KR20110093912A

KR20110093912A - 개미산을 이용해 수소를 생산해 낼 수 있는 Ｔｈｅｒｍｏｃｃｕｓｓｐｐ．로부터 분리된 신규한 서열번호 7의 수소화효소, 이를 암호화하는 유전자 및 그 유전자를 갖는 미생물을 이용하여 수소를 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20110093912A
Application number: KR1020117014736A
Authority: KR
Inventors: 이정현; 강성균; 이현숙; 김상진; 권개경; 차선신; 전정호; 임형순; 김윤재; 배승섭; 임재규; 김민식; 김태완; 류지영; 정재연
Original assignee: 한국해양연구원
Priority date: 2008-09-05
Filing date: 2009-09-07
Publication date: 2011-08-18
Also published as: JP2018138060A; US9976124B2; US9267115B2; KR101833975B1; KR20110069744A; KR20160108384A; KR20160114654A; JP5735425B2; US20140178960A1; KR20110094092A; KR101736484B1; KR20140022082A; RU2012103674A; EP2333054A2; US20140248683A1; WO2010027233A2; RU2010119233A; KR20110093913A; KR20140022081A; RU2499831C2

Abstract

본 발명은 Thermococcus 속에 속하는 고호열성 신균주로부터 분리한 신규한 수소화효소(hydrogenase), 이를 암호화하는 유전자 및 이들을 이용하여 수소를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 수소생산방법에 따르면 상기 균주를 특정 배양조건으로 배양하는 것만으로 많은 양의 수소를 생산할 수 있으므로, 기존의 수소생산방법에 비하여 경제적이고 효율적이며, 고온에서도 수소를 생산할 수 있는 장점이 있다.

Description

개미산을 이용해 수소를 생산해 낼 수 있는 Ｔｈｅｒｍｏｃｃｕｓｓｐｐ．로부터 분리된 신규한 서열번호 7의 수소화효소, 이를 암호화하는 유전자 및 그 유전자를 갖는 미생물을 이용하여 수소를 생산하는 방법{Novel hydrogenases of Sequence number 7 purified from Thermococcus spp. by using formate, Genes encoding them, and Methods for producing hydrogen using microorganism having the genes}

본 발명은 Thermococcus 속에 속하는 신균주로부터 발견한 새로운 수소화효소 (hydrogenase), 이를 암호화하는 유전자, 및 이들을 이용하여 수소를 생산하는 방법에 관한 것이다.

수소에너지는 중량당 발열량이 석유보다 3배 이상 높으면서도, 이산화탄소, NOx, SOx 등 환경에 악영향을 미칠 수 있는 물질들을 배출하지 않아, 장차 화석에너지를 대체할 에너지로써 각광받고 있다.

종래부터 사용된 수소 생산 방법에는 물의 전기분해, 천연가스나 나프타의 열분해 (thermal-cracking) 또는 수증기 개질법 (steam reforming) 등이 있다. 그러나 이러한 방법들은 다시 화석연료를 사용하여 고온, 고압 조건을 만들어야 하는 문제가 있으며, 일산화탄소를 포함한 혼합가스를 발생시키므로 그러한 가스로부터 일산화탄소를 제거하여야 하는 어려운 문제를 발생시킨다.

반면 미생물을 이용한 생물학적 수소 생산 방법은 별도의 에너지를 투입하여 고온, 고압 조건을 만들 필요가 없고, 생성된 가스에 일산화탄소를 포함하지 않는다는 장점이 있다. 이러한 생물학적 수소생산방법은 크게 광합성 미생물을 이용하는 것과 비-광합성 미생물(주로 혐기성 미생물)을 이용하는 것으로 나눠볼 수 있다. 전자에 속하는 예로 대한민국 등록특허 제10-0680624호 "높은 염분농도에서 수소생성능이 우수한 광합성 세균 로도박터 스페로이데스 균주를 이용한 수소생산 방법" 등이 있다.

그러나 빛을 에너지원으로 사용하는 광합성 세균들의 고농도 배양기술이 아직 충분히 개발되어 있지 않으며, 종래의 광합성 세균들은 높은 분압의 기질이 있을 경우 기질저해가 심하다는 단점이 있다. 또한, 이들은 빛이 존재하는 경우에만 수소생성능이 지속될 수 있다는 문제점이 있다.

따라서, 유기 탄소를 이용하여 수소를 생산할 수 있는 미생물들을 이용하여 수소를 생산하려는 시도가 지속적으로 이루어지고 있으며, 그 예로 대한민국 등록특허 제10-0315663호 "사이트로박터속 균주 Y19 및 이에 의한 수소 생산", 대한민국 등록특허 제10-0315662호 "로도슈도모나스 팔루스트리스 P4 및 이에 의한 수소생산" 등이 있다.

본 발명자들은 고호열성 신균주 Thermococcus onnurineus NA1 (기탁번호: KCTC 10859BP)의 신규한 단백질 및 이를 암호화하는 유전자들에 대해 2008년 9월 5일 자로 특허출원하였으며(대한민국 특허출원 제10-2008-0087794호), 본 발명은 이들 특허출원된 단백질 및 유전자들 중 특히 수소생성과 관련된 것들에 대한 것이다. 본 발명자들은 상기 균주의 수소생성능력과 관련된 실험을 한 결과 상기 균주가 고온의 환경에서도 많은 양의 수소를 생성함을 발견하였고, 특히 일산화탄소(CO) 또는 포름산염(formate)을 첨가한 배양조건에서 많이 발현되는 신규한 수소화효소들을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 고온의 환경에서도 수소를 생산할 수 있는 고호열성 Thermococcus spp.의 수소화효소 및 이를 암호화하는 유전자를 제공하고, 이를 이용하여 효율적으로 수소를 생산하는 방법을 제공하는 것에 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 수단으로 본 발명은 혐기적 배양조건에서 수소를 생산할 수 있는 고호열성 Thermococcus spp. 균주가 갖고 있는 수소화효소(hydrogenase) 및 이를 암호화하는 유전자를 제공한다. 또한 본 발명은 상기 균주를 배양하여 수소를 생산하는 방법 및 상기 유전자를 이용하여 수소를 생산하는 방법을 제공한다.

제 1 양태로, 본 발명은 고호열성 신균주 Thermococcus onnurineus NA1 (기탁번호: KCTC 10859BP)이 생산하는 수소화효소를 제공한다. T. onnurineus NA1 은 8종류의 신규한 수소화효소 유전자 클러스터를 갖고 있으며, 이에 속하는 수소화효소에 대한 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 서열번호 8과 같다.

제 2 양태로, 본 발명은 상기 아미노산을 암호화하는 유전자를 제공한다. 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게 상기 유전자는 서열번호 12 내지 서열번호 19이다(상기 서열번호 1 내지 서열번호 8의 아미노산이 각각 서열번호 12 내지 19의 유전자에 대응됨).

제 3 양태로, 본 발명은 Thermococcus spp. 를 배양하여 수소를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 1)배양용기에 배지를 만드는 단계, 2) Thermococcus spp.를 상기 배양용기에서 배양하는 단계, 및 3) 상기 배양용기로부터 수소를 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 Thermococcus spp.는 바람직하게는 Thermococcus onnurineus NA1(기탁번호: KCTC 10859BP)이다.

추가로, 상기 배지는 일산화탄소, 포름산염 및 녹말로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 물질이 첨가된 배지가 될 수 있다. 또한, 상기 배양은 80℃의 고온에서 이루어질 수 있으며, 혐기적 조건에서 이루어질 수 있다.

제 4 양태로, 본 발명은 서열번호 9 내지 서열번호 11로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열로 이루어진 탈수소화효소(dehydrogenase)를 제공한다.

제 5 양태로, 본 발명은 상기 탈수소화효소를 암호화하는 유전자를 제공하며, 바람직하게 이는 서열번호 20 내지 서열번호 22이다(상기 서열번호 9 내지 11의 아미노산이 각각 서열번호 20 내지 22에 대응됨).

제 6 양태로, 본 발명은 T. onnurineus NA1의 CODH-MCH-MNH3 수소화효소 클러스터를 구성하는 유전자가 모두 작동가능하도록 연결된 재조합벡터를 제공한다. 바람직하게, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 유전자는 서열번호 21(CODH 탈수소화효소) 및 서열번호 16(MCH 수소화효소)의 유전자를 포함한다. 추가로, 본 발명은 상기 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 배양용기에 배지를 만드는 단계; 상기 배양용기의 가스층에 일산화탄소를 공급하는 단계; 상기 형질전환체를 상기 배양용기에서 배양하는 단계; 및 상기 배양용기로부터 수소를 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 형질전환체를 이용하여 수소를 생산하는 방법을 제공한다.

제 7 양태로, 본 발명은 T. onnurineus NA1의 FDH2-MFH2-MNH2 수소화효소 클러스터를 구성하는 유전자가 모두 작동가능하도록 연결된 재조합벡터를 제공한다. 바람직하게, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 유전자는 서열번호 22(FDH2 탈수소화효소) 및 서열번호 18(MFH2 수소화효소)의 유전자를 포함한다. 추가로, 본 발명은 상기 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 배양용기에 포름산염을 포함하는 배지를 만드는 단계; 상기 형질전환체를 상기 배양용기에서 배양하는 단계; 및 상기 배양용기로부터 수소를 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 형질전환체를 이용하여 수소를 생산하는 방법을 제공한다.

제 8 양태로, 본 발명은 T. onnurineus NA1의 FDH1-MFH1-MNH1 수소화효소 클러스터를 구성하는 유전자가 모두 작동가능하도록 연결된 재조합벡터를 제공한다. 바람직하게, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 유전자는 서열번호 20(FDH1 탈수소화효소) 및 서열번호 13(MFH1 수소화효소)의 유전자를 포함한다. 추가로, 본 발명은 상기 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 배양용기에 녹말을 포함하는 배지를 만드는 단계; 상기 형질전환체를 상기 배양용기에서 배양하는 단계; 및 상기 배양용기로부터 수소를 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 형질전환체를 이용하여 수소를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 수소생산방법은 종래의 화학적 생산 방법과 달리 고온, 고압 조건을 필요로 하지 않고, 상온, 상압 조건에서 수소를 발생시킬 수 있으며, 유해한 부산물을 발생시키지 않는다는 장점이 있다. 또한, 미생물을 이용하여 수소를 생산하는 종래의 기술과 비교하더라도 고순도의 수소를 고효율로 생산할 수 있고, 고온 조건에서도 수소를 생산할 수 있는 장점이 있다.

