KR20150091477A

KR20150091477A - Ish 분석 결과를 선택적으로 정제하기 위한 면역염색 마스크의 사용 시스템 및 방법

Info

Publication number: KR20150091477A
Application number: KR1020157014524A
Authority: KR
Inventors: 안티 세포; 요제프 알-코파히; 더크 라이언 파드필드
Original assignee: 제너럴 일렉트릭 캄파니
Priority date: 2012-12-04
Filing date: 2013-11-05
Publication date: 2015-08-11
Also published as: EP2929505B1; CN104813366A; JP2016505823A; CA2890060A1; EP2929505A1; US9135694B2; RU2015119035A; AU2013356581A1; WO2014088744A1; SG11201504266PA; US20140153811A1; AU2013356581A2

Abstract

조직 샘플 중 생물학적 단위를 나타내는 이미지 데이터의 컴퓨터-실행 처리 방법은, 면역형광 (IF) 형태학적 마커로부터의 신호를 함유하며 IF 형태학적 마커로 염색되어 있는 조직 샘플의 제1 이미지를 수신하는 단계, 및 형광 프로브로부터의 신호를 함유하며 계내에서 형광 프로브와 혼성화되어 있는 동일한 조직 샘플의 제2 이미지를 수신하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 추가로 제1 이미지에서의 IF 형태학적 마커로부터의 평균 신호 강도를 기준으로 조직 샘플 중 각 생물학적 단위를 2개 이상의 부류 중 하나로 분류하는 단계, 제2 이미지에서의 조직 샘플의 형광 계내 혼성화 (FISH) 분석을 수행하여 그로부터 결과를 수득하는 단계, 및 FISH 분석의 결과를 필터링하여 하나의 부류로 분류되어 있는 생물학적 단위에 속하는 결과 하위세트를 산출하는 단계를 포함한다.

Description

ISH 분석 결과를 선택적으로 정제하기 위한 면역염색 마스크의 사용 시스템 및 방법 {SYSTEMS AND METHODS FOR USING AN IMMUNOSTAINING MASK TO SELECTIVELY REFINE ISH ANALYSIS RESULTS}

본 개시내용은 일반적으로 생물학적 샘플에서의 단백질 발현 및 표적 핵산 서열의 검출, 더 구체적으로는 계내 혼성화 (ISH) 분석 결과를 선택적으로 정제하기 위한 면역염색 마스크의 사용 시스템 및 방법에 관한 것이다.

형광 계내 혼성화 (FISH)를 사용하여 조직학적 절편 및 기타 세포학적 제제에서의 단백질의 분석이 수행될 수 있다. FISH는 염색체상에서 특정 DNA 서열의 존재 또는 부재를 검출 및 위치확인하기 위한 세포유전학적 기술이다. FISH는 고도의 서열 상보성을 나타내는 염색체 부분에만 결합하는 형광 프로브를 사용한다. 형광 현미경검사는 이미지에 존재하는 형광 점을 계수하는 것에 의해 형광 프로브가 염색체의 어디에 결합되는지를 찾아내는 데에 사용될 수 있다.

암종 종양 샘플에서의 FISH 분석의 경우, FISH 점 계수의 측정은 샘플 중 상피 세포와만 관련된다. 그러나, 통상적인 FISH 분석은 시야의 모든 세포에 대한 FISH 신호를 측정하는데, 정해진 세포 하위세트로 분석을 제한하는 효과적인 방법이 결핍되어 있기 때문이다. 수동 개입의 부재시, 이는 많은 비-상피 세포 (예컨대 기질 세포)가 FISH 점 계수 통계에 기여하는 것으로 이어짐으로써, 덜 정밀한 점 계수 측정치로 이어질 수 있다.

한 실시양태에 따르면, 조직 샘플 중 생물학적 단위를 나타내는 이미지 데이터의 컴퓨터-실행 처리 방법 (여기서 컴퓨터는 프로세서를 포함함)은, 프로세서에 의해, 면역형광 (IF) 형태학적 마커로부터의 신호를 함유하며 IF 형태학적 마커로 염색되어 있는 조직 샘플의 제1 이미지를 수신하는 단계, 및 프로세서에 의해, 형광 프로브로부터의 신호를 함유하며 계내에서 형광 프로브와 혼성화되어 있는 동일한 조직 샘플의 제2 이미지를 수신하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 프로세서에 의해 제1 이미지에서의 IF 형태학적 마커로부터의 평균 신호 강도를 기준으로 조직 샘플 중 각 생물학적 단위를 2개 이상의 부류 중 하나로 분류하는 단계, 프로세서에 의해 제2 이미지에서의 조직 샘플의 형광 계내 혼성화 (FISH) 분석을 수행하여 그로부터 결과를 수득하는 단계, 및 프로세서에 의해 FISH 분석의 결과를 필터링하여 상기 2개 이상의 부류 중 하나로 분류되어 있는 생물학적 단위에 속하는 결과 하위세트만을 산출하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 부류는 상피 및 비-상피 세포를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 상기 방법은 프로세서에 의해 제2 이미지에서의 형광 프로브로부터의 신호의 위치와 함께 제1 이미지에서의 IF 형태학적 마커로부터의 신호의 위치를 기록하여 기록된 이미지를 산출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 프로세서에 의해 제2 이미지를 분절화하여 제2 이미지에서의 형광 프로브로부터의 신호의 위치를 기준으로 조직 샘플 중 핵을 식별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 각 생물학적 단위는 조직 샘플 중 식별된 각 핵에 상응할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵을 분절화하는 작용은 프로세서에 의해 제2 이미지에 웨이블렛 변환을 적용하는 것을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 상기 방법은 프로세서에 의해 제2 이미지에서의 핵으로부터의 임계 거리 맵으로부터 생성되는 보로노이(Voronoi) 파티션 및 링들을 생성시키는 단계이며, 여기서 각 개별 링은 조직 샘플 중 하나의 핵만을 적어도 부분적으로 둘러싸도록 제약되는 것인 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 이미지에서 보로노이 파티션을 생성시키는 작용은 각 링에 의해 한정되는 마스크에 의해 다중화되는 보로노이 파티션의 시드로서 조직 샘플 중 식별된 핵을 사용하여 제2 이미지로부터 국소적 배경 영역을 생성시키는 것을 가능케 할 수 있다.

일부 실시양태에서, IF 형태학적 마커는 시토케라틴 (CK) 단백질을 표적으로 하도록 구성될 수 있다. 상기 방법은 오츠 임계화 방법(Otsu's thresholding method)과 연계된 임계 값을 사용하여 제1 이미지를 임계화하는 단계, 및 제1 이미지에서의 상피 영역의 최소 강도 수준을 산정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 각 생물학적 단위의 분류 변화를 관찰하면서 사용자가 쌍방향으로 임계 값을 변화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 각 핵은 핵을 둘러싸고 있는 링 내에서의 평균 시토케라틴 (CK) 강도를 계산하는 것 및 상기 평균 CK 강도를 상피 영역의 산정된 최소 강도 수준과 비교하는 것에 의해 상피 또는 비-상피로 분류될 수 있다. 일부 실시양태에서, IF 형태학적 마커는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI) 염색제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, IF 형태학적 마커는 시토케라틴 (CK) 단백질 및 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2) 단백질 중 적어도 하나를 표적으로 하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 형광 프로브는 HER2 유전자 및 염색체 17 동원체 반복부 중 적어도 하나에 결합하도록 구성될 수 있다.

한 실시양태에 따르면, 비-일시적 컴퓨터-판독가능 매체는, 컴퓨터에 의해 실행될 경우 컴퓨터가 면역형광 (IF) 형태학적 마커로부터의 신호를 함유하며 IF 형태학적 마커로 염색되어 있는 조직 샘플의 제1 이미지를 수신하도록 하고, 형광 프로브로부터의 신호를 함유하며 계내에서 형광 프로브와 혼성화되어 있는 동일한 조직 샘플의 제2 이미지를 수신하도록 하는 컴퓨터-실행가능 명령을 저장하고 있다. 상기 컴퓨터-판독가능 매체는, 컴퓨터에 의해 실행될 경우 컴퓨터가 제1 이미지에서의 IF 형태학적 마커로부터의 평균 신호 강도를 기준으로 조직 샘플 중 각 생물학적 단위를 2개 이상의 부류 중 하나로 분류하도록 하고, 제2 이미지에서의 조직 샘플의 형광 계내 혼성화 (FISH) 분석을 수행하여 그로부터 결과를 수득하도록 하며, FISH 분석의 결과를 필터링하여 상피로 분류되어 있는 생물학적 단위에 속하는 결과 하위세트만을 산출하도록 하는 컴퓨터-실행가능 명령을 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 컴퓨터-판독가능 매체는, 컴퓨터에 의해 실행될 경우 컴퓨터가 제2 이미지에서의 형광 프로브로부터의 신호의 위치와 함께 제1 이미지에서의 IF 형태학적 마커로부터의 신호의 위치를 기록하여 기록된 이미지를 산출하도록 하는 컴퓨터-실행가능 명령을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 컴퓨터-판독가능 매체는, 컴퓨터에 의해 실행될 경우 컴퓨터가 제2 이미지를 분절화하여 제2 이미지에서의 형광 프로브로부터의 신호의 위치를 기준으로 조직 샘플 중 핵을 식별하도록 하는 컴퓨터-실행가능 명령을 추가로 포함할 수 있다.

한 실시양태에 따르면, 조직 샘플 중 생물학적 단위를 나타내는 이미지 데이터의 처리 시스템은 프로세서, 프로세서와 전기 통신하며 이미지 데이터를 수신하도록 구성되는 입력장치, 및 프로세서와 전기 통신하는 메모리를 포함한다. 상기 메모리는, 프로세서에 의해 실행될 경우 프로세서가 면역형광 (IF) 형태학적 마커로부터의 신호를 함유하며 IF 형태학적 마커로 염색되어 있는 조직 샘플의 제1 이미지를 수신하도록 하고, 형광 프로브로부터의 신호를 함유하며 계내에서 형광 프로브와 혼성화되어 있는 동일한 조직 샘플의 제2 이미지를 수신하도록 하고, 제1 이미지에서의 IF 형태학적 마커로부터의 평균 신호 강도를 기준으로 조직 샘플 중 각 생물학적 단위를 2개 이상의 부류 중 하나로 분류하도록 하고, 제2 이미지에서의 조직 샘플의 형광 계내 혼성화 (FISH) 분석을 수행하여 그로부터 결과를 수득하도록 하고, FISH 분석의 결과를 필터링하여 상기 2개 이상의 부류 중 하나로 분류되어 있는 생물학적 단위에 속하는 결과 하위세트만을 산출하도록 하는 컴퓨터-실행가능 명령을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 부류는 상피 및 비-상피 세포를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 메모리는, 프로세서에 의해 실행될 경우 프로세서가 제2 이미지에서의 형광 프로브로부터의 신호의 위치와 함께 제1 이미지에서의 IF 형태학적 마커로부터의 신호의 위치를 기록하여 기록된 이미지를 산출하도록 하는 컴퓨터-실행가능 명령을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 메모리는, 프로세서에 의해 실행될 경우 프로세서가 제2 이미지를 분절화하여 제2 이미지에서의 형광 프로브로부터의 신호의 위치를 기준으로 조직 샘플 중 핵을 식별하도록 하는 컴퓨터-실행가능 명령을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 각 생물학적 단위는 조직 샘플 중 식별된 각 핵에 상응할 수 있다.

일부 실시양태에서, 메모리는, 프로세서에 의해 실행될 경우 프로세서가 제2 이미지에 웨이블렛 변환을 적용하여 조직 샘플 중 핵을 분절화하도록 하는 컴퓨터-실행가능 명령을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 메모리는, 프로세서에 의해 실행될 경우 프로세서가 제2 이미지에서의 핵으로부터의 임계 거리 맵으로부터 생성되는 보로노이 파티션 및 링들을 생성시키도록 하며, 여기서 각 개별 링은 조직 샘플 중 하나의 핵만을 적어도 부분적으로 둘러싸도록 제약되는 것인 컴퓨터-실행가능 명령을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 메모리는, 프로세서에 의해 실행될 경우 프로세서가 각 링에 의해 한정되는 마스크에 의해 다중화되는 보로노이 파티션의 시드로서 조직 샘플 중 식별된 핵을 사용하여 제2 이미지로부터 국소적 배경 영역을 생성시키도록 하는 컴퓨터-실행가능 명령을 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, IF 형태학적 마커는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI) 염색제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, IF 형태학적 마커는 시토케라틴 (CK) 단백질 및 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2) 단백질 중 적어도 하나를 표적으로 하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 형광 프로브는 HER2 유전자 및 염색체 17 동원체 반복부 중 적어도 하나에 결합하도록 구성될 수 있다.

하기에서는, 실시양태의 특징 및 측면들을 기술하는 데에 첨부 도면을 참조하는 바, 그의 요소들이 반드시 스케일에 맞게 도시되어 있는 것은 아니다.
도 1은 한 실시양태에 따라 조직 샘플 중 생물학적 단위를 나타내는 이미지 데이터를 처리하기 위한 프로세스의 한 예의 블록도이다.
도 2는 예시적인 DAPI 이미지를 도시한다.
도 3은 예시적인 시토케라틴 이미지를 도시한다.
도 4는 한 실시양태에 따라 핵이 분절화되어 있는 도 2 DAPI 이미지의 한 예를 도시한다.
도 5는 한 실시양태에 따라 상응하는 영향 구역을 가지는 각 분절화된 핵 주변의 링을 보여주는 도 4 DAPI 이미지의 한 예를 도시한다.
도 6은 한 실시양태에 따른 처리 후의 예시적인 중첩 이미지를 도시한다.
도 7은 한 실시양태에 따라 조직 샘플 중 생물학적 단위를 나타내는 이미지 데이터를 처리하기 위한 프로세스의 한 예의 흐름도이다.
도 8은 한 실시양태에 따른 예시적인 컴퓨터처리 시스템을 도시한다.
도 9는 한 실시양태에 따른 예시적인 네트워크 환경을 도시한다.

