KR20120088716A - 생물학적 샘플 내의 다수의 표적의 검출 - Google Patents

생물학적 샘플 내의 다수의 표적의 검출 Download PDF

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KR20120088716A
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애넙 수드
존 리차드 넬슨
마이클 저디스
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제너럴 일렉트릭 캄파니
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Abstract

생물학적 샘플 내의 다수의 표적을 검출하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 생물학적 샘플을 다수의 표적-결합(target-binding) 프로브와 접촉시켜 다수의 표적-결합된(target-bound) 프로브를 형성시키는 단계, 표적-결합된 프로브들 중 하나 이상을 생물학적 샘플에 공유결합으로 부착시키는 단계, 및 표적-결합된 프로브들로부터의 신호들을 순차적으로 관찰하는 단계를 포함한다. 다수의 표적의 검출을 위한 관련된 키트 및 장치가 또한 제공된다.

Description

생물학적 샘플 내의 다수의 표적의 검출{DETECTION OF PLURALITY OF TARGETS IN BIOLOGICAL SAMPLES}
발명 분야
본 발명은 일반적으로 생물학적 샘플 내의 다수의 표적을 검출하기 위한 방법, 키트 및 장치에 관한 것이다.
배경기술
생물학적 샘플의 특성을 판별하고 다양한 생물학적 표적에 관한 정보를 얻기 위한 생물학적 샘플의 분석이 생물학 및 의학 양쪽에서 요구된다. 다양한 방법이 생물학적 표적들의 존재, 부재, 농도 및/또는 공간 분포를 특히 검출하기 위해 생물학적 샘플을 분석하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 조직학적 절편 또는 세포학적 제제 내의 단백질의 검출을 조직화학, 면역조직화학 (IHC), 또는 면역형광을 사용하여 수행할 수 있다.
그러나, 생물학적 샘플 내의 표적을 검출하기 위한 기존 기술들 중 다수는 감도, 정확도 및/또는 다중화 능력 면에서의 제한이 있다. 특히, 단일 생물학적 샘플 내의 다중 표적의 검출은 한번에 오직 몇 개의 표적 (약 4개 내지 5개의 표적)만의 검출로 제한된다. 예를 들어, 면역형광 검정 동안 단일 조직 샘플 내에서 정확하게 검출가능한 표적의 갯수가 중첩된 신호들을 분해하는 형광-기반 검출 시스템의 감도에 의해 제한된다. 따라서, 모든 관련 표적에 관한 정보를 얻기 위해 공급원으로부터의 추가적인 생물학적 샘플이 종종 요구될 수 있다.
다중 생물학적 샘플의 분석은 생물학적 샘플 내의 다수의 상이한 표적의 상대적인 특성들 (예를 들어, 존재, 부재, 농도 및/또는 공간 분포)을 정확하게 결정하는 능력을 제한한다. 또한, 특정 경우에, 제한된 양의 샘플만 분석에 이용가능할 수 있다. 따라서, 개별적인 생물학적 샘플을 분석하여 이러한 생물학적 샘플 내의 다수의 상이한 표적을 검출할 수 있는 방법, 작용제 및 장치가 요구된다.
간단한 설명
생물학적 샘플 내의 다수의 표적을 검출하는 방법은 일반적으로 생물학적 샘플을 다수의 표적-결합(target-binding) 프로브와 접촉시켜 다수의 표적-결합된(target-bound) 프로브를 형성시키는 단계, 표적-결합된 프로브들 중 하나 이상을 생물학적 샘플에 공유결합으로 부착시키는 단계, 및 다수의 표적-결합된 프로브의 제1 세트로부터의 제1 신호 세트를 관찰하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 관찰된 신호들을 변형시키는 단계, 이어서 다수의 표적-결합된 프로브의 제2 세트로부터 제2 신호 세트를 생성시키는 단계, 및 제2 신호 세트를 관찰하는 단계를 추가로 포함한다.
생물학적 샘플 내의 다수의 표적을 검출하는 방법의 추가적인 예는 일반적으로 생물학적 샘플을 다수의 표적-결합 프로브와 접촉시켜 다수의 표적-결합된 프로브를 형성시키는 단계, 표적-결합된 프로브들 중 하나 이상을 생물학적 샘플에 공유결합으로 부착시키는 단계, 다수의 표적-결합된 프로브의 제1 세트로부터 제1 신호 세트를 생성시키는 단계, 및 제1 신호 세트를 관찰하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 관찰된 신호들을 변형시키는 단계, 다수의 표적-결합된 프로브의 제2 세트로부터 제2 신호 세트를 생성시키는 단계, 및 제2 신호 세트를 관찰하는 단계를 추가로 포함한다.
생물학적 샘플 내의 다수의 표적을 검출하는 방법의 기타 예는 생물학적 샘플을 다수의 표적-결합 프로브와 접촉시켜 다수의 표적-결합된 프로브를 형성시키는 단계, 표적-결합된 프로브들 중 하나 이상을 생물학적 샘플에 공유결합으로 부착시키는 단계, 표적-결합된 프로브들을 다수의 표적-결합된 프로브의 제1 세트와 결합할 수 있고 제1 신호 세트를 생성할 수 있는 신호-생성(signal-generating) 프로브들의 제1 세트와 접촉시키는 단계, 및 제1 신호 세트를 관찰하는 것을 통해 다수의 표적의 제1 세트를 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 관찰된 제1 신호 세트를 변형시키는 단계를 추가로 포함한다. 접촉 단계, 검출 단계, 및 변형 단계를 다수의 표적의 후속 세트를 검출하기 위해 신호-생성 프로브들의 후속 세트를 사용하여 여러 번 반복할 수 있고, 이때 신호-생성 프로브들의 후속 세트는 다수의 표적-결합된 프로브의 후속 세트에 결합할 수 있고, 후속 신호 세트를 생성할 수 있다.
생물학적 샘플 내의 다수의 다중 표적의 검출을 위한 키트는 일반적으로 각각의 표적-결합 프로브가 신호를 생성시킬 수 있는 다수의 표적-결합 프로브, 및 하나 이상의 표적-결합 프로브로부터의 생성된 신호를 변형시킬 수 있는 하나 이상의 화학 작용제를 포함한다. 다수의 표적-결합 프로브 중 하나 이상은 추가로 표적에 또는 표적 부근에 위치하는 분자에 가교될 수 있다.
생물학적 샘플 내의 다수의 표적의 검출을 위한 장치는 일반적으로 샘플 취급 시스템, 시약 분배 시스템, 프로브 가교 시스템, 및 신호 검출 시스템을 포함한다.
도면
본 발명의 이러한 및 기타의 특색, 측면 및 장점이 첨부된 도면을 참조로 하기의 상세한 설명을 읽으면 더 잘 이해될 것이고, 이때 도면에서 도면 전반에 걸쳐 유사한 문자는 유사한 부분을 나타낸다.
도 1은 본 발명의 실시양태를 도해하는 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 실시양태를 도해하는 흐름도이다.
도 3은 시아닌 염료로 표지된 DNA 올리고머 (Cy3-T20-SFAD 또는 Cy3-T20-SDAD)의 스트렙타비딘 코팅된 플레이트에 대한 가교를 나타낸다.
도 4는 시아닌 염료로 표지된 DNA 올리고머 (Cy3-T20-NH2 또는 Cy3-T20-SANPAH)의 세포에 대한 상호작용을 나타낸다.
도 5는 프로브들의 동시 첨가에 이어지는 표적-결합된 프로브들의 순차적인 검출에 의한 조직 샘플 내의 폴리(A) mRNA 및 U6 snRNA 프로브의 다중화 검출을 나타내는 영상을 나타낸다.
도 6은 프로브들의 동시 첨가에 이어지는 가교, 및 표적-결합된 프로브들의 순차적인 검출에 의한 조직 샘플 내의 b-액틴 및 U6 프로브의 다중화 검출을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 한 실시양태에 따른 예시적인 장치를 개략적으로 도해하는 블록 선도이다.
도 8은 본 발명의 한 실시양태에 따른 예시적인 조직병리학 시스템을 개략적으로 도해하는 블록 선도이다.
상세한 설명
더욱 명확하고 정확하게 기술하기 위해, 그리고 청구된 발명의 주제를 가리키기 위해, 하기의 설명 및 첨부된 청구항에서 사용되는 특정 용어들에 대해 하기의 정의가 제공된다. 명세서 전반에 걸쳐, 특정 용어들의 실례는 제한적이지 않은 예로 간주되어야 한다.
단수 형태의 관사 ("a", "an" 및 "the")는 문맥에서 명확하게 달리 지시되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 명세서 및 청구항 전반에 걸쳐 본원에서 사용된 바와 같은 대략화(approximating) 언어는 관련되는 기본 기능에서의 변화를 초래하지 않으면서 허용가능하게 변할 수 있는 임의의 정량적인 표현을 수식하는데 적용될 수 있다. 따라서, "약"과 같은 용어에 의해 수식되는 값은 특정된 정확한 값에 한정되지 않아야 한다. 일부 경우에, 대략화 언어는 값을 측정하기 위한 장비의 정확성에 상응할 수 있다. 유사하게, "없는(free)"이 용어와 조합되어 사용될 수 있고, 수식된 용어가 여전히 없는 것으로 간주되면서 실질적이지 않은 개수 또는 미량을 포함할 수 있다. 필요하다면, 범위가 공급될 수 있고, 이러한 범위는 이들 사이의 모든 하위 범위를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "생물학적 샘플"은 생물학적 기원의 샘플, 또는 생물학적 기원의 샘플로부터 유래된 샘플을 지칭한다. 생물학적 샘플은 생체내 샘플 또는 시험관내 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 원핵생물 기원 또는 진핵생물 기원일 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 박테리아, 진균류, 원생동물, 곤충, 어류, 조류, 파충류, 포유동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 소, 개, 당나귀, 기니피그, 또는 토끼), 또는 영장류 (예를 들어, 침팬지, 또는 인간)과 같은 생물학적 대상체로부터 기원할 수 있다.
다양한 방법에 의해 생물학적 대상체로부터 생물학적 샘플이 수득 또는 유래될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플이 포유동물 (예를 들어, 인간)로부터 단리된 조직 또는 세포, 생물학적 샘플의 절편 (예를 들어, 기관 또는 조직의 단면부), 또는 생물학적 샘플로부터의 추출물 (예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변과 같은 체액으로부터 추출된 항원)을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플의 비-제한적인 예로는 세포, 세포 단편, 조직, 조직 절편, 기관, 또는 체액이 포함된다. 생물학적 샘플이 블롯(blot) 또는 어레이(array)에서와 같이 고체 지지체 상에 고정될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플이 막, 종이, 유리 슬라이드, 마이크로타이터 플레이트, 또는 ELISA 플레이트 상에 고정될 수 있다.
용어 "핵산"은 임의의 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA) (예를 들어, 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 또는 박테리아 핵산), 또는 이들의 유사체를 포함하도록 의도된다. 용어 "핵산"은 이중 가닥 핵산의 어느 한쪽 가닥 또는 양쪽 가닥을 포함한다. 핵산은 천연 핵산 또는 합성 핵산일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "표적"은 일반적으로 생물학적 샘플 내에 존재하는 경우 검출 또는 분석될 수 있는 생물학적 샘플의 성분 (예를 들어, 생물학적 분자 예컨대 단백질 또는 핵산, 생물학적 분자의 일부분 예컨대 에피토프, 또는 생물학적 구조)를 지칭한다. 표적은 천연적으로 발생하는 표적-결합 모이어티 (예를 들어, 표적 항원에 대한 항체)가 존재하거나 또는 표적-결합 모이어티 (예를 들어, 표적 수용체에 대한 리간드와 같은 합성 소분자 결합제)가 제조될 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 적절한 표적의 비-제한적인 예로는 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA), 폴리사카라이드 (예를 들어, 렉틴 또는 당), 지질, 리간드, 수용체, 항체, 어피바디(affibody), 항원, 압타머(aptamer), 합텐, 호르몬, 효소, 효소 기질, 또는 이들의 조합물이 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "다수의 표적", 또는 "다수의 상이한 표적"은 2개 이상의 상이한 표적을 지칭한다. 예를 들어, 생물학적 샘플 내의 다수의 표적은 생물학적 샘플 내의 다수의 항원을 지칭할 수 있고, 이때 다수의 항원은 2개 이상의 상이한 유형의 항원을 포함한다 (예를 들어, 항원 A 및 항원 B의 혼합물). 일반적으로, 다수의 표적은 상이한 표적들의 각각의 세트가 하나 이상의 표적을 포함하는, 상이한 표적들의 2개 이상의 세트를 포함한다. 상이한 표적들의 2개의 세트는 동일한 유형의 바이오마커를 포함할 수 있거나 (예를 들어, 상이한 항원들의 2개의 세트; 항원 A의 제1 세트 및 항원 B의 제2 세트), 또는 상이한 유형의 바이오마커를 포함할 수 있다 (예를 들어, RNA의 제1 세트 및 DNA의 제2 세트). 상이한 표적들의 각각의 세트는 종종 1개를 초과하는 표적을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "표적-결합 프로브"는 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티를 지칭한다. 표적-결합 프로브는 표적이 생물학적 샘플 내에 존재할 때 표적을 검출 또는 분석하는데 사용될 수 있다. 표적-결합 프로브는 하나 이상의 표적-결합 모이어티를 포함한다. 표적-결합 모이어티는 표적의 천연적으로 발생하는 특이적 결합제, 천연적으로 발생하는 특이적 결합제로부터 유래되는 모이어티, 또는 표적에 특이적으로 결합하는 합성 모이어티일 수 있다. 예를 들어, 표적 항원을 검출하기 위한 표적-결합 프로브가 표적 항원에 대해 특이적인 항체로부터 유래될 수 있다. 표적-결합 프로브는 표적-결합 모이어티에 (공유결합으로 또는 비-공유결합으로) 회합된 신호-생성 모이어티, 차폐된 신호-생성 모이어티, 가교 모이어티 또는 독립적으로 검출가능한 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 종종, 표적-결합 프로브들은 표적 또는 표적의 구조적 성분의 별개의 화학적 모이어티들의 분자적 인식을 통해 (예를 들어, 단백질의 특이적인 3차원 구조의 분자적 인식을 통해) 표적에 결합한다. 표적-결합 프로브의 적절한 예로는 DNA, RNA, 잠금(locked) 핵산 (LNA), 펩티드 핵산 (PNA), 변형된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 변형된 염기, 변형된 당 모이어티 또는 변형된 포스페이트 모이어티가 있는 올리고뉴클레오티드), 항체, 항체 단편, 펩티드, 어피바디, 합텐, 리간드, 또는 압타머가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "특이적 결합"은 2개의 상이한 분자 (파트너 분자) 중 하나가 기타 비-파트너 분자(들)에 대한 실질적으로 더 적은 인식에 비해 다른 하나에 대해 특이적으로 인식하는 것을 지칭한다. 일반적으로, 결합 이벤트의 특이성은 파트너 분자들 내의 특이적 분자 인식 부위로부터 초래된다. 이러한 분자들은 2개의 파트너 분자 간의 특이적 인식을 일으키는 인식 부위가 분자의 표면에 또는 분자의 공동에 있을 수 있다. 분자 인식은 정전기적 상호작용, 수소 결합형성, 소수성 상호작용 또는 이들 상호작용의 조합을 통해 일어날 수 있다. 특이적 결합 상호작용에 대한 예로는 항체-항원 상호작용, 효소-기질 상호작용, 상보적 핵산 서열 혼성화, 리간드-수용체 상호작용 등이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 표적-결합 프로브는 이러한 프로브가 이의 각각의 표적에 특이적으로 결합하는 방식으로 선택된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "신호 생성기", 또는 "신호-생성 모이어티"는 검출가능한 신호를 제공하거나 생성하는 분자를 지칭한다. 신호 생성기는 검출가능한 신호를 생성하기 위해 어떠한 사전의 화학적 또는 구조적 변형도 필요로 하지 않으면서 검출가능한 신호를 선천적으로 제공할 수 있거나 (예를 들어, 형광단으로부터의 형광 신호), 또는 또 다른 적절한 모이어티와의 상호작용을 통해 검출가능한 신호를 생성할 수 있다 (예를 들어, 효소-기질 반응을 통한 효소에 의한 신호 생성). 검출가능한 신호는 광학 신호, 전기 신호, 음향 신호, 또는 방사성 신호를 포함할 수 있다. 검출가능한 신호를 하나 이상의 검출 기술 예컨대 분광측정법, 분광분석법, 또는 육안 검사를 사용하여 관찰할 수 있다. 적절한 신호 생성기의 예로는 발색단, 형광단, 라만(Raman)-활성 태그(tag), 방사성 표지, 효소, 또는 이들의 조합물이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "차폐된 신호-생성 모이어티"는 신호 생성기의 검출가능한 신호가 차폐된 전구체 신호 생성기 (전(pro)-신호 생성기)를 지칭한다. 차폐는 신호 특성 중 하나 이상을 변형시킬 수 있다. 차폐는 신호의 완전한/부분적인 제거, 신호 피크에서의 이동, 신호 강도에서의 감소, 또는 신호 주파수에서의 이동을 초래할 수 있다. 차폐된 신호-생성 모이어티는 탈차폐 시 신호 생성기로 전환될 수 있다. 예를 들어, 차폐된 신호-생성 모이어티가 있는 표적-결합 프로브가 켄칭(quenching)된 형광단 (차폐된 신호-생성 모이어티)과 커플링된 항체 (표적-결합 모이어티)를 포함할 수 있다. 도너(donor)-어셉터(acceptor) 형광단 쌍 (예를 들어, 형광단-켄처(quencher) 쌍)이 차폐된 신호-생성 모이어티 (차폐된 형광단)로서 사용될 수 있고, 이때 도너의 형광이 어셉터로의 공명 에너지 전달을 통해 켄칭된다. 도너와 어셉터 사이의 거리를 변형시키는 것, 또는 어셉터의 제거가 도너 형광단을 탈차폐시키는데 사용될 수 있고, 그 후 도너로부터의 형광을 관찰할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "독립적으로 검출가능한 모이어티"는 직접적인 검정에 의해 또는 간접적인 검정에 의해 검출될 수 있는 모이어티를 지칭한다. 직접적인 검정에 의해 검출되기 위해, 독립적으로 검출가능한 모이어티는 신호 생성기를 포함하여야 한다 (즉, 검출가능한 신호를 제공/생성하여야 한다). 독립적으로 검출가능한 모이어티가 검출가능한 신호를 스스로 생산할 수 없거나 또는 차폐된 신호-생성 모이어티를 함유하는 경우, 독립적으로 검출가능한 모이어티를 검출하기 위해 간접적인 검정이 사용될 필요가 있다. 예를 들어, 그렇다면 독립적으로 검출가능한 모이어티가 이를 신호-생성 모이어티와 회합시킴으로써 또는 신호-생성 모이어티를 탈차폐시킴으로써 검출될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "상관시킴"은 어떠한 방식으로든 성능 및/또는 결과를 비교 또는 분석하여, 상관될 이벤트들 간의 서로간의 관계 또는 상호 관계를 확립하는 것을 지칭한다.
