JP2018138060A - Thermococcus属から分離された新規な水素化酵素、これを暗号化する遺伝子及びその遺伝子を有する微生物を用いて水素を産生する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
T. onnurineus NA1は8種類の新規な水素化酵素遺伝子クラスターを有している。前記水素化酵素は水素分子(H2)の代謝に関連する核心的酵素であって、2H++2e−⇔H2の可逆的反応に触媒作用をする。好ましくは、前記クラスターに属する水素化酵素は配列番号1乃至配列番号8よりなる群から選ばれるいずれか一種以上のアミノ酸配列を含むタンパク質及びこの機能的な同等物を提供する。「機能的同等物」には前記タンパク質においてその一部または全部が置換されたり、アミノ酸の一部が欠失または付加されたアミノ酸配列変形体が含まれる。アミノ酸の置換は、好ましくは、保存的置換である。天然に存在するアミノ酸の保存的置換の例は、下記の通りである;脂肪族アミノ酸(Gly、Ala、Pro)、疎水性アミノ酸(Ile、Leu、Val)、芳香族アミノ酸(Phe、Tyr、Trp)、酸性アミノ酸(Asp、Glu)、塩基性アミノ酸(His、Lys、Arg、Gln、Asn)及び硫黄含有アミノ酸(Cys、Met)。アミノ酸の欠失は、好ましくは、水素化酵素の活性に直接的に関与しない部分に位置する。
(1)実験方法
1)培養条件
一般的な培養条件として、80℃の嫌気性環境においてYPS(yeast extract-peptone-sulfur)培地に細胞を培養させた(Holden et al. 2001)。生理的特性に対する試験は、1.0ml微量元素混合物、1mlビタミン溶液(Balch, W. E., G. E. Fox, L. J. Magrum, C. R. Woese, and R. S. Wolfe. 1979. Methanogens: reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43:260-296.)、NaCl(30gl−1)及び酵母抽出物(0.5gl−1)を追加した変形培地1(Sokolova, T. G., C. Jeanthon, N. A Kostrikina, N. A. Chernyh, A. V. Lebedinsky, E. Stackebrandt, and E. A. Bonch-Osmolovskaya. 2004. The first evidence of anaerobic CO oxidation coupled with H2 production by a hyperthermophilic archaeon isolated from a deep-sea hydrothermal vent. Extremophiles 8:317-323.)を用いて行った。pHはNaOHを用いて8.0に調整した。嫌気的条件下で製造した培地を25ml血清瓶に入れ、残りのガス層(15ml)をN2/CO2(80:20、1bar)または100%COにより満たした。ホルム酸塩や澱粉により培養する場合には、加圧滅菌する前にそれぞれ10gL−1のホルム酸塩ナトリウム(Sigma社製)や5gL−1の可溶性澱粉(Sigma社製)を培地に添加した。生理的な試験のための培養はいずれも80℃において2日間行った。
T. onnurineus NA1の遺伝体配列は全ゲノムショットガンシークエンス法及びパイロシークエンス法を用いて決定した。キャピラリーシークエンスのために、2−から3−kbサイズの挿入ライブラリ(11,028クローン)、40−kbの挿入ライブラリ(1,870クローン)、及び35−kbの挿入ライブラリ(288クローン)を製作し、ABI 3730XLシーケンサー(Applied Biosystems社製)を用いて配列分析した。パイロシークエンスのために、GS−20シーケンサー(454 Life Sciences)を用いて581,990個のDNA断片に対して配列分析を行った。両配列分析機により生成されたコンティグを組み合わせ、クローンワーキング及びPCRシークエンスによりシークエンス間隔を埋めた。タンパク質を暗号化するORF及びRNA遺伝子はGlimmer 3.0(University of Maryland)、GSFinder及びRBSFinderの組み合わせとmanual ORF fitting processを通じて予測した。全てのORFを決定した後に、NCBI nrタンパク質データベース、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)及びCOGs(Clusters of Orthologous Groups of proteins)データベースに対してBLASTp検索(Tatusova, R. L., D. A. Natale, I. V. Garkavtsev, T. A. Tatusova, U. T. Shankavaram, B. S. Rao, B. Kiryutin, M. Y. Galperin, N. D. Fedorova, and E. V. Koonin. 2001. The COG database: new developments in phylogenetic classification of proteins from complete genomes. Nucleic Acids Res. 29:22-28.)を用いてタンパク質配列をさらに分析した。tRNA−暗号化部位はtRNA scan−SEを用いて予測した(Lowe, T. M., and S. R. Eddy. 1997. tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Res. 25:955-964.)。