따라서 석유정제공정 등에서 배출되는 고온의 일산화탄소를 별도의 냉각과정 없이 바로 포획하여 수소생성에 활용할 수 있는 경제적 이점이 있으며, 공기정화의 측면에서도 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 Thermococcales , strains, T. onnurineus NA1 (NA1), T. kodakaraensis, P. furiosus, 및 P. abyssi. 의 프로테옴(proteome)의 공통영역 및 특이영역을 나타내는 벤다이어그램이다. 상기 균주들에 대한 단백질 세트는 NCBI의 RefSeq collection 에서 구하였다.
도 2의 A는 T. onnurineus NA1 의 8개 수소화효소 유전자 클러스터의 대표도이다. A, B, C, D; 막 내 수소화효소(membrane-bound hydrogenases) 및 세포질 내 NiFe-수소화효소(cytoplasmic NiFe-hydrogenases). S1, S2, S3; T. onnurineus NA1. 유전자들에 특이적인 수소화효소들을 COG 기능 카테고리(functional categories)에 따라 채색하였다. TON_0051-0055는 서열번호 1부터 5, TON_0486-0498은 서열번호 35부터 47, TON_0533-0544는 서열번호 48부터 59, TON_1583-1595는 서열번호 100부터 112, TON_0261-0289는 서열번호 6부터 34, TON_1016-1031은 서열번호 60부터 75, TON_1559-1582는 서열번호 76부터 99를 나타낸다.
도 2의 B는 T. onnurineus NA1 의 지놈 상에서 3-모듈 유전자 클러스터를 갖는 3개의 수소화효소 유전자 클러스터(fdh1 - mfh1 - mnh1 , fdh2 - mfh2 - mnh2 및 codh -mch-mnh)의 유전자 구성을 나타낸 것이다. 같은 서브클러스터에 속하는 유전자들은 같은 색으로 표시하였다.
도 3은 31 개의 고세균 유전체의 수소화효소 유전자 클러스터의 분포 및 보존 패턴을 나타낸다. 파란색 꺾쇠(아래에서 첫 번째, 세 번째, 다섯 번째 꺾쇠)로 표시한 부분은 31개의 고세균 유전체의 CDS들에 대해 낮은(＜25％) 유사도를 보인 CDS들을 나타낸다. 검은색으로 표시한 부분은 P. abyssi 의 수소화효소 4에 유사한 CDS 들을 나타낸다. 1번부터 31번에 해당하는 고세균 유전자는 다음과 같다.
[표 8]

도 4 및 도 5는 CODH와 F420 수소화효소 단백질들의 알파 서브유닛(α subunit)을 비교한 것이다. 도 4는 CODH의 계통수(Phylogenetic tree)이며, 도 5는 F420 수소화효소 알파 서브유닛의 계통수이다. 계통수상 각각의 단백질의 동족체(homologue)들은 NCBI nr 데이터베이스에서 얻었다.
도 6은 CO에 의존하는 T. onnurineus NA1 의 성장분석표이다. T. onnurineus NA1 을 CO (2, 정삼각형), 황 (3, 네모) 또는 양자 모두 (4, 역삼각형) 첨가된 배지 1에서 키웠다. 대조군으로 첨가물이 없는 배지 (1, 원) 와 YPS 배지 (C) 에서 배양한 것을 표시하였다. 필터 상의 DAPI-염색된 세포들을 형광현미경으로 직접 세었다. a, 다양한 효모추출물(yeast extract, YE) 농도의 배지 조성에 따른 효과. b, 다른 보충물들이 첨가된 배지 1에서 T. onnurineus NA1 의 성장곡선. c, CODH 유전자의 전사(transcription) 분석.
도 7은 YPS(A) 또는 CO-함유 배지(B)에서 T. onnurineus NA1 의 성장 및 수소 생성을 보여준다. 열린 원은 성장을 나타내며, 닫힌 원은 수소생성을 나타냄.
도 8은 YPS(A) 또는 CO-함유 배지(B)에서 T. onnurineus NA1 의 수소화효소 유전자 클러스터의 발현을 마이크로어레이(A) 및 RT-PCR(B)로 분석한 것이다. (A)는 T. onnurineus NA1 의 8 반복의 수소화효소 유전자 클러스터의 마이크로어레이 분석이다. CO에서의 mRNA 변화의 계층적(hierarchical) 클러스터링과 대조구로서 YPS 성장 조건에서의 것을 비교하였다. 상향조절(up-regulation) 및 하향조절(down-regulation)은 각각 붉은 색과 녹색으로 표시하였다. 성장조건들은 클러스터링의 상단에 표시하였다. 클러스터링의 오른쪽에, codh - mch - mnh3 , fdh1 - mfh1 -mnh1 또는 fdh2 - mfh2 - mnh2 각각의 ORF들을 막대로 표시하였다. YE: yeast extract. (B)는 mbh (TON_1593), mbx (TON 0489), frh (TON_1560), sulf I (TON_0534), mch (TON_1023), mfh2 (TON_1569), 또는 mfh1 (TON_0276) 수소화효소의 큰 서브유닛 각각의 CO 또는 YPS 조건에서의 정량적 RT-PCR 분석 결과이다. T. onnurineus NA1의 cha, 샤페로닌(chaperonine)-암호화 유전자, 가 대조구로서 발현 수준을 표준화하는데 사용되었다.
도 9는 mch (TON_1023) 및 mfh2 (TON_1569) 수소화효소 각각의 큰 서브유닛의 표적 유전자 파괴(Targeted gene disruption)를 나타낸다. (A)는 T. onnurineus NA1의 codh - mch - mnh3 및 fdh2 - mfh2 - mnh2 클러스터 각각의 유전자 구성이다. P_gdh _, T. kodakaraensis KOD1 의 글루타메이트 탈수소화효소 유전자의 5'-상류 지역의 프로모터; hmg_Pfu, Pyrococcus furiosus의 3-히드록시-메틸글루타릴 코엔자임 A 환원효소 유전자(3-hydroxy-methyalutaryl coenzyme A reductase gene). (B)는 PCR에 의한 유전자 결손의 확인을 나타낸다. 왼쪽 패널은 과발현 카세트(P_gdh-hmg_Pfu) 영역에 대한 프라이머를 이용한 PCR 증폭을 나타낸다. 오른쪽 패널은 mch _TNA1 또는 mfh2 _TNA1 수소화효소 각각의 큰 서브유닛 영역에 대한 프라이머들을 이용한 PCR 증폭을 나타낸다. M, 크기 마커(1kb ladder); W, 야생형: lane 1-2, 각각의 돌연변이 균주.
도 10은 YPS 또는 CO-함유 배지에서 Δ mch _TNA1 또는Δ mfh2 _TNA1 돌연변이 균주의 성장 및 수소생성을 나타낸다. 열린 원, 성장; 닫힌 원; 수소 생성.
도 11은 YPS(A) 또는 포름산염-함유 배지(B)에서 T. onnurineus NA1 의 성장 및 수소 생성을 보여준다. 열린 원은 성장을 나타내며, 닫힌 원은 수소생성을 나타냄.
도 12는 YPS(A) 또는 포름산염-함유 배지(B)에서 T. onnurineus NA1 의 수소화효소 유전자 클러스터의 발현을 마이크로어레이(A) 및 RT-PCR(B)로 분석한 것이다. (A)는 T. onnurineus NA1 의 8 반복의 수소화효소 유전자 클러스터의 마이크로어레이 분석이다. 외부 포름산염상에서의 mRNA 변화의 계층적(hierarchical) 클러스터링과 대조구로서 YPS 성장 조건에서의 것을 비교하였다. 상향조절(up-regulation) 및 하향조절(down-regulation)은 각각 붉은 색과 녹색으로 표시하였다. 성장조건들은 클러스터링의 상단에 표시하였다. 클러스터링의 오른쪽에, mbh , codh-mch-mnh3, fdh1 - mfh1 - mnh1 또는 fdh2 - mfh2 - mnh2 각각의 ORF들을 막대로 표시하였다. YE: yeast extract. (B)는 mbh (TON_1593), mbx (TON 0489), frh (TON_1560), sulf I (TON_0534), mch (TON_1023), mfh2 (TON_1569), 또는 mfh1 (TON_0276) 수소화효소의 큰 서브유닛 각각의 포름산염 또는 YPS 조건에서의 정량적 RT-PCR 분석 결과이다. T. onnurineus NA1의 cha, 샤페로닌(chaperonine)-암호화 유전자, 가 대조구로서 발현수준을 표준화하는데 사용되었다.
도 13은 mfh1 (TON_0276) 및 mfh2 (TON_1569) 수소화효소 각각의 큰 서브유닛의 표적 유전자 파괴(Targeted gene disruption)를 나타낸다. (A)는 T. onnurineus NA1의 fdh1 - mfh1 - mnh1 및 fdh2 - mfh2 - mnh2 클러스터 각각의 유전자 구성이다. P_gdh, T. kodakaraensis KOD1 의 글루타메이트 탈수소화효소 유전자의 5'-상류 지역의 프로모터; hmg_Pfu, Pyrococcus furiosus의 3-히드록시-메틸글루타릴 코엔자임 A 환원효소 유전자(3-hydroxy-methyalutaryl coenzyme A reductase gene). (B)는 PCR에 의한 유전자 결손의 확인을 나타낸다. 왼쪽 패널은 과발현 카세트(P_gdh-hmg _Pfu) 영역에 대한 프라이머를 이용한 PCR 증폭을 나타낸다. 오른쪽 패널은 mfh1 _TNA1 또는 mfh2 _TNA1 수소화효소 각각의 큰 서브유닛 영역에 대한 프라이머들을 이용한 PCR 증폭을 나타낸다. M, 크기 마커(1kb ladder); W, 야생형: lane 1-2, 각각의 돌연변이 균주.
도 14는 YPS 또는 포름산염-함유 배지에서 Δ mch _TNA1, Δ mfh1 _TNA1 또는Δmfh2 _TNA1 돌연변이 균주의 성장 및 수소생성을 나타낸다. 열린 원, 성장; 닫힌 원; 수소 생성.

[발명의 실시를 위한 최선의 형태]

제 1 양태로, 본 발명은 혐기성 조건에서 수소를 생산하는 고호열성 신균주 Thermococcus onnurineus NA1 (기탁번호: KCTC 10859BP)이 생산하는 수소화효소를 제공한다. 상기 균주는 이스트 마뉴스 바신(East Manus Basin)에 있는 파크마누스 지역의 심해 열수 분출구로부터 분리한 것으로, 대한민국 생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 2005년 10월 7일 기탁하여, 2005년 10월 20일에 KCTC 10859BP의 기탁번호를 부여받았다. 상기 균주의 특징 및 배양방법 등에 대해서는 본 출원의 기초출원인 대한민국 특허출원 제10-2007-0127255호에 기재되어 있다.

T. onnurineus NA1 은 8종류의 신규한 수소화효소 유전자 클러스터를 갖고 있다. 상기 수소화효소는 수소 분자(H₂)의 대사에 관련된 핵심적 효소로서, 2H⁺ + 2e^- ⇔ H₂의 가역적 반응에 촉매 작용을 한다. 바람직하게 상기 클러스터에 속하는 수소화효소는 서열번호 1 내지 서열번호 8로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 및 이의 기능적 동등물을 제공한다. "기능적 동등물"에는 상기 단백질들에 있어 그 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 수소화효소의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다.

제 4 양태로, 본 발명은 서열번호 9 내지 서열번호 11로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 탈수소화효소(dehydrogenase)를 제공한다. 상기 탈수소화효소, Fdh1(서열번호 20), Fdh2(서열번호 22) 및 CODH(서열번호 21) 각각은 수소화효소 MFH1, MFH2 및 MCH 수소화효소와 함께 클러스터를 이루어 기능할 수 있다.

