분획으로부터 과량의 용리액을 제거한 후, 소정의 이민 생성물을 얻었다(150 mg, 0.21 mmol, 77%).
LC-MS RT 2.63 분, 97% 면적, 726 (M + H); 1H-NMR (400 MHZ, CDCl3) δ 7.85 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 7.84 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 7.50 (s, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.36 (s, 1H), 7.32 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.11 (t, (d, J = 7.8 Hz, 1H), 6.90-6.80 (m, 4H), 6.77 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.40-4.20 (m, 6H), 3.92 (s, 6H), 3.80 (s, 3H), 3.60-3.27 (m, 6H), 2.48-2.29 (m,2H)
실시예 5
Figure pct00088

(a) (11S,11 aS )-2,2,2- 트리클로로에틸 11-( 터트 - 부틸디메틸실릴옥시 )-8-(5-((11S,11aS)-11-(터트- 부틸디메틸실릴옥시 )-7- 메톡시 -2-(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-10-((2,2,2-트 리클로 로에톡시)카르보닐)-5,10,11,11a- 테트라히드로 -1H- 피롤로 [2,1- c][1,4]벤조디아제핀 -8- 일옥시 ) 펜틸옥시 )-7- 메톡시 -5-옥소-2-( 트리플루오로메틸설 포닐옥시)-11,11a- 디히드로 - 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -10(5H)- 카르복실레이트 ( 21 )
고상 4-메톡시벤젠붕산(59 mg, 0.39 mmol)을 톨루엔(10.8 ㎖), 에탄올(5.4 ㎖) 및 물(5.4 ㎖) 중 Troc 보호된 비스 트리플레이트(화합물 44, WO 2006/111759)(600 mg, 0.41 mmol), 탄산나트륨(65 mg, 0.61 ㎜o㎖) 및 팔라듐 테트라키스 트리페닐포스핀(0.012 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 하룻밤 동안 상온에서 교반시켰다. 그 다음, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트와 물 간에 분배하였다. 유기층을 물 및 식염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 과량의 용매를 감압 하에서 회전 증발에 의해 제거하고, 생성된 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; 구배 용리 EtOAc/헥산 20/80→30/70→40/60→60/40) 처리하여 미반응 비스-트리플레이트를 제거하였다. 선택된 분획으로부터 과량의 용리액을 제거하여 4-메톡시페닐 커플링된 생성물을 얻었다(261 mg, 0.18 mmol, 46%).
LC-MS RT 4.17 분, 1427 (M + H); 1H-NMR (400 MHZ, CDCl3) δ 7.38 (s, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.30 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 7.20 (bs, 1H), 6.92 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.77 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.0-5.90 (m, 2H), 5.25 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 5.24 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.24 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.22 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.18-4.08 (m, 2H), 4.07-3.89 (m, 10H), 3.81 (s, 3H), 3.44-3.25 (m, 2H), 2.85 (d, J = 16.6 Hz, 2H), 2.05-1.90 (m, 4H), 1.76-1.64 (m, 2H), 0.93 (s, 9H), 0.90 (s, 9H), 0.30 (s, 6H), 0.26 (s, 6H).
(b) (11S,11 aS )-2,2,2- 트리클로로에틸 11-( 터트 - 부틸디메틸실릴옥시 )-8-(5-((11S,11aS)-11-(터트- 부틸디메틸실릴옥시 )-2-(4- 히드록시페닐 )-7- 메톡시 -5-옥소-10-((2,2,2-트 리클 로로에톡시)카르보닐)-5,10,11,11a- 테트라히드로 -1H- 피롤로 [2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8- 일옥시 ) 펜틸옥시 )-7- 메톡시 -2-(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-11,11a-디히드로-1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -10(5H)- 카르복실레이트 ( 22 )
단계 (a)에 기재된 스즈키 커플링 과정을 화합물 21의 합성에 적용하였다. 화합물 20(62.5 mg 0.044 mmol)을 30℃에서 하룻밤 동안 1 당량의 4-히드록시벤젠붕산(10 mg)으로 처리하고 실리카 겔의 패드를 통해 여과시킨 후 소정의 화합물을 얻었다(40 mg, 0.029 mmol, 66% 수율). 화합물을 추후의 단계에서 직접 사용하였다.
LC-MS RT 4.27 분, 1371 (M + H)
(c) (S)-2-(4- 히드록시페닐 )-7- 메톡시 -8-(5-((S)-7- 메톡시 -2-(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-5,11a- 디히드로 -1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -8- 일옥시 ) 펜틸옥시 )-1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -5(11 aH )-온( 23 )
카드뮴/납 커플[100 mg, 문헌(Q Dong et al. Tetrahedron Letters vol 36, issue 32, 5681-5682, 1995)]을 THF(1 ㎖) 및 암모늄 아세테이트(1 N, 1 ㎖) 중 21(40 mg, 0.029 mmol)의 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 1 시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 클로로포름과 물 간에 분배하고, 상을 분리하고, 수상을 클로로포름으로 추출하였다. 화합한 유기층을 식염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 감압 하에서의 회전 증발에 의해 미정제 생성물을 얻었고, 이를 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, 0→ 4% MeOH/CHCl3)로 처리하였다. 감압 하에서 회전 증발에 의해 과량의 용리액을 제거하여 소정의 이민 생성물을 얻었다(17 mg 0.023 mmol, 79%).
LC-MS RT 2.20 분, 755 (M + H); 1H-NMR (400 MHZ, CDCl3) δ 7.89 (d, J = 3.94 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 4.00 Hz, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.38 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.33 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.28 (s, 1H), 6.90 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.84 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.82 (s, 1H), 6.81 (s, 1H), 5.68 (bs, 1H), 4.50-4.30 (m, 2H), 4.22-4.00 (m, 4H), 3.93 (s, 6H), 3.82 (s, 3H), 3.69-3.45 (m, 2H), 3.44-3.28 (m, 2H), 2.64-1.88 (m, 4H), 1.77-1.62 (m, 2H).
실시예 6
Figure pct00089

(a) (11S,11 aS )-2,2,2- 트리클로로에틸 11-( 터트 - 부틸디메틸실릴옥시 )-8-(5-((11S,11aS)-11-(터트- 부틸디메틸실릴옥시 )-2-(4- 포르밀페닐 )-7- 메톡시 -5-옥소-10-((2,2,2-트 리클로 로에톡시)카르보닐)-5,10,11,11a- 테트라히드로 -1H- 피롤로 [2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8- 일옥시 ) 펜틸옥시 )-7- 메톡시 -2-(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-11,11a-디히드로-1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -10(5H)- 카르복실레이트 ( 24 )
실시예 5, 단계 (a)에 기재된 스즈키 커플링 과정을 화합물 24의 합성에 적용하였다. 화합물 21(62.5 mg, 0.044 mmol)을 하룻밤 동안 상온에서 1 당량의 4-포르밀벤젠붕산(10.5 mg)으로 처리하고, 이를 실리카 겔의 패드를 통해 여과한 후, 소정의 화합물을 얻었다(45 mg, 0.033 mmol, 75% 수율). 화합물을 추후의 단계에서 직접 사용하였다.
LC-MS RT 4.42 분, 1383 (M + H)
(b) 4-((S)-7- 메톡시 -8-(5-((S)-7- 메톡시 -2-(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-5,11a- 디 히드로-1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -8- 일옥시 ) 펜틸옥시 )-5-옥소-5,11a- 디히드로 -1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -2-일) 벤즈알데히드 ( 25 )
실시예 5, 단계 (c)에 기재된 방법에 의해 화합물 24를 탈보호하여 소정의 화합물을 얻었다(18 mg, 0.023 mmol, 79%).
LC-MS RT 3.18 분, 768 (M + H); 1H-NMR (400 MHZ, CDCl3) δ 9.98 (s, 1H), 7.91 (d, J = 3.90 Hz, 1H), 7.90-7.80 (m, 3H), 7.68 (s, 1H), 7.60-7.45 (m, 4H), 7.39 (s, 1H), 7.33 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.83 (s, 1H), 6.82 (s, 1H), 4.55-4.44 (m, 1H), 4.43-4.36 (m, 1H), 4.23-4.00 (m, 4H), 3.95 (s, 3H), 3.94 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.66-3.51 (m, 2H), 3.50-3.34 (m, 2H), 2.05-1.87 (m, 4H), 1.76-164 (m, 2H).
실시예 7
Figure pct00090

(a) (11S,11 aS )-2,2,2- 트리클로로에틸 2-(3- 아미노페닐 )-11-( 터트 - 부틸디메틸실릴옥시 )-8-(5-((11S,11 aS )-11-( 터트 - 부틸디메틸실릴옥시 )-7- 메톡시 -5-옥소-10-((2,2,2-트 리클로 로에톡시)카르보닐)-2-( 트리플루오로메틸설포닐옥시 )-5,10,11,11a-테트라히드로-1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -8- 일옥시 ) 펜틸옥시 )-7-메톡시-5-옥소-11,11a- 디히드로 -1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -10(5H)- 카르복실레이트 ( 26 )
3-아미노벤젠붕산을 사용하여 실시예 5, 단계 (a)에 기재된 스즈키 커플링 과정을 화합물 26의 합성에 적용하여 소정의 화합물을 41% 수율로 얻었다(230 mg, 0.163 mmol).
LC-MS RT 4.28 분, 1411 (M + H); 1H-NMR (400 MHZ, CDCl3) δ 7.44 (bs, 1H), 7.29 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 7.20 (s, 1H), 7.16 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 6.84-6.73 (m, 3H), 6.70 (bs, 1H), 6.62 (dd, J = 7.9, 1.7 Hz, 1H), 6.66-6.58 (m, 2H), 5.25 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 5.24 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.24 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.22 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.17-4.07 (m, 2H), 4.08-3.89 (m, 10H), 3.43-3.28 (m, 2H), 2.85 (d, J = 1.65 Hz, 2H), 2.07-1.90 (m, 4H), 1.78-1.63 (m, 2H), 0.94 (s, 9H), 0.90 (s, 9H), 0.30 (s, 6H), 0.27 (s, 6H).
(b) (11S,11 aS )-2,2,2- 트리클로로에틸 2-(3- 아미노페닐 )-11-( 터트 - 부틸디메틸실릴옥시 )-8-(5-((11S,11 aS )-11-( 터트 - 부틸디메틸실릴옥시 )-2-(4-(3-(디메틸아미노) 프로폭시 ) 페닐 )-7- 메톡시 -5-옥소-10-((2,2,2- 트리클로로에톡시 )카르보닐)-5,10,11,11a-테트라히드로-1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -8- 일옥시 ) 펜틸옥시 )-7-메톡시-5-옥소-11,11a- 디히드로 -1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -10(5H)- 카르복실레이트 ( 27 )
고상 4-[3-(디메틸아미노)프로폭시벤젠붕산 피나콜 에스테르(25 mg, 0.082 mmol)를 톨루엔(1 ㎖), 에탄올(0.5 ㎖) 및 물(0.5 ㎖) 중 26(73 mg, 0.052 mmol), 탄산나트륨(18 mg, 0.17 mmol) 및 팔라듐 테트라키스 트리페닐포스핀(3 mg)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 하룻밤 동안 상온에서 교반시켰다. 그 다음, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트와 물 간에 분배하였다. 유기층을 물 및 식염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 과량의 용매를 감압 하에서 회전 증발에 의해 제거하고, 생성된 잔류물을 클로로포름/메탄올로 실리카 겔의 플러그를 통해 용리시켰다. 선택된 분획으로부터 과량의 용리액을 제거하여 4-메톡시페닐 커플링된 생성물을 얻었다(50 mg, 0.035 mmol, 67%).
LC-MS RT 4.12 분, 1440 (M + H)
(c) (S)-2-(3- 아미노페닐 )-8-(5-((S)-2-(4-(3-(디메틸아미노) 프로폭시 ) 페 닐)-7- 메톡시 -5-옥소-5,11a- 디히드로 -1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -8- 일옥시 ) 펜틸옥시 )-7- 메톡시 -1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -5(11 aH )-온( 28 )
실시예 5, 단계 (c)에 기재된 방법에 의해 화합물 27을 탈보호하여 소정의 화합물을 얻었다. 반응 혼합물을 DCM과 탄산수소나트륨 수용액(에멀션) 간에 분배하고, 미정제 생성물을 실리카 겔 상에서의 구배 컬럼 크로마토그래피(5% 메탄올 클로로포름→35% 메탄올/클로로포름)에 의해 정제하여 소정의 비대칭 PBD 이민을 얻었다(50 mg, 0.018 mmol, 58%).
LC-MS RT 2.55 분, 826 (M + H); 1H-NMR (400 MHZ, CDCl3) δ 7.92-7.82 (m, 2H), 7.52 (bs, 2H), 7.45 (bs, 1H), 7.39 (bs, 1H), 7.31 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.14 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.85-6.75 (m, 3H), 6.72 (bs, 1H), 6.60 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.46-4.33 (m, 2H), 4.21-3.98 (m, 6H), 3.94 (s, 6H), 3.63-3.50 (m, 2H), 3.43-3.29 (m, 2H), 2.64-2.48 (m, 2H), 2.34 (s, 6H), 2.10-1.89 (m, 6H), 1.57 (m, 2H).
실시예 8
Figure pct00091

(a) (11S,11 aS )-2,2,2- 트리클로로에틸 2-(3- 아미노페닐 )-11-( 터트 - 부틸디메틸실릴옥시 )-8-(5-((11S,11 aS )-11-( 터트 - 부틸디메틸실릴옥시 )-7- 메톡시 -2-(4-(4- 메틸피페라진 -1-일) 페닐 )-5-옥소-10-((2,2,2- 트리클로로에톡시 )카르보닐)-5,10,11,11a-테트라히드로-1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -8- 일옥시 ) 펜틸옥시 )-7-메톡시-5-옥소-11,11a- 디히드로 -1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -10(5H)- 카르복실레이트 ( 29 )
실시예 7, 단계 (b)의 방법을 수행하고 실리카 겔의 플러그를 통한 여과(1/3 메탄올/클로로포름 사용) 및 감압 하의 회전 증발에 의한 과량의 용매 제거 후, 소정 생성물을 얻었다(58 mg, 0.040 mmol, 78%).
LC-MS RT 4.08 분, 1439 (M + H)
(b) (S)-2-(3- 아미노페닐 )-7- 메톡시 -8-(5-((S)-7- 메톡시 -2-(4-(4- 메틸피페라 진-1-일) 페닐 )-5-옥소-5,11a- 디히드로 -1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -8- 일옥시 ) 펜틸옥시 )-1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -5(11 aH )-온( 30 )
실시예 7, 단계 (c)의 방법을 이용하여 화합물 29를 탈보호하였다. 미정제 생성물을 실리카 겔 구배 크로마토그래피(2% 메탄올 클로로포름→35% 메탄올/클로로포름)에 의해 정제하여 소정의 비대칭 PBD 이민을 얻었다(18 mg, 0.022 mmol, 59%).
LC-MS RT 2.52 분, 823 (M + H); 1H-NMR (400 MHZ, CDCl3) δ 7.80 (d, J = 3.8Hz, 2H), 7.45 (s, 2H), 7.38 (s, 1H), 7.30 (s, 1H), 7.23 (d, J = 8.6Hz, 2H), 7.07 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 6.83 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.79-6.89 (m, 3H), 6.65 (s, 1H), 6.54 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.40-4.24 (m, 2H), 4.15-3.93 (m, 4H), 3.87 (s, 6H), 3.56-3.42 (m, 2H), 3.37-3.23 (m, 2H), 3.22-3.08 (m, 4H), 2.61-2.41 (m, 4H), 2.29 (s, 3H), 1.98-1.80 (m, 4H), 1.67-1.54 (m, 2H).
실시예 9
Figure pct00092

