JPH01196567A - 核酸検査方法及び核酸検査装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、核酸検査方法及び核酸検査装置に係り、特に
精度の高い検査に好適な核酸検査方法及び核酸検査装置
に関する。

〔従来の技術〕 核酸試料と核酸プローブとのハイブリダイゼイション（
分子雑種形成）によって、核酸試料が核酸プローブの相
補塩基配列を有するか否かを検査する核酸検査方法につ
いてはネイチャー、３０４（１９８３年）第２３０頁か
ら第２３４頁（ＮＡＴＵＲＥ、３０４（１９８３）　ｐ
ｐ２３０−２３４）に記載されている。この方法は、α
、−アンチトリプシン欠損症の病因遺伝子の有無を検査
している。以下、検査方法の概要について述べる。

まず始めに病因遺伝子の塩基配列を求める。次に病因遺
伝子の異常配列部位の相補塩基配列を有する核酸プロー
ブを合成する。

第４図に、α、−アンチトリプシン欠損症の病因遺伝子
を有する核酸試料を示す。塩基配列は、・・・・・・Ａ
ＣＣＡＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡＡＧＧＧＡ・・・・・・で
ある。この核酸試料を以下、「病因遺伝子核酸試料」と
呼び、図面の符号は１とする。

第５図に、α、−アンチトリプシン欠損症の病因遺伝子
の異常配列部位の相補塩基配列を有する核酸プローブを
示す。塩基配列は、ＴＧＧＴＡＧＣ：ＴＧＣＴＣＴＴＴ
ＣＣ，ＣＴである。この核酸プローブを以下、「病因遺
伝子核酸プローブ」と呼び、図面の符号は２とする。

この核酸プローブを放射性同位体０Ｐで標識しておく。

次に、この核酸プローブと核酸試料を用い、適当な条件
下でハイブリダイゼイション反応を行わせる。過剰の核
酸プローブを除き、最後に、オートラジオグラフィ法に
よって、ハイブリダイゼイションの有無を調べる。もし
、核酸プローブと核酸試料がハイブリダイゼイションを
していれば、核酸試料が核酸プローブの相補塩基配列（
即ち、病因遺伝子の塩基配列）を有していることが分か
る。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記従来技術は、類似塩基配列による非特異的なハイブ
リダイゼイションについて配慮されていなかった。すな
わち、核酸試料が核酸プローブの相補塩基配列を有して
いない場合でも、それとよく似た塩基配列を有している
と、核酸試料が核酸プローブとハイブリダイゼイション
をしてしまい、誤った検査結果を得ることがあった。

前述のα、−アンチトリプシン欠損症の場合は、正常遺
伝子の塩基配列と病因遺伝子の塩基配列はよく類似して
いる。第６図に正常遺伝子を有する核酸試料を示す。塩
基配列は、・・・・・・ＡＣＣＡＴＣＧＡＣＡＡＧＡＡ
ＡＧＧＧＡ・・・・・・である。この核酸試料を以下、
「正常遺伝子核酸試料」と呼び、図面の符号は３とする
。この正常遺伝子核酸試料と病因遺伝子核酸試料の塩基
配列を比較すると、１０番目のＧがＡに変化しているだ
けで、類似度が非常に高い。

このように病因遺伝子と正常遺伝子の類似度が高い場合
には、本来病因遺伝子核酸プローブは病因遺伝子核酸試
料としかハイブリダイゼイションをしないはずであるが
、正常遺伝子核酸試料とも非特異的なハイブリダイゼイ
ションをしてしまうことがあり、検査精度を低下させる
という問題があった。

この問題の解決について、被検核酸試料の他に、病因遺
伝子核酸試料と正常遺伝子核酸試料を用意しておき、対
照とする方法、また、病因遺伝子核酸プローブの他に、
正常遺伝子核酸試料の相補塩基配列を有する核酸プロー
ブを用意しておき、核酸試料と作用させ、対照とする方
法等も検討されている。

