JP2012501645A - Thermococcus属から分離された新規な水素化酵素、これを暗号化する遺伝子及びその遺伝子を有する微生物を用いて水素を産生する方法 - Google Patents
Thermococcus属から分離された新規な水素化酵素、これを暗号化する遺伝子及びその遺伝子を有する微生物を用いて水素を産生する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2012501645A JP2012501645A JP2011525990A JP2011525990A JP2012501645A JP 2012501645 A JP2012501645 A JP 2012501645A JP 2011525990 A JP2011525990 A JP 2011525990A JP 2011525990 A JP2011525990 A JP 2011525990A JP 2012501645 A JP2012501645 A JP 2012501645A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- gene
- hydrogenase
- hydrogen
- culture vessel
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 110
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 title claims abstract description 89
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 88
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 title claims abstract description 82
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 82
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 241000205188 Thermococcus Species 0.000 title claims abstract description 15
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 17
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 61
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 claims description 60
- 241001054881 Thermococcus onnurineus NA1 Species 0.000 claims description 52
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 37
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 25
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 20
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 12
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 9
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 9
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 229910017171 MNH2 Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 108010031234 carbon monoxide dehydrogenase Proteins 0.000 description 22
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 22
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 101100076833 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) fml2 gene Proteins 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 101100046502 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) TNA1 gene Proteins 0.000 description 11
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 9
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 238000009709 capacitor discharge sintering Methods 0.000 description 7
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 7
- 239000007205 yps medium Substances 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 229910001030 Iron–nickel alloy Inorganic materials 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 241000981880 Thermococcus kodakarensis KOD1 Species 0.000 description 6
- 241000617156 archaeon Species 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 6
- 102100021083 Forkhead box protein C2 Human genes 0.000 description 5
- 101800002739 Melanin-concentrating hormone Proteins 0.000 description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 241000204969 Thermococcales Species 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 101150110903 foxc2 gene Proteins 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- -1 3-hydroxy-methylglutaryl Chemical group 0.000 description 4
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 4
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 4