(a) (S)-2-(4-( 아미노메틸 ) 페닐 )-7- 메톡시 -8-(3-((S)-7- 메톡시 -2-(4- 메톡시페닐 )-5,11- 디옥소 -10-((2-( 트리메틸실릴 ) 에톡시 ) 메틸 )-5,10,11,11a- 테트라히드로 -1H- 피롤로 [2,1-c][1,4]벤조 디아제핀 -8- 일옥시 ) 프로필옥시 )-10-((2-( 트리메틸실릴 ) 에톡시 ) 메틸 )-1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -5,11(10H,11 aH )- 디온 ( 31 )
고상 4-아미노메틸벤젠붕산 염산염(0.111 g, 0.59 mmol)을 톨루엔(10 ㎖), 에탄올(5 ㎖) 및 물(5 ㎖) 중 17(0.394 g, 0.37 mmol), 탄산나트륨(175 mg, 1.654 mmol) 및 팔라듐 테트라키스 트리페닐포스핀(28.0 mg, 0.024 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 30℃에서 하룻밤 동안 교반시켰다. 다음 날, 반응 혼합물을 70℃에서 추가 3 시간 동안 가열하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트와 물 간에 분배하였다. 유기층을 물 및 식염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 과량의 용매를 감압 하에서 회전 증발에 의해 제거하고, 생성된 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔; 구배 용리 EtOAc/헥산 2/98→15/85)로 처리하였다. 선택된 분획으로부터 과량의 용리액을 제거하여 소정의 생성물을 얻었다(0.230 mg, 0.22 mmol, 61%).
LC-MS RT 3.63 분, 1034 (M + 2H); 1H-NMR (400 MHz, DMSO d 6) δ 11.7 (s, 2H), 7.52 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.48 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.40 (s, 1H), 7.50 (d, J = 8.1 Hz, 2H),7.38-7.19 (m, 5H) 6.93 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 5.40 (d, J = 2.13 Hz, 1H), 5.38 (d, J = 2.12 Hz, 1H), 5.32 (d, J = 10.6 Hz, 2H), 5.25 (d, J = 10.6 Hz, 2H), 4.87-4.72 (m, 2H), 4.35-4.15 (m, 4H), 3.85 (s, 6H), 3.79 (s, 3H), 3.73-3.56 (m, 2H), 3.55-3.39 (m, 4H), 3.22-3.02 (m, 2H), 2.39-2.23 (m, 2H), 0.94-0.67 (m, 4H), 0.06 (s, 18H).
(b) (S)-2-(4-( 아미노메틸 ) 페닐 )-7- 메톡시 -8-(3-((S)-7- 메톡시 -2-(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-5,11a- 디히드로 -1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -8- 일옥시 ) 프로필옥시 )-1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -5(11 aH )-온( 32 )
실시예 1, 단계 (c)의 방법에 따라 화합물 31을 탈보호하였다. 미정제 생성물을 구배 컬럼 크로마토그래피(5/95→30/70 MeOH/CHCl3)에 의해 정제하여 이민 및 카르비놀아민 메틸 에테르의 혼합물로서 생성물을 얻었다.
LC-MS RT 2.58 분, 740 (M + H).
실시예 10
Figure pct00093

(S)-2-(4- 아미노페닐 )-7- 메톡시 -11(S)- 설포 -8-(3-((S)-7- 메톡시 -11(S)- 설포 -2-(4-메 톡 시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a- 테트라히드로 -1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -8- 일옥시 ) 프로필옥시 )-1H- 피롤로 [2,1-c][[1,4]벤조디아제핀-5(11 aH )-온 이나트륨 염( 33 )
나트륨 비설파이트(8.5 mg, 3.1 당량)를 이소프로판올(4 ㎖) 및 물(2 ㎖) 중 비스-이민 11(20 mg, 0.036 mmol)의 교반된 현탁액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 격렬하게 교반시키자 최종적으로 투명하게 되었다(약 1 시간). 반응 혼합물을 깔때기에 옮기고, 코튼 월(cotton wall)을 통해 여과하였다(그 다음 2 ㎖의 물로 세척함). 여액을 플래쉬 냉동시키고[액체 및 조(bath)로], 동결 건조시켜 소정의 생성물 33을 정량적인 수율로 얻었다.
LC-MS RT 11.77 분, 727.2 (M + H) (모화합물의 질량, 비설파이트 부가물은 질량 분석계에서 불안정함); 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.66-7.55 (m, 5H), 7.43 (s, 1H), 7.39 (d, J = 8.66 Hz, 2H), 7.06 (m, 2H), 6.93 (d, J = 8.84 Hz, 2H), 6.54 (m, 2H), 5.29-5.21 (m, 2H), 4.32-4.28 (m, 2H), 4.14-4.20 (m, 4H), 3.96-3.83 (m, 2H), 3.77 (s, 3H), 3.73 (m, 6H), 3.52-3.43 (m, 2H), 3.30-3.08 (m, 2H), 2.24-2.21 (m, 2H).
실시예 11
Figure pct00094

(a) (S)-2-(2-아미노페닐)-7-메톡시-8-(3-(((S)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5,11-디옥소-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-5,10,11,11a-테트라히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-10-((2-(트리메틸실릴)에톡시)메틸)-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온 ( 103 )
촉매량의 테트라키스트리페닐포스핀팔라듐(0)(11.2 mg)을 에탄올 (5 ㎖), 톨루엔 (5㎖) 및 물(5 ㎖) 중 모노 트리플레이트 17 (380 mg), 2-아미노페닐붕산의 피나콜 에스테르 (124 mg) 및 탄산 나트륨 (120 mg)의 혼합물에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 상온에서 하룻밤 동안 교반하고 반응이 완료될 때까지 40℃에서 교반하였다(약 2 시간). 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 유기층을 물 및 식염수로 세척하였다. 상기 에틸 아세테이트 용액을 황산마그네슘 상에서 건조시키고 진공 하에 여과하였다. 감압 하에 회전 증발시켜 에틸 아세테이트를 제거하여 미정제 생성물을 얻고 이를 플래쉬 크로마토그래피로 처리하였다(실리카 겔, 에틸 아세테이트/헥산). 순수한 분획을 수집하고 화합하였다. 감압 하에 회전 증발시켜 과량의 용리액을 제거하여 순수한 생성물 103을 얻었다(330 mg, 86% 수율). LC/MS RT: 4.17 분, ES+ 1018.48.
(b) (S)-2-(2-아미노페닐)-7-메톡시-8-(3-(((S)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,11a-디히드로-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-yl)옥시)프로폭시)-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5(11aH)-온 ( 104 )
건조 테트라히드로푸란 중의 과수소화물의 용액(1.0 M, 4.4 당량)을 불활성 대기 하 -78℃에서 건조 테트라히드로푸란 (5 ㎖) 중 2-아날리노 화합물 103(300 mg)의 용액에 첨가하였다. 환원이 서서히 진행될 때 분취량의 리튬 보로하이드라이드 (20 당량)를 첨가하고 반응 혼합물을 상온으로 회복되게 하였다. 물/얼음을 반응 혼합물에 첨가하여 미반응 하이드라이드를 퀀칭시키고 상기 반응물을 디클로로메탄으로 희석시켰다. 유기층을 물 (2회), 시트르산 및 식염수로 순차적으로 세척하였다. 과량의 디클로로메탄을 감압 하에 회전 증발시켜 제거하고 잔류물을 에탄올 및 물에 재용해시킨 후 96 시간 동안 실리카 겔로 처리하였다. 반응 혼합물을 진공 여과하고 여액을 증발시켜 건조시켰다. 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, 구배 클로로포름/메탄올)로 처리하였다. 순수한 분획을 수집하고 화합한 후 과량의 용리액을 감압 하에 회전 증발시켜 제거하여 순수한 생성물 104를 얻었다(30 mg, 14% 수율). LC/MS RT: 2.90 분, ES+ 726.09.
실시예 12: 대표적인 PBD 화합물의 시험관내 세포 독성의 측정
K562 분석
K562 인간 만성 골수성 백혈병 세포를 5% CO2를 함유하는 습윤 분위기 하 37℃에서 10% 우태아 혈청 및 2 mM 글루타민으로 보충된 RPM1 1640 배지 중에서 유지시키고, 암실에서 37℃에서 1 시간 또는 96 시간 동안 특정 용량의 약물과 함께 배양하였다. 원심 분리(5 분, 300 g)를 통해 배양을 종결시키고, 세포를 약물이 없는 배지로 1 회 세척하였다. 적절한 약물 처리 후, 세포를 96 웰 미량역가 플레이트(웰당 104 세포, 샘플당 8 웰)에 옮겼다. 그 다음 플레이트를 5% CO2를 함유하는 습윤 분위기 하 37℃의 암실에 보관하였다. 분석은 황색 가용성 테트라졸륨 염, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드(MTT, Aldrich-Sigma)를 불용성 보라색 포르마잔 침전으로 환원시키는 생존 가능한 세포의 능력을 기준으로 하였다. (대조구 세포를 약 10 배수로 증가시킬 수 있는) 4 일 동안의 플레이트의 배양 후, 20 ㎕의 MTT 용액(포스페이트 완충 식염수 중 5 mg/㎖)을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 5 시간 동안 추가로 배양하였다. 그 다음, 플레이트를 300 g에서 5 분 동안 원심 분리하고, 대부분의 매질을 웰당 10 내지 20 ㎕를 남기고 세포 펠렛으로부터 피펫팅하였다. DMSO(200 ㎕)를 각각의 웰에 첨가하고, 샘플을 완전히 혼합되도록 교반하였다. 그 다음, 광학 밀도를 Titertek Multiscan ELISA 플레이트 판독기 상에서 550 ㎚의 파장으로 판독하고, 용량-반응 곡선을 구성하였다. 각각의 곡선에 대해, IC50 값을 대조구 값의 50%로 최종 광학 밀도를 감소시키는 데에 필요한 용량으로서 판독하였다.
화합물 13은 이 분석에서 30 pM의 IC50을 가졌다.
A2780 분석
A2780 모세포주를 ~10% 우태아 혈청(FCS) 및 ~1% 200mM L-글루타민 용액을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 성장시키고, Corning Cellbind 75 ㎠ 플라스크에서 성장시켰다.
190 ㎕의 세포 현탁액을 96 웰 플레이트(Nunc 96F 편평 바닥 TC 플레이트)의 컬럼 2 내지 11의 각각의 웰에 (1×104로) 첨가하였다. 190 ㎕의 배지를 컬럼 1 및 12의 각각의 웰에 첨가하였다. 배지는 [~10% 우태아 혈청(FCS) 및 ~1% 200 mM L-글루타민 용액을 함유하는] 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)였다.
세포가 부착된 경우 약물을 첨가하기 전에 플레이트를 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 200 μM의 시험 화합물 용액(100% DMSO 중)을 96 웰 플레이트를 교차하여 연속적으로 희석시켰다. 그 다음, 각각의 생성된 지점을 살균 증류수(SDW)로 추가로 1/10으로 희석시켰다.
세포 음성 블랭크 및 화합물 음성 대조구 웰에, 10% DMSO를 5% v/v로 첨가하였다. 분석 플레이트를 72 시간 동안 습윤된 배양기에서 5% CO2에서 37℃에서 하기 지속 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 1.5 μM의 최종 농도로 MTT 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 그 다음, 플레이트를 습윤된 배양기에서 5% CO2에서 37℃에서 추가 4 시간 동안 배양하였다. 그 다음 배지를 제거하고, 염료를 200 ㎕ DMSO(99.99%)에 용해시켰다.
플레이트를 Envision 플레이트 판독기를 이용하여 540 nm 흡광도로 판독하였다. 데이터를 마이크로소프트 엑셀 및 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)을 이용하여 분석하고, IC50 값을 얻었다.
화합물 11은 이 분석에서 11.7 pM의 IC50을 가졌다.
신장 세포 및 AML 세포주 분석
다양한 약물이 없는 화합물의 세포독성을 신장 세포 암 세포주 786-O, 호지킨 림프종 세포주 L428 및 2개의 AML 세포주 HL60 및 HEL에 대해 시험하였다.
96-시간 분석을 위하여, 로그-상 성장으로 배양된 세포를 20% FBS로 보충된 150 ㎕의 RPMI 1640을 함유하는 96-웰 플레이트에 24 시간 동안 접종하였다. 세포 배양 배지 중의 시험 물질(즉, 약물이 없는 화합물)의 연속적인 희석액을 4x 작업 농도로 준비하였다; 50 ㎕의 각각의 희석액을 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 시험 물질의 첨가 후, 세포를 37℃에서 4 일 동안 시험 물질과 함께 배양하였다. 그 다음 레자주린을 50 μM의 최종 농도가 되도록 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 추가 4 시간 동안 배양하였다. 그 다음 상기 플레이트를 각각 530 및 590 nm의 여기 및 방출 파장으로 Fusion HT 플레이트 판독기(Packard Instruments, Meridien, CT, USA) 상에서 염료 환원 정도에 대해 판독하였다. 여기에서, 3중으로 측정된, IC50 값을 미처리 대조구와 대비하여 세포 성장을 50% 감소하게 하는 농도로서 정의한다.
하기 표 1을 참조하면, 본 분석에서 파라-아닐린 화합물 11은 메타-아닐린 화합물 19와 대비하여 이들 세포주에 대한 현저하게 증가된 활성을 나타내었다.
표 1: 약물이 없는 화합물에 대한 IC50 요약 [nM]
Figure pct00095

하기 표 2를 참조하면, 화합물 28, 30 및 32의 활성이 L428, 786-O, HEL, HL-60 및 MCF-7 세포 상에서 나타났을 뿐 아니라, 화합물 19의 활성이 MCF-7 세포 상에서 나타났다.
표 2: 약물이 없는 화합물에 대한 IC50 요약 [nM]
Figure pct00096

하기 표 3을 참조하면, 화합물 23, 25의 활성은 786-O, Caki-1, MCF-7, HL-60, THP-1, HEL, 및 TF1 세포 상에서 화합물 11의 활성과 비교되었다. 세포를 검은 측면 투명 바닥의 96-웰 플레이트(Costar, Corning) 내로 웰 당 150 ㎕ 성장 배지에 도말하고, 생물학적 상자(biological cabinet) 내에서 1 시간 동안 정착시킨 후 37℃, 5% CO2의 배양기 내에 넣었다. 다음 날, 4X 농도의 약물 스톡을 제조한 다음, 8-포인트 용량 곡선을 생성하는 10-배 연속 희석액과 같이 적정하고 이중으로 웰 당 50 ㎕로 첨가하였다. 그 다음 세포를 37℃, 5% CO2에서 48 시간 동안 배양하였다. 세포독성을 1 시간 동안 100 ㎕ Cell Titer Glo (Promega) 용액으로 배양함으로써 측정한 다음, 발광을 Fusion HT 플레이트 판독기 (Perkin Elmer) 상에서 측정하였다. 데이터를 엑셀(마이크로소프트) 및 그래프패드(프리즘)로 처리하여 용량 반응 곡선을 생성하고 IC50 값을 얻고 데이터를 수집하였다.
표 3: 약물이 없는 화합물에 대한 IC50 요약 [nM]
Figure pct00097