T. onnurineus NA1細胞を4%SDS及び4mM EDTAが含まれている100mM Tris−HClバッファ(pH6.8)に浮遊させ、10分間沸騰した後、22,000gにて20分間遠心分離した。12%SDS−PAGEを用いて細胞溶解物を分離し、分子サイズに基づいて30個の分画を得た。その後、トリプシン(Promega, USA)を用いてそれをイン−ゲル分解させ(Kim, Y. H., K. Cho, S. H. Yun, J. Y. Kim, K. H. Kwon, J. S. Yoo, and S. I. Kim. 2006. Analysis of aromatic catabolic pathways in Pseudomonas putida KT 2440 by combined proteomic approach: 2-DE/MS and cleavable ICAT analysis. Proteomics 6:1301-1318.)、質量分析計(Thermo Finnigan LTQ IT)により分析するためにトリプシンにより分解した物質を0.5%トリフルオロ酢酸溶液に溶かした。ペプチド同定はシーケストプログラム(Thermo Finnigan, San Jose, CA)を用いて行った。
50mlのT. onnurineus NA1培養液をN2/CO2(80:20, 1bar)または100%CO気体相において様々な濃度の酵母抽出物を添加した変形培地1において半指数成長段階まで生長した。6,000xgにて30分間遠心分離して細胞を得た。500μlのトリゾール試薬(Invitrogen, Carlsbad, CA)を添加した50μlの50mM Tris−HClバッファ(pH7.5)にペレットを再懸濁させた。その細胞を冷凍と解凍過程を通じて溶解させ、200μlのクロロホルムを用いて試料を抽出した。総RNAを含む水溶液相はエタノール沈殿を通じてさらに処理した後、蒸留水に再懸濁させた。RNAの濃度及び完全性は0.8%アガロースゲル分析と260及び280nmにおける吸光度測定を通じて決定した。製品使用説明書による方法によりSuperScriptTM II逆転写酵素(Invitrogen)を用いて逆転写及びPCR増幅を行った。対照群として、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ(CODH:carbon monooxide dehydrogenase)及びHsp60(chaperonine)の増幅のために下記の2組のプライマーを使用した。
Hsp60 gene(順方向、5’−ATGGCACAGCTTAGTGGACAG−3’(配列番号25)及び逆方向、5’−CAAGGATTTCCTGGGCTTTCTC−3’(配列番号26))。
アミノ酸配列の相同性検索はNCBIの非冗長なタンパク質データベースに対してBLASTプログラムを用いて行った。グループ4水素化酵素のL1信号(C[GS][ILV]C[AGNS]xxH、xはあるアミノ酸を表示)を持つタンパク質のためのモチーフ検索は、NCBIの非冗長なタンパク質データベースに対してProteinFinderプログラム(Ensoltek, Korea)を用いて行った。タンパク質に対する多重配列整列はClustalWプログラム(Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680.)を用いて行い、系統学的ツリーはMolecular Evolutionary Genetics Analysis (Mega 4.1) ソフトウェア(Tamura, K., Dudley, J., Nei, M. and Kumar, S. (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol. Biol. Evol. 24, 1596-1599.)を用いて構築した。16S rRNA配列の系統学ツリーはRibosomalデータベースサイト(http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp)から得たプレアライン配列を用いて製造した。
ロゴ表示は、関連配列により共有される与えられたモチーフそれぞれの位置と関連する情報を視覚化するために用いられた。グラフィック表示において、それぞれの位置の全体的な高さはその位置(ビットにて表示)における保存度と関連があるのに対し、ある位置内のシンボルの相対的なサイズはそれらの相対的な頻度を示す。ロゴ分析は、Berkeley Structural Genomics Center (http://weblogo.berkeley.edu/)において行われた。