- 241000190984 Rhodospirillum rubrum Species 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 108700042296 Archaeal Genes Proteins 0.000 description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 238000010629 Molecular evolutionary genetics analysis Methods 0.000 description 3
- 241001148023 Pyrococcus abyssi Species 0.000 description 3
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 241001235254 Thermococcus kodakarensis Species 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 108010092755 nickel-iron hydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003669 Antiporters Human genes 0.000 description 2
- 108090000084 Antiporters Proteins 0.000 description 2
- 101100378521 Arabidopsis thaliana ADH2 gene Proteins 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- 101150034017 FDH1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150096236 FDH2 gene Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000003332 Ilex aquifolium Nutrition 0.000 description 2
- 241000209027 Ilex aquifolium Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 2
- RYMZZMVNJRMUDD-UHFFFAOYSA-N SJ000286063 Natural products C12C(OC(=O)C(C)(C)CC)CC(C)C=C2C=CC(C)C1CCC1CC(O)CC(=O)O1 RYMZZMVNJRMUDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 101100446293 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) fbh1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- GEHSZWRGPHDXJO-ALELSXGZSA-N coenzyme f420 Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](C)O[P@@](O)(=O)OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CN1C2=CC(O)=CC=C2C=C2C1=NC(=O)NC2=O GEHSZWRGPHDXJO-ALELSXGZSA-N 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical compound [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical group C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 235000021062 nutrient metabolism Nutrition 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 2
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N simvastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)C(C)(C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N 0.000 description 2
- 229960002855 simvastatin Drugs 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 230000009105 vegetative growth Effects 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 101150016096 17 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150078635 18 gene Proteins 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102100038222 60 kDa heat shock protein, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 101710154868 60 kDa heat shock protein, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000950981 Bacillus subtilis (strain 168) Catabolic NAD-specific glutamate dehydrogenase RocG Proteins 0.000 description 1
- 102100031680 Beta-catenin-interacting protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101100327692 Caenorhabditis elegans hsp-60 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001025886 Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2901 Species 0.000 description 1
- 241000905957 Channa melasoma Species 0.000 description 1
- 241000588923 Citrobacter Species 0.000 description 1
- 101001071225 Clostridium pasteurianum Iron hydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010089656 Ech hydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108091006149 Electron carriers Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- YPZRHBJKEMOYQH-UYBVJOGSSA-N FADH2 Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]([C@H](O)[C@@H]1O)O[C@@H]1COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C(NC(=O)NC2=O)=C2NC2=C1C=C(C)C(C)=C2 YPZRHBJKEMOYQH-UYBVJOGSSA-N 0.000 description 1
