CN104813366A - 使用免疫染色掩膜选择性细化ish分析结果的系统和方法 - Google Patents

Abstract

一种处理表示组织样品中的生物单元的图像数据的计算机实现方法包括：接收包含来自免疫荧光(IF)形态标记的信号的组织样品的第一图像，其中组织样品采用IF形态标记来染色；以及接收包含来自荧光探针的信号的同一组织样品的第二图像，其中组织样品与荧光探针原位杂交。该方法还包括：基于第一图像中来自IF形态标记的信号的平均强度将组织样品中的各生物单元分类为至少两个类别之一；执行第二图像中的组织样品的荧光原位杂交(FISH)分析，以从其中得到结果；以及过滤FISH分析的结果，以产生与在一个类别中分类的生物单元有关的结果的子集。

Description

使用免疫染色掩膜选择性细化ISH分析结果的系统和方法

技术领域

一般来说，本公开涉及生物样品中的蛋白质表达和靶核酸序列的检测，以及更具体来说，涉及使用免疫染色掩膜(immunostaining mask)选择性细化原位杂交(ISH)分析结果的系统和方法。

背景技术

组织切片和其他细胞学制备物中的蛋白质分析可使用荧光原位杂交(FISH)来进行。FISH是用于检测和定位染色体上的特定DNA序列是否存在的细胞遗传技术。FISH使用荧光探针，荧光探针仅结合染色体中荧光探针对其呈现高度序列互补性的那些部分。荧光显微术可用来通过计算图像中存在的荧光点，来找出荧光探针结合到染色体的位置。

对于癌肿瘤样品中的FISH分析，FISH点计数的测量仅对样品中的上皮细胞是相关的。但是，常规FISH分析测量视场中所有细胞的FISH信号，因为缺乏将分析限制到细胞的所定义子集的有效方式。在没有手动干预的情况下，这可导致许多非上皮细胞(例如基质细胞)促成FISH点计数统计，这导致不太准确的点计数测量。

发明内容

按照一个实施方案，一种处理表示组织样品中的生物单元的图像数据的计算机实现方法(其中计算机包括处理器)包括：由处理器接收包含来自免疫荧光(IF)形态标记的信号的组织样品的第一图像，其中组织样品采用IF形态标记来染色；以及由处理器接收包含来自荧光探针的信号的同一组织样品的第二图像，其中组织样品与荧光探针原位杂交。该方法还包括：由处理器基于第一图像中来自IF形态标记的信号的平均强度将组织样品中的各生物单元分类为至少两个类别之一；由处理器执行第二图像中的组织样品的荧光原位杂交(FISH)分析，以从其中得到结果；以及由处理器过滤FISH分析的结果，以产生与仅在至少两个类别之一中分类的生物单元有关的结果的子集。在一些实施方案中，类别可包括上皮和非上皮细胞。

在一些实施方案中，该方法还可包括由处理器将第一图像中来自IF形态标记的信号的位置与第二图像中来自荧光探针的信号的位置配准，以产生配准图像。在一些实施方案中，该方法还可包括由处理器分割第二图像，以基于第二图像中来自荧光探针的信号的位置来识别组织样品中的细胞核。在一些实施方案中，各生物单元可对应于组织样品中识别的相应细胞核。在一些实施方案中，分割细胞核的动作可包括由处理器将小波变换应用于第二图像。

在一些实施方案中，该方法还可包括由处理器从第二图像中的细胞核来生成从阈值距离图所生成的Voronoi划分和环形，其中各相应环形限制成至少部分仅包围组织样品中的一个细胞核。在一些实施方案中，生成第二图像中的Voronoi划分的动作使得能够使用组织样品中识别的细胞核作为与各环形所限定的掩膜相乘的Voronoi划分的种子(seed)，从第二图像来生成局部背景区域。

在一些实施方案中，IF形态标记可配置成针对细胞角蛋白(CK)蛋白质。该方法还可包括使用结合Otsu定阈值方法的阈值对第一图像定阈值，并且估计第一图像中的上皮区域的最小强度级。在一些实施方案中，该方法还可包括由用户在观察各生物单元的分类的变化的同时交互地改变阈值。

在一些实施方案中，通过计算包围细胞核的环形中的平均细胞角蛋白(CK)强度，并且将平均CK强度与上皮区域的所估计的最小强度级进行比较，各细胞核可分类为上皮或者非上皮的。在一些实施方案中，IF形态标记可包括4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色剂。在一些实施方案中，IF形态标记可配置成针对细胞角蛋白(CK)蛋白质和人表皮生长因子受体2(HER2)蛋白质中的至少一种。在一些实施方案中，荧光探针可配置成结合到HER2基因和染色体17着丝粒重复中的至少一个。

按照一个实施方案，一种非暂时计算机可读介质上存储了计算机可执行指令，其在由计算机运行时使该计算机接收包含来自免疫荧光(IF)形态标记的信号的组织样品的第一图像(其中组织样品采用IF形态标记来染色)，并且接收包含来自荧光探针的信号的同一组织样品的第二图像(其中组织样品与荧光探针原位杂交)。该计算机可读介质还包括计算机可执行指令，其在由计算机运行时使计算机基于第一图像中来自IF形态标记的信号的平均强度将组织样品中的各生物单元分类为至少两个类别之一，执行第二图像中的组织样品的荧光原位杂交(FISH)分析以从其中得到结果，并且过滤FISH分析的结果以产生仅与分类为上皮的生物单元有关的结果的子集。

在一些实施方案中，该计算机可读介质还可包括计算机可执行指令，其在由计算机运行时使计算机将第一图像中来自IF形态标记的信号的位置与第二图像中来自荧光探针的信号的位置配准，以产生配准图像。在一些实施方案中，该计算机可读介质还可包括计算机可执行指令，其在由计算机运行时使计算机分割第二图像，以基于第二图像中来自荧光探针的信号的位置来识别组织样品中的细胞核。

按照一个实施方案，一种用于处理表示组织样品中的生物单元的图像数据的系统包括：处理器；输入，与处理器进行通信，并且配置成接收图像数据；以及存储器，与处理器进行电通信。该存储器包括计算机可执行指令，其在由处理器运行时使处理器接收包含来自免疫荧光(IF)形态标记的信号的组织样品的第一图像(其中组织样品采用IF形态标记来染色)，接收包含来自荧光探针的信号的同一组织样品的第二图像(其中组织样品与荧光探针原位杂交)，基于第一图像中来自IF形态标记的信号的平均强度将组织样品中的各生物单元分类为至少两个类别之一，执行第二图像中的组织样品的荧光原位杂交(FISH)分析以从其中得到结果，并且过滤FISH分析的结果以产生与仅在至少两个类别之一中分类的生物单元有关的结果的子集。在一些实施方案中，类别可包括上皮和非上皮细胞。

在一些实施方案中，该存储器还可包括计算机可执行指令，其在由处理器运行时使处理器将第一图像中来自IF形态标记的信号的位置与第二图像中来自荧光探针的信号的位置配准，以产生配准图像。在一些实施方案中，该存储器还可包括计算机可执行指令，其在由处理器运行时使处理器分割第二图像，以基于第二图像中来自荧光探针的信号的位置来识别组织样品中的细胞核。在一些实施方案中，各生物单元可对应于组织样品中识别的相应细胞核。

在一些实施方案中，该存储器还可包括计算机可执行指令，其在由处理器运行时使处理器将小波变换应用于第二图像，以分割组织样品中的细胞核。在一些实施方案中，该存储器还可包括计算机可执行指令，其在由处理器运行时使处理器从第二图像中的细胞核来生成从阈值距离图所生成的Voronoi划分和环形，其中各相应环形限制成至少部分仅围绕组织样品中的一个细胞核。在一些实施方案中，该存储器还可包括计算机可执行指令，其在由处理器运行时使处理器使用在组织样品中识别的细胞核作为与各环形所限定的掩膜相乘的Voronoi划分的种子，从第二图像来生成局部背景区域。

在一些实施方案中，IF形态标记可包括4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色剂。在一些实施方案中，IF形态标记可配置成针对细胞角蛋白(CK)蛋白质和人表皮生长因子受体2(HER2)蛋白质中的至少一种。在一些实施方案中，荧光探针可配置成结合到HER2基因和染色体17着丝粒重复中的至少一个。

        附图简述

下面参照附图来描述实施方案的特征和方面，附图中，各要素不一定按比例示出。

图1是按照一个实施方案，用于处理表示组织样品中的生物单元的图像数据的过程的一个实例的框图。

图2示出示例性DAPI图像。

图3示出示例性细胞角蛋白图像。

图4示出按照一个实施方案，具有所分割的细胞核的图2的DAPI图像的一个实例。

图5示出按照一个实施方案，图4的DAPI图像的一个实例，显示了具有对应影响区、围绕各分割细胞核的环形。

图6示出按照一个实施方案，处理之后的示例性覆盖图像。

图7是按照一个实施方案，用于处理表示组织样品中的生物单元的图像数据的过程的一个实例的流程图。

图8示出按照一个实施方案的示例性计算系统。

图9示出按照一个实施方案的示例性网络环境。

发明详述

示例性实施方案涉及用于组合来自免疫荧光(IF)染色和同一生物试样的荧光原位杂交(FISH)染色的图像的信息以实现FISH分析结果的准确自动化计算的系统和方法。

定义

为了更清楚准确地描述和指出要求保护的发明主题，提供在以下描述和所附权利要求书中使用的具体术语的如下定义。

单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数对象，除非上下文另加明确规定。本文所使用的近似语言在本说明书和权利要求书中通篇可适用于修饰可准许改变的任何定量表示，而没有引起与其相关的基本功能的变化。相应地，通过例如“约”等术语所修饰的值不是要局限于所指定的准确值。除非另外说明，否则本说明书和权利要求书中使用的表示组分、性质(例如分子量、反应条件等)的所有数值将被理解为在所有情况下通过术语“约”来修饰。相应地，除非另加相反说明，否则以下说明书和所附权利要求书中提出的数值参数为近似值，其可根据本发明设法得到的预期性质而改变。各数值参数起码应当至少根据所报告的有效位数的数值并且通过应用普通舍入技术来理解。