용어 "원위치"는 원래의 장소 또는 천연 장소에 발생하는 이벤트를 지칭한다. 예를 들어, 원위치는 무손상 기관 또는 조직에서, 또는 기관 또는 조직의 대표적인 부분에서 발생하는 이벤트를 지칭할 수 있다. 표적의 원위치 분석은 표적이 이의 기원 부위에서 제거되는 경우에 상실될 수 있는 맥락적인 정보를 종종 제공한다. 표적의 원위치 분석은 생물, 기관, 조직 또는 세포 배양물이 포함되는 다양한 공급원으로부터 유래된 세포, 조직 또는 조직 절편 상에서 수행될 수 있다. 따라서, 세포 또는 조직 내의 표적의 원위치 분석은 전체 세포 또는 조직 샘플 내에 위치하는 표적-결합된 프로브의 분석을 기술하고, 이때 표적-결합된 프로브가 여전히 세포 내에 존재한다. 원위치 분석을 수행하는 동안 세포막은 완전히 무손상성일 수 있거나 또는 부분적으로 무손상성일 수 있다. 또한, 이러한 방법은 고정된, 고정되지 않은 또는 동결된 세포 또는 조직 샘플에서 원위치에서 표적을 분석하는데 사용될 수 있다.
용어 "신호를 관찰하는 것"은 신호를 검출하거나, 특성화하거나, 또는 모니터링하는 것을 지칭한다. 신호 생성기로부터의 신호를 검출 시스템 또는 영상화 시스템을 사용하여 관찰할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플로부터 신호를 관찰하는 것이 생물학적 샘플의 영상을 포착함으로써 수행될 수 있다. 사용되는 검출 시스템 또는 영상화 시스템의 성질은 신호 생성기에 의해 생성되는 신호의 성질에 좌우된다. 신호를 관찰하는데 사용될 수 있는 검출/영상화 시스템의 비-제한적인 예로는 전자 스핀 공명 (ESR) 시스템, 전하 결합 소자 (CCD) 시스템 (예를 들어, 방사성동위원소용), 광학 시스템 (예를 들어, 광학적 영상화, 형광 영상화, 공초점 영상화), 전기 시스템, 사진 필름 시스템, 화학발광 시스템, 효소 검출 시스템, 원자력 현미경검사 (AFM) 시스템, 주사 터널링 현미경 (STM) 검출 시스템, 근적외선 필드 시스템, 또는 내부 전반사 (TIR) 시스템이 포함된다. 신호를 관찰하는 것은 신호의 육안 관찰을 또한 포함한다.
이러한 방법들 중 하나 이상이 분석물 검출, 질환 검출, 질환 모니터링, 치료 모니터링, 질환 예측, 조직화학, 세포화학, 면역화학, 면역조직화학, 또는 면역형광과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 분석, 진단 또는 예후 용도에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법들이 조직화학, 면역조직화학, 또는 면역형광 분야에서 특히 유용할 수 있다.
이러한 방법들은 단일 생물학적 샘플 내의 다수의 표적을 검출하는데 사용될 수 있다. 다수의 표적의 검출은 다수의 표적의 존재, 부재, 위치 및/또는 양을 확인하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 방법들은 다수의 표적을 검출하기 위해 단일 검출 채널을 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법들이 생물학적 샘플의 시험관내 분석을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법들이 생물학적 샘플의 생체내 분석을 위해 사용될 수 있다.
이러한 방법들은 동일한 생물학적 샘플 내의 다수의 표적의 검출을 가능하게 한다. 동일한 생물학적 샘플 내의 표적들을 검출하는 것은 생물학적 샘플 내의 표적들에 관한 공간 정보를 결정하는데 또한 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 한정된 양의 생물학적 샘플이 분석에 이용가능할 수 있거나 또는 동일한 샘플이 다중 분석에 대해 프로세싱되어야 하는 경우의 분석 용도에서 유용하다. 동일한 검출 채널이 동일한 샘플 내의 상이한 표적들을 검출하기 위해 여러 번 사용될 수 있어, 다중 표적의 분석을 위한 더 적은 화학 요건을 가능하게 한다. 이러한 방법들은 중첩 신호들을 분해하는 것에서의 제한으로 인해 통상적인 검출 방법이 제한된 개수의 표적만 검출할 수 있는 경우에 또한 유용하다. 예를 들어, 통상적인 형광-기반 검출 검정에서, 동시에 검출될 수 있는 표적의 개수가 약 4개로 제한될 수 있는데, 이는 4개를 초과하는 형광 신호가 이들의 여기 및 방출 파장 성질을 기초로 분해가능하지 않을 수 있기 때문이다. 본 발명의 방법들은 이러한 제한을 극복하는 것을 도울 수 있고, 다중 표적 (예를 들어, 4개를 초과하는 표적)의 검출을 가능하게 할 수 있다. 이러한 방법은 상이한 유형의 세포 또는 조직들을 비교하는 것, 상이한 발달 단계들을 비교하는 것, 질환 또는 이상의 존재를 검출하는 것, 또는 질환 또는 이상의 유형을 결정하는 것에서 도움이 될 수 있는 다수의 표적을 검출하는데 사용될 수 있다.
이러한 방법들은 이미 영상화가능한 표지가 있는 표적-결합 프로브와 함께 영상화를 위해 활성화될 수 있는 활성화가능한 표지 (예를 들어, 신호 생성기)가 있는 표적-결합 프로브를 사용함으로써 표적들의 검출의 다중성을 증가시키는 수단을 추가로 제공한다. 이는 하나는 직접적으로 검출가능한 한편 다른 하나는 활성화 후에만 검출될 수 있어 검출을 위한 동일한 검출 채널의 재사용을 허용하는 2개 이상의 표적 결합제/검출제의 동시 사용을 허용한다. 이러한 방법들은 이미 활성인 표지가 영상화된 후에 활성화될 수 있는 활성화가능한 표지를 활성 표지와 함께 사용하는 것을 기술한다. 표지들이 상이한 검출 채널에서 검출된다면 동일한 조건 하에 또는 동일한 검출 채널이 검출에 사용된다면 상이한 조건 하에 각각 활성화가능한, 활성화가능한 다중 표지들을 사용하는 것이 또한 가능하다. 이미 영상화가능한 표지는 적합한 링커 및 보호기 화학을 사용하여 활성화가능한 표지가 활성화되기 전에 또는 이와 동시에 절단될 수 있다. 본 발명은 상이한 농도로 존재할 수 있는 특이적인 다중 분자들을 검출하기 위해 신호를 증폭시키는 방법을 추가로 기술한다. 상이한 수준의 증폭을 달성하기 위한 다중 증폭 방식들이 동시에 사용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 특색은 다중 표지된 올리고뉴클레오티드 또는 중합체 및/또는 원위치 중합을 사용하는 다중화 양식으로의 신호 증폭이다.
생물학적 샘플에는 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 뇌척수액, 흉수, 유액, 림프, 가래, 정액, 소변, 대변, 눈물, 타액, 주사 흡인물, 피부의 외부 절편, 호흡관, 장관, 비뇨생식관, 종양, 기관, 세포 배양물, 세포 배양물 구성물, 조직 샘플, 조직 절편, 전체 세포, 세포 구성물, 세포 원심분리물(cytospin), 또는 세포 도말표본(smear)이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 생물학적 샘플은 고체 또는 유체 형태로 존재할 수 있고, 동결 샘플, 고정 샘플, 염색 샘플 또는 예비-처리 샘플을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 천연 형태의 샘플과는 본래 혼합되지 않을 수 있는 방부제, 항응고제, 완충제, 고정제, 영양소, 항생제 등과 같은 화합물들을 추가로 포함할 수 있다. 생물학적 샘플을 그대로, 즉 관심 표적의 수확 및/또는 단리 없이 분석할 수 있거나, 또는 분석 전에 표적의 수확 및/또는 단리에 적용할 수 있다.
생물학적 샘플이 전체 세포를 포함할 수 있다. 세포는 1차 세포, 배양 세포, 또는 세포주일 수 있다. 생물학적 샘플은 줄기 세포 (예를 들어, 성체 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포), 탈분화된 체세포, 리프로그래밍(reprogramming)된 세포, 또는 유도된 만능성(pluripotent) 세포를 포함할 수 있다. 줄기 세포는 전능성(totipotent), 만능성 또는 다능성(multipotent)일 수 있다.
생물학적 샘플은 조직 샘플을 포함할 수 있다. 조직 샘플은 유사한 기능을 지닐 수 있는 생물학적 대상체로부터 수득된 유사한 세포들 (반드시 동일한 세포들이지는 않지만, 동일한 기원으로부터의 세포들)의 수집을 포함한다. 예를 들어, 인간 조직에는 상피 조직 (예를 들어, 피부, 기도, 생식관, 또는 소화관 내층의 표면), 결합 조직 (예를 들어, 혈관, 뼈, 또는 연골), 근육 조직 (내장근 또는 평활근, 골격근, 또는 심근), 또는 신경 조직 (예를 들어, 뇌, 뇌신경 또는 척수)이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 조직 샘플은 신선한 또는 보존된 (예를 들어, 고정 또는 동결된) 기관, 생검, 흡인물, 혈액, 혈액 구성물 또는 체액 (예를 들어, 뇌척수액, 양수, 복수, 또는 간질액)으로부터, 생물학적 대상체의 임신 (출생전) 또는 발달 시의 임의의 시점 동안 수득될 수 있다.
조직 샘플은 정상 조직 (예를 들어, 결장, 유방 또는 전립선의 조직 절편) 또는 질환 조직 (예를 들어, 결장 선암종)으로부터 유래된, 조직 또는 이의 일부분의 얇은 슬라이드 (조직 절편)일 수 있다. 조직 절편은 두께가 약 1 마이크로미터 (㎛) 내지 약 100 ㎛, 또는 약 1 ㎛ 내지 약 50 ㎛, 또는 약 2 ㎛ 내지 약 25 마이크로미터, 또는 약 3 ㎛ 내지 약 5 마이크로미터 범위일 수 있다. 형태학적 수준 또는 분자 수준에서 상이한 표적들의 2개 이상의 세트를 검출하기 위해 조직 샘플의 동일한 절편을 취하여 분석에 적용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수의 표적을 검출하기 위해 조직 샘플의 다중 절편을 분석할 수 있다. 조직 샘플은 조직 마이크로 어레이(micro array) (예를 들어, 유방 조직 마이크로 어레이)의 형태로 제공될 수 있다.
일부 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 다수의 표적을 검출하는 방법은 생물학적 샘플 내의 다수의 표적의 순차적인 검출을 포함한다. 먼저, 다수의 표적-결합 프로브를 생물학적 샘플에 첨가하여 다수의 표적-결합된 프로브를 형성시킨다. 그 후, 표적-결합된 프로브들 중 하나 이상을 생물학적 샘플에 공유결합으로 부착시킨다. 그 후, 표적-결합된 프로브들을 검출함으로써 다수의 표적을 순차적으로 검출한다. 방법들 중 하나 이상이 샘플을 다수의 표적-결합 프로브와 접촉시켜 다수의 표적-결합된 프로브를 형성시키는 단계, 표적-결합된 프로브들 중 하나 이상을 생물학적 샘플에 공유결합으로 부착시키는 단계, 다수의 표적-결합된 프로브의 제1 세트로부터의 제1 신호 세트를 관찰하는 단계, 관찰된 신호들을 변형시키는 단계, 다수의 표적-결합된 프로브의 제2 세트로부터 제2 신호 세트를 생성시키는 단계, 및 제2 신호 세트를 관찰하는 단계를 포함할 수 있다.
방법은 일반적으로 표적-결합 프로브들의 다수의 다중 세트를 생물학적 샘플에 적용하는 단계, 표적-결합된 프로브들 중 하나 이상을 생물학적 샘플에 공유결합으로 부착시키는 단계, 다수의 표적의 제1 세트로부터의 제1 신호 세트를 관찰함으로써 생물학적 샘플 내의 다수의 표적의 제1 세트를 검출하는 단계, 관찰된 제1 신호 세트를 변형시키는 단계, 및 (다수의 표적의 제2 세트로부터 제2 신호 세트를 생성시키고, 제2 신호 세트를 관찰하는 것을 통해) 생물학적 샘플 내의 다수의 표적의 제2 세트를 검출하는 단계를 포함한다. 방법은 다수의 표적의 제2 세트로부터의 관찰된 신호 (즉, 제2 신호 세트)의 변형 단계에 이어서 생물학적 샘플 내의 다수의 표적의 제3 세트를 검출하는 것을 반복하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법 단계들을 (다수의 표적의 제4, 제5 및 제n 세트를 검출하기 위해) 여러 번 반복하여, 생물학적 샘플 내의 다수의 표적 대부분 또는 모두를 검출할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적들의 약 100개의 상이한 세트 (즉, n=100)를 검출하기 위해 단계들이 약 100회 반복된다. 제1 신호 세트 및 후속 신호 세트는 모두 동일한 유형일 수 있거나 (예를 들어, 형광 신호), 또는 상이한 유형일 수 있다 (예를 들어, 제1 세트는 형광 신호일 수 있고, 제2 세트는 흡수 신호일 수 있다). 제1 신호 세트 및 후속 신호 세트가 단일 검출 채널을 사용할 수 있거나, 또는 다중 검출 채널을 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 다수의 표적은 상이한 표적들의 각각의 세트가 하나 이상의 표적을 포함하는, 상이한 표적들의 2개 이상의 세트를 포함한다. 상이한 표적들의 2개의 세트는 동일한 유형의 바이오마커를 포함할 수 있거나 (예를 들어, 상이한 항원들의 2개의 세트; 항원 A의 제1 세트 및 항원 B의 제2 세트), 또는 상이한 유형의 바이오마커를 포함할 수 있다 (예를 들어, 항원 A의 제1 세트 및 DNA의 제2 세트). 일부 실시양태에서, 다수의 표적은 상이한 표적들의 다중 세트를 포함할 수 있다. 표적은 생물학적 샘플의 표면 상에 존재할 수 있거나 (예를 들어, 조직학적 절편, DNA 마이크로어레이, 단백질 마이크로어레이, 현탄액 내의 세포, 세포학 도말표본, 또는 고체 지지체 (예컨대 젤, 블롯, 유리 슬라이드, 비드 또는 ELISA 플레이트)의 표면), 또는 내부에 매립될 수 있다 (예를 들어, 원위치 검출을 위한 세포 내의 RNA 또는 DNA 표적). 표적은 특정 세포 유형 (예를 들어, 분화 대 미분화 줄기 세포), 또는 특정 질환 또는 의학 상태에 특징적일 수 있다. 적절한 표적에는 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 핵산 (예를 들어, 데옥시리보핵산 (DNA), 또는 리보핵산 (RNA)), 폴리사카라이드 (예를 들어, 렉틴 또는 당), 지질, 리간드, 수용체, 항체, 어피바디, 항원, 압타머, 합텐, 지질, 호르몬, 효소, 효소 기질, 또는 이들의 조합물이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
이러한 방법들은 예후성 표적, 호르몬 또는 호르몬 수용체 표적, 림프성 표적, 종양 조직 표적, 세포 주기-관련 표적, 신경 조직 표적, 또는 분화 클러스터 (CD) 표적 또는 이들의 조합물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 상이한 표적들을 검출하는데 사용될 수 있다. 표적의 비-제한적인 예로는 동원체 단백질-F (CENP-F), 자이안틴(giantin), 인볼루크린(involucrin), 라민(lamin) A&C (XB 10), LAP-70, 뮤신(mucin), 핵공 복합체 단백질, p180 층판체(lamellar body) 단백질, 랜(ran), 카텝신(cathepsin) D, Ps2 단백질, Her2-neu, P53, S100, 상피 표적 항원 (EMA), TdT, MB2, MB3, PCNA, 또는 Ki67이 포함된다.
종양 조직 표적의 비-제한적인 예로는 유방암 바이오마커 (예를 들어, ER, PR, Her2, CA 15-3, CA 27.29, CEA, uPA, PAI-1, 또는 Ki-67), 결장직장암 바이오마커 (예를 들어, CEA, CA19-9, 티미딜레이트 신타제(Thymidylate Synthase), 또는 CA125), 폐암 바이오마커 (예를 들어, NSE, CEA, CYFRA 21-1, IMP3, TPA, proGRP, TTF, D2-40, 포도플라닌(Podoplanin), 사이토케라틴(Cytokeratin)-20, 크로모그라닌(Chromogranin) A, 또는 혈청 아밀로이드(Serum Amyloid) A), 전립선암 바이오마커 (예를 들어, PSA, PCA3, uPM3, hk2, 또는 PSMA), 또는 간암 바이오마커 (예를 들어, AFP)와 같은 바이오마커가 포함될 수 있다.