- 229910002548 FeFe Inorganic materials 0.000 description 1
- 101000993469 Homo sapiens Beta-catenin-interacting protein 1 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241001529871 Methanococcus maripaludis Species 0.000 description 1
- 241000109953 Methanococcus maripaludis S2 Species 0.000 description 1
- 241001139408 Methanosarcina acetivorans C2A Species 0.000 description 1
- 241001437647 Methanosarcina mazei Go1 Species 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 241000320117 Pseudomonas putida KT2440 Species 0.000 description 1
- 241000205160 Pyrococcus Species 0.000 description 1
- 241000191043 Rhodobacter sphaeroides Species 0.000 description 1
- 241000190932 Rhodopseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000190950 Rhodopseudomonas palustris Species 0.000 description 1
- 241000847591 Thermococcus barophilus MP Species 0.000 description 1
- 241001127161 Thermococcus gammatolerans Species 0.000 description 1
- 241001495444 Thermococcus sp. Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004887 air purification Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000009604 anaerobic growth Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920005549 butyl rubber Polymers 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000012824 chemical production Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 1
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000005868 electrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004134 energy conservation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000002803 fossil fuel Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012405 in silico analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000000696 methanogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 239000003345 natural gas Substances 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000001782 photodegradation Methods 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000013630 prepared media Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000011425 standardization method Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000000629 steam reforming Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000005979 thermal decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0067—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen as donor (1.12)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P3/00—Preparation of elements or inorganic compounds except carbon dioxide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y112/00—Oxidoreductases acting on hydrogen as donor (1.12)
- C12Y112/01—Oxidoreductases acting on hydrogen as donor (1.12) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.12.1)
- C12Y112/01004—Hydrogenase (NAD+, ferredoxin)(1.12.1.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/10—Process efficiency
- Y02P20/129—Energy recovery, e.g. by cogeneration, H2recovery or pressure recovery turbines
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
T. onnurineus NA1は8種類の新規な水素化酵素遺伝子クラスターを有している。前記水素化酵素は水素分子(H2)の代謝に関連する核心的酵素であって、2H++2e−⇔H2の可逆的反応に触媒作用をする。好ましくは、前記クラスターに属する水素化酵素は配列番号1乃至配列番号8よりなる群から選ばれるいずれか一種以上のアミノ酸配列を含むタンパク質及びこの機能的な同等物を提供する。「機能的同等物」には前記タンパク質においてその一部または全部が置換されたり、アミノ酸の一部が欠失または付加されたアミノ酸配列変形体が含まれる。アミノ酸の置換は、好ましくは、保存的置換である。天然に存在するアミノ酸の保存的置換の例は、下記の通りである;脂肪族アミノ酸(Gly、Ala、Pro)、疎水性アミノ酸(Ile、Leu、Val)、芳香族アミノ酸(Phe、Tyr、Trp)、酸性アミノ酸(Asp、Glu)、塩基性アミノ酸(His、Lys、Arg、Gln、Asn)及び硫黄含有アミノ酸(Cys、Met)。アミノ酸の欠失は、好ましくは、水素化酵素の活性に直接的に関与しない部分に位置する。