如本文所使用的术语“结合剂”表示可结合到生物样品中的一个或多个靶的分子。结合剂可特异性结合到靶。适当结合剂可包括天然或修饰肽、蛋白质(例如抗体、亲和体或适体)、核酸(例如多核苷酸、DNA、RNA或适体)、多糖(例如凝集素、糖)、脂质、酶、酶底物或抑制剂、配体、受体、抗原或半抗原中的一种或多种。适当结合剂可根据待分析的样品和可用于检测的靶来选择。例如，样品中的靶可包括配体，而结合剂可包括受体，或者靶可包括受体，而结合剂可包括配体。类似地，靶可包括抗原，而结合剂可包括抗体或抗体片段，反过来也是一样。在一些实施方案中，靶可包括核酸，而结合剂可包括互补核酸。在一些实施方案中，靶和结合剂均可包括能够相互结合的蛋白质。

如本文所使用的术语“生物样品”表示从生物受试者所得到的样品，包括体内或体外得到的生物组织或液体来源的样品。这类样品非限制性地可以是从哺乳动物(包括人类)所分离的体液(例如血液、血浆、血清或尿)、器官、组织、级分和细胞。生物样品还可包括生物样品的切片，包括组织(例如器官或组织的截面部分)。生物样品还可包括来自生物样品的提取物、例如来自生物体液(例如血液或尿)的抗原。

生物样品可为原核来源或真核来源(例如昆虫、原生动物、鸟、鱼、爬行动物)。在一些实施方案中，生物样品是哺乳动物(例如大鼠、小鼠、牛、狗、驴、天竺鼠或兔)。在某些实施方案中，生物样品为灵长类来源(例如黑猩猩或人类)。

如本文所使用的术语“探针”表示具有结合剂和标记的试剂，例如信号发生器或酶。在一些实施方案中，结合剂和标记(信号发生器或酶)包含在单个实体中。结合剂和标记可直接(例如经由掺入结合剂中的荧光分子)或者间接(例如通过接头，其可包括切割位点)连接并且在单个步骤中应用于生物样品。在备选实施方案中，结合剂和标记包含在分立实体中(例如，能够结合靶的第一抗体以及能够结合第一抗体的酶或信号发生器标记的第二抗体)。当结合剂和标记(信号发生器或酶)是独立实体时，它们可在单个步骤或者多个步骤中应用于生物样品。如本文所使用的术语“荧光探针”表示具有偶联到荧光信号发生器的结合剂的试剂。

如本文所使用的术语“信号发生器”表示能够使用一种或多种检测技术(例如，光谱测定、热量测定、光谱学或者肉眼检查)来提供可检测信号的分子。可检测信号的适当实例可包括光信号和电信号或者放射信号。信号发生器的实例包括发色团、荧光团、拉曼活性标签或放射标签中的一种或多种。如上所述，关于探针，在一些实施方案中，信号发生器和结合剂可存在于单个实体(例如，具有荧光标记的结合靶的蛋白质)中。备选地，结合剂和信号发生器可以是分立实体(例如，受体蛋白质以及针对该特定受体蛋白质的标记抗体)，其在引入到样品时或之前彼此相关。

本文使用的术语“荧光团”或“荧光信号发生器”是指化合物，当通过暴露于特定波长的光来激发时，所述化合物发射不同波长的光。荧光团可根据其发射特性或“颜色”描述。绿色荧光团(例如Cy3、FITC和Oregon Green)的特征可为其通常在515-540纳米范围的波长下发射。红色荧光团(例如德克萨斯红、Cy5和四甲基若丹明)的特征可为其通常在590-690纳米范围的波长下发射。荧光团的实例包括但不限于4-乙酰氨基-4′-异硫氰酸根合芪-2,2′-二磺酸；吖啶；吖啶衍生物和异硫氰酸吖啶；5-(2′-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)；4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3,5-二磺酸酯(Lucifer Yellow VS)；N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；氨基苯甲酰胺；亮黄；香豆素；香豆素衍生物；7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)；7-氨基-三氟甲基香豆素(Coumaran 151)；四氯四溴荧光素(cyanosine)、4′,6-二脒基(diaminidino)-2-苯基吲哚 (DAPI)；5′,5”-二溴邻苯三酚-磺酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙基氨基-3-(4′-异硫氰酸根合苯基) 4-甲基香豆素；4,4′-二异硫氰酸根合二氢-芪-2,2′-二磺酸；4,4′-二异硫氰酸根合芪-2,2′-二磺酸；5-[二甲氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；伊红；伊红衍生物，例如异硫氰酸伊红；赤藓红；赤藓红衍生物，例如赤藓红B和异硫氰酸赤藓红；溴乙啶；荧光素和衍生物，例如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2′,7′-二甲氧基-4′,5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、QFITC (XRITC)；荧光胺衍生物(与胺反应时发荧光)；IR144；IR1446；异硫氰酸孔雀绿；4-甲基-7-羟基香豆素；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；碱性副品红；酚红、B-藻红蛋白；邻苯二甲醛衍生物(与胺反应时发荧光)；芘和衍生物，例如芘、芘丁酸酯(pyrene butyrate)和1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯(sucinimidyl 1-pyrene butyrate)；活性红4 (Cibacron.RTM.亮红3B-A)；若丹明和衍生物，例如6-羧基-X-若丹明(ROX)、6-羧基若丹明(R6G)、丽丝胺若丹明B磺酰氯、若丹明(Rhod)、若丹明B、若丹明123、异硫氰酸若丹明X、磺基若丹明B、磺基若丹明101和磺基若丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红)；N,N,N′,N′-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)；四甲基若丹明、四甲基若丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；玫红酸和镧系螯合物衍生物、量子点(quantum dots)、花菁、pyrelium染料和方酸菁(squaraines)。

如本文所使用的术语“原位”一般表示在原始位置发生的事件，例如在完整器官或组织中或者在器官或组织的代表性区段中。在一些实施方案中，靶的原位分析可对源于多种来源(包括有机体、器官、组织样品或细胞培养物)的细胞进行。原位分析提供情境(contextual)信息，其在靶从其原始位点被去除时可能丢失。相应地，靶的原位分析描述定位在整个细胞或组织样品中的靶结合探针的分析，无论细胞膜是完全完整还是部分完整的，其中靶结合探针保持在细胞中。此外，本文所公开的方法可用来在细胞或组织样品(其是固定或者未固定的)中原位分析靶。

如本文所使用的术语“辐射”或“辐照”表示将样品或溶液暴露于非电离辐射的动作或过程。在一些实施方案中，非电离辐射具有在350 nm与1.3μm之间的波长。在优选实施方案中，非电离辐射是波长为400-700 nm的可见光。可通过将样品或溶液暴露于能够发射某个波长或者波长范围的辐射的辐射源、例如灯，来实现辐照。在一些实施方案中，能够经过光致激发的分子因辐照而光致激发。在一些实施方案中，能够经历光致激发的分子是信号发生器、例如荧光信号发生器。在一些实施方案中，荧光信号发生器的辐照引发荧光信号发生器与信号灭活剂之间的光致反应。在一些实施方案中，辐照引发光致反应，其通过光敏化化学漂白来灭活信号发生器。在其他实施方案中，信号灭活剂经历光致激发，以生成反应性部分，其与信号发生器发生反应以灭活信号。光学过滤器可用来将样品或溶液的辐照限制到特定波长或波长范围。在一些实施方案中，光学过滤器可用来将辐照限制到窄范围波长，以选择性光致激发能够经历光致激发的一个或多种分子。

如本文所使用的术语“选择性光致激发”表示动作或过程，由此能够经历光致激发的一种或多种分子在能够经历光致激发的一种或多种其他分子(其在辐照之后保持在电子基态)存在的情况下被光致激发。

在一些实施方案中，能够经历光致激发的分子是荧光染料、例如花菁染料。在一个进一步实施方案中，限制到620-680 nm之间的波长范围的辐照用于Cy5染料的选择性光致激发。在备选实施方案中，样品在特定波长的辐照也可通过使用激光来实现。

示例性实施方案的一般描述

在一个实施方案中，生物试样中的细胞类型(例如上皮或者非上皮)的确定可使用IF标记来自动化，其中IF信号的强度定义试样中的给定细胞是否为感兴趣的。包含IF和FISH标记的图像可通过迭代分析技术来复用，并且各细胞可根据其类型(例如上皮或者非上皮)自动分类。这使FISH分析能够限制到感兴趣细胞(例如上皮细胞)，供准确、完全自动化的计数统计。虽然IF和FISH是互斥技术，但是它们可同时或依次进行。例如在美国专利No.7629125和美国专利No.7741046中描述了迭代分析单独样品的方法，通过引用将其每个完整地结合于此。

图1是示出按照一个实施方案、用于选择性细化FISH结果的过程的一个实例的框图。对该过程的输入是来自FISH染色集合和CK的染色的DAPI图像以及来自IF染色循环的CK和/或人表皮生长因子受体2(Her2) IF图像。一些实施方案可用于人类肿瘤的标准福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品。例如，可使用乳癌样品。在这个实例中，样品切割成4微米细切片，将其放置在显微镜载片上，并且经过处理以使用常规方法进行免疫染色。