예시적인 실시양태들은 FISH 분석 결과의 정밀한 자동화된 컴퓨터처리를 가능케 하도록 동일한 생물학적 시편의 면역형광 (IF) 염색 및 형광 계내 혼성화 (FISH) 염색 이미지들로부터의 정보를 조합하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다.

정의

청구 발명의 주제를 더 명확하고 간결하게 기술 및 표현하기 위하여 하기의 정의가 특정 용어들에 대하여 제공되는 바, 하기 상세한 설명 및 첨부된 청구범위에 사용된다.

단수 형태는 문맥상 분명하게 다르게 제시되지 않는 한, 복수의 언급도 포함한다. 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 본원에서 사용될 때의 개산형 용어는 그것이 관련되어 있는 기본적인 기능의 변화를 초래하지 않으면서도 가변성을 허용할 수 있는 임의의 양적 표현을 수식하는 데에 적용될 수 있다. 따라서, "약"과 같은 용어에 의해 수식되는 값이 정확한 열거 값으로 제한되어서는 아니 된다. 다르게 표시되지 않는 한, 명세서 및 청구범위에서 사용되는 성분, 특성 예컨대 분자량, 반응 조건 등의 양을 표현하는 모든 수는 모든 경우에 있어서 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 다르게 표시되지 않는 한, 하기의 명세서 및 첨부된 청구범위에서 제시되는 숫자 파라미터들은 본 발명이 수득하고자 하는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사값이다. 적어도 각 숫자 파라미터는 최소한 기록되는 유효 숫자의 수 관점에서 일반적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다.

본원에서 사용될 때, "결합제"라는 용어는 생물학적 샘플 중 하나 이상의 표적에 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 결합제는 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 적합한 결합제에는 자연형이거나 변형된 펩티드, 단백질 (예를 들어 항체, 아피바디 또는 압타머), 핵산 (예를 들어 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA 또는 압타머); 폴리사카라이드 (예를 들어 렉틴, 당), 지질, 효소, 효소 기질 또는 억제제, 리간드, 수용체, 항원 또는 합텐 중 하나 이상이 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 분석될 샘플 및 검출에 이용가능한 표적에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 샘플 중 표적은 리간드를 포함하고 결합제는 수용체를 포함할 수 있거나, 또는 표적은 수용체를 포함하고 결합제는 리간드를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 표적은 항원을 포함하고 결합제는 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있거나, 또는 그 반대일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적이 핵산을 포함하고 결합제는 상보성 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적과 결합제 모두가 서로 결합할 수 있는 단백질을 포함할 수 있다.

본원에서 사용될 때, "생물학적 샘플"이라는 용어는 생체내 또는 시험관내에서 수득된 생물학적 조직 또는 유체 기원의 샘플을 포함하여, 생물학적 대상체로부터 수득됨 샘플을 지칭한다. 이와 같은 샘플은 인간을 포함한 포유동물로부터 단리된 체액 (예를 들어 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변), 기관, 조직, 분획 및 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 생물학적 샘플에는 조직을 포함한 생물학적 샘플의 절편 (예를 들어 기관 또는 조직의 절편 부분)도 포함될 수 있다. 생물학적 샘플에는 또한 생물학적 샘플로부터의 추출물, 예를 들어 생물학적 유체 (예를 들어 혈액 또는 소변)로부터의 항원이 포함될 수 있다.

생물학적 샘플은 원핵생물 기원 또는 진핵생물 기원 (예를 들어 곤충, 원생동물, 조류, 어류, 파충류)의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 포유동물 (예를 들어 래트, 마우스, 소, 개, 당나귀, 기니 피그 또는 토끼)이다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 영장류 기원 (예를 들어 침팬지 또는 인간)의 것이다.

본원에서 사용될 때, "프로브"라는 용어는 결합제 및 표지, 예컨대 신호 발생기 또는 효소를 가지는 작용제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 결합제 및 표지 (신호 발생기 또는 효소)는 단일의 것으로 구현된다. 결합제 및 표지는 직접적으로 (예를 들어 결합제에 통합되어 있는 형광 분자를 통함) 또는 간접적으로 (예를 들어 절단 부위를 포함할 수 있는 링커를 통함) 결합됨으로써, 단일 단계로 생물학적 샘플에 적용될 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 결합제 및 표지는 별개의 것 (예를 들어 표적에 결합할 수 있는 일차 항체와 상기 일차 항체에 결합할 수 있는 효소 또는 신호 발생기-표지된 이차 항체)으로 구현된다. 결합제와 표지 (신호 발생기 또는 효소)가 별도의 것인 경우, 그들은 단일 단계 또는 다중 단계로 생물학적 샘플에 적용될 수 있다. 본원에서 사용될 때, "형광 프로브"라는 용어는 형광 신호 발생기에 커플링된 결합제를 가지는 작용제를 지칭한다.

본원에서 사용될 때, "신호 발생기"라는 용어는 하나 이상의 검출 기술 (예를 들어 분광측정법, 열량측정법, 분광분석법 또는 시각적 검사)을 사용하여 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 분자를 지칭한다. 검출가능한 신호의 적합한 예에는 광학 신호, 전기 신호 또는 방사성 신호가 포함될 수 있다. 신호 발생기의 예에는 발색단, 형광단, 라만(Raman)-활성 태그 또는 방사성 표지 중 하나 이상이 포함된다. 프로브와 관련하여 상기에서 언급된 바와 같이, 신호 발생기 및 결합제는 일부 실시양태에서 단일의 것 (예를 들어 형광 표지를 가지고 있는 표적 결합 단백질)으로 존재할 수 있다. 대안적으로, 결합제 및 신호 발생기는 샘플에의 도입 전 또는 도입시에 서로 결합되는 별개의 것 (예를 들어 수용체 단백질과 그 특정 수용체 단백질에 대한 표지된-항체)일 수 있다.

본원에서 사용될 때, "형광단" 또는 "형광 신호 발생기"라는 용어는 특정 파장의 광에의 노출에 의해 여기될 경우 상이한 파장에서 광을 방출하는 화합물을 지칭한다. 형광단은 그의 방출 프로파일, 또는 "색상"의 관점에서 기술될 수 있다. 녹색 형광단 (예를 들어 Cy3, FITC 및 오레곤 그린)은 일반적으로 515-540 나노미터 범위인 파장에서의 그의 방출을 특징으로 할 수 있다. 적색 형광단 (예를 들어 텍사스 레드, Cy5 및 테트라메틸로다민)은 일반적으로 590-690 나노미터 범위인 파장에서의 그의 방출을 특징으로 할 수 있다. 형광단의 예에는 4-아세트아미도-4'-이소티오시아네이토스틸벤-2,2'디술폰산, 아크리딘, 아크리딘 및 아크리딘 이소티오시아네이트의 유도체, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-술폰산 (EDANS), 4-아미노-N-[3-비닐술포닐)페닐]나프탈이미드-3,5 디술포네이트 (루시페르 옐로우 VS), N-(4-아닐리노-1-나프틸)말레이미드, 안트라닐아미드, 브릴리안트 옐로우, 쿠마린, 쿠마린 유도체, 7-아미노-4-메틸쿠마린 (AMC, 쿠마린 120), 7-아미노-트리플루오로메틸쿨루아린 (쿠마란 151), 시아노신; 4',6-디아미니디노-2-페닐인돌 (DAPI), 5',5"-디브로모피로갈롤-술폰프탈레인 (브로모피로갈롤 레드), 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아네이토페닐)4-메틸쿠마린, -, 4,4'-디이소티오시아네이토디히드로-스틸벤-2,2'-디술폰산, 4,4'-디이소티오시아네이토스틸벤-2,2'-디술폰산, 5-[디메틸아미노]나프탈렌-1-술포닐 클로라이드 (DNS, 단실 클로라이드), 에오신, 에오신의 유도체 예컨대 에오신 이소티오시아네이트, 에리트로신, 에리트로신의 유도체 예컨대 에리트로신 B 및 에리트로신 이소티오시아네이트; 에티디움; 플루오레세인 및 유도체 예컨대 5-카르복시플루오레세인 (FAM), 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일)아미노플루오레세인 (DTAF), 2'7'-디메톡시-4'5'-디클로로-6-카르복시플루오레세인 (JOE), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), QFITC (XRITC); 플루오레스카민 유도체 (아민과의 반응시 형광); IR144; IR1446; 말라카이트 그린 이소티오시아네이트; 4-메틸움벨리페론; 오르토 크레졸프탈레인; 니트로티로신; 파라로스아닐린; 페놀 레드, B-피코에리트린; o-프탈디알데히드 유도체 (아민과의 반응시 형광); 피렌 및 유도체 예컨대 피렌, 피렌 부티레이트 및 숙신이미딜 1-피렌 부티레이트; 리액티브 레드 4 (시바크론 .RTM. 브릴리안트 레드 3B-A), 로다민 및 유도체 예컨대 6-카르복시-X-로다민 (ROX), 6-카르복시로다민 (R6G), 리싸민 로다민 B 술포닐 클로라이드, 로다민 (Rhod), 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X 이소티오시아네이트, 술포로다민 B, 술포로다민 101 및 술포로다민 101의 술포닐 클로라이드 유도체 (텍사스 레드); N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민 (TAMRA); 테트라메틸 로다민, 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트 (TRITC); 리보플라빈; 로솔산 및 라타니드 킬레이트 유도체, 양자점, 시아닌, 피렐륨 염료 및 스쿠아레인이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에서 사용될 때, "계내"라는 용어는 일반적으로 원래의 위치, 예를 들어 무손상 기관 또는 조직, 또는 기관 또는 조직의 대표적인 분절에서 이루어지는 사건을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 생물체, 기관, 조직 샘플 또는 세포 배양물을 포함한 다양한 공급원으로부터 유래하는 세포에서 표적의 계내 분석이 수행될 수 있다. 계내 분석은 표적이 그의 원래의 부위로부터 이탈될 경우 상실될 수 있는 전후관계 정보를 제공한다. 따라서, 표적의 계내 분석은 표적-결합된 프로브가 세포 내에서 유지되는 경우, 세포 막이 완전히 무손상인지 또는 부분적으로 무손상인지에 관계없이, 전체 세포 또는 조직 샘플 내에 위치된 표적-결합된 프로브의 분석을 말한다. 또한, 본원에서 개시되는 방법은 고정되거나 고정되지 않은 세포 또는 조직 샘플 내 계내에서 표적을 분석하는 데에 사용될 수 있다.

본원에서 사용될 때, "조사" 또는 "조사하다"라는 용어는 샘플 또는 용액을 비-이온화 방사선에 노출시키는 작용 또는 과정을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 비-이온화 방사선은 350 nm 내지 1.3 ㎛ 사이의 파장을 가진다. 바람직한 실시양태에서, 비-이온화 방사선은 파장 400-700 nm의 가시 광선이다. 조사는 특정 파장 또는 파장 범위의 방사선을 방출할 수 있는 방사선 공급원, 예를 들어 램프에 샘플 또는 용액을 노출시키는 것에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조사의 결과로서, 광여기를 겪을 수 있는 분자가 광여기된다. 일부 실시양태에서, 광여기를 겪을 수 있는 상기 분자는 신호 발생기, 예를 들어 형광 신호 발생기이다. 일부 실시양태에서, 형광 신호 발생기의 조사가 형광 신호 발생기와 신호 불활성화 작용제 사이의 광반응을 개시한다. 일부 실시양태에서, 조사는 광활성화된 화학적 표백에 의해 신호 발생기를 실질적으로 불활성화하는 광반응을 개시한다. 다른 실시양태에서, 신호 불활성화 작용제가 광여기를 겪음으로써, 신호 발생기와 반응하여 신호를 불활성화하는 반응성 모이어티를 생성시킨다. 특정 파장 또는 파장 범위로 샘플 또는 용액의 조사를 제한하는 데에는 광학 필터가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 광학 필터는 광여기를 겪을 수 있는 하나 이상 분자의 선택적 광여기를 위해 좁은 파장 범위로 조사를 제한하는 데에 사용될 수 있다.

본원에서 사용될 때, "선택적 광여기"라는 용어는 조사 후 바닥 전자 상태로 유지되는 광여기를 겪을 수 있는 하나 이상의 다른 분자 존재하에 광여기를 겪을 수 있는 하나 이상의 분자가 광여기되는 작용 또는 과정을 지칭한다.

일부 실시양태에서, 광여기를 겪을 수 있는 분자는 형광 염료, 예를 들어 시아닌 염료이다. 추가적인 한 실시양태에서, 620-680 nm 사이 파장 범위로 제한되는 조사가 Cy5 염료의 선택적 광여기에 사용된다. 대안적인 실시양태에서, 특정 파장에서의 샘플의 조사가 레이저를 사용하여 수행될 수도 있다.

예시적인 실시양태의 일반적 기술

한 실시양태에서, IF 마커를 사용하여 생물학적 시편에서의 세포 유형 (예를 들어 상피 또는 비-상피)의 결정이 자동화될 수 있는데, 여기에서는 IF 신호의 강도가 주어진 시편 중 세포가 관심대상인지 여부를 정한다. IF 및 FISH 마커를 함유하는 이미지는 반복 분석 기술에 의해 다중화될 수 있으며, 각 세포는 그의 유형 (예를 들어 상피 또는 비-상피)에 의해 자동으로 분류될 수 있다. 이는 정밀하고 완전히 자동화된 계수 통계를 위하여 FISH 분석이 관심 세포 (예를 들어 상피 세포)로 제한되는 것을 가능케 한다. IF 및 FISH가 상호 배타적인 기술이기는 하지만, 이들이 동시에 또는 순차적으로 수행될 수는 있다. 개별 샘플을 반복적으로 분석하는 방법에 대해서는 예를 들어 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 7,629,125 및 미국 특허 번호 7,741,046에 기술되어 있다.