(1)実験方法
1)培養条件
一般的な培養条件として、80℃の嫌気性環境においてYPS(yeast extract-peptone-sulfur)培地に細胞を培養させた(Holden et al. 2001)。生理的特性に対する試験は、1.0ml微量元素混合物、1mlビタミン溶液(Balch, W. E., G. E. Fox, L. J. Magrum, C. R. Woese, and R. S. Wolfe. 1979. Methanogens: reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43:260-296.)、NaCl(30gl−1)及び酵母抽出物(0.5gl−1)を追加した変形培地1(Sokolova, T. G., C. Jeanthon, N. A Kostrikina, N. A. Chernyh, A. V. Lebedinsky, E. Stackebrandt, and E. A. Bonch-Osmolovskaya. 2004. The first evidence of anaerobic CO oxidation coupled with H2 production by a hyperthermophilic archaeon isolated from a deep-sea hydrothermal vent. Extremophiles 8:317-323.)を用いて行った。pHはNaOHを用いて8.0に調整した。嫌気的条件下で製造した培地を25ml血清瓶に入れ、残りのガス層(15ml)をN2/CO2(80:20、1bar)または100%COにより満たした。ホルム酸塩や澱粉により培養する場合には、加圧滅菌する前にそれぞれ10gL−1のホルム酸塩ナトリウム(Sigma社製)や5gL−1の可溶性澱粉(Sigma社製)を培地に添加した。生理的な試験のための培養はいずれも80℃において2日間行った。
T. onnurineus NA1の遺伝体配列は全ゲノムショットガンシークエンス法及びパイロシークエンス法を用いて決定した。キャピラリーシークエンスのために、2−から3−kbサイズの挿入ライブラリ(11,028クローン)、40−kbの挿入ライブラリ(1,870クローン)、及び35−kbの挿入ライブラリ(288クローン)を製作し、ABI 3730XLシーケンサー(Applied Biosystems社製)を用いて配列分析した。パイロシークエンスのために、GS−20シーケンサー(454 Life Sciences)を用いて581,990個のDNA断片に対して配列分析を行った。両配列分析機により生成されたコンティグを組み合わせ、クローンワーキング及びPCRシークエンスによりシークエンス間隔を埋めた。タンパク質を暗号化するORF及びRNA遺伝子はGlimmer 3.0(University of Maryland)、GSFinder及びRBSFinderの組み合わせとmanual ORF fitting processを通じて予測した。全てのORFを決定した後に、NCBI nrタンパク質データベース、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)及びCOGs(Clusters of Orthologous Groups of proteins)データベースに対してBLASTp検索(Tatusova, R. L., D. A. Natale, I. V. Garkavtsev, T. A. Tatusova, U. T. Shankavaram, B. S. Rao, B. Kiryutin, M. Y. Galperin, N. D. Fedorova, and E. V. Koonin. 2001. The COG database: new developments in phylogenetic classification of proteins from complete genomes. Nucleic Acids Res. 29:22-28.)を用いてタンパク質配列をさらに分析した。tRNA−暗号化部位はtRNA scan−SEを用いて予測した(Lowe, T. M., and S. R. Eddy. 1997. tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Res. 25:955-964.)。
T. onnurineus NA1細胞を4%SDS及び4mM EDTAが含まれている100mM Tris−HClバッファ(pH6.8)に浮遊させ、10分間沸騰した後、22,000gにて20分間遠心分離した。12%SDS−PAGEを用いて細胞溶解物を分離し、分子サイズに基づいて30個の分画を得た。その後、トリプシン(Promega, USA)を用いてそれをイン−ゲル分解させ(Kim, Y. H., K. Cho, S. H. Yun, J. Y. Kim, K. H. Kwon, J. S. Yoo, and S. I. Kim. 2006. Analysis of aromatic catabolic pathways in Pseudomonas putida KT 2440 by combined proteomic approach: 2-DE/MS and cleavable ICAT analysis. Proteomics 6:1301-1318.)、質量分析計(Thermo Finnigan LTQ IT)により分析するためにトリプシンにより分解した物質を0.5%トリフルオロ酢酸溶液に溶かした。ペプチド同定はシーケストプログラム(Thermo Finnigan, San Jose, CA)を用いて行った。
50mlのT. onnurineus NA1培養液をN2/CO2(80:20, 1bar)または100%CO気体相において様々な濃度の酵母抽出物を添加した変形培地1において半指数成長段階まで生長した。6,000xgにて30分間遠心分離して細胞を得た。500μlのトリゾール試薬(Invitrogen, Carlsbad, CA)を添加した50μlの50mM Tris−HClバッファ(pH7.5)にペレットを再懸濁させた。その細胞を冷凍と解凍過程を通じて溶解させ、200μlのクロロホルムを用いて試料を抽出した。総RNAを含む水溶液相はエタノール沈殿を通じてさらに処理した後、蒸留水に再懸濁させた。RNAの濃度及び完全性は0.8%アガロースゲル分析と260及び280nmにおける吸光度測定を通じて決定した。製品使用説明書による方法によりSuperScriptTM II逆転写酵素(Invitrogen)を用いて逆転写及びPCR増幅を行った。対照群として、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ(CODH:carbon monooxide dehydrogenase)及びHsp60(chaperonine)の増幅のために下記の2組のプライマーを使用した。
Hsp60 gene(順方向、5’−ATGGCACAGCTTAGTGGACAG−3’(配列番号25)及び逆方向、5’−CAAGGATTTCCTGGGCTTTCTC−3’(配列番号26))。