예후성 표적의 적절한 예로는 갈락토실 트랜스퍼라제(transferase) II, 뉴런 특이적 에놀라제(enolase), 양성자 ATPase-2, 또는 산 포스파타제(phosphatase)와 같은 효소성 표적이 포함될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 호르몬, 호르몬-조절, 또는 호르몬-수용체 표적에는 인간 융모성 생식선자극호르몬 (HCG), 부신피질자극 호르몬, 암배아 항원 (CEA), 전립선-특이적 항원 (PSA), 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 안드로겐 수용체, gC1q-R/p33 보체 수용체, IL-2 수용체, p75 뉴로트로핀(neurotrophin) 수용체, PTH 수용체, 갑상선 호르몬 수용체, 또는 인슐린 수용체가 포함될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
림프성 표적의 적절한 예로는 알파-1-항키모트립신, 알파-1-항트립신, B 세포 표적, bcl-2, bcl-6, B 림프구 항원 36 kD, BM1 (골수성 표적), BM2 (골수성 표적), 갈렉틴(galectin)-3, 그랜자임(granzyme) B, HLA 클래스 I 항원, HLA 클래스 II (DP) 항원, HLA 클래스 II (DQ) 항원, HLA 클래스 II (DR) 항원, 인간 호중구 디펜신(defensin), 면역글로불린 A, 면역글로불린 D, 면역글로불린 G, 면역글로불린 M, 카파 경쇄, 카파 경쇄, 람다 경쇄, 림프구/조직구 항원, 포식세포 표적, 뮤라미다제(muramidase) (라이소자임), p80 역형성 림프종 키나제(kinase), 형질 세포 표적, 분비성 백혈구 프로테아제(protease) 억제제, T 세포 항원 수용체 (JOVI 1), T 세포 항원 수용체 (JOVI 3), 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(transferase), 또는 클러스터화되지 않은 B 세포 표적이 포함될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
종양 조직 표적에는 알파 태아단백질, 아포지질단백질 D, BAG-1 (RAP46 단백질), CA19-9 (시알릴 루이사(sialyl lewisa)), CA50 (암종 관련 뮤신 항원), CA125 (난소암 항원), CA242 (종양 관련 뮤신 항원), 크로모그라닌 A, 클루스테린(clusterin) (아포지질단백질 J), 상피 막 항원, 상피-관련 항원, 상피 특이적 항원, 총체적 낭성 질환 유체 단백질-15, 간세포 특이적 항원, 헤레귤린(heregulin), 인간 위 뮤신, 인간 유액 지방구, MAGE-1, 매트릭스 메탈로프로테이나제(metalloproteinase), 멜란(melan) A, 흑색종 표적 (HMB45), 메소텔린(mesothelin), 메탈로티오네인(metallothionein), 소안구증 전사 인자 (MITF), Muc-1 코어(core) 당단백질. Muc-1 당단백질, Muc-2 당단백질, Muc-5AC 당단백질, Muc-6 당단백질, 마이엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase), Myf-3 (횡문근육종 표적), Myf-4 (횡문근육종 표적), MyoD1 (횡문근육종 표적), 마이오글로빈(myoglobin), nm23 단백질, 태반 알칼리성 포스파타제, 프리알부민(prealbumin), 전립선 특이적 항원, 전립선 산 포스파타제, 전립선 인히빈(inhibin) 펩티드, PTEN, 신세포 암종 표적, 소장 뮤신성 항원, 테트라넥틴(tetranectin), 갑상선 전사 인자-1, 매트릭스 메탈로프로테이나제 1의 조직 억제제, 매트릭스 메탈로프로테이나제 2의 조직 억제제, 티로시나제(tyrosinase), 티로시나제-관련 단백질-1, 빌린(villin), 또는 폰 빌레브란트(von Willebrand) 인자가 포함될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
세포 주기-관련 표적의 비-제한적인 예로는 세포자멸사 프로테아제 활성화 인자-1, bcl-w, bcl-x, 브로모데옥시유리딘, cdk-활성화 키나제 (CAK), 세포성 세포자멸사 감수성 단백질 (CAS), 카스파제(caspase) 2, 카스파제 8, CPP32 (카스파제-3), CPP32 (카스파제-3), 시클린(cyclin) 의존성 키나제, 시클린 A, 시클린 B1, 시클린 D1, 시클린 D2, 시클린 D3, 시클린 E, 시클린 G, DNA 단편화 인자 (N-말단), Fas (CD95), Fas-관련 사망 도메인 단백질, Fas 리간드, Fen-1, IPO-38, Mcl-1, 미니염색체 유지 단백질, 미스매치(mismatch) 복구 단백질 (MSH2), 폴리 (ADP-리보스) 중합효소, 증식 세포 핵 항원, p16 단백질, p27 단백질, p34cdc2, p57 단백질 (Kip2), p105 단백질, Stat 1 알파, 토포이소머라제(topoisomerase) I, 토포이소머라제 II 알파, 토포이소머라제 III 알파, 또는 토포이소머라제 II 베타가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
신경 조직 표적에는 알파 B 크리스탈린(crystallin), 알파-인터넥신(internexin), 알파 시뉴클레인(synuclein), 아밀로이드 전구체 단백질, 베타 아밀로이드, 칼빈딘(calbindin), 콜린 아세틸트랜스퍼라제(acetyltransferase), 흥분성 아미노산 전달체 1, GAP43, 아교세포 섬유성 산성 단백질, 글루타메이트 수용체 2, 미엘린 염기성 단백질, 신경 성장 인자 수용체 (gp75), 신경모세포종 표적, 신경미세섬유 68 kD, 신경미세섬유 160 kD, 신경미세섬유 200 kD, 뉴런 특이적 에놀라제, 니코틴성 아세틸콜린 수용체 알파4, 니코틴성 아세틸콜린 수용체 베타2, 페리페린(peripherin), 단백질 유전자 생성물 9, S-100 단백질, 세로토닌(serotonin), SNAP-25, 시냅신(synapsin) I, 시냅토피신(synaptophysin), 타우(tau), 트립토판 히드롤라제, 티로신 히드롤라제, 또는 유비퀴틴(ubiquitin)이 포함될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
클러스터 분화 표적의 적절한 예로는 CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, CD1e, CD2, CD3델타, CD3엡실론, CD3감마, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8알파, CD8베타, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CDw12, CD13, CD14, CD15, CD15s, CD16a, CD16b, CDw17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a, CD42b, CD42c, CD42d, CD43, CD44, CD44R, CD45, CD46, CD47, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD51, CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CDw60, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64, CD65, CD65s, CD66a, CD66b, CD66c, CD66d, CD66e, CD66f, CD68, CD69, CD70, CD71, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD87, CD88, CD89, CD90, CD91, CDw92, CDw93, CD94, CD95, CD96, CD97, CD98, CD99, CD100, CD101, CD102, CD103, CD104, CD105, CD106, CD107a, CD107b, CDw108, CD109, CD114, CD115, CD116, CD117, CDw119, CD120a, CD120b, CD121a, CDw121b, CD122, CD123, CD124, CDw125, CD126, CD127, CDw128a, CDw128b, CD130, CDw131, CD132, CD134, CD135, CDw136, CDw137, CD138, CD139, CD140a, CD140b, CD141, CD142, CD143, CD144, CDw145, CD146, CD147, CD148, CDw149, CDw150, CD151, CD152, CD153, CD154, CD155, CD156, CD157, CD158a, CD158b, CD161, CD162, CD163, CD164, CD165, CD166, 또는 TCR-제타가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
생물학적 샘플 내의 다수의 표적이 표적-결합 모이어티를 통해 표적에 결합할 수 있는 다수의 프로브 (표적-결합 프로브)를 사용함으로써 검출된다. 다수의 표적-결합 프로브는 각각의 프로브 세트가 다른 세트와 구조적으로 또는 기능적으로 상이할 수 있는 다중 프로브 세트를 포함한다. 표적-결합 프로브들을 생물학적 샘플과 접촉시키고 이어서 인큐베이션함으로써 표적-결합 프로브들이 표적에 결합된다. 표적을 표적-결합 프로브의 결합에 접근가능하게 만들기 위해 생물학적 샘플의 사전 프로세싱이 요구될 수 있다 (예를 들어, 항원 복원). 표적-결합 프로브가 표적에 결합되면, 표적-결합된 프로브를 검출함으로써 표적의 검출이 달성될 수 있다. 표적-결합 프로브는 신호 생성기를 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 표적-결합 프로브가 신호 생성기를 포함하는 경우, 신호 생성기로부터의 신호를 관찰함으로써 표적의 검출이 달성될 수 있다. 표적-결합 프로브가 신호 생성기를 포함하지 않는 경우, 표적-결합된 프로브에 특이적으로 결합하는 신호-생성 모이어티가 표적-결합된 프로브에 회합되어, 표적의 검출을 가능하게 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적-결합 프로브는 표적-결합 모이어티 및 독립적으로 검출가능한 모이어티로부터 유래된 단위를 포함한다. 독립적으로 검출가능한 모이어티는 형광단, 발색단, 라만 태그, 표면 강화 라만 분광분석법 (SERS) 태그, 표면 강화 공명 라만 분광분석법 (SERRS) 태그, 또는 방사성동위원소와 같은 신호 생성기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 독립적으로 검출가능한 모이어티는 간접적인 검정을 사용하여 검출될 수 있는 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 독립적으로 검출가능한 모이어티가 독특한 핵산 서열, 합텐, 효소, 또는 이들의 조합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 독립적으로 검출가능한 모이어티는 차폐된 신호-생성 모이어티를 포함한다. 차폐된 신호-생성 모이어티의 예로는 차폐된 형광단, 차폐된 발색단, 차폐된 라만 태그, 차폐된 SERS 태그, 차폐된 SERRS 태그, 또는 이들의 조합물이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 차폐된 형광단은 도너-어셉터 형광단 쌍 (예를 들어, 플루오레세인-로다민 쌍), 켄칭된 형광단 (예를 들어, 금속 또는 유기 모이어티에 의해 켄칭됨), 또는 극성-민감성 형광단 (예를 들어, 프로단(Prodan); 6-프로피오닐-2-디메틸아미노나프탈렌, 팔단(Paldan); 6-팔미토일-2-디메틸아미노나프탈렌, 또는 로르단(Laurdan); 6-도데카노일-2-디메틸아미노나프탈렌)을 포함할 수 있다.
독립적으로 검출가능한 모이어티는 공유 결합을 통해 (링커 모이어티 없이 직접적인 부착에 의해 또는 링커 모이어티를 통한 부착에 의해), 또는 비-공유 상호작용 (예를 들어, 정전기 상호작용, 반데르발스 상호작용, 쌍극자-쌍극자 상호작용, 수소 결합형성, 또는 이들의 조합)을 통해 표적-결합 모이어티에 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 독립적으로 검출가능한 모이어티가 절단가능한 링커를 통해 표적-결합 모이어티에 부착된다. 절단가능한 링커는 (예를 들어, 산화, 친핵성 치환, 환원 또는 pH 변화에 의해) 절단될 수 있는 절단가능한 공유 결합 (예를 들어, S-S 결합)을 포함할 수 있거나, 적절한 조건 하에 해리될 수 있는 결합 쌍 (예를 들어, 상보적 핵산, 또는 데티오아비딘-비오틴 쌍)을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적-결합 프로브는 표적-결합 모이어티, 가교 모이어티, 및 독립적으로 검출가능한 모이어티를 포함한다. 예를 들어, RNA 표적용 표적-결합 프로브는 표적 RNA에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드 (즉, 표적-결합 모이어티)를 포함하는 제1 영역, 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브 (즉, 신호 생성기)에 상보적일 수 있는 올리고뉴클레오티드 (즉, 독립적으로 검출가능한 모이어티, 우편 번호)를 포함하는 제2 영역, 및 표적-결합 프로브를 표적 RNA 부근에 위치하는 분자에 가교시킬 수 있는, 가교 모이어티가 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제3 영역인 3개의 영역을 포함할 수 있다. 가교 모이어티는 링커 모이어티를 통해 제3 영역 내의 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 표적-결합 프로브의 가교는 표적-결합 프로브를 적절한 개시제 (예를 들어, 빛 또는 화학 작용제)에 노출시킴으로써 개시될 수 있다. 표적-결합 모이어티, 가교 모이어티 및 독립적으로 검출가능한 모이어티는 표적-결합 프로브 내에 임의의 순서로 놓일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 표적-결합 모이어티가 가교 모이어티 및 독립적으로 검출가능한 모이어티 양쪽에 직접적으로 부착될 수 있다. 다른 예에서, 표적-결합 모이어티가 가교 모이어티에 직접적으로 부착될 수 있고, 차례로 가교 모이어티가 독립적으로 검출가능한 모이어티에 직접적으로 부착될 수 있다. 또 다른 예에서, 표적-결합 모이어티가 독립적으로 검출가능한 모이어티에 직접적으로 부착될 수 있고, 차례로 독립적으로 검출가능한 모이어티가 가교 모이어티에 직접적으로 부착될 수 있다.
표적-결합된 프로브는 독립적으로 검출가능한 모이어티의 성질에 따라 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 예를 들어, 독립적으로 검출가능한 모이어티가 검출가능한 신호 (예를 들어, 광학 신호 또는 방사성 신호)를 스스로 제공하는 경우, 직접적인 검출 방법이 사용될 수 있다. 독립적으로 검출가능한 모이어티가 검출가능한 신호를 스스로 제공하지 않는 경우, 사전의 신호 생성 단계가 표적-결합된 프로브를 검출하는데 필요할 수 있다 (간접적인 검출). 예를 들어, 독립적으로 검출가능한 모이어티가 핵산 서열인 경우, 표지된 상보적 핵산 서열과 모이어티가 혼성화될 수 있고, 그 후, 표지로부터의 신호를 관찰함으로써 혼성화 복합체를 검출할 수 있다.
일부 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 다수의 표적이 표적-결합 프로브들의 동시 적용에 이어지는 표적-결합 프로브들의 순차적인 검출에 의해 검출된다. 다수의 표적은 상이한 표적들의 각각의 세트가 하나 이상의 표적을 포함하는, 상이한 표적들의 2개 이상의 세트를 포함한다. 다수의 표적-결합된 프로브는 상이한 표적-결합된 프로브들의 각각의 세트가 하나 이상의 표적-결합된 프로브를 포함하는, 상이한 표적-결합된 프로브들의 2개 이상의 세트를 포함한다. 한 예에서, 방법은 생물학적 샘플을 다수의 표적-결합 프로브와 접촉시켜 다수의 표적-결합된 프로브를 형성시키는 단계를 포함한다. 그 후, 표적-결합된 프로브들 중 하나 이상이 생물학적 샘플에 공유결합으로 부착된다. 그 후, 표적-결합된 프로브들의 다수의 상이한 세트가 순차적인 방식으로 검출된다. 일반적으로, 표적-결합된 프로브들의 상이한 세트들이 한번에 한 세트씩 순차적으로 검출된다. 먼저, 다수의 표적-결합된 프로브의 제1 세트로부터 제1 신호 세트가 관찰될 수 있다. 이러한 제1 신호 세트는 서로 구별될 수 없는 신호들을 포함할 수 있거나, 또는 스펙트럼 차이 또는 신호 유형을 기초로 서로 구별될 수 있는 신호들을 포함할 수 있다. 그 후, 관찰된 신호들이 변형된다. 표백 (예를 들어, 광 표백 또는 화학적 표백)과 같은 신호 변형 절차들 중 임의의 것을 사용하여 신호가 변형될 수 있다. 그 후, 다수의 표적-결합된 프로브의 제2 세트로부터 제2 신호 세트가 생성될 수 있으며, 제2 신호 세트를 관찰하는 것이 이어진다. 관찰된 신호들 (즉, 제2 신호 세트)를 변형시키는 단계, 다수의 표적-결합된 프로브로부터 제3 신호 세트를 생성시키는 단계, 이어서 제3 신호 세트를 관찰하는 단계를 방법이 추가로 포함할 수 있다. "관찰된 신호들을 변형시키는 단계", 및 후속 신호 세트를 "생성시킨 후 관찰하는 단계"를 다수의 표적-결합된 프로브의 제4, 제5 및 제n 세트로 여러 번 반복하여 제4, 제5 및 제n 신호 세트를 관찰할 수 있다. 가능하게는, 무한 개수의 표적 (즉, 이때, n의 정수값이 n=6 내지 n=∞ 범위일 수 있음)이 이러한 방법을 사용하여 순차적으로 검출될 수 있다. 관찰된 신호들의 변형 동안, 모든 관찰된 신호를 변형시키는 것이 필요하지 않을 수 있다. 관찰된 신호들 중 하나 이상이 변형 없이 보존될 수 있다. 그 후, 보존된 신호들 중 하나 이상이 공동-등록(co-registration) 또는 비교 분석에 활용될 수 있다. 관찰된 신호들을 생물학적 샘플 내의 다수의 표적의 검출에 상관시키는 단계들을 방법이 추가로 포함할 수 있다.