도 1은 한 실시양태에 따라 FISH 결과를 선택적으로 정제하기 위한 프로세스의 한 예를 보여주는 블록도이다. 프로세스에의 입력치는 FISH 염색 세트로부터의 염색된 DAPI 이미지, 및 IF 염색 단계로부터의 CK 및/또는 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (Her2) IF 이미지이다. 일부 실시양태는 인간 종양의 표준 로프말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 샘플용으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 유방암 샘플이 사용될 수 있다. 이와 같은 예에서, 샘플은 4 마이크로미터의 얇은 절편으로 절단되어, 현미경 슬라이드상에 그것이 위치된 후, 통상적인 방법을 사용하여 면역염색용으로 처리된다.

첫 번째 염색 단계에서는, 시토케라틴 (CK) 및/또는 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (Her2)에 대한 면역형광 (IF) 염색은 물론, DAPI 염색이 수행되어, 상응하는 형광 이미지가 기록된다. 다음에, 슬라이드는 Her2 및 CEP17 FISH에 대하여 염색되고, DAPI 염색된 다음, IF 염색에서와 동일한 위치에서 이미지화된다. 이와 같은 프로세스는 정확하게 동일한 샘플 중 세포의 이미지 두 세트를 산출한다. 한 이미지 세트는 상응하는 DAPI, CK 및 Her2 IF 신호 (입력 (110)으로 표시)를 포함하며, 다른 이미지 세트는 상응하는 DAPI, Her2 FISH 및 CEP17 FISH 신호 (입력 (120)으로 표시)를 포함한다. 도 2는 예시적인 DAPI 이미지를 도시하며, 도 3은 상응하는 시토케라틴 이미지를 도시한다. 다음에는, 해당 각 DAPI 신호를 사용하여 IF 및 FISH 이미지화 단계가 기록되고 ((130)으로 표시), 신호를 분절화 (140), 분류 (150) 및 측정 (160)하기 위하여 이미지 분석 알고리즘이 사용된다. 프로세스의 출력치는 (예를 들어 결과로부터 비-상피 세포를 제거하기 위하여) 이미지에서의 세포 분류에 따라 필터링된 분석 결과를 포함한다.

세포의 분류 (예를 들어 상피 또는 피-상피로의 것)는 웨이블렛 분절화 기술에 이어지는 연접 핵을 분리하는 단계를 사용하여, DAPI 이미지에서 핵을 분절화하는 것으로 시작할 수 있다. 분절화된 핵에 거리 변환을 적용하는 것 및 이와 같은 거리를 임계화하는 것은 도 4에 도시되어 있는 바와 같은 세포질의 영향 구역을 개략화하는 각 핵 주변의 링 세트로 이어지게 된다. 각 핵에 대한 고유한 세포질 링을 생성시키고 이러한 링들이 다른 핵과 중복되는 것 (올바르지 않은 측정 영역으로 이어질 수 있음)을 방지하기 위하여, 보로노이 파티션이 링의 영향 구역을 제약하는 데에 사용될 수 있다. 이는 예를 들어 링에 의해 생성되는 마스크에 의해 다중화되는 시드로서 핵 분절화를 사용하는 분수령 분절화에 의해 수행될 수 있다. 다음에, 평균 강도 값을 임계 값에 비교함으로써 세포가 상피인지 아닌지를 측정하기 위하여, 이러한 제약된 링에서 IF 채널의 평균 강도가 측정될 수 있다. 도 5에 도시되어 있는 바와 같이, 보로노이 파티션화의 결과는, 단리된 세포는 그 주변으로 완전한 링을 가지는 반면, 가까이 밀집된 세포는 제약된 영역을 가진다는 것이다. 다음에는, FISH 점 계수 알고리즘 (160, 170)을 사용하여 모든 세포상의 FISH 신호가 처리될 수 있다. FISH 점 계수 알고리즘 (160, 170)으로부터의 결과는 상피/비-상피 분류에 따라 필터링됨으로써 (180), 상피 세로로부터의 FISH 분석만을 산출할 수 있다. 도 6은 상기한 예시적인 프로세스를 사용한 처리 후의 각각 도 2 및 3의 DAPI 및 시토케라틴 이미지 중첩의 한 예를 도시한다.

또 다른 실시양태에서, IF 이미지가 시토케라틴 (CK) 마커를 함유하며, 제1 이미지에서의 상피 영역의 최소 강도 수준을 산정하기 위하여 오츠 임계화 방법을 사용하여 임계화될 수 있다. 각 핵은 핵을 둘러싸고 있는 링 내에서의 평균 시토케라틴 (CK) 강도를 계산하는 것 및 상기 평균 CK 강도를 상피 영역의 산정된 최소 강도 수준과 비교하는 것에 의해 상피 또는 비-상피로 분류될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 예를 들어 상피 대 비-상피 세포 분류의 변화를 관찰하면서 사용자가 쌍방향으로 임계 값을 변화시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 사용자가 문제의 이미지를 나타내는 상피 영역을 선택하는 것을 가능케 하고, 사용자가 포함된 영역에 대한 강도 임계 값을 변화시키는 "슬라이더"를 이용하여 선택을 변형시키는 것을 가능케 하는 쌍방향 기구가 제공된다.

도 7은 한 실시양태에 따른 이미지 분석 프로세스 (700)의 한 예인 흐름도이다. 단계 (702)에서는, 예를 들어 프로세서에 의해, IF 형태학적 마커로부터의 신호를 함유하는 조직 샘플의 제1 이미지가 수신된다. 단계 (704)에서는, 형광 프로브로부터의 신호를 함유하는 동일한 조직 샘플의 제2 이미지가 수신된다. 상기 조직 샘플은 예를 들어 형광 프로브와 계내에서 혼성화될 수 있다.

단계 (706)에서는, 제1 이미지의 각 생물학적 단위가 2개 이상의 부류, 예를 들어 상피 및 비-상피 중 하나로 분류된다. 단계 (708)에서는, 제2 이미지를 사용하여 FISH 분석이 수행된다. 단계 (710)에서는, FISH 분석의 결과가 각 생물학적 단위의 분류에 따라 필터링된다. 예를 들어, 상피로 분류된 세포에 속하는 결과만이 보존될 수 있으며, 반면 다른 세포에 속하는 결과는 폐기될 수 있다.

일부 실시양태에서, 제2 이미지의 핵이 분절화된 후에 분류 단계 (706)가 수행될 수 있다. 분절화는 먼저 제2 이미지에서의 신호의 위치와 함께 제1 이미지에서의 신호의 위치를 기록하는 것 (단계 (712))에 의해 수행될 수 있다. 이와 같은 기록은 세포와 관련하여 제1 이미지 및 제2 이미지가 정렬되는 것을 가능케 한다. 단계 (714)에서는, 제2 이미지에 적용되는 웨이블렛 변환을 사용하여 핵이 분절화될 수 있다. 단계 (716)에서는, 분절화된 핵으로부터의 임계 거리 맵으로부터 보로노이 파티션 및 링이 생성된다. 도 1과 관련하여 상기한 바와 같이 단계 (706)에서 수행되는 분류를 용이하게 하기 위하여, 상기 링은 적어도 부분적으로 하나의 핵만을 둘러싸도록 제약될 수 있다. 보로노이 파티션은 각 링에 의해 한정되는 마스크에 의해 다중화되는 파티션의 시드로서 핵을 사용하여 제2 이미지에 국소적 배경 영역을 생성시키는 것을 가능케 한다.

다른 예시적인 실시양태

일부 실시양태에서, 생물학적 시편은 고체 지지체에 고정된 다수의 표적을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 시편에는 조직 샘플, 전세포, 세포 구성성분, 세포원심분리물 또는 세포 도말이 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 시편에는 조직 샘플 또는 조직 성분이 포함될 수 있다. 상기 조직 샘플에는 유사한 기능을 가질 수 있는 생물학적 대상체의 조직으로부터 수득된 유사한 세포의 모음이 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플이 인간의 조직으로부터 수득된 유사한 세포의 모음을 포함할 수 있다. 인간 조직의 적합한 예에는 (1) 상피; (2) 혈관, 골 및 연골을 포함한 결합 조직; (3) 근육 조직; 및 (4) 신경 조직이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 조직 샘플의 공급원은 신선한 것이거나, 냉동된 것이거나 및/또는 보존된 것인 기관 또는 조직 샘플 또는 생검물 또는 흡인물로부터 수득된 고체 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성성분; 뇌척수액, 양수, 복수 또는 간질액과 같은 체액; 또는 대상체의 임신 또는 발생의 임의의 시점에서의 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플에는 일차 또는 배양 세포, 순환성 질환 또는 정상 세포, 감염원에 반응하는 활성화된 백혈구, 또는 세포주가 포함될 수 있다.

일부 실시양태에서, 생물학적 시편에는 건강하거나 이환된 조직 샘플로부터의 조직 절편 (예를 들어 결장, 유방 조직, 전립선으로부터의 조직 절편)이 포함된다. 조직 절편에는 조직 샘플의 단일 부분 또는 조각, 예를 들어 얇은 조직 슬라이스, 또는 조직 샘플로부터 절단된 세포가 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수의 조직 샘플 절편, 예를 들어 조직 마이크로어레이가 채취되어, IF 및 FISH에 의한 분석에 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 동일한 조직 샘플 절편이 형태학적 및 분자 수준 모두에서 분석될 수 있다. 생물학적 샘플로 사용될 경우, 조직 절편은 약 100 마이크로미터 미만인 범위, 약 50 마이크로미터 미만인 범위, 약 25 마이크로미터 미만인 범위, 또는 약 10 마이크로미터 미만인 범위의 두께를 가질 수 있다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플 또는 생물학적 샘플 중 표적은 고체 지지체에 고정될 수 있다. 고체 지지체에는 마이크로어레이 (예를 들어 DNA 또는 RNA 마이크로어레이), 겔, 블롯, 유리 슬라이드, 비드 또는 ELISA 플레이트가 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플 또는 생물학적 샘플 중 표적은 나일론, 니트로셀룰로스 및 폴리비닐리덴 디플루오라이드에서 선택되는 막에 고정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체는 폴리스티렌, 폴리카르보네이트 및 폴리프로필렌에서 선택되는 플라스틱 표면을 포함할 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에 따른 생물학적 샘플은 고체 또는 액체일 수 있다. 생물학적 샘플의 적합한 예에는 배양물, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 뇌척수액, 흉수, 젖, 림프, 가래, 정액, 소변, 대변, 눈물, 타액, 바늘 흡인물, 피부의 외부 절편, 기도, 장관로 및 비뇨생식관, 종양, 기관, 세포 배양물 또는 세포 배양물 구성성분, 또는 고체 조직 절편이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 그대로, 즉 관심 표적의 수확 및/또는 단리 없이 분석될 수 있다.

생물학적 샘플에는 비제한적으로 냉동되거나, 염색되거나, 또는 다르게 처리되는 것과 같은 그의 물리적 상태에 관계없이, 상기 언급된 샘플들 중 어느 것이 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 보존제, 항응고제, 완충제, 고정제, 영양소, 항생제 등과 같이, 자연에서는 샘플과 자연적으로 혼합되지 않는 화합물을 포함할 수 있다.

샘플은 냉동된 조직 절편 또는 파라핀 포매 샘플일 수 있다. 파라핀 샘플은 예를 들어 파라포름알데히드에 생물학적 샘플이 미리 고정된 후 이어서 왁스에 포매된 샘플을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 먼저 고정된 다음, 상향 일련의 알콜을 통하여 탈수되고, 침윤된 후, 조직 샘플이 절편화될 수 있도록 파라핀 또는 기타 절편화 매체를 사용하여 포매될 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 조직 샘플은 절편화되고, 이어서 고정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 포매된 후, 파라핀 중에서 처리될 수 있다. 사용될 수 있는 파라핀의 예에는 파라플라스트(Paraplast), 브롤로이드(Broloid) 및 티슈메이(Tissuemay)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일단 조직 샘플이 포매되고 나면, 샘플은 마이크로톰에 의해 약 3 마이크로미터 내지 약 5 마이크로미터 범위의 두께를 가질 수 있는 절편으로 절편화될 수 있다. 일단 절편화되고 나면, 절편은 접착제를 사용하여 슬라이드에 접착될 수 있다. 슬라이드 접착제의 예에는 실란, 젤라틴, 폴리-L-리신이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 실시양태에서, 파라핀이 포매 재료로 사용되는 경우, 조직 절편은 수중에서 탈파라핀화 및 재수화될 수 있다. 조직 절편은 예를 들어 크실렌 및 점차적 하향 일련의 알콜, 또는 세척제와 같은 유기 작용제를 사용하여 탈파라핀화될 수 있다.

일부 실시양태에서, 상기에서 논의된 샘플 제조 절차 이외에도, 계내 혼성화 및/또는 면역조직화학 전, 동안 또는 후에 조직 절편이 추가적인 처리에 적용될 수 있다. 예를 들어 일부 실시양태에서, 조직 절편은 시트레이트 완충제 중에서의 조직 샘플의 가열과 같은 에피토프 복구법에 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조직 절편이 임의로 임의의 비-특이적 결합을 최소화하기 위한 차단 단계에 적용될 수 있다.