실시예 13 내지 16에서, 하기 화합물들을 이하에서 나타낸 바와 같이 화합물 번호로 언급하였다.
Figure pct00098

실시예 13: PBD 약물 링커 화합물의 합성
일반적인 정보 하기 실시예에서, 모든 상업적으로 입수 가능한 무수 용매들은 추가의 정제 없이 사용하였다. 분석 박막 크로마토그래피는 실리카 겔 60 F254 알루미늄 시트(EMD Chemicals, Gibbstown, NJ) 상에서 수행하였다. 방사상 크로마토그래피(radial chromatography)는 크로마토트론 기기(Harris Research, Palo Alto, CA) 상에서 수행하였다. 분석 HPLC는 Varian ProStar 330 PDA 검출기와 함께 구성된 Varian ProStar 210 용매 전달 시스템 상에서 수행하였다. 샘플은 C12 Phenomenex Synergi 2.0 x 150 mm, 4 ㎛, 80 Å 역상 컬럼 상에서 용리시켰다. 산성 이동상은 둘 다 0.05% 트리플루오로아세트산 또는 0.1% 포름산 중의 하나를 함유하는 아세토니트릴 및 물로 이루어졌다(각각의 화합물에 대해 표시됨). 화합물은 1 분 후 주입시 5%로부터 11분에 95%까지 산성 아세토니트릴의 선형 구배로 용리시킨 후, 15 분까지 95% 아세토니트릴의 일정용매조성으로 용리시켰다(유속 = 1.0 ㎖/분). LC-MS는 C12 Phenomenex Synergi 2.0 x 150 mm, 4 ㎛, 80 Å 역상 컬럼이 장착된 HP Agilent 1100 HPLC 기기에 결부된 ZMD Micromass 질량 분광기 상에서 수행하였다. 산성 용리액은 10 분에 걸쳐 0.1% 포름산 수용액 중 5%로부터 95%로의 아세토니트릴의 선형 구배, 이어서 5 분 동안 95% 아세토니트릴의 일정용매조성으로 이루어졌다(유속 = 0.4 ㎖/분). 예비 HPLC는 Varian ProStar 330 PDA 검출기와 함께 구성된 Varian ProStar 210 용매 전달 시스템 상에서 수행하였다. 생성물은 물 중 0.1% 포름산(용매 A) 및 아세토니트릴 중 0.1% 포름산(용매 B)으로 용리시켜 C12 Phenomenex Synergi 10.0 x 250 mm, 4 ㎛, 80 Å 역상 컬럼 상에서 정제하였다. 정제 방법은 하기 용매 A 내지 용매 B의 구배로 이루어졌다: 0 내지 5 분까지 90:10; 5 내지 80 분까지 90:10 내지 10:90; 이어서 5 분 동안 10:90의 일정용매조성. 유속은 254 nm에서 모니터링하면서 4.6 ㎖/분이었다. NMR 스펙트럼 데이터는 Varian Mercury 400 MHz 분광기 상에서 수집하였다. 커플링 상수(J)는 헤르츠로 기록하였다.
반응식 1
Figure pct00099

( S )-2-(( S )-2-(6-(2,5- 디옥소 -2,5- 디히드로 -1 H -피롤-1-일) 헥산아미도 )-3- 메 틸부탄아미도) 프로파노산 (36): 10.6 mL 무수 DMF 중에 용해된 Val-Ala 디펩티드 34(200 mg, 1.06 mmol)의 용액에 말레이미도카프로일 NHS 에스테르 35(327 mg, 1.06 mmol)를 첨가하였다. 그 다음 디이소프로필에틸아민(0.92 mL, 5.3 mmol)을 첨가하고 반응물을 18 시간 동안 대기 온도에서 질소 하에 교반하였으며, 이 시점에서 TLC 및 분석 HPLC가 출발 물질의 소비를 나타내었다. 상기 반응물을 0.1 M HCl(100 mL)로 희석시키고, 수층을 에틸 아세테이트(100 mL, 3x)로 추출하였다. 화합된 유기층을 물 및 식염수로 세척한 다음, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과한 후 농축하였다. 미정제 생성물을 최소량의 메틸렌 클로라이드 중에 용해시키고 CH2Cl2/MeOH 혼합물(95:5 내지 90:10 CH2Cl2/MeOH)로 용리시켜 2 mm 크로마토트론 플레이트 상에서 방사상 크로마토그래피에 의해 정제하여 오일의 잔류물로서 36을 얻었다(158 mg, 39%). TLC: Rf = 0.26, CH2Cl2 중의 10% MeOH. 1H NMR (CDCl3) δ (ppm) 0.95 (d, J = 17 Hz, 3H), 0.98 (d, J = 17 Hz, 3H), 1.30 (m, 2H), 1.40 (d, J = 17 Hz, 3H), 1.61 (m, 4H), 2.06 (m, 1H), 2.25 (dt, J = 4, 19 Hz, 2H), 3.35 (s, 1H), 3.49 (t, J = 17 Hz, 2H), 4.20 (d, J = 18 Hz, 1H), 4.38 (m, 1H), 6.80 (s, 2H). 분석 HPLC (0.1% 포름산): t R 9.05 분. LC-MS: t R 11.17 분, m/z (ES+) 실측치 381.9 (M+H)+, m/z (ES-) 실측치 379.9 (M-H)-.
6-(2,5- 디옥소 -2,5- 디히드로 -1 H -피롤-1-일)- N -(( S )-1-((( S )-1-((4-(( S )-7- 메 톡시-8-(3-((( S )-7- 메톡시 -2-(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-5,11a- 디히드로 -1H- 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀 -8-일) 옥시 ) 프로폭시 )-5-옥소-5,11a- 디히드로 -1H- 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀 -2-일) 페닐 )아미노)-1- 옥소프로판 -2-일)아미노)-3- 메틸 -1-옥소부탄-2-일) 헥산아미드 (38): 불꽃-건조된 10 mL 플라스크에 산 36(3.6 mg, 9.5 μmol), EEDQ(2.8 mg, 11.4 μmol), 및 0.33 mL 무수 CH2Cl2를 넣었다. 메탄올(4 방울, ~80 ㎕)을 첨가하여 용해를 촉진시키고 혼합물을 1 시간 동안 질소 하에서 교반하였다. 그 다음 PBD 이량체 37(5.7 mg, 7.9 μmol)을 첨가하고 반응물을 6 시간 동안 상온에서 교반하였으며, 이 시점에서 LC-MS는 생성물로의 전환을 나타내었다. 반응물을 농축시키고, 최소량의 CH2Cl2 중에 용해시킨 후, CH2Cl2/MeOH 혼합물(100:0 내지 90:10 CH2Cl2/MeOH)로 용리시켜 1 mm 크로마토트론 플레이트 상에서 방사상 크로마토그래피로 정제하여 약물 링커 38을 얻었다(3.9 mg, 45%). TLC: Rf = 0.06, CH2Cl2 중의 5% MeOH. 분석 HPLC (0.1% 포름산): t R 11.51 분. LC-MS: t R 12.73 분, m/z (ES+) 실측치 1089.6 (M+H)+, m/z (ES-) 실측치 1087.3 (M-H)-.
반응식 2
Figure pct00100

6-(2,5- 디옥소 -2,5- 디히드로 -1 H -피롤-1-일)- N -(4-(( S )-7- 메톡시 -8-(3-((( S )-7-메 톡 시-2-(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-5,11 a - 디히드로 -1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀 -8-일) 옥시 ) 프로폭시 )-5-옥소-5,11a- 디히드로 -1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아 제핀-2-일) 페닐 ) 헥산아미드 (40): 불꽃-건조된 10 mL 플라스크에, CHCl3 중 10% MeOH의 1.4 mL 용매 혼합물 중에 용해시킨, PBD 이량체 37(25 mg, 34.4 μmol)을 첨가하였다. 말레이미도카프로산(39)을 첨가하고(7.3 mg, 34.4 μmol), EEDQ(10.2 mg, 41.3 μmol) 및 피리딘(6 ㎕, 68.8 μmol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 14 시간 동안 질소 분위기 하에서 상온으로 교반하였으며, 이 시점에서 LC-MS는 생성물로의 전환을 나타내었다. 반응물을 농축시키고, 최소량의 CH2Cl2 중에 용해시킨 후, CH2Cl2/MeOH 혼합물(100:0 내지 90:10 CH2Cl2/MeOH)로 용리시켜 1 mm 크로마토트론 플레이트 상에서 방사상 크로마토그래피에 의해 정제하여 약물 링커 40을 얻었다(14.1 mg, 45%). LC-MS: t R 12.81 분, m/z (ES+) 실측치 918.9 (M+H)+, m/z (ES-) 실측치 917.0 (M-H)-.
반응식 3
Figure pct00101

2- 브로모 - N -(4-(( S )-7- 메톡시 -8-(3-((( S )-7- 메톡시 -2-(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-5,11 a -디히드로-1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀 -8-일) 옥시 ) 프로폭시 )-5-옥소-5,11 a -디히드로-1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀 -2-일) 페닐 ) 아세트아미드 (41): 불꽃-건조된 10 mL 플라스크에, CHCl3 중 10% MeOH의 0.9 mL 용매 혼합물 중에 용해시킨, PBD 이량체 37(16.5 mg, 22.7 μmol)을 첨가하였다. 브로모아세트산을 첨가한 후(3.2 mg, 22.7 μmol), EEDQ(6.8 mg, 27.2 μmol)를 첨가하였다. 상기 반응물을 4 시간 동안 질소 분위기 하에서 상온으로 교반하였으며, 이 시점에서 LC-MS는 생성물로의 전환을 나타내었다. 반응물을 농축시키고, 최소량의 CH2Cl2 중에 용해시킨 후, CH2Cl2/MeOH 혼합물(100:0 내지 90:5 CH2Cl2/MeOH)로 용리시켜 1 mm 크로마토트론 플레이트 상에서 방사상 크로마토그래피에 의해 정제하여 약물 링커 41을 얻었다(9.9 mg, 52%). TLC: Rf = 0.09, CH2Cl2 중 5% MeOH. LC-MS: t R 12.44 분, m/z (ES+) 실측치 848.1 (M+H)+, m/z (ES-) 실측치 845.7 (M-H)-.
반응식 4
Figure pct00102

6-(2,5- 디옥소 -2,5- 디히드로 -1 H -피롤-1-일)- N -(( S )-1-((( S )-1-((3-(( S )-7- 메 톡시-8-(3-((( S )-7- 메톡시 -2-(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-5,11 a - 디히드로 -1 H - 피롤로[2,1 - c ][1,4]벤조디아제핀-8-일) 옥시 ) 프로폭시 )-5-옥소-5,11 a - 디히드로 -1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀-2-일) 페닐 )아미노)-1- 옥소프로판 -2-일)아미노)-3- 메틸 -1- 옥소 부탄-2-일) 헥산아미드 (43): 불꽃-건조된 10 mL 플라스크에 산 36(3.6 mg, 9.4 μmol), EEDQ(2.8 mg, 11.3 μmol), 및 1% 메탄올을 함유하는 0.38 mL 무수 CH2Cl2를 넣었다. 상기 반응물을 1 시간 동안 질소 하에서 교반한 다음; PBD 이량체 42(6.8 mg, 9.4 μmol)를 첨가하고 반응물을 2 시간 동안 상온에서 교반하였으며, 이 시점에서 LC-MS가 생성물로의 전환을 나타내었다. 반응물을 농축시키고, 최소량의 CH2Cl2 중에 용해시킨 후, CH2Cl2/MeOH 혼합물(100:0 내지 90:10 CH2Cl2/MeOH)로 용리시켜 1 mm 크로마토트론 플레이트 상에서 방사상 크로마토그래피에 의해 정제하여 약물 링커 43을 얻었다(3.1 mg, 30%). TLC: Rf = 0.31, CH2Cl2 중의 10% MeOH. 분석 HPLC (0.1% 포름산): t R 11.49 분. LC-MS: t R 12.28 분, m/z (ES+) 실측치 1089.5 (M+H)+, m/z (ES-) 실측치 1087.3 (M-H)-.
반응식 5
Figure pct00103

6-(2,5- 디옥소 -2,5- 디히드로 -1 H -피롤-1-일)- N -(3-(( S )-7- 메톡시 -8-(3-((( S )-7-메 톡 시-2-(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-5,11 a - 디히드로 -1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀 -8-일) 옥시 ) 프로폭시 )-5-옥소-5,11 a - 디히드로 -1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀 -2-일) 페닐 ) 헥산아미드 (44): 불꽃-건조된 10 mL 플라스크에, CHCl3 중 10% MeOH의 0.44 mL 용매 혼합물 중에 용해시킨, PBD 이량체 42(8.0 mg, 11 μmol)을 첨가하였다. 말레이미도카프로산(39)을 첨가한 후(2.3 mg, 11 μmol), EEDQ(3.3 mg, 13.2 μmol) 및 피리딘(1.8 ㎕, 22 μmol)를 첨가하였다. 상기 반응물을 3 시간 동안 질소 분위기 하에서 상온으로 교반하였으며, 이 시점에서 LC-MS는 생성물로의 전환을 나타내었다. 반응물을 CH2Cl2/MeOH 혼합물(100:0 내지 90:10 CH2Cl2/MeOH)로 용리시켜 1 mm 크로마토트론 플레이트 상에서 방사상 크로마토그래피에 의해 정제하여 약물 링커 44를 얻었다(1.2 mg, 12%). TLC: Rf = 0.45, CH2Cl2 중의 10% MeOH. 분석 HPLC (0.05% 트리플루오로아세트산): t R 11.71 분. LC-MS: t R 12.63 분, m/z (ES+) 실측치 919.1 (M+H)+, m/z (ES-) 실측치 917.1 (M-H)-.
반응식 6
Figure pct00104

(2 S ,3 R ,4 S ,5 R ,6 R )-2-(2-(3-((((9 H - 플루오렌 -9-일) 메톡시 )카르보닐)아미노) 프 로판아미도)-4-((((3-(( S )-7- 메톡시 -8-(3-((( S )-7- 메톡시 -(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-5,11 a -디히드로-1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀 -8-일) 옥시 ) 프로폭시 )-5-옥소-5,11 a -디히드로-1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀 -2-일) 페닐 ) 카르바모일 ) 옥시 ) 메 틸) 페녹시 )-6- 메틸테트라히드로 -2 H -피란-3,4,5-트리일 트리아세테이트 (46): 불꽃-건조된 10 mL 플라스크에, 글루쿠로나이드 링커 중간체 45(참조: Jeffrey et al., Bioconjugate Chemistry, 2006, 17, 831-840) (15 mg, 20 μmol), 1.4 mL 무수 CH2Cl2, 피리딘(20 ㎕, 240 μmol)을 넣은 다음, 질소 하에서 -78℃로 냉각시켰다. 그 다음, 디포스겐(3.0 ㎕, 24 μmol)을 첨가하고 상기 반응물을 -78℃에서 2 시간 동안 교반하였으며, 이 시점 이후 소량의 분취량을 메탄올로 퀀칭시키고 메틸 카르보네이트의 형성에 대하여 LC-MS로 분석하여, 글루쿠로나이드 클로로포르메이트의 형성을 확인하였다. 그 다음, PBD 이량체 42(15 mg, 20 μmol)를 0.7 mL 무수 CH2Cl2 중에 용해시키고 반응 용기에 적가하였다. 상기 반응물을 2 시간에 걸쳐 0℃로 승온시킨 다음, 50 mL CH2Cl2로 희석시켰다. 유기층을 물(50 mL), 식염수(50 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시킨 후, 여과하고 농축시켰다. 미정제 반응 생성물을 CH2Cl2 중 10% MeOH로 용리시켜 1 mm 크로마토트론 플레이트 상에서 방사상 크로마토그래피에 의해 정제하여 약물 링커 46을 얻었다(5.7 mg, 19%). TLC: Rf = 0.47, CH2Cl2 중 10% MeOH. 분석 HPLC (0.1% 포름산): t R 12.09 분. LC-MS: t R 14.05 분, m/z (ES+) 실측치 1500.3 (M+H)+.
(2 S ,3 S ,4 S ,5 R ,6 S )-6-(2-(3- 아미노프로판아미도 )-4-((((3-(( S )-7- 메톡시 -8-(3-((( S )-7-메톡시-2-(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-5,11 a - 디히드로 -1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀-8-일) 옥시 ) 프로폭시 )-5-옥소-5,11 a - 디히드로 -1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀-2-일) 페닐 ) 카르바모일 ) 옥시 ) 메틸 ) 페녹시 )-3,4,5- 트리히드록시 테트라히드로-2 H -피란-2- 카르복실산 (47): 각각 0.2 mL의 MeOH, 테트라하이드로푸란 및 물의 용매 혼합물 중에 용해시킨 46(5.7 mg, 3.8 μmol)을 함유하는 플라스크를 0℃로 냉각시켰다. 교반된 용액에 리튬 히드록사이드 모노하이드레이트(0.8 mg, 19 μmol)를 첨가하고 상기 반응물을 4 시간 동안 상온에서 교반하였으며, 이 시점에서 LC-MS는 생성물로의 전환을 나타내었다. 냉 아세트산(1.1 ㎕, 19 μmol)을 첨가하고 반응물을 농축시켜 47을 얻었으며, 이를 추가의 정제 없이 이후 사용하였다. LC-MS: t R 11.59 분, m/z (ES+) 실측치 1138.4 (M+H)+.
(2 S ,3 S ,4 S ,5 R ,6 S )-6-(2-(3-(6-(2,5- 디옥소 -2,5- 디히드로 -1 H -피롤-1-일) 헥산 아미도) 프로판아미도 )-4-((((3-(( S )-7- 메톡시 -8-(3-((( S )-7- 메톡시 -2-(4- 메톡시페 닐)-5-옥소-5,11 a - 디히드로 -1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀 -8-일) 옥시 ) 프로폭 시)-5-옥소-5,11 a - 디히드로 -1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀 -2-일) 페닐 ) 카르바 모일) 옥시 ) 메틸 ) 페녹시 )-3,4,5- 트리히드록시테트라히드로 -2H-피란-2- 카르복실산 (48): 0.38 mL 무수 DMF 중에 용해시킨 47(4.3 mg, 3.8 μmol)의 용액에 말레이미도카프로일 NHS 에스테르 35(1.2 mg, 3.8 μmol)를 첨가한 후, 디이소프로필에틸아민(4.0 ㎕, 22.8 μmol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 2 시간 동안 질소 하 상온에서 교반하였으며, 이 시점에서 LC-MS가 생성물로의 전환을 나타내었다. 반응물을 아세토니트릴(0.5 mL), DMSO(1 mL), 물(0.5 mL)의 혼합물로 희석시킨 다음, 예비 HPLC로 정제하였다. 이동상은 A = 물 및 B = 아세토니트릴로 구성되었으며, 이들 모두 0.1% 포름산을 함유하였다. 75 분에 걸쳐 90:10 A:B 내지 10:90 A:B의 선형 용리 구배를 이용하였으며 소정의 생성물을 함유하는 분획을 동결 건조시켜 약물 링커 화합물 48을 얻었다(1.2 mg, 2 단계에 걸쳐 24%). 분석 HPLC (0.1% 포름산): t R 10.85 분. LC-MS: t R 12.12 분, m/z (ES+) 실측치 1331.4 (M+H)+, m/z (ES-) 실측치 1329.5 (M-H)-.
반응식 7
Figure pct00105