1)T. onnurineus NA1遺伝子の一般的特徴
熱水噴出孔地域においてThermococcus spp.が成功的な優占種になった理由を明らかにするために、T. onnurineus NA1の遺伝体配列を任意的な全ゲノムショットガンシークエンス法及びパイロシークエンスを組み合わせて決定した。その結果、T. onnurineus NA1は別途の染色体外構成要素がなく、一つの環状染色体(1,847,607bp)を有していることを明らかにし、合計1,976個の暗号化DNA配列(coding DNA sequences, CDSs)を同定した(表1及び図1)。1104個のCDS(55.8%)は相同性及びドメイン検索を通じてアノテーションすることができるが、残りの872個のCDSの機能は1次構造から予測することができなかった。遺伝体スケールにてタンパク質類似度を検索したとき、T. onnurineus NA1タンパク質の82.7%がThermococcalesのものと類似性を示した。
T. onnurineus NA1の遺伝体において水素化酵素及びそれと関連するタンパク質の割合が高いことを見出し(5.5%)、これは、CO脱水素酵素及びホルム酸塩脱水素酵素を含む酸化還元酵素と関連する還元力の保存または再循環の増加を示す。
[NiFe]−水素化酵素のグループ4に属する前記3個のEch水素化酵素(MFH1、MFH2、MCH)それぞれは、TON_266−TON_282、TON_1563−TON_1580及びTON_1016−TON_1031ORFs(オープン・リーディング・フレーム)よりなる大きな17−または18−遺伝子クラスター(fdh1−mfh1−mnh1、fdh2−mfh2−mnh2及びcodh−mch−mnh3)の一部であることが判明された(図2のB)。クラスター内のORFは3個のサブクラスターに分けられる。1番目の部分は、ホルム酸塩脱水素化酵素(Fdh1(配列番号9)またはFdh2(配列番号11))または一酸化炭素脱水素化酵素(Codh(配列番号10))などの酸化還元酵素を暗号化している。2番目の部分は、5個から7個のサブユニットを有する多重膜−結合水素化酵素(MFH1、MFH2またはMCH)を暗号化する。最後の部分は、Na+/H+アンチポーターなどの陽イオン/水素イオンアンチポーターを暗号化する。このような3モジュール遺伝子クラスターは未だ報告されていない。
(1)分析方法
水素ガスはHP−PLOT Molesieve column (Agilent)及びTCD検出器を備えたgas chromatograph HP 5890 series II (Hewlett Packard)を用いて測定した。アルゴンをガス運搬体として用いた。水素ガスを定量化するために窒素にそれぞれの成分(CO、CO2、H2、CH4及びO2)1%(w/w)が含まれているGas calibration standard (Supleco)を使用した。
反復された多数の水素化酵素が様々な環境下においてT. onnurineus NA1に水素を効率的に産生せしめるかどうかを調べるために、様々なエネルギー源を用いて水素生成率を分析した(表2)。その結果、NA1菌株は硫黄無し条件下でも澱粉、CO、及びホルム酸塩を用いて水素を生成することができた。特に、CO及びホルム酸塩は水素を効率的に産生する上で極めて優れたエネルギー源であった。
(1)CODH遺伝子クラスター及び一酸化炭素栄養成長
上述したように、T. onnurineus NA1は特異的な遺伝子クラスターを有していることを見出し(CODH−MCH−MNH3)、この遺伝子クラスターは水素化酵素(mch、TON_1021−1024、配列番号5)と一緒に暫定的な転写調節因子(TON_1016)、CODH付属タンパク質(CooC、TON_1019)、CODH触媒サブユニット(CooS、TON_1018)、及び電子伝達タンパク質(CooF、TON_1017)を暗号化する塩基配列から構成されている(図2B)。微生物の一酸化炭素(CO)代謝の中心酵素であるCooS(TON_1018)は、Methanosarcina acetivorans C2AのCODH(AAM06652)(60%)及びMethanosarcina mazei Go1のCODH(AAM29817)(59%)などのCO−酸化メタン生成古細菌のCODHとかなり高い類似度を示している(図3及び図4)。これは、両機能を有するCODH/ACS酵素のアセチル−CoA合成/切断活性がない単一機能のCODH(Bonam, D., L. Lehman, G. P. Roberts, and P. W. Ludden. 1989. Regulation of carbon monoxide dehydrogenase and hydrogenase in Rhodospirillum rubrum: effects of CO and oxygen on synthesis and activity. J. Bacteriol. 171:3102-3107.