분석될 표적의 적합성은 생물학적 샘플에 필요한 분석의 유형 및 특성에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적은 생물학적 샘플 중 분석물의 존재 또는 부재에 대한 정보를 제공할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 표적은 생물학적 샘플의 상태에 대한 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플이 조직 샘플을 포함하고 있는 경우, 본원에서 개시되는 방법은 상이한 유형의 세포 또는 조직들을 비교하는 것, 상이한 발생 단계들을 비교하는 것, 질환 또는 이상의 존재를 검출하는 것, 또는 질환 또는 이상의 유형을 결정하는 것을 도울 수 있는 표적을 검출하는 데에 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플 중 표적은 펩티드, 단백질 (예를 들어 항체, 아피바디 또는 압타머), 핵산 (예를 들어 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA 또는 압타머); 폴리사카라이드 (예를 들어 렉틴 또는 당), 지질, 효소, 효소 기질, 리간드, 수용체, 항원 또는 합텐 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적은 본질적으로 단백질 또는 핵산을 포함할 수 있다. 상기 언급된 표적들 중 하나 이상은 특정 세포의 특징일 수 있는 반면, 다른 표적은 특정 질환 또는 상태와 관련될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 방법을 사용하여 검출 및 분석될 수 있는 표적에는 예후 표적, 호르몬 또는 호르몬 수용체 표적, 림프 표적, 종양 표적, 세포 주기 관련 표적, 신경 조직 및 종양 표적, 또는 클러스터 분화 표적이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예후 표적의 적합한 예에는 효소 표적 예컨대 갈락토실 트랜스퍼라제 II, 뉴런 특이적 에놀라제, 양성자 ATPase-2 또는 산 포스파타제가 포함될 수 있다.

호르몬 또는 호르몬 수용체 표적의 적합한 예에는 인간 융모막성 고나도트로핀 (HCG), 부신피질자극 호르몬, 암종배아 항원 (CEA), 전립선-특이적 항원 (PSA), 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 안드로겐 수용체, gC1q-R/p33 보체 수용체, IL-2 수용체, p75 뉴로트로핀 수용체, PTH 수용체, 갑상선 호르몬 수용체 또는 인슐린 수용체가 포함될 수 있다.

림프 표적의 적합한 예에는 알파-1-항키모트립신, 알파-1-항트립신, B 세포 표적, bcl-2, bcl-6, B 림프구 항원 36 kD, BM1 (골수양 표적), BM2 (골수양 표적), 갈렉틴-3, 그란자임 B, HLA 부류 I 항원, HLA 부류 II (DP) 항원, HLA 부류 II (DQ) 항원, HLA 부류 II (DR) 항원, 인간 호중구 데펜신, 이뮤노글로불린 A, 이뮤노글로불린 D, 이뮤노글로불린 G, 이뮤노글로불린 M, 카파 경쇄, 카파 경쇄, 람다 경쇄, 림프구/조직구 항원, 대식세포 표적, 무라미다제 (리소자임), p80 역형성 림프종 키나제, 혈장 세포 표적, 분비 백혈구 프로테아제 억제제, T 세포 항원 수용체 (JOVI 1), T 세포 항원 수용체 (JOVI 3), 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 또는 비클러스터화 B 세포 표적이 포함될 수 있다.

종양 표적의 적합한 예에는 알파 태아단백질, 아포지질단백질 D, BAG-1 (RAP46 단백질), CA19-9 (시알릴 루이사), CA50 (암종 관련 뮤신 항원), CA125 (난소암 항원), CA242 (종양 관련 뮤신 항원), 크로모그라닌 A, 클러스터린 (아포지질단백질 J), 상피 막 항원, 상피-관련 항원, 상피 특이적 항원, 조대 낭성 질환 유체 단백질-15, 간세포 특이적 항원, 헤레굴린, 인간 위 뮤신, 인간 젖 지방 글로뷸, MAGE-1, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 멜란 A, 흑색종 표적 (HMB45), 메소텔린, 메탈로티오네인, 마이크로프탈라미아 전사 인자 (MITF), Muc-1 코어 글리코단백질, Muc-1 글리코단백질, Muc-2 글리코단백질, Muc-5AC 글리코단백질, Muc-6 글리코단백질, 미엘로퍼옥시다제, Myf-3 (횡문근육종 표적), Myf-4 (횡문근육종 표적), MyoD1 (횡문근육종 표적), 미오글로빈, nm23 단백질, 태반 알칼리성 포스파타제, 전알부민, 전립선 특이적 항원, 전립선산 포스파타제, 전립선 인히빈 펩티드, PTEN, 신세포 암종 표적, 소장 점액성 항원, 테트라넥틴, 갑상선 전사 인자-1, 매트릭스 메탈로프로테이나제 1의 조직 억제제, 매트릭스 메탈로프로테이나제 2의 조직 억제제, 티로시나제, 티로시나제-관련 단백질-1, 빌린 또는 폰 빌레브란트 인자가 포함될 수 있다.

세포 주기 관련 표적의 적합한 예에는 아폽토시스 프로테아제 활성화 인자-1, bcl-w, bcl-x, 브로모데옥시우리딘, CAK (cdk-활성화 키나제), 세포 아폽토시스 감수성 단백질 (CAS), 카스파제 2, 카스파제 8, CPP32 (카스파제-3), CPP32 (카스파제-3), 시클린 의존성 키나제, 시클린 A, 시클린 B1, 시클린 D1, 시클린 D2, 시클린 D3, 시클린 E, 시클린 G, DNA 단편화 인자 (N-말단), Fas (CD95), Fas-관련 사망 도메인 단백질, Fas 리간드, Fen-1, IPO-38, Mcl-1, 미니염색체 유지 단백질, 미스매치 복구 단백질 (MSH2), 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제, 증식성 세포 핵 항원, p16 단백질, p27 단백질, p34cdc2, p57 단백질 (Kip2), p105 단백질, Stat 1 알파, 토포이소머라제 I, 토포이소머라제 II 알파, 토포이소머라제 III 알파 또는 토포이소머라제 II 베타가 포함될 수 있다.

신경 조직 및 종양 표적의 적합한 예에는 알파 B 크리스탈린, 알파-인터넥신, 알파 시누클레인, 아밀로이드 전구체 단백질, 베타 아밀로이드, 칼빈딘, 콜린 아세틸트랜스퍼라제, 흥분성 아미노산 수송체 1, GAP43, 신경교 섬유 산성 단백질, 글루타메이트 수용체 2, 미엘린 염기성 단백질, 신경 성장 인자 수용체 (gp75), 신경모세포종 표적, 신경필라멘트 68 kD, 신경필라멘트 160 kD, 신경필라멘트 200 kD, 뉴런 특이적 에놀라제, 니코틴계 아세틸콜린 수용체 알파4, 니코틴계 아세틸콜린 수용체 베타2, 페리페린, 단백질 유전자 생성물 9, S-100 단백질, 세로토닌, SNAP-25, 시냅신 I, 시냅토피신, tau, 트립토판 히드록실라제, 티로신 히드록실라제 또는 유비퀴틴이 포함될 수 있다.

클러스터 분화 표적의 적합한 예에는 CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, CD1e, CD2, CD3델타, CD3엡실론, CD3감마, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8알파, CD8베타, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CDw12, CD13, CD14, CD15, CD15s, CD16a, CD16b, CDw17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a, CD42b, CD42c, CD42d, CD43, CD44, CD44R, CD45, CD46, CD47, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD51, CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CDw60, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64, CD65, CD65s, CD66a, CD66b, CD66c, CD66d, CD66e, CD66f, CD68, CD69, CD70, CD71, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD87, CD88, CD89, CD90, CD91, CDw92, CDw93, CD94, CD95, CD96, CD97, CD98, CD99, CD100, CD101, CD102, CD103, CD104, CD105, CD106, CD107a, CD107b, CDw108, CD109, CD114, CD115, CD116, CD117, CDw119, CD120a, CD120b, CD121a, CDw121b, CD122, CD123, CD124, CDw125, CD126, CD127, CDw128a, CDw128b, CD130, CDw131, CD132, CD134, CD135, CDw136, CDw137, CD138, CD139, CD140a, CD140b, CD141, CD142, CD143, CD144, CDw145, CD146, CD147, CD148, CDw149, CDw150, CD151, CD152, CD153, CD154, CD155, CD156, CD157, CD158a, CD158b, CD161, CD162, CD163, CD164, CD165, CD166 및 TCR-제타가 포함될 수 있다.

기타 적합한 예후 표적에는 동원체 단백질-F (CENP-F), 기안틴, 인볼루크린, 라민 A&C (XB 10), LAP-70, 뮤신, 핵 세공 복합체 단백질, p180 라멜라체 단백질, ran, r, 카텝신 D, Ps2 단백질, Her2-neu, P53, S100, 상피 표적 항원 (EMA), TdT, MB2, MB3, PCNA 또는 Ki67이 포함될 수 있다.

신호 발생기로부터의 신호는 다양한 관찰 또는 검출 시스템을 사용하여 검출될 수 있다. 사용되는 검출 시스템의 특성은 사용되는 신호 발생기의 특성에 따라 달라질 수 있다. 검출 시스템에는 예를 들어 전하 커플링 소자 (CCD) 검출 시스템, 상보성 금속-산화물-반도체 (CMOS) 이미지화 검출 시스템, 형광 검출 시스템, 전기 검출 시스템, 사진 필름 검출 시스템, 화학발광 검출 시스템, 효소 검출 시스템, 광학 검출 시스템, 근접장 검출 시스템, 또는 전반사 (TIR) 검출 시스템이 포함될 수 있다.

상기 언급된 기술들 중 하나 이상이 신호 발생기 (결합제와 커플링되거나 효소 기질과 커플링되어 있음)로부터의 신호의 하나 이상의 특징을 관찰하는 데에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 언급된 기술들 중 하나 이상을 사용하여 신호 강도, 신호 파장, 신호 위치, 신호 주파수 또는 신호 이동이 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 상기 언급된 신호 특징은 관찰, 측정 및 기록될 수 있다.

일부 실시양태에서, 관찰되는 신호는 형광 신호이며, 생물학적 샘플 중 표적에 결합된 프로브가 형광단인 신호 발생기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 형광 신호는 형광 검출 시스템을 사용하여 형광 파장 또는 형광 강도를 측정하는 것에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호가 계내에서 관찰될 수 있는데, 다시 말하자면 결합제를 통하여 생물학적 샘플 중 표적에 결합되어 있는 신호 발생기로부터 직접 신호가 관찰될 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 발생기로부터의 신호는 별도의 어레이-기반 검출 시스템에 대한 필요성 없이, 생물학적 샘플 내에서 분석될 수 있다.

일부 실시양태에서, 신호를 관찰하는 것은 생물학적 샘플의 이미지를 포착하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이미지화 장치에 연결된 현미경이 본원에서 개시되는 방법에 따라 검출 시스템으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 발생기 (예컨대 형광단)가 여기될 수 있으며, 수득되는 신호 (예컨대 형광 신호)는 관찰된 후, 디지털 신호 (예를 들어 디지털화된 이미지)의 형태로 기록될 수 있다. 적절한 형광 필터를 사용하여, 샘플에 결합되어 있는 상이한 신호 발생기들 (존재할 경우)에 대하여 동일한 절차가 반복될 수 있다.

일부 실시양태에서, 동일한 샘플에서 다수의 상이한 유형의 신호가 관찰될 수 있다. 예를 들어, 한 표적은 형광 프로브를 사용하여 검출될 수 있으며, 동일 샘플 중의 제2의 표적은 발색 프로브를 사용하여 검출될 수 있다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 형태학적 염색제 또는 마커와 접촉될 수 있다. 형태학적 염색제에는 세포 유형 또는 질환 상태의 식별을 용이하게 하기 위하여 상이한 세포 성분들을 염색할 수 있는 염료가 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 형태학적 염색제는 프로브의 신호 발생기와 용이하게 구별가능할 수 있는데, 다시 말하자면 염색제는 프로브로부터의 신호와 중복될 수 있는 신호를 방출할 수 없다. 예를 들어, 형광 형태학적 염색제의 경우, 형태학적 염색제로부터의 신호는 프로브에서 사용되는 형광단과 동일한 파장에서 자가형광성일 수 없다.

일부 실시양태에서, 발색단, 형광단, 효소 또는 효소 기질이 형태학적 염색제로 사용될 수 있다. 형태학적 염색제로 사용될 수 있는 발색단 (및 그의 표적 세포, 세포하 구획 또는 세포 성분)의 적합한 예에는 에오신 (알칼리성 세포 성분, 세포질), 헤마토크실린 (핵산), 오렌지 G (적혈구, 췌장 세포 및 뇌하수체 세포), 라이트 그린 SF (콜라겐), 로마노우스키-김자 (전체적 세포 형태), 메이-그룬발트 (혈구), 블루 카운터스테인 (트레비겐), 에틸 그린 (CAS) (아밀로이드), 페울겐-나프톨 옐로우 S (DNA), 김자 (다양한 세포 구획들을 상이하게 염색함), 메틸 그린 (아밀로이드), 피로닌 (핵산), 나프톨-옐로우 (적혈구), 뉴트럴 레드 (핵), 파파니콜라오우 염색제 (헤마토크실린, 에오신 Y, 오렌지 G 및 비스마르크 브라운 혼합물의 혼합물 (전체 세포 형태)), 레드 카운터스테인 B (트레비겐), 레드 카운터스테인 C (트레비겐), 시리우스 레드 (아밀로이드), 페울겐 시약 (파라로스아닐린) (DNA), 갈로시아닌 크롬-알룸 (DNA), 갈로시아닌 크롬-알룸 및 나프톨 옐로우 S (DNA), 메틸 그린-피로닌 Y (DNA), 티오닌-페울겐 시약 (DNA), 아크리딘 오렌지 (DNA), 메틸렌 블루 (RNA 및 DNA), 톨루이딘 블루 (RNA 및 DNA), 알시안 블루 (탄수화물), 루테늄 레드 (탄수화물), 수단 블랙 (지질), 수단 IV (지질), 오일 레드-O (지질), 판 기에슨 트리크롬 염색제 (산 푹신과 피크르산 혼합물) (근육 세포), 매쓴 트리크롬 염색제 (헤마토크실린, 산 푹신 및 라이트 그린 혼합물) (콜라겐, 세포질, 핵소체를 서로 다르게 염색함), 알데히드 푹신 (엘라스틴 섬유) 또는 웨이게르트 염색제 (망상 및 콜라겐성 섬유를 구별함)가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