제 6 양태로, 본 발명은 T. onnurineus NA1의 CODH-MCH-MNH3 수소화효소 클러스터를 구성하는 유전자가 모두 작동가능하도록 연결된 재조합벡터를 제공한다. 바람직하게, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 유전자는 서열번호 21(CODH 탈수소화효소) 및 서열번호 16(MCH 수소화효소)의 유전자를 포함한다. 상기 "벡터"는 또 다른 핵산을 그것에 결합시켜 이송시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 상기 벡터에 의해 운반되는 각 재조합형 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 합성시킬 수 있는 "발현벡터"로 플라스미드, 코스미드 또는 파아지 등을 이용할 수 있다. 바람직한 벡터는 그것이 결합된 핵산을 자기 복제 및 발현시킬 수 있는 벡터이다.

추가로, 본 발명은 상기 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 원핵생물, 곰팡이, 식물, 동물세포 등의 세포를 형질전환시켜 높은 효율로 수소를 생산시킬 수 있는 형질전환 세포를 만드는데 이용될 수 있다. '형질전환'이란 용어는 외래 DNA 또는 RNA가 세포에 흡수되어 세포의 유전형이 변화되는 것을 말한다. 상기 숙주세포를 만들기 위해 각 세포에 따른 공지의 형질전환 방법을 이용할 수 있다.

상기 "벡터", "형질전환" 및 "숙주세포"에 관한 사항은 상기 제 6 양태에 기술된 바와 같다.

[발명의 실시를 위한 형태]

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. Thermococcus onnurineus NA1 균주의 수소화효소 유전자 분석

(1) 실험방법

1) 배양 조건

일반적인 배양조건으로서, 80℃의 혐기성 환경에서 YPS(yeast extract-peptone-sulfur) 배지에 세포들을 배양시켰다(Holden et al. 2001). 생리적 특성들에 대한 시험은 1.0 ml trace element mixture, 1 ml 비타민 용액 (Balch, W. E., G. E. Fox, L. J. Magrum, C. R. Woese, and R. S. Wolfe. 1979. Methanogens: reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43:260-296.), NaCl(30 g 1^-1) 및 효모추출물(yeast extract) (0.5 g 1^-1)을 추가한 변형배지 1(Sokolova, T. G., C. Jeanthon, N. A Kostrikina, N. A. Chernyh, A. V. Lebedinsky, E. Stackebrandt, and E. A. Bonch-Osmolovskaya. 2004. The first evidence of anaerobic CO oxidation coupled with H₂ production by a hyperthermophilic archaeon isolated from a deep-sea hydrothermal vent. Extremophiles 8:317-323.)을 이용하여 수행하였다. pH는 NaOH를 사용하여 8.0에 맞췄다. 혐기적 조건에서 만든 배지를 25-ml 혈청병(serum bottle)에 넣고, 나머지 가스층(15ml)을 N₂/CO₂ (80:20, 1 bar) 또는 100％ CO로 채웠다. 포름산염(formate)이나 녹말(starch)로 배양시키는 경우에는, 가압멸균(autoclaving)시키기 전에 각각 10 g L^- ¹ 의 포름산염나트륨(Sigma) 이나 5 g L^- ¹ 의 가용성 녹말(Sigma)을 배지에 첨가하였다. 생리적 시험을 위한 배양은 모두 80 ℃에서 2일간 수행하였다.

2) 유전자 서열분석

T. onnurineus NA1 의 유전체 서열은 총 지놈 샷건 시퀀싱(whole genome shotgun sequencing) 및 피로시퀀싱(pyrosequencing) 을 이용하여 결정하였다. 캐필러리 시퀀싱(capillary sequencing)을 위하여, 2- 에서 3-kb 크기의 삽입 라이브러리(insert library)(11,028 클론), 40-kb 의 삽입 라이브러리(1,870 클론), 및 35-kb 의 삽입 라이브러리(288 클론)를 제작하고, ABI 3730XL sequencer (Applied Biosystems)를 이용하여 서열 분석하였다. 피로시퀀싱을 위하여, GS-20 sequencer (454 Life Sciences)를 이용하여 581,990개의 DNA 단편들에 대해 서열 분석하였다. 양 서열분석기에 의해 생성된 컨티그(contig)들을 조합하고, 클론 워킹(clone walking) 및 PCR 시퀀싱으로 시퀀싱 간격(sequencing gap)을 메웠다. 단백질을 암호화하는 ORF 및 RNA 유전자들은 Glimmer 3.0 (University of Maryland), GSFinder, 및 RBSFinder 의 조합과 manual ORF fitting process를 통하여 예측하였다. 모든 ORF들을 결정한 후에, NCBI nr 단백질 데이터베이스, KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 및 COGs (Clusters of Orthologous Groups of proteins) 데이터베이스에 대해 BLASTp 검색(Tatusova, R. L., D. A. Natale, I. V. Garkavtsev, T. A. Tatusova, U. T. Shankavaram, B. S. Rao, B. Kiryutin, M. Y. Galperin, N. D. Fedorova, and E. V. Koonin. 2001. The COG database: new developments in phylogenetic classification of proteins from complete genomes. Nucleic Acids Res. 29:22-28.)을 이용하여 단백질 서열을 더 분석하였다. tRNA-암호화 부위는 tRNA scan-SE를 이용하여 예측하였다(Lowe, T. M., and S. R. Eddy. 1997. tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Res. 25:955-964.).

3) 단백질 분석

T. onnurineus NA1 세포들을 4％ SDS 및 4 mM EDTA가 포함된 100 mM Tris-HCl 버퍼(buffer)(pH 6.8)에 부유시키고, 10분간 끓인 후, 22,000g 로 20분간 원심분리시켰다. 12％ SDS-PAGE를 이용하여 세포 용해물(lysate)을 분리시켰고, 분자 크기에 기초하여 30개의 분획(fraction)들을 얻었다. 그 후 트립신(trypsin) (Promega, USA)을 이용하여 그것들을 인-젤 분해시켰고(in-gel digestion)(Kim, Y. H., K. Cho, S. H. Yun, J. Y. Kim, K. H. Kwon, J. S. Yoo, and S. I. Kim. 2006. Analysis of aromatic catabolic pathways in Pseudomonas putida KT 2440 by combined proteomic approach: 2-DE/MS and cleavable ICAT analysis. Proteomics 6:1301-1318.), 질량분석계(Thermo Finnigan LTQ IT)로 분석하기 위해 트립신으로 분해시킨 물질들을 0.5％ 트리플루오로아세틱산 용액(trifluoroacetic acid solution)에 녹였다. 펩티드 동정은 시퀘스트 프로그램(Sequest program) (Thermo Finnigan, San Jose, CA)을 이용하여 수행하였다.

4) 총(total) RNA 분리 및 RT-PCR 분석

50-ml의 T. onnurineus NA1 배양액을 N₂/CO₂ (80:20, 1 bar) 또는 100％ CO 기체상(gas phase)에서 다양한 농도의 효모추출물(yeast extract)을 첨가한 변형 배지 1에서 반-지수성장단계(mid-exponential growth phase)까지 키웠다. 6,000 x g 로 30분간 원심분리하여 세포들을 얻었다. 500㎕의 트리졸 시약(Trizol reagent) (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 첨가한 50㎕의 50mM Tris-HCl 버퍼(buffer)(pH 7.5)에 펠렛(pellet)을 재현탁시켰다. 그 세포들을 냉동과 해동과정을 통해 용해시키고, 200㎕의 클로로포름(chloroform)을 이용하여 시료들을 추출하였다. 총 RNA를 포함하는 수용액상(aqueous phase)은 에탄올 침전을 통해 더 처리한 후, 증류수에 재현탁시켰다. RNA의 농도 및 완전성(integrity)은 0.8％ 아가로스 젤 분석과 260 및 280nm 에서의 흡광도 측정을 통해 결정하였다. 제품 사용설명서에 따른 방법으로 SuperScript™ II 역전사효소(Reverse Transcriptase)(Invitrogen)를 이용하여 역전사 및 PCR 증폭을 수행하였다. 대조군으로 CODH (carbon monooxide dehydrogenase) 및 Hsp60 (chaperonine) 의 증폭을 위해 다음 두 세트의 프라이머들을 사용하였다.

CODH gene (forward, 5'-GGACCATGTAGAATCGAYCCGTTY-3'(서열번호 23) 및 reverse, 5'-TTCRTTTCCGGTACAGCA-3'(서열번호 24))

Hsp60 gene (forward, 5'-ATGGCACAGCTTAGTGGACAG-3'(서열번호 25) 및 reverse, 5'-CAAGGATTTCCTGGGCTTTCTC-3'(서열번호 26)).

5) 컴퓨터 분석

아미노산 서열의 상동성 검색은 NCBI 의 non-redundant protein 데이터베이스에 대해 BLAST 프로그램을 사용하여 수행하였다. 그룹 4 수소화효소의 L1 신호(C[GS][ILV]C[AGNS]xxH, x는 어떤 아미노산을 표시)를 가진 단백질들을 위한 모티프 검색은 NCBI 의 non-redundant protein 데이터베이스에 대해 ProteinFinder 프로그램(Ensoltek, Korea)을 사용하여 수행하였다. 단백질들에 대한 다중서열정렬(Multiple sequence alignment) 은 ClustalW 프로그램(Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680.)을 사용하여 수행하였으며, 계통학적 트리(phylogenetic tree)는 Molecular Evolutionary Genetics Analysis (Mega 4.1) 소프트웨어(Tamura, K., Dudley, J., Nei, M. and Kumar, S. (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol. Biol. Evol. 24, 1596-1599.)를 사용하여 구축하였다. 16S rRNA 서열의 계통학적 트리는 Ribosomal 데이터베이스 사이트 (http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp)에서 얻은 프리얼라인(prealigned) 서열들을 사용하여 만들었다.

6) 서열로고의 생성

로고 표시는 관련 서열들에 의해 공유되는 주어진 모티프들 각각의 위치와 관련된 정보를 시각화하기 위해 사용되었다. 그래픽 표시에서, 각각의 위치의 전체적인 높이는 그 위치(bits로 표시)에서의 보존도와 관련이 있는 반면, 어떤 위치내 심볼들의 상대적인 크기는 그것들의 상대적인 빈도들을 나타낸다. 로고 분석은 Berkeley Structural Genomics Center (http://weblogo.berkeley.edu/)에서 수행되었다.

(2) 분석결과

1) T. onnurineus NA1 유전자의 일반적 특징

열수분출공(hydrothermal vent) 지역에서 Thermococcus spp. 가 성공적인 우점종이 된 이유를 밝히기 위해, T. onnurineus NA1의 유전체 서열을 임의적 총 지놈 샷건 시퀀싱(whole genome shotgun sequencing) 및 피로시퀀싱(pyrosequencing)을 조합하여 결정하였다. 그 결과, T. onnurineus NA1 은 별도의 염색체 외 구성요소 (exochromosomal element)들이 없으며, 하나의 환상 염색체(circular chromosome)(1,847,607 bp)를 갖고 있음을 밝혔고, 총 1,976 개의 암호화 DNA 서열들(coding DNA sequences, CDSs)을 동정하였다(표 1 및 도 1). 1104개의 CDS(55.8％) 들은 상동성(homology) 및 도메인(domain) 검색을 통해 어노테이션(annotation) 할 수 있으나, 나머지 872개의 CDS 들의 기능은 1차 구조로부터 예측할 수 없었다. 유전체(genome-wide) 스케일로 단백질 유사도를 검색하였을 때, T. onnurineus NA1 단백질의 82.7％가 Thermococcales 의 것과 유사성을 보였다.