第７図に、正常遺伝子の相補塩基配列を有する核酸プロ
ーブを示す。塩基配列は、ＴＧＧＴＡＧＣＴＧＴＴＣＴ
ＴＴＣＣＣＴである。この核酸プローブを以下、「正常
遺伝子核酸プローブ」と呼び図面の符号は４とする。し
かしこれらの方法は、核酸試料毎や核酸プローブ毎に異
なる反応を行なっているため、反応の再現性に問題があ
った。

本発明の目的は、類似配列による非特異的なハイブリダ
イゼイションを防いだ、精度の高い核酸検査方法及び核
酸検査装置を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的は、核酸試料と核酸プローブのハイブリダイゼ
イションにより、該核酸試料が該核酸プローブの相補塩
基配列を有するか否かを検査する核酸検査方法において
、上記プローブ及び上記核酸プローブの類似塩基配列を
有する少なくとも一種類以上の核酸プローブを同時に上
記核酸試料に作用させてハイブリダイゼイション反応を
行なわせ、上記核酸試料が上記核酸プローブの相補塩基
配列を有するか否かを検査することを特徴とする核酸検
査方法によって達成される。

また、このような核酸検査方法を行なうための装置の一
例としては、核酸試料と核酸プローブとのハイブリダイ
ゼイション反応物から放出される放射線を電気信号に変
換するための手段、上記電気信号の大きさと頻度から上
記放射線のエネルギースペクトルの濃度を検出する手段
及び二種以上のエネルギースペクトルの濃度を比較する
ことによりいずれのエネルギースペクトルが主であるか
判定する手段を有することを特徴とする核酸検査装置又
は核酸試料と核酸プローブとのハイブリダイゼイション
反応物から放出される光を電気信号に変換するための手
段、上記電気信号の大きさから上記光の強度を検出する
手段及び二種以上の波長の強度からいずれの波長が主で
あるか判定する手段を有することを特徴とする核酸検査
装置がある。

これらの核酸検査装置において、いずれのエネルギース
ペクトルが主であるか又はいずれの波長が主であるかの
判定は、必ずしも一種を選ぶことではない。例えば遺伝
子には父方由来のものと母方由来のものがあり、二種の
エネルギースペクトル又は波長が共に主であると判定し
てもよい。

〔作　　用〕

核酸プローブとこの核酸プローブと類似配列を有する核
酸プローブとを同時に用いて、後者の塩基配列と相補塩
基配列を有する核酸試料に対してハイブリダイゼイショ
ン反応を行なった場合の作用について述べる。前者の核
酸プローブと上記核酸試料のハイブリダイゼイションの
強さと、後者の核酸プローブと上記核酸試料のハイブリ
ダイゼイションの強さを比較すると、後者の方が前者よ
り強い。このため核酸試料の大部分は後者の核酸プロー
ブとハイブリダイゼイションする。従って前者の核酸プ
ローブが類似配列に基づく非特異的なハイブリダイゼイ
ションを行なうのを防ぎ、精度の高い検査結果を得るこ
とができる。

〔実施例〕

以下、本発明の一実施例をα□−アンチトリプシン欠損
症を例にとり、第１図から第３図により説明する。なお
、以下の図面において核酸試料と核酸プローブを示す際
には、病因遺伝子と正常遺伝子の区別がつきやすいよう
に、相異点の塩基のみを表示する。

核酸試料としては、正常人とα１−アンチトリプシン欠
損症患者の血液各々２〜４ｍＱを精製して約ｌＯμｇの
ゲノムＤＮＡを得た後、これをＢａｎＨｌとＸｂａＩ、
Ｈｉｎｄ　Ｉ［［とＸｂａｌなどの制限酵素で切断した
ものを用いた。なお、上記核酸試料はそのままニトロセ
ルロースなどのフィルター上に固定した。なお、アガロ
ースゲルを用いた電気泳動で分子量分離した後に同様の
フィルター上に転写固定して用いてもよい。フィルター
としてはナイロン固定化膜等も用いられる。

また、病因遺伝子核酸プローブと正常遺伝子核酸プロー
ブとしては、第５図及び第７図に示した塩基配列のＤＮ
Ａ断片をトリエステル法で化学合成した後、放射線同位
体３２　ｐ　、　３５　Ｓ又は蛍光体ＦＩＴＣ（フルオ
レッセイン　イソチオシアネート）、テキサス　レッド
又は酵素、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビのペルオ
キシダーゼ等で標識した。