표적-결합된 프로브들의 다중 세트가 (예를 들어, 스펙트럼 차이 또는 신호 유형을 기초로) 서로로부터 분해될 수 있는 상호 구별가능한 신호들을 생산하는 경우, 표적-결합된 프로브들의 다중 세트의 배치(batch)들을 순차적으로 검출하도록 방법이 변형될 수 있다. 예를 들어, 상이한 표적-결합된 프로브들의 4개의 세트 각각으로부터의 형광이 서로로부터 분해가능한 경우, 상이한 표적-결합된 프로브들의 4개의 세트의 제1 배치를 (예를 들어, 4-채널 검출을 사용함으로써) 한번에 검출함으로써 형광 신호들을 생성하는 표적-결합된 프로브들의 순차적인 검출을 수행할 수 있다. 일단 상이한 표적-결합된 프로브들의 4개의 세트의 제1 배치로부터의 신호들이 관찰되면, 관찰된 신호들이 변형된다. 이에 이어서, 상이한 표적-결합된 프로브들의 4개의 세트의 제2 배치를 제2 배치로부터 신호들을 생성시키고 생성된 신호들을 관찰함으로써 검출할 수 있다. 일반적으로, 각각의 배치에서 한번에 검출될 수 있는 상이한 표적-결합된 프로브들의 세트의 개수는 신호들을 관찰하는데 사용되는 장치가 각각의 세트의 신호들을 서로로부터 분해하는 능력에 좌우된다. 중첩되지 않는 스펙트럼 특성으로 인해, 신호 유형 (예를 들어, 형광 신호 및 방사성 신호)으로 인해, 또는 생물학적 샘플 내에서의 상이한 위치 (예를 들어, 세포질로부터의 신호 및 핵으로부터의 신호)로 인해 신호들이 서로로부터 분해가능할 수 있다. 모든 상이한 표적-결합된 프로브들이 순차적으로 검출될 때까지 단계들을 반복할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적-결합 프로브들을 생물학적 샘플과 접촉시킨 후,생물학적 샘플을 표적들에 대한 표적-결합 프로브들의 특이적 결합에 충분한 기간 동안 인큐베이션할 수 있다. 실온에서 약 5분 내지 약 16시간의 시간 범위 동안 또는 4℃에서 약 16시간 동안 인큐베이션을 수행할 수 있다. 인큐베이션 온도 및 인큐베이션 시간 범위는 사용된 표적-결합 프로브의 기능적 및/또는 구조적 특성 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프로브의 융점 (Tm))에 주로 좌우된다. 표적-결합 모이어티는 정전기 상호작용, 반데르발스 상호작용, 쌍극자-쌍극자 상호작용 또는 수소 결합형성을 포함하지만 이에 한정되지 않는 비-공유결합 상호작용을 통해 표적에 결합될 수 있다. 임의적으로, 표적에 결합되지 않았을 수 있는 임의의 표적-결합 프로브를 제거하기 위한 추가적인 단계들을 방법이 포함할 수 있다. 적절한 완충제로 생물학적 샘플을 세정함으로써 임의의 미결합 프로브의 제거가 달성될 수 있다.
다수의 표적-결합 프로브는 생물학적 샘플에 공유결합으로 결합할 수 있는 하나 이상의 표적-결합 프로브를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 다수의 표적-결합 프로브 모두가 생물학적 샘플에 공유결합으로 결합할 수 있다. 생물학적 샘플에 대한 표적-결합 프로브들의 공유결합 부착은 표적 자체 또는 표적 부근에 위치하는 분자를 통한 것일 수 있다. 일반적으로, 다수의 표적-결합 프로브가 생물학적 샘플과 접촉되고, 인큐베이션된다. 종종, 다수의 표적-결합 프로브가 먼저 물리적 상호작용 (즉, 비-공유결합 상호작용 예컨대 수소 결합형성, 반데르발스 상호작용 등)을 통해 표적에 결합되어, 다수의 표적-결합된 프로브가 생성된다. 적절한 조건 하에, 그 후, 다수의 표적-결합된 프로브 중 하나 이상이 표적 자체에 또는 표적 부근에 위치하는 분자에 공유결합으로 커플링될 수 있다. 일부 경우에, 다수의 표적-결합된 프로브 모두가 생물학적 샘플에 공유결합으로 커플링/가교될 수 있다. 표적 또는 표적 부근에 위치하는 분자에 대한 표적-결합 프로브의 공유결합 부착은 직접적인 커플링 (예를 들어, 단백질 또는 핵산의 가교)에 의해, 또는 링커 모이어티를 통해 (예를 들어, 이관능성 링커 모이어티를 통해) 달성될 수 있다. 공유결합 부착이 링커 모이어티를 통해 수행되는 경우, 생물학적 세포의 치수에 비교했을 때 유의하지 않도록 링커 길이가 선택된다 (예를 들어, 약 5 Å 내지 약 50 Å). 따라서, 표적-결합 프로브가 표적 부근에 위치하는 분자에 가교되더라도, 결합된 프로브의 위치는 표적의 위치와 실질적으로 동일할 수 있다. 공유결합 커플링은 비가역적인 공유결합 연결 (예를 들어, C-C 결합), 가역적인 결합 (예를 들어, S-S 결합의 형성), 또는 절단가능한 결합 (예를 들어, 절단가능한 링커를 통한 커플링)을 포함할 수 있다. 공유결합 커플링은 광 가교에 의해 또는 화학적 가교에 의해 에스테르, 아미드 또는 티오에테르 결합 형성을 통해 달성될 수 있다. 표적에 대한 표적-결합 프로브의 공유결합 커플링은 다수의 표적을 검출하기 위한 후속 방법 단계들을 수행하는 동안 표적의 시그니처(signature)를 유지하는 것을 도울 수 있다. 용어 시그니처는 표적이 후속 조작에서 파괴될 수 있지만, 샘플 내의 이의 존재가 초기에 표적에 선택적으로 결합하고 그 자리에서 가교된 표적-결합된 프로브의 존재로부터 추정될 수 있다는 것을 의미한다. 표적에 대한 표적-결합 프로브의 공유결합 부착은 표적이 신호 생성 및 신호 변형에 사용되는 다양한 작용제에 대해 감수성일 수 있는 경우에 특히 관련된다. 예를 들어, RNA 표적이 관찰된 신호를 변형시키는데 사용될 수 있는 화학 작용제에 대해 감수성일 수 있다. 따라서, 다수의 RNA-결합된(RNA-bound) 프로브로부터의 신호들을 관찰함으로써 다수의 상이한 RNA 표적을 검출하는 동안, RNA 표적들의 제1 및/또는 제2 세트로부터 신호를 생성시키거나 관찰된 신호를 변형시키는 동안 RNA 표적들의 후속 세트가 파괴될 가능성이 존재한다. 그러나, RNA-결합(RNA-binding) 프로브가 표적 RNA에 또는 표적 RNA 부근의 분자에 가교되면, 후속 조작에서 RNA 표적이 파괴되더라도, 샘플 내의 이의 존재가 초기에 표적 RNA에 선택적으로 결합하고 그 자리에서 가교된 결합된 프로브 (표적 RNA에 결합되거나 또는 생물학적 샘플에 결합됨)의 존재로부터 추정될 수 있다. 실제로, 일부 예에서, 일단 표적-결합된 프로브가 생물학적 샘플에 가교되면 생물학적 샘플을 RNAse로 처리함으로써 모든 세포성 RNA를 파괴하는 것이 이로울 수 있다. 또한, 표적-결합 프로브가 생물학적 샘플에 가교되면 임의의 미결합 표적-결합 프로브를 제거하기 위해 더욱 엄격한 세정 조건을 사용할 수 있다. 이러한 절차는 생물학적 샘플 내의 다수의 RNA 표적을 검출하는 동안 신호-대-잡음 비율을 증가시킨다.
다수의 표적-결합된 프로브의 제1 세트로부터의 제1 신호 세트를 직접적으로 또는 간접적으로 관찰할 수 있다. 직접적인 검정이 사용되는 경우, 다수의 표적-결합 프로브의 제1 세트 (즉, 다수의 표적의 제1 세트에 결합하여 표적-결합된 프로브들의 제1 세트를 형성하는 프로브들의 세트)는 표적-결합 모이어티 및 독립적으로 검출가능한 모이어티로부터 유래된 단위를 포함하고, 이때 독립적으로 검출가능한 모이어티는 관찰가능한 신호를 스스로 생산할 수 있다 (즉, 독립적으로 검출가능한 모이어티가 신호 생성기를 포함한다).
일부 실시양태에서, 표적-결합 프로브들의 제1 세트는 신호 생성기 (예를 들어, 형광단, 발색단, 방사성동위원소, 효소, 또는 라만 활성 모이어티)로 표지된 표적-결합 모이어티 (예를 들어, 항체, 핵산, 압타머, 어피바디, 또는 합텐)를 포함할 수 있다. 신호 생성기는 직접적으로 검출 또는 가시화될 수 있는 관찰가능한 신호를 생산한다. 예를 들어, 표적-결합 프로브들의 제1 세트가 표적-결합 모이어티에 형광단이 부착된 프로브들로 구성되는 경우, 표적에의 결합 시, 형광단으로부터의 형광 신호를 관찰함으로써 표적-결합된 프로브들을 검출할 수 있다. 신호 생성기는 관찰가능한 신호를 선천적으로 (예를 들어, 형광발생성 신호 생성기), 또는 적절한 기질과의 상호작용 (예를 들어, 효소성 신호 생성기에 대한 효소-기질 반응)에 의해 생산할 수 있다.
표적-결합 프로브들의 제1 세트가 관찰가능한 신호를 스스로 제공하지 않는 경우, 표적-결합된 프로브들의 제1 세트의 간접적인 검출이 사용된다. 일부 실시양태에서, 이는 신호-생성 모이어티를 표적-결합된 프로브들의 제1 세트와 회합시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 표적-결합 프로브들의 제1 세트가 표지되지 않은 1차 프로브들 (예를 들어, 1차 항체들)을 포함할 수 있고, 이것이 생물학적 샘플 내의 표적들 (예를 들어, 항원들)의 제1 세트에 결합하는데 사용될 수 있다. 그 후, 표지된 2차 프로브들 (예를 들어, 표지된 2차 항체들)이 표적-결합 1차 프로브들을 태깅(tagging)하는데 사용될 수 있다. 그 후, 태깅된 표적-결합 1차 프로브들을 표지된 2차 프로브들 (1차 프로브들에 결합됨)로부터의 신호를 관찰함으로써 검출할 수 있다. 그 후, 태깅된 1차 프로브들의 검출이 생물학적 샘플 내의 표적들의 제1 세트의 존재와 상관될 수 있다. 간접적인 검정은 검출 감도를 증가시키는데 효과적으로 사용될 수 있는데, 이는 1차 프로브가 여러 2차 프로브들로 태깅될 수 있어, 이어서 신호-대-잡음 비율을 강화하기 때문이다.
표적-결합된 프로브들의 제1 세트로부터 제1 신호 세트를 직접적으로 또는 간접적으로 관찰한 후, 관찰된 신호들이 변형된다. 신호 변형은 하나 이상의 신호 특성에서의 변화를 포함할 수 있다. 예를 들어, 신호 변형은 신호 강도에서의 감소, 신호 피크에서의 이동, 공명 주파수에서의 변화, 또는 신호를 제거하는 것 (신호 파괴)을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 관찰된 신호의 변형은 표적-결합된 프로브들의 후속 세트의 검출 동안 신호들 (이미 관찰된 신호들 대 관찰될 신호들)의 중첩을 피하는 것을 돕는다.
임의의 신호 변형 방법 예컨대 표백 (예를 들어, 광-표백, 또는 화학적 표백), 켄칭 (예를 들어, 형광 켄칭용 금속 이온), 또는 격리 (예를 들어, 킬레이터를 사용하는 것에 의한 격리)가 관찰된 신호를 변형시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학 작용제가 관찰된 신호를 변형시키기 위해 적용된다. 관찰된 신호를 변형시키는데 유용한 적절한 화학 작용제로는 pH를 변형시키는 작용제 (예를 들어, 산 또는 염기), 친핵체, 친전자체, 산화제, 환원제, 또는 이들의 조합물이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, 염기성 pH의 200 mM NaHCO3 내의 3％ H2O2가 시아닌 (예를 들어, Cy3 또는 Cy5) 염료의 형광을 변형시키는데 사용될 수 있다.
표적-결합된 프로브들의 제1 세트로부터 제1 신호 세트를 관찰하고, 이어서 변형시킨 후, 표적-결합된 프로브들의 제2 및 후속 세트로부터의 신호를 관찰할 수 있다. 표적-결합된 프로브들의 제2 및 후속 세트는 간접적인 검정을 통해 검출되는데, 이는 관찰가능한 신호를 선천적으로 생산하지 않도록 표적-결합된 프로브들의 제2 및 후속 세트가 선택되기 때문이다. 그러므로, 사전의 신호 생성 단계가 표적-결합된 프로브들의 제2 및 후속 세트로부터 신호를 생성시키는데 요구된다. 이는 신호-생성 모이어티를 표적-결합된 프로브들의 제2 및 후속 세트에 회합시키고, 이러한 신호-생성 모이어티로부터의 신호를 관찰함으로써 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적-결합된 프로브들의 제2 및 후속 세트는 표적-결합 모이어티 및 독립적으로 검출가능한 모이어티로부터 유래된 단위를 포함하고, 이때 독립적으로 검출가능한 모이어티는 관찰가능한 신호를 스스로 생산하지 않는다. 예를 들어, 독립적으로 검출가능한 모이어티가 독특한 핵산 서열, 합텐, 효소, 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 신호-생성 모이어티 (예를 들어, 표지)를 독립적으로 검출가능한 모이어티에 회합시킴으로써 표적-결합된 프로브들이 간접적으로 분석될 수 있다. 예를 들어, 표지된 항-합텐을 (합텐-항-합텐 상호작용을 통해) 표적-결합된 프로브에 결합시킨 후, 표지로부터의 신호를 관찰함으로써, 독립적으로 검출가능한 모이어티로서 합텐이 있는 표적-결합된 프로브를 검출할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적-결합 프로브들의 동시 적용에 이어지는 순차적인 검출을 사용하여 표적들의 2개의 세트를 검출할 수 있다. 그러나, 이러한 방법이 동일한 생물학적 샘플 (예를 들어, 동일한 조직 절편) 내의 표적들의 2개를 초과하는 세트를 검출하는데 반복적으로 사용될 수 있다. 검출될 수 있는 표적들 (즉, 상이한 표적들의 세트)의 개수의 상한은 사용된 생물학적 샘플의 유형, 및 신호 생성 및 신호 변형에 사용된 화학에 종종 좌우된다. 더 거친 방법들은 일단 방법 단계들이 수 회 반복되면 생물학적 샘플의 통합성에 영향을 미칠 수 있다. 그러나, 적절하고 온화한 (덜 거친) 조건을 선택함으로써, 방법 단계들이 생물학적 샘플의 통합성을 손상시키지 않으면서 다수의 표적 (예를 들어, 표적들의 10개 내지 100개의 세트)을 검출하는데 효과적으로 사용될 수 있다.
관찰된 신호를 다수의 표적의 검출과 상관시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 관찰 또는 상관 단계들 중 하나 이상을 컴퓨터-보조 수단을 사용하여 수행할 수 있다. 상관은 수동으로 수행될 수 있거나 (예를 들어, 육안 상관), 반-자동화될 수 있거나 (예를 들어, 약간의 사용자 개입과 함께 상관 알고리듬을 사용함), 또는 완전히 자동화될 수 있다 (예를 들어, 어떠한 사용자 개입도 없이 컴퓨터/로봇을 통해 컴퓨터 판독가능 매체에서 상관 알고리듬을 사용함). 신호(들)이 디지털 영상(들)의 형태로 관찰 및 저장되는 실시양태에서, 영상(들)의 컴퓨터-보조 분석이 수행될 수 있다. 생물학적 샘플의 완전한 정보 (예를 들어, 위상학적 및/또는 상관 정보)를 수득하기 위해, 영상 (예를 들어, 표적-결합 프로브(들)로부터의 신호 및 형태학적 염색)들이 컴퓨터-보조 중첩을 사용하여 오버레이(overlay)될 수 있다.
관찰된 신호들 (예를 들어, 제1, 제2, 또는 후속 신호 세트 및/또는 이들의 조합)을 분석하여 생물학적 샘플에 관한 다양한 정보를 수득할 수 있다. 예를 들어, 신호(들)의 제1 세트의 존재 또는 부재는 생물학적 샘플 내의 표적(들)의 제1 세트 (표적-결합 프로브들의 제1 세트에 결합할 수 있음)의 존재 또는 부재를 가리킬 수 있다. 유사하게, 신호(들)의 제2 세트의 존재 또는 부재는 생물학적 샘플 내의 표적(들)의 제2 세트 (표적-결합 프로브들의 제2 세트에 결합할 수 있음)의 존재 또는 부재를 가리킬 수 있다. 다수의 표적-결합 프로브를 사용하여 다중 표적이 분석될 수 있는 용도에 대해, 표적-결합 프로브들의 특정 세트에 대한 특정 신호의 존재 또는 부재는 생물학적 샘플 내의 상응하는 표적(들)의 존재 또는 부재를 가리킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 신호의 강도 값 (예를 들어, 형광 강도)을 관찰, 측정할 수 있고, 생물학적 샘플 내의 표적의 양과 상관시킬 수 있다. 표적의 양과 신호 강도 간의 상관 관계를 검정 표준물을 사용하여 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 신호들의 강도 값을 측정할 수 있고, 각각의 표적 양에 상관시킬 수 있다. 2개의 신호 강도를 비교함으로써, 제1 표적 및 제2 표적의 상대적인 양 (서로에 대해 또는 대조군에 대해 상대적인 양)을 또한 확인할 수 있다. 유사하게, 다중 표적이 다수의 표적-결합 프로브를 사용하여 분석되는 경우에, 다수의 표적-결합 프로브 각각으로부터의 신호의 상이한 강도들을 측정하고 상관시킴으로써 생물학적 샘플 내의 상이한 표적들의 상대적인 양을 결정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 대조군 샘플을 사용할 수 있고, 대조군 샘플과 비교하여 생물학적 샘플 내의 신호의 존재 또는 부재를 관찰함으로써 (즉, 관심 대상인 생물학적 샘플 대 대조군), 생물학적 샘플에 관한 특정한 정보를 수득할 수 있다. 예를 들어, 질환 조직 샘플 대 정상 조직 샘플을 비교함으로써, 질환 조직 샘플에만 존재/부재하는 표적에 관한 정보를 수득할 수 있다. 유사하게, 관심 샘플과 하나 이상의 대조군 간의 신호 강도를 비교함으로써, 관심 샘플 내의 표적들의 차별적인 발현에 관한 정보를 수득할 수 있다.