적합한 형광 형태학적 염색제, 및 해당될 경우 그의 표적 세포, 세포하 구획 또는 세포 성분의 예에는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI) (핵산), 에오신 (알칼리성 세포 성분, 세포질), 훽스트 33258 및 훽스트 33342 (두 비스벤즈이미드) (핵산), 프로피듐 아이오다이드 (핵산), 스펙트럼 오렌지 (핵산), 스펙트럼 그린 (핵산), 퀴나크린 (핵산), 플루오레세인-팔로이딘 (액틴 섬유), 크로모마이신 A3 (핵산), 아크리플라빈-페울겐 반응 (핵산), 아우라민 O-페울겐 반응 (핵산), 에티듐 브로마이드 (핵산), 니쓸 염색제 (뉴런), 고도 친화성 DNA 형광단 예컨대 POPO, BOBO, YOYO 및 TOTO 등, 그리고 히스톤과 같은 DNA 결합 단백질에 융합된 녹색 형광 단백질, ACMA, 퀴나크린 및 아크리딘 오렌지가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

적합한 효소, 및 그의 일차적인 세포 위치 또는 활성의 예에는 ATPase (근육 섬유), 숙시네이트 데히드로게나제 (미토콘드리아), 시토크롬 c 옥시다제 (미토콘드리아), 포스포릴라제 (미토콘드리아), 포스포프룩토키나제 (미토콘드리아), 아세틸콜린에스테라제 (신경 세포), 락타제 (소장), 산 포스파타제 (리소솜), 류신 아미노펩티다제 (간 세포), 데히드로게나제 (미토콘드리아), 미오데닐레이트 데아미나제 (근육 세포), NADH 디아포라제 (적혈구) 및 수크라제 (소장)가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

특정 실시양태에서, 형태학적 염색제는 불활성화 작용제에 대하여 안정할 수 있는데, 다시 말하자면 형태학적 염색제의 신호 발생 특성이 불활성화 작용제에 의해 실질적으로 영향을 받지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플이 동시에 프로브 및 형태학적 염색제를 사용하여 염색될 수 있는 경우, 프로브로부터의 신호를 변형시키기 위한 불활성화 작용제의 적용이 형태학적 염색제로부터의 신호는 변형시키지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 형태학적 염색은 반복적인 프로브화 단계를 통하여 수득되는 분자 정보와 형태학적 염색을 통하여 수득되는 형태학적 정보를 공동-기록하기 위한 대조로서 사용될 수 있다.

단백질, RNA 및 DNA의 검출과 관련하여 본원에서 개시되는 방법은 일반적으로 특이적인 방식으로 표적에 물리적으로 결합하는 결합제의 사용을 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 결합제는 충분한 특이성으로 표적에 결합할 수 있는데, 다시 말하자면 결합제는 임의의 다른 분자에 대하여 그것이 하는 것에 비해 더 큰 친화성으로 표적에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합제가 다른 분자에 결합할 수도 있으나, 결합이 배경 수준 또는 그 부근에서 비-특이적 결합이 이루어질 수 있도록 하는 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 표적에 대한 결합제의 친화성은 다른 분자에 대한 그의 친화성에 비해 2-배 이상, 5-배 이상, 10-배 이상 또는 그 초과인 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 그것이 표적에 대하여 가장 큰 친화성을 가지는 것이 아닐 수 있다 할지라도, 가장 큰 구별 친화성을 가지는 결합제가 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 표적과 결합제 사이의 결합은 물리적 결합에 의해 영향을 받을 수 있다. 물리적 결합에는 비-공유 상호작용을 사용하여 수행되는 결합이 포함될 수 있다. 비-공유 상호작용에는 소수성 상호작용, 이온 상호작용, 수소-결합 상호작용 또는 친화성 상호작용 (예컨대 비오틴-아비딘 또는 비오틴-스트렙타비딘 복합체화)이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 표적 및 결합제는 그의 표면 또는 공강에 물리적 결합을 초래하는 2종 사이의 특이적 인식을 야기하는 영역을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합제는 그들의 분자 형상 부분의 상반 정합을 바탕으로 하여 생물학적 표적에 결합할 수 있다.

결합제 및 그의 상응하는 표적은 결합 쌍으로 간주될 수 있는데, 그의 비-제한적인 예로는 면역-유형 결합-쌍, 예컨대 항원/항체, 항원/항체 단편 또는 합텐/항-합텐; 비면역-유형 결합-쌍, 예컨대 비오틴/아비딘, 비오틴/스트렙타비딘, 폴산/폴레이트 결합 단백질, 호르몬/호르몬 수용체, 렉틴/특이적 탄수화물, 효소/효소, 효소/기질, 효소/기질 유사체, 효소/가성-기질 (효소 활성에 의해 촉매될 수 없는 기질 유사체), 효소/보조-인자, 효소/조절인자, 효소/억제제 또는 비타민 B12/내인 인자가 포함된다. 결합 쌍의 다른 적합한 예에는 상보성 핵산 단편 (DNA 서열, RNA 서열, LNA 서열 및 PNA 서열 포함); 단백질 A/항체; 단백질 G/항체; 핵산/핵산 결합 단백질; 또는 폴리뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드 결합 단백질이 포함될 수 있다.

일부 실시양태에서, 결합제는 서열- 또는 구조-특이적 결합제일 수 있는데, 결합제에 의해 인식 및 결합되는 표적의 서열 또는 구조는 그 표적에 있어서 충분히 고유할 수 있다.

일부 실시양태에서, 결합제는 구조-특이적일 수 있으며, 표적의 일차, 이차 또는 삼차 구조를 인식할 수 있다. 표적의 일차 구조는 그의 원자 조성의 세부사항, 및 그 원자들을 연결하는 화학 결합 (입체화학 포함), 예를 들어 단백질에서의 아미노산 선형 배열의 유형 및 특성이 포함될 수 있다. 표적의 이차 구조는 생체분자 분절의 일반적인 3-차원 형태를 지칭할 수 있는데, 예를 들어 단백질 이차 구조의 경우, 원거리 아미노산이 서로 근접하게 되는 것을 초래할 수도 있는 다양한 입체형태로의 펩티드 "백본" 쇄의 접힘을 지칭할 수 있다. 이차 구조의 적합한 예에는 알파 나선, 베타 주름 시트 또는 무작위 코일이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 표적의 삼차 구조는 그의 전체적인 3차원 구조일 수 있다. 표적의 사차 구조는 하나 이상의 다른 표적 또는 거대분자와의 그의 비공유 상호작용 (예컨대 단백질 상호작용)에 의해 형성되는 구조일 수 있다. 사차 구조의 예는 헤모글로빈을 구성하는 4개-글로빈 단백질 서브유닛에 의해 형성되는 구조일 수 있다. 본 발명의 실시양태에 따른 결합제는 상기-언급된 구조들 중 어느 것에 대하여 특이적일 수 있다.

구조-특이적 결합제의 예에는 단백질 표적에 결합할 수 있는 단백질-특이적 분자가 포함될 수 있다. 적합한 단백질-특이적 분자의 예에는 항체 및 항체 단편, 핵산 (예를 들어 단백질 표적을 인식하는 압타머) 또는 단백질 기질 (촉매가능하지 않음)이 포함될 수 있다.

일부 실시양태에서, 결합제는 서열-특이적일 수 있다. 서열-특이적 결합제에는 핵산이 포함될 수 있는데, 결합제는 표적에서의 뉴클레오티드 또는 그의 유도체의 특정 선형 배열을 인식할 수 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 선형 배열은 각각 결합제의 상응하는 상보성 뉴클레오티드에 결합할 수 있는 연속 뉴클레오티드 또는 그의 유도체를 포함할 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 서열은 연속적이지 않을 수 있는데, 프로브에 상응하는 상보성 잔기를 가지지 않을 수 있는 1개, 2개 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 존재할 수 있기 때문이다. 핵산-기재 결합제의 적합한 예에는 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 적합한 핵산은 핵산 유사체, 예컨대 디옥시제닌 dCTP, 비오틴 dcTP 7-아자구아노신, 아지도티미딘, 이노신 또는 우리딘을 포함할 수 있다.

결합제 및 표적의 유형에 관계없이, 단백질, DNA 및 RNA 검출에서, 결합제와 표적 사이 결합의 특이성은 결합 조건 (예를 들어 상보성 핵산의 경우, 혼성화 조건)에 따라 영향을 받을 수도 있다. 적합한 결합 조건은 pH, 온도 또는 염 농도 중 하나 이상의 조절에 의해 실현될 수 있다.

결합제는 내인성으로 표지되거나 (결합제의 합성 동안에 신호 발생기 또는 효소가 결합됨), 외인성으로 표지될 (이후의 단계 동안 신호 발생기 또는 효소가 결합됨) 수 있다. 예를 들어 단백질-기재 결합제의 경우, 내인성으로 표지된 결합제는 표지된 아미노산을 사용하여 제조될 수 있다. 마찬가지로, 내인성으로 표지된 핵산은 성장하는 핵산에 직접 신호 발생기-표지된 뉴클레오티드를 도입하는 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합제는 더 이후의 단계에서 신호 발생기 또는 효소가 도입될 수 있도록 하는 방식으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 이와 같은 후기 표지는 화학적 수단에 의한 펩티드 쇄 중 핵산에의 활성 아미노 또는 티올 기의 도입에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 (예를 들어 항체) 또는 핵산 (예를 들어 DNA)과 같은 결합제가 적절한 화학을 사용하여 직접 화학적으로 표지될 수 있다.

일부 실시양태에서는 더 큰 특이성, 또는 특정 실시양태에서는 신호의 증폭을 제공할 수 있는 결합제의 조합이 사용될 수도 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 결합제의 샌드위치가 사용될 수도 있는데, 이 경우 제1 결합제는 표적에 결합하여 제2의 결합을 제공하는 작용을 할 수 있으며, 제2 결합제는 표지를 포함하거나 포함하지 않을 수 있고, (필요할 경우) 추가로 제3의 결합을 제공할 수도 있는데, 이 경우 제3 결합 구성원이 표지를 포함할 수 있다.

결합제 조합의 적합한 예에는 일차 항체-이차 항체, 상보성 핵산 또는 기타 리간드-수용체 쌍 (예컨대 비오틴-스트렙타비딘)이 포함될 수 있다. 적합한 결합제 쌍의 일부 구체적인 예에는 c-myc 에피토프를 가지는 재조합 발현 단백질에 대한 마우스 항-myc; His-Tag 에피토프를 가지는 재조합 단백질에 대한 마우스 항-HisG, 에피토프-tag를 가지는 재조합 단백질에 대한 마우스 항-xpress, 염소 IgG 일차 분자에 대한 토끼 항-염소, 핵산에 대한 상보성 핵산 서열; 티오레독신 융합 단백질에 대한 마우스 항-티오, 융합 단백질에 대한 토끼 항-GFP, ?-D-갈락토스에 대한 자칼린; 및 탄수화물-결합 단백질, 당, 니켈 커플 매트릭스 또는 헤파린에 대한 멜리비오스가 포함될 수 있다.

일부 실시양태에서, 일차 항체와 이차 항체의 조합이 결합제로 사용될 수 있다. 일차 항체는 표적의 특이적 영역에 결합할 수 있으며, 이차 항체는 일차 항체에 결합할 수 있다. 이차 항체는 일차 항체에 결합하기 전에 신호 발생기 또는 효소에 결합될 수 있거나, 또는 더 이후의 단계에 신호 발생기 또는 효소에 결합할 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 일차 항체 및 특이적 결합 리간드-수용체 쌍 (예컨대 비오틴-스트렙타비딘)이 사용될 수 있다. 일차 항체는 상기 쌍 중 한 구성원 (예를 들어 비오틴)에 결합될 수 있으며, 다른 구성원 (예를 들어 스트렙타비딘)은 신호 발생기 또는 효소로 표지될 수 있다. 이차 항체, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 비오틴은 각각 독립적으로 신호 발생기 또는 효소로 표지될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 방법은 면역염색 절차에 사용될 수 있으며, 일차 항체가 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 데에 사용될 수 있다. 이차 항체는 일차 항체에 특이적으로 결합하며, 그에 의해 일차 항체와 존재할 경우 이후의 시약 (예를 들어 신호 발생기 또는 효소) 사이의 가교를 형성하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 일차 항체는 마우스 IgG (마우스에서 생성된 항체)일 수 있으며, 상응하는 이차 항체는 마우스 IgG의 영역에 결합할 수 있는 영역을 가지는 염소 항-마우스 (염소에서 생성된 항체)일 수 있다.

일부 실시양태에서, 수종의 이차 항체가 일차 항체상의 에피토프에 결합할 수 있는 경우에는, 신호 증폭이 수득될 수 있다. 면역염색 절차에서, 일차 항체는 절차에서 사용되는 첫 번째 항체일 수 있으며, 이차 항체는 절차에서 사용되는 두 번째 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 일차 항체가 면역염색 절차에 사용되는 유일한 항체일 수 있다.

본원에서 개시되는 방법에 적합한 신호 발생기의 유형은 수행되는 분석의 특성, 사용되는 에너지원 및 검출기의 유형, 사용되는 불활성화 작용제의 유형, 결합제의 유형, 표적의 유형, 또는 결합제와 신호 발생기 사이의 결합 양식 (예를 들어 절단가능 또는 비-절단가능)을 포함한 다양한 인자들에 따라 달라질 수 있다.

적합한 신호 발생기에는 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 분자 또는 화합물이 포함될 수 있다. 신호 발생기는 에너지원 또는 전류와의 상호작용 후 특징적인 신호를 제공할 수 있다. 에너지원에는 전자기 방사선 공급원 및 형광 여기 공급원이 포함될 수 있다. 전자기 방사선 공급원은 가시, 적외 및 자외를 포함한 임의의 파장의 전자기 에너지를 제공할 수 있다. 전자기 방사선은 직접적인 광원의 형태일 수 있거나, 또는 공여자 형광단과 같은 광 방출 화합물에 의해 방출될 수 있다. 형광 여기 공급원은 형광 공급원을 형성할 수 있거나, 또는 광자 방출 (즉 전자기 방사선, 유도 전기장, 온도, 물리적 접촉 또는 기계적 붕괴)을 야기할 수 있다. 적합한 신호 발생기는 광학 측정 (예를 들어 형광), 전기 전도성 또는 방사능을 포함한 다양한 방법에 의해 검출될 수 있는 신호를 제공할 수 있다. 적합한 신호 발생기는 예를 들어 광 방출성이거나, 에너지 수용성이거나, 형광성이거나, 방사성이거나, 급랭성일 수 있다.