まず第１図に示すように、検査をしたい核酸試料５に病
因遺伝子核酸プローブ２と正常遺伝子核酸プローブ４を
同時に加えて、５５℃に２時間保ちハイブリダイゼイシ
ョン反応を行なわせた後、５５℃の緩衝液で洗浄する。

ここで核酸試料５が病因遺伝子核酸試料１の場合には、
核酸試料と病因遺伝子核酸プローブ２のハイブリダイゼ
イションの強さは、核酸試料と正常遺伝子核酸プローブ
４のハイブリダイゼイションの強さよりも強い。従って
、第２図に示すように核酸試料の大部分は病因遺伝子核
酸プローブ２とハイブリダイゼイションし、正常遺伝子
核酸プローブ４と非特異的なハイブリダイゼイションは
極くわずかしか生じない。

一方核酸試料５が正常遺伝子核酸試料３の場合には、第
３図に示すように、核酸試料の大部分は正常遺伝子核酸
プローブ４とハイブリダイゼイションし、病因遺伝子核
酸プローブ２とのハイブリダイゼイションは極くわずか
しか生じない。本実施例によれば、類似配列による非特
異的なハイブリダイゼイションを防ぐことができるので
、精度の高い検査結果が得られる。

本実施例において、核酸試料５にハイブリダイゼイショ
ンしたのが、病因遺伝子核酸プローブ２か正常遺伝子核
酸プローブ４かを判定する必要がある。判定の方法とし
ては、病因遺伝子核酸プローブ２と正常遺伝子核酸プロ
ーブ４を異なる標識体で標識する方法と、核酸プローブ
のどちらか一方のみを標識する方法と、核酸プローブの
どちらか一方のみに制限酵素の認識部位を付加する方法
等がある。これらについて説明する。

まず核酸プローブを二種類の放射性同位体で標識した場
合について第８図から第１２図を用いて説明する。放射
性同位体は３２Ｐと３ＳＳとし、病因遺伝子核酸プロー
ブ２の標識体を３２ｐ、正常遺伝子核酸プローブ４の標
識体を３ＳＳとする。３２ｐと３ＳＳから放出される放
射線の最大エネルギーはそれぞれ、１　、７１　Ｍ　ｅ
　Ｖと０．１７ＭｅＶである。まず第８図に示すように
、これら２種類の核酸プローブと核酸試料５を混合して
５５℃に２時間保ちハイブリダイゼイション反応を行な
わせた。第８図では核酸プローブの標識が末端標識にな
っているが、全鎖標識でも同様である。次に５５℃の緩
衝液で洗浄してハイブリダイゼイションをしなかった核
酸プローブを除去した。最後にこのようにして得られた
試料から放出される放射線を第９図の装置で測定した。

試料６から放出された放射線がシンチレータ７に当たる
と光を発生する。光は光電子増倍管８によって増幅され
、電流となる。電流はアンプ９を通って、マルチチャン
ネルアナライザ１０に入る。マルチチャンネルアナライ
ザ１０は入力信号の大きさをもとに、試料６から放出さ
れた放射線のエネルギーレベルとその頻度、すなわちエ
ネルギースペクトルを求める。２０は判定装置で、二種
のエネルギースペクトルを比較し、いずれのエネルギー
スペクトルが主であるか判定する。

核酸試料５が病因遺伝子核酸試料の場合は、核酸試料５
とハイブリダイゼイションするのは、はとんどが３２ｐ
で標識された病因遺伝子核酸プローブ２である。その結
果、試料から放出される放射線のエネルギースペクトル
としては、第１０図に示すように、最大エネルギーが１
　、７１　Ｍ　ｅ　Ｖのものを主成分とするスペクトル
が得られた。これに対し、核酸試料５が正常遺伝子核酸
試料の場合は、核酸試料５とハイブリダイゼイションす
るのは、はとんどが３５８で標識された正常遺伝子核酸
プローブ４である。その結果、試料から放出される放射
線のエネルギースペクトルとしては、第１１図に示すよ
うに最大エネルギーが０．１７ＭｅＶのものを主成分と
するスペクトルが得られた。このように放射線のエネル
ギースペクトルを測ることにより、核酸試料５にハイブ
リダイゼイションした核酸プローブの種類を知ることが
できた。