およびWu, M. Q. Ren, A. S. Durkin, S. C. Daugherty, L. M Brinkac, R. J. Dodson, R. Madupu, S. A. Sullivan, J. F. Kolonay, W. C. Nelson, L. J. Tallon, K. M. Jones, L. E. Ulrich, J. M. Gonzalez, I. B. Zhulin, F. T. Robb, and J. A. Eisen. 2005. Life in hot carbon monoxide: the complete genome sequence of Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2901. PLoS Genet. 1:e65.)であると認められる。Fox et al. (Fox, J. D., R. L. Kerby, G. P. Roberts, and P. W. Ludden. 1996. Characterization of the CO-induced, CO-tolerant hydrogenase from Rhodospirillum rubrum and the gene encoding the large subunit of the enzyme. J. Bacteriol. 178:1515-1524.)によれば、Rhodospirillum rubrumの単一機能CODH/水素化酵素複合体は、細胞膜を横切って発生する水素イオン濃度勾配にてエネルギーが保存されるCO−誘発陽性子呼吸に関与する。この観点から、CODHクラスターがCOを酸化させることによりエネルギー保存に類似する役割を果たすことができるという点を説明するために、本発明者らは、T. onnurineus NA1がCOを利用することができるかどうかを試験した。その結果、前記菌株は、実際に、YPS培地よりはやや成長率が落ちるとしても(図6a)、基本培地よりも培地1において硫黄があるかないCO気体環境において一層上手く成長するということを見出した(図6a、b)。CO気体環境における成長はCooS遺伝子の転写と関連されており、その遺伝子はCOの存在により誘導可能である(図6c)。硫黄の添加はCooS遺伝子の転写を減少させるという点に注目する必要がある。これらの結果は、T. onnurineus NA1がCOからエネルギーを発生するという仮説を裏付ける。以下、前記仮説を検証するための具体的な実験方法及び結果をさらに述べる。
1)培養条件
YPS(yeast extract-peptone-sulfur)培地において80℃の嫌気性条件下でT. onnurineus NA1を培養した。突然変異菌株の生長特性を調べるために、基本培地として30.0g/LのNaClを添加した変形培地1を使用した(Uffen, R. L. 1976. Anaerobic growth of a Rhodopseudomonas species in the dark with carbon monoxide as sole carbon and energy substrate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:3298-3302)。前記培地を加圧滅菌した後、嫌気性チャンバーにおいて1.0ml/Lのビタミン溶液(Balch, W. E., G. E. Fox, L. J. Magrum, C. R. Woese, and R. S. Wolfe. 1979. Methanogens: reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43:260-296)及び0.5g/Lの酵母抽出物を変形培地1に添加した。前記基本培地に1N NaOHを添加してpHを8.0に調整した。準備された培地30mlを150ml培養瓶に分配し、ガス層(120ml)は100%CO(105Pa)に交換した。生理学的実験のためのすべての培養は80℃の嫌気性条件下で24時間行われ、前記実験は重複して行った。
培養物を4℃において3,500×gにて10分間遠心分離し、生産者のプロトコール(Invitrogen, Carlsbad, California)に従ってTRIZOL試薬により総RNAを抽出した。総RNA試料はNanoDrop分光器(ND−1000, Thermo Scientific)及び電気泳動により定量及び定性分析した。この実験に供されたマイクロアレイは、Roche NimbleGenマイクロアレイであった。簡略に、総31,994個の独立した60merオリゴヌクレオチドを設計し、光脱分解を用いて、インサイチュにて合成した。それぞれの独立したオリゴヌクレオチドはアレイ上において2回反復された(総〜72,000features)。