[표 1]

T. kodakaraensis KOD1 (KOD1) 및 다른 Pyrococcus 균주들과 T. onnurineus NA1 (NA1) 유전체의 일반적인 특징.

2) 수소화효소 클러스터(cluster)

T. onnurineus NA1의 유전체에서 수소화효소(hydrogenase) 및 그와 관련된 단백질들의 비율이 높은 것을 발견하였으며(5.5％), 이는 CO 탈수소효소(dehydrogenase) 및 포름산염 탈수소효소(formate dehydrogenase)를 포함하는 산화환원효소들과 관련된 환원력의 보존 내지 재순환의 증가를 나타낸다.

수소화효소는 그들의 촉매금속중심(catalytic metal center)에 근거하여 [NiFe]-수소화효소, [FeFe]-수소화효소 및 [Fe]-수소화효소로 분류될 수 있다. 상기 각각의 수소화효소군 내에 보존된 특징적인 기능성 중심(functional core)에 근거할 때, 하나의 수소화효소를 제외한 T. onnurineus NA1 내의 모든 수소화효소는 [NiFe]-수소화효소에 속하는 것으로 볼 수 있다. Vignais et al .의 분류체계에 따르면, T. onnurineus NA1의 [NiFe]-수소화효소는 그룹 3 (하나의 F420-reducing 및 두 개의 NADP-reducing 수소화효소들) 또는 그룹 4 (4개의 막-관련 수소화효소) 에 속한다(Silva, P.J., van den Ban, E.C., Wassink, H., Haaker, H., de Castro, B., Robb, F.T. and Hagen, W.R. (2000) Enzymes of hydrogen metabolism in Pyrococcus furiosus. Eur. J. Biochem. 267, 6541-6551). 그룹 4에 속하는 수소화효소들은 에너지 전환 수소화효소(energy-converting hydrogenases, Ech)라 명명되었으며, 박테리아 및 고세균 사이에 널리 분포되어 있다.

수소화효소 대사의 분자적 기초를 이해하기 위하여 수소화효소 유전자 클러스터들을 비교분석 하였다. 상기 수소화효소들의 계통학적 분석 결과, 그룹 4 수소화효소들을 두 개의 서브그룹, 4a 및 4b로 분류할 수 있었고, 그룹 4b의 모든 서열들에 공통적인 한 쌍의 모티프(motif) 패턴을 발견할 수 있었다.

도 2에 표시된 바와 같이, Pyrococcus spp. 및 T. kodakaraensis KOD1에서 보고된 두 개의 막 내 수소화효소(membrane-bound hydrogenase)인 Mbh(TON_1590-1595, 서열번호 8), Mbx(TON_0489-0486, 서열번호 3) 및 두 개의 세포질 내 NiFe-수소화효소(cytoplasmic NiFe-hydrogenase)인 Sulf-I(TON_0533-0544, 서열번호 4), Sulf-II(TON_0051-0055, 서열번호 1) 과 함께 T. onnurineus NA1 유전체에서 세 개와 추가적인 수소화효소 클러스터 FDH1-MFH1-MNH1 (Hyg4-I, S1:TON_0279-0274, MFH1: 서열번호 2), CODH-MCH-MNH3 (Hyg4-II, S2:TON_1021-1024, MCH: 서열번호 5), FDH2-MFH2-MNH2 (Hyg4-III, S3:TON_1565-1571, MFH2: 서열번호 7)와 Frh(TON_1559-1562, 서열번호 6)수소화효소를 찾았다. 31개의 고세균 유전체(archaeal genomes)의 CDS들로 수소화효소의 유전자 클러스터 분석을 한 결과 FDH1-MFH1-MNH1(Hyg4-I), CODH-MCH-MNH3(Hyg4-II) 및 FDH2-MFH2-MNH2(Hyg4-III) 는 일차 서열이 특이적이었고, 이는 P. abyssi 및 R. rubrum 의 수소화효소-4 의 구성요소들과 유사도가 낮음을 보여준다(도 3). 추가적인 수소화효소들과 마찬가지로 FDH2-MFH2-MNH2(Hyg4-III) 클러스터(TON_1559-1582, 서열번호 76부터 99)는 유전체에서 F420 수소화효소(TON_1559-1561, 서열번호 76부터 78)의 α/β/γ 서브유닛(subunit)들을 포함하였다. F420 수소화효소의 α/β/γ 서브유닛은 특이적인 일차 서열을 가졌고, 이는 Methanococcus maripaludis 의 조효소(coenzyme) F420-reducing hydrogenase (YP_001097176) (33％) 및 Methanococcus maripaludis S2 의 조효소 F420-reducing hydrogenase (NP_987940) (33％) 와의 유사성을 나타낸다(도 3 및 도 5). Thermococcales 의 F420-hydrogenase 에 상동성이 있는 것(homologue)들은 아직 보고되지 않았다.

3) 3-모듈 유전자 클러스터들의 구성

[NiFe]-수소화효소의 그룹 4에 속하는 상기 세 개의 Ech 수소화효소들(MFH1, MFH2, MCH) 각각은 TON_266-TON_282, TON_1563-TON_1580 및 TON_1016-TON_1031 ORFs(open reading frames) 로 이루어진 큰 17- 또는 18- 유전자 클러스터(fdh1 -mfh1-mnh1, fdh2 - mfh2 - mnh2 및 codh - mch - mnh3)의 일부임이 밝혀졌다(도 2의 B). 클러스터 내의 ORF들은 세 개의 서브클러스터들로 나뉠 수 있다. 첫 번째 부분은 포름산염 탈수소화효소(formate dehydrogenases)(Fdh1(서열번호 9) 또는 Fdh2(서열번호 11)) 또는 일산화탄소 탈수소화효소(carbon monoxide dehydrogenase)(Codh(서열번호 10))와 같은 산화환원효소(oxidoreductase)들을 암호화하고 있다. 두 번째 파트는 5개에서 7개의 서브유닛들을 갖는 다중 막-결합 수소화효소들(multimeric membrane-bound hydrogenases)(MFH1, MFH2 또는 MCH)을 암호화한다. 마지막 부분은 Na⁺/H⁺ 안티포터(antiporter)와 같은 양이온/수소이온 안티포터들(cation/proton antiporters)을 암호화한다. 이러한 3 모듈 유전자 클러스터는 아직 보고된 바 없다.

실시예 2. 가스 조성의 분석

(1) 분석방법

수소가스는 HP-PLOT Molesieve column (Agilent) 및 TCD detector를 갖춘 gas chromatograph HP 5890 series II (Hewlett Packard)를 이용하여 측정하였다. 아르곤을 가스 운반체로 사용하였다. 수소가스를 정량하기 위하여 질소에 각각의 성분(CO, CO₂, H₂, CH₄ 및 O₂) 1％(w/w) 가 포함된 Gas calibration standard (Supleco) 를 사용하였다.

(2) 다양한 물질들을 이용한 수소 생성

반복된 다수의 수소화효소가 다양한 환경에서 T. onnurineus NA1이 수소를 효율적으로 생산하게 하는지 알아보기 위하여, 다양한 에너지원을 이용하여 수소 생성율을 분석하였다(표 2). 그 결과, NA1 균주는 황이 없는 조건에서도 녹말, CO, 및 포름산염(formate)을 이용하여 수소를 만들 수 있었다. 특히 CO 및 포름산염은 수소를 효율적으로 생산하는데 매우 좋은 에너지원이었다.

[표 2]

다양한 조건하에서의 T. onnurineus NA1 의 수소 생성 비교

회분식 배양 (batch culture)에서 NA1 균주의 수소 생산성은 T. kodakaraensis KOD1 및 Pyrococcus furiosus의 연속식 배양(continuous culture)에서 얻어지는 것과 유사하다. 고호열성 고세균(hyperthermophilic archaea)은 낮은 체적생산성(volumetric productivity)에도 불구하고, 중온성 세균의 발효(mesophilic bacterial fermentation) 나 광합성 원핵생물(photobacteria)에 의한 수소생성에 비하여 높은 특이적 생산율 (specific production rate) 을 보이며 고순도의 수소 생산 등과 같은 여러 장점을 갖고 있다. 본 명세서에 기재된 높은 수소 생성율은 배양조건 및 처리과정 설계의 최적화 또는 대사공학에 의해 더 향상될 여지가 많이 있다.

실시예 3. Thermococcus onnurineus NA1 에 의한 CO -의존적 H ₂ 생성: CO -반응(responsive) 수소화효소의 동정

(1) CODH 유전자 클러스터 및 일산화탄소영양성장 (carboxydotrophic growth)

상술한 바와 같이, T. onnurineus NA1 은 특이적인 유전자 클러스터를 갖고 있음을 발견했으며(CODH-MCH-MNH3), 이 유전자 클러스터는 수소화효소 (mch, TON_1021-1024, 서열번호 5) 와 함께 잠정적인 전사조절인자 (TON_1016), CODH 부속 단백질(accessory protein)(CooC, TON_1019), CODH 촉매 서브유닛 (catalytic subunit)(CooS, TON_1018), 및 전자전달 단백질(CooF, TON_1017)을 암호화하는 염기서열로 이루어졌다(도 2의 B). 미생물의 일산화탄소(CO) 대사의 중심 효소인 CooS (TON_1018) 는 Methanosarcina acetivorans C2A 의 CODH (AAM06652) (60％) 및 Methanosarcina mazei Go1 의 CODH (AAM29817) (59％) 와 같은 CO-산화 메탄생성 고세균 (CO-oxidizing methanogenic archaea)의 CODH 들과 상당한 유사도를 보였다(도 3 및 도 4). 이것은 두 기능을 갖는(bifunctional) CODH/ACS 효소의 아세틸-CoA 합성/절단 활성(acetyl-CoA synthesis/cleavage activity) 이 없는 단일 기능의 CODH (Bonam, D., L. Lehman, G. P. Roberts, and P. W. Ludden. 1989. Regulation of carbon monoxide dehydrogenase and hydrogenase in Rhodospirillum rubrum: effects of CO and oxygen on synthesis and activity. J. Bacteriol. 171:3102-3107. 및 Wu, M. Q. Ren, A. S. Durkin, S. C. Daugherty, L. M Brinkac, R. J. Dodson, R. Madupu, S. A. Sullivan, J. F. Kolonay, W. C. Nelson, L. J. Tallon, K. M. Jones, L. E. Ulrich, J. M. Gonzalez, I. B. Zhulin, F. T. Robb, and J. A. Eisen. 2005. Life in hot carbon monoxide: the complete genome sequence of Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2901. PLoS Genet. 1:e65.)인 것으로 보인다. Fox et al. (Fox, J. D., R. L. Kerby, G. P. Roberts, and P. W. Ludden. 1996. Characterization of the CO-induced, CO-tolerant hydrogenase from Rhodospirillum rubrum and the gene encoding the large subunit of the enzyme. J. Bacteriol. 178:1515-1524.) 에 따르면, Rhodospirillum rubrum 의 단일기능 CODH/수소화효소 복합체 (monofunctional CODH/hydrogenase complex) 는, 세포막을 가로질러 발생하는 수소이온 농도 구배로 에너지가 보존되는 CO-유발 양성자 호흡 (CO-driven proton respiration) 에 관여한다. 이러한 관점에서, CODH 클러스터가 CO를 산화시킴으로써 에너지 보존에 유사한 역할을 할 수 있다는 점을 설명하기 위해, 본 발명자들은 T. onnurineus NA1 이 CO를 이용할 수 있는지를 시험하였다. 그 결과 상기 균주는 실제로, YPS 배지에서보다는 성장률이 다소 떨어지더라도(도 6a), 기본배지(basal medium)에서 보다 배지 1(medium 1)에서 황이 있거나 없는 CO기체 환경에서 더 잘 자란다는 것을 발견했다(도 6a, b). CO기체 환경에서의 성장은 CooS 유전자의 전사와 관련되어 있으며, 그 유전자는 CO의 존재로 유도될 수 있다(도 6c). 황의 첨가는 CooS 유전자의 전사를 감소시킴을 주목할 필요가 있다. 이러한 결과들은 T. onnurineus NA1이 CO로부터 에너지를 발생시킨다는 가설을 뒷받침한다. 이하 상기 가설을 검증하기 위한 구체적인 실험방법 및 결과를 추가로 기술한다.