次に、核酸プローブを二種類の蛍光体で標識する方法に
ついて説明する。蛍光体はＦＩＴＣとテキサス　レッド
を用い病因遺伝子核酸プローブの標識体はＦＩＴＣ１正
常遺伝子核酸プローブの標識体はテキサス　レッドとし
た。ＦＩＴＣの最大吸収波長は４８９ｎｍ、最大発光波
長は５１５止、テキサス　レッドの最大吸収波長は５９
９ｎ＋ｓ、最大発光波長は６１２ｎｍである。反応の方
法は放射性同位体の場合と同様であるが測定の方法が異
なる。測定装置の構成を第１２図に示す。レーザ１１か
ら出た光は４８９ｎｎ＋か５９９ｎｍのフィルタ１２を
通り、試料６に当たる。試料６から発生した蛍光はレン
ズ１３と５１５　ｎｍか６１２ｎｍのフィルタ１４を通
って光電子増倍管８に入る。光電子増倍管８の出力信号
はアンプ９を通り、信号処理回路１５に入る。２１は判
定装置で、二種の波長の強度からいずれの波長が主であ
るか判定する。フィルタの波長の組み合わせは、４８９
　ｎｍ＋　５１５ｎｍと５９９ｎｍ＋６１２ｎｍである
。核酸試料が病因遺伝子核酸試料ならば、核酸試料とハ
イブリダイゼイションするのは、主としてＦＩＴＣで標
識された病因遺伝子核酸プローブである。その結果、フ
ィルタの波長の組み合わせが４８９ｎｍ＋５１５ｎｍの
場合に５９９ｎｍ＋６１２ｎｍの場合より大きい信号が
検出された。これに対し、核酸試料が正常遺伝子核酸試
料の場合には、核酸試料とハイブリダイゼイションする
のは、主としてテキサス　レッドで標識された正常遺伝
子核酸プローブである。その結果、フィルタの波長の組
み合わせが５９９ｎｍ　＋　６１２ｎｍの場合に４８９
ｎｍ　＋　５１５ｎｍの場合より大きい信号が検出され
た。また、核酸試料が病因遺伝子核酸試料と正常遺伝子
核酸試料の混合物の場合には、フィルタの波長の組み合
わせがいずれの場合にも同程度の信号が検出された。こ
のようにフィルタの組み合わせを変えて信号を検出し、
その大きさを比較することにより、核酸試料にハイブリ
ダイゼイションした核酸プローブの種類を知ることがで
きる。

核酸プローブを二種類の標識体で標識する方法としては
、異常の他に二種類の酵素を用いる方法、放射性同位体
と蛍光体と酵素のうちの二種類を用いる方法がある。ま
た、標識体の違いを検出できるものならば、これ以外の
標識体でもよい。

酵素の例としては、β−ガラクトシダーゼや西洋ワサビ
のペルオキシダーゼが挙げられる。β−ガラクトシダー
ゼは４−メチルウンベリフェリルガラクトシドを基質と
し、これを特異的に分解して最大吸収波長３６０ｎｍ、
最大発光波長４５０ｎｍの蛍光体を生成する。また、西
洋ワサビのペルオキシダーゼはｐ−ハイドロオキシ　フ
ェニルプロピオン酸を基質とし、これを特異的に分解し
て最大吸収波長３２０ｎｍ、最大発光波長４０５ｎｍの
蛍光体を生成する。そこで、ハイブリダイゼイション反
応と緩衝液による洗浄を行なった後に上記の２つの基質
を加え、生成した蛍光体を核酸プローブを蛍光体で標識
する場合と同様の方法で区別した所、核酸試料にハイブ
リダイゼイションした核酸プローブの種類を知ることが
できた。すなわち、フィルタの波長の組み合わせとして
３６０ｎｍと４５０ｎｍを用いた時に３２０ｎｍと４０
５ｎ＋ｍを用いた時より強い信号が検出された場合には
、ハイブリダイゼイションした核酸プローブはβ−ガラ
クトシダーゼで標識されたものであり、フィルタの波長
の組み合わせとして３２０ｎｍと４０５ｎ＋Ｉｌを用い
た時に３６０ｎｍと４５０ｎｍを用いた時より強い信号
が検出された場合には、ハイブリダイゼイションした核
酸プローブは西洋ワサビのペルオキシダーゼで標識され
たものであることを知ることができた。同様に、この２
種類のフィルタの組み合わせで得られた信号強度が同程
度の時には、ハイブリダイゼイションしたのは両方の酵
素で各々標識された核酸プローブであることが分かった
。

