JP3936689B2 - シアニン系有機色素劣化環境の検知方法 - Google Patents

Description

この出願の発明は、特定のシアニン系有機色素が劣化する環境を検知する方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明はDNAマイクロアレイ等における蛍光標識物質として頻用されている特定のシアニン系有機色素が劣化することによってDNAマイクロアレイ等における検出精度に誤差を生じさせる試験環境を事前に検知する方法と、この方法によって検知されたシアニン系有機色素劣化環境を非劣化環境に変換する方法に関するものである。

DNAマイクロアレイは、ガラス基板上に数千〜数万の遺伝子DNA（キャプチャープローブ）を高密度に配置したデバイスであり、サンプルDNAとのハイブリダイゼーションによって、遺伝子発現プロファイルや遺伝子多型をゲノムスケールで解析することを可能にしている。

DNAマイクロアレイにおけるキャプチャープローブとサンプルDNAとのハイブリダイゼーションは、サンプルDNAを蛍光標識し、キャプチャープローブとのハイブリダイゼーションによってマイクロアレイ上に残存したサンプルDNAの蛍光シグナルを共焦点レーザースキャナ等によって検出する方法が採用されている。

また、サンプルDNAとともにコントロールDNAを使用する方法や、あるいは異なる標本（組織、細胞）から得た2種類のDNAを用いて競合的ハイブリダイゼーションを行う方法も広く行われており、その場合には2種類のサンプルDNAやコントロールDNAに異なる蛍光標識を使用している（二蛍光標識法）。そして、この二蛍光標識法には、蛍光シグナル強度の異なる複数種のシアニン系有機色素（特許文献１；Cy3、Cy5またはCy7：アマシャム ファルマシア バイオテク社の登録商標）が最もよく使用されている（以上、例えば非特許文献１、２参照）。
特表2003-522333号公報 Mark Schena編（加藤郁之監訳）、「DNAマイクロアレイ」、TaKaRa社、2000年 松村正明、那波宏之監修、細胞工学別冊ゲノムサイエンスシリーズ「DNAマイクロアレイと最新PCR法」、秀潤社、2000年

DNAマイクロアレイによる検査を通常の実験室等の環境下で行う場合には、室内の粉塵がマイクロアレイに付着し、その粉塵がレーザーによって発光してしまうため、サンプルDNAの蛍光シグナルを正確に測定できない場合がある。そのため、粉塵による誤差シグナルを排除するため無塵室（クリーンルーム）内での実施が好ましく採用されている。

ところが、この出願の発明者らは、クリーンルーム内で二蛍光方式法等によりDNAマイクロアレイ検査を行った場合に、特定のシアニン系有機色素が劣化し、それ本来のシグナル強度が得られないために、劣化のないシアニン系有機色素シグナルとの比較による判定が不可能になるという問題点を見出した。

そのようなシアニン系有機色素の劣化を無視して検査を行えば、正確な結果を得ることができない。またDNAマイクロアレイ検査における蛍光シグナルの測定は、検査工程における最終段階であり、それ以前に標識化サンプルDNAの調製工程やハイブリダイゼーション工程に多大な労力、時間、費用を要しており、最終段階で測定が失敗すればそれまでに費やされた労力、時間、費用が全て無に帰してしまう。従って、検査環境がシアニン系有機色素の劣化を生じさせるものであるか否かを事前に検知することは極めて重要である。

この出願の発明は以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、二蛍光標識法でのDNAマイクロアレイ検査における特定のシアニン系有機色素劣化環境を事前に検知するための手段を提供することを課題としている。

またこの出願の発明は、検知されたシアニン系有機色素劣化環境を非劣化環境に変換する一手段を提供することを課題としてもいる。

この出願の発明は、前記の課題を解決するための第1の発明として、下記式：

（ただし、式中Ｘは同一または別異にＣＲ³Ｒ⁴を表し、Ｙは同一または別異に水素原子、炭化水素基、またはヘテロ原子を有する官能基から選択され、Ｒ¹またはＲ²はいずれか一方が活性エステル基を、他方が官能基を有してもよい炭化水素基を表し、Ｒ³およびＲ⁴は水素原子または炭化水素基であり、少なくとも一方は炭化水素基であり、ｎは２または３である）
で表される化合物またはその誘導体であるシアニン系有機色素が劣化する環境を検知する方法であって、前記のシアニン系有機色素を０．５〜２０μｍｏｌ／Ｌの範囲で含有する被験溶液を検査環境中に暴露し、この被験溶液の吸光度が減少した場合に、検査環境をシアニン系有機色素劣化環境と判定することを特徴とする方法を提供する。