일부 실시양태에서, 예를 들어, 형태학적 염색 또는 구획 염색을 사용하여, 신호의 위치, 또는 생물학적 샘플 내의 2개 이상의 신호의 상대적인 위치를 관찰할 수 있다. 신호 위치를 생물학적 샘플 내의 표적의 위치와 상관시켜, 생물학적 샘플 내의 다수의 상이한 표적의 위치에 관한 정보를 제공할 수 있다. 신호의 강도 값 및 신호 위치를 상관시켜 생물학적 샘플 내의 상이한 표적들의 위치 및 농도에 관한 정보를 수득할 수 있다. 예를 들어, 특정 표적들이 핵에 비해 세포질에서 더 많이 발현될 수 있거나, 또는 반대일 수 있다. 2개 이상의 신호의 위치 및 강도 값을 비교함으로써 표적들의 상대적인 국소화 및 양에 관한 정보를 수득할 수 있다.
일부 실시양태에서, 샘플을 다수의 표적-결합 프로브와 접촉시키기 전에 생물학적 샘플을 관찰하여 (예를 들어, 영상화하여), 배경 신호 시그니처에 관한 정보를 수득할 수 있다. 배경 신호 시그니처를 표적-결합된 프로브들 (예를 들어, 제1, 제2, 및/또는 제n 표적-결합된 프로브들)로부터 관찰된 신호로부터 차감한 후에, 관찰된 신호를 표적 검출과 상관시킬 수 있다. 이러한 방법은 임의의 잔류 신호 시그니처에 관한 정보를 수득하기 위한 하나 이상의 신호 변형 단계 후의 생물학적 샘플을 관찰하는 단계들을 추가로 포함할 수 있다. 생물학적 샘플을 각각의 신호 변경 단계 후에 관찰할 수 있다. 잔류 신호 시그니처는 신호 변형 효율 (예를 들어, 표백 효율)을 특징화하는데, 신호 변형 단계 예컨대 신호 변형제의 선택, 인큐베이션 시간 및/또는 인큐베이션 온도를 미세 조정하는데 사용될 수 있다. 잔류 신호 시그니처는 후속 표적-결합된 프로브들로부터의 관찰된 신호를 표준화하는데 또한 사용될 수 있다. 잔류 신호 시그니처를 후속 표적-결합된 프로브들로부터의 관찰된 신호들로부터 차감한 후에, 관찰된 신호들을 표적 검출과 상관시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 다수의 표적을 다수의 표적-결합 프로브를 사용함으로써 검출할 수 있고, 이때 다수의 표적-결합 프로브 모두가 간접적인 검정에 의해 검출될 수 있다. 한 예에서, 이러한 방법은 샘플을 다수의 표적-결합 프로브와 접촉시켜 다수의 표적-결합된 프로브를 생성시키는 단계, 다수의 표적-결합된 프로브의 제1 세트로부터 제1 신호 세트를 생성시키는 단계, 제1 신호 세트를 관찰하는 단계, 관찰된 신호들을 변형시키는 단계, 다수의 표적-결합된 프로브의 제2 세트로부터 제2 신호 세트를 생성시키는 단계, 제2 신호 세트를 관찰하는 단계, 및 관찰된 신호들을 다수의 표적의 검출에 상관시키는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 관찰된 신호들을 변형시키는 단계 및 다수의 표적-결합된 프로브의 제3, 제4 및 제n 세트로 새로운 신호 세트를 여러 번 생성시키는 단계, 및 생성된 제3, 제4 및 제n 신호 세트를 관찰하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 기술된 방법들에서의 표적-결합 프로브들은 스스로 신호를 생산할 수 없다. 따라서, 일단 표적-결합 프로브가 표적에 결합되면, 표적-결합된 프로브로부터의 신호를 관찰하기 전에 사전의 신호 생성 단계가 요구된다.
일부 실시양태에서, 생물학적 샘플을 영상화함으로써 신호가 관찰된다. 샘플을 다수의 표적-결합 프로브와 접촉시키기 전에 또는 다수의 표적-결합된 프로브의 제1 세트로부터의 제1 신호 세트의 생성 전에 생물학적 샘플을 영상화하여 배경 신호 시그니처를 수득할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 신호-프로세싱 단계들을 추가로 포함한다. 예를 들어, 배경 신호 시그니처를 후속 신호 관찰 단계들에서 관찰되는 신호들로부터 차감할 수 있다. 신호-프로세싱 단계들은 관찰된 신호들을 다수의 표적의 검출에 상관시키기 전에 또는 상관시키는 동안에 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 다수의 핵산 표적이 생물학적 샘플에서 검출될 수 있다. 다수의 핵산 표적은 상이한 표적들의 2개 이상의 세트 (제1 세트 및 제2 세트)를 포함할 수 있다. 다수의 표적은 DNA 표적들의 세트 2개, RNA 표적들의 세트 2개, 또는 DNA 표적들의 세트 1개 및 RNA 표적들의 세트 1개를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적들의 세트는 2개 이상의 상이한 표적들의 혼합물 (예를 들어, 2가지 유형의 DNA의 혼합물, 2가지 유형의 RNA의 혼합물, 또는 DNA 표적들 및 RNA 표적들의 혼합물)을 포함할 수 있다.
다수의 표적-결합 프로브와 접촉되면, 제1 표적 세트가 제1 프로브 세트에 결합하고, 이때 제1 프로브 세트가 제1 조건 세트 하에 제1 신호 세트를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플 내의 RNA 표적들이 RNA-결합 프로브들의 제1 세트 (RNA 표적들의 제1 세트에 결합함)를 포함하는 다수의 프로브에 접촉되어, RNA 표적-결합된 프로브들의 제1 세트가 생성될 수 있다. RNA-결합된 프로브들의 이러한 전체 제1 세트가 제1 조건 세트 하에 제1 신호 세트를 생성시킬 수 있다. 이러한 방법은 표적-결합된 프로브들로부터 신호를 생성시키기 전에 표적에 결합되지 않은 임의의 표적-결합 프로브를 제거하는 단계들을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적-결합된 프로브들 중 하나 이상이 표적 자체에 대한 또는 표적 부근에 위치하는 분자 또는 구조에 대한 공유결합 커플링을 통해 생물학적 샘플에 공유결합으로 부착될 수 있다. 이같은 경우에, 표적에 결합되지 않은 임의의 표적-결합 프로브의 제거가 표적-결합된 프로브를 생물학적 샘플에 공유결합으로 부착시키기 전에 수행될 수 있다. RNA-결합 프로브들의 제1 세트는 표적-결합 모이어티 및 독립적으로 검출가능한 모이어티를 포함하는 핵산 (예를 들어, DNA, RNA, LNA 또는 PNA) 프로브일 수 있다. 예를 들어, 표적-결합 프로브가 표적 RNA 서열 (제1 표적 세트 내)의 적어도 일부분에 대해 상보적인 서열 및 간접적인 검정에서 독립적으로 검출될 수 있는 독특한 서열을 포함하는 DNA 프로브일 수 있다. DNA 프로브들을 상보적인 표적 RNA 서열에 대한 DNA 프로브 서열의 선택적인 혼성화에 충분한 기간 동안 적절한 혼성화 조건 하에 생물학적 샘플과 함께 인큐베이션할 수 있다. 이러한 방법은 혼성화된 DNA 프로브를 표적 RNA 서열에 또는 표적 RNA 서열 부근에 위치하는 분자/구조에 가교시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 독특한 서열을 분석함으로써 표적-결합된 프로브를 검출할 수 있다. 예를 들어, 독특한 서열에 대해 상보적인 충분한 서열이 있는 표지된 핵산 서열 (예를 들어, DNA, RNA, PNA 또는 LNA)이 표적-결합된 프로브를 태깅하는데 사용될 수 있다. 태깅은 생물학적 샘플을 표지된 상보적인 핵산 서열과 함께 서열 혼성화에 충분한 기간 동안 혼성화 조건 하에 인큐베이션함으로써 수행될 수 있다. 표지에는 발색단, 형광단, 나노입자, 라만 활성 모이어티, SERS 활성 모이어티 또는 SERRS 활성 모이어티 등이 포함될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 그 후, 표지로부터의 신호를 관찰 (예를 들어, 영상화)함으로써 표적-결합된 프로브를 검출할 수 있다. 독특한 핵산 서열을 신호 증폭 절차를 포함하는 간접적인 검정 (예를 들어, 다수의 독립적으로 검출가능한 모이어티 (예를 들어, 핵산 서열)를 포함하는 나노입자와 혼성화시키고, 각각의 독립적으로 검출가능한 모이어티로부터 신호를 생성시킴)에 의해 또한 분석할 수 있다.
생물학적 샘플 내의 다수의 표적을 검출하는 방법의 또 다른 예는 샘플을 다수의 표적-결합 프로브와 접촉시켜 다수의 표적-결합된 프로브를 형성시키는 단계, 표적-결합된 프로브들 중 하나 이상을 생물학적 샘플에 공유결합으로 부착시키는 단계, 표적-결합된 프로브들을 다수의 표적-결합된 프로브의 제1 세트에 결합할 수 있고 제1 신호 세트를 생성할 수 있는 신호-생성 프로브들의 제1 세트와 접촉시키는 단계, 제1 신호 세트를 관찰하는 것을 통해 다수의 표적의 제1 세트를 검출하는 단계, 관찰된 제1 신호 세트를 변형시키는 단계, 및 신호들을 생성시키고 관찰된 신호들을 변형시키는 단계를 신호-생성 프로브들의 후속 세트를 사용하여 여러 번 반복하여, 다수의 표적의 후속 세트를 검출하는 단계를 포함한다. 관찰된 신호를 변형시키기 위해 화학 작용제가 적용될 수 있다. 신호-생성 프로브들의 후속 세트는 다수의 표적-결합된 프로브의 후속 세트에 결합할 수 있고, 후속 신호 세트를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단계들이 10번, 25번, 50번, 또는 100번 반복되어, 표적들의 세트 10개, 표적들의 세트 25개, 표적들의 세트 50개, 또는 표적들의 세트 100개가 검출될 수 있다.
다수의 표적은 DNA, RNA, 단백질, 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수의 표적은 다수의 상이한 RNA를 포함한다. 검출될 수 있는 표적 RNA의 비-제한적인 예로는 리보솜 RNA (rRNA), 메신저 RNA (mRNA), 전달 RNA (tRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 전달 메신저 RNA (tm RNA), 피위(piwi)-상호작용 RNA (piRNA), 비-코딩 RNA, 조절 RNA, CRISPR RNA, 소형 핵 RNA (snRNA), 소형 핵소체 RNA (snoRNA), RNAse-P-RNA, PUT RNA, 리보자임, 또는 마이크로 RNA (miRNA)가 포함된다. 일부 실시양태에서, 다수의 표적이 원위치에서 검출된다. 이러한 방법은, 예를 들어, 신생 RNA 전사물의 원위치 영상화에 의해 전사 개시 부위 또는 차별적인 유전자 조절을 검출하는데 사용될 수 있다.
생물학적 샘플 내의 다수의 표적을 검출하기 위한 상기 언급된 방법들은 다수의 표적의 다중 배치를 검출하는데 사용될 수 있고, 이때 다수의 표적의 각각의 배치는 다수의 표적의 다중 세트를 포함한다. 예를 들어, 생물학적 샘플 내의 다수의 핵산 (상이한 핵산들의 다중 세트) 및 다수의 단백질 (상이한 단백질들의 다중 세트)이 다수의 표적의 2개의 배치를 구성할 수 있다. 먼저, 생물학적 샘플 내의 다수의 핵산 (예를 들어, DNA의 제1 세트 및 RNA의 제2 세트와 같은 상이한 핵산들의 2개의 세트)을 표적-결합 프로브들의 동시 적용에 이어지는 표적-결합된 프로브들의 순차적인 검출에 의해 검출할 수 있다. 그 후, 다수의 단백질의 검출 (예를 들어, 단백질 A의 제1 세트 및 단백질 B의 제2 세트의 검출)을 수행할 수 있다. 예를 들어, 다수의 핵산-결합(nucleic acid-binding) 프로브 (즉, DNA-결합(DNA-binding) 프로브들 및 RNA-결합 프로브들)를 생물학적 샘플에 적용하여, 다수의 핵산-결합(nucleic acid-bound) 프로브 (DNA-결합된(DNA-bound) 프로브들의 제1 세트 및 RNA-결합된 프로브들의 제2 세트)를 형성시킬 수 있다. 그 후, 제1 세트 DNA-결합된 프로브들로부터의 신호(들)을 검출할 수 있다 (DNA-결합된 프로브들이 스스로 신호를 생성하는지 아닌지 여부에 따라 직접적인 검정 또는 간접적인 검정에 의해). 그 후, 관찰된 신호를 변형시킬 수 있고, 다수의 RNA-결합된 프로브로부터의 제2 신호 세트를 생성시키는 것이 이어진다 (이러한 신호들은 표적-결합된 프로브들의 제2 세트로부터 생성될 필요가 있는데, 이는 핵산들의 제2 세트에 혼성화하는 표적-결합 프로브들이 검출가능한 신호를 스스로 생산하지 않도록 선택되기 때문이다). 그 후, RNA-결합된 프로브들로부터의 생성된 신호들을 관찰할 수 있다. 일단 핵산 표적들의 다수의 다중 세트의 검출이 수행되면, 이러한 방법이 단백질들의 다수의 다중 세트를 검출하는데 사용할 수 있다. 표적 단백질 A 및 B에 결합할 수 있는 다수의 표적-결합 프로브 (예를 들어, 항체 A 및 항체 B)가 적용될 수 있다. 그 후, 단백질 A에 결합된 항체 A를 항체 A로부터의 신호들을 관찰함으로써 직접적인 검정 또는 간접적인 검정을 통해 검출할 수 있다 (제1 단백질 세트). 그 후, 관찰된 신호들을 변형시킬 수 있다. 그 후, 단백질 B에 결합된 항체 B로부터의 신호들을 생성시키고, 이어서 생성된 신호들을 관찰한다. 그 후, 관찰된 신호들을 단백질 A의 세트들 및 단백질 B의 세트들의 검출에 상관시킬 수 있다.
방법 단계들 중 하나 이상이 수동으로 수행될 수 있거나, 또는 자동화될 수 있고 자동화 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 모든 방법 단계들이 자동화 시스템을 사용하여 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법들을 사용하는 생물학적 샘플 내의 다수의 표적을 검출하기 위한 장치가 제공된다. 장치는 샘플 취급 시스템, 시약 분배 시스템, 프로브 가교 시스템, 및 신호 검출 시스템을 포함한다. 생물학적 샘플을 다수의 표적-결합 프로브와 접촉시켜 다수의 표적-결합된 프로브를 형성시키는 단계, 임의적으로, 다수의 표적-결합 프로브 중 하나 이상을 생물학적 샘플에 공유 결합을 통해 부착시키는 단계, 다수의 표적-결합된 프로브의 제1 세트로부터의 제1 신호 세트를 관찰하는 단계, 관찰된 신호들을 변형시키는 단계, 다수의 표적-결합된 프로브의 제2 세트로부터 제2 신호 세트를 생성시키는 단계, 및 제2 신호 세트를 관찰하는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 생물학적 샘플 내의 다수의 표적을 검출하도록 장치가 작동될 수 있다. 샘플 취급 시스템은 샘플을 홀딩(holding)하기 위한 플랫폼(platform) (예를 들어, 조직 절편 슬라이드를 홀딩하기 위한 현미경 스테이지(stage)), 및 하나 이상의 시약을 샘플로 입력 및 출력하기 위한 포트(port)를 포함할 수 있다. 샘플 취급 시스템은 인큐베이션 파라메터 (예를 들어, 온도, 압력)을 제어하는데 사용될 수 있는 인큐베이션 시스템을 추가로 포함할 수 있다. 샘플 취급 시스템은 통합된 샘플 홀딩 플랫폼, 통합된 시약 유입 및 유출용 포트 및/또는 통합된 인큐베이션 시스템이 있는 유동 셀(flow cell)로서 구성될 수 있다. 시약 분배 시스템은 하나 이상의 시약을 홀딩할 수 있는 하나 이상의 시약 저장소, 및 시약을 샘플 취급 시스템에 위치하는 샘플로 분배하는 수단을 포함할 수 있다. 슬라이드 홀더 상의 포트 내로의 피펫팅(pipetting)을 통해 또는 슬라이드 홀더와 시약 분배 시스템을 연결하는 관을 통한 펌핑(pumping)을 통해 시약이 샘플로 분배될 수 있다. 신호 검출 시스템은 광원 (예를 들어, 현미경 광원) 및 신호 포착 시스템을 포함할 수 있다. 예를 들어, 신호 검출 시스템은 광원 및 생물학적 샘플의 영상의 디지털 포착을 위한 카메라 (예를 들어, CCD 카메라)가 있는 현미경일 수 있다. 프로브 가교 시스템은 특정 기간 동안 특정 파장의 빛을 방출하도록 제어될 수 있는 광원을 포함할 수 있다. 신호 검출 시스템이 광원을 포함하는 경우, 프로브 가교 시스템이 동일한 광원을 사용하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로브 가교 시스템이 신호 검출 시스템의 일부에 구성될 수 있다.