なお、従来は核酸試料の濃度が低いと、核酸試料が病因
遺伝子核酸試料であっても、ハイブリダイゼイションす
る核酸プローブの量が少なく、核酸試料を正常遺伝子核
酸試料と誤判定してしまう恐れがあったが、本実施例に
よれば、２種類の核酸プローブから放出される信号量を
加算すれば、核酸試料の濃度を推定できるので、誤判定
をすることがない。また、本実施例によれば、核酸試料
が２種類の核酸試料の混合物の場合、２種類の核酸プロ
ーブから放出される信号量の比を求めれば、２種類の核
酸試料の混合比を求めることも可能である。

次に、核酸プローブのどちらか一方のみを標識する方法
について説明する。標識体は”Ｐを使用し、病因遺伝子
核酸プローブのみを標識した。ハイブリダイゼイション
反応は第１３図のようになるが、その他の反応と測定装
置は、二種類の放射性同位体で標識した場合と同様であ
る。核酸試料５が病因遺伝子核酸試料の場合には主とし
て３２ｐで標識された病因遺伝子核酸プローブ２とハイ
ブリダイゼイションする。これに対し、核酸試料５が正
常遺伝子核酸試料の場合には主として３２Ｐでは標識さ
れていない正常遺伝子核酸プローブ４とハイブリダイゼ
イションする。そこで試料からの放射線の強度を測定し
た所、核酸試料５が病因遺伝子核酸試料の場合は正常遺
伝子核酸試料の場合に比べて放射線の強度が強く検出さ
れ、両者を区別することができた。

以上の説明では、標識体として放射性同位体を用いたが
、他の標識体でも同様である。

最後に、核酸プローブのどちらか一方のみに制限酵素の
認識部位を付加する方法がある。制限酵素としては、例
えばＦｏｋｌのように認識部位と切断部位が離れたもの
を使った。Ｆｏｋｌの認識部位の塩基配列はＣＣＴＡＣ
である。第１４図に、ＦｏｋＩの認識部位を付加した病
因遺伝子核酸プローブ２を示す、この核酸プローブに病
因遺伝子核酸試料１がハイブリダイゼイシゴンすると、
第１５図の矢印の位置に切断部位ができる。

以下、第１４図の病因遺伝子核酸プローブ２を用いた検
査方法を、第１６図を用いて説明する。まず始めに、核
酸試料５と病因遺伝子核酸プローブ２と正常遺伝子核酸
プローブ４を用いて、ハイブリダイゼイション反応及び
緩衝液による洗浄を行なった。次に、制限酵素ＦｏｋＩ
を加えて、切断反応を行い、最後に、アガロースゲル電
気泳動法によって、核酸試料又は核酸プローブの長さを
求めた。

もし、核酸試料５が病因遺伝子核酸試料の場合には、Ｆ
ｏｋｌの認識部位を付加された病因遺伝子核酸プローブ
２がハイブリダイゼイションするので、Ｆｏｋｌによっ
て切断され、核酸試料と核酸プローブの長さが短くなっ
た。しかし核酸試料５が正常遺伝子核酸試料の場合には
病因遺伝子核酸プローブ２はハイブリダイゼイションせ
ず、ＦｏｋＩによって切断されないので核酸試料と核酸
プローブの長さは短くならなかった。このように、核酸
試料あるいは核酸プローブの長さを調べることにより、
核酸試料にハイブリダイゼイションした核酸プローブの
種類を知ることができた。