在第一染色步骤中，进行细胞角蛋白(CK)的免疫荧光(IF)染色和/或人表皮生长因子受体2(Her2)以及DAPI染色，并且记录对应荧光图像。随后，针对Her2和CEP17 FISH将载片染色，DAPI染色，并且然后从与对于IF染色相同的位置来成像。这个过程产生样品中的完全相同细胞的图像的两个集合。图像的一个集合包含对应DAPI、CK和Her2 IF信号(示为输入110)，以及图像的另一集合包含对应DAPI、Her2 FISH和CEP17 FISH信号(示为输入120)。图2示出示例性DAPI图像，以及图3示出对应细胞角蛋白图像。然后使用其相应DAPI信号将IF和FISH成像循环配准(以130示出)，并且图像分析算法用来分割(140)、分类(150)和测量(160)信号。该过程的输出包括按照图像中的细胞的分类所过滤的分析结果(例如从结果中去除非上皮细胞)。

细胞的分类(例如分类为上皮或者非上皮)可通过使用小波分割技术以分割DAPI图像中的细胞核、之后接着分离接触细胞核的步骤来开始。将距离变换应用于分割的细胞核并且对这个距离定阈值将使围绕各细胞核(其接近如图4所示的细胞质的影响区)的环形的集合。为了生成各细胞核的唯一细胞质环形以及避免使这些环形重叠其他细胞核(其会导致不正确测量区域)，Voronoi划分可用来限制环形的影响区。这例如可通过使用细胞核分割作为与环形所创建的掩膜相乘的种子的分水线分割来实现。然后可在这些限制环形中测量IF通道的平均强度，以通过将平均强度值与阈值进行比较，来确定细胞是否为上皮的。Voronoi划分的结果在于，分离细胞具有围绕它们的全环形，而紧密堆积的细胞具有限制区域，例如图5所示。所有细胞上的FISH信号然后可使用FISH点计数算法(160、170)来处理。来自FISH点计数算法(160、170)的结果可按照上皮/非上皮分类来过滤(180)，以便仅产生FISH分析形式上皮细胞。图6分别示出使用上述示例性过程的处理之后、图2和图3的DAPI和细胞角蛋白的覆盖的一个实例。

在另一个实施方案中，IF图像包含细胞角蛋白(CK)标记，并且可使用Otsu的定阈值方法来定阈值，以估计第一图像中的上皮区域的最小强度级。通过计算包围细胞核的环形中的平均细胞角蛋白(CK)强度，并且将平均CK强度与上皮区域的所估计的最小强度级进行比较，各细胞核可分类为上皮或者非上皮的。在另一个实施方案中，阈值可由用户在观察例如上皮与非上皮细胞的分类的变化的同时交互地改变。在又一实施方案中，提供交互工具，以允许用户选择上皮区域，其示出所述的图像，并且允许用户通过改变所包含区域的强度阈值的“浮动块”来修改选择。

图7是按照一个实施方案的图像分析过程700的一个实例的流程图。在步骤702，包含来自IF形态标记的信号的组织样品的第一图像例如由处理器来接收。在步骤704，接收包含来自荧光探针的信号的同一组织样品的第二图像。组织样品例如可与荧光探针原位杂交。

在步骤706，将第一图像中的各生物单元分类为至少两个类别，例如上皮和非上皮之一。在步骤708，FISH分析使用第二图像来执行。在步骤710，FISH分析的结果按照各生物单元的分类来过滤。例如，可以仅保存与分类为上皮的细胞有关的结果，而可丢弃与其他细胞有关的结果。

在一些实施方案中，分类步骤706可在已经分割第二图像中的细胞核之后执行。可通过首先将第一图像中的信号的位置与第二图像中的信号的位置配准，来实现分割(步骤712)。这个配准使第一和第二图像能够相对细胞对齐。在步骤714，可使用应用于第二图像的小波变换来分割细胞核。在步骤716，从来自分割细胞核的阈值距离图来生成Voronoi划分和环形。环形可限制成至少部分仅包围一个细胞核，以促进在步骤706所执行的分类，例如以上针对图1所述。Voronoi划分实现使用细胞核作为与各环形所限定的掩膜相乘的划分的种子来生成第二图像中的局部背景区域。

其他示例性实施方案

在一些实施方案中，生物试样可包含附于固体支持物的多个靶。在一些实施方案中，生物试样可包括组织样品、完整细胞、细胞组分、细胞离心涂片或细胞涂片。在一些实施方案中，生物试样可包括组织样品或组织成分。组织样品可包括从可具有相似功能的生物受试者的组织所得到的相似细胞的集合。在一些实施方案中，组织样品可包括从人体组织所得到的相似细胞的集合。人体组织的适当实例包括但不限于：(1) 上皮；(2) 结缔组织，包括血管、骨和软骨；(3) 肌肉组织；以及(4) 神经组织。组织样品的来源可以是：从新鲜、冷冻和/或保存器官或组织样品或活组织检查或抽吸物所得到的固体组织；血液或者任何血液组分；体液，例如脑脊液、羊膜液、腹膜液或间质液；或者来自受试者的妊娠或发育的任何时间的细胞。在一些实施方案中，组织样品可包括原代或培养细胞、循环疾病或正常细胞、响应传染剂的活化白细胞或者细胞系。

在一些实施方案中，生物试样包括来自健康或患病组织样品的组织切片(例如来自结肠、乳腺组织、前列腺的组织切片)。组织切片可包括组织样品的单个部分或单片，例如从组织样品所切割的组织或细胞的薄切片。在一些实施方案中，组织样品的多个切片可被获取、例如组织微阵列，并且经过IF和FISH分析。在一些实施方案中，组织样品的同一切片可在形态和分子水平来分析。组织切片在被用作生物样品时可具有在小于约100微米的范围中、在小于约50微米的范围中、在小于约25微米的范围中或者在小于约10微米的范围中的厚度。

在一些实施方案中，生物样品或者生物样品中的靶可附于固体支持物。固体支持物可包括微阵列(例如DNA或RNA微阵列)、凝胶、印迹、玻璃载片、珠或ELISA板。在一些实施方案中，生物样品或者生物样品中的靶可附于选自尼龙、硝基纤维素和聚偏二氟乙烯的膜。在一些实施方案中，固体支持物可包括选自聚苯乙烯、聚碳酸酯和聚丙烯的塑料表面。

按照本发明的一个实施方案的生物样品可以是固体或流体。生物样品的适当实例可包括但不限于培养物、血液、血浆、血清、唾液、脑脊液、胸膜液、乳汁、淋巴液、痰、精液、尿、粪便、泪液、唾液、针抽吸物、皮肤的外部切片、呼吸道、肠道以及生殖泌尿道、肿瘤、器官、细胞培养物或细胞培养组分或者固体组织切片。在一些实施方案中，生物样品按原样、即在没有感兴趣靶的收集和/或分离的情况下被分析。

生物样品可包括上述样品的任一个，而与其物理状况(非限制性地例如冷冻或染色或者以其他方式处理)无关。在一些实施方案中，生物样品可包括化合物，其在性质上没有与样品天然混合，例如防腐剂、抗凝血剂、缓冲剂、固定剂、营养素、抗生素等。

样品可以是冷冻组织切片或者石蜡包埋样品。石蜡样品表示那些样品，其中生物样品先前被固定在例如多聚甲醛中之后接着包埋在蜡中。在一些实施方案中，组织样品可首先被固定，并且然后通过乙醇的递增系列来脱水，采用石蜡或其他切片介质来渗入和包埋，使得可将组织样品切片。在一备选实施方案中，组织样品可被切片并且随后被固定。在一些实施方案中，组织样品可在石蜡中包埋和处理。可使用的石蜡的实例包括但不限于Paraplast、Broloid和Tissuemay。一旦包埋组织样品，样品可由切片机切片为可具有在从约3微米至约5微米的范围中的厚度的切片。一旦被切片，切片可使用粘合剂来附着到载片。载片粘合剂的实例可包括但不限于硅烷、明胶、聚-L-赖氨酸。在实施方案中，如果石蜡用作包埋材料，则组织切片可在水中去石蜡化和再水合。可例如通过使用有机剂(例如二甲苯和逐渐递减系列的乙醇或洗涤剂)，对组织切片去石蜡化。

在一些实施方案中，除了上述样品制备过程之外，组织切片可在原位杂交和/或免疫组织化学之前、期间或之后经过进一步处理。例如，在一些实施方案中，组织切片可经过表位修复方法，例如在柠檬酸盐缓冲剂中的组织样品的加热。在一些实施方案中，组织切片可选地可经过封闭步骤，以使非特异性结合为最小。

待分析的靶的适合性可根据生物样品所需的分析的类型和性质来确定。在一些实施方案中，靶可提供与生物样品中的分析物是否存在有关的信息。在另一个实施方案中，靶可提供关于生物样品的状态的信息。例如，如果生物样品包括包括组织样品，则本文所公开的方法可用来检测靶，其可帮助比较不同类型的细胞或组织，比较不同发育阶段，检测疾病或异常的存在，或者确定疾病或异常的类型。

在一些实施方案中，生物样品中的靶可包括肽、蛋白质(例如抗体、亲和体或适体)、核酸(例如多核苷酸、DNA、RNA或适体)、多糖(例如凝集素、糖)、脂质、酶、酶底物、配体、受体、抗原或半抗原中的一种或多种。在一些实施方案中，靶可基本上包括蛋白质或核酸。上述靶的一种或多种可为特定细胞特有的，而其他靶可与特定疾病或状况关联。在一些实施方案中，可使用本文所公开方法来检测和分析的靶可包括但不限于预后靶、激素或激素受体靶、淋巴样靶、肿瘤靶、细胞周期相关靶、神经组织和肿瘤靶或者簇分化靶。