この第１発明の方法においては、蛍光標識法でのＤＮＡマイクロアレイ検査のためのクリーンルームまたはクリーンブース無塵環境での検査であることや、上記の化２式において、Ｒ¹またはＲ²がｄＵＴＰ（5-Amino-propargyl-2'-deoxyuridine5'-triphosphate）またはｄＣＴＰ（5-Amino-propargyl-2'-deoxycytidine5'-triphosphate）であることを好ましい態様としている。

またこの第1発明の方法においては、暴露時間が4時間から24時間であること、暴露Cy5溶液の吸光度の減少率が25％以上である場合に、検査環境をシアニン系有機色素劣化環境と判定することをそれぞれ好ましい態様としている。

この出願は、第２の発明として、前記のいずれかの方法で検知されたシアニン系有機色素環境をシアニン系有機色素非劣化環境に変換する方法であって、環境内のエアーを吸着剤または水洗によりフィルトレーション処理することを特徴とする方法を提供する。

この第２発明の方法においては、吸着剤が活性炭であることを好ましい態様としている。

なお、この発明において「シアニン系有機色素の劣化」とは、それが本来有している強度の蛍光シグナルを発することができない状態（機能的劣化）を意味する。また、「劣化環境」とは特定のシアニン系有機色素（例えばCy5、Cy7）を機能的に劣化させる非特定物質を含む環境を言う。

なお以下の説明においては、下記の式（化３）で示されるシアニン系有機色素のうち、式中ｎ＝１のもの（例えばCy3）をＮ１色素、ｎ＝２のもの（例えばCy5）をＮ２色素、ｎ＝３のもの（例えばCy7）をＮ３色素と記載することがある。またＮ２色素およびＮ３色素をＮ２／３色素と記載することがある。

（ただし、式中Ｘは同一または別異にＣＲ³Ｒ⁴を表し、Ｙは同一または別異に水素原子、炭化水素基、またはヘテロ原子を有する官能基から選択され、Ｒ¹またはＲ²はいずれか一方が活性エステル基を、他方が官能機を有してもよい炭化水素基を表し、Ｒ³およびＲ⁴は水素原子または炭化水素基であり、少なくとも一方は炭化水素基であり、ｎは１、２または３である。）

この発明によれば、Ｎ２／３色素（例えばCy5、Cy7）を劣化させる環境を事前に検知すること、さらにはＮ２／３色素劣化環境を非劣化環境へと変換することが可能となる。これによって、好ましい環境下でのDNAマイクロアレイ検査が可能となり、正確な検査結果を得ることが可能となる。また再検査のための多大な労力、時間、費用が不要となる。さらには、この発明の方法は、DNAマイクロアレイ検査のために好ましいクリーンルーム環境を整備する際の基準をも提供する。

第1発明の方法は、Ｎ２色素またはＮ３色素を含有する被験溶液を検査環境中に暴露し、この暴露後の被験溶液の吸光度が減少した場合に、検査環境をＮ２／３色素劣化環境と判定する。

Ｎ２／３色素は以下の式（化４）で表される化合物またはその誘導体である。

（ただし、式中Ｘは同一または別異にＣＲ³Ｒ⁴を表し、Ｙは同一または別異に水素原子、炭化水素基、またはヘテロ原子を有する官能基から選択され、Ｒ¹またはＲ²はいずれか一方が活性エステル基を、他方が官能基を有してもよい炭化水素基を表し、Ｒ³およびＲ⁴は水素原子または炭化水素基であり、少なくとも一方は炭化水素基であり、ｎは２または３である。）
具体的には、式中Ｘ（ＣＲ³Ｒ⁴）は、Ｒ³がＣＨ₃、Ｒ⁴がＨの場合にはＣ（ＣＨ₃）、Ｒ³がＣＨ₃、Ｒ⁴がＣＨ₃の場合にはＣ（ＣＨ₃）₂、Ｒ³がＣＨ₃、Ｒ⁴がＣ₂Ｈ₅の場合にはＣ（ＣＨ₃）（Ｃ₂Ｈ₅）である。またＹは水素原子、メチル、エチル、プロピル、ブチル基等のアルキル基、アリール基、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、スルホン基、カルボキシル基またはアルキルカルボニル基である。さらにＲ¹またはＲ²の活性エステル基は、例えば末端にＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を有する基である。