マイクロアレイ実験は生産者のプロトコールに従って実施した。それぞれの総RNA試料(5μg)は逆転写酵素、SuperScrip II (Invitrogen, Carlsbad, California)を用いた逆転写反応によりシアニン(Cy5)結合dCTP(Amersharm, Piscataway, NJ)にて標識された。その後、前記標識されたcDNA混合物をエタノール沈殿法を用いて濃縮させた。濃縮されたCy5標識cDNAsを30μlの混成化溶液(GenoCheck, Korea)に懸濁させた。標識されたcDNAをマイクロアレイに位置させた後、MAUI Mixer X4 hybridization chamber mixers (BioMicro systems, Salt Lake City, UT)により覆った。前記スライドをMAUI 12−bay systems (BioMicro systems, Salt Lake City, UT)により42℃において12時間混成化させた。前記混成化されたスライドを室温において2XSSC、0.1%SDSにおいて2分、1XSSCにおいて3分、その後、0.2XSSCにおいて2分間洗浄した。前記スライドを乾燥するために、1, 000xgにて20秒間遠心分離した。
アレイはGenePix 4000B scanner (Molecular Devices Corporation, Union City, CA)を用いてスキャンし、データはNimbleScan 2.4ソフトウェアを用いて抽出した。アレイ標準化はメディアンポリッシュ及びクォンタイル標準化方法を用いて行った(Amaratunga, D., and J. Cabrera. 2001. Statistical analysis of viral microchip data. J. Am. Stat. Assoc. 96:1161-1170)。個別的なプローブに対する標準化された発現値は、Irizarry et al. (Karl, D. M. 1995. The microbiology of deep-sea hydrothermal vents. CRC Press, Boca Raton, FL)に記述されたRMA(robust multi-array average)方法を用いて、与えられたORFに対する発現値を得るのに用いられた。最後に、試料から特定の遺伝子のために得たRMA処理された発現値(RMA calls)を用いてn倍変化率(R)を計算した。データ分析は、GeneSpring GX 7.3.1 (Agilent technologies, CA)を用いて行った。フォールド変化フィルターは上向き調節される遺伝子に対しては少なくとも対照区の200%、下向き調節される遺伝子に対しては対照区の50%以下で現れるべきであるという条件を含めた。データは、GeneSpring GX 7.3.1 (Agilent technologies, CA)を用いた実験において類似に行動する遺伝子グループ内にクラスターさせた。類似するパターンの遺伝子を分離するためにユークリッド距離及び平均結合法に基づくアルゴリズムを用いた。
T. onnurineus NA1(Genbank accession number,CP000855)の遺伝体配列から遺伝子特異的プライマーを設計した。プライマー配列は、下記表3に記載されている。
T. onnurineus NA1の生体内における水素化酵素の機能を分析するために、高好熱性古細菌であるT. kodakaraensis KOD1に用いられた遺伝子除去システムを用いて(Sapra, R., K. Bagramyan, and M. W. W. Adams. 2003. A simple energy-conserving system: Proton reduction coupled to proton translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7545-7550)、mchまたはmfh2水素化酵素の大きなサブユニットの挿入不活性突然変異を製作した。具体的に、mch及びmfh2水素化酵素それぞれの大きなサブユニット(TON_023及びTON_1569)の隣接地域を含むDNA断片をFlk−mchまたはFlk−mfh2に対するプライマー組(表3)を用いてT. onnurineus NA1のゲノムDNAから増幅させた。それぞれの増幅された断片はHincIIで切断されたpUC118に接合させた。その後、鋳型(Flk−mch_pUC118またはFlk−mfh2_pUC118組換えプラスミド)からプライマー組(Ivs−mchまたはIvs−mfh2)(表3)を用いて逆PCRを行い、次いで、Pgdh−hmgPfuカセットに接合させた(Sapra, R., K. Bagramyan, and M. W. W. Adams. 2003. A simple energy-conserving system: Proton reduction coupled to proton translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7545-7550)。その後、前記接合された結果物をEscherichia coli DH5a細胞に形質転換させた。組換えプラスミド(mch::Pgdh−hmgPfu及びmfh2::Pgdh−hmgPfu)はプラスミドミニキット(Qiagen, Hilden, Germany)により準備した。