(2) 실험방법

1) 배양조건

YPS(yeast extract-peptone-sulfur) 배지에서 80℃의 혐기성 조건으로 T. onnurineus NA1을 배양하였다. 돌연변이 균주의 생장 특성을 조사하기 위해, 기본배지로 30.0g/L 의 NaCl을 첨가한 변형배지 1을 사용하였다(Uffen, R. L. 1976. Anaerobic growth of a Rhodopseudomonas species in the dark with carbon monoxide as sole carbon and energy substrate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:3298-3302). 상기 배지를 가압멸균시킨 후, 혐기성 챔버에서 1.0ml/L 의 비타민 용액(Balch, W. E., G. E. Fox, L. J. Magrum, C. R. Woese, and R. S. Wolfe. 1979. Methanogens: reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43:260-296) 및 0.5g/L의 효모추출물(yeast extract)을 변형배지 1에 첨가하였다. 상기 기본 배지에 1N NaOH을 첨가하여 pH를 8.0으로 맞췄다. 준비된 배지 30ml를 150ml 배양병(serum bottle)에 분배시켰고, 가스층(120ml)은 100％ CO (10⁵ Pa)로 바꾸었다. 생리학적 실험을 위한 모든 배양은 80℃의 혐기성 조건에서 24시간 동안 이루어졌으며, 상기 실험들은 중복하여 수행하였다.

2) RNA 추출 및 마이크로어레이 설계

배양물들을 4℃에서 3,500×g 로 10분간 원심분리하고, 생산자의 프로토콜(Invitrogen, Carlsbad, California)에 따라 TRIZOL 시약으로 총(total) RNA를 추출하였다. 총 RNA 시료들은 NanoDrop 분광기(ND-1000, Thermo Scientific) 및 전기영동으로 정량 및 정성 분석하였다. 본 실험에 사용된 마이크로어레이는 Roche NimbleGen 마이크로어레이를 사용하였다. 간략하게, 총 31,994 개의 독립적인 60mer 올리고뉴클레오티드들을 설계하고, 광 탈분해 (photo deprotection chemistry)를 이용하여, 인 시츄(in situ)로 합성하였다. 각각의 독립적인 올리고 뉴클레오티드는 어레이 상에서 2번 반복되었다(총 ∼72,000 features).

3) cDNA 합성 및 혼성화(hybridization) 조건

마이크로어레이 실험은 생산자의 프로토콜에 따라 실시하였다. 각각의 총 RNA 시료(5 ㎍)는 역전사효소, SuperScrip Ⅱ (Invitrogen, Carlsbad, California)를 이용한 역전사 반응에 의해 시아닌(Cy5) 결합 dCTP (Amersharm, Piscataway, NJ)로 표지되었다. 그 후 상기 표지된 cDNA 혼합물을 에탄올 침전법을 이용해 농축시켰다. 농축된 Cy5 표지 cDNAs 를 30㎕ 의 혼성화 용액(GenoCheck, Korea)에 현탁시켰다. 표지된 cDNA들을 마이크로어레이에 위치시킨 후, MAUI Mixer X4 hybridization chamber mixers (BioMicro systems, Salt Lake City, UT) 로 덮었다. 상기 슬라이드들을 MAUI 12-bay systems (BioMicro systems, Salt Lake City, UT)로 42°C에서 12시간 동안 혼성화시켰다. 상기 혼성화된 슬라이드들을 실온에서 2 X SSC, 0.1％ SDS 에서 2분, 1X SSC 에서 3분, 그 후 0.2 X SSC 에서 2분 동안 세척하였다. 상기 슬라이드들을 말리기 위해 1,000 x g에서 20초간 원심분리하였다.

4) 슬라이드 스캐닝(scanning), 표준화(normalization), 및 데이터 분석

어레이는 GenePix 4000B scanner (Molecular Devices Corporation, Union City, CA)를 사용하여 스캔하였고, 데이터는 NimbleScan 2.4 소프트웨어를 사용하여 추출하였다. 어레이 표준화는 메디안 폴리쉬 및 콴틸 표준화(median polish and quantile normalization) 방법을 사용하여 수행하였다(Amaratunga, D., and J. Cabrera. 2001. Statistical analysis of viral microchip data. J. Am. Stat. Assoc. 96:1161-1170). 개별적인 프로브들에 대한 표준화된 발현 값은, Irizarry et al. (Karl, D. M. 1995. The microbiology of deep-sea hydrothermal vents. CRC Press, Boca Raton, FL)에 기술된 바와 같은 RMA (robust multi-array average) 방법을 사용하여, 주어진 ORF에 대한 발현 값을 얻는데 사용되었다. 마지막으로, 시료에서 특정 유전자를 위해 얻은 RMA-처리된 발현 값들(RMA calls)을 이용하여 n배 변화율(n-fold change ratios)(R)을 계산하였다. 데이터 분석은 GeneSpring GX 7.3.1 (Agilent technologies, CA) 를 이용하여 수행하였다. 폴드 변화 필터(Fold change filters)는 상향조절(up-regulated)되는 유전자들에 대해서는 적어도 대조구의 200％, 하향조절되는 유전자들에 대해서는 대조구의 50％ 이하로 나타나야 한다는 조건을 포함시켰다. 데이터는 GeneSpring GX 7.3.1 (Agilent technologies, CA)을 사용한 실험들에서 유사하게 행동하는 유전자 그룹들 내에 클러스터시켰다. 유사한 패턴의 유전자를 분리하기 위하여 유클리드 거리(Euclidian distance) 및 평균결합법(average linkage)에 근거한 알고리즘을 사용하였다.

5) 정량적 RT-PCR

T. onnurineus NA1 (Genbank accession number, CP000855) 의 유전체 서열로부터 유전자 특이적 프라이머들을 설계하였다. 프라이머 서열은 하기 표 3에 기재되어 있다.

cDNA들은 역전사효소, SuperScrip Ⅱ (Invitrogen, Carlsbad, California)를 사용하여 생산자의 프로토콜에 따라 350ng의 총 RNA로부터 합성하였다. PCR 반응은 T1 thermocycler (Biometra)를 사용하여 rTaq (Takara) DNA 중합효소로 수행하였다. 상기 반응은 1차-사슬 반응(first-strand reaction) cDNA, 10 pmol 의 프라이머들, 250 μM dNTPs 및 생산자의 버퍼를 포함하는 50 μl 혼합물에서 이루어졌다. 94℃에서 2분간의 변성(denaturation) 단계 후에, 변성 (30초, 94°C), 어닐링(annealing) (30초, 56°C) 및 신장반응(extension) (1분, 72°C)이 25 사이클 수행되었다. PCR 산물은 0.8％ 아가로스젤 전기영동을 사용하여 분석하였다. 발현수준은 GelPro32.EXE v4.6 (Media Cybernetics, Inc.) 을 사용하여 측정하였다. cha로 명명된 샤페로닌(Chaperonine)-암호화 유전자를 발현 수준을 표준화하기 위한 대조구로 사용하였다.

[표 3]

본 연구에 사용된 올리고뉴클레오티드

6) 표적 유전자 제거(Targeted gene disruption)

T. onnurineus NA1의 생체 내(in vivo)에서의 수소화효소의 기능을 분석하기 위해, 고호열성 고세균(archaeon)인 T. kodakaraensis KOD1 에 사용된 유전자 제거 시스템(gene disruption system)을 이용하여(Sapra, R., K. Bagramyan, and M. W. W. Adams. 2003. A simple energy-conserving system: Proton reduction coupled to proton translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7545-7550), mch 또는 mfh2 수소화효소의 큰 서브유닛의 삽입 불활성 돌연변이(insertional inactivation mutant)들을 제작하였다. 구체적으로, mch 및 mfh2 수소화효소 각각의 큰 서브유닛(TON_023 및 TON_1569)의 인접지역(flanking region)을 포함하는 DNA 단편들을 Flk-mch 또는 Flk-mfh2에 대한 프라이머 세트들(표 3)을 사용하여 T. onnurineus NA1의 지놈 DNA로부터 증폭시켰다. 각각의 증폭된 단편들은 HincII 로 절단된 pUC118에 접합시켰다. 그 후, 주형(Flk-mch_pUC118 또는 Flk-mfh2_pUC118 재조합 플라스미드)으로부터 프라이머 세트(Ivs-mch 또는 Ivs-mfh2)(표 3)들을 사용하여 역(inverse) PCR을 수행하고, 이어서 P_gdh-hmg_Pfu 카세트에 접합시켰다(Sapra, R., K. Bagramyan, and M. W. W. Adams. 2003. A simple energy-conserving system: Proton reduction coupled to proton translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7545-7550). 그 후, 상기 접합된 결과물을 Escherichia coli DH5α 세포들에 형질전환시켰다. 재조합 플라스미드(mch::P_gdh-hmg_Pfu 및 mfh2 _::P_gdh-hmg_Pfu)들은 플라스미드 미니 키트(Qiagen, Hilden, Germany)로 준비하였다. 마지막으로, 상기 플라스미드들을 Sato et al.(Sato, T., T. Fukui, H. Atomi, and T. Imanaka. 2003. Targeted gene disruption by homologous recombination in the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis KOD1. J. Bacteriol. 185:210-220., Sato, T., T. Fukui, H. Atomi, and T. Imanaka. 2005. Improved and versatile transformation system allowing multiple genetic manipulations of the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis. Appl. Environ. Microbiol. 71:3889-3899)의 약간 변형된 방법으로 T. onnurineus NA1에 형질전환시켰다. 형질전환체들은 10 μM 심바스타틴(simvastatin)의 존재 하에 ASW-YT-S 배지에 의해 스크리닝되었고(Matsumi, R., K. Manabe, T. Fukui, H. Atomi, T. Imanaka. 2007. Disruption of a sugar transporter gene cluster in a hyperthermophilic archaeon using a host-marker system based on antibiotic resistance. J. Bacteriol. 189:2683-2691), 표적 유전자가 제거된 것으로 생각되는 후보군들은 PCR 증폭을 통해 표적 지역내 P_gdh-hmg _Pfu 카세트의 존재여부로 제거여부를 확인할 수 있었다.