以上のような方法によれば、核酸試料にハイブリダイゼ
イションした核酸プローブの種類を判定し、核酸試料の
種類を求めることができた。なお、以上の説明では、核
酸試料の種類が２種類の場合を例として説明したが、３
種類以上の場合は、それに合わせて核酸プローブの種類
を増やすことで同様の効果を得た。

〔発明の効果〕

本発明によれば、類似配列による非特異的なハイブリダ
イゼイションを防ぐことができるので、精度の高い検査
結果を得ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図、第３図、第８図、第１３図及び第１６
図は、本発明の一実施例の反応系を表わす図、第４図、
第５図、第６図、第７図、第１４図及び第１５図は核酸
試料又は核酸プローブの構造を表わす図、第９図及び第
１２図は本発明の一実施例の測定装置の構成図、第１０
図及び第１１図は測定装置の出力を示す図である。 １・・・病因遺伝子核酸試料 ２・・・病因遺伝子核酸プローブ ３・・・正常遺伝子核酸試料 ４・・・正常遺伝子核酸プローブ ５・・・核酸試料　　　　　６・・・試料７・・・シン
チレータ　　　８・・・光電子増倍管９・・・アンプ １０・・・マルチチャンネルアナライザ１１・・・レー
ザ　　　　　　　１２・・・フィルタ１３・・・レンズ
　　　　　　１４・・・フィルタ１５・・・信号処理回
路　　　２０・・・判定装置２１・・・判定装置

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、核酸試料と核酸プローブのハイブリダイゼイション
   により、該核酸試料が該核酸プローブの相補塩基配列を
   有するか否かを検査する核酸検査方法において、上記プ
   ローブ及び上記核酸プローブの類似塩基配列を有する少
   なくとも一種類以上の核酸プローブを同時に上記核酸試
   料に作用させてハイブリダイゼイション反応を行なわせ
   、上記核酸試料が上記核酸プローブの相補塩基配列を有
   するか否かを検査することを特徴とする核酸検査方法。 ２、上記核酸プローブ及び該核酸プローブと類似塩基配
   列を有する核酸プローブは、いずれも互に異なる標識体
   で標識された核酸プローブである特許請求の範囲第１項
   記載の核酸検査方法。 ３、上記標識体は、互に異なる放射性同位体である特許
   請求の範囲第２項記載の核酸検査方法。 ４、上記標識体は、互に異なる蛍光体である特許請求の
   範囲第２項記載の核酸検査方法。 ５、上記標識体は、互に異なる酵素である特許請求の範
   囲第２項記載の核酸検査方法。 ６、上記標識体は、蛍光体、放射性同位体及び酵素の中
   の少なくとも二種類以上である特許請求の範囲第２項記
   載の核酸検査方法。 ７、上記核酸プローブ及び該核酸プローブと類似塩基配
   列を有する核酸プローブの一種類以上が標識体で標識さ
   れた核酸プローブである特許請求の範囲第１項記載の核
   酸検査方法。 ８、上記核酸プローブ及び該核酸プローブと類似塩基配
   列を有する核酸プローブのいずれか一種が、認識部位と
   切断部位が離れている酵素の認識部位を付加された核酸
   プローブである特許請求の範囲第１項記載の核酸検査方
   法。 ９、核酸試料と核酸プローブとのハイブリダイゼイショ
   ン反応物から放出される放射線を電気信号に変換するた
   めの手段、上記電気信号の大きさと頻度から上記放射線
   のエネルギースペクトルの濃度を検出する手段及び二種
   以上のエネルギースペクトルの濃度を比較することによ
   りいずれのエネルギースペクトルが主であるか判定する
   手段を有することを特徴とする核酸検査装置。 １０、核酸試料と核酸プローブとのハイブリダイゼイシ
   ョン反応物から放出される光を電気信号に変換するため
   の手段、上記電気信号の大きさから上記光の強度を検出
   する手段及び二種以上の波長の強度からいずれの波長が
   主であるか判定する手段を有することを特徴とする核酸
   検査装置。