장치가 완전히 자동화될 수 있거나 (즉, 어떠한 조작자 개입도 없음), 또는 반-자동화될 수 있고, 이때 샘플 취급 시스템, 프로브 가교 시스템, 시약 분배 시스템, 또는 신호 검출 시스템 중 하나 이상이 조작자 개입 없이 작동가능하다. 장치는 중앙 프로세싱 유닛, 메모리, 제어기 유닛, 및/또는 디스플레이 장치를 포함할 수 있다. 디스플레이 장치는 관찰된 신호 (예를 들어, 생물학적 샘플의 영상)를 디스플레이하는데 사용될 수 있다. 제어기 유닛은 중앙 프로세싱 유닛, 샘플 취급 시스템, 시약 분배 시스템, 프로브 가교 시스템 또는 신호 검출 시스템 중 하나 이상과 통신할 수 있다. 통신은 단방향 통신 또는 양방향 통신일 수 있다. 제어기 유닛은 (알고리듬을 통해) 미리 결정된 명령 세트를 사용하여 작동가능하다. 양방향 통신을 사용하는 경우, 중앙 프로세싱 유닛, 샘플 취급 시스템, 시약 분배 시스템, 프로브 가교 시스템 또는 신호 검출 시스템 중 임의의 것으로부터의 피드백에 따라 미리 결정된 명령 세트를 조정할 수 있다.
샘플 취급 시스템은 생물학적 샘플을 홀딩하기 위한 플랫폼을 포함할 수 있다. 플랫폼은 고정상일 수 있거나, 또는 생물학적 샘플을 운송하기 위해 한 위치에서 또 다른 위치로 이동될 수 있다. 시약 분배 시스템은 하나 이상의 표적-결합 프로브를 포함하는 하나 이상의 시약 용액을 생물학적 샘플에 분배하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 시약 분배 시스템은 생물학적 샘플을 다수의 표적-결합 프로브에 접촉시키기 위해 다수의 표적-결합 프로브를 포함하는 시약 용액을 생물학적 샘플 상에 분배하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시약 분배 시스템은 각각의 용액이 하나 이상의 표적-결합 프로브를 포함하는 다중 시약 용액을 (동시에 또는 순차적으로) 분배하는데 또한 사용될 수 있다. 시약 분배 시스템은 표적에 결합되지 않은 임의의 표적-결합 프로브를 제거하는데 사용될 수 있는 세정 용액, 생물학적 샘플을 비-특이적 결합으로부터 차단하기 위한 차단 용액, 또는 프로브 가교, 세정 및/또는 신호 검출에 필요할 수 있는 기타 시약을 분배하는데 또한 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시약 분배 시스템은 표적들의 세트에 대한 관찰된 신호들을 변형시키기 위한 화학 작용제를 포함하는 시약 용액을 분배하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 생물학적 샘플 내의 다수의 다중 표적을 검출하기 위한 키트가 제공된다. 키트는 함께 포장된, 상기 언급된 방법들을 수행하는데 필요할 수 있는 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 다수의 표적-결합 프로브, 및 미결합 표적-결합 프로브들을 세정하기 위한 완충제를 포함할 수 있다. 키트는 신호를 생성시킬 수 있고 표적에 또는 표적 부근에 위치하는 분자에 가교될 수 있는 표적-결합 프로브, 및 생성된 신호를 변형시킬 수 있는 화학 작용제를 포함할 수 있다. 한 예에서, 키트는 생물학적 샘플에 가교될 수 있는 형광으로 표지된 표적-결합 프로브 (예를 들어, 형광으로 표지된 항체), 및 형광 표지로부터 형광을 파괴할 수 있는 화학 작용제를 포함한다. 키트는 가교 반응에 필요할 수 있는 시약을 또한 함유할 수 있다. 키트는 키트 내에 존재하는 성분들 및/또는 키트 내에 존재하는 성분들을 사용하여 필요한 방법 단계들을 수행하기 위한 프로토콜을 상술하는 사용 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
한 예에서, 생물학적 샘플 내에 존재하는 다수의 다중 표적의 검출의 위한 키트는 각각의 표적-결합 프로브가 신호를 생성시킬 수 있고, 표적-결합 프로브 중 하나 이상이 이의 표적에 또는 표적 부근에 위치하는 분자에 가교될 수 있는, 다수의 표적-결합 프로브; 및 하나 이상의 표적-결합 프로브로부터의 생성된 신호를 변형시킬 수 있는 하나 이상의 화학 작용제를 포함한다. 다수의 표적-결합 프로브는 2개의 상이한 표적에 결합할 수 있는 상이한 표적-결합 프로브들의 2개 이상의 세트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 구획성 바이오마커 (예를 들어, 핵 내에 존재하는 바이오마커)에 특이적으로 결합하는 표적-결합 프로브들의 제1 세트, 및 질환 마커 (예를 들어, 암 바이오마커)에 특이적으로 결합하는 표적-결합 프로브들의 제2 세트를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 단일한 화학 작용제가 모든 표적-결합 프로브로부터의 생성된 신호(들)을 변형시키는데 사용될 수 있다. 그러나, 키트가 키트 내의 각각의 표적-결합 프로브로부터 생성된 신호를 변형시키기 위한 다중 화학 작용제를 포함하는 것이 또한 가능하다.
이러한 방법들은 동일한 생물학적 샘플로부터의 다수의 (예를 들어, 잠재적으로는 무한 개수의) 표적 (예를 들어, 질환 마커)의 정확하고 신뢰할 수 있는 분석을 용이하게 한다. 다수의 표적의 검출은 생물학 및 의학에서의 분석적, 진단적, 치료적 또는 예후적 용도에서 용도를 발견할 수 있다. 예를 들어, 환자로부터의 세포 또는 조직 샘플을 분석하기 위한 방법들이 진단적으로 (예를 들어, 특정 질환에 걸렸거나, 특정 독소에 노출되었거나, 특정 치료제 또는 장기 이식에 잘 응답하는 환자를 확인하기 위해), 그리고 예후적으로 (예를 들어, 특정 질환이 발달될 것 같거나, 특정 치료제에 잘 응답할 것 같거나, 특정 장기 이식을 받아들일 것 같은 환자를 확인하기 위해) 사용될 수 있다.
실시예
달리 특정되지 않는 한, 실시예에서 기술된 성분들은 통상적인 화학물질 공급자들로부터 시판된다. 실시예 섹션에서 사용된 일부 약어들이 하기와 같이 설명된다: "mg": 밀리그램; "ng": 나노그램; "pg": 피코그램; "fg": 펨토그램; "ag": 아토그램; "zg": 젭토그램; "㎕": 마이크로리터; "㎖": 밀리리터; "mg/㎖": 밀리리터 당 밀리그램; "mM": 밀리몰; "μM": 마이크로몰; "pM": 피코몰; "nmol": 나노몰; "mmol": 밀리몰; "pmol": 피코몰; "ms": 밀리세컨드; "min.": 분; "h.": 시, 및 "℃": 섭씨 온도.
도 1은 본 발명의 한 실시양태에 따른 방법 단계들을 개략적으로 도해하는 흐름도이다. 도면은 표적-결합 프로브들의 2개의 세트의 동시 적용에 이어지는 표적-결합된 프로브들의 각각의 세트의 순차적인 검출에 의한 상이한 표적들의 2개의 세트의 검출을 도해한다. 이러한 방법은 다수의 상이한 표적-결합 프로브를 생물학적 샘플에 적용하는 단계 (12)를 포함한다. 다수의 표적-결합 프로브는 순차적으로 검출될 수 있는 표적-결합 프로브들의 다중 세트 (예를 들어, 표적-결합 프로브들의 2개의 세트)를 포함한다. 접촉에 이어지는 인큐베이션 시, 다수의 표적-결합 프로브가 다수의 상이한 표적에 결합된다. 그 후, 표적-결합 프로브들이 생물학적 샘플에 가교된다 (공유결합으로 부착된다) (14). 생물학적 샘플에 대한 표적-결합된 프로브들의 공유결합 부착은 표적을 통해 이루어질 수 있거나 (즉, 프로브가 표적에 가교됨), 또는 표적 부근에 위치하는 분자를 통해 이루어질 수 있다 (예를 들어, 인접한 단백질에 대한 프로브의 가교). 일단 다수의 표적-결합 프로브가 다수의 상이한 표적 (예를 들어, 표적들의 2개의 세트)에 결합되면, 다수의 표적-결합된 프로브를 순차적으로 검출함으로써 다수의 표적이 순차적으로 검출될 수 있다. 다수의 표적-결합된 프로브의 제1 세트가 신호 생성기를 포함하면, 어떠한 추가적인 신호 생성 단계도 필요로 하지 않으면서 신호 생성기로부터의 신호(들)을 관찰할 수 있다 (20). 그러나, 다수의 표적-결합된 프로브의 제1 세트가 스스로 신호를 방출하지 않으면, 추가적인 신호 생성 단계가 필요할 수 있다. 한 실시양태에서, 이는 신호 생성기를 다수의 표적-결합된 프로브의 제1 세트에 회합시킴으로써 달성된다 (18). 그 후, 다수의 표적-결합된 프로브의 제1 세트로부터 신호를 관찰할 수 있다 (20). 일단 표적-결합된 프로브들의 제1 세트로부터의 신호(들)이 관찰되면 (예를 들어, 영상화에 의해), 관찰된 신호가 변형된다 (예를 들어, 제거된다) (22). 생물학적 샘플을 화학 작용제와 함께 인큐베이션함으로써, 관찰된 신호가 변형될 수 있다. 일단 표적-결합된 프로브의 제1 세트로부터의 관찰된 신호가 변형되면, 다수의 표적-결합된 프로브의 제2 세트로부터 신호가 생성된다 (24). 그 후, 생성된 신호를 관찰하여, 표적-결합된 프로브의 제2 세트를 검출할 수 있다 (26).
도 2는 다수 (예를 들어, 제1 세트, 제2 세트, 및 제n 세트 (정수값 "n"은 1 내지 100의 범위일 수 있음))의 상이한 표적들을 검출하기 위한 본 발명의 한 실시양태에 따른 방법 단계들을 개략적으로 도해한다. 이러한 방법은 다수의 상이한 표적-결합 프로브를 생물학적 샘플에 적용하는 단계 (32)를 포함한다. 다수의 표적-결합 프로브는 순차적으로 검출될 수 있는 표적-결합 프로브들의 다중 세트 (예를 들어, 제1 세트, 제2 세트, 및 제n 세트 (정수값 "n"은 1 내지 100의 범위일 수 있음))를 포함한다. 일단 다수의 표적-결합 프로브가 다수의 상이한 표적에 결합되면, 다수의 표적-결합된 프로브를 순차적으로 검출함으로써 다수의 표적이 순차적으로 검출될 수 있다. 생물학적 샘플을 접촉시키는 것에 이어지는 인큐베이션 시, 다수의 표적-결합 프로브가 다수의 상이한 표적에 결합된다. 그 후, 표적-결합 프로브들이 생물학적 샘플에 가교될 수 있다 (예를 들어, 공유결합으로 커플링될 수 있다) (34). 임의의 공유결합 커플링 방법이 표적-결합 프로브를 생물학적 샘플에 공유결합으로 부착시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적-결합 프로브가 아미드 결합, 에스테르 결합, 디술피드 결합, 탄소-탄소 결합 등을 통해 생물학적 샘플에 공유결합으로 커플링될 수 있다. 다수의 표적-결합된 프로브의 제1 세트가 신호 생성기를 포함하면, 어떠한 추가적인 신호 생성 단계도 필요로 하지 않으면서 신호 생성기로부터의 신호(들)를 관찰할 수 있다 (40). 그러나, 다수의 표적-결합된 프로브의 제1 세트가 스스로 신호를 방출하지 않으면, 추가적인 신호 생성 단계가 필요할 수 있다. 한 실시양태에서, 이는 신호 생성기를 다수의 표적-결합된 프로브의 제1 세트에 회합시킴으로써 달성된다 (38). 그 후, 생물학적 샘플을 영상화함으로써 다수의 표적-결합된 프로브의 제1 세트로부터 신호를 관찰할 수 있다 (40). 일단 영상화에 의해 표적-결합된 프로브들의 제1 세트로부터의 신호(들)이 관찰되면, 관찰된 신호가 변형된다 (42). 그 후, 신호(들)의 제2 세트가 다수의 표적-결합된 프로브의 제2 세트로부터 생성된다 (44). 제2 신호 세트는 제1 신호 세트와 동일할 수 있거나 동일하지 않을 수 있다. 그 후, 신호(들)의 제2 세트를 생물학적 샘플을 영상화함으로써 관찰한다 (46). 일단 관찰되면, 신호(들)의 이러한 제2 세트가 변형된다 (예를 들어, 화학 작용제를 적용함으로써 파괴되거나, 광-표백된다) (47). 신호 생성, 변형 및 관찰의 방법 단계들을 여러 번 반복하여, 표적-결합된 프로브들의 후속 세트로부터의 신호를 생성시키고, 표적-결합된 프로브들의 후속 세트를 영상화시킬 수 있다 (48). 그 후, 관찰된 신호들을 생물학적 샘플 내의 다수의 표적의 검출과 상관시킬 수 있다 (49). 상관 단계는 표적-결합된 프로브들의 각각의 세트로부터의 신호(들)의 각각의 세트를 관찰한 직후에 수행될 수 있거나, 또는 모든 표적-결합된 프로브로부터의 모든 신호(들)를 관찰한 후에 수행될 수 있다.
실시예 1
가교제로 변형되고 시아닌 염료로 표지된 DNA 올리고머인 Cy3-T20-SFAD를 하기와 같이 합성하였다. 10× PBS (포스페이트 완충 염수) 내의 Cy3-T20-NH2 (3'-말단에서 아미노-변형(amino modified) 링커로 표지되고 5'-말단에서 Cy3™ 염료로 표지된, 20개의 티미딘 단위를 포함하는 티미딘 올리고머, 인테그레이티드 DNA 테크놀로지즈(Integrated DNA technologies) (미국)로부터 상업적으로 수득됨)의 10 ㎕ (31.9 nmol) 용액을 80 ㎕ 물 및 10 ㎕의 1 M NaHCO3/Na2CO3 완충제 (pH 8.4)로 희석하였다. 여기에, 술포숙신이미딜-[펜타플루오로아지도벤즈아미도]에틸-1,3-디티오프로피오네이트 (술포-SFAD, 써모피셔 사이언티픽 인코포레이티드(ThermoFisher Scientific Inc.) (미국 일리노이주)로부터 상업적으로 수득됨)의 10 mM DMSO 용액 (20 당량)을 첨가하였다. 혼합된 용액을 실온에서 약 1-2시간 동안 교반하였다. 미가공 혼합물을 NAP-10 칼럼 (GE 헬스케어(GE Healthcare), 미국) 상에서 컬럼 공급사가 제공하는 프로토콜을 사용하여 정제하였다.
술포-SFAD는 길이가 14.6 Å인 디술피드 스페이서 팔의 반대쪽 말단들에 아민 반응성 술포-N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르 및 광활성화가능한 테트라플루오로페닐 아지드를 함유하는 이종이관능성 가교제이다. NHS 에스테르는 pH 7-9 완충제에서 1차 아미노 기와 효율적으로 반응하여 안정한 아미드 결합을 형성한다. 자외선 (300-370 nm)에 노출되었을 때, 퍼플루오로페닐 아지드는 극도로 반응성인 니트렌 기를 형성하고, 이는 활성 탄소-수소 결합 (C-H) 내로 삽입될 수 있거나 또는 불포화 탄소 사슬에 부가될 수 있다. 퍼플루오로아릴 니트렌은 신속하게 반응하고, 비-플루오르화 아릴 아지드보다 더 큰 효율로 C-H 결합에 비-특이적으로 삽입된다.
실시예 2
가교제로 변형되고, 시아닌 염료로 표지된 DNA 올리고머인 Cy3-T20-SDAD를 하기와 같이 합성하였다. 10× PBS (포스페이트 완충 염수) 내의 Cy3-T20-NH2 (3'-말단에서 아미노-변형 링커로 표지되고 5'-말단에서 Cy3™ 염료로 표지된, 20개의 티미딘 단위를 포함하는 티미딘 올리고머, 인테그레이티드 DNA 테크놀로지즈 (미국)로부터 상업적으로 수득됨)의 10 ㎕ (31.9 nmol) 용액을 80 ㎕ 물 및 10 ㎕의 1 M NaHCO3/Na2CO3 완충제 (pH 8.4)로 희석하였다. 여기에, 술포숙신이미딜 2-([4,4'-아지펜탄아미도]에틸)-1,3'-디티오프로피오네이트 (술포-SDAD, 써모피셔 사이언티픽 인코포레이티드 (미국 일리노이주)로부터 상업적으로 수득됨)의 10 mM 수용액 (20 당량)을 첨가하였다. 혼합된 용액을 실온에서 1-2시간 동안 교반하였다. 미가공 혼합물을 NAP-10 칼럼 (GE 헬스케어, 미국) 상에서 컬럼 공급사가 제공하는 프로토콜을 사용하여 정제하였다.