このようなＮ２色素およびＮ３色素はそれぞれ市販品（例えばCy5およびCy7）を使用することができる。またＮ２色素としてはCy5ホスホロアミダイト（グレン リサーチ社製）、Ｎ３色素としてはヨウ化1,1',3,3,3',3'-ヘキサメチルインドトリカルボシアニン（関東化学株式会社）等を使用することもできる。さらに、例えばDNAマイクロアレイの検査環境を対象とする場合には、標識化サンプルDNAの調製に使用するCy5-dUTPまたはCy7-dUTP（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）、またはCy5-dNTPとしてCy5-dCTP（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）、Cy7-dNTPとしてCy7-dCTP（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を使用することが好ましい。また、Cy5またはCy7と結合しているｄNTPは4種類のdNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）の混合物であってもよく、そのうちの1種類であってもよい。

Ｎ２色素またはＮ３色素と混合する溶媒は、精製水、蒸留水、滅菌水または緩衝液（例えばリン酸緩衝液（pH 7.5）等）を使用することができる。色素の濃度は、0.5〜20μmol／L、好ましくは1〜10μmol／L程度とする。

このように調製した被験溶液を透明容器（例えばガラス製のシャーレ、試験管、PCRチューブ等）に入れる。被験溶液の容量は容器の種類等に応じて適宜とすることができるが、10〜100μL、好ましくは40〜60μL程度で十分である。

次いで、被験溶液を充填した容器を開口した状態で、検査環境に置き、環境に暴露させる。被験溶液を環境暴露する時間は4〜24時間、好ましくは7〜16時間程度とする。また検査環境（温度、湿度、照明の有無等）は、例えばDNAマイクロアレイ検査を実施するのと同一の条件とし、被験溶液を暴露する間で変更しないことが好ましい。

そして、環境暴露後の被験溶液の吸光度を吸光度計を用いて測定する。をその際に、環境暴露中に蒸発した溶媒量を補充し、初期容量とする。なお吸光度は、被験色素に応じたいOD値、例えばＮ２色素としてCy5を用いる場合にはOD650nm、Ｎ３色素としてCy7を用いる場合にはOD740nmを測定する。

このようにして測定した被験溶液の吸光度を、コントロール値と比較することによって吸光度の減少率を得る。コントロール値は、例えば、環境暴露前の被験溶液の吸光度、環境非暴露被験溶液（例えば容器に蓋をした状態で検査溶液と同一時間、同一環境中に置かれた被験溶液）、あるいは如何なる環境下でも機能的劣化がほとんどないＮ１色素（例えばCy3）の溶液等を使用することができる。

このような比較によって、検査環境に暴露された被験溶液の吸光度の減少率が25％以上、特に30％以上である場合には、検査環境がＮ２／３色素劣化環境であると判定する。また、Ｎ１色素溶液の吸光度をコントロールとする場合には、Ｎ１色素溶液の吸光度変化に対して、被験溶液の吸光度変化が10％以上、特に30％以上大きい場合に、検査環境がＮ２／３色素劣化環境であると判定することもできる。

次に、第2発明の方法について説明する。この方法は、Ｎ２／３色素劣化環境として検知された環境内のエアーを吸着剤または水洗によりフィルトレーション処理することによって、Ｎ２／３色素劣化環境を非劣化環境へと変換することを特徴とする。

この方法は、例えば、Ｎ２／３色素劣化環境に局所閉鎖的な空間（例えばクリーンブースなど）を設置し、この閉鎖空間に吸入するエアを吸着剤または水洗によりフィルトレーション処理することによって実施することができる。吸着剤としては、活性炭、ゼオライト、シリカゲル、活性アルミナ等を採用することができるが、特に活性炭の使用が好ましい。また水洗処理は、例えば多孔質セラミックなどのろ材を用いた接触ろ過、多層ディスク等の方法によって実施することができる。

以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。

1．試料の調製
Cy5-dUTPを10mMリン酸緩衝液（pH 7.5）溶解し、濃度1μmol/L、3.3μmol/L、10μmol/Lおよび40μmol/Lの4種類のCy5溶液を調製した。またCy3-dUTPを用いて前記と同一濃度の4種類のCy3溶液を調製した。これらの溶液をそれぞれ、0.5mL容PCRチューブに50μL充填した。
２．試験方法
各チューブを封止しない状態で、検査環境に０〜16時間放置した。検査環境は「クリーンルーム内」と「防塵設備を持たない実験室（普通環境）」とした。