アミノ酸配列の相同性検索はNCBIの非冗長なタンパク質データベースに対してBLASTプログラムを用いて行った。グループ4水素化酵素のL1信号(C[GS][ILV]C[AGNS]xxH、xはあるアミノ酸を表示)を持つタンパク質のためのモチーフ検索は、NCBIの非冗長なタンパク質データベースに対してProteinFinderプログラム(Ensoltek, Korea)を用いて行った。タンパク質に対する多重配列整列はClustalWプログラム(Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680.)を用いて行い、系統学的ツリーはMolecular Evolutionary Genetics Analysis (Mega 4.1) ソフトウェア(Tamura, K., Dudley, J., Nei, M. and Kumar, S. (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol. Biol. Evol. 24, 1596-1599.)を用いて構築した。16S rRNA配列の系統学ツリーはRibosomalデータベースサイト(http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp)から得たプレアライン配列を用いて製造した。
ロゴ表示は、関連配列により共有される与えられたモチーフそれぞれの位置と関連する情報を視覚化するために用いられた。グラフィック表示において、それぞれの位置の全体的な高さはその位置(ビットにて表示)における保存度と関連があるのに対し、ある位置内のシンボルの相対的なサイズはそれらの相対的な頻度を示す。ロゴ分析は、Berkeley Structural Genomics Center (http://weblogo.berkeley.edu/)において行われた。
1)T. onnurineus NA1遺伝子の一般的特徴
熱水噴出孔地域においてThermococcus spp.が成功的な優占種になった理由を明らかにするために、T. onnurineus NA1の遺伝体配列を任意的な全ゲノムショットガンシークエンス法及びパイロシークエンスを組み合わせて決定した。その結果、T. onnurineus NA1は別途の染色体外構成要素がなく、一つの環状染色体(1,847,607bp)を有していることを明らかにし、合計1,976個の暗号化DNA配列(coding DNA sequences, CDSs)を同定した(表1及び図1)。1104個のCDS(55.8%)は相同性及びドメイン検索を通じてアノテーションすることができるが、残りの872個のCDSの機能は1次構造から予測することができなかった。遺伝体スケールにてタンパク質類似度を検索したとき、T. onnurineus NA1タンパク質の82.7%がThermococcalesのものと類似性を示した。
T. onnurineus NA1の遺伝体において水素化酵素及びそれと関連するタンパク質の割合が高いことを見出し(5.5%)、これは、CO脱水素酵素及びホルム酸塩脱水素酵素を含む酸化還元酵素と関連する還元力の保存または再循環の増加を示す。
[NiFe]−水素化酵素のグループ4に属する前記3個のEch水素化酵素(MFH1、MFH2、MCH)それぞれは、TON_266−TON_282、TON_1563−TON_1580及びTON_1016−TON_1031ORFs(オープン・リーディング・フレーム)よりなる大きな17−または18−遺伝子クラスター(fdh1−mfh1−mnh1、fdh2−mfh2−mnh2及びcodh−mch−mnh3)の一部であることが判明された(図2のB)。クラスター内のORFは3個のサブクラスターに分けられる。1番目の部分は、ホルム酸塩脱水素化酵素(Fdh1(配列番号9)またはFdh2(配列番号11))または一酸化炭素脱水素化酵素(Codh(配列番号10))などの酸化還元酵素を暗号化している。2番目の部分は、5個から7個のサブユニットを有する多重膜−結合水素化酵素(MFH1、MFH2またはMCH)を暗号化する。最後の部分は、Na+/H+アンチポーターなどの陽イオン/水素イオンアンチポーターを暗号化する。このような3モジュール遺伝子クラスターは未だ報告されていない。
(1)分析方法
水素ガスはHP−PLOT Molesieve column (Agilent)及びTCD検出器を備えたgas chromatograph HP 5890 series II (Hewlett Packard)を用いて測定した。アルゴンをガス運搬体として用いた。水素ガスを定量化するために窒素にそれぞれの成分(CO、CO2、H2、CH4及びO2)1%(w/w)が含まれているGas calibration standard (Supleco)を使用した。
反復された多数の水素化酵素が様々な環境下においてT. onnurineus NA1に水素を効率的に産生せしめるかどうかを調べるために、様々なエネルギー源を用いて水素生成率を分析した(表2)。その結果、NA1菌株は硫黄無し条件下でも澱粉、CO、及びホルム酸塩を用いて水素を生成することができた。特に、CO及びホルム酸塩は水素を効率的に産生する上で極めて優れたエネルギー源であった。
(1)CODH遺伝子クラスター及び一酸化炭素栄養成長
上述したように、T. onnurineus NA1は特異的な遺伝子クラスターを有していることを見出し(CODH−MCH−MNH3)、この遺伝子クラスターは水素化酵素(mch、TON_1021−1024、配列番号5)と一緒に暫定的な転写調節因子(TON_1016)、CODH付属タンパク質(CooC、TON_1019)、CODH触媒サブユニット(CooS、TON_1018)、及び電子伝達タンパク質(CooF、TON_1017)を暗号化する塩基配列から構成されている(図2のB)。微生物の一酸化炭素(CO)代謝の中心酵素であるCooS(TON_1018)は、Methanosarcina acetivorans C2AのCODH(AAM06652)(60%)及びMethanosarcina mazei Go1のCODH(AAM29817)(59%)などのCO−酸化メタン生成古細菌のCODHとかなり高い類似度を示している(図3及び図4)。これは、両機能を有するCODH/ACS酵素のアセチル−CoA合成/切断活性がない単一機能のCODH(Bonam, D., L. Lehman, G. P. Roberts, and P. W. Ludden. 1989. Regulation of carbon monoxide dehydrogenase and hydrogenase in Rhodospirillum rubrum: effects of CO and oxygen on synthesis and activity. J. Bacteriol. 171:3102-3107.およびWu, M. Q. Ren, A. S. Durkin, S. C. Daugherty, L. M Brinkac, R. J. Dodson, R. Madupu, S. A. Sullivan, J. F. Kolonay, W. C. Nelson, L. J. Tallon, K. M. Jones, L. E. Ulrich, J. M. Gonzalez, I. B. Zhulin, F. T. Robb, and J. A. Eisen. 2005. Life in hot carbon monoxide: the complete genome sequence of Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2901. PLoS Genet. 1:e65.)であると認められる。Fox et al. (Fox, J. D., R. L. Kerby, G. P. Roberts, and P. W. Ludden. 