预后靶的适当实例可包括酶靶，例如半乳糖转移酶II、神经元特异性烯醇酶、质子ATP酶-2或者酸性磷酸酶。

激素或激素受体靶的适当实例可包括人类绒毛膜促性腺激素(HCG)、促肾上腺皮质激素、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、雌激素受体、孕酮受体、雄性激素受体、gC1q-R/p33补体受体、IL-2受体、p75神经营养因子受体、PTH受体、甲状腺激素受体或者胰岛素受体。

淋巴样靶的适当实例可包括α-1-抗胰凝乳蛋白酶、α-1-抗胰蛋白酶、B细胞靶、bcl-2、bcl-6、B淋巴细胞抗原36 kD、BM1(骨髓样靶)、BM2(骨髓样靶)、半乳凝素-3、粒酶B、HLA类I抗原、HLA类II(DP)抗原、HLA类II(DQ)抗原、HLA类II(DR)抗原、人中性粒细胞防御素、免疫球蛋白A、免疫球蛋白D、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、κ轻链、λ轻链、淋巴细胞/组织细胞抗原、巨噬细胞靶、胞壁质酶(溶菌酶)、p80间变性淋巴瘤激酶、浆细胞靶、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂、T细胞抗原受体(JOVI 1)、T细胞抗原受体(JOVI 3)、末端脱氧核糖核酸转移酶或者未分簇B细胞靶。

肿瘤靶的适当实例可包括α胎蛋白、载脂蛋白D、BAG-1(RAP46蛋白质)、CA19-9(唾液酸化路易糖(sialyl lewisa))、CA50(癌相关黏液素抗原)、CA125(卵巢癌抗原)、CA242(肿瘤相关粘蛋白抗原)、嗜铬粒蛋白A、丛生蛋白(载脂蛋白J)、上皮膜抗原、上皮相关抗原、上皮特异性抗原、巨囊性病液状蛋白-15、肝细胞特异性抗原、heregulin、人类胃粘蛋白、人乳脂肪球、MAGE-1、基质金属蛋白酶、melan A、黑素瘤靶(HMB45)、间皮素、金属硫蛋白、小眼球转录因子(MITF)、Muc-1核心糖蛋白、Muc-1糖蛋白、Muc-2糖蛋白、Muc-5AC糖蛋白、Muc-6糖蛋白、髓过氧物酶、Myf-3(横纹肌肉瘤靶)、Myf-4 (横纹肌肉瘤靶)、MyoD1(横纹肌肉瘤靶)、肌红蛋白、nm23蛋白质、胎盘碱性磷酸酶、前清蛋白、前列腺特异性抗原、前列腺酸性磷酸酶、前列腺抑制肽、PTEN、肾脏细胞癌靶、小肠粘蛋白抗原、四连接素、甲状腺转录因子-1、基质金属蛋白酶1的组织抑制剂、基质金属蛋白酶2的组织抑制剂、酪氨酸酶、酷氨酸酶相关蛋白质-1、绒毛蛋白或者血管性血友病因子。

细胞周期相关靶的适当实例可包括凋亡蛋白酶活化因子-1、bcl-w、bcl-x、溴脱氧尿苷、CAK (cdk活化激酶)、细胞凋亡敏感性蛋白质(CAS)、半胱天冬酶2、半胱天冬酶8、CPP32 (半胱天冬酶-3)、CPP32 (半胱天冬酶-3)、细胞周期蛋白依赖性激酶、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白D2、细胞周期蛋白D3、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白G、DNA片断化因子(N-末端)、Fas (CD95)、Fas相关死亡结构域蛋白质、Fas配体、Fen-1、IPO-38、Mcl-1、微型染色体维持蛋白、错配修复蛋白(MSH2)、聚(ADP-核糖)聚合酶、增殖细胞核抗原、p16蛋白质、p27蛋白质、p34cdc2、p57蛋白质(Kip2)、p105蛋白质、Stat 1 α、拓扑异构酶I、拓扑异构酶II α、拓扑异构酶III α或者拓扑异构酶II β。

神经组织和肿瘤靶的适当实例可包括α B晶状体蛋白、α-中连蛋白、α突触核蛋白、淀粉样前蛋白、β淀粉样、钙结合蛋白、胆碱乙酰基转移酶、兴奋性氨基酸转运蛋白1、GAP43、胶质原纤维酸性蛋白、谷氨酸受体2、髓鞘碱性蛋白、神经生长因子受体(gp75)、成神经细胞瘤靶、神经丝68 kD、神经丝160 kD、神经丝200 kD、神经元特异性烯醇酶、烟碱型乙酰胆碱受体α4、烟碱型乙酰胆碱受体β2、外周蛋白、蛋白基因产物9、S-100蛋白质、血清素、SNAP-25、突触蛋白I、突触素、tau、色氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶或泛素。

簇分化靶的适当实例可包括CD1a、CD1b、CD1 c、CD1d、CD1e、CD2、CD3 δ、CD3 ε、CD3 γ、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8 α、CD8 β、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16a、CD16b、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD44R、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD65s、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CDw92、CDw93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CDw108、CD109、CD114、CD115、CD116、CD117、CDw119、CD120a、CD120b、CD121a、CDw121b、CD122、CD123、CD124、CDw125、CD126、CD127、CDw128a、CDw128b、CD130、CDw131、CD132、CD134、CD135、CDw136、CDw137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CDw145、CD146、CD147、CD148、CDw149、CDw150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD157、CD158a、CD158b、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166和TCR-ζ。

其他适当预后靶可包括着丝粒蛋白F(CENP-F)、巨蛋白、外皮蛋白、核纤层蛋白A&C(XB 10)、LAP-70、粘蛋白、核孔复合体蛋白、p180层状体蛋白、ran、r、组织蛋白酶D、Ps2蛋白质、Her2-neu、P53、S100、上皮靶抗原(EMA)、TdT、MB2、MB3、PCNA或Ki67。

来自信号发生器的信号可使用多种观测或检测系统来检测。所使用的检测系统的性质可取决于所使用的信号发生器的性质。检测系统可包括例如电荷耦合器件(CCD)检测系统、互补金属氧化物半导体(CMOS)成像检测系统、荧光检测系统、电检测系统、摄影胶片检测系统、化学发光检测系统、酶检测系统、光学检测系统、近场检测系统或者全内反射(TIR)检测系统。

上述技术的一种或多种可用来观测来自信号发生器(与结合剂偶联或者与酶底物偶联)的一种或多种特性。在一些实施方案中，信号强度、信号波长、信号位置、信号频率或者信号偏移可使用上述技术的一种或多种来确定。在一些实施方案中，可观测、测量和记录信号的一种或多种上述特性。

在一些实施方案中，观测信号是荧光信号，以及结合到生物样品中的靶的探针可包括作为荧光团的信号发生器。在一些实施方案中，可通过使用荧光检测系统确定荧光波长或荧光强度，来测量荧光信号。在一些实施方案中，信号可原位观测，也就是说，可从通过结合剂关联到生物样品中的靶的信号发生器直接观测信号。在一个实施方案中，来自信号发生器的信号可在生物样品中分析，从而避免对独立的基于阵列的检测系统的需要。

在一些实施方案中，观测信号可包括捕获生物样品的图像。在一些实施方案中，按照本文所公开的方法，连接到成像装置的显微镜可用作检测系统。在一些实施方案中，可激发信号发生器(例如荧光团)，并且可观测和记录呈数字信号(例如数字化图像)形式的所得信号(例如荧光信号)。相同过程可对于使用适当荧光过滤器在样品中结合的不同信号发生器(若存在的话)重复进行。

在一些实施方案中，可在同一样品中观测多种不同类型的信号。例如，一个靶可采用荧光探针来检测，而同一样品中的第二靶可采用发色探针来检测。

在一些实施方案中，生物样品可与形态染色剂或标记接触。形态染色剂可包括染料，其可对不同细胞成分染色，以便促进细胞类型或疾病状态的识别。在一些实施方案中，形态染色剂可易于与探针中的信号发生器区分，也就是说，染色剂可以不发射可与来自探针的信号重叠的信号。例如，对于荧光形态染色剂，来自形态染色剂的信号可以不是在与探针所使用的荧光团相同的波长中自发荧光。

在一些实施方案中，发色团、荧光团、酶或者酶底物可用作形态染色剂。可用作形态染色剂的发色团(及其靶细胞、亚细胞区室或细胞成分)的适当实例可包括但不限于伊红(碱性细胞成分、细胞质)、苏木精(核酸)、橙G(红血细胞、胰腺细胞和垂体细胞)、浅绿SF(胶原)、罗曼诺斯基-吉姆沙(总细胞形态)、迈格吉(血细胞)、蓝色复染剂(Trevigen)、乙基绿(CAS)(淀粉样)、Feulgen萘酚黄S (DNA)、吉姆萨(有差别地对各种细胞区室进行染色)、甲基绿(淀粉样)、派若宁(核酸)、萘酚黄(红血细胞)、中性红(细胞核)、巴氏染色(苏木精、伊红Y、橙G和俾斯麦棕混合物的混合物(总细胞形态))、红色复染剂B(Trevigen)、红色复染剂C (Trevigen)、天狼星红(淀粉样)、福尔根试剂(副品红)(DNA)、氰宁铬明矾(DNA)、氰宁铬明矾和萘酚黄S(DNA)、甲基绿-派洛宁Y(DNA)、硫堇-福尔根试剂(DNA)、吖啶橙(DNA)、亚甲蓝(RNA和DNA)、甲苯胺蓝(RNA和DNA)、阿辛蓝(碳水化合物)、钌红(碳水化合物)、苏丹黑(脂质)、苏丹IV(脂质)、油红-O (脂质)、万吉森三色染色剂(酸性品红和苦味酸混合物)(肌细胞)、马森三色染色(苏木精、酸性品红和浅绿混合物)(对胶原、细胞质、核仁(nucleioli)差异染色)、醛品红(弹性蛋白纤维)或魏格特染色剂(区分网状和胶原纤维)。