6-(2,5- 디옥소 -2,5- 디히드로 -1 H -피롤-1-일)- N -(( S )-1-((( S )-1-((3-(( S )-7- 메 톡시-8-((5-((( S )-7- 메톡시 -2-(4-(4- 메틸피페라진 -1-일) 페닐 )-5-옥소-5,11 a - 디히드 로-1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀 -8-일) 옥시 ) 펜틸 ) 옥시 )-5-옥소-5,11 a - 디히드 로-1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀 -2-일) 페닐 )아미노)-1- 옥소프로판 -2-일)아미노)-3- 메틸 -1- 옥소부탄 -2-일) 헥산아미드 (51): 불꽃-건조된 10 mL 플라스크에 산 36(2.7 mg, 7.1 μmol), EEDQ(2.1 mg, 8.5 μmol), 및 1% 메탄올을 함유하는 0.28 mL 무수 CH2Cl2를 넣었다. 상기 반응물을 1 시간 동안 질소 하에 교반한 다음; PBD 이량체 49(5.8 mg, 7.1 μmol)를 첨가하고 반응물을 20 시간 동안 상온에서 교반하였으며, 이 시점에서 LC-MS가 생성물로의 전환을 나타내었다. 상기 반응물을 농축시킨 다음 예비 HPLC로 정제하고 소정의 생성물을 함유하는 분획을 동결건조시켜 약물 링커 화합물 51을 얻었다(2.7 mg, 32%). 분석 HPLC (0.1% 포름산): t R 9.17 분. LC-MS: t R 11.25 분, m/z (ES+) 실측치 1185.3 (M+H)+, m/z (ES-) 실측치 1182.9 (M-H)-.
N -(( S )-1-((( S )-1-((3-(( S )-8-((5-((( S )-2-(4-(3-(디메틸아미노) 프로폭시 ) 페닐 )-7- 메톡시 -5-옥소-5,11 a - 디히드로 -1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀 -8-일) 옥시 ) 펜틸 ) 옥시 )-7- 메톡시 -5-옥소-5,11 a - 디히드로 -1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제 핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1 H -피롤-1-일)헥산아미드 (52): 불꽃-건조된 10 mL 플라스크에 산 36(3.7 mg, 9.7 μmol), EEDQ(2.9 mg, 11.6 μmol), 및 1% 메탄올을 함유하는 0.4 mL 무수 CH2Cl2를 넣었다. 상기 반응물을 1 시간 동안 질소 하에 교반한 다음; PBD 이량체 50(8.0 mg, 9.7 μmol)를 첨가하고 반응물을 6 시간 동안 상온에서 교반하였으며, 이 시점에서 LC-MS가 생성물의 존재를 나타내었다. 상기 반응물을 농축시킨 다음 예비 HPLC로 정제하고 소정의 생성물을 함유하는 분획을 동결건조시켜 약물 링커 화합물 52를 얻었다(3.1 mg, 25%). 분석 HPLC (0.1% 포름산): t R 9.45 분. LC-MS: t R 11.75 분, m/z (ES+) 실측치 1188.4 (M+H)+, m/z (ES-) 실측치 1186.0 (M-H)-.
반응식 8
Figure pct00106

4-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-N-((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-메톡시-8-(3-(((S)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,11a-디히드로-1 H -피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-5-옥소-5,11a-디히드로-1 H -피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)벤즈아미드 (54): 불꽃-건조된 10 mL 플라스크에, CH2Cl2 중 5% MeOH의 0.33 mL 용매 혼합물 중에 용해시킨, 링커 단편 53(7.7 mg, 20 μmol)을 첨가하였다. EEDQ(6.1 mg, 25 μmol)를 첨가하고 반응물을 15 분 동안 질소 하에 상온에서 교반하였으며, 이 시점에 PBD 이량체 37(12 mg, 16.5 μmol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 추가 3 시간 동안 질소 분위기 하에 상온에서 교반하였으며, 이 시점에서 LC-MS가 생성물로의 전환을 나타내었다. 반응물을 CH2Cl2/MeOH 혼합물(100:0 내지 90:10 CH2Cl2/MeOH)로 용리하여 1 mm 크로마토트론 플레이트 상에서 방사상 크로마토그래피에 의해 정제하여 54를 얻었다(2.4 mg, 13%). TLC: Rf = 0.44, CH2Cl2 중 10% MeOH. 분석 HPLC (0.05% 트리플루오로아세트산): t R 11.53 분. LC-MS: t R 12.61 분, m/z (ES+) 실측치 1095.4 (M+H)+, m/z (ES-) 실측치 1093.9 (M-H)-.
(S)-2-(2-아이오도아세트아미도)-N-((S)-1-((4-((S)-7-메톡시-8-(3-(((S)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,11a-디히드로-1 H -피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-5-옥소-5,11a-디히드로-1 H -피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)-3-메틸부탄아미드 (56): 불꽃-건조된 10 mL 플라스크에, CH2Cl2 중 5% MeOH의 0.37 mL 용매 혼합물 중에 용해시킨, 링커 55(7.8 mg, 22 μmol)을 넣었다. EEDQ(6.8 mg, 27.5 μmol)를 첨가하고 반응물을 15 분 동안 질소 하에 상온에서 교반하였으며, 이 시점에 PBD 이량체 37(13 mg, 18 μmol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 추가 4 시간 동안 질소 분위기 하에 상온에서 교반하였으며, 이 시점에서 LC-MS가 생성물로의 전환을 나타내었다. 반응물을 CH2Cl2/MeOH 혼합물(100:0 내지 80:20 CH2Cl2/MeOH)로 용리하여 1 mm 크로마토트론 플레이트 상에서 방사상 크로마토그래피에 의해 정제하여 56을 얻었다(3.5 mg, 18%). 분석 HPLC (0.1% 포름산): t R 11.43 분. LC-MS: t R 12.49 분, m/z (ES+) 실측치 1064.6 (M+H)+, m/z (ES-) 실측치 1098.9 (M+2H2O-H)-.
반응식 9
Figure pct00107

6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-N-((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-메톡시-8-((5-(((S)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,11a-디히드로-1 H -피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)펜틸)옥시)-5-옥소-5,11a-디히드로-1 H -피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)헥산아미드 (58): 불꽃-건조된 10 mL 플라스크에, CH2Cl2 중 5% MeOH의 0.37 mL 용매 혼합물 중에 용해시킨, 링커 단편 36(19 mg, 50 μmol)을 넣었다. EEDQ(12.4 mg, 50 μmol)를 첨가하고 반응물을 15 분 동안 질소 하에 상온에서 교반하였으며, 이 시점에 PBD 이량체 57(12.5 mg, 16.6 μmol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 추가 5 시간 동안 질소 분위기 하에 상온에서 교반하였으며, 이 시점에서 LC-MS가 생성물로의 전환을 나타내었다. 반응물을 CH2Cl2/MeOH 혼합물(100:0 내지 80:20 CH2Cl2/MeOH)로 용리하여 1 mm 크로마토트론 플레이트 상에서 방사상 크로마토그래피에 의해 정제하여 58을 얻었다(2.1 mg, 11%). 분석 HPLC (0.1% 포름산): t R 12.19 분. LC-MS: t R 12.58 분, m/z (ES+) 실측치 1117.8 (M+H)+, m/z (ES-) 실측치 1133.7 (M+H2O-H)-.
반응식 10
Figure pct00108

(R)-2-((R)-2-((((9H- 플루오렌 -9-일) 메톡시 )카르보닐)아미노)-3- 메틸부탄아미도 ) 프로파노산 (60): 불꽃-건조된 플라스크에 Fmoc-D-발린(200 mg, 0.59 mmol) 및 5.9 mL 무수 THF를 넣었다. N-히드록시숙신이미드(75 mg, 0.65 mmol)를 첨가하고, 디이소프로필카르보디이미드(0.1 mL, 0.65 mmol)를 첨가한 후, 상기 반응물을 하룻밤 동안 대기 온도에서 교반하였으며, 이 시점에서 LC-MS가 생성물로의 전환을 나타내었다. 반응물을 CH2Cl2로 희석시키고 물(50 mL), 식염수(50 mL)로 세척한 후, 황산나트륨 상에서 건조시키고 농축시켜 건조시켰다. 상기 물질을 추가의 정제 없이 이후 사용하였다. LC-MS: t R 13.89 분, m/z (ES+) 실측치 437.0 (M+H)+. 미정제 Fmoc-D-Val-OSu(0.59 mmol)를 디메톡시에탄(1.5 mL) 및 THF(0.8 mL) 중에 용해시켰다. D-알라닌(73 mg, 0.89 mmol)을 2.3 mL 물 중에 용해시키고 상기 반응 혼합물에 첨가한 후, 탄산수소나트륨(99 mg, 1.2 mmol)을 첨가하였다. 상기 생성된 슬러리를 하룻밤 동안 상온에서 교반하였으며, 이 시점에서 반응물이 맑아졌고 LC-MS가 완료를 나타내었다. 상기 반응물을 50 mL CH2Cl2에 붓고 유기층을 50 mL 0.1 M HCl로 세척한 다음, 식염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시킨 다음, 농축시켜 건조시켰다. 상기 미정제 생성물을 CH2Cl2로 용리하여 1 mm 크로마토트론 플레이트 상에서 방사상 크로마토그래피에 의해 정제하여 60을 얻었다(128 mg, 54%). TLC: Rf = 0.18, CH2Cl2 중 10% MeOH. 분석 HPLC (0.1% 포름산): t R 9.47 분. LC-MS: t R 13.09 분, m/z (ES+) 실측치 411.1 (M+H)+, m/z (ES-) 실측치 409.2 (M-H)-.
(R)-2-((R)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)-3-메틸부탄아미도) 프로파노산 (61): 보호된 디펩티드 60(70 mg, 0.37 mmol)을 6 mL 무수 CH2Cl2 중에 현탁시키고, 질소 하 얼음 상에서 냉각시킨 후, 2 mL의 디에틸아민을 적가하였다. 상기 반응물을 상온으로 승온시키고 2 시간 동안 질소 하에 교반하였으며, 이 시점에서 HPLC가 출발 물질의 소비를 나타내었다. 상기 반응물을 6 mL의 클로로포름으로 희석시키고 농축시켰다. 상기 미정제 반응 잔류물을 6 mL의 클로로포름 중에 재용해시키고 2회 농축시킨 후, 2 시간 동안 진공 라인 상에서 건조시켰다. 그 다음 상기 탈보호된 디펩티드를 3.7 mL 무수 DMF 중에 용해시켰다. 그 다음 MC-OSu(138 mg, 0.44 mmol)를 첨가하고, 디이소프로필에틸아민(0.32 mL, 1.9 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 하룻밤 동안 상온에서 질소 분위기 하에 교반하였다. 상기 반응물을 50 mL 0.1 M HCl에 붓고 에틸 아세테이트(50 mL, 3x)로 추출함으로써 작업을 수행하였다. 화합된 유기층을 물(50 mL) 및 식염수(50 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시킨 후, 농축시켰다. 미정제 생성물을 CH2Cl2/MeOH 혼합물(99:1 내지 95:5 CH2Cl2/MeOH)로 용리하여 1 mm 크로마토트론 플레이트 상에서 방사상 크로마토그래피에 의해 정제하여 61을 얻었다(14 mg, 22%). 1H NMR (CD3OD) δ (ppm) 0.94 (d, J = 14 Hz, 3H), 0.98 (d, J = 14 Hz, 3H), 1.29 (m, 2H), 1.39 (d, J = 7.4 Hz, 3H), 1.61 (m, 4H), 2.05 (m, 1H), 2.25 (dt, J = 1.2, 7.4 Hz, 2H), 3.48 (t, J = 7 Hz, 2H), 4.19 (m, 1H), 4.37 (m, 1H), 6.78 (s, 2H). 분석 HPLC (0.1% 포름산): t R 10.04 분. LC-MS: t R 11.22 분, m/z (ES+) 실측치 382.1 (M+H)+, m/z (ES-) 실측치 380.0 (M-H)-.
6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-N-((R)-1-(((R)-1-((4-((S)-7-메톡시-8-(3-(((S)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,11a-디히드로-1 H -피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-5-옥소-5,11a-디히드로-1 H -피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)헥산아미드 (62): 불꽃-건조된 10 mL 플라스크에, CH2Cl2 중 5% MeOH의 0.33 mL 용매 혼합물 중에 용해시킨, 링커 61(9.5 mg, 25 μmol)을 첨가하였다. EEDQ(7.3 mg, 30 μmol)를 첨가하고 반응물을 15 분 동안 질소 하에 상온에서 교반하였으며, 이 시점에 PBD 이량체 37(12 mg, 16.5 μmol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 추가 3 시간 동안 질소 분위기 하에 상온에서 교반하였으며, 이 시점에서 LC-MS가 생성물로의 전환을 나타내었다. 반응물을 CH2Cl2/MeOH 혼합물(100:0 내지 80:20 CH2Cl2/MeOH)로 용리하여 1 mm 크로마토트론 플레이트 상에서 방사상 크로마토그래피에 의해 정제하여 62를 얻었다(2.8 mg, 16%). TLC: Rf = 0.39, CH2Cl2 중 10% MeOH. 분석 HPLC (0.1% 포름산): t R 11.50 분. LC-MS: t R 12.50 분, m/z (ES+) 실측치 1089.7 (M+H)+, m/z (ES-) 실측치 1088.0 (M-H)-.
반응식 11
Figure pct00109