적합한 신호 발생기는 그것이 결합되는 구성성분, 예를 들어 결합제와 입체적 및 화학적으로 상용성일 수 있다. 또한, 적합한 신호 발생기는 표적에 대한 결합제의 결합을 방해하지 않을 수 있을 뿐만 아니라, 결합제의 결합 특이성에도 영향을 주지 않을 수 있다. 적합한 신호 발생기는 특성상 유기 또는 무기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 발생기는 화학물질, 펩티드 또는 핵산 특성의 것일 수 있다.

적합한 신호 발생기는 직접적으로 검출가능할 수 있다. 직접적으로 검출가능한 모이어티는 예를 들어 또 다른 더 낮은 특징적인 파장의 광에 의한 여기 및/또는 특정 파장 광의 흡수 후 특정 파장의 광을 방출하는 형광 표지와 같이, 신호를 방출하는 그의 능력에 의해 직접적으로 검출될 수 있는 것일 수 있다.

본원에서 개시되는 방법에 따라 적합한 신호 발생기는 화학 작용제의 적용시 조작하기가 용이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 발생기는 불활성화 작용제에의 노출시 화학적으로 파괴가능할 수 있다. 화학적 파괴에는 신호 발생기의 완전한 분해 또는 신호 발생기 중 신호-발생 성분의 변형이 포함될 수 있다. 신호-발생 성분의 변형에는 신호 발생 특성의 변형을 초래할 수 있는 임의의 화학적 변형 (예컨대 첨가, 치환 또는 제거)이 포함될 수 있다. 예를 들어, 접합된 신호 발생기를 접합해제하는 것은 신호 발생기의 발색 특성의 파괴를 초래할 수 있다. 마찬가지로, 형광 신호 발생기에서의 형광-억제 관능기의 치환은 그의 형광 특성의 변형을 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정 화학 작용제에 의한 불활성화에 대하여 실질적으로 내성인 하나 이상의 신호 발생기가 제공되는 방법에서 대조 프로브로 사용될 수도 있다.

일부 실시양태에서, 신호 발생기는 광 방출 분자, 방사성동위원소 (예를 들어 P32 또는 H3, 14C, 125I 및 131I), 광학 또는 전자 밀도 마커, 라만-활성 태그, 전자 회전 공명 분자 (예를 들어 니트록실 라디칼), 전기 전하 전달 분자 (즉 전기 전하 전도 분자), 반도체 나노결정, 반도체 나노입자, 콜로이드 금 나노결정, 마이크로비드, 자기 비드, 상자성 입자 또는 양자점에서 선택될 수 있다.

일부 실시양태에서, 신호 발생기는 광-방출 분자를 포함할 수 있다. 광 방출 분자는 특정 파장의 광을 사용한 조사에 반응하여 광을 방출할 수 있다. 광 방출 분자는 발광 (여기시 물질에 의한 전자기 방사선의 비-열적 방출), 인광 (방사선 흡수의 결과로서의 지연된 발광), 화학발광 (화학 반응으로 인한 발광), 형광 또는 편광 형광을 통하여 광을 흡수 및 방출시킬 수 있다.

일부 실시양태에서, 신호 발생기는 본질적으로 형광단을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 발생기는 본질적으로 예컨대 면역조직화학 분석에서의 항체에 결합된 형광단을 포함할 수 있다. 일차 항체에 접합될 수 있는 적합한 형광단에는 플루오레세인, 로다민, 텍사스 레드, 벡터 레드, ELF (효소-표지 형광), Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy7, 플루오르X, 칼세인, 칼세인-AM, 크립토플루오르, 오렌지 (42 kDa), 탄저린 (35 kDa), 골드 (31 kDa), 레드 (42 kDa), 크림슨 (40 kDa), BHMP, BHDMAP, Br-오레곤, 루시페르 옐로우, 알렉사 염료 계열, N-[6-(7-니트로벤즈-2-옥사-1, 3-디아졸-4-일)아미노]카프로일] (NBD), 보디파이, 붕소 디피로메텐 디플루오라이드, 오레곤 그린, 미토트래커 레드, 피코에리트린, 피코빌리단백질 BPE (240 kDa) RPE (240 kDa) CPC (264 kDa) APC (104 kDa), 스펙트럼 블루, 스펙트럼 아쿠아, 스펙트럼 그린, 스펙트럼 골드, 스펙트럼 오렌지, 스펙트럼 레드, 적외선 (IR) 염료, 고리형 GDP-리보스 (cGDPR), 칼코플루오르 화이트, 리싸민, 움벨리페론, 티로신 또는 트립토판이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 신호 발생기는 본질적으로 시아닌 염료를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 발생기는 본질적으로 하나 이상의 Cy3 염료, Cy5 염료 또는 Cy7 염료를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 신호 발생기는 프렛(FRET) 쌍의 일부일 수 있다. 프렛 쌍은 서로 근접하여 위치될 경우 프렛을 겪음으로써 검출가능한 신호를 생성시키거나 제거할 수 있는 두 형광단을 포함한다. 공여자의 일부 예에는 알렉사 488, 알렉사 546, 보디파이 493, 오이스터 556, 플루오르 (FAM), Cy3 또는 TTR (탐라)가 포함될 수 있다. 수용체의 일부 예에는 Cy5, 알렉사 594, 알렉사 647 또는 오이스터 656이 포함될 수 있다.

이상에서 기술된 바와 같이, 상기 언급된 분자들 중 하나 이상이 신호 발생기로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 발생기 중 하나 이상은 화학적 파괴가 용이하지 않을 수 있으며, 신호 발생기와 결합제를 결합시키기 위하여 절단가능 링커가 사용될 수도 있다. 일부 실시양태에서, 신호 발생기 중 하나 이상은 신호 파괴가 용이할 수 있으며, 신호 발생기는 본질적으로 화학적으로 파괴될 수 있는 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 발생기는 산화제에 의해 화학적으로 파괴될 수 있는 형광단을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 발생기는 본질적으로 산화제에 의해 화학적으로 파괴될 수 있는 시아닌, 쿠마린, 보디파이, 아토 658, 양자점 또는 아토 634를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 발생기는 파괴되거나 급랭될 수 있는 하나 이상의 Cy3 염료, Cy5 염료 또는 Cy7 염료를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 프로브는 효소에 커플링된 결합제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 효소는 기질의 화학적 반응을 촉매함으로써, 샘플 또는 샘플이 결합되어 있는 고체 지지체에 존재하는 수용체 (예를 들어 페놀계 기)에 결합될 수 있는 반응 생성물을 형성시킨다. 수용체는 외인성 (즉 외적으로 샘플 또는 고체-지지체에 결합되는 수용체)이거나, 또는 내인성 (본질적으로 샘플 또는 고체-지지체에 존재하는 수용체)일 수 있다. 신호 증폭은 단일 효소가 다수의 신호 발생기를 표적 부근에 공유 결합시키는 기질의 화학 반응을 촉매할 수 있을 때에 이루어질 수 있다.

일부 실시양태에서, 적합한 효소는 산화제에 의해 불활성화될 수도 있다. 적합한 효소의 예에는 퍼옥시다제, 옥시다제, 포스파타제, 에스테라제 및 글리코시다제가 포함된다. 적합한 효소의 구체적인 예에는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 리파제 및 글루코스 옥시다제가 포함된다. 일부 실시양태에서, 효소는 양고추냉이 퍼옥시다제, 시토크롬 C 퍼옥시다제, 글루타치온 퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제, 미엘로퍼옥시다제, 락토퍼옥시다제 및 대두 퍼옥시다제에서 선택되는 퍼옥시다제이다.

일부 실시양태에서, 결합제와 효소는 단일의 것, 예를 들어 표적에 결합할 수 있으며 또한 기질의 화학 반응을 촉매할 수 있는 단백질 분자로 구현될 수 있다. 다른 실시양태에서, 결합제와 효소는 별도의 것으로 구현될 수 있으며, 공유 결합 형성에 의해, 또는 리간드-수용체 접합체 쌍 (예를 들어 비오틴 스트렙타비딘)을 사용하는 것에 의해 커플링될 수 있다.

효소 기질은 사용되는 효소, 및 샘플 또는 고체 지지체에서 결합에 이용가능한 표적에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 효소로서 HRP를 포함하는 실시양태에서, 기질은 치환된 페놀 (예를 들어 티라민)을 포함할 수 있다. 티라민에 대한 HRP의 반응은 생물학적 샘플의 표면 단백질에 존재하는 전자-풍부 모이어티 (예컨대 티로신 또는 트립토판) 또는 페놀계 기와 같은 내인성 수용체에 결합할 수 있는 활성화된 페놀계 기질을 생성시킬 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 3-메틸-2-벤조티아졸린온 히드로클로라이드 (MBTH)가 HRP 효소와 함께 기질로 사용될 수 있는 경우에는, p-디메틸아미노벤즈알데히드 (DMAB)와 같은 외인성 수용체가 기질과 반응하기 전에 고체 지지체 또는 생물학적 샘플에 결합될 수 있다.

일부 실시양태에서, 효소 기질은 효소와의 반응 후 탈인산화될 수 있다. 탈인산화된 반응 생성물은 샘플 또는 고체-지지체의 내인성 또는 외인성 수용체 (예를 들어 항체)에 결합할 수 있다. 예를 들어, 효소는 알칼리성 포스파타제 (AP)를 포함할 수 있으며, 기질은 NADP, 치환된 포스페이트 (예를 들어 니트로페닐 포스페이트) 또는 인산화된 비오틴을 포함할 수 있다. 수용체는 적절하게 NAD 결합 단백질, 탈인산화된 반응 생성물에 대한 항체 (예를 들어 항 니트로-페놀), 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 효소는 β-갈락토시다제를 포함할 수 있으며, 기질은 플루오레세인 또는 쿠마린의 β-갈락토피라노실-글리코시드를 포함할 수 있다. 수용체는 탈글리코실화 모이어티에 대한 항체 (예를 들어 항-플루오레세인 또는 항-쿠마린)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, HRP/AP와 같은 다중 효소 조합이 효소로서 사용될 수 있다. 기질은 인산화된 치환 페놀, 예를 들어 티로신 포스페이트를 포함할 수 있으며, 그것은 HRP와 반응하기 전에 AP에 의해 탈인산화됨으로써, 페놀계 기 또는 전자 풍부 모이어티-기재 수용체에 결합할 수 있는 반응 생성물을 형성할 수 있다.

효소 기질의 반응 생성물은 또한 검출가능한 신호를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 방법에 사용되는 효소 기질은 비-발색 또는 비-화학발광 기질을 포함할 수 있는데, 다시 말하자면 효소와 효소 기질의 반응이 그 자체로는 검출가능한 신호를 생성시킬 수 없다. 본원에서 개시되는 방법에 사용되는 효소 기질은 표지로서 외인성 신호 발생기 (예를 들어 형광단)를 포함할 수 있다. 신호 발생기와 효소 기질은 직접적으로 (예를 들어 형광 표지를 가지는 효소 기질) 또는 간접적으로 (예를 들어 리간드-수용체 접합체 쌍을 통함) 결합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 기질은 보호된 관능기 (예를 들어 술프히드릴 기)를 포함할 수 있다. 수용체에 대한 활성화된 기질의 결합 후에는, 관능기가 탈보호되고, 티올 반응성 기 (예를 들어 말레이미드 또는 아이오도아세틸)를 가지는 신호 발생기를 사용하여 신호 발생기에의 접합이 수행될 수 있다.

일부 실시양태에서, 표지는 양고추냉이 퍼옥시다제를 포함할 수 있으며, 기질은 치환된 페놀 (예를 들어 티라민)에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 양고추냉이 퍼옥시다제는 활성화된 페놀계 기질이 샘플 또는 샘플이 결합되어 있는 고체 지지체에 존재하는 페놀계 기에 공유 결합되도록 한다. 일부 실시양태에서, 프로브는 HRP에 커플링된 결합제를 포함할 수 있으며, 기질은 형광단에 커플링된 티라민을 포함할 수 있다.

화학 작용제는 신호 발생기, 효소, 또는 신호 발생기와 결합제 또는 효소 기질 사이의 절단가능 링커 (존재할 경우)를 변형시킬 수 있는 하나 이상의 화학물질을 포함할 수 있다. 화학 작용제는 고체, 용액, 겔 또는 현탁액 형태의 샘플과 접촉될 수 있다.

일부 실시양태에서, 화학 작용제는 산화제, 예를 들어 활성 산소 종, 히드록실 라디칼, 일중항 산소, 과산화수소 또는 오존을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학 작용제는 과산화수소, 과망가니즈산칼륨, 중크로뮴산나트륨, 수성 브로민, 아이오딘-아이오딘화칼륨 또는 t-부틸 히드로퍼옥시드를 포함할 수 있다.

화학 작용제에 대한 신호 발생기, 효소, 결합제, 표적 또는 생물학적 샘플의 감수성에 따라, 상기 언급된 화학 작용제들 중 하나 이상이 본원에서 개시되는 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합제, 표적 및 생물학적 샘플의 완전성에 본질적으로 영향을 주지 않는 화학 작용제가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합제와 표적 사이 결합의 특이성에 영향을 주지 않는 화학 작용제가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호의 강도 값 (예를 들어 형광 강도)이 측정될 수 있으며, 생물학적 샘플 중 표적의 양과 상관될 수 있다.