7) 성장 및 수소 생성에 관한 동역학적 분석

성장은 눈으로 직접 확인하였다. 시료들을 해염(Sea Salt) (30.0 g/L), 포르말린(2.5％), 및 4' -6' -디아미디노-2-페닐인돌(0.01％)를 포함하는 멸균수에 희석시키고(Sato, T., T. Fukui, H. Atomi, and T. Imanaka. 2005. Improved and versatile transformation system allowing multiple genetic manipulations of the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis. Appl. Environ. Microbiol. 71:3889-3899), 블랙 폴리카보네이트 막 필터로 거른 후(구멍 크기, 0.2㎛; Whatman), 위상차현미경(Zeiss Axioplan)으로 셌다. 수소 가스는 HP-PLOT Molesieve column (Agilent) 및 TCD 검출기가 구비된 가스 크로마토그래프 HP 5890 series II (Hewlett Packard)를 사용하여 측정하였다. 아르곤이 가스 운반자로 사용되었다. 오븐 온도는 40℃ 였다. 분석을 위한 10㎕의 가스 시료는 배양병의 부틸고무를 통해 가스-타이트 시린지(gas-tight syringe)로 꺼냈다. 검출된 수소 가스의 측정은 피크 면적을, 질소에 40％ 수소를 포함하는 표준 가스를 사용한 희귀분석에 의해 수행된 보정 곡선과 비교함으로써 계산되었다.

(3) 실험결과

1) T. onnurineus NA1 수소화효소의 in silico 분석

앞선 T. onnurineus NA1의 유전체 분석은 8 반복의 수소화효소 유전자 클러스터의 존재를 보여주었으며(Porter, K. G. and Y. S. Feig. 1980. The use of DAPI for identifying and counting microflora. Limnol. Oceanogr. 25:943-948), 5개의 막-결합(membrane-bound) [NiFe]-수소화효소 (Mbh, TON_1583-1595; Mbx, TON_0486-0498; Mfh1, TON_0273-0278; Mfh2, TON_1566-1573; Mch, TON_1021-1024), 및 3개의 세포질내(cytoplasmic) [NiFe]-수소화효소 (Fru, TON_1559-1562; Sulf I, TON_0533-0544; Sulf II, TON_0051-0055)를 포함한다. 지놈 시퀀싱이 완료된 Thermococcales 균주들과의 수소화효소 유전자 클러스터 비교 분석 결과를 볼 때, Mfh1, Mfh2, 또는 Mch 클러스터들에 상동성이 있는 클러스터들은 매우 드물어 보이고, T. barophilus MP (Mfh1, Mch 상동유전자), Thermococcus sp. AM4 (Mfh1, Mch 상동유전자) (Unfinished sequence, GenBank accession number, ABXN00000000), 및 T. gammatolerans (Mfh1 및 Mfh2 상동성) (GenBank accession number, CP001398)와 같이 최근에 지놈 서열이 결정된 Thermococcales 균주들에서 발견된다. T. onnurineus NA1의 fdh1 - mfh1 - mnh1 (Lee, H. S., S. G. Kang, S. S. Bae, J. K. Lim, Y. Cho, Y. J. Kim, J. H. Jeon, S.-S. Cha, K. K. Kwon, H.-T. Kim, C.-J. Park, H.-W. Lee, S. I. Kim, J. Chun, R. R. Colwell, S.-J. Kim, 및 J.-H. Lee. 2008. The complete genome sequence of Thermococcus onnurineus NA1 reveals a mixed heterotrophic and carboxydotrophic metabolism. J. Bacteriol. 190:7491-7499.의 논문에서 Hyg4-I 으로 명명됨.), fdh2 - mfh2 - mnh2 (Hyg4-III), 및 codh -mch-mnh3 (Hyg4-II) 클러스터들의 서열분석은 상기 클러스터들이 각각 포름산염 탈수소화효소(FDH) 및 CO 탈수소화효소(Codh)와 같은 산화환원효소들을 포함한다는 사실을 보여준다. 특히, CO 조건에서의 성장에 의해 나타나는 일산화탄소영양 대사는 CO를 산화시킴으로써 수소생성 경로에서 에너지를 제공하는 Codh-Mch-Mnh3의 기능적 역할을 암시한다.

2) CO-유도(driven) 성장 조건하에서의 수소화효소 유전자의 발현

T. onnurineus NA1 이 CO 조건에서 성장하면서 수소를 생산할 수 있는지 알아보았다. 도 7에 나타난 바와 같이, YPS배지에서는 수소 생산을 탐지할 수 없었지만, CO가 첨가된 배지 1에서는 배양시간이 길어질수록 총 수소 가스와 세포 수가 증가하였다.

*그 후, 어떤 수소화효소가 일산화탄소영양 성장 동안에 수소 생성에 관여하는지 알아보기 위하여 CO가 포함된 성장조건 또는 복합배지(YPS)에서의 수소화효소 유전자들의 발현 수준을 분석하였다. 하기 표 4, 표 5 및 도 8A 에 나와 있듯이, codh-mch-mnh3 클러스터의 일부 ORF들(16개 중 10개의 ORF들)의 발현 수준은 CO를 포함한 생장조건에서 YPS에 비해서 2배 이상 상향조절(up-regulated)되었다. 추가로, fdh2 - mfh2 - mnh2 클러스터 내 여러 ORF들(TON_1563, TON_1569-1571)의 발현 수준 역시 1g의 효모추출물을 포함한 CO 조건에서 상향조절되었다. codh - mch - mnh3 클러스터 내의 ORF들의 발현 수준 역시 효모추출물의 양에 따라 다양하다는 것을 주목할 필요가 있고, 이는 CO-유도 대사작용(CO-driven metabolism)에서 이화작용의 억제 또는 활성에의 관련성을 암시한다(표 4 및 표 5). 반면에, 다른 수소화효소 유전자 클러스터들의 발현은 큰 변화가 없는 반면 fdh1-mfh1-mnh1 클러스터의 유전자들(29개 ORF들 중 20개의 유전자들)은 하향조절을 보였다. 수소화효소 각각의 큰 서브유닛에 대한 정량적 RT-PCR 데이터 역시 마이크로어레이 데이터와 일치하였다. mch 및 mfh2 수소화효소의 큰 서브유닛 (TON_1023 및 TON_1569)의 발현은 2배 이상 증가한 반면(도 8B), mfh1 수소화효소의 큰 서브유닛(TON_0276)의 발현은 억제되었고, 다른 큰 서브유닛들(mbh, mbx, frh, 및 sulfⅠ)은 양 쪽 조건에서 모두 일정하게 유지되었다. 이러한 결과들은 codh - mch - mnh3 또는 fdh2 - mfh2 - mnh2 클러스터들이 CO에 의해 유도될 수 있으며, 일산화탄소영양 대사와 관련된 수소 생성 과정에 관련될 수 있다는 점을 암시한다.

하기 표 4는 YPS 배지에서와 비교한 CO 성장 조건에서의 수소화효소 유전자 클러스터 각각의 ORF 발현 수준을 나타내며, 표 5는 T. onnurineus NA1 의 수소화효소 클러스터를 포함한 112개 ORF들의 계층적 클러스터링을 보여준다.

[표 4]

[표 5]

3) 유전자 파괴 및 돌연변이들의 형질분석(Gene disruption and phenotype analysis of disruption mutants)

전사체(transcriptome) 분석은 codh와 가깝게 클러스터된 mch 수소화효소가(도 9A) T. onnurineus NA1에서 일산화탄소영양 수소 생성(carboxydotrophic hydrogenogenesis) 과정에 중요한 역할을 할 수 있다는 사실을 암시한다. 하지만, fdh2-mfh2-mnh2 클러스터의 상향조절 및 다른 수소화효소 mRNA의 많은 반복수는 codh-mch-mnh3 가 단독으로 상기 과정에 관여하는 것인지 아니면 다른 수소화효소들이 탈수소화효소(dehydrogenases)와 복합체를 형성하거나 탈수소화효소와 연합하여 FADH₂나 NADH와 같은 전자운반체를 재활용함으로써 mch 에 대해 대체적 경로가 될 수 있는지에 관하여 의문을 불러일으킨다. 따라서 본 발명자들은 mch 또는 mfh2 수소화효소 각각의 큰 서브유닛의 결손(disruption) 돌연변이들을 만들었다(Matsumi, R., K. Manabe, T. Fukui, H. Atomi, T. Imanaka. 2007. Disruption of a sugar transporter gene cluster in a hyperthermophilic archaeon using a host-marker system based on antibiotic resistance. J. Bacteriol. 189:2683-2691). 제작 방법은 도 9A에 도시되어 있다. 표적 영역에서의 상동재조합(homologous recombination)에 의한 P_gdh-hmg _Pfu 카세트의 삽입 불활성화 및 그에 따른 hmg-CoA 유전자의 과발현으로 Mch 또는 Mfh2 수소화효소 유전자 클러스터 각각의 큰 서브유닛이 파괴(disruption)된다. 표적 유전자 파괴는, 10 μM 심바스타틴(simvastatin)이 첨가된 YPS 배지에서의 생존으로 후보군들을 선별한 후에, PCR 증폭을 통한 P_gdh-hmg _Pfu카세트의 존재로 확인되었다(도 9B). 파괴 후보군들(Δ mch _TNA1 및 Δ mfh2 _TNA1)에서 P_gdh-hmg _Pfu가 증폭될 수 있는 반면, mch 또는 mfh2의 큰 서브유닛의 증폭은 실패했다. 이러한 결과들은 T. kodakaraensis KOD1 (Sapra, R., K. Bagramyan, and M. W. W. Adams. 2003. A simple energy-conserving system: Proton reduction coupled to proton translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7545-7550)에 보고된 유전자 파괴 시스템이 T. onnurinues NA1에도 적용될 수 있음을 보여준다.

YPS 배지에서 결손(disruption) 돌연변이 Δmch _TNA1 및 Δmfh2 _TNA1 을 얻을 수 있었으므로, Mch 또는 Mfh2 가 YPS 배지의 대사 소비에 필수적이지 않다는 것을 알 수 있다. 도 10에서 알 수 있듯이, 돌연변이 균주들 Δ mch _TNA1 및 Δ mfh2 _TNA1 의 성장 및 형태 변화는 YPS 배지 상에서 상기 유전자들이 반드시 필수적인 것은 아니라는 것을 확인시켜준다. 추가적으로, CO 성장 조건에서 Δ mfh2 _TNA1 균주는 야생형 균주와 비슷한 수준으로 성장하고 수소를 생성하였다(도 7 및 10). 반면에, Δ mch _TNA1 돌연변이는 CO 성장 조건에서 성장할 수 없었으며, 수소도 생산하지 못했다(도 10). 이는 Mch 큰 서브유닛의 부재가 CO 하에서 T. onnurineus NA1의 일산화탄소영양 생존능력을 완전히 파괴한다는 것을 보여준다. 이 결과들을 함께 고려하면, CO가 기질로 공급되었을 경우 Mch 수소화효소만이 성장 및 수소 생성에 관여한다고 볼 수 있다.