(S)-2-(6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미도)프로파노산 (64): L-알라닌(58 mg, 0.65 mmol)을 6.5 mL 무수 DMF 중에 현탁시킨 다음, MC-OSu 35(100 mg, 0.324 mmol)를 첨가하였다. 디이소프로필에틸아민(0.28 mL, 1.6 mmol)을 첨가하고 상기 반응물을 질소 하에 상온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 상기 반응물을 50 mL 0.1 M HCl로 희석시킨 다음 수층을 에틸 아세테이트(50 mL, 3x)로 추출하였다. 그 다음 화합된 유기층을 물(50 mL) 및 식염수(50 mL)로 세척하고 황산나트륨 상에서 건조시킨 다음, 농축시켜 건조시켰다. 반응물을 CH2Cl2/MeOH 혼합물(97.5:2.5 내지 90:10 CH2Cl2/MeOH)로 용리하여 1 mm 크로마토트론 플레이트 상에서 방사상 크로마토그래피에 의해 정제하여 64를 얻었다(25 mg, 27%). TLC: Rf = 0.25, CH2Cl2 중 10% MeOH. 1H NMR (CD3OD) δ (ppm) 1.30 (m, 2H), 1.37 (d, J = 7.4 Hz, 3H), 1.60 (m, 4H), 2.21 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 3.48 (t, J = 7 Hz, 2H), 4.35 (q, J = 7.4 Hz, 1H), 6.78 (s, 2H). 분석 HPLC (0.1% 포름산): t R 9.06 분.
6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-N-((S)-1-((4-((S)-7-메톡시-8-(3-(((S)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,11a-디히드로-1 H -피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-5-옥소-5,11a-디히드로-1 H -피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)헥산아미드 (65): 불꽃-건조된 10 mL 플라스크에, CH2Cl2 중 5% MeOH의 0.66 mL 용매 혼합물 중에 용해시킨, 링커 64(14 mg, 50 μmol)을 첨가하였다. EEDQ(15 mg, 60 μmol)를 첨가하고 반응물을 15 분 동안 질소 하에 상온에서 교반하였으며, 이 시점에 PBD 이량체 37(24 mg, 33 μmol)을 첨가하였다. 상기 반응물을 추가 4 시간 동안 질소 분위기 하에 상온에서 교반하였다. 반응물을 CH2Cl2/MeOH 혼합물(100:0 내지 90:10 CH2Cl2/MeOH)로 용리하여 1 mm 크로마토트론 플레이트 상에서 방사상 크로마토그래피에 의해 정제하여 65를 얻었다(3.5 mg, 11%). 분석 HPLC (0.1% 포름산): t R 11.40 분. LC-MS: t R 12.39 분, m/z (ES+) 실측치 990.6 (M+H)+, m/z (ES-) 실측치 989.0 (M-H)-.
반응식 12
Figure pct00110

말레이미도카프로일 스페이서를 통해 직접 결합된 PBD 이량체 57 (반응식 14): PBD 이량체 57을 반응식 2에 설명된 화학적 성질을 이용하여 말레이미도카프로산 39에 결합시킨다.
반응식 13
Figure pct00111

6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-N-(2-((S)-7-메톡시-8-(3-(((S)-7-메 톡 시-2-(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-5,11a- 디히드로 -1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아 제핀-8-일) 옥시 ) 프로폭시 )-5-옥소-5,11a- 디히드로 -1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아 제핀-2-일) 페닐 ) 헥산아미드 (68): CH2Cl2(300 mL) 중의 66(10 mg, 0.013 mmol)의 혼합물에 DIPEA 및 MC-Cl(67)(3 mg, 0.013 mmol)을 첨가하였다. 1 시간 후, DIPEA의 추가 3 당량(7 mL) 및 산 염화물의 추가 2 당량(6 mg, 0.026 mmol)을 첨가하였다. 1 시간 후, DIPEA의 추가량(7 mL) 및 산 염화물의 추가량(6 mg, 0.026 mmol)을 첨가하였다. 추가 3 시간 후, 상기 반응 혼합물을 1mm 방사 크로마토트론 플레이트 상에 직접적으로 흡인시키고 디클로로메탄으로 용리시킨 후 디클로로메탄 중 메탄올의 구배(1% 내지 5%)로 용리시켰다. 출발 아닐린과의 혼합물로서, 생성물 함유 분획을 잔류물로 농축시키고 0.5 mL DMSO, 0.5 mL 아세토니트릴 및 0.5 mL 탈이온수의 혼합물 중에 용해시킨 후 예비 HPLC로 추가적으로 정제하였다. 주요 피크를 수집하고 상기 분획을 화합하여 동결시키고 동결건조시켜 2.1 mg을 얻었다(18%): MS (ES+) m/z 919.2 [M+H]+.
주석(note): 산 염화물 67은 옥살일 클로라이드(5 mL) 중에 100 mg의 39를 용해시켜 제조하였다. 한 방울의 DMF를 첨가하고 혼합물을 수 시간 동안 대기 온도에서 교반하고 감압 하에 농축시켰다. 디클로로메탄을 첨가하고 혼합물을 두 번째로 농축시켜 오프-화이트색의 고체를 얻었으며 이를 직접 사용하였다: 1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ 6.70 (s, 2H), 3.46 (t, J = 7 Hz, 2H), 2.82 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.72 (pent, J = 7.6 Hz, 2H), 1.61 (pent, J = 7.4 Hz, 2H), 1.35 (pent, J = 7.6 Hz, 2H).
반응식 14
Figure pct00112

터트 -부틸 2-(2- 아미노아세트아미도 )아세테이트 (69): 디클로로메탄(25 mL) 중 글리신 터트-부틸 에스테르 염화수소 염(70)(484 mg, 2.9 mmol)의 혼합물에 Fmoc-Gly-OH(71)(0.861 mg, 2.99 mmol), DIPEA(756 mg, 4.35 mmol) 및 HATU(1.3 g, 3.5 mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 16 시간 동안 대기 온도에서 교반한 다음 에틸 아세테이트에 붓고 물(3X) 및 식염수(1X)로 세척하였다. 유기상을 MgSO4 상에서 건조시키고 여과한 후 감압 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 5% 메탄올/디클로로메탄으로 용리하여 2 mm 플레이트 상에서 방사상 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 감압 하에 농축시키고 1 시간 동안 20% 피페리딘/디클로로메탄(10 mL)으로 처리한 후, 감압 하에 농축시킨 다음 5 내지 10% 메탄올/디클로로메탄의 구배로 용리하여 2 mm 플레이트 상에서 방사상 크로마토그래피에 의해 2회 정제하여 200 mg, 37%을 얻었다: 1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ 7.62 (s, 1H), 4.00 (s, 2H), 3.39 (s, 2H), 1.47 (s, 9H).
2-(2-(6-(2,5- 디옥소 -2,5- 디히드로 -1H-피롤-1-일) 헥산아미도 ) 아세트아미도 )아세트산 (72): DMF(1 mL) 중 아민 69(200 mg, 0.11 mmol)의 용액에 35( 350 mg, 0.11 mmol)를 첨가하고 반응 혼합물을 2 시간 동안 대기 온도에서 교반하였다. 상기 혼합물을 감압 하에 농축시키고 디클로로메탄, 및 디클로로메탄 중 메탄올의 구배(1 내지 5%)로 용리하여 1 mm 플레이트 상에서 방사상 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 감압 하에 농축시키고 디클로로메탄(4 mL) 중에 용해시킨 후 트리플루오로아세트산(4 mL)으로 처리하였다. 40 분 후, 혼합물을 감압 하에 농축시키고 생성된 잔류물을 디클로로메탄 중에 용해시킨 후 농축시켜 흰색 고체로서 22.5 mg(19%)의 72를 얻었다: 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ 6.79 (s, 2H), 3.93 (s, 2H), 3.89 (s, 2H), 3.49 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.26 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 1.61 (m, 4H), 1.34 (m, 2H); MS (ES+) m/z 326.21 [M+H]+.
6-(2,5- 디옥소 -2,5- 디히드로 -1H-피롤-1-일)-N-(2-((2-((4-((S)-7- 메톡시 -8-(3-(((S)-7-메톡시-2-(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-5,11a- 디히드로 -1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀-8-일) 옥시 ) 프로폭시 )-5-옥소-5,11a- 디히드로 -1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀-2-일) 페닐 )아미노)-2- 옥소에틸 )아미노)-2- 옥소에틸 ) 헥산아미 드 (73): 5% 메탄올/디클로로메탄(0.5 mL) 중 72(15 mg, 0.046 mmol)의 혼합물에 EEDQ(11 mg, 0.046 mmol)를 첨가하고 혼합물을 대기 온도에서 30 분 동안 교반하였으며, 이 시점에 37(16 mg, 0.023 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 3 시간 동안 교반하고 곧바로 1% 내지 4% 메탄올/디클로로메탄 구배로 용리하여 1 mm 방사 크로마토트론 플레이트 상에서 정제하여 황색 고체로서 6.8 mg(29%)의 73을 얻었다: MS (ES+) m/z 1033.57 [M+H]+.
반응식 15
Figure pct00113

(S)- 터트 -부틸 1-((S)- 피롤리딘 -2-카르보닐) 피롤리딘 -2- 카르복실레이트 (74): 디클로로메탄(50 mL) 중 L-프롤린-터트-부틸 에스테르 염화수소 염 75(0.5 g, 2.9 mmol)의 혼합물에 76(0.98 g, 2.99 mmol), DIPEA(756 mg, 4.35 mmol) 및 HATU(1.3 g, 3.5 mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 16 시간 동안 대기 온도에서 교반하였다. 상기 혼합물을 에틸 아세테이트(100 mL)에 붓고 0.2 N HCl(50 mL), 물(50 mL), 식염수(50 mL)로 세척한 후 MgSO4 상에서 건조시켰다. 헥산 중 10% 에틸 아세테이트로 용리하여 2 mm 방사 크로마토트론 플레이트 상에서 크로마토그래피를 수행하였다. 생성물-함유 분획을 감압 하에 농축시키고, 디클로로메탄(8 mL) 중에 용해시킨 후 피페리딘(2 mL)으로 처리하였다. 상기 혼합물을 1 시간 동안 교반하고, 감압 하에 농축시킨 후 5% 메탄올/디클로로메탄으로 용리하여 2 mm 방사 크로마토트론 플레이트 상에서 정제하였다. 이로써 200 mg(26%)의 디펩티드 74를 얻었다: 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.41 (m, 1H), 4.17 (m, 1H), 3.82 (m, 1H), 3.57 (m, 4H), 3.2 (m, 1H), 2.82 (m, 1H), 2.83-1.65 (m, 5H), 1.44 (m, 9H).
(S)- 터트 -부틸 1-((S)-1-(6-(2,5- 디옥소 -2,5- 디히드로 -1H-피롤-1-일) 헥사노 일) 피롤리딘 -2-카르보닐) 피롤리딘 -2- 카르복실레이트 (77): 아민 74(200 mg, 0.75 mmol), 39(190 mg, 0.9 mmol) 및 DIPEA(0.32 mL, 1.8 mmol)의 혼합물에 HATU(342 mg, 0.9 mmol)를 첨가하고 상기 혼합물을 5 시간 동안 대기 온도에서 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트(100 mL)에 붓고 물(3X100 mL), 식염수(1X100 mL)로 세척하였다. 유기상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과한 후 농축시켰다. 생성된 잔류물을 디클로로메탄으로 용리한 후 디클로로메탄 중 1 내지 5% 메탄올의 증가하는 구배로 용리하여 2 mm 방사 크로마토트론 플레이트 상에서 방사상 크로마토그래피를 수행하였다. 둘다 디클로로메탄 중 1 내지 5% 메탄올의 구배로 용리하고, 처음은 2 mm 플레이트 상에서 수행하고 그 다음은 1 mm 플레이트 상에서 수행하는 2번의 추가 정제를 통해 흰색 고체로서 113 mg(33%)의 77을 얻었다: 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.63 (m, 1H), 4.41 (m, 1H), 3.82 (m, 1H), 3.6 3 (m, 1H), 3.55 (m, 1H), 3.45 (m, 3H), 2.38-1.83 (m, 10H), 1.70-1.50 (m, 5H), 1.45 (m, 9H), 1.35 (m, 2H); MS (ES+) m/z 462.33 [M+H]+.
(S)-1-((S)-1-(6-(2,5- 디옥소 -2,5- 디히드로 -1H-피롤-1-일) 헥사노일 ) 피롤리딘 -2-카르보닐) 피롤리딘 -2- 카르복실산 (78): 디클로로메탄(4 mL) 중 터트-부틸 에스테르 77의 혼합물에 트리플루오로아세트산(4 mL)을 첨가하였다. 40 분 후, 상기 반응물에 대해 HPLC 분석을 통해 완료 여부를 측정하였다. 상기 혼합물을 감압 하에 농축시키고 생성된 잔류물을 디클로로메탄 중에 용해시킨 후 두 번째로 농축시켜 흰색 고체로서 37 mg(100%)의 78을 얻었다: 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.68 (s, 2H), 4.62 (m, 2H), 3.81 (m, 1H), 3.70 (m, 1H), 3.57 (m, 2H), 3.45 (m, 2H), 2.40-1.91 (m, 10H), 1.70-1.45 (m, 4H), 1.33 (m, 2H); MS (ES+) m/z 406.2 [M+H]+.
1-(1-(6-(2,5- 디옥소 -2,5- 디히드로 -1H-피롤-1-일) 헥사노일 ) 피롤리딘 -2-카르보닐)-N-(4-((S)-7- 메톡시 -8-(3-(((S)-7- 메톡시 -2-(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-5,11a- 디 히드로-1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀 -8-일) 옥시 ) 프로폭시 )-5-옥소-5,11a- 디 히드로-1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀 -2-일) 페닐 ) 피롤리딘 -2- 카르복사미드 (79): 5% 메탄올/디클로로메탄(0.4 mL) 중 78(9.3 mg, 0.023 mmol)의 혼합물에 EEDQ(7 mg, 0.027 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 대기 온도에서 15 분 동안 교반한 다음 37(15 mg, 0.021 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 4 시간 동안 교반하고, 반응 혼합물을 디클로로메탄(2mL)으로 희석시킨 후 1 mm 방사 크로마토트론 플레이트 상에 직접적으로 흡인시켰다. 생성물을 디클로로메탄 중 1 내지 5% 메탄올의 구배로 용리하여 황색 고체로서 6.8 mg(29%)의 79를 얻었다: MS (ES+) m/z 1113.51 [M+H]+.
반응식 16
Figure pct00114