표적의 양과 신호 강도 사이의 상관관계는 보정 표준을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 신호의 강도 값이 측정되어, 각 표적 양에 상관될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 두 신호 강도를 비교하는 것에 의해, 제1 표적 및 제2 표적의 (서로와 관련한, 또는 대조와 관련한) 상대적인 양이 확인될 수 있다. 마찬가지로, 다수의 프로프를 사용하여 다수의 표적이 분석될 수 있는 경우, 상이한 신호 강도들을 측정하는 것에 의해, 생물학적 샘플 중 상이한 표적들의 상대적인 양이 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 대조 샘플이 이상에서 기술된 바와 같이 사용될 수 있다.

샘플에서의 신호의 존재 또는 부재를 관찰하는 것에 의해 (관심 생물학적 샘플 대 대조), 생물학적 샘플과 관련한 정보가 수득될 수 있다. 예를 들어, 이환된 조직 샘플 대 정상 조직 샘플을 비교하는 것에 의해, 이환된 조직 샘플에 존재하는 표적과 관련한 정보가 수득될 수 있다. 마찬가지로, 샘플들 (즉 관심 샘플 및 하나 이상의 대조) 사이의 신호 강도를 비교하는 것에 의해, 샘플에서의 표적의 발현과 관련한 정보가 수득될 수 있다.

일부 실시양태에서, 생물학적 샘플에서의 신호의 위치가 관찰될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 신호에서의 신호의 위치는 형태학적 염색을 사용하여 관찰될 수 있다. 일부 실시양태에서, 둘 이상 신호의 상대적 위치가 관찰될 수 있다. 신호의 위치는 생물학적 샘플에서의 표적의 위치와 상관됨으로써, 생물학적 샘플에서의 상이한 표적들의 위치확인과 관련한 정보를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플에서의 상이한 표적들의 위치확인과 관련한 정보를 수득하기 위하여, 신호의 강도 값과 신호의 위치가 상관될 수 있다. 예를 들어, 특정 표적은 핵에 비해 세포질에서 더 많이 발현될 수 있거나, 또는 그 반대일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적들의 상대적 위치확인과 관련한 정보는 둘 이상 신호들의 위치 및 강도 값을 비교하는 것에 의해 수득될 수 있다.

예시적인 컴퓨터 시스템 및 네트워크 환경

본원에서 개시되는 시스템 및 방법은 하나 이상의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 매체, RAM, ROM, 하드 드라이브 및/또는 하드웨어에 저장되는 그와 관련되어 있는 실행가능 명령을 가지는 하나 이상의 프로그램가능 처리 유닛을 포함할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 예를 들어 기존의 인프라구조 (예를 들어 기존의 장치/처리 유닛)와 연계하여 사용하기 위한 업그레이드 모듈(들)로서, 하드웨어, 펌웨어 및/또는 실행가능 코드가 제공될 수 있다. 하드웨어는 예를 들어 컴퓨터처리 프로세스로서 본원에서 교시되는 실시양태들을 실행하기 위한 부품 및/또는 로직 회로를 포함할 수 있다.

예를 들어 본 개시내용에 따라 그래픽 사용자 인터페이스를 제공하기 위한 디스플레이 및/또는 기타 피드백 부품들 역시 포함될 수 있다. 상기 디스플레이 및/또는 기타 피드백 부품들은 독립형 장비일 수 있거나, 또는 처리 유닛(들)의 하나 이상 부품/모듈로서 포함될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 디스플레이 및/또는 기타 피드백 부품들은 생물학적 조직 샘플 시야의 형태학적 및 통계적 표현 양자를 동시에 기술하는 데에 사용될 수 있다.

본 발명 실시양태의 일부를 실행하는 데에 사용될 수 있는 실제 소프트웨어 코드 또는 제어 하드웨어로써 해당 실시양태의 영역을 제한하고자 하는 것은 아니다. 예를 들어, 본원에서 기술되는 실시양태의 특정 측면은, 예를 들어 통상적이거나 대상-지향적인 프로그래밍 기술을 사용하는, 예를 들어 어셈블리 코드, C, C# 또는 C++와 같은 어떠한 적합한 프로그래밍 언어 유형을 사용하는 코드에서도 실행될 수 있다. 그와 같은 코드는 예를 들어 자기 또는 광학 저장 매체와 같은 임의의 유형의 적합한 비-일시적 컴퓨터-판독가능 매체 또는 매체들에 저장 또는 유지된다.

본원에서 사용될 때, "프로세서", "처리 유닛", "컴퓨터" 또는 "컴퓨터 시스템"은 예를 들어 마이크로컴퓨터, 미니컴퓨터, 서버, 메인프레임, 랩톱, 개인 휴대용 정보 단말기 (PDA), 무선 e-메일 장치 (예를 들어 "블랙베리", "안드로이드" 또는 "애플"의 상표명 장치), 휴대 전화, 삐삐, 프로세서, 팩스 기계, 스캐너, 또는 네트워크상으로 데이터를 전송 및 수신하도록 구성되는 임의의 다른 프로그램가능 장치의 무선 또는 유선 변종일 수 있다. 본원에서 개시되는 컴퓨터 시스템은 데이터를 수득, 처리 및 통신하는 데에 사용되는 특정 소프트웨어 애플리케이션을 저장하기 위한 메모리를 포함할 수 있다. 그와 같은 메모리는 개시되는 실시양태에 대하여 내장형 또는 외장형일 수 있다는 것을 알아야 한다. 메모리에는 또한 하드 디스크, 광학 디스크, 플로피 디스크, ROM (리드 온리 메모리), RAM (랜덤 액세스 메모리), PROM (프로그램가능 ROM), EEPROM (전기적으로 삭제가능한 PROM), 플래시 메모리 저장 장치 등을 포함하여, 소프트웨어를 저장하기 위한 비-일시적 저장 매체를 포함할 수 있다.

도 8은 본원에서 개시되는 시스템 및 방법을 실행하는 데에 사용될 수 있는 예시적인 컴퓨터처리 장치 (1000)를 나타내는 블록도를 도시한다. 컴퓨터처리 장치 (1000)는 워크스테이션, 데스크탑 컴퓨터, 서버, 랩탑, 휴대용 컴퓨터, 태블릿 컴퓨터 (예를 들어 아이패드™ 태블릿 컴퓨터), 이동식 컴퓨터처리 또는 통신 장치 (예를 들어 아이폰™ 이동 통신 장치, 안드로이드™ 이동 통신 장치 등), 또는 통신을 할 수 있으며 본원에서 기술되는 작업을 수행하기에 충분한 프로세서 능력 및 메모리 용량을 가지는 다른 형태의 컴퓨터처리 또는 원격통신 장치와 같은 임의의 컴퓨터 시스템일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 다수의 그와 같은 컴퓨터처리 장치들을 포함하는 분산형 컴퓨터 시스템이 제공될 수도 있다.

컴퓨터처리 장치 (1000)는 본원에서 기술되는 예시적인 방법을 실행하기 위한 하나 이상의 컴퓨터-실행가능 명령 또는 소프트웨어가 코딩되어 있는 하나 이상의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 매체를 포함한다. 상기 비-일시적 컴퓨터-판독가능 매체에는 하나 이상 유형의 하드웨어 메모리 및 기타 유형 매체 (예를 들어 하나 이상의 자기 저장 디스크, 하나 이상의 광학 디스크, 하나 이상의 USB 플래시 드라이브) 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 컴퓨터처리 장치 (1000)에 포함되어 있는 메모리 (1006)가 본원에서 기술되는 바와 같은 그래픽 사용자 인터페이스를 실행하기 위한 컴퓨터-판독가능 및 컴퓨터-실행가능 명령 또는 소프트웨어를 저장할 수 있다. 컴퓨터처리 장치 (1000)는 또한 메모리 (1006)에 저장되어 있는 컴퓨터-판독가능 및 컴퓨터-실행가능 명령 또는 소프트웨어, 및 시스템 하드웨어를 제어하기 위한 다른 프로그램들을 실행하기 위한 프로세서 (1002) 및 관련 코어 (1004), 그리고 일부 실시양태에서는 하나 이상의 추가적인 프로세서(들) (1002') 및 관련 코어(들) (1004') (예를 들어 다중 프로세서/코어를 가지는 컴퓨터 시스템의 경우)를 포함한다. 프로세서 (1002) 및 프로세서(들) (1002')은 각각 단일 코어 프로세서 또는 다중 코어 (1004 및 1004') 프로세서일 수 있다.

컴퓨터처리 장치 (1000)에는, 컴퓨터처리 장치의 인프라구조 및 자원이 동적으로 공유될 수 있도록, 가상화가 사용될 수 있다. 다중 프로세서에서 전개되는 프로세스를 조작함으로써 프로세스가 다수의 컴퓨터처리 자원이 아닌 하나의 컴퓨터처리 자원만을 사용하는 것으로 보이도록, 가상 기계 (1014)가 제공될 수 있다. 다중 가상 기계 역시 하나의 프로세서로 사용될 수 있다.

메모리 (1006)에는 컴퓨터 시스템 메모리 또는 랜덤 액세스 메모리, 예컨대 DRAM, SRAM, EDO RAM 등이 포함될 수 있다. 메모리 (1006)에는 다른 유형의 메모리 또는 그의 조합 역시 포함될 수 있다.

사용자는 본원에서 기술되는 예시적인 실시양태에 따라 제공되는 하나 이상의 그래픽 사용자 인터페이스 (1020)를 디스플레이할 수 있는 스크린 또는 모니터와 같은 시각 디스플레이 장치 (1018)를 통하여 컴퓨터처리 장치 (1000)와 상호작용할 수 있다. 시각 디스플레이 장치 (1018)는 또한 예시적인 실시양태와 관련된 다른 측면, 요소 및/또는 정보 또는 데이터도 디스플레이할 수 있다. 컴퓨터처리 장치 (1000)는 사용자로부터의 입력치를 수신하기 위한 다른 I/O 장치, 예를 들어 키보드 또는 임의의 적합한 다중-점 접촉 인터페이스 (1008), 포인팅 장치 (1010) (예를 들어 마우스, 사용자의 손가락으로 디스플레이 장치와 직접 인터페이싱하는 것 등)를 포함할 수 있다. 키보드/다중-점 접촉 인터페이스 (1008) 및 포인팅 장치 (1010)는 시각 디스플레이 장치 (1018)에 커플링될 수 있다. 컴퓨터처리 장치 (1000)는 다른 적합한 통상적인 I/O 주변장치를 포함할 수도 있다. I/O 장치는 본원에서 기술되는 예시적인 실시양태를 위한 하나 이상 그래픽 사용자 인터페이스 (1020)의 실행, 예를 들어 그래픽 사용자 인터페이스의 하나 이상의 선택 성분 (예를 들어 시야 선택 성분, 바이오마커 선택 성분, 바이오마커 발현 수준 기준 선택 성분, 형태학적 특징 선택 성분 등)의 실행을 용이하게 할 수 있다.

컴퓨터처리 장치 (1000)는 본원에서 교시되는 바와 같은 예시적인 실시양태를 실행하는 데이터 및 컴퓨터-판독가능 명령 및/또는 소프트웨어를 저장하기 위하여, 지속성 디스크 저장장치 (임의의 적합한 광학 또는 자기 지속성 저장 장치, 예를 들어 RAM, ROM, 플래시, USB 드라이브 또는 기타 반도체-기재 저장 매체가 포함될 수 있음), 하드-드라이브, CD-ROM, 또는 기타 컴퓨터-판독가능 매체와 같은 하나 이상의 저장 장치 (1024)를 포함할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 상기 하나 이상의 저장 장치 (1024)는 본 개시내용의 시스템 및 방법에 의해 생성될 수 있는 데이터를 위한 저장장치를 제공할 수 있다. 예를 들어, 저장 장치 (1024)는 이미지 데이터용 저장장치 및/또는 데이터 분석용 저장장치 (예를 들어 이미지 분절화 결과와 같이 본원에서 기술되는 이미지 또는 통계 분석 중 어느 것에 대한 파라미터의 결과를 위한 저장장치)를 제공할 수 있다. 하나 이상의 저장 장치 (1024)는 또한 본원에서 기술되는 바와 같은 하나 이상의 방법과 관련된 컴퓨터-판독가능 명령을 위한 저장장치를 제공할 수 있다. 하나 이상의 저장 장치 (1024)는 컴퓨터처리 장치 (1000)에 제공되고/거나 컴퓨터처리 장치 (1000)와 별도 또는 원격으로 제공될 수 있다.

컴퓨터처리 장치 (1000)는 하나 이상의 네트워크 장치 (1022)를 통하여 하나 이상의 네트워크, 예를 들어 비제한적으로 표준 전화 선, LAN 또는 WAN 링크 (예를 들어 802.11, T1, T3, 56 kb, X.25), 브로드밴드 연결장치 (예를 들어 ISDN, 프레임 릴레이, ATM), 무선 연결장치, 컨트롤러 영역 네트워크 (CAN), 또는 상기 중 어느 것 또는 모두의 일부 조합을 포함한 다양한 연결장치들을 통한 로컬 에어리어 네트워크 (LAN), 와이드 에어리어 네트워크 (WAN) 또는 인터넷과 인터페이싱하도록 구성되는 네트워크 인터페이스 (1012)를 포함할 수 있다. 상기 네트워크 인터페이스 (1012)는 컴퓨터처리 장치 (1000)를, 통신과 본원에서 기술되는 작업을 수행할 수 있는 임의의 유형의 네트워크에 인터페이싱하는 데에 적합한 내장형 네트워크 어댑터, 네트워크 인터페이스 카드, PCMCIA 네트워크 카드, 카드 버스 네트워크 어댑터, 무선 네트워크 어댑터, USB 네트워크 어댑터, 모뎀 또는 임의의 다른 장치를 포함할 수 있다. 네트워크 장치 (1022)는 비제한적으로 하나 이상의 수신장치, 하나 이상의 전송장치, 하나 이상의 송수신장치, 하나 이상의 안테나 등을 포함하여, 네트워크 상에서 통신을 수신 및 전송하기 위한 하나 이상의 적합한 장치를 포함할 수 있다.