술포-SDAD는 길이가 13.5 Å인 디술피드 스페이서 팔의 반대쪽 말단들에 아민 반응성 술포-N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르 및 광활성화가능한 디아지린 모이어티를 함유하는 이종이관능성 가교제이다. NHS 에스테르는 pH 7-9 완충제에서 1차 아미노 기와 효율적으로 반응하여 안정한 아미드 결합을 형성한다. 장파 자외선 (330-370 nm)으로의 디아지린의 광활성화는 반응성 카르벤 중간체를 생성시킨다. 이같은 중간체는 부가 반응을 통해 스페이서 팔 길이에 상응하는 거리에 있는 임의의 아미노산 측쇄 또는 펩티드 골격과 공유 결합을 형성할 수 있다.
실시예 3
가교제로 변형되고 시아닌 염료로 표지된 DNA 올리고머인 Cy3-T20-SANPAH를 하기와 같이 합성하였다. 10× PBS (포스페이트 완충 염수) 내의 Cy3-T20-NH2 (3'-말단에서 아미노-변형 링커로 표지되고 5'-말단에서 Cy3™ 염료로 표지된, 20개의 티미딘 단위를 포함하는 티미딘 올리고머, 인테그레이티드 DNA 테크놀로지즈 (미국)로부터 상업적으로 수득됨)의 10 ㎕ (31.9 nmol) 용액을 80 ㎕ 물 및 10 ㎕의 1 M NaHCO3/Na2CO3 완충제 (pH 8.4)로 희석하였다. 여기에, N-술포숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노) 헥사노에이트 (술포-SANPAH, 써모피셔 사이언티픽 인코포레이티드 (미국 일리노이주)로부터 상업적으로 수득됨)의 20 mM 수용액 (50 당량)을 첨가하였다. 혼합된 용액을 실온에서 1-2시간 동안 교반하였다. 미가공 혼합물을 NAP-10 칼럼 (GE 헬스케어, 미국) 상에서 컬럼 공급사가 제공하는 프로토콜을 사용하여 정제하였다.
술포-SANPAH는 스페이서 팔 길이가 18.2 Å인 수용성 이종이관능성 가교제이다. 술포-SANPAH 가교 시약은 1차 아민과 반응하는 NHS 에스테르 및 320-350 nm에서 광-반응성인 니트로페닐아지드 기를 함유한다.
실시예 4
가교 관능성이 있는, 시아닌 염료로 표지된 DNA 올리고머 (Cy3-T20-SFAD 또는 Cy3-T20-SDAD)를 스트렙타비딘과 접촉시킴으로써 단백질에 대한 DNA 프로브의 가교를 연구하였다. Cy3-T20-SFAD 및 Cy3-T20-SDAD는 가교 관능성에서만 서로 상이하다. 가교 관능성이 없는, 시아닌-염료로 표지된 DNA 올리고머인 Cy3-T20-NH2가 대조군으로서 역할을 하였다. 반응을 각각의 올리고머에 대해 2개의 실험 세트로 3중으로 수행하였다 (즉, 올리고머 당 3개의 웰의 세트 2개). 각각의 반응에 대해, Cy3으로 표지된 올리고머 (100 ㎕/웰, 1 μM 또는 0.1 μM)를 마이크로타이터 플레이트 (리액티-바인드(Reacti-Bind) (높은 결합 용량) 플레이트, 써모피셔 사이언티픽 (미국 일리노이주)으로부터 상업적으로 수득됨) 내의 스트렙타비딘이 코팅된 웰에 첨가하였다. 1개의 세트 (각각의 올리고머에 대한 1개의 세트, 3중)는 자외선에 20분 동안 노출시킨 한편, 다른 세트 (각각의 올리고머에 대한 1개의 세트, 3중)는 암실에서 유지시켰다. 반응 후, 과량의 시약을 제거하고, 웰을 1×PBS로 3회 세정하였다. 그 후, 웰에 100 ㎕ 1×PBS를 보충하고, 마이크로타이터 플레이트를 테칸(Tecan) 플레이트 판독기에서 판독하였다 (여기 파장은 544 nm였고, 방출 파장은 595 nm였다). 각각의 세트를 각각의 올리고머의 2가지 상이한 농도 (1 μM 및 0.1 μM)로 수행하였고, 상대적인 형광 카운트를 비교하였다.
도 3은 Cy3-T20-SFAD 및 Cy3-T20-SDAD의 2가지 상이한 농도에서의 각각의 세트에 대한 평균 형광 카운트를 나타낸다. 도 3은 자외선에의 노출 시 스트렙티비딘에 대한 Cy3-T20-SFAD 올리고머의 유의한 가교를 나타낸다. 1 μM의 Cy3-T20-SFAD가 실험에 사용되었을 때 0.44％의 Cy3-T20-SFAD가 스트렙타비딘에 가교되었다. 0.1 μM의 농도가 사용되었을 때, 0.15％의 Cy3-T20-SFAD가 스트렙타비딘에 가교되었다. 암실에서 수행되었을 때 (대조군), Cy3-T20-SFAD의 가교가 상당히 감소되었다. 대조군 올리고머 및 Cy3-T20-SDAD는 자외선에 노출된 샘플과 노출되지 않은 샘플 간에 유의한 차이를 나타내지 않았다.
실시예 5
DNA 프로브와 세포의 가교를 시아닌 염료로 표지된 DNA 올리고머 (Cy3-T20-SANPAH, 또는 Cy3-T20-NH2 (대조군))를 세포와 함께 인큐베이션함으로써 연구하였다. Cy3-T20-SANPAH는 세포 단백질과 반응할 수 있는 (따라서 프로브를 가교시킬 수 있는) 아지드 관능기를 포함한다. 대조군 프로브인 Cy3-T20-NH2는 어떠한 가교 관능성도 함유하지 않는다.
25 nM 농도에서 각각의 올리고머에 대한 2개의 세트로 반응을 수행하였다. 벤타나(Ventana) 자동염색기에서 탈랍을 위한 벤타나 디스커버리(Ventana Discovery) 시스템의 프로토콜 및 2-단계 매질 항원 복원 프로토콜을 사용하여, LNCap (안드로겐-민감성 인간 전립선 선암종 세포) 펠릿 슬라이드 (셀 시그널링 테크놀로지 인코포레이티드(Cell Signaling Technology Inc.) (미국 매사츄세츠주)로부터 수득됨)를 탈랍시키고, 항원을 복원시켰다. 슬라이드를 세제 (1회), 물 (3회) 및 1×PBS (1회)로 세정하였다. 각각의 반응에 대해, 300 ㎕의 올리고머 용액을 각각의 슬라이드 상에 놓고, 슬라이드를 암실에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1개의 세트 (각각의 올리고머에 대한)는 자외선 (투과조명기)에 40분 동안 노출시킨 한편, 다른 세트 (각각의 올리고머에 대한)는 암실에 남겨두었다. 반응 후, 과량의 시약을 제거하고, 슬라이드를 1×PBS로 10분 동안 세정하였다. 슬라이드를 1×PBS로 추가로 세정하고, DAPI (1 ㎍/㎖, 2.86 μM)로 5분 동안 염색하였다. 그 후, 슬라이드를 DAPI 용액으로부터 제거하고, 벡타쉴드(Vectashield)를 사용하여 마운팅(mounting)하고, 영상화하였다. 20 ms의 Cy3 노출을 사용하는 짜이스(Zeiss) 영상화기를 사용하여 영상화를 수행하였다.
도 4는 각각의 세트에 대한 평균 형광 카운트를 나타낸다. 자외선 하에 Cy3-T20-SANPAH와 함께 인큐베이션된 슬라이드가 나머지에 비해 더 높은 형광 카운트를 나타냈다. 이는 올리고머 Cy3-T20-SANPAH가 자외선 노출 시 세포와 가교하였음을 명확하게 가리킨다. 희미한 염색이 다른 세트에서 관찰되었다. 슬라이드를 1×PBS 내에 놓음으로써 커버슬립을 제거하였고, 슬라이드를 0.5×SSC와 함께 40℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 1×PBS로의 세정 (ON 세정) 후, 슬라이드를 마운팅하고, 짜이스 상에서 영상화하였다. Cy3 노출 시간은 20 ms에서 유지되었다. 도 4는 각각의 세트에 대한 평균 형광 카운트를 나타낸다. 도 4는 가교제가 접합된 올리고머 및 자외선에의 노출이 있는 슬라이드만 양호한 신호를 나타낸다는 것을 명확하게 나타낸다. 정량적 분석이 이를 확증한다.
실시예 6
조직 샘플 내의 폴리(A) mRNA 및 U6 snRNA 프로브의 다중화 검출을 하기와 같이 표적-결합 프로브들의 동시 첨가에 이어지는 표적-결합된 프로브들의 순차적인 검출에 의해 수행하였다. 5'-비오틴으로 표지된 LNA™ mRNA 원위치 혼성화 프로브인 PolyT(25)Vn (엑시콘(Exiqon) (미국)으로부터 상업적으로 수득됨) 및 5'-디곡시제닌으로 표지된 miRCURY LNA™ 검출 프로브인 U6 hsa/mmu/rno (엑시콘으로부터 상업적으로 수득됨)가 전체 폴리(A) mRNA 및 U6 snRNA 프로브를 검출하기 위해 각각 사용되었다. 인간 결장암 조직 샘플을 함유하는 슬라이드를 히스토초이스(histochoice) (암레스코(AMRESCO) (미국)으로부터 상업적으로 수득됨)에서 탈랍시키고, 감소되는 양의 에탄올에서 15분 동안 재수화시켰다. 그 후, 조직 샘플을 1×PBS, 1×PBS 내의 0.3％ 트리톤(Triton) X-100 (wt/wt ％), 이어서 1×PBS로 세정하였다. 그 후, 조직 샘플을 각각 10분 동안 50％, 70％, 95％ 및 100％ 에탄올 (수 중 v/v ％)에서 탈수시키고, 20분 동안 공기-건조시켰다. 혼성화 완충제 (50％ 포름아미드, 2×SSC, 500 ug/㎖ 효모 tRNA, 0.1％ 트윈(Tween)-20) 내의 PolyT(25)Vn 및 U6 hsa/mmu/rno (25 nM)를 함유하는 용액을 적용하였다. 프로브들을 95℃의 온도 블록에서 10분 동안 가열하고, 간략하게 원심분리하고, 조직 샘플에 적용하였다. 그 후, 조직 샘플을 커버글래스로 덮고, 밀봉하였다. 그 후, 슬라이드를 습윤화된 챔버에서 12시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 혼성화 후, 조직 샘플을 2×SSC에서 5분 동안, 0.5×SSC에서 5분 동안, 그리고 0.5×SSC에서 10분 동안 67℃에서 세정하였다.
그 후, 조직 샘플을 1×PBS로 세정하고, 3％ BSA PBS (wt/wt ％) 내의 Cy3으로 표지된 스트렙타비딘 (잭슨 이뮤노랩스(Jackson Immunolabs), 미국)과 함께 30분 동안 실온에서 인큐베이션하고, Cy3 필터 큐브를 사용하여 짜이스 현미경 상에서 영상화하였다. 도 5 (샘플 1)는 Cy3 채널에서의 강한 신호를 나타내고, 이는 폴리(A) mRNA의 검출을 지시한다. 폴리(A) mRNA의 검출 후, 슬라이드를 200 mM NaHCO3 내의 염기성 3％ H2O2 (화학적 표백 용액)로 15분 동안 처리하였다. 슬라이드를 1×PBS에서 헹구고, 20분 동안 200 mM NaHCO3 내의 3％ H2O2로 한번 더 처리한 후, 1×PBS로 헹궜다. 그 후, 슬라이드를 모든 채널에서 영상화하였다. 도 5 (샘플 2)는 Cy3 신호 대부분이 화학적 표백 용액으로의 처리 시 표백되었음을 나타낸다. 마지막으로, 슬라이드를 로다민으로 표지된 항-디곡시제닌 항체 (로쉐(Roche), 미국)와 함께 인큐베이션하여, U6 전사물을 검출하였다. Cy3 필터 큐브를 사용하여 영상화함으로써 슬라이드를 관찰하였다. 도 5 (샘플 3)는 Cy3 채널에서의 강한 신호를 나타내고 (로다민 형광이 Cy3 형광과 중첩됨), 이는 U6 snRNA 전사물의 검출을 지시한다. 디곡시제닌으로 표지된 U6 hsa/mmu/rno 프로브가 조직 샘플을 화학적 표백에 적용한 후에도 샘플에서 유지되었다.
실시예 7
가교제로 변형되고 시아닌으로 표지된 5'-Cy3-b-액틴-LNA-AmM-SANPAH (구조 1에 도해됨; 뉴클레오티드 기호 뒤의 별표 (*)는 이러한 뉴클레오티드가 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드임을 가리킨다)를 하기와 같이 합성하였다.
Figure pct00001
5×PBS 내의 5'-Cy3-b-액틴-LNA-AmM 올리고뉴클레오티드의 20 ㎕ (14.13 nmol) 용액을 70 ㎕ 물 및 10 ㎕의 1 M NaHCO3/Na2CO3 (pH 8.4) 완충제와 혼합하였다. 술포-SANPAH (써모피셔 사이언티픽 인코포레이티드, 미국 일리노이주)의 20 mM 용액을 2 mg의 술포-SANPAH를 203 ㎕ 물에 용해시킴으로써 제조하였다. 이러한 용액 35.3 ㎕ (50 당량)를 교반하면서 올리고뉴클레오티드 용액에 첨가하였다. 암실에서 2시간 동안 교반한 후, 혼합물을 냉장고에서 12시간 동안 보관하였다. PD-10 칼럼 (GE 헬스케어, 미국) 상에서 제조사의 프로토콜을 사용하여 정제를 수행하였다. 분홍색 물질을 수집하였고 (분획 1), HPLC에 의해 분석하였다. 주 피크가 생성물에 상응하였고 (순도 약 91％), 미변형 올리고뉴클레오티드가 주요 불순물이었다.
실시예 8
가교제로 변형되고 비오틴으로 표지된 5'-비오틴-U6-LNA-AmM-SANPAH (구조 2에 도해됨; 뉴클레오티드 기호 뒤의 별표 (*)는 이러한 뉴클레오티드가 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드임을 가리킨다)를 하기와 같이 합성하였다.
Figure pct00002
5×PBS 내의 5'-비오틴-U6-LNA-AmM 올리고뉴클레오티드의 20 ㎕ (22.04 nmol) 용액을 70 ㎕ 물 및 10 ㎕의 1 M NaHCO3/Na2CO3 (pH 8.4) 완충제와 혼합하였다. 술포-SANPAH (써모피셔 사이언티픽 인코포레이티드, 미국 일리노이주)의 20 mM 용액을 2 mg의 술포-SANPAH를 203 ㎕ 물에 용해시킴으로써 제조하였다. 이러한 용액 55.1 ㎕ (50 당량)를 교반하면서 올리고뉴클레오티드 용액에 첨가하였다. 암실에서 2시간 동안 교반한 후, 혼합물을 냉장고에서 12시간 동안 보관하였다. PD-10 칼럼 (GE 헬스케어, 미국) 상에서 제조사의 프로토콜을 사용하여 정제를 수행하였다. 무색 물질을 수집하였고 (분획 1), HPLC에 의해 분석하였다. 1개의 피크만 관찰되었고, 이는 원하는 생성물에 상응하였다.
실시예 9
조직 샘플 내의 b-액틴 및 U6 프로브의 다중화 검출을 하기와 같이 5'-Cy3-b-액틴-LNA-AmM-SANPAH 프로브 및 5'-비오틴-U6-LNA-AmM-SANPAH 프로브의 동시 첨가에 이어지는 프로브들의 가교, 및 이들의 순차적인 검출에 의해 수행하였다. 인간 편도선 조직을 함유하는 슬라이드를 히스토초이스 (암레스코, 미국)에서 탈랍시키고, 감소되는 양의 에탄올 및 트리톤 X-100 (PBS 내의 0.3％)에서 15분 동안 재수화시켰다. 그 후, 조직을 1×PBS에서 세정하였다. 혼성화 완충제 (2×SSC/50％ 포름아미드/5％ 덱스트란 술페이트) 내의 5'-Cy3-b-액틴-LNA-AmM-SANPAH 프로브 및 5'-비오틴-U6-LNA-AmM-SANPAH 프로브 (각각 25 nM)를 함유하는 용액을 적용하였다. 프로브들을 실온에서 DR180 투과조명기를 사용하여 40분 동안 조직과 가교시켰다. 그 후, 슬라이드를 1×PBS에서 세정하고, DAPI로 염색하고, Cy3, Cy5 & DAPI 큐브를 사용하여 짜이스 현미경 상에서 영상화시켰다. 도 6은 Cy3 채널에서 강한 신호가 관찰되었음을 나타내고, 이는 b-액틴 프로브의 존재를 지시한다 (단계 1). 예상 대로, 약한 샘플 자가형광 이외의 신호가 Cy5 채널에 존재하지 않았다. b-액틴 프로브의 검출 후, 슬라이드를 200 mM NaHCO3 내의 염기성 3％ H2O2로 20분 동안 처리하였다. 슬라이드를 PBS에서 헹구고, 20분 동안 200 mM NaHCO3 내의 3％ H2O2로 한번 더 처리한 후, PBS로 헹궜다. 그 후, 모든 채널에서 영상을 기록하였다. 영상들은 대부분의 Cy3 신호의 표백을 나타냈다 (단계 2). 일부 잔류 신호가 관찰되었고, 아마도 내인성 자가형광 또는 불완전한 표백에 기인할 것이다. 마지막으로, 슬라이드를 Cy5로 표지된 스트렙타비딘과 함께 인큐베이션하여 U6 프로브를 검출하였다 (U6에 결합된 비오틴화 프로브인 5'-비오틴-U6-LNA-AmM-SANPAH 프로브의 검출을 통해). 영상화에 의해 슬라이드를 관찰하였다. 영상화는 Cy5 채널에서의 강한 신호를 나타냈고 (단계 3), 이는 비오틴화 프로브가 샘플을 표백 사이클에 적용한 후에도 샘플에서 유지되었음을 가리킨다.