(S)-5-( 알릴옥시 )-2-((S)-2-((( 알릴옥시 )카르보닐)아미노)-3- 메틸부탄아미도 )-5- 옥소펜타노산 (80): 디클로로메탄(10 ml) 중에 현탁시킨 2-클로로트리틸 수지(1.0 g, 1.01 mmol)의 혼합물에 Fmoc-Glu-(OAllyl)-OH(81)(409 mg, 1.0 mmol) 및 DIPEA(173 mL, 1.0 mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 5 분 동안 진탕한 후, 추가량의 DIPEA(260 mL, 1.5 mmol)를 첨가하고 상기 혼합물을 1 시간 동안 진탕하였다. 메탄올(0.8 mL)을 첨가하고 상기 혼합물을 5 분 동안 진탕한 후, 여과하고 DMF(6X), 디클로로메탄(6X), 디에틸 에테르(6X)로 세척한 후 감압 하에 건조시켰다. 생성된 수지를 1 시간 동안 디클로로메탄(10 mL) 중 20% 피페리딘에 가한 후, 여과하고 DMF(6X), 디클로로메탄(6X), 디에틸 에테르(6X)로 세척한 후 감압 하에 건조시켰다.
DMF(7 mL) 중 Fmoc-Val-OH(82)(1.03 g, 3.30 mmol)의 혼합물에 DIPEA(1.0 mL) 및 HATU(1.1 g, 3.03 mmol)를 첨가하였다. 완전한 혼합 후, 상기 용액을 상기에서 제조된 수지를 함유하는 10 mL 시린지 내로 흡인시켰다. 상기 혼합물을 캡핑하고 16 시간 동안 진탕하였다. 상기 수지를 DMF(6X), 디클로로메탄(6X) 및 에테르(6X)로 세척하였다. 소량(10 mg)을 분리하고 20% TFA/디클로로메탄으로 처리한 후 생성된 용액을 LC-MS로 분석하자 정확한 질량(MS (ES+) m/z 509.28 [M+H]+)을 나타내는 하나의 고순도 피크가 나타났다. 그 다음 나머지 수지를 2 시간 동안 20% 피페리딘/DMF(8 mL)로 처리한 후, DMF(6X), 디클로로메탄(6X), 디에틸 에테르(6X)로 세척하고 감압 하에 건조시켰다.
디클로로메탄(10 mL) 중 알릴 클로로포르메이트(529 mL, 5.05 mmol), DIPEA(1.7 mL, 10 mmol)의 혼합물을 제조하고 상기 수지를 함유하는 시린지에 흡인시켰다. 상기 혼합물을 캡핑하고 진탕하였다. 약 2 시간 후, 상기 반응 혼합물을 배출시키고, 디클로로메탄(6X)으로 세척하였다. 소량의 수지(~10 mg)를 20% TFA/디클로로메탄으로 분할하여 출발 물질 및 생성물의 질량에 대하여 LC-MS로 분석하였다. 주성분이 여전히 미반응 아민이어서, 상기 수지를 다시 상기 기재된 조건으로 처리하였다. 4 시간 후, 상기 수지를 디클로로메탄(6X)으로 세척한 다음, 디클로로메탄 중 5% TFA로 반복적으로 처리하였다(4 X 7 mL). 생성된 용액을 감압 하에 농축시켰다. 상기 혼합물을 5% 메탄올/디클로로메탄으로 용리하여 2 mm 방사 크로마토트론 플레이트 상에서 정제하여 107 mg의 80을 얻었다: 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.05 (s, 1H), 5.90 (m, 2H), 5.57 (d, 1H), 5.29 (d, J = 14.7 Hz, 2H), 5.22 (t, J = 10.9 Hz, 2H), 4.59 (m, 5H), 4.02 (m, 1H), 2.60-2.40 (m, 2H), 2.37-2.18 (m, 1H), 2.17-2.02 (m, 2H), 0.96 (d, J=6.4 Hz, 3H), 0.93 (d, J = 6.6 Hz, 3H); MS (ES+) m/z 371.12 [M+H]+.
(S)-알릴 4-((S)-2-((( 알릴옥시 )카르보닐)아미노)-3- 메틸부탄아미도 )-5-((4-((S)-7-메톡시-8-(3-(((S)-7- 메톡시 -2-(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-5,11a- 디히드로 -1 H -피롤로[ 2,1- c ][1,4]벤조디아제핀 -8-일) 옥시 ) 프로폭시 )-5-옥소-5,11a- 디히드로 -1 H -피롤로[ 2,1- c ][1,4]벤조디아제핀 -2-일) 페닐 )아미노)-5- 옥소펜타노에이트 (83): 5% 메탄올/디클로로메탄(1 mL) 중 산 80(30, 0.04 mmol)의 혼합물에 EEDQ(20 mg, 0.082 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 대기 온도에서 30 분 동안 교반한 다음 37(30 mg, 0.04 mmol)을 첨가하고 혼합물을 약 5 시간 동안 교반하였다. 1 mm 방사 크로마토트론 플레이트 상으로 직접적으로 흡인시키고 1% 내지 5% 메탄올/디클로로메탄의 구배로 용리하여 부분적으로 정제함으로써 소정의 생성물 및 37의 혼합물(26 mg; 각각 ~3:1)을 얻고 이를 추가의 정제 없이 이후 사용하였다.
(S)-4-((S)-2-아미노-3- 메틸부탄아미도 )-5-((4-((S)-7- 메톡시 -8-(3-(((S)-7-메톡시-2-(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-5,11a- 디히드로 -1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제 핀-8-일) 옥시 ) 프로폭시 )-5-옥소-5,11a- 디히드로 -1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제 핀-2-일) 페닐 )아미노)-5- 옥소펜타노산 (84): 무수 디클로로메탄(3 mL) 중 83 및 37(26 mg)의 혼합물에 Ph3P(0.3 mg, 0.0012 mmol), 피롤리딘(4 mL, 0.048 mmol) 및 테트라키스 팔라듐(0.7 mg, 0.6 mmol)을 첨가하였다. 2 시간 후, 추가량(0.7 mg, 0.6 mmol)의 테트라키스 팔라듐을 첨가하고 상기 반응물을 추가 1 시간 동안 교반한 후 감압 하에 농축시켰다. 상기 잔류물을 DMSO(1 mL), 0.05% 포름산 함유 아세토니트릴(1 mL) 및 0.05% 포름산 함유 물(1 mL) 중에 용해시키고 분취용 역상 HPLC로 정제하였다. 단일 분획의 생성물을 수집하고 동결 건조시켜 6 mg의 84를 얻었다(두 단계에 대하여 14%): MS (ES+) m/z 1078.6 [M+H]+.
(S)-4-((S)-2-(6-(2,5- 디옥소 -2,5- 디히드로 -1H-피롤-1-일) 헥산아미도 )-3- 메 틸부탄아미도)-5-((4-((S)-7- 메톡시 -8-(3-(((S)-7- 메톡시 -2-(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-5,11a-디히드로-1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀 -8-일) 옥시 ) 프로폭시 )-5-옥소-5,11a-디히드로-1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀 -2-일) 페닐 )아미노)-5- 옥소펜타 노산 (85): DMF(200 mL) 중 84(6 mg, 6 mmol), 및 35(2 mg, 6 mmol)의 혼합물에 DIPEA(3 mL, 18 mmol)를 첨가하고 상기 반응 혼합물을 대기 온도에서 교반하였다. 1 시간 후, 추가 당량의 35(2 mg, 6 mmol)를 첨가하고 반응물을 3 시간 동안 대기 온도에서 교반하며 유지하였다. 세 번째 당량의 35(2 mg, 6 mmol)를 첨가하고 상기 혼합물을 약 1 시간 동안 교반한 후, 감압 하에 농축시키고, 디클로로메탄 중에 용해시킨 다음 1 mm 방사 크로마토트론 플레이트 상에 직접적으로 흡인시킨 후 디클로로메탄 중 5% 메탄올로 용리하였다. 이로써 2.5 mg(36%)의 고순도 85를 얻었다: MS (ES+) m/z 1147.49 [M+H]+.
(21S,24S)-1-(2,5- 디옥소 -2,5- 디히드로 -1H-피롤-1-일)-21-이소프로필-24-((4-((S)-7-메톡시-8-(3-(((S)-7- 메톡시 -2-(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-5,11a- 디히드로 -1 H -피 롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제 핀-8-일) 옥시 ) 프로폭시 )-5-옥소-5,11a- 디히드로 -1 H -피 롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제 핀-2-일) 페닐 ) 카바모일 )-3,19,22- 트리옥소 -7,10,13,16-테트라옥사-4,20,23- 트리아자헵타코산 -27- 오익 산 (86): DMF(200 mL) 중 84(8mg, 8.4 mmol) 및 Mal-PEG4-NHS(87)(6.5 mg, 12.6 mmol)의 혼합물에 DIPEA(4.3 mL, 25 mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 2 시간 동안 대기 온도에서 교반하고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 디클로로메탄 중에 용해시키고 1 mm 방사 크로마토트론 플레이트 상에 흡인시켰다. 상기 물질은 극성이었으며 실리카 겔-기초의 크로마토트론 플레이트 상에서 크로마토그래피 하지 않았다. 상기 플레이트를 메탄올로 용리하고 감압 하에 분리하여 혼합물을 회수하였다. 잔류 물질을 분취용 역상 HPLC를 통해 정제하였다. 용리된 단일의 주요 피크 및 분획을 화합하고, 동결한 후 동결건조시켜 0.9 mg(8 %)의 86의 잔류물을 얻었다: MS (ES+) m/z 1353.04 [M+H]+.
반응식 17
Figure pct00115

(S)-6-(디메틸아미노)-2-(6-(2,5- 디옥소 -2,5- 디히드로 -1H-피롤-1-일) 헥산아미도 ) 헥사노산 (88): CH2Cl2(10 ml) 중 2-클로로트리틸 수지(1 g, 1.01 mmol)의 혼합물에 Fmoc-Lys(Me)2-OH(89)(432 mg, 1.0 mmol) 및 DIPEA(433 mL, 2.5 mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 1 시간 동안 진탕하였다. 메탄올(0.8 mL)을 첨가하고 혼합물을 추가 5 분 동안 진탕한 후 여과하고 DMF(6x), 디클로로메탄(6x), 디에틸 에테르(6x)로 세척한 뒤 감압 하에 건조시켰다. 상기 건조된 수지를 1 시간 동안 DMF(10 mL) 중 20% 피페리딘으로 처리하고, 여과한 후 DMF(6X), 디클로로메탄(6X), 디에틸 에테르(6X)로 세척하였다.
DMF(7 mL) 중 39(3.0 mmol, 633 mg)의 혼합물에 DIPEA(1.0 mL) 및 HATU(1.1 g, 3.03 mmol)를 첨가하였다. 완전한 혼합 후, 상기 용액을 상기 수지를 함유하는 10 mL 시린지에 흡인시켰다. 상기 혼합물을 캡핑하고, 16 시간 동안 진탕한 후, 여과하고 수지를 DMF(6X), 디클로로메탄(6X), 및 에틸 에테르(6X)로 세척하였다. 상기 수지를 5% TFA/디클로로메탄으로 반복적으로 처리하고(6 mLX5), 1 분 동안 진탕한 다음, 여과하였다. 생성된 용액을 감압 및 고도의 진공 하에 농축시켰다. 상기 물질을 분취용 역상 HPLC로 정제하여 208 mg의 88을 얻었다: 1H-NMR (400 MHz, CD3OH/CDCl3 1:1 혼합물 ) δ 6.73 (s, 2H), 4.41 (m, 1H), 3.48 (t, 2H), 3.31 (s, 1H), 3.03 (m, 2H), 2.84 (s, 6H), 2.22 (m, 2H), 1.87 (m, 2H), 1.78-1.52 (m, 6H), 1.43 (m, 2H), 1.31 (pent, 2H); MS (ES+) m/z 386.28 [M+H]+.
(S)-6-(디메틸아미노)-2-(6-(2,5- 디옥소 -2,5- 디히드로 -1H-피롤-1-일) 헥산아 미도)-N-(4-((S)-7- 메톡시 -8-(3-(((S)-7- 메톡시 -2-(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-5,11a- 디 히드로-1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀 -8-일) 옥시 ) 프로폭시 )-5-옥소-5,11a- 디 히드로-1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀 -2-일) 페닐 ) 헥산아미드 (90): 5% 메탄올/디클로로메탄(400 mL) 중 88(9.3 mg, 0.023 mmol)의 혼합물에 EEDQ(7 mg, 0.027 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 대기 온도에서 30 분 동안 교반한 다음 37(15 mg, 0.021 mmol)을 첨가하였다. 4 시간 후, 상기 혼합물을 감압 하에 농축시키고, DMSO(1 mL), 아세토니트릴(0.05 % 포름산 함유 2 mL) 및 물(0.05 % 포름산 함유 1 mL)의 혼합물 중에 용해시킨 후 역상 HPLC로 정제하였다(방법 A). 생성물 함유 분획을 37로 오염시키고, 상기 분획을 동결건조시켜 잔류물을 얻고 이를 상기 기재한 바와 같이 재정제하여 0.5 mg(2 %)의 순수 90을 얻었다: MS (ES+) m/z 537.46 [M+H]/2+.
반응식 18
Figure pct00116

알릴 ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7- 메톡시 -8-(3-(((S)-7- 메톡시 -2-(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-5,11a- 디히드로 -1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀 -8-일) 옥시 ) 프로폭 시)-5-옥소-5,11a- 디히드로 -1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀 -2-일) 페닐 )아미노)-1-옥 소프로 판-2-일)아미노)-3- 메틸 -1- 옥소부탄 -2-일) 카바메이트 (91): 5% 메탄올/디클로로메탄(1 mL) 중 92(45 mg, 0.123 mmol)의 혼합물에 EEDQ(30.4 mg, 0.123 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 대기 온도에서 30 분 동안 교반한 다음 37(30 mg, 0.041 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 약 5 시간 동안 교반한 다음 5% 메탄올/디클로로메탄으로 용리하여 1 mm 방사 크로마토트론 플레이트 상에서 정제하여 22mg(55%)의 91을 얻었으며 이를 특성 분석하지 않고 곧바로 사용하였다.
1-(3-(2,5- 디옥소 -2,5- 디히드로 -1H-피롤-1-일) 프로판아미도 )-N-((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-메톡시-8-(3-(((S)-7- 메톡시 -2-(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-5,11a-디히드로-1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀 -8-일) 옥시 ) 프로폭시 )-5-옥소-5,11a-디히드로-1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤조디아제핀 -2-일) 페닐 )아미노)-1- 옥소프로판 -2-일)아미노)-3- 메틸 -1- 옥소부탄 -2-일)-3,6,9,12- 테트라옥사펜타데칸 -15-아미드 (93): 무수 디클로로메탄(3 mL) 중 91(22 mg, 0.022 mmol)의 용액에 Ph3P(0.3 mg, 0.0012 mmol), 피롤리딘(4 mL, 0.048 mmol) 및 테트라키스 팔라듐(0.7 mg, 6 mmol)을 첨가하였다. 약 2 시간 후, 상기 반응 혼합물을 5% 내지 10% 메탄올/디클로로메탄으로 용리하여 1 mm 방사 크로마토트론 플레이트 상에서 정제하였다. 주요 밴드를 수집하고 농축시켜 잔류물을 얻고 이를 DMF(0.2 mL) 중에 용해시키고 NHS 에스테르 87(10 mg, 0.19 mmol)과 반응시켰다. 상기 반응물을 30 분 동안 교반하고, 농축시킨 후 5% 메탄올/디클로로메탄으로 용리하여 1 mm 플레이트 상에서 방사상 크로마토그래피에 의해 정제하여 3.2 mg(11%)의 93을 얻었다: MS (ES+) m/z 1294.7 [M+H]+.
반응식 19
Figure pct00117

(E)-6-(2,5- 디옥소 -2,5- 디히드로 -1H-피롤-1-일)- N' -(4-((S)-7- 메톡시 -8-((5-(((S)-7-메톡시-2-(4- 메톡시페닐 )-5-옥소-5,11a- 디히드로 -1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤 조디아제핀-8-일) 옥시 ) 펜틸 ) 옥시 )-5-옥소-5,11a- 디히드로 -1 H - 피롤로[2,1- c ][1,4]벤 조디아제핀-2-일) 벤질리덴 ) 헥산히드라진 (94): 0℃에서 5% 메탄올/디클로로메탄 중 알데히드 95(5.4 mg, 7 mmol)의 혼합물에 히드라지드-TFA 염 96(4.5 mg, 14 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 대기 온도로 승온시키고 5 시간 동안 교반한 후 감압 하에 농축시키고 3% 메탄올/디클로로메탄으로 용리하여 실리카 겔 컬럼 상에서 정제하여 2.2 mg(32%)의 94를 얻었다: MS (ES+) m/z 974.49 [M+H]+.
반응식 20
Figure pct00118