컴퓨터처리 장치 (1000)는 마이크로소프트® 윈도우즈® 운영 체제의 버젼들 중 어느 것, 유닉스 및 리눅스 운영 체제의 여러 배포물, 매킨토시 컴퓨터용 MacOS®의 임의의 버젼, 임의의 포매형 운영 체제, 임의의 실시간 운영 체제, 임의의 오픈 소스 운영 체제, 임의의 사유 운영 체제, 이동식 컴퓨터처리 장치용의 임의의 운영 체제, 또는 컴퓨터처리 장치에서 전개되어 본원에서 기술되는 작업을 수행할 수 있는 임의의 기타 운영 체제와 같은 어떠한 운영 체제 (1016)도 전개할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 운영 체제 (1016)는 네이티브 모드 또는 에뮬레이티드된 모드로 전개될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 운영 체제 (1016)는 하나 이상 클라우드 기계의 경우로 전개될 수 있다.

도 9는 본원에서 개시되는 실시양태의 실행에 적합한 예시적인 네트워크 환경 (2000)을 도시한다. 상기 네트워크 환경 (2000)은 통신 네트워크 (2010)를 통하여 하나 이상의 클라이언트 (2006) 및 (2008)에 커플링된 하나 이상의 서버 (2002) 및 (2004)를 포함할 수 있다. 분명히, 상기 하나 이상의 서버 (2002) 및 (2004), 및 하나 이상의 클라이언트 (2006) 및 (2008) 각각은 도 8과 관련하여 기술된 바와 같은 컴퓨터처리 장치 (1000)와 같이 실행될 수 있다. 따라서, 하나 이상의 서버 (2002) 및 (2004), 및 하나 이상의 클라이언트 (2006) 및 (2008) 각각은 서버 (2002) 및 (2004)가 통신 네트워크 (2010)를 통하여 클라이언트 (2006) 및 (2008)과 통신하는 것을 가능케 하는 네트워크 인터페이스 (1012) 및 네트워크 장치 (1022)를 포함할 수 있다. 상기 통신 네트워크 (2010)에는 인터넷, 인트라넷, LAN (로컬 에어리어 네트워크), WAN (와이드 에어리어 네트워크), MAN (메트로폴리탄 에어리어 네트워크), 무선 네트워크, 광학 네트워크 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 통신 네트워크 (2010)에 의해 제공되는 통신 설비들은 본원에서 개시되는 바와 같은 협업 분석 및 연구 작업을 지지할 수 있다.

예시적인 실시양태에서, 협업하는 것은 하나 이상의 클라이언트 (2006) (2008)가 하나 이상의 서버 (2002) (2004)에 원격으로 액세스하는 것을 이용할 수 있다. 서버 (2002) 및 (2004)는 유리하게는 본 개시내용의 시스템 및 방법과 관련된 데이터를 저장, 액세싱, 공유 및 분석 (예를 들어 확인)하기 위한 클라우드 환경을 제공할 수 있다. 하나 이상의 서버 (2006) (2008)는 또한 유리하게는 예컨대 본원에서 기술되는 바와 같은 사용자 인터페이스의 생성 및/또는 데이터 분석과 관련된 하나 이상의 모듈을 실행하기 위한 컴퓨터-판독가능 명령을 특징으로 하는 하나 이상의 애플리케이션과 결합될 수 있다. 상기 하나 이상의 애플리케이션은 유리하게는 하나 이상의 클라이언트 (2006) 및 (2008)에서 원격으로 액세스 및 전개될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 상기 하나 이상 애플리케이션의 배포는 라이센스 동의와 같은 특정 조건에 적용될 수 있다.

이와 같이 본 발명의 몇 가지 예시적인 실시양태들을 기술한 바, 통상의 기술자라면, 다양한 대안, 변형 및 개선이 용이하게 이루어지게 된다는 것을 알아야 한다. 그와 같은 대안, 변형 및 개선은 본 개시내용의 일부가 되는 것으로 하고자 하며, 본 발명의 영역에 속하는 것으로 하고자 한다. 따라서, 전기한 상세한 설명 및 도면은 단지 예를 든 것이다.

Claims

조직 샘플 중 생물학적 단위를 나타내는 이미지 데이터의 컴퓨터-실행 처리 방법이며,
상기 컴퓨터는 프로세서를 포함하고,
프로세서에 의해, 면역형광 (IF) 형태학적 마커로부터의 신호를 함유하며 IF 형태학적 마커로 염색되어 있는 조직 샘플의 제1 이미지를 수신하는 단계;
프로세서에 의해, 형광 프로브로부터의 신호를 함유하며 계내에서 형광 프로브와 혼성화되어 있는 동일한 조직 샘플의 제2 이미지를 수신하는 단계;
프로세서에 의해 제1 이미지에서의 IF 형태학적 마커로부터의 평균 신호 강도를 기준으로 조직 샘플 중 각 생물학적 단위를 2개 이상의 부류 중 하나로 분류하는 단계;
프로세서에 의해 제2 이미지에서의 조직 샘플의 형광 계내 혼성화 (FISH) 분석을 수행하여 그로부터 결과를 수득하는 단계; 및
프로세서에 의해 FISH 분석의 결과를 필터링하여 상기 2개 이상의 부류 중 하나로 분류되어 있는 생물학적 단위에 속하는 결과 하위세트만을 산출하는 단계
를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 2개 이상의 부류가 상피 및 비-상피를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 프로세서에 의해 제2 이미지에서의 형광 프로브로부터의 신호의 위치와 함께 제1 이미지에서의 IF 형태학적 마커로부터의 신호의 위치를 기록하여 기록된 이미지를 산출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제3항에 있어서, 프로세서에 의해 제2 이미지를 분절화하여 제2 이미지에서의 형광 프로브로부터의 신호의 위치를 기준으로 조직 샘플 중 핵을 식별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제4항에 있어서, 각 생물학적 단위가 조직 샘플 중 식별된 각 핵에 상응하는 것인 방법.
제4항에 있어서, 핵을 분절화하는 것이 프로세서에 의해 제2 이미지에 웨이블렛 변환을 적용하는 것을 포함하는 것인 방법.
제6항에 있어서, 프로세서에 의해 제2 이미지에서의 핵으로부터의 임계 거리 맵으로부터 생성되는 보로노이(Voronoi) 파티션 및 링들을 생성시키는 단계이며, 여기서 각 개별 링은 조직 샘플 중 하나의 핵만을 적어도 부분적으로 둘러싸도록 제약되는 것인 단계를 추가로 포함하는 방법.
제7항에 있어서, 제2 이미지에서 보로노이 파티션을 생성시키는 것이 각 링에 의해 한정되는 마스크에 의해 다중화되는 보로노이 파티션의 시드로서 조직 샘플 중 식별된 핵을 사용하여 제2 이미지로부터 국소적 배경 영역을 생성시키는 것을 가능케 하는 것인 방법.
제7항에 있어서, IF 형태학적 마커가 시토케라틴 (CK) 단백질을 표적으로 하도록 구성되며, 오츠 임계화 방법과 연계된 임계 값을 사용하여 제1 이미지를 임계화하는 단계, 및 제1 이미지에서의 상피 영역의 최소 강도 수준을 산정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제9항에 있어서, 각 생물학적 단위의 분류 변화를 관찰하면서 사용자가 쌍방향으로 임계 값을 변화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제9항에 있어서, 각 핵이 핵을 둘러싸고 있는 링 내에서의 평균 시토케라틴 (CK) 강도를 계산하는 것 및 상기 평균 CK 강도를 상피 영역의 산정된 최소 강도 수준과 비교하는 것에 의해 상피 및 비-상피 중 하나로 분류되는 것인 방법.
제1항에 있어서, IF 형태학적 마커가 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI) 염색제를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, IF 형태학적 마커가 시토케라틴 (CK) 단백질 및 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2) 단백질 중 적어도 하나를 표적으로 하도록 구성되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 형광 프로브가 HER2 유전자 및 염색체 17 동원체 반복부 중 적어도 하나에 결합하도록 구성되는 것인 방법.
컴퓨터에 의해 실행될 경우 컴퓨터가
면역형광 (IF) 형태학적 마커로부터의 신호를 함유하며 IF 형태학적 마커로 염색되어 있는 조직 샘플의 제1 이미지를 수신하도록 하고;
형광 프로브로부터의 신호를 함유하며 계내에서 형광 프로브와 혼성화되어 있는 동일한 조직 샘플의 제2 이미지를 수신하도록 하고;
제1 이미지에서의 IF 형태학적 마커로부터의 평균 신호 강도를 기준으로 조직 샘플 중 각 생물학적 단위를 2개 이상의 부류 중 하나로 분류하도록 하고;
제2 이미지에서의 조직 샘플의 형광 계내 혼성화 (FISH) 분석을 수행하여 그로부터 결과를 수득하도록 하고;
FISH 분석의 결과를 필터링하여 상피로 분류되어 있는 생물학적 단위에 속하는 결과 하위세트만을 산출하도록 하는
컴퓨터-실행가능 명령을 저장하고 있는 비-일시적 컴퓨터-판독가능 매체.
제15항에 있어서, 컴퓨터에 의해 실행될 경우 컴퓨터가
제2 이미지에서의 형광 프로브로부터의 신호의 위치와 함께 제1 이미지에서의 IF 형태학적 마커로부터의 신호의 위치를 기록하여 기록된 이미지를 산출하도록 하는
컴퓨터-실행가능 명령을 추가로 포함하는 컴퓨터-판독가능 매체.
제16항에 있어서, 컴퓨터에 의해 실행될 경우 컴퓨터가
제2 이미지를 분절화하여 제2 이미지에서의 형광 프로브로부터의 신호의 위치를 기준으로 조직 샘플 중 핵을 식별하도록 하는
컴퓨터-실행가능 명령을 추가로 포함하는 컴퓨터-판독가능 매체.
프로세서;
프로세서와 전기 통신하며 이미지 데이터를 수신하도록 구성되는 입력장치; 및
프로세서와 전기 통신하며, 프로세서에 의해 실행될 경우 프로세서가
면역형광 (IF) 형태학적 마커로부터의 신호를 함유하며 IF 형태학적 마커로 염색되어 있는 조직 샘플의 제1 이미지를 수신하도록 하고,
형광 프로브로부터의 신호를 함유하며 계내에서 형광 프로브와 혼성화되어 있는 동일한 조직 샘플의 제2 이미지를 수신하도록 하고,
제1 이미지에서의 IF 형태학적 마커로부터의 평균 신호 강도를 기준으로 조직 샘플 중 각 생물학적 단위를 2개 이상의 부류 중 하나로 분류하도록 하고,
제2 이미지에서의 조직 샘플의 형광 계내 혼성화 (FISH) 분석을 수행하여 그로부터 결과를 수득하도록 하고,
FISH 분석의 결과를 필터링하여 상기 2개 이상의 부류 중 하나로 분류되어 있는 생물학적 단위에 속하는 결과 하위세트만을 산출하도록 하는
컴퓨터-실행가능 명령을 포함하는 메모리
를 포함하는, 조직 샘플 중 생물학적 단위를 나타내는 이미지 데이터의 처리 시스템.
제18항에 있어서, 상기 2개 이상의 부류가 상피 및 비-상피를 포함하는 것인 시스템.
제18항에 있어서, 메모리가, 프로세서에 의해 실행될 경우 프로세서가
제2 이미지에서의 형광 프로브로부터의 신호의 위치와 함께 제1 이미지에서의 IF 형태학적 마커로부터의 신호의 위치를 기록하여 기록된 이미지를 산출하도록 하는
컴퓨터-실행가능 명령을 추가로 포함하는 것인 시스템.
제20항에 있어서, 메모리가, 프로세서에 의해 실행될 경우 프로세서가
제2 이미지를 분절화하여 제2 이미지에서의 형광 프로브로부터의 신호의 위치를 기준으로 조직 샘플 중 핵을 식별하도록 하는
컴퓨터-실행가능 명령을 추가로 포함하는 것인 시스템.
제21항에 있어서, 각 생물학적 단위가 조직 샘플 중 식별된 각 핵에 상응하는 것인 시스템.
제21항에 있어서, 메모리가, 프로세서에 의해 실행될 경우 프로세서가 제2 이미지에 웨이블렛 변환을 적용하여 조직 샘플 중 핵을 분절화하도록 하는 컴퓨터-실행가능 명령을 추가로 포함하는 것인 시스템.
제23항에 있어서, 메모리가, 프로세서에 의해 실행될 경우 프로세서가 제2 이미지에서의 핵으로부터의 임계 거리 맵으로부터 생성되는 보로노이 파티션 및 링들을 생성시키도록 하며, 여기서 각 개별 링은 조직 샘플 중 하나의 핵만을 적어도 부분적으로 둘러싸도록 제약되는 것인 컴퓨터-실행가능 명령을 추가로 포함하는 것인 시스템.
제23항에 있어서, 메모리가, 프로세서에 의해 실행될 경우 프로세서가 각 링에 의해 한정되는 마스크에 의해 다중화되는 보로노이 파티션의 시드로서 조직 샘플 중 식별된 핵을 사용하여 제2 이미지로부터 국소적 배경 영역을 생성시키도록 하는 컴퓨터-실행가능 명령을 추가로 포함하는 것인 시스템.
제18항에 있어서, IF 형태학적 마커가 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI) 염색제를 포함하는 것인 시스템.
제18항에 있어서, IF 형태학적 마커가 시토케라틴 (CK) 단백질 및 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2) 단백질 중 적어도 하나를 표적으로 하도록 구성되는 것인 시스템.
제18항에 있어서, 형광 프로브가 HER2 유전자 및 염색체 17 동원체 반복부 중 적어도 하나에 결합하도록 구성되는 것인 시스템.