所定の時間経過後、各チューブの液量をピペットマンで計測し、滅菌水を加えて初期容量（50μL）とした。この溶液の吸光度を吸光光度計によって測定した。すなわち、Cy5溶液はOD650nm、Cy3溶液はOD550nmの吸光度を測定した。
３．結果
Cy3溶液のOD550nmにおける吸光度の測定結果は表1（クリーンルーム）および表2（普通環境）のとおりである。Cy3溶液はいずれの環境下でも、試験した全ての濃度において16時間経過の後もほとんど吸光度が減少しなかった。

一方、Cy5溶液のOD650nmにおける吸光度は表3（クリーンルーム）および表4（普通環境）に示したとおりである。例えば1μmol/L濃度のCy5溶液を普通環境下に4時間放置した場合、OD650値の減少率は約20％であり、16時間放置した場合の減少率は約60％であるのに対し、同濃度のCy5溶液をクリーンルームに放置した場合、４時間後には50％、16時間後には98％もの減少が観察された。

以上の結果から、検査したクリーンルームはCy5を劣化させる環境であることが確認された。

以下、参考例として、Cy5劣化を予防する方法について例示する。

実施例１と同様の検査を、クリーンルーム内で65℃温度条件下にて実施した。結果は表5に示したとおりであり、Cy5溶液のOD650値の減少は観察されなかった。この結果から、65℃程度の高温下ではCy5の劣化が抑制されることが確認された。

クリーンブース（アズワン社製、600型、外寸法600×480×720mm）の上部にあるヘパフィルター前段部に活性炭入りフードを設置し、和光純薬製活性炭660g（活性炭層：200×200×高さ66mm）をフード内に充填した。活性炭フードの下部には、活性炭を保持するためのメッシュを付し、活性炭をフード内に保持して外気を活性炭層の中だけ透過させるようにした。実施例１でCy5劣化環境と判定されたクリーンルーム内において、このクリーンブースを流量250L／分で稼動し、その15分後に3.3μmol／L濃度のCy5溶液チューブをクリーンブース内に置いた。

その結果、クリーンブース外ではCy5溶液のOD650値が16時間後に80％減少したが、クリーンブース内ではOD650値の減少は5〜10％であった。この結果から、活性炭入りフード付きクリーンブース内ではCy5劣化が抑制されることが確認された。

実施例１でCy5劣化環境と判定されたクリーンルーム内において、水洗環境下にエアーを通過させた場合も実施例２および３と同様にCy5劣化が抑制されることが確認された。

以上詳しく説明したとおり、この出願の方法によって、Cy5を劣化させる環境を事前に検知することが可能となる。Cy5標識を用いたDNAマイクロアレイ検査等において、この事前検知は正確な検査結果を得るため、またCy5の劣化による再検査の危険性を排除する。

Claims (7)

1. 下記式：
   （ただし、式中Ｘは同一または別異にＣＲ³Ｒ⁴を表し、Ｙは同一または別異に水素原子、炭化水素基、またはヘテロ原子を有する官能基から選択され、Ｒ¹またはＲ²はいずれか一方が活性エステル基を、他方が官能基を有してもよい炭化水素基を表し、Ｒ³およびＲ⁴は水素原子または炭化水素基であり、少なくとも一方は炭化水素基であり、ｎは２または３である）
   で表される化合物またはその誘導体であるシアニン系有機色素が劣化する環境を検知する方法であって、前記のシアニン系有機色素を０．５〜２０μｍｏｌ／Ｌの範囲で含有する被験溶液を検査環境中に暴露し、この被験溶液の吸光度が減少した場合に、検査環境をシアニン系有機色素劣化環境と判定することを特徴とする方法。
2. 蛍光標識法でのＤＮＡマイクロアレイ検査のためのクリーンルームまたはクリーンブース無塵環境における請求項１の方法。
3. 化１式において、Ｒ ¹ またはＲ ² がｄＵＴＰ（5-Amino-propargyl-2'-deoxyuridine5'-triphosphate）またはｄＣＴＰ（5-Amino-propargyl-2'-deoxycytidine5'-triphosphate）である請求項１の方法。
4. 暴露時間が４時間から２４時間である請求項１の方法。
5. 被験溶液の吸光度の減少率が２５％以上である場合に、検査環境をシアニン系有機色素劣化環境と判定する請求項１の方法。
6. 請求項１から５のいずれかの方法で検知されたシアニン系有機色素劣化環境を、シアニン系有機色素非劣化環境に変換する方法であって、環境内のエアーを吸着剤または水洗によりフィルトレーション処理することを特徴とする方法。
7. 吸着剤が活性炭である請求項６の方法。