실시예 4. Thermococcus onnurineus NA1 에 의한 포름산염 ( formate )-의존적 H₂ 생성: 포름산염-반응(responsive) 수소화효소의 동정

(1) 실험방법

1) 배양조건

YPS(yeast extract-peptone-sulfur) 배지에서 80℃의 혐기성 조건으로 T. onnurineus NA1을 배양하였다. 돌연변이 균주의 생장 특성을 조사하기 위해, 기본배지로 30.0g/L 의 NaCl을 첨가한 변형배지 1을 사용하였다(Uffen, R. L. 1976. Anaerobic growth of a Rhodopseudomonas species in the dark with carbon monoxide as sole carbon and energy substrate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:3298-3302). 상기 배지를 가압멸균시킨 후, 혐기성 챔버에서 1.0ml/L 의 비타민 용액(Balch, W. E., G. E. Fox, L. J. Magrum, C. R. Woese, and R. S. Wolfe. 1979. Methanogens: reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43:260-296) 및 1.0g/L의 효모추출물(yeast extract)을 첨가하였다. 상기 기본 배지에 1N NaOH 및 10.0g/L의 포름산염 나트륨(Sigma)을 첨가하여 pH를 8.0으로 맞췄다. 준비된 배지 30ml를 150ml 배양병(serum bottle)에 분배시켰고, 가스층(120ml)은 80％ N₂ - 20％ CO₂ (10⁵Pa)로 하였다. 생리학적 실험을 위한 모든 배양은 80℃의 혐기성 조건에서 24시간 동안 이루어졌으며, 상기 실험들은 중복하여 수행하였다.

2) RNA 추출 및 마이크로어레이 설계

상기 배양물들을 4℃에서 3,500×g 로 10분간 원심분리하고, 생산자의 프로토콜(Invitrogen, Carlsbad, California)에 따라 TRIZOL 시약으로 총(total) RNA를 추출하였다. 총 RNA 시료들은 NanoDrop 분광기(ND-1000, Thermo Scientific) 및 전기영동으로 정량 및 정성 분석하였다. 본 실험에 사용된 마이크로어레이는 Roche NimbleGen 마이크로어레이를 사용하였다. 간략하게, 총 31,994 개의 독립적인 60mer 올리고뉴클레오티드들을 설계하고, 광 탈분해 (photo deprotection chemistry)를 이용하여, 인 시츄(in situ)로 합성하였다. 각각의 독립적인 올리고뉴클레오티드는 어레이 상에서 2번 반복되었다(총 ∼72,000 features).

3) cDNA 합성 및 혼성화(hybridization) 조건

마이크로어레이는 생산자의 프로토콜에 따라 실시하였다. 각각의 총 RNA 시료(5 ㎍)는 역전사효소, SuperScrip Ⅱ (Invitrogen, Carlsbad, California) 를 이용한 역전사 반응에 의해 시아닌(Cy5) 결합 dCTP (Amersharm, Piscataway, NJ)로 표지되었다. 그 후 상기 표지된 cDNA 혼합물을 에탄올 침전법을 이용해 농축시켰다. 농축된 Cy5 표지 cDNAs 를 30㎕ 의 혼성화 용액(GenoCheck, Korea)에 현탁시켰다. 표지된 cDNA들을 마이크로어레이에 위치시킨 후, MAUI Mixer X4 hybridization chamber mixers (BioMicro systems, Salt Lake City, UT) 로 덮었다. 상기 슬라이드들을 MAUI 12-bay systems (BioMicro systems, Salt Lake City, UT)로 42°C에서 12시간 동안 혼성화시켰다. 상기 혼성화된 슬라이드들을 실온에서 2 X SSC, 0.1％ SDS 에서 2분, 1X SSC 에서 3분, 그 후 0.2 X SSC 에서 2분 동안 세척하였다. 상기 슬라이드들을 말리기 위해 1,000 x g에서 20초간 원심분리하였다.

5) 정량적 RT-PCR

T. onnurineus NA1 (Genbank accession number, CP000855) 의 유전체 서열로부터 유전자 특이적 프라이머들을 설계하였다(상기 표 3 참조).

cDNA들은 역전사효소, SuperScrip Ⅱ (Invitrogen, Carlsbad, California)를 사용하여 생산자의 프로토콜에 따라 350ng의 총 RNA로부터 합성하였다. PCR 반응은 T1 thermocycler (Biometra)를 사용하여 rTaq (Takara) DNA 중합효소로 수행하였다. 상기 반응은 1차-사슬 반응(first-strand reaction) cDNA, 10 pmol 의 프라이머들, 200 μmM dNTPs 및 생산자의 버퍼를 포함하는 50 μl 혼합물에서 이루어졌다. 94℃에서 2분간의 변성(denaturation) 단계 후에, 변성 (30초, 94°C), 어닐링(annealing) (30초, 56°C) 및 신장반응(extension) (1분, 72°C)이 25 사이클 수행되었다. PCR 산물은 0.8％ 아가로스젤 전기영동을 사용하여 분석하였다. 발현수준은 GelPro32.EXE v4.6 (Media Cybernetics, Inc.) 을 사용하여 측정하였다. Cha로 명명된 샤페로닌(Chaperonine)-암호화 유전자를 발현 수준을 표준화하기 위한 대조구로 사용하였다.

6) 표적 유전자 제거(Targeted gene disruption)

T. onnurineus NA1의 생체 내(in vivo)에서의 수소화효소의 기능을 분석하기 위해, 고호열성 고세균(archaeon)인 T. kodakaraensis KOD1 에 사용된 유전자 제거 시스템(gene disruption system)을 이용하여(Sapra, R., K. Bagramyan, and M. W. W. Adams. 2003. A simple energy-conserving system: Proton reduction coupled to proton translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7545-7550), Mfh 수소화효소의 큰 서브유닛의 삽입 불활성 돌연변이(insertional inactivation mutant)들을 제작하였다.

구체적으로, mfh1 및 mfh2 수소화효소의 각각의 큰 서브유닛(TON_0276 및 TON_1569)의 인접지역(flanking region)을 포함하는 DNA 단편들을 Flk-mfh1 또는 Flk-mfh2에 대한 프라이머 세트들(표 3)을 사용하여 T. onnurineus NA1의 지놈 DNA로부터 증폭시켰다. 각각의 증폭된 단편들은 HincII 로 절단하여 pUC118에 접합시켰다. 그 후, 주형(Flk-Mfh1_pUC118 또는 Flk-mfh2_pUC118 재조합 플라스미드)으로부터 프라이머 세트(Ivs-Mfh1 또는 Ivs-mfh2) (표 3)들을 사용하여 역(inverse) PCR을 수행하고, 이어서 P_gdh-hmg_Pfu 카세트에 접합시켰다(Sapra, R., K. Bagramyan, and M. W. W. Adams. 2003. A simple energy-conserving system: Proton reduction coupled to proton translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7545-7550). 그 후, 상기 접합된 결과물을 Escherichia coli DH5α 세포들에 형질전환시켰다. 재조합 플라스미드(Mfh1::P_gdh-hmg_Pfu 및 mfh2 _::P_gdh-hmg_Pfu)들은 플라스미드 미니 키트(Qiagen, Hilden, Germany)로 준비하였다. 마지막으로, 상기 플라스미드들을 Sato et al.(Sato, T., T. Fukui, H. Atomi, and T. Imanaka. 2003. Targeted gene disruption by homologous recombination in the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis KOD1. J. Bacteriol. 185:210-220., Sato, T., T. Fukui, H. Atomi, and T. Imanaka. 2005. Improved and versatile transformation system allowing multiple genetic manipulations of the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis. Appl. Environ. Microbiol. 71:3889-3899)의 약간 변형된 방법으로 T. onnurineus NA1에 형질전환시켰다. 형질전환체들은 10 μM 심바스타틴(simvastatin)의 존재 하에 ASW-YT-S 배지에 의해 스크리닝되었고, 표적 유전자의 제거여부는 PCR 증폭을 통해 표적 지역내 P_gdh-hmg _Pfu 카세트의 존재여부로 확인할 수 있었다.

7) 성장 및 수소 생산에 관한 동역학적 분석

성장은 눈으로 직접 확인하였다. 시료들을 해염(Sea Salt) (30.0 g/L), 포르말린(2.5％), 및 4' -6' -디아미디노-2-페닐인돌(0.01％)을 포함하는 멸균수에 희석시키고(Sato, T., T. Fukui, H. Atomi, and T. Imanaka. 2005. Improved and versatile transformation system allowing multiple genetic manipulations of the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis. Appl. Environ. Microbiol. 71:3889-3899), 블랙 폴리카보네이트 막 필터로 거른 후(구멍 크기, 0.2㎛; Whatman), 위상차현미경(Zeiss Axioplan)으로 셌다. 수소 가스는 HP-PLOT Molesieve column (Agilent) 및 TCD 검출기가 구비된 가스 크로마토그래프 HP 5890 series II (Hewlett Packard)를 사용하여 측정하였다. 아르곤이 가스 운반자로 사용되었다. 오븐 온도는 40℃ 였다. 분석을 위한 10㎕의 가스 시료는 배양병의 부틸고무를 통해 가스-타이트 시린지(gas-tight syringe)로 꺼냈다. 검출된 수소 가스의 측정은 피크 면적을, 질소에 40％ 수소를 포함하는 표준 가스를 사용한 희귀분석에 의해 수행된 보정 곡선과 비교함으로써 계산되었다.