도 7은 본 발명의 한 실시양태에 따라 생물학적 샘플 내의 다수의 상이한 표적을 검출하기 위한 장치 (50)의 블록 선도이다. 이러한 장치는 샘플 취급 시스템 (62), 시약 분배 시스템 (64), 광원 (66), 및 신호 검출 시스템 (60)을 포함한다. 광원은 프로브 가교 시스템으로서 작용할 수 있을 뿐만 아니라, 신호 검출 시스템용 광원으로서 또한 작용할 수 있다. 도해된 장치 (50)는 메모리 및 프로세서 (54)가 있는 컴퓨터 (52), 제어기 유닛 (58), 및 디스플레이 장치 (56)를 추가로 포함한다. 도면에서, 화살표는 통신 링크를 가리키고, 양방향 화살표는 상호 통신 링크를 나타내며, 점선 화살표는 임의적인 통신 링크를 가리킨다.
제어기 유닛은 컴퓨터 (52), 샘플 취급 시스템 (62), 시약 분배 시스템 (64), 광원 (66), 또는 신호 검출 시스템 (60) 중 하나 이상과 통신할 수 있다. 통신은 단방향 통신 또는 양방향 통신일 수 있다. 샘플 취급 시스템 (62), 광원 (66), 시약 분배 시스템 (64) 및 신호 검출 시스템 (60)이 제어기 유닛 (58)에 의해 제어될 수 있고, 이는 다중 표적의 검출을 위한 신호/프로토콜을 제어한다. 또한, 신호 검출 시스템 (60)이 제어기 (58)에 커플링되고, 이는 신호 취득을 명령할 수 있다. 제어기 (58)는, 예컨대 샘플 취급 시스템 (62), 광원 (66) 등의 초기 조정을 위해, 다양한 기능을 또한 실행할 수 있다. 일반적으로, 제어기 (58)는 다중 표적을 검출하는 방법의 단계들을 실행하도록, 그리고 취득된 데이터를 프로세싱하도록 장치의 작동을 명령한다. 제어기 (58)는 범용 또는 용도-특이적 디지털 컴퓨터를 전형적으로 기초로 하는 신호 프로세싱 회로, 이러한 컴퓨터에 의해 실행되는 프로그램 및 루틴을 저장하기 위한 관련된 메모리 회로 등을 또한 포함할 수 있다.
컴퓨터 (52)는 전형적으로 제어기 (58)에 커플링되거나 그에 혼입된다. 신호 검출 시스템 (60)에 의해 수집된 데이터가 후속 프로세싱 및 재구성을 위해 컴퓨터 (52)로 직접적으로 또는 제어기 (58)를 통해 전송될 수 있다. 컴퓨터 (52)는 컴퓨터 (52)에 의해 프로세싱된 데이터 또는 컴퓨터 (52)에 의해 프로세싱될 데이터를 저장할 수 있는 메모리를 포함할 수 있거나 또는 이와 통신할 수 있다. 이같은 예시적인 시스템 (50)이 다량의 데이터를 저장하도록 구성된 임의 유형의 메모리를 이용할 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 메모리는 장치에 놓일 수 있거나, 또는 데이터, 프로세싱 파라메터 및/또는 방법을 실행하기 위한 루틴을 저장하기 위한 원격 성분, 예컨대 네트워크로 접근할 수 있는 메모리 매체를 포함할 수 있다.
도 8은 생물학적 샘플 내의 다수의 상이한 표적들을 검출하기 위한 예시적인 조직병리학 장치 (70)의 블록 선도이다. 이러한 조직병리학 장치는 슬라이드 홀더 (86) 및 스테이지 (88)가 있는 샘플 취급 시스템 (84), 시약 분배 시스템 (90), 가교용 광원 (94), 및 현미경 (82) 및 CCD 카메라 (80)를 포함하는 신호 검출 시스템을 포함한다. 장치는 중앙 프로세싱 유닛 (74) 및 메모리가 있는 컴퓨터 (72), 제어기 유닛 (78), 및 디스플레이 장치 (76)를 추가로 포함할 수 있다. 제어기 유닛은 중앙 프로세싱 유닛, 샘플 취급 시스템, 시약 분배 시스템, 프로브 가교 시스템, 또는 신호 검출 시스템 중 하나 이상과 통신할 수 있다. 통신은 단방향 통신 또는 양방향 통신일 수 있다.
제어기 (78)에 의해 구동될 수 있는 시약 분배, 프로브 가교 및 신호 검출과 같은 특색들을 제어하도록 컴퓨터 (72)가 또한 개조될 수 있다. 또한, 키보드 및 기타 입력 장치 (제시되지 않음)가 전형적으로 장착된 조작자 워크스테이션 (제시되지 않음)을 통해 조작자로부터의 명령 및 기타 파라메터를 수신하도록 컴퓨터 (72)가 구성될 수 있다. 이에 의해 조작자가 입력 장치를 통해 시스템 70을 제어할 수 있다. 따라서, 조작자가 컴퓨터 (72)로부터의 재구성된 영상/데이터 또는 시스템 (70)에 관련된 기타 데이터의 관찰, 영상화 개시 등을 할 수 있다.
조작자 워크스테이션 또는 컴퓨터 (72)에 커플링된 디스플레이 (76)를 이용하여 검출된 신호 또는 재구성된 영상을 관찰할 수 있다. 추가적으로, 재구성된 영상을 조작자 워크스테이션에 커플링될 수 있는 인쇄기 (제시되지 않음)로 인쇄할 수도 있다. 또한 디스플레이 (72) 및 인쇄기가 컴퓨터 (72)에 직접적으로 또는 조작자 워크스테이션을 통해 연결될 수 있다. 또한 조작자 워크스테이션이 영상 저장 및 통신 시스템에 커플링될 수 있다. 조작자 워크스테이션이 원격 시스템, 예컨대 조직병리학과 정보 시스템, 병원 정보 시스템, 또는 내부 또는 외부 네트워크에 커플링될 수 있어, 다른 장소의 사람들이 재구성된 영상에 접근할 수 있음을 주지하여야 한다.
컴퓨터 (72) 및 조작자 워크스테이션이 표준 또는 특수 목적 컴퓨터 모니터 및 관련된 프로세싱 회로를 포함할 수 있는 기타 출력 장치에 커플링될 수 있음을 추가로 주지하여야 한다. 하나 이상의 조작자 워크스테이션이 시스템 파라메터 출력, 영상 보기 등을 위해 시스템에서 추가로 연결될 수 있다. 일반적으로, 장치 내에 공급된 디스플레이, 인쇄기, 워크스테이션 및 유사 장치는 장치에 대해 구내(local)일 수 있거나, 또는 하나 이상의 구성가능한 네트워크, 예컨대 인터넷, 가상 사설 네트워크 등을 통해 신호 검출 시스템에 연결된 기관 또는 병원 내의 다른 곳 또는 전적으로 상이한 위치와 같이 장치로부터 원격일 수 있다.
상기의 예 및 실시양태는 본원에 기술된 발명에 대해 제한적이기보다는 본 발명의 일부 특색의 실례이다. 이들은 다양한 모든 가능한 실시양태 또는 예로부터의 선택된 실시양태 또는 예이다. 본 발명은 이의 취지 또는 본질적인 특징을 벗어나지 않으면서 다른 특정 형태로 구현될 수 있다. 따라서, 첨부된 청구항이 본 발명의 진정한 취지 내에 속하는 모든 변형 및 변화를 포함하도록 의도된다는 것을 이해하여야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> GE Healthcare UK Limited and General Electric Company <120> DETECTION OF PLURALITY OF TARGETS IN BIOLOGICAL SAMPLES <130> PG10018 <150> US12/582745 <151> 2009-10-21 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 1 ctcattgtag aaggtgtggt gcca 24 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 2 cacgaatttg cgtgtcatcc tt 22

Claims (40)

  1. (a) 생물학적 샘플을 다수의 표적-결합(target-binding) 프로브와 접촉시켜 다수의 표적-결합된(target-bound) 프로브를 형성시키는 단계;
    (b) 표적-결합된 프로브들 중 하나 이상을 생물학적 샘플에 공유결합으로 부착시키는 단계;
    (c) 다수의 표적-결합된 프로브의 제1 세트로부터의 제1 신호 세트를 관찰하는 단계;
    (d) 관찰된 신호들을 변형시키는 단계;
    (e) 다수의 표적-결합된 프로브의 제2 세트로부터 제2 신호 세트를 생성시키는 단계; 및
    (f) 제2 신호 세트를 관찰하는 단계
    를 포함하는, 생물학적 샘플 내의 다수의 표적을 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (d) 내지 (f)를 다수의 표적-결합된 프로브의 제3, 제4 및 제n 세트로 여러 번 반복하여 제3, 제4 및 제n 신호 세트를 관찰하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 관찰된 신호들을 다수의 표적의 검출에 상관시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 다수의 표적-결합된 프로브 모두가 생물학적 샘플에 공유결합으로 부착되는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 표적-결합된 프로브가 표적 자체를 통해 또는 표적 부근에 위치하는 분자를 통해 생물학적 샘플에 공유결합으로 부착되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 표적-결합 프로브가 표적-결합 모이어티(moiety) 및 독립적으로 검출가능한 모이어티로부터 유래된 단위를 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 다수의 표적-결합된 프로브의 제1 세트의 독립적으로 검출가능한 모이어티가 신호-생성(signal-generating) 모이어티를 포함하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 신호-생성 모이어티가 형광단, 발색단, 라만(Raman) 태그(tag), SERS 태그, 또는 이들의 조합물을 포함하는 것인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 표적-결합 모이어티가 독립적으로 검출가능한 모이어티에 절단가능한 링커를 통해 커플링되는 방법.
  10. 제6항에 있어서, 독립적으로 검출가능한 모이어티가 독특한 핵산 서열, 합텐, 효소, 또는 이들의 조합물을 포함하는 것인 방법.
  11. 제6항에 있어서, 독립적으로 검출가능한 모이어티가 차폐된 신호-생성 모이어티를 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 차폐된 신호-생성 모이어티가 차폐된 형광단, 차폐된 발색단, 차폐된 라만 태그, 차폐된 SERS 태그, 또는 이들의 조합물을 포함하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 차폐된 신호-생성 모이어티를 탈차폐시킴으로써 다수의 표적-결합된 프로브로부터 신호들이 생성되는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 신호-생성 모이어티를 각각의 표적-결합된 프로브와 회합시킴으로써 다수의 표적-결합된 프로브로부터 신호들이 생성되는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 접촉 단계 후의, 표적에 결합되지 않은 임의의 표적-결합 프로브를 제거하기 위한 단계들을 추가로 포함하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 생물학적 샘플을 다수의 표적-결합 프로브와 접촉시키는 단계 전에 생물학적 샘플을 영상화하여 배경 신호 시그니처(signature)를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 다수의 표적의 검출이 다수의 표적의 존재, 부재, 위치 또는 양을 확인하는 것을 포함하는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 다수의 표적이 올리고뉴클레오티드, 핵산, 펩티드, 단백질, 호르몬, 수용체, 폴리사카라이드, 지질, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 다수의 표적이 본질적으로 다수의 리보핵산으로 구성되는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 다수의 표적이 본질적으로 다수의 단백질로 구성되는 것인 방법.
  21. (a) 생물학적 샘플을 다수의 표적-결합 프로브와 접촉시켜 다수의 표적-결합된 프로브를 형성시키는 단계;
    (b) 표적-결합된 프로브들 중 하나 이상을 생물학적 샘플에 공유결합으로 부착시키는 단계;
    (c) 다수의 표적-결합된 프로브의 제1 세트로부터 제1 신호 세트를 생성시키는 단계;
    (d) 제1 신호 세트를 관찰하는 단계;
    (e) 관찰된 신호들을 변형시키는 단계;
    (f) 다수의 표적-결합된 프로브의 제2 세트로부터 제2 신호 세트를 생성시키는 단계; 및
    (g) 제2 신호 세트를 관찰하는 단계
    를 포함하는, 생물학적 샘플 내의 다수의 표적을 검출하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 단계 (e) 내지 (g)를 다수의 표적-결합된 프로브의 제3, 제4 및 제n 세트로 반복하여 제3, 제4 및 제n 신호 세트를 관찰하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, n의 정수 값이 5 내지 100인 방법.
  24. 제21항에 있어서, 관찰된 신호들을 다수의 표적의 검출에 상관시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제21항에 있어서, 제1 신호 세트를 생성시키는 단계 전에 생물학적 샘플을 영상화하여 배경 신호 시그니처를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상관 단계 전에 배경 신호 시그니처를 후속 신호 관찰 단계에서 관찰된 신호에서 차감하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  27. (a) 샘플을 다수의 표적-결합 프로브와 접촉시켜 다수의 표적-결합된 프로브를 형성시키는 단계;
    (b) 표적-결합된 프로브들 중 하나 이상을 생물학적 샘플에 공유결합으로 부착시키는 단계;
    (c) 다수의 표적-결합된 프로브를 다수의 표적-결합된 프로브의 제1 세트와 결합할 수 있고 제1 신호 세트를 생성할 수 있는 신호-생성 프로브들의 제1 세트와 접촉시키는 단계;
    (d) 제1 신호 세트를 관찰하는 것을 통해 다수의 표적의 제1 세트를 검출하는 단계;
    (e) 관찰된 제1 신호 세트를 변형시키는 단계; 및
    (f) 다수의 표적의 후속 세트를 검출하기 위해 신호-생성 프로브들의 후속 세트를 사용하여 단계 (c) 내지 (e)를 여러 번 반복하고, 이때 신호-생성 프로브들의 후속 세트가 다수의 표적-결합된 프로브의 후속 세트에 결합할 수 있고, 후속 신호 세트를 생성할 수 있는 단계
    를 포함하는, 생물학적 샘플 내의 다수의 표적을 검출하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 관찰된 제1 신호 세트가 화학 작용제를 적용함으로써 변형되는 방법.
  29. 제27항에 있어서, 표적-결합된 프로브들을 신호-생성 프로브들의 제1 세트와 접촉시키는 단계 전에, 다수의 표적에 결합되지 않은 표적-결합 프로브들을 제거하기 위한 단계들을 추가로 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 다수의 표적의 제1 세트를 검출하는 단계 전에, 다수의 표적-결합된 프로브의 제1 세트에 결합되지 않은 신호-생성 프로브들의 제1 세트를 제거하기 위한 단계들을 추가로 포함하는 방법.
  31. 제27항에 있어서, 다수의 표적-결합된 프로브 모두가 표적 자체에 또는 표적 부근에 위치하는 분자에 공유결합으로 커플링(coupling)되는 방법.
  32. 제27항에 있어서, 단계 (c) 내지 (f)가 100회까지 반복되는 방법.
  33. 제27항에 있어서, 다수의 표적이 데옥시리보핵산, 리보핵산, 단백질, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  34. 제27항에 있어서, 다수의 표적이 본질적으로 다수의 리보핵산으로 구성되는 것인 방법.
  35. 각각의 표적-결합 프로브가 신호를 생성할 수 있고, 표적-결합 프로브 중 하나 이상이 표적에 또는 표적 부근에 위치하는 분자에 가교될 수 있는, 다수의 표적-결합 프로브; 및
    하나 이상의 표적-결합 프로브로부터의 생성된 신호를 변형시킬 수 있는 하나 이상의 화학 작용제
    를 포함하는, 생물학적 샘플 내의 다수의 다중 표적의 검출을 위한 키트.
  36. 샘플 취급 시스템;
    시약 분배 시스템;
    프로브 가교 시스템; 및
    신호 검출 시스템
    을 포함하는, 생물학적 샘플 내의 다수의 표적의 검출을 위한 장치.
  37. 제36항에 있어서, 시약 분배 시스템이 하나 이상의 표적-결합 프로브를 포함하는 하나 이상의 시약 용액을 분배하는 장치.
  38. 제36항에 있어서, 샘플 취급 시스템, 시약 분배 시스템, 프로브 가교 시스템, 또는 신호 검출 시스템 중 하나 이상이 조작자의 개입 없이 작동가능한 장치.
  39. 제36항에 있어서,
    (a) 생물학적 샘플을 다수의 표적-결합 프로브와 접촉시켜 다수의 표적-결합된 프로브를 형성시키는 단계;
    (b) 다수의 표적-결합된 프로브의 제1 세트로부터의 제1 신호 세트를 관찰하는 단계;
    (c) 관찰된 신호들을 변형시키는 단계;
    (d) 다수의 표적-결합된 프로브의 제2 세트로부터 제2 신호 세트를 생성시키는 단계; 및
    (e) 제2 신호 세트를 관찰하는 단계
    를 포함하는 방법을 사용하여 생물학적 샘플 내의 다수의 표적을 검출하도록 작동가능한 장치.
  40. 제36항에 있어서,
    (a) 생물학적 샘플을 다수의 표적-결합 프로브와 접촉시켜 다수의 표적-결합된 프로브를 형성시키는 단계;
    (b) 표적-결합된 프로브 중 하나 이상을 생물학적 샘플에 공유결합으로 부착시키는 단계;
    (c) 다수의 표적-결합된 프로브의 제1 세트로부터의 제1 신호 세트를 관찰하는 단계;
    (d) 관찰된 신호들을 변형시키는 단계;
    (e) 다수의 표적-결합된 프로브의 제2 세트로부터 제2 신호 세트를 생성시키는 단계; 및
    (f) 제2 신호 세트를 관찰하는 단계
    를 포함하는 방법을 사용하여 생물학적 샘플 내의 다수의 표적을 검출하도록 작동가능한 장치.
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