(S)- 터트 -부틸 2-((S)-2-아미노-3- 메틸부탄아미도 ) 프로파노에이트 (97): 디클로로메탄(5 mL) 중 알라닌-O-터트-부틸 에스테르 염화수소 염(98)(500 mg, 2.76 mmol)의 혼합물에 Fmoc-val-OSu(99)(1.09 g, 2.51 mmol)를 첨가하였다. DIPEA(0.96 ml, 5.5 mmol)를 첨가하고 상기 반응 혼합물을 16 시간 동안 대기 온도에서 교반하였다. 혼합물을 디클로로메탄(100 mL)에 붓고 1N HCl(50 mL) 및 물(50 mL)로 세척한 후 황산 마그네슘 상에서 건조시켰다. 상기 물질을 1 내지 5% 메탄올/디클로로메탄 구배로 용리하여 2 mm 방사 크로마토트론 플레이트 상에서 크로마토그래피하고 생성물 함유 분획을 화합한 후 농축시켰다. 생성된 잔류물을 디클로로메탄(16 mL) 중에 용해시키고 피페리딘(4 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 10 분 동안 교반한 후 감압 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 암모니아-포화된 디클로로메탄으로 먼저 용리한 후 암모니아-포화된 디클로로메탄 중 5% 메탄올로 용리하여 2 mm 플레이트 상에서 크로마토그래피 하여 494 mg(2.02 mmol, 두 단계에 대하여 81%)의 97을 얻었다: 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.78 (bs, 1H), 4.47 (m, 1H), 3.30 (d, 1H), 2.30 (m, 1H), 1.38 (d, 3H), 1.47 (s, 9H), 1.00 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.84 (d, J = 6.9 Hz, 3H).
(S)- 터트 -부틸 2-((S)-2-(4-(2,5- 디옥소 -2,5- 디히드로 -1H-피롤-1-일) 벤즈아 미도)-3- 메틸부탄아미도 ) 프로파노에이트 (100): 97(100 mg, 0.41 mmol) 및 4-말레이미도벤조산(101)(98 mg, 0.45 mmol)의 혼합물에 디클로로메탄(5 mL)을 첨가한 후, TBTU(157 mg, 0.49 mmol) 및 DIPEA(212 uL, 1.23 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 16 시간 동안 대기 온도에서 교반한 다음 헥산 중 50% 에틸 아세테이트로 용리하여 2 mm 방사 크로마토트론 플레이트 상에서 정제하여 95 mg(51%)의 100을 얻었다: 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.85 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 7.42 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 6.81 (s, 2H), 6.38 (bs, 1H), 4.43 (m, 2H), 2.14 (sept, J = 6.6 Hz, 1H), 1.41 (s, 9H), 1.31 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.98 (m, 6H); MS (ES-) m/z 441.90 [M-H]-.
(R)-2-((S)-2-(4-(2,5- 디옥소 -2,5- 디히드로 -1H-피롤-1-일) 벤즈아미도 )-3- 메 틸부탄아미도) 프로파노산 (53): 디클로로메탄(5 mL) 중 100(47 mg, 0.11 mmol)의 혼합물에 트리플루오로아세트산(5 mL)을 첨가하고 상기 반응 혼합물을 TLC로 모니터링하였다(헥산 중 50% 에틸 아세테이트, 5 분 동안 고도의 진공 하에 TLC 플레이트 아래로 펌핑 후). 75 분 후, 출발 물질이 TLC에 의해 검출될 수 없었다. 상기 반응을 동일한 조건을 이용하여 두 번째로 수행하고 두 반응 유래의 물질을 화합한 후 디클로로메탄 중 5-10% 메탄올의 구배로 용리하여 2 mm 방사 크로마토트론 플레이트 상에서 정제하였다. 수율은 42 mg(49%)의 53이었다: 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.92 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 7.51 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 7.0 (m, 1H), 6.89 (s, 2H), 6.70 (s, 1H), 4.60 M, 1H), 2.22 (m, 1H), 1.18 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 1.04 (m, 6H); MS (ES+) m/z 388.02 [M+H]+.
(S)-2-((S)-2-(2-아이오도아세트아미도)-3-메틸부탄아미도)프로파노산 (102): 디클로로메탄 중 97(100 mg, 0.41 mmol)의 혼합물에 아이오도아세트아미드-NHS 에스테르(103)(115 mg, 0.41 mmol)를 첨가하고 상기 혼합물을 대기 온도에서 교반하였다. 30 분 후, 상기 혼합물을 1 mm 크로마토트론 플레이트 상에 흡인시키고 헥산 중 에틸 아세테이트(1:1)로 용리시켰다. 단일 밴드를 수집하고 구조를 확인하였다: 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.70 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 6.27 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 4.45 (m, 1H), 4.26 (dd, J = 8.6, 6.3 Hz, 1H), 3.72 (quart, J = 11.3 Hz, 2H), 2.13 (sept, J = 6.5 Hz, 1H), 1.47 (s, 9H), 1.38 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.99 (m, 6H); MS (ES+) m/z 412.87 [M+H]+.
(S)-2-((S)-2-(2-아이오도아세트아미도)-3-메틸부탄아미도)프로파노산 (55): (R)-2-((S)-2-(4-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)벤즈아미도)-3-메틸부탄아미도)프로파노산(53)의 합성 과정을 참고하였다. 이로써 22 mg을 얻었다(두 단계에 대하여 15%): 1H -NMR (400 MHz, D6-DMSO) δ 8.27 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 4.24 (m, 2H), 3.97 (bs, 2H), 3.83 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 3.71 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 2.07 (m, 1H), 1.33 (d, J = 7.3 Hz, 3H), 0.93 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.89 (d, J = 6.9 Hz, 3H); MS (ES-) m/z 354.84 [M-H]-.
반응식 21
Figure pct00119

지방족 아민을 통해 연결된 PBD 이량체 (반응식 21). 벤질 아민과 같은, 지방족 아민을 포함하는 PBD 이량체(실시예 9)를 펩티드성 링커, 글루쿠로나이드 링커 및/또는 방출에 대해 mAb 분해 의존적인 링커(즉, 비-분열성 링커)를 이용하여 합성하였다. 벤질 아민을 통해 접합된 약물 링커는 하기를 포함할 것이다: (1) 반응식 1과 유사한 화학적 성질을 이용하는 분열성 펩티드; (2) 말레이미도카프로일 기(비분열성 링커)에 대한 직접적인 부착(반응식 2); (3) 반응식 6에 기재된 바와 같이 제조된, 글루쿠로나이드 링커.
반응식 22
Figure pct00120

제네릭 펩티드 결합된 2-, 3-, 및 4-아닐린 PBD 이량체 (반응식 22). 반응식 1에 기재된 화학적 성질을 이용하거나, 또는 반응식 2에 예시된 바와 같이 말레이미도카프로산에 직접적으로 부착시켜, 2-, 3-, 및 4-번 위치에 아닐린을 갖는 PBD 이량체를 펩티드-기초의 링커에 접합시킬 것이다.
실시예 14: PDB 이량체 접합체의 제조
항체-약물 접합체는 이전에 기술된 바와 같이 제조하거나[문헌(Doronina et al., Nature Biotechnology, 21, 778-784 (2003)) 참조] 또는 이하에 기술된 바와 같이 제조하였다. 간략히 언급하면, 말레이미드 약물-링커를 위하여 pH 7.4의 50 mM 소듐 보레이트를 함유하는 PBS 중의 mAbs(4-5 mg/mL)를 37℃에서 트리스(카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드(TCEP)로 환원시켰다. 사슬간 디설파이드를 환원시키는 반응의 진행을 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)과의 반응으로 모니터링하고 티올/mAb의 소정의 수준에 이를 때까지 이를 진행하였다. 그 다음 환원된 항체를 0℃로 냉각시키고 항체 티올 당 1.5 당량의 말레이미드 약물-링커로 알킬화하였다. 1 시간 후, 반응을 5 당량의 N-아세틸 시스테인을 첨가하여 퀀칭시켰다. 퀀칭된 약물-링커를 PD-10 컬럼 상에서 겔 여과로 제거하였다. 그 다음 ADC를 0.22 ㎛ 시린지 필터를 통해 멸균-여과하였다. 단백질 농도를, 280 nm에서의 약물 흡광도의 기여분을 보정하면서, 각각 280 nm 및 329 nm에서 분광학적 분석을 통해 측정하였다. 크기별 배제 크로마토그래피를 사용하여 항체의 집합 정도를 측정하고 RP-HPLC로 잔여의 NAC-퀀칭된 약물-링커가 없음을 확인하였다.
할로 아세트아미드-기초의 약물 링커를 위하여, 일반적으로 하기와 같이 접합을 수행하였다: 10 mM Tris (pH 7.4), 50 mM NaCl, 및 2 mM DTPA 중 (중쇄 내 S239C의 치환에 의해 도입된 시스테인을 갖는 (아래 참조)) 환원 및 재산화된 항체의 10 mg/mL 용액에 0.5 부피의 프로필렌 글리콜을 첨가하였다. 디메틸아세트아미드 중 아세트아미드-기초 약물 링커의 10 mM 용액을 접합 직전에 제조하였다. 상기 항체 용액에 첨가된 바와 같은 당량의 프로필렌 글리콜을 6-배 몰의 과량의 약물 링커에 첨가하였다. 상기 묽은 약물-링커 용액을 항체 용액에 첨가하고 1 M Tris(pH 9)를 이용하여 pH를 8.0-8.5로 조정하였다. 접합 반응을 37℃에서 45 분 동안 진행하였다. 접합은 역상 PLRP-S 크로마토그래피를 환원 및 변성시킴으로써 확인하였다. 과량의 약물 링커를 Quadrasil MP 수지(시그마 알드리치; 제품 번호 679526)로 제거하고 완충액을 PD-10 탈염 컬럼(지이 헬쓰케어; 제품 번호 17-0851-01)을 이용하여 10 mM Tris(pH 7.4), 50 mM NaCl, 및 5% 프로필렌 글리콜로 교환하였다.
도입된 시스테인을 갖는 조작된(engineered) hIgG1 항체: 중쇄(h1F6d)의 239 위치에 시스테인 잔기를 함유하는 CD70 항체를, 10 당량의 TCEP 및 1 mM EDTA를 첨가하고 1M Tris 완충액(pH 9.0)을 이용하여 pH를 7.4로 조정함으로써 완전히 환원시켰다. 37℃에서 1 시간 동안 배양시킨 후, 상기 반응물을 22℃로 냉각시키고 30 당량의 디히드로아스코르브산을 첨가하여 본래의 디설파이드를 선택적으로 재산화시키면서, 시스테인 239는 환원된 상태로 남겼다. pH를 1M Tris 완충액(pH 3.7)을 이용하여 6.5로 조정하고 상기 반응을 22℃에서 1 시간 동안 진행하였다. 그 다음 상기 용액의 pH를 1 M Tris 완충액(pH 9.0)을 첨가하여 다시 7.4로 향상시켰다. DMSO 중 3.5 당량의 PBD 약물 링커를, 상기 반응물에 첨가하기 전에, 프로필렌 글리콜로 희석하기에 적합한 용기에 넣었다. PBD 약물 링커의 용해도를 유지하기 위하여, 항체 자체를 먼저 프로필렌 글리콜로 33%의 최종 농도로 희석시켰다(예를 들어, 항체 용액이 60 mL 반응 부피인 경우, 30 mL의 프로필렌 글리콜을 첨가함). 그 다음 이러한 동일한 부피의 프로필렌 글리콜(본 실시예에서는 30 mL)을 희석제로서 PBD 약물 링커에 첨가하였다. 혼합 후, 프로필렌 글리콜 중 PBD 약물 링커의 용액을 상기 항체 용액에 첨가하여 접합을 달성하였다; 프로필렌 글리콜의 최종 농도는 50%이었다. 상기 반응을 30 분 동안 진행한 다음 5 당량의 N-아세틸 시스테인을 첨가하여 퀀칭시켰다. 그 다음 ADC를 30 kD 막을 통해 한외여과하여 정제하였다. (반응에 사용된 프로필렌 글리콜의 농도는 임의의 특정 PBD를 위해 줄일 수 있으며, 이의 단 하나의 목적은 수성 매질 중에서 약물 링커의 용해도를 유지하기 위함임을 주지한다.)
실시예 15: 선택된 접합체의 시험관내 활성 측정
선택된 항체 약물 접합체의 시험관내 세포독성 활성을 레자주린(Sigma, St. Louis, MO, USA) 환원 분석법(참조: Doronina et al., Nature Biotechnology, 2003, 21, 778-784)을 이용하여 평가하였다. 항체 약물 접합체를 실시예 13에서 상기 기재된 바와 같이 제조하였다.
96-시간 분석을 위하여, 로그-상 성장으로 배양된 세포를 20% FBS로 보충된 150 ㎕ RPMI 1640을 포함하는 96-웰 플레이트에서 24 시간 동안 접종하였다. 세포 배양 배지 중 ADC의 연속 희석물을 4x 작업 농도로 제조하였다; 50 ㎕의 각 희석물을 96-웰 플레이트에 첨가하였다. ADC의 첨가 후, 세포를 37℃에서 4 일 동안 시험 물질과 함께 배양하였다. 그 다음 레자주린을 각 웰에 첨가하여 50 μM의 최종 농도에 이르게 하고, 상기 플레이트를 37℃에서 추가 4 시간 동안 배양하였다. 그 다음 상기 플레이트를 각각 530 및 590 nm의 여기 및 방출 파장으로 Fusion HT 플레이트 판독기(Packard Instruments, Meridien, CT, USA) 상에서 염료 환원의 정도에 대해 판독하였다. 여기에서, 3중으로 측정된, IC50 값을 미처리 대조구 대비 세포 성장의 50% 감소를 초래하는 농도로서 정의한다.
표 4(아래)를 보면, 96 시간 분석법을 이용한 파라-아닐린 PBD 이량체를 갖는 ADC의 시험관내 세포독성이 나타나있다. ADC는 CD70+ CD30- 세포주 및 대조구 CD70- CD30- 세포주에 대해 테스트되었다. 사용된 항체는 CD70 항체, 인간화 1F6(미국공개공보 제2009-148942호 참조), CD30 항체, 키메릭 AC10(미국공개공보 제2008-0213289호 참조) 및 아미노산 중쇄 위치 239에 도입된 시스테인 잔기를 갖는 CD70 항체(인간화 1F6)(EU 넘버링 시스템에 따름)(h1F6d로 표시됨)이었다. 말레이미딜-펩티드 링커(약물 링커 화합물 38)를 갖는 접합체는 말레이미딜 또는 아세트아미드-기초의 링커(각각 화합물 40 및 41)를 갖는 접합체보다 더욱 낮은 IC50을 가졌다.
파라-아닐린 PBD 이량체 37로부터 유래된 약물 링커를 함유하고 있는 ADC의 시험관내 세포독성 활성:
표 4. CD70+ 세포주에 대한 시험관내 세포독성 활성(ng/mL), 모든 ADC는 2 약물/mAb임
Figure pct00121

표 5를 보면, 96 시간 분석법을 이용한 CD30+ 세포주에서의 PBD 이량체에 대한 ADC 접합체의 시험관내 세포독성이 나타나있다. ADC는 CD30+CD70+ 세포주 및 CD70- CD30+ 세포주에 대하여 테스트되었다. 사용된 항체는 CD70 항체, 인간화 1F6(미국특허공개 제2009-148942호 참조) 및 CD30 항체, 키메릭 AC10(미국특허공개 제2008-0213289호 참조)이었다. 말레이미딜-펩티드 링커(약물 링커 화합물 38)를 갖는 접합체는 일반적으로 말레이미딜 또는 아세트아미드-기초의 링커(각각 화합물 40 및 41)를 갖는 접합체보다 더욱 낮은 IC50을 가졌다.
표 5. CD30+ 세포주에 대한 시험관내 세포독성 활성(ng/mL), 모든 ADC는 2 약물/mAb임
Figure pct00122

메타-아닐린 PBD 이량체 42로부터 유래된 약물 링커를 함유하고 있는 ADC의 시험관내 세포독성 활성:
표 6을 보면, 96 시간 분석법을 이용한 CD30+ 세포주에서의 PBD 이량체를 함유하는 ADC의 시험관내 세포독성이 나타나있다. 활성은 CD30+CD70+ 세포주 및 CD70- CD30+ 세포주에 대하여 테스트되었다. 사용된 항체는 CD70 항체, 인간화 1F6(미국특허공개 제2009-148942호 참조) 및 아미노산 중쇄 위치 239에 도입된 시스테인 잔기를 갖는 CD70 항체(인간화 1F6)(EU 넘버링 시스템에 따름)(h1F6d로 표시됨)이었다. 말레이미딜-펩티드 링커(약물 링커 화합물 43) 및 글루쿠로나이드 링커(48)를 갖는 접합체는 일반적으로 말레이미딜-기초의 링커(화합물 44)를 갖는 접합체보다 더욱 낮은 IC50을 가졌다.
표 6. CD70+ 세포주에 대한 시험관내 세포독성 활성 (ng/mL)
Figure pct00123