1996. Characterization of the CO-induced, CO-tolerant hydrogenase from Rhodospirillum rubrum and the gene encoding the large subunit of the enzyme. J. Bacteriol. 178:1515-1524.)によれば、Rhodospirillum rubrumの単一機能CODH/水素化酵素複合体は、細胞膜を横切って発生する水素イオン濃度勾配にてエネルギーが保存されるCO−誘発陽性子呼吸に関与する。この観点から、CODHクラスターがCOを酸化させることによりエネルギー保存に類似する役割を果たすことができるという点を説明するために、本発明者らは、T. onnurineus NA1がCOを利用することができるかどうかを試験した。その結果、前記菌株は、実際に、YPS培地よりはやや成長率が落ちるとしても(図6a)、基本培地よりも培地1において硫黄があるかないCO気体環境において一層上手く成長するということを見出した(図6a、b)。CO気体環境における成長はCooS遺伝子の転写と関連されており、その遺伝子はCOの存在により誘導可能である(図6c)。硫黄の添加はCooS遺伝子の転写を減少させるという点に注目する必要がある。これらの結果は、T. onnurineus NA1がCOからエネルギーを発生するという仮説を裏付ける。以下、前記仮説を検証するための具体的な実験方法及び結果をさらに述べる。
1)培養条件
YPS(yeast extract-peptone-sulfur)培地において80℃の嫌気性条件下でT. onnurineus NA1を培養した。突然変異菌株の生長特性を調べるために、基本培地として30.0g/LのNaClを添加した変形培地1を使用した(Uffen, R. L. 1976. Anaerobic growth of a Rhodopseudomonas species in the dark with carbon monoxide as sole carbon and energy substrate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:3298-3302)。前記培地を加圧滅菌した後、嫌気性チャンバーにおいて1.0ml/Lのビタミン溶液(Balch, W. E., G. E. Fox, L. J. Magrum, C. R. Woese, and R. S. Wolfe. 1979. Methanogens: reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43:260-296)及び0.5g/Lの酵母抽出物を変形培地1に添加した。前記基本培地に1N NaOHを添加してpHを8.0に調整した。準備された培地30mlを150ml培養瓶に分配し、ガス層(120ml)は100%CO(105Pa)に交換した。生理学的実験のためのすべての培養は80℃の嫌気性条件下で24時間行われ、前記実験は重複して行った。
培養物を4℃において3,500×gにて10分間遠心分離し、生産者のプロトコール(Invitrogen, Carlsbad, California)に従ってTRIZOL試薬により総RNAを抽出した。総RNA試料はNanoDrop分光器(ND−1000, Thermo Scientific)及び電気泳動により定量及び定性分析した。この実験に供されたマイクロアレイは、Roche NimbleGenマイクロアレイであった。簡略に、総31,994個の独立した60merオリゴヌクレオチドを設計し、光脱分解を用いて、インサイチュにて合成した。それぞれの独立したオリゴヌクレオチドはアレイ上において2回反復された(総〜72,000features)。
マイクロアレイ実験は生産者のプロトコールに従って実施した。それぞれの総RNA試料(5μg)は逆転写酵素、SuperScrip II (Invitrogen, Carlsbad, California)を用いた逆転写反応によりシアニン(Cy5)結合dCTP(Amersharm, Piscataway, NJ)にて標識された。その後、前記標識されたcDNA混合物をエタノール沈殿法を用いて濃縮させた。濃縮されたCy5標識cDNAsを30μlの混成化溶液(GenoCheck, Korea)に懸濁させた。標識されたcDNAをマイクロアレイに位置させた後、MAUI Mixer X4 hybridization chamber mixers (BioMicro systems, Salt Lake City, UT)により覆った。前記スライドをMAUI 12−bay systems (BioMicro systems, Salt Lake City, UT)により42℃において12時間混成化させた。前記混成化されたスライドを室温において2XSSC、0.1%SDSにおいて2分、1XSSCにおいて3分、その後、0.2XSSCにおいて2分間洗浄した。前記スライドを乾燥するために、1, 000xgにて20秒間遠心分離した。
アレイはGenePix 4000B scanner (Molecular Devices Corporation, Union City, CA)を用いてスキャンし、データはNimbleScan 2.4ソフトウェアを用いて抽出した。アレイ標準化はメディアンポリッシュ及びクォンタイル標準化方法を用いて行った(Amaratunga, D., and J. Cabrera. 2001. Statistical analysis of viral microchip data. J. Am. Stat. Assoc. 96:1161-1170)。個別的なプローブに対する標準化された発現値は、Irizarry et al. (Karl, D. M. 1995. The microbiology of deep-sea hydrothermal vents. CRC Press, Boca Raton, FL)に記述されたRMA(robust multi-array average)方法を用いて、与えられたORFに対する発現値を得るのに用いられた。最後に、試料から特定の遺伝子のために得たRMA処理された発現値(RMA calls)を用いてn倍変化率(R)を計算した。データ分析は、GeneSpring GX 7.3.1 (Agilent technologies, CA)を用いて行った。フォールド変化フィルターは上向き調節される遺伝子に対しては少なくとも対照区の200%、下向き調節される遺伝子に対しては対照区の50%以下で現れるべきであるという条件を含めた。データは、GeneSpring GX 7.3.1 (Agilent technologies, CA)を用いた実験において類似に行動する遺伝子グループ内にクラスターさせた。類似するパターンの遺伝子を分離するためにユークリッド距離及び平均結合法に基づくアルゴリズムを用いた。
T. onnurineus NA1(Genbank accession number,CP000855)の遺伝体配列から遺伝子特異的プライマーを設計した。プライマー配列は、下記表3に記載されている。
T. onnurineus NA1の生体内における水素化酵素の機能を分析するために、高好熱性古細菌であるT. kodakaraensis KOD1に用いられた遺伝子除去システムを用いて(Sapra, R., K. Bagramyan, and M. W. W. Adams. 2003. A simple energy-conserving system: Proton reduction coupled to proton translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7545-7550)、mchまたはmfh2水素化酵素の大きなサブユニットの挿入不活性突然変異を