最後に、前記プラスミドをSato et al.(Sato, T., T. Fukui, H. Atomi, and T. Imanaka. 2003. Targeted gene disruption by homologous recombination in the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis KOD1. J. Bacteriol. 185:210-220., Sato, T., T. Fukui, H. Atomi, and T. Imanaka. 2005. Improved and versatile transformation system allowing multiple genetic manipulations of the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis. Appl. Environ. Microbiol. 71:3889-3899)の僅かな変形された方法によりT. onnurineus NA1に形質転換させた。形質転換体は10μMシンバスタチンの存在下でASW−YT−S培地によりスクリーニングされ(Matsumi, R., K. Manabe, T. Fukui, H. Atomi, T. Imanaka. 2007. Disruption of a sugar transporter gene cluster in a hyperthermophilic archaeon using a host-marker system based on antibiotic resistance. J. Bacteriol. 189:2683-2691)、標的遺伝子が除去されたと思われる候補群はPCR増幅を通じて標的地域内Pgdh−hmgPfuカセットの存在有無により除去有無を確認することができた。
成長は目視確認した。試料を海塩(30.0g/L)、ホルマリン(2.5%)、及び4’−6’−ジアミジノ−2−フェニルインドール(0.01%)を含む滅菌水に希釈させ(Sato, T., T. Fukui, H. Atomi, and T. Imanaka. 2005. Improved and versatile transformation system allowing multiple genetic manipulations of the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis. Appl. Environ. Microbiol. 71:3889-3899)、ブラックポリカーボネート膜フィルターによりろ過した後(孔径;0.2μm, Whatman)、位相差顕微鏡(Zeiss Axioplan)により計数した。水素ガスはHP−PLOT Molesieve column (Agilent)及びTCD検出器を備えたガスクロマトグラフHP5890series II(Hewlett Packard)を用いて測定した。アルゴンがガス運搬体として用いられた。オーブンの温度は40℃であった。分析のための10μlのガス試料は培養瓶のブチルゴムを通じてガスタイトシリンジにより取り出した。検出された水素ガスの測定はピーク面積を、窒素に40%水素を含む標準ガスを用いた回帰分析により行われた補正曲線と比較することにより計算された。
1)T. onnurineus NA1水素化酵素のイン・シリコ分析
先のT. onnurineus NA1の遺伝体分析は8反復の水素化酵素遺伝子クラスターの存在を示し(Porter, K. G. and Y. S. Feig. 1980. The use of DAPI for identifying and counting microflora. Limnol. Oceanogr. 25:943-948)、5個の膜結合[NiFe]−水素化酵素(Mbh,TON_1583−1595;Mbx,TON_0486−0498;Mfh1,TON_0273−0278;Mfh2,TON_1566−1573;Mch,TON_1021−1024)、及び3個の細胞質内[NiFe]−水素化酵素(Fru,TON_1559−1562;SulfI,TON_0533−0544;SulfII,TON_0051−0055)を含む。ゲノムシークエンスが完了したThermococcales菌株との水素化酵素遺伝子クラスターの比較分析結果をみるとき、Mfh1、Mfh2、またはMchクラスターに相同性があるクラスターは極めて稀であると考えられ、T. barophilus MP(Mfh1、Mch相同遺伝子)、Thermococcus sp. AM4(Mfh1、Mch相同遺伝子)(Unfinished sequence, GenBank accession number, ABXN00000000)、及びT. gammatolerans(Mfh1及びMfh2相同性)(GenBank accession number、CP001398)のように最近にゲノム配列が決定されたThermococcales菌株から発見される。