(2) 실험결과

1) T. onnurineus NA1 내의 수소화효소

앞선 T. onnurineus NA1의 유전체 분석은 8 반복의 수소화효소 유전자 클러스터의 존재를 보여주었으며(Porter, K. G. and Y. S. Feig. 1980. The use of DAPI for identifying and counting microflora. Limnol. Oceanogr. 25:943-948), 5개의 막-결합(membrane-bound) [NiFe]-수소화효소들(Mbh, TON_1583-1595; Mbx, TON_0486-0498; Mfh1, TON_0273-0278; Mfh2, TON_1566-1573; Mch, TON_1021-1024), 및 3개의 세포질내(cytoplasmic) [NiFe]-수소화효소들(Fru, TON_1559-1562; Sulf I, TON_0533-0544; Sulf II, TON_0051-0055)을 포함한다. 지놈 시퀀싱이 완료된 Thermococcales 균주들과의 수소화효소 유전자 클러스터의 비교 분석을 통해 Mbh, Mbx, Sulf I 및 Sulf II 클러스터들이 다른 Thermococcales 균주들에서 많이 발견된다는 것을 알 수 있었다(Fox, J. D., R. L. Kerby, G. P. Roberts, and P. W. Ludden. 1996. Characterization of the CO-induced, CO-tolerant hydrogenase from Rhodospirillum rubrum and the gene encoding the large subunit of the enzyme. J. Bacteriol. 178:1515-1524. 등 참조). 반면에, Mfh1, Mfh2 또는 Mch 클러스터들에 상동성이 있는 클러스터들은 매우 드물었고, T. barophilus MP (Mfh1, Mch homologues) 및 Thermococcus sp. AM4 (Mfh1, Mch homologoues)와 같이 최근에 지놈 서열이 결정된 Thermococcales 균주들에서 발견된다. 특히, T. onnurineus NA1의 Mfh1 및 Mfh2 의 비교 분석은 양 클러스터의 유전자 구성이 T. litoralis (Wu, M., Q. Ren, A. S. Durkin, S. C. Daugherty, L. M Brinkac, R. J. Dodson, R. Madupu, S. A. Sullivan, J. F. Kolonay, W. C. Nelson, L. J. Tallon, K. M. Jones, L. E. Ulrich, J. M. Gonzalez, I. B. Zhulin, F. T. Robb, and J. A. Eisen. 2005. Life in hot carbon monoxide: the complete genome sequence of Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2901. PLoS Genet. 1:e65), T. barophilus MP (Unfinished sequence, GenBank accession number, ABSF00000000), Thermococcus sp. AM4 (Unfinished sequence, GenBank accession number, ABXN00000000) 및 Pyrococcus abyssi (GenBank accession number, AL096836) 에서 발견된 것과 매우 유사하다는 것을 보여준다. 상기 유전자 클러스터들은 포름산염 탈수소화효소 (FDH) 유닛, 에너지-전환 수소화효소 (ECH) 유닛 및 H⁺/Na⁺ 역수송체 (Mnh) 유닛으로 구성된다. 막-결합 수소화효소와 연관된 FDHs 에 더하여, 막-결합 [NiFe]-수소화효소에 클러스터되지 않은 2개 이상의 FDH 복제물을 유전체에서 발견하였다.

2) 포름산염 성장 조건에서의 수소화효소 유전자들의 발현

도 11에 나타낸 바와 같이, T. onnurineus NA1 은 외부 포름산염을 기질로 하여 성장할 수 있으며, 상기 성장은 수소 생성과 밀접한 상관관계가 있다. 수소 가스의 양과 세포 수는 포름산염을 첨가한 배지 1에서 배양 시간이 길어질수록 증가하였다. 포름산염-포함 배지에서 수소생성과 관련된 수소화효소를 동정하기 위하여, 포름산염 배지에서 키웠을 때의 수소화효소 유전자 클러스터의 mRNA 발현 수준과 복합 배지(YPS)에서 키웠을 때의 발현 수준을 마이크로어레이 분석을 이용하여 비교하였다. 하기 표 6, 표 7 및 도 12A 에 나타낸 바와 같이, fdh2-mfh2-mnh2 클러스터(앞서, Hyg4-III 로 명명) 에서 20개의 ORF들 중 10개의 ORF들의 mRNA 발현 수준은 YPS에 비해서 포름산염 배지에서 상당히 (2배 이상) 상향조절(up-regulated)되었다. 게다가, codh-mch-mnh3 클러스터 (앞서, Hyg4-II 로 명명)에서 6개의 ORF들의 발현 수준 역시 3.0g의 효모추출물을 포함한 포름산염 배지에서만 상향조절되었다. 또한, fdh2-mfh2-mnh2 클러스터의 ORF 발현수준은 효모추출물의 양에 따라 다양했으며, 이는 포름산염-유도 대사작용(formate-driven metabolism)에서 이화작용의 억제 또는 활성에의 관련성을 암시한다(표 6 및 표 7 참조). 반면에, 다른 수소화효소 유전자 클러스터들의 ORF 발현 수준들은 상대적으로 일정하거나(mbx, frh 및 mch) 억제된 수준(mbh, sulf I 및 mfh1)으로 나타났다. 흥미롭게도, fdh1-mfh1-mnh1 클러스터(앞서, Hyg4-I 로 명명) 내의 대부분의 유전자들(29개 ORF들 중 25개 유전자들)은 하향조절되었고, 이는 외부의 포름산염이 fdh2-mfh2-mnh2 는 상향조절시키는 반면, fdh1-mfh1-mnh1의 발현은 억제할 수 있다는 것을 시사한다. 수소화효소 유전자 클러스터 각각의 큰 서브유닛에 대한 정량적 RT-PCR 결과 역시 마이크로어레이 데이터와 일치하였다. mfh2 수소화효소의 큰 서브유닛 (TON_1569)은 YPS에서 보다 포름산염-첨가 배지에서 적어도 2 사이클 빨리 증폭되었다(도 12B). 이러한 결과들은 fdh2-mfh2-mnh2 클러스터가 포름산염에 반응할 수 있다는 사실을 암시한다. fdh2-mfh2-mnh2 클러스터만이 가능한 포름산염 트랜스포터(putative formate transporter) (TON_1573)로 어노테이션된 유전자를 가졌다는 점을 주목할 필요가 있으며, 포름산염을 유입시키는 기능과 관련될 수 있다.

하기 표 6은 YPS 배지에서와 비교한 포름산염 포함 배지에서의 수소화효소 유전자 클러스터 각각의 ORF 발현 수준을 보여주며, 표 7은 T. onnurineus NA1 의 수소화효소 클러스터를 포함한 112개 ORF들의 계층적 클러스터링을 나타낸다.

[표 6]

[표 7]

전사체(transcriptome) 분석은 Mfh2 가 T. onnurineus NA1에서 외부 포름산염을 이용한 수소 생성에 중요한 역할을 할 수 있다는 사실을 암시한다. 하지만, 포름산염 포함 배지에서의 codh-mch-mnh3 클러스터의 여러 ORF들의 상향조절 또는 Mbx 및 Frh 와 같은 다른 수소화효소 유전자들의 높은 발현수준은 여전히 Mfh2가 단독으로 상기 과정에 관여하는 것인지 아니면 다른 수소화효소들이 포름산염 탈수소화효소(formate dehydrogenases)와 복합체를 형성하거나 FADH₂나 NADH와 같은 전자운반체를 재활용함으로써 Mfh2에 대해 대체적 경로가 될 수 있는지에 관하여 의문을 불러일으킨다. 따라서 본 발명자들은 Mfh1 (TON_0276) 또는 Mfh2 (TON_1569) 수소화효소 각각의 큰 서브유닛의 파괴(disruption) 돌연변이들을 만들었다. 제작 방법은 도 13A에 도시되어 있다. 표적 영역에서의 상동재조합(homologous recombination)에 의한 P_gdh-hmg_Pfu 카세트의 삽입 불활성화 및 그에 따른 hmg-CoA 유전자의 과발현으로 Mfh1 또는 Mfh2 수소화효소 유전자 클러스터 각각의 큰 서브유닛이 파괴(disruption)된다. 표적 유전자 파괴는, 10 μM 심바스타틴(simvastatin)이 첨가된 YPS 배지에서의 생존으로 후보군들을 선별한 후에, PCR 증폭을 통한 P_gdh-hmg_Pfu 카세트의 존재로 확인되었다(도 13B). 예를 들어, 파괴 후보군들(Δmfh1_TNA1 및 Δmfh2_TNA1)에서는 P_gdh-hmg_Pfu가 증폭될 수 있는 반면, Mfh1 또는 Mfh2의 큰 서브유닛의 증폭은 실패했다. 이러한 결과들은 표적 유전자 파괴가 원하는 유전자 위치에서 정확하게 일어났으며, T. kodakaraensis KOD1 (Sapra, R., K. Bagramyan, and M. W. W. Adams. 2003. A simple energy-conserving system: Proton reduction coupled to proton translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7545-7550)에 보고된 유전자 파괴 시스템이 T. onnurinues NA1에도 적용될 수 있음을 보여준다.

YPS 배지에서 결손(disruption) 돌연변이 Δmfh1_TNA1 및 Δmfh2_TNA1 을 얻을 수 있었으므로, mfh1 및 mfh2 가 YPS 배지의 대사 소비에 필수적이지 않다는 것을 알 수 있다. Mfh1, Mfh2 및 Mch 수소화효소의 돌연변이 균주들(Δmfh1_TNA1, Δmfh2_TNA1 및 Δmch_TNA1)의 성장 및 형태 변화는 YPS 배지 상에서 상기 유전자들이 반드시 필수적인 것은 아니라는 것을 보여준다(도 14). 추가적으로, 포름산염이 포함된 배지에서 Δmfh1_TNA1 및 Δmch_TNA1 균주들의 성장 및 수소생성은 야생형 균주와 비슷한 수준이었다(도 11 및 14). 이는 상기 유전자 클러스터들이 외부 포름산염이 투입된 조건에서의 성장과 무관하다는 것을 보여준다. 반면에, Δmfh2_TNA1 돌연변이는 생장할 수 없으며, 수소를 생산할 수도 없었다(도 14). 이 결과들을 함께 고려하면, 포름산염이 기질로 공급되었을 경우 Mfh2 수소화효소만이 성장 및 수소 생성에 관여한다는 것을 보여준다.

[산업상 이용가능성]

본 발명의 신규한 수소화효소(hydrogenase)는 일산화탄소, 포름산염 또는 녹말 등과 같은 여러 기질에 대해 특이적으로 반응하여 많은 양의 수소를 생성할 수 있다. 본 발명의 수소생산방법에 따르면 상기 균주를 특정 배양조건으로 배양하는 것만으로 많은 양의 수소를 생산할 수 있으므로, 기존의 수소생산방법에 비하여 경제적이고 효율적이며, 고온에서도 수소를 생산할 수 있는 장점이 있다.

Claims

서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 수소화효소(hydrogenase).
제 1 항의 수소화효소를 암호화하는 유전자.
제 2 항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 18의 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 수소화효소를 암호화하는 유전자.
배양용기에 배지를 만드는 단계; Thermococcus spp.를 상기 배양용기에서 배양하는 단계; 및 상기 배양용기로부터 수소를 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 Thermococcus spp. 로부터 수소를 생산하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 Thermococcus spp. 는 Thermococcus onnurineus NA1 (기탁번호: KCTC 10859BP)인 것을 특징으로 하는 수소를 생산하는 방법.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 배지는 포름산염이 첨가된 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항 내지 제 6 항의 어느 한 항에 있어서, 상기 배양은 80℃의 고온에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항 내지 제 6 항의 어느 한 항에 있어서, 상기 배양은 혐기적 조건에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
으로 하는 방법.
서열번호 22 및 서열번호 18 (FDH2-MFH2-MNH2 클러스터를 구성하는 유전자)의 유전자가 작동가능하도록 연결된 재조합벡터.
제 9 항의 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포.
제 10 항의 형질전환체를 이용하여 수소를 생산하는 방법에 있어서,
배양용기에 포름산염을 포함하는 배지를 만드는 단계;
상기 형질전환체를 상기 배양용기에서 배양하는 단계; 및
상기 배양용기로부터 수소를 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.