适当荧光形态染色剂及其靶细胞、亚细胞区室或细胞成分(若适用)的实例可包括但不限于，4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(核酸)、伊红(碱性细胞组分，细胞质)、Hoechst 33258和Hoechst 33342(两种双苯甲亚胺)(核酸)、碘化丙锭(核酸)、光谱橙(核酸)、光谱绿(核酸)、奎纳克林(核酸)、荧光鬼笔环肽(肌动蛋白纤维)、色霉素A 3(核酸)、吖啶黄-福尔根反应(核酸)、金胺O-福尔根反应(核酸酸)、溴化乙锭(核酸)、尼氏染色剂(神经元)、高亲和力DNA荧光团(例如POPO、BOBO、YOYO和TOTO等)以及融合到DNA结合蛋白的绿荧光蛋白例如组蛋白、ACMA、奎纳克林和吖啶橙。

适当酶及其原始细胞位置或活性的实例可包括但不限于ATP酶(肌肉纤维)、琥珀酸脱氢酶(线粒体)、细胞色素c氧化酶(线粒体)、磷酸化酶(线粒体)、磷酸果糖激酶(线粒体)、乙酰胆碱酯酶(神经细胞)、乳糖酶(小肠)、酸性磷酸酶(溶酶体)、亮氨酸氨肽酶(肝细胞)、脱氢酶(线粒体)、肌腺苷酸脱氨酶(肌细胞)、NADH心肌黄酶(红细胞)和蔗糖酶(小肠)。

在某些实施方案中，形态染色剂对于灭活剂可以是稳定的，也就是说，形态染色剂的信号生成性质可以基本上不受灭活剂影响。在一些实施方案中，在生物样品可同时采用探针和形态染剂色来染色的情况下，应用灭活剂以改变来自探针的信号可不改变来自形态染色剂的信号。在一些实施方案中，形态染色剂可用作对照以共同配准通过迭代探测步骤所得到的分子信息以及通过形态染色剂所得到的形态信息。

本文公开的涉及蛋白质、RNA和DNA检测的方法一般涉及使用结合剂，其在物理上按照特定方式结合到靶。因此，在一些实施方案中，结合剂可以以充分特异性结合到靶，也就是说，结合剂可以以比它对任何其他分子的更大亲和力而结合到靶。在一些实施方案中，结合剂可结合到其他分子，但是结合可以是使得非特异结合可处于或接近背景水平。在一些实施方案中，感兴趣靶的结合剂的亲和力可为它对其他分子的亲和力的至少2倍、至少5倍、至少10倍或以上的范围。在一些实施方案中，可采用具有最大差别亲和力的结合剂，但是它们可能不是对靶具有最大亲和力的那些结合剂。

在一些实施方案中，靶与结合剂之间的结合可受到物理结合影响。物理结合可包括使用非共价相互作用所实现的结合。非共价相互作用可包括但不限于疏水相互作用、离子相互作用、氢键相互作用或者亲和力相互作用(例如生物素-亲和素或生物素-链霉亲和素复合)。在一些实施方案中，靶和结合剂在其表面上或者腔中可具有这样的区域，其引起产生物理结合的两者之间的特异性识别。在一些实施方案中，结合剂可基于其分子形状的一部分的相互拟合来结合到生物靶。

结合剂及其对应靶可被认为是结合对，其非限制性实例包括：免疫类型结合对，例如抗原/抗体、抗原/抗体片段或半抗原/抗半抗原；非免疫类型结合对，例如生物素/亲和素、生物素/链霉亲和素、叶酸/叶酸结合蛋白质、激素/激素受体、凝集素/特异碳水化合物、酶/酶、酶/底物、酶/底物类似物、酶/假底物(不能通过酶活性来催化的底物类似物)、酶/辅因子、酶/调节剂、酶/抑制剂或维生素B12/内因子。结合对的其他适当实例可包括：互补核酸片段(包括DNA序列、RNA序列、LNA序列和PNA序列)；蛋白A/抗体；蛋白G/抗体；核酸/核酸结合蛋白；或者多核苷酸/多核苷酸结合蛋白。

在一些实施方案中，结合剂可以是序列或结构特异性结合剂，其中由结合剂所识别和结合的靶的序列或结构可以是对该靶充分独特的。

在一些实施方案中，结合剂可以是结构特异的，并且可识别靶的一级、二级、三级结构。靶的一级结构可包括其原子组成以及连接那些原子的化学键(包括立体化学)的规格，例如蛋白质中的氨基酸的线性排列的类型和性质。靶的二级结构可表示生物分子的区段的一般三维形式，例如，对于蛋白质，二级结构可表示将肽“主”链折叠到各种构象中，其可使远处氨基酸相互接近。二级结构的适当实例可包括但不限于α螺旋、β折叠片或随机卷曲。靶的三级结构可以是其总体三维结构。靶的四级结构可以是通过它与一种或多种其他靶或大分子的非共价相互作用(例如蛋白质相互作用)所形成的结构。四级结构的实例可以是通过产生血红蛋白的四个珠蛋白的蛋白亚单位所形成的结构。按照本发明的实施方案的结合剂对于上述结构的任一个可以是特异的。

结构特异性结合剂的实例可包括蛋白质特异性分子，其可结合到蛋白质靶。适当蛋白质特异性分子的实例可包括抗体和抗体片段、核酸(例如识别蛋白质靶的适体)或蛋白质底物(不可催化的)。

在一些实施方案中，结合剂可以是序列特异性的。序列特异性结合剂可包括核酸，并且结合剂可以能够识别靶中的核苷酸或者其衍生物的特定线性排列。在一些实施方案中，线性排列可包括相邻核苷酸或者其衍生物，其各可结合到结合剂中的对应互补核苷酸。在一备选实施方案中，序列可以不是相邻的，因为可存在在探针上没有对应互补残基的一个、两个或更多个核苷酸。基于核酸的结合剂的适当实例可包括但不限于DNA或RNA寡核苷酸或者多核苷酸。在一些实施方案中，适当核酸可包括核酸类似物，例如dioxygenin dCTP、生物素dcTP 7-氮杂鸟苷、叠氮胸苷、肌苷或尿苷。

不管结合剂和靶的类型，在蛋白质、DNA和RNA检测中，结合剂与靶之间的结合的特异性也可根据结合条件而受影响(例如在互补核酸的情况下的杂交条件)。适当结合条件可通过调节pH、温度或盐浓度中的一个或多个来实现。

结合剂可被内源性标记(在结合剂的合成期间所连接的信号发生器或酶)或者被外源性标记(在后一步骤期间所连接的信号发生器或酶)。例如，对于基于蛋白质的结合剂，被内源性标记的结合剂可通过采用标记的氨基酸来制备。类似地，被内源性标记的核酸可使用将信号发生器标记的核苷酸直接掺入生长核酸中的方法来合成。在一些实施方案中，结合剂可按照使得信号发生器或酶可在后一阶段掺入的方式来合成。例如，这后一标记可通过将活性氨基或硫醇基引入肽链的核酸中的化学方式来实现。在一些实施方案中，结合剂、例如蛋白质(例如抗体)或核酸(例如DNA)可使用适当化学直接化学标记。

在一些实施方案中，可使用结合剂的组合，其可提供更大特异性或者在某些实施方案中的信号的放大。因此，在一些实施方案中，可使用结合剂的夹心，其中第一结合剂可结合到靶并且用来提供二级结合，其中二级结合剂可以或者可以不包括标记，这可进一步提供三级结合(在需要时)，其中三级结合成员可包括标记。

结合剂组合的适当实例可包括第一抗体-第二抗体、互补核酸或者其他配体-受体对(例如生物素-链霉亲和素)。适当结合剂对的一些具体实例可包括：针对具有c-myc表位的重组表达蛋白质的小鼠抗myc，针对具有His-标签表位的重组蛋白质的小鼠抗HisG，针对具有表位标签的重组蛋白质的小鼠抗xpress，针对山羊IgG一级分子的兔抗山羊，针对核酸的互补核酸序列；针对硫氧还蛋白融合蛋白的小鼠抗thio，针对融合蛋白的兔抗GFP，针对?-D-半乳糖的榴莲凝素；以及针对糖类结合蛋白的蜜二糖，糖，镍偶联基质或肝素。

在一些实施方案中，第一抗体和第二抗体的组合可用作结合剂。第一抗体可以能够结合到靶的特定区域，以及第二抗体可以能够结合到第一抗体。第二抗体可在结合到第一抗体之前连接到信号发生器或酶，或者可以能够在后一步骤结合到信号发生器或酶。在一备选实施方案中，可使用第一抗体和特异性结合配体-受体对(例如生物素-链霉亲和素)。第一抗体可连接到该对的一个成员(例如生物素)和另一成员(例如链霉亲和素)可采用信号发生器或酶来标记。第二抗体、亲和素、链霉亲和素或生物素各可采用信号发生器或酶单独标记。

在一些实施方案中，本文所公开的方法可用于免疫染色过程中，以及第一抗体可用来特异性结合靶蛋白质。第二抗体可用来特异性结合到第一抗体，由此形成第一抗体与后续试剂(例如信号发生器或酶)之间的桥(若有的话)。例如，第一抗体可以是小鼠IgG(在小鼠中产生的抗体)，以及对应第二抗体可以是具有能够结合到小鼠IgG中的区域的山羊抗小鼠(在山羊中产生的抗体)。

在一些实施方案中，当若干第二抗体可结合到第一抗体上的表位时，可得到信号放大。在免疫染色过程中，第一抗体可以是该过程中使用的第一抗体，以及第二抗体可以是该过程中使用的第二抗体。在一些实施方案中，第一抗体可以是免疫染色过程中使用的唯一抗体。

适合于本文所公开方法的信号发生器的类型可取决于多种因素，包括所进行的分析的性质、所使用的能源和检测器的类型、所采用的灭活剂的类型、结合剂的类型、靶的类型或者结合剂与信号发生器之间的连接模式(例如可裂解或者不可裂解的)。

适当信号发生器可包括能够提供可检测信号的分子或化合物。信号发生器可在与能源或电流的相互作用之后提供特征性信号。能源可包括电磁辐射源和荧光激发源。电磁辐射源可以能够提供任何波长(包括可见、红外和紫外)的电磁能量。电磁辐射可采取直接光源的形式，或者可通过光发射化合物、例如供体荧光团来发射。荧光激发源可以能够使源发荧光，或者可引起光子发射(即，电磁辐射、定向电场、温度、物理接触或者机械中断)。适当信号发生器可提供能够通过多种方法所检测的信号，包括光学测量(例如荧光)、电导率或放射性。适当信号发生器可以是例如发光的、能量接受的、发荧光的、放射性的或者猝灭的。

适当信号发生器可在空间上和化学上兼容与其结合的组分、例如结合剂。另外，适当信号发生器可以不干扰结合剂与靶的结合，也可以不影响结合剂的结合特异性。适当信号发生器本质上可以是有机或无机的。在一些实施方案中，信号发生器可具有化学、肽或核酸性质。

适当信号发生器可以是直接可检测的。直接可检测的部分可以是可根据其发射信号的能力直接检测的部分，例如在通过另一个较低特征性波长的光的激发之后发射特定波长的荧光标记，和/或吸收特定波长的光的荧光标记。

按照本文所公开方法是适合的信号发生器可经受化学试剂施用时的处理。在一些实施方案中，信号发生器可以能够在暴露于灭活剂时以化学方式被破坏。化学破坏可包括信号发生器的完全分解或者信号发生器的信号生成组分的改变。信号生成组分的改变可包括任何化学修改(例如添加、取代或去除)，其可引起信号生成性质的改变。例如，使缀合的信号发生器脱缀合(unconjugate)可引起信号发生器的发色性质的破坏。类似地，对荧光信号发生器的荧光抑制性官能团的取代可引起其荧光性质的改变。在一些实施方案中，对通过特定化学试剂的灭活具有显著抗性的一个或多个信号发生器可用作所提供方法中的对照探针。

在一些实施方案中，信号发生器可选自光发射分子、放射性同位素(例如P32或H3、14C、125I和131I)、光或电子密度标记、拉曼活性标签、电子自旋共振分子(例如硝酰基自由基)、电荷传递分子(即，电荷转导分子)、半导体纳米晶体、半导体纳米粒、胶态金纳米晶体、纳米珠、磁珠、顺磁性颗粒或者量子点。

在一些实施方案中，信号发生器可包括光发射分子。光发射分子可响应采用特定波长的光辐射而发射光。光发射分子可以能够通过发光(通过材料在激发时的电磁辐射的非热发射)、磷光(因辐射的吸收导致的延迟发光)、化学发光(因化学反应而发光)、荧光或偏振荧光来吸收和发射光。

在一些实施方案中，信号发生器可基本上包括荧光团。在一些实施方案中，信号发生器可基本上包括例如在免疫组织化学分析中连接到抗体的荧光团。可缀合到第一抗体的适当荧光团包括但不限于荧光素、若丹明、德克萨斯红、VECTOR红、ELF (酶标记的荧光)、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy7、FluorX、钙黄绿素、钙黄绿素-AM、CRYPTOFLUOR、橙(42 kDa)、橘红(35 kDa)、金(31 kDa)、红(42 kDa)、深红(40 kDa)、BHMP、BHDMAP、Br-Oregon、萤光黄、Alexa染料家族、N-[6-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基]己酰](NBD)、BODIPY、氟硼二吡咯(boron dipyrromethene difluoride)、Oregon Green、MITOTRACKER红、藻红蛋白、藻胆蛋白BPE (240 kDa) RPE (240 kDa) CPC (264 kDa) APC (104 kDa)、光谱蓝、光谱浅绿(Spectrum Aqua)、光谱绿、光谱金、光谱橙、光谱红、红外(IR)染料、环状GDP-核糖(cGDPR)、Calcofluor白、丽丝胺、伞形酮、酪氨酸或色氨酸。在一些实施方案中，信号发生器可基本上包括花菁染料。在一些实施方案中，信号发生器可基本上包括一种或多种Cy3染料、Cy5染料或Cy7染料。

在一些实施方案中，信号发生器可以是FRET对的一部分。FRET对包括两种荧光团，其能够在相互接近定位时经过FRET，以产生或消除可检测信号。供体的一些实例可包括Alexa 488、Alexa 546、BODIPY 493、Oyster 556、Fluor (FAM)、Cy3或TTR(Tamra)。受体的一些实例可包括Cy5、Alexa 594、Alexa 647或Oyster 656。

如上文所述，上述分子的一种或多种可用作信号发生器。在一些实施方案中，信号发生器的一种或多种可以不经受化学破坏，并且可裂解接头可用来将信号发生器与结合剂缔合。在一些实施方案中，信号发生器的一种或多种可经受信号破坏，并且信号发生器可基本上包括能够以化学方式被破坏的分子。在一些实施方案中，信号发生器可包括能够通过氧化剂而化学破坏的荧光团。在一些实施方案中，信号发生器可基本上包括能够通过氧化剂而化学破坏的花菁、香豆素、BODIPY、ATTO 658、量子点或ATTO 634。在一些实施方案中，信号发生器可基本上包括能够被破坏或猝灭的一种或多种Cy3染料、Cy5染料或Cy7染料。

在一些实施方案中，探针可包括偶联到酶的结合剂。在一些实施方案中，适当酶催化底物的化学反应，以形成反应产物，其可结合到样品或者样品与其结合的固体支持物中存在的受体(例如酚基)。受体可以是外源性的(即，外在地附着到样品或固体支持物的受体)或者内源性的(内在地存在于样品或固体支持物中的受体)。可实现信号放大，因为单个酶可催化底物的化学反应，以共价地结合靶附近的多个信号发生器。

在一些实施方案中，适当酶也可以能够通过氧化剂来灭活。适当酶的实例包括过氧物酶、氧化酶、磷酸酶、酯酶和糖苷酶。适当酶的具体实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、脂肪酶和葡糖氧化酶。在一些实施方案中，酶是选自辣根过氧化物酶、细胞色素C过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、微过氧化物酶、髓过氧物酶、乳过氧化物酶和大豆过氧化物酶的过氧物酶。

在一些实施方案中，结合剂和酶可包含在单个实体，例如能够结合到靶并且还催化底物的化学反应的蛋白质分子中。在其他实施方案中，结合剂和酶可包含在独立实体中，并且可通过共价键形成或者通过使用配体-受体缀合对(例如生物素链霉亲和素)来偶联。

酶底物可根据所采用的酶以及可用于在样品中或者固体支持物上进行结合的靶来选择。例如，在包括作为酶的HRP的实施方案中，底物可包括取代酚(例如酪胺)。HRP与酪胺的反应可产生活化酚类底物，其可结合到外源性受体，例如生物样品的表面蛋白质中存在的富含电子的部分(例如酪氨酸或色氨酸)或者酚基。在备选实施方案中，当3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐(MBTH)可连同HRP酶用作底物时，外源性受体例如对二甲氨基苯甲醛(DMAB)可在与底物发生反应之前附着于固体支持物或生物样品。

在一些实施方案中，酶底物可在与酶发生反应之后脱磷酸。脱磷酸的反应产物可以能够结合到样品或固体支持物中的内源性或外源性受体(例如抗体)。例如，酶可和碱性磷酸酶(AP)，以及底物可包括NADP、取代磷酸盐(例如硝基苯基磷酸盐)或磷酸化生物素。受体可相应地包括NAD结合蛋白、针对脱磷酸反应产物的抗体(例如抗硝基酚)、亲和素或链霉亲和素。

在一些实施方案中，酶可包括β-半乳糖苷酶，以及底物可包括荧光素或香豆素的β-半乳吡喃糖基-糖苷。受体可包括针对去糖基化部分的抗体(例如抗荧光素或者抗香豆素)。在一些实施方案中，多个酶组合、例如HRP/AP可用作酶。底物可包括磷酸化取代苯酚、例如磷酸酪氨酸，其可在与HRP发生反应之前通过AP脱磷酸，以形成能够结合到酚基或基于富含电子部分的受体的反应产物。

酶底物的反应产物还可以能够提供可检测信号。在一些实施方案中，本文所公开方法中使用的酶底物可包括非发色或者非化学发光底物，即，酶和酶底物的反应本身可以不产生可检测信号。本文所公开方法中使用的酶底物可包括作为标记的外在的信号发生器(例如荧光团)。信号发生器和酶底物可直接(例如，具有荧光标记的酶底物)或间接(例如通过配体-受体缀合对)连接。在一些实施方案中，底物可包括受保护官能团(例如巯基)。在活化底物与受体的结合之后，官能团可以去保护，以及使用具有硫醇反应基团(例如马来酰亚胺或碘代乙酰基)的信号发生器来实现与信号发生器的缀合。

在一些实施方案中，标记可包括辣根过氧化物酶，以及底物选自取代苯酚(例如酪胺)。在一些实施方案中，辣根过氧化物酶使活化酚底物共价结合到样品或者样品与其结合的固体支持物中存在的酚基。在一些实施方案中，探针可包括偶联到HRP的结合剂，以及底物可包括偶联到荧光团的酪胺。

化学试剂可包括一种或多种化学品，其能够修饰信号发生器、酶或者信号发生器与结合剂或酶底物之间的可裂解接头(若存在的话)。化学试剂可与采取固体、溶液、凝胶或悬浮液形式的样品接触。

在一些实施方案中，化学试剂可包括氧化剂，例如活性氧物类、羟基、单线态氧、过氧化氢或臭氧。在一些实施方案中，化学试剂可包括过氧化氢、高锰酸钾、重铬酸钠、溴水、碘-碘化钾或者叔丁基氢过氧化物。

上述化学试剂的一种或多种可根据信号发生器、酶、结合剂、靶或者生物样品对化学试剂的敏感性来用于本文所公开的方法中。在一些实施方案中，可采用基本上不影响结合剂、靶和生物样品的完整性的化学试剂。在一些实施方案中，可采用不影响结合剂与靶之间的结合特异性的化学试剂。在一些实施方案中，信号的强度值(例如荧光强度)可被测量，并可与生物样品中的靶量相关连。

靶量与信号强度之间的相关性可使用校准标准来确定。在一些实施方案中，第一和第二信号的强度值可被测量，并且与相应靶量相关连。在一些实施方案中，通过比较两个信号强度，可确定第一靶和第二靶的相对量(相互之间或者相对于对照)。类似地，在多个靶可使用多个探针来分析的情况下，生物样品的不同靶的相对量可通过测量不同信号强度来确定。在一些实施方案中，一种或多种对照样品可如上所述使用。

通过观测样品中的信号是否存在(感兴趣生物样品与对照)，可得到与生物样品有关的信息。例如，通过比较患病组织样品与正常组织样品，可得到与患病组织样品中存在的靶有关的信息。类似地，通过比较样品之间的信号强度(即，感兴趣样品和一种或多种对照)，可得到与样品中的靶的表达有关的信息。

在一些实施方案中，可观测生物样品中的信号的位置。在一些实施方案中，生物信号中的信号的定位可使用形态染色剂来观测。在一些实施方案中，可观测两个或更多信号的相对位置。信号的位置可与生物样品中的靶的位置相关连，从而提供与生物样品中不同靶的定位有关的信息。在一些实施方案中，信号的强度值和信号的位置可相关连，以得到与生物样品中的不同靶的定位有关的信息。例如，相对于细胞核，某些靶在细胞质中可表达更多，反过来也是一样。在一些实施方案中，与靶的相对定位有关的信息可通过比较两个或更多信号的位置和强度值来得到。

示例性计算机系统和网络环境

本文所公开的系统和方法可包括一个或多个可编程处理单元，其具有一个或多个非暂时计算机可读介质、RAM、ROM、硬盘驱动器和/或硬件上保存的、与其关联的可执行指令。在示例性实施方案中，硬件、固件和/或可执行代码例如可作为供结合现有基础设施(例如现有装置/处理单元)结合使用的(一个或多个)升级模块来提供。硬件例如可包括用于运行本文教导为计算过程的实施方案的组件和/或逻辑电路。

按照本公开，还可包括显示器和/或其他反馈组件，例如以用于呈现图形用户界面。显示器和/或其他反馈组件可以是独立设备，或者可作为(一个或多个)处理单元的一个或多个组件/模块来包含。在示例性实施方案中，显示器和/或其他反馈组件可用来同时描述生物组织样品的视场的形态和统计表示。

可用来实现当前实施方案的一部分的实际软件代码或控制硬件不是要限制这类实施方案的范围。例如，本文所述实施方案的某些方面可通过使用任何适当编程语言类型(例如使用例如常规或面向对象编程技术的汇编代码、C、C#或C++)的代码来实现。这种代码存储或保存在任何类型的适当非暂时计算机可读介质(例如磁或光存储介质)上。

如本文所使用的“处理器”、“处理单元”、“计算机”或“计算机系统”可以是例如多种无线或有线微型计算机、小型计算机、服务器、大型计算机、膝上型、个人数字助理(PDA)、无线电子邮件装置(例如“BlackBerry”、“Android”或“Apple”商标指定装置)、蜂窝电话、寻呼机、处理器、传真机、扫描仪或者配置成通过网络传送和接收数据的任何其他可编程装置。本文所公开的计算机系统可包括存储器，以用于存储在得到、处理和传递数据中使用的某些软件应用。能够理解，这种存储器可以是所公开实施方案的内部或外部的。存储器还可包括用于存储软件的非暂时存储介质，包括硬盘、光盘、软盘、ROM(只读存储器)、RAM(随机存取存储器)、PROM(可编程ROM)、EEPROM(电可擦PROM)、闪速存储器存储装置等。

图8示出表示可用来实现本文所公开的系统和方法的示例性计算装置1000的框图。计算装置1000可以是任何计算机系统，例如工作站、台式计算机、服务器、膝上型、手持计算机、平板计算机(例如iPad?平板计算机)、移动计算或通信装置(例如iPhone?移动通信装置、Android?移动通信装置等)或者能够进行通信并且具有充分处理器能力和存储器容量来执行本文所述操作的其他形式的计算或电信装置。在示例性实施方案中，可提供包括多个这类计算装置的分布式计算系统。

计算装置1000包括一个或多个非暂时计算机可读介质，其上编码有用于实现本文所述示例性方法的一个或多个计算机可执行指令或软件。非暂时计算机可读介质可包括但不限于一种或多种类型的硬件存储器和其他有形介质(例如一个或多个磁存储盘、一个或多个光盘、一个或多个USB flash驱动器)等。例如，计算装置1000中包含的存储器1006可存储用于实现如本文所述的图形用户界面的计算机可读和计算机可执行指令或软件。计算装置1000还包括处理器1002及关联核心1004，以及在一些实施方案中包括一个或多个附加处理器1002’及(一个或多个)关联核心1004’(例如在具有多个处理器/核心的计算机系统的情况下)，以用于运行存储器1006中存储的计算机可读和计算机可执行指令或软件以及用于控制系统硬件的其他程序。处理器1002和(一个或多个)处理器1002’各可以是单核处理器或多核(1004和1004’)处理器。

虚拟化可用于计算装置1000中，使得可动态共享计算装置中的基础设施和资源。可提供虚拟机1014以操控运行于多个处理器的进程，使得进程看来像是仅使用一个计算资源而不是多个计算资源。多个虚拟机还可与一个处理器配合使用。

存储器1006可包括计算机系统存储器或随机存取存储器，例如DRAM、SRAM、EDO RAM等。存储器1006也可包括其他类型的存储器或者其组合。

用户可通过可视显示装置1018(例如屏幕或监视器，其可显示按照本文所述示例性实施方案所提供的一个或多个图形用户界面1020)与计算装置1000进行交互。可视显示装置1018还可显示与示例性实施方案关联的其他方面、元件和/或信息或者数据。计算装置1000可包括用于接收来自用户的输入的其他I/O装置，例如键盘或者任何适当多点触摸界面1008、指针装置1010(例如鼠标、与显示装置直接进行接口的用户手指等)。键盘/多点触摸界面1008和指针装置1010可耦合到可视显示装置1018。计算装置1000可包括其他适当常规I/O外设。I/O装置可促进一个或多个图形用户界面1020的实现，例如实现本文所述示例性实施方案的图形用户界面的一个或多个选择组件(例如视场选择组件、生物标记选择组件、生物标记表达水平标准选择组件、形态特征选择组件等)。

计算装置1000可包括一个或多个存储装置1024，例如持久磁盘存储(其可包括任何适当的光或磁持久存储装置，例如RAM、ROM、Flash、USB驱动器或者其他基于半导体的存储介质)、硬盘驱动器、CD-ROM或者其他计算机可读介质，以用于存储实现本文所教导示例性实施方案的数据和计算机可读指令和/或软件。在示例性实施方案中，一个或多个存储装置1024可为可由本公开的系统和方法来生成的数据提供存储。例如，存储装置1024可为图像数据提供存储和/或为数据分析提供存储(例如，本文所述图像或统计分析的任一个的参数的结果、例如图像分割结果的存储)。一个或多个存储装置1024还可为与如本文所述的一个或多个方法相关的计算机可读指令提供存储。一个或多个存储装置1024可在计算装置1000上提供，和/或独立于或者远离计算装置1000来提供。

计算装置1000可包括网络接口1012，其配置成经由一个或多个网络装置1022、经过多种连接(包括但不限于标准电话线、LAN或WAN链路(例如802.11、T1、T3、56kb、X.25)、宽带连接(例如ISDN、帧中继、ATM)、无线连接、控制器区域网络(CAN)或者上述任一个或全部的某种组合)，来与一个或多个网络(例如局域网(LAN)、广域网(WAN)或因特网)进行接口。网络接口1012可包括内置网络适配器、网络接口卡、PCMCIA网络卡、卡总线网络适配器、无线网络适配器、USB网络适配器、调制解调器或者适合于将计算装置1000与能够进行通信的任何类型的网络进行接口并且执行本文所述操作的任何其他装置。网络装置1022可包括用于通过网络接收和传送通信的一个或多个适当装置，包括但不限于一个或多个接收器、一个或多个发射器、一个或多个收发器、一个或多个天线等。

计算装置1000可运行任何操作系统1016，例如Microsoft?Windows?操作系统的各版本、Unix和Linux操作系统的不同版本、Macintosh计算机的MacOS?的任何版本、任何嵌入式操作系统、任何实时操作系统、任何开放源操作系统、任何专有操作系统、用于移动计算装置的任何操作系统或者能够运行于计算装置并且执行本文所述操作的任何其他操作系统中的任一个。在示例性实施方案中，操作系统1016可运行于本机模式或仿真模式。在一示例性实施方案中，操作系统1016可运行于一个或多个云机器实例。

图9示出适合于本文所公开实施方案的实现的示例性网络环境2000。网络环境2000可包括一个或多个服务器2002和2004，其经由通信网络2010耦合到一个或多个客户端2006和2008。值得注意，一个或多个服务器2002和2004以及一个或多个客户端2006和2008的每个可实现为如针对图8所述的计算装置1000。因此，一个或多个服务器2002和2004以及一个或多个客户端2006和2008的每个可包括网络接口1012和网络装置1022，以便使服务器2002和2004能够经由通信网络2010与客户端2006和2008进行通信。通信网络2010可包括但不限于因特网、内联网、LAN(局域网)、WAN(广域网)、MAN(城域网)、无线网络、光网络等。由通信网络2010所提供的通信设施能够支持如本文所公开的协作分析和研究工作。

在示例性实施方案中，协作实体可利用一个或多个客户端2006、2008来远程访问一个或多个服务器2002、2004。服务器2002和2004可有利地提供用于存储、访问、共享和分析(例如验证)与本公开的系统和方法相关的数据的云环境。一个或多个服务器2006、2008还可有利地与一个或多个应用(其特征在于例如用于实现与如本文所述的用户界面的生成和/或数据分析相关的一个或多个模块的计算机可读指令)关联。一个或多个应用可有利地在一个或多个客户端2006和2008上远程地访问和运行。在示例性实施方案中，一个或多个应用的分布可服从特定条件、例如许可协议。

这样描述了本发明的若干示例性实施方案，将会理解，各种变更、修改和改进将是本领域的技术人员易于想到的。预计这类变更、修改和改进是本公开的部分，并且预计处于本发明的范围之内。相应地，以上描述和附图仅作为举例。

Claims (28)

1. 一种处理表示组织样品中的生物单元的图像数据的计算机实现方法，所述计算机包括处理器，所述方法包括：

由所述处理器接收包含来自免疫荧光(IF)形态标记的信号的所述组织样品的第一图像，其中所述组织样品采用所述IF形态标记来染色；

由所述处理器接收包含来自荧光探针的信号的同一组织样品的第二图像，其中所述组织样品与所述荧光探针原位杂交；

由所述处理器基于所述第一图像中来自所述IF形态标记的所述信号的平均强度将所述组织样品中的各生物单元分类为至少两个类别中之一；

由所述处理器执行所述第二图像中的所述组织样品的荧光原位杂交(FISH)分析，以从其中得到结果；以及

由所述处理器过滤所述FISH分析的结果，以产生与仅在所述至少两个类别中之一分类的生物单元有关的结果子集。

2. 权利要求1的方法，其中所述至少两个类别包括上皮和非上皮。

3. 权利要求1的方法，还包括由所述处理器将所述第一图像中来自所述IF形态标记的信号的位置与所述第二图像中来自所述荧光探针的信号的位置配准，以产生配准图像。

4. 权利要求3的方法，还包括由所述处理器分割所述第二图像，以基于所述第二图像中来自所述荧光探针的信号的位置来识别所述组织样品中的细胞核。

5. 权利要求4的方法，其中各生物单元对应于所述组织样品中识别的相应细胞核。

6. 权利要求4的方法，其中分割所述细胞核包括由所述处理器将小波变换应用于所述第二图像。

7. 权利要求6的方法，还包括由所述处理器从所述第二图像中的细胞核来生成从阈值距离图所生成的Voronoi划分和环形，其中各相应环形限制成至少部分仅包围所述组织样品中的一个细胞核。

8. 权利要求7的方法，其中生成所述第二图像中的Voronoi划分使得能够使用所述组织样品中识别的细胞核作为与各环形所限定的掩膜相乘的Voronoi划分的种子，从所述第二图像来生成局部背景区域。

9. 权利要求7的方法，其中所述IF形态标记配置成针对细胞角蛋白(CK)蛋白质，并且其中所述方法还包括使用结合Otsu定阈值方法的阈值对所述第一图像定阈值，并且估计所述第一图像中的上皮区域的最小强度级。

10. 权利要求9的方法，还包括由用户在观察各生物单元的分类的变化的同时交互地改变所述阈值。

11. 权利要求9的方法，其中通过计算包围所述细胞核的所述环形中的平均细胞角蛋白(CK)强度，并且将所述平均CK强度与所述上皮区域的所估计的最小强度级进行比较，各细胞核可分类为上皮和非上皮之一。

12. 权利要求1的方法，其中所述IF形态标记包括4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色剂。

13. 权利要求1的方法，其中所述IF形态标记配置成针对细胞角蛋白(CK)蛋白质和人表皮生长因子受体2(HER2)蛋白质中的至少一种。

14. 权利要求1的方法，其中所述荧光探针配置成结合到HER2基因和染色体17着丝粒重复中的至少一个。

15. 一种其上存储了计算机可执行指令的非暂时计算机可读介质，所述计算机可执行指令由计算机运行时使所述计算机：

接收包含来自免疫荧光(IF)形态标记的信号的组织样品的第一图像，其中所述组织样品采用所述IF形态标记来染色；

接收包含来自荧光探针的信号的同一组织样品的第二图像，其中所述组织样品与所述荧光探针原位杂交；

基于所述第一图像中来自所述IF形态标记的所述信号的平均强度将所述组织样品中的各生物单元分类为至少两个类别之一；

执行所述第二图像中的所述组织样品的荧光原位杂交(FISH)分析，以从其中得到结果；以及

过滤所述FISH分析的结果，以产生与仅分类为上皮的生物单元有关的结果的子集。

16. 权利要求15的计算机可读介质，还包括计算机可执行指令，其由所述计算机运行时使所述计算机：

将所述第一图像中来自所述IF形态标记的信号的位置与所述第二图像中来自所述荧光探针的信号的位置配准，以产生配准图像。

17. 权利要求16的计算机可读介质，还包括计算机可执行指令，其由所述计算机运行时使所述计算机：

分割所述第二图像，以基于所述第二图像中来自所述荧光探针的信号的位置来识别所述组织样品中的细胞核。

18. 一种用于处理表示组织样品中的生物单元的图像数据的系统，所述系统包括：

处理器；

输入，与所述处理器进行电通信，并且配置成接收所述图像数据；以及

存储器，与所述处理器进行电通信，所述存储器包括计算机可执行指令，其由所述处理器运行时使所述处理器：

接收包含来自免疫荧光(IF)形态标记的信号的组织样品的第一图像，其中所述组织样品采用所述IF形态标记来染色；

接收包含来自荧光探针的信号的同一组织样品的第二图像，其中所述组织样品与所述荧光探针原位杂交；

基于所述第一图像中来自所述IF形态标记的所述信号的平均强度将所述组织样品中的各生物单元分类为至少两个类别之一；

执行所述第二图像中的所述组织样品的荧光原位杂交(FISH)分析，以从其中得到结果；以及

过滤所述FISH分析的结果，以产生与仅在所述至少两个类别之一中分类的生物单元有关的结果的子集。

19. 权利要求18的系统，其中所述至少两个类别包括上皮和非上皮。

20. 权利要求18的系统，其中所述存储器还包括计算机可执行指令，其由所述处理器运行时使所述处理器：

将所述第一图像中来自所述IF形态标记的信号的位置与所述第二图像中来自所述荧光探针的信号的位置配准，以产生配准图像。

21. 权利要求20的系统，其中所述存储器还包括计算机可执行指令，其由所述处理器运行时使所述处理器：

分割所述第二图像，以基于所述第二图像中来自所述荧光探针的信号的位置来识别所述组织样品中的细胞核。

22. 权利要求21的系统，其中各生物单元对应于所述组织样品中识别的相应细胞核。

23. 权利要求21的系统，其中所述存储器还包括计算机可执行指令，其在由所述处理器运行时使所述处理器将小波变换应用于所述第二图像，以分割所述组织样品中的细胞核。

24. 权利要求23的系统，其中所述存储器还包括计算机可执行指令，其在由所述处理器运行时使所述处理器从所述第二图像中的细胞核来生成从阈值距离图所生成的Voronoi划分和环形，其中各相应环形限制成至少部分仅围绕所述组织样品中的一个细胞核。

25. 权利要求23的系统，其中所述存储器还包括计算机可执行指令，其在由所述处理器运行时使所述处理器使用在所述组织样品中识别的细胞核作为与各环形所限定的掩膜相乘的Voronoi划分的种子，从所述第二图像来生成局部背景区域。

26. 权利要求18的系统，其中所述IF形态标记包括4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色剂。

27. 权利要求18的系统，其中所述IF形态标记配置成针对细胞角蛋白(CK)蛋白质和人表皮生长因子受体2(HER2)蛋白质中的至少一种。

28. 权利要求18的系统，其中所述荧光探针配置成结合到HER2基因和染色体17着丝粒重复中的至少一个。