T. onnurineus NA1のfdh1−mfh1−mnh1(Lee, H. S., S. G. Kang, S. S. Bae, J. K. Lim, Y. Cho, Y. J. Kim, J. H. Jeon, S.-S. Cha, K. K. Kwon, H.-T. Kim, C.-J. Park, H.-W. Lee, S. I. Kim, J. Chun, R. R. Colwell, S.-J. Kim,及びJ.-H. Lee. 2008. The complete genome sequence of Thermococcus onnurineus NA1 reveals a mixed heterotrophic and carboxydotrophic metabolism. J. Bacteriol. 190:7491-7499.の論文においてHyg4−Iと命名される。)、fdh2−mfh2−mnh2(Hyg4−III)、及びcodh−mch−mnh3(Hyg4−II)クラスターの配列分析は前記クラスターがそれぞれホルム酸塩脱水素化酵素(FDH)及びCO脱水素化酵素(Codh)などの酸化還元酵素を含むということを示す。特に、CO条件における成長により現れる一酸化炭素栄養代謝はCOを酸化させることにより水素生成経路においてエネルギーを提供するCodh−Mch−Mnh3の機能的役割を示唆する。
T. onnurineus NA1がCO条件下で成長しながら水素を産生することができるかどうかを調べてみた。図7に示すように、YPS培地においては水素産生を探知することができなかったが、COが添加された培地1においては培養時間が長くなるにつれて総水素ガスと細胞数が増大した。
転写体分析は、codhと近くにクラスターされたmch水素化酵素が(図9A)T. onnurineus NA1において一酸化炭素栄養水素の生成過程に重要な役割を果しうるということを示唆する。しかしながら、fdh2−mfh2−mnh2クラスターの上向き調節及び他の水素化酵素mRNAの多くの反復数はcodh−mch−mnh3が単独にて前記過程に関与するものであるか、それとも、他の水素化酵素が脱水素化酵素と複合体を形成したり脱水素化酵素と連合してFADH2やNADHなどの電子運搬体を再活用することによりmchに対して代替的経路になりうるかに関して疑問を引き起こす。このため、本発明者らは、mchまたはmfh2水素化酵素それぞれの大きなサブユニットの欠損突然変異を製造した(Matsumi, R., K. Manabe, T. Fukui, H. Atomi, T. Imanaka. 2007. Disruption of a sugar transporter gene cluster in a hyperthermophilic archaeon using a host-marker system based on antibiotic resistance. J. Bacteriol. 189:2683-2691)。製作方法は、図9Aに示してある。標的領域における相同組換えによるPgdh−hmgPfuカセットの挿入不活性化及びそれによるhmg−CoA遺伝子の過発現によりMchまたはMfh2水素化酵素遺伝子クラスターそれぞれの大きなサブユニットが破壊される。標的遺伝子破壊は、10μMシンバスタチンが添加されたYPS培地における生存により候補群を選別した後、PCR増幅を通じてのPgdh−hmgPfuカセットの存在により確認された(図9B)。破壊候補群(△mchTNA1及び△mfh2TNA1)においてPgdh−hmgPfuが増幅可能であるのに対し、mchまたはmfh2の大きなサブユニットの増幅には失敗した。これらの結果は、T. kodakaraensis KOD1(Sapra, R., K. Bagramyan, and M. W. W. Adams. 2003. A simple energy-conserving system: Proton reduction coupled to proton translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7545-7550)に報告された遺伝子破壊システムがT. onnurinues NA1にも適用可能であることを示す。
Claims (5)
- ホルム酸から水素を産生するための 配列番号 61ないし 配列番号 80の塩基配列を含 Hyg4-III遺伝子。
- 水素産生のための組換えベクターであって、 請求項1に記載の遺伝子が作動可能に連結される、組換えベクター。
- 水素産生のための、請求項2に記載の組換えベクターで形質転換された原核細胞。
- 請求項3に記載の形質転換体を使用して水素を産生する方法であって、
培養容器に培地を生成するステップと、
前記培養容器の気体相中にホルム酸塩を供給するステップと、
前記培養容器において前記形質転換体を培養するステップと、
前記培養容器から水素を抽出するステップと
を含む、方法。 - 配列番号 61ないし 配列番号 80の タンパク質を含 水素産生の酵素システム。
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