파라- 및 메타-아닐린 PBD 이량체 38 및 42(각각)로부터 유래된 약물 링커를 함유하고 있는 ADC의 시험관내 세포독성 활성:
표 7을 보면, 96 시간 분석법을 이용한 CD70+ 세포주에서의 PBD 이량체를 함유하는 ADC의 시험관내 세포독성이 나타나있다. 활성은 CD70+ 세포주 L428 및 786O 및 CD70- AML 세포주에 대하여 테스트되었다. 사용된 항체는 CD70 항체, 인간화 1F6(미국특허공개 제2009-148942호 참조) 및 아미노산 중쇄 위치 239에 도입된 시스테인 잔기를 갖는 CD70 항체(인간화 1F6)(EU 넘버링 시스템에 따름)(h1F6d로 표시됨)이었다. 메타-아닐린을 갖는 말레이미딜-펩티드 링커(약물 링커 화합물 43)를 갖는 접합체는 파라-아닐린을 갖는 말레이미딜-펩티드 링커(약물 링커 화합물 38)를 갖는 접합체보다 다소 더욱 낮은 활성을 가졌다. 항체 당 2개로 메타-아닐린 화합물의 약물 탑재량을 감소시킴으로써 활성이 감소하였다. 파라-아닐린 화합물의 글루쿠로나이드 링커(48)를 갖는 접합체는 일반적으로 말레이미딜-기초의 링커(화합물 39)를 갖는 접합체보다 더욱 낮은 IC50을 가졌다. 또한, 파라-아닐린 화합물의 아릴 말레이미드(54)는 이들 세포주에 대해 활성이 없었다. 또한, 화합물 42에 직접적으로 접합된 말레이미딜 링커를 갖는 접합체는 접합체 h1F6-43에 대비하여 감소된 활성을 가졌다(데이터 미도시).
표 7. CD70+ 세포주에 대한 시험관내 세포독성 활성 (ng/mL)
Figure pct00124

아닐린-결합된 PBD 이량체로부터 유래된 약물 링커를 함유하고 있는 ADC의 시험관내 세포독성 활성
표 8을 보면, 96 시간 분석법을 이용한 CD70+ 세포주에서의 PBD 이량체를 함유하는 ADC의 시험관내 세포독성이 나타나있다. 활성은 CD70+ 세포주 Caki-1 및 L428 및 CD70- 세포주에 대하여 테스트되었다. 사용된 항체는 아미노산 중쇄 위치 239에 도입된 시스테인 잔기를 갖는 CD70 항체(인간화 1F6)(EU 넘버링 시스템에 따름)(h1F6d로 표시됨)이었다. 비-분열성 링커(화합물 68)에 의한 오르토 위치에서의 아민을 통한 PBD의 결합은, 파라-아닐린-결합된 분열성 링커(화합물 54)에 의해 결합된 ADC와 비교하여, 활성을 현저하게 감소시켰다. 분열성 링커를 갖는, 화합물 73 및 85는 화합물 54와 유사한 활성을 나타내었다; 이들 화합물 둘다는 파라-아닐린에 의해 결합된다. 더 많은 일련의 분열을 필요로 하는 분열성 링커를 갖는 화합물, 화합물 79 및 90은, 화합물 54와 비교하여 다소 감소된 활성을 나타내었다.
표 8. CD70+ 세포주에 대한 시험관내 세포독성 활성 (ng/mL)
Figure pct00125

아닐린-결합된 PBD 이량체로부터 유래된 약물 링커를 함유하고 있는 ADC의 시험관내 세포독성 활성
표 9를 보면, 96 시간 분석법을 이용한 CD70+ 세포주에서의 PBD 이량체를 함유하는 ADC의 시험관내 세포독성이 나타나있다. 활성은 CD70+ 세포주 Caki-1 및 L428 및 CD70- 백혈병 세포주에 대하여 테스트되었다. 사용된 항체는 CD70 항체, 인간화 1F6(미국특허공개 제2009-148942호 참조) 및 아미노산 중쇄 위치 239에 도입된 시스테인 잔기를 갖는 CD70 항체(인간화 1F6)(EU 넘버링 시스템에 따름)(h1F6d로 표시됨)이었다. 아세트아미드에 의해 항체에 결합된 분열성 링커를 갖는 화합물 56은, 화합물 38와 유사한 활성을 나타내었다. 메타-아닐린 결합된 PBD 이량체의 글루쿠로나이드-결합된 변형, 화합물 48은 본 분석에서 거의 활성을 나타내지 않았다. PBD 가교에 5개의 메틸렌 기를 갖는 화합물 58은, PBD 가교에 3개의 메틸렌 기를 갖는 화합물 38과 유사한 활성을 나타내었다.
표 9. CD70+ 세포주에 대한 시험관내 세포독성 활성 (ng/mL)
Figure pct00126

실시예 16: 선택된 접합체의 생체내 세포독성의 측정
모든 실험은 실험 동물 관리 평가 인증 협회에 의해 완전히 공인된 설비에서 실험동물윤리위원회에 따라 수행하였다. 접합체가 임상적 관련 용량에서 내성이 있는지 확인하기 위하여 생체내 내성을 먼저 평가하였다. BALB/c 마우스를 0.01% 트윈 20을 포함하는 PBS 중에 제형화한 ADC의 단계적으로 증가시킨 용량으로 처리하였다. 마우스를 약물 처리 후 중량 손실에 대해 모니터링하였다; 20% 중량 손실을 나타내거나 또는 병적 상태의 다른 징후를 나타내는 것들을 안락사시켰다. 사용된 항체는 CD70 항체, 인간화 1F6(미국공개특허 제2009-148942호 참조) 및 CD30 항체, 키메릭 AC10(미국공개특허 제2008-0213289호 참조)이었다.
도 1을 보면, 중량 손실 조사의 결과를 cAC10-val-ala-SG3132(2)(cAC10-화합물 38)를 이용하여 나타내었다. IP 또는 IV 중 어느 하나에 의해 5 mg으로 투여된 접합체의 단일 투약은 중량 손실을 거의 주지 않았다. 접합체의 더욱 높은 투약(15 mg/kg)이 마우스에서 중량 손실을 야기시켰다.
도 2를 보면, 중량 손실 조사의 결과를 h1F6-val-ala-SG3132(2)(h1F6-화합물 38)를 이용하여 나타내었다. IP에 의해 5 mg으로 투여된 접합체의 단일 투약은 중량 손실을 다소 주었다. 접합체의 더욱 높은 투약(10 mg/kg)이 마우스에서 유의적인 중량 손실을 야기시켰다.
치료 실험을 2개의 CD70+ 신장 세포 암 이종 이식 모델에서 수행하였다. 종양(786-O 및 Caki-1) 단편을 누드 마우스의 오른쪽 측복부에 이식하였다. 마우스를 각 군의 평균이 약 100 mm3가 되도록 8일째(786-O) 또는 9일째(Caki-1)에 실험군(n=5)으로 임의 추출하였다. ADC 또는 대조구를 q4dx4 스케쥴에 따라 복강(ip) 투여하였다. 시간의 함수로서 종양 부피를 식 (L x W2)/2을 이용하여 측정하였다. 종양 부피가 1000 mm3에 이르렀을 때 동물을 안락사시켰다. 오래 견디는 쇠퇴를 보이는 마우스는 이식 후 약 100일에 종결지었다.
도 3을 보면, h1F6-val-ala-SG3132(2)(h1F6-화합물 38)를 이용한 치료 실험의 결과를 나타내었다. 또한, 대조구 접합체, cAC10-val-ala-SG3132(2)(cAC10-화합물 38)를 사용하였다. 0.1 mg/kg으로 h1F6 접합체가 투여된 마우스는 다소의 종양 감소를 나타내었으며, 0.3 mg/kg 및 1 mg/kg의 더욱 높은 투여량은 완전한 종양 감소를 나타내었다. 대조구 접합체(비-결합)는 h1F6 접합체에 비해 거의 활성이 없었다.
도 4를 보면, h1F6-mc-val-ala-SG3132(2)(h1F6-화합물 38) 접합체를 이용한 치료 실험의 결과를 나타내었다. 또한, 대조구 접합체, cAC10-mc-val-ala-SG3132(2)(cAC10-화합물 38)가 사용되었다. 1 mg/kg으로 h1F6 접합체가 투여된 마우스는 완전한 종양 감소를 나타내는 것으로 나타났다. 0.3 mg/kg 및 0.1 mg/kg의 더욱 낮은 투여량으로 투여된 마우스는 각각 더욱 낮은 종양 감소를 나타내었다. 대조구 접합체(비-결합)는, 비록 더욱 낮은 투여량으로 투여된 h1F6 접합체보다는 더욱 높은 활성을 나타내었지만, 유사한 투여량으로 투여된 h1F6 접합체에 비해 거의 활성이 없었다. 또한 h1F6 접합체는 더욱 높은 투여량으로 투여된 h1F6-vc-MMAE 접합체(미국특허공개 제2009-0148942호) 보다 더욱 높은 활성을 나타내었다.
도 5를 보면, 2개-탑재된 비-결합 대조구, 화합물 38에 접합된 H00d(h00d-38)에 대비하여 동일 화합물에 결합된 2개의 탑재된 항체 h1F6d(h1F6d-38)를 이용한 치료 실험의 결과가 나타나있다. 모델은 누드 마우스 내 Caki 피하 모델이었다. 투여량은 0.1, 0.3 및 1 mg/kg q7dX2이었다. 가장 높은 2개 투여량의 h1F6 접합체는 1 mg/kg에서 완전한 쇠퇴를 나타내고 0.3 mg/kg에서 실질적인 종양 지연을 나타내었다. 비-결합 대조구는 1 mg/kg 투여량에서 종양 지연을 나타내었다.
도 6을 보면, 2개-탑재된 비-결합 대조구, 화합물 38에 접합된 H00d(h00d-38)에 대비하여 동일 화합물에 결합된 2개의 탑재된 항체 h1F6d(h1F6d-38)를 이용한 치료 실험의 결과가 나타나있다. 모델은 누드 마우스 내 786-O 피하 모델이었다. 투여량은 0.1, 0.3 및 1 mg/kg q7dX2이었다. 모든 3개의 투여량의 h1F6 접합체는 완전한 쇠퇴 또는 종양 지연을 나타내었으며, 비-결합 대조구는 종양 지연을 나타내었다.

Claims (34)

  1. 하기 화학식 I을 갖는 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물:
    Figure pct00127

    상기 식에서,
    L은 리간드 단위이고,
    LU는 링커 단위이며,
    p는 1 내지 20이고,
    D는 하기 화학식 Ⅱ를 갖는 PBD 이량체를 포함하는 약물 단위이다:
    Figure pct00128

    상기 식에서,
    R2는 하기 화학식 Ⅲ의 구조를 가지며:
    Figure pct00129

    상기 식에서, A는 C5 -7 아릴기이고, X는 -O-, -S-, -C(O)O-, -C(O)-, -NH(C=O)-, 및 -N(RN)-을 포함하는 군에서 선택되고, 여기서 RN은 H, C1 -4 알킬 및 (C2H4O)mCH3를 포함하는 군에서 선택되며, 여기서 m은 1 내지 3이고,
    (i) Q1은 단일 결합이고, Q2는 단일 결합 및 -Z-(CH2)n-에서 선택되며, 여기서 Z는 단일 결합, O, S 및 NH에서 선택되고, n은 1 내지 3이거나; 또는
    (ii) Q1은 -CH=CH-이고, Q2는 단일 결합이고;
    R12는 할로, 니트로, 시아노, 에테르, C1 -7 알킬, C3 -7 헤테로시클일, 디메틸아미노프로필옥시, 피페라지닐 및 비스-옥시-C1 -3 알킬렌을 포함하는 군에서 선택되는 1 이상의 치환기로 임의로 치환된 C5 -10 아릴기이고;
    R6 및 R9는 독립적으로 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', 니트로, Me3Sn 및 할로에서 선택되고;
    여기서, R 및 R'는 독립적으로 임의로 치환된 C1 -12 알킬, 임의로 치환된 C3 -20 헤테로시클일 및 임의로 치환된 C5 -20 아릴기에서 선택되며;
    R7은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NHRR', 니트로, Me3Sn 및 할로에서 선택되고;
    (a) R10은 H이고, R11은 OH 또는 ORA이고, 여기서 RA는 C1 -4 알킬이거나;
    (b) R10 및 R11은 이들이 결합된 질소 원자와 탄소 원자 사이에 질소-탄소 이중 결합을 형성하거나; 또는
    (c) R10은 H이고, R11은 SOzM이고, 여기서 z는 2 또는 3이고, M은 1가의 약학적으로 허용되는 양이온이고;
    R"는 사슬에 O, S, NH로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 헤테로 원자, 및 방향족 고리가 개재할 수 있는 C3 -12 알킬렌기이며;
    Y는 O, S 또는 NH에서 선택되며;
    R6', R7', R9'는 각각 R6, R7 및 R9와 동일한 기에서 선택되고, R10' 및 R11'는 R10 및 R11과 동일하며, 여기서 R11 및 R11'가 SOzM일 경우, M은 2가의 약학적으로 허용되는 양이온을 나타낼 수 있다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 R7은 H, OH 및 OR로부터 선택되는 접합체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 R7은 C1 -4 알킬옥시기인 접합체.
  4. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Y는 O인 접합체.
  5. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R"는 C3 -7 알킬렌인 접합체.
  6. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R9는 H인 접합체.
  7. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R6은 H 및 할로로부터 선택되는 접합체.
  8. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 A는 페닐인 접합체.
  9. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X는 -O-, -S-, 또는 -NH-로부터 선택되는 접합체.
  10. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Q1은 단일 결합인 접합체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 Q2는 단일 결합인 접합체.
  12. 제10항에 있어서, 상기 Q2는 -Z-(CH2)n-이고, 여기서 Z는 O 또는 S이며 n은 1 또는 2인 접합체.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Q1은 -CH=CH-인 접합체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R12는 C5 -7 아릴기인 접합체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 R12는 페닐인 접합체.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R12는 C8 -10 아릴기인 접합체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R12는 1개 내지 3개의 치환기를 포함하는 접합체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R10 및 R11은 질소-탄소 이중 결합을 형성하는 접합체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R6', R7', R9', R10', R11' 및 Y'는 각각 R6, R7, R9, R10, R11 및 Y와 동일한 접합체.
  20. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 단위 (LU)는 하기 화학식 1a 또는 1b를 갖는 접합체:
    Figure pct00130

    여기에서,
    -A1-은 신장 단위이고,
    a는 1 또는 2이며,
    L1-은 특이성 단위이고,
    s는 1 내지 12 범위의 정수이며,
    -L2-는 스페이서 단위이고,
    y는 0, 1 또는 2이며;
    p는 1 내지 20이고; 또는
    Figure pct00131

    여기에서,
    -A1-은 신장 단위 (L2)에 연결된 신장 단위이고,
    a는 1 또는 2이며,
    L1 -은 신장 단위 (L2)에 연결된 특이성 단위이고,
    s는 0 내지 12 범위의 정수이며,
    -L2-는 스페이서 단위이고,
    y는 0, 1 또는 2이며;
    -D는 PBD 이량체이고;
    p는 1 내지 20이다.
  21. 제20항에 있어서, 상기 링커 단위 (LU)는 화학식 1a를 갖는 접합체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 A1은 하기로부터 선택되는 접합체:
    Figure pct00132

    상기 식에서, 별표는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 내지 6이고;
    Figure pct00133

    상기 식에서, 별표는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 내지 6이고;
    Figure pct00134

    상기 식에서, 별표는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이고; 또는
    Figure pct00135

    상기 식에서, 별표는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이다.
  23. 제21항에 있어서, 상기 A1은 하기인 접합체:
    Figure pct00136

    상기 식에서, 별표는 L1에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 리간드 단위에 대한 부착 지점을 나타내며, n은 0 내지 6이다.
  24. 제23항에 있어서, 상기 n은 5인 접합체.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L1은 아미노산 서열을 포함하는 접합체.
  26. 제25항에 있어서, 상기 L1은 디펩티드인 접합체.
  27. 제26항에 있어서, 상기 L1은 발린-알라닌, 발린-시트룰린 및 페닐알라닌-리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 접합체.
  28. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 y는 0인 접합체.
  29. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 y는 1 또는 2인 접합체.
  30. 제29항에 있어서, 상기 L2는 하기인 접합체:
    Figure pct00137

    상기 식에서, 별표는 약물 단위에 대한 부착 지점을 나타내고, 파선은 L1에 대한 부착 지점을 나타내며, Y는 -N(H)-, -O-, -C(=O)N(H)- 또는 -C(=O)O-이고, n은 0 내지　3이다.
  31. 제30항에 있어서, 상기 L2는 하기인 접합체:
    Figure pct00138

  32. 증식 질환 또는 자가면역 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 접합체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물의 사용.
  33. 증식 질환 또는 자가면역 질환의 치료를 위한 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 접합체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물의 사용.
  34. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 접합체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 증식 질환 또는 자가면역 질환을 갖는 포유류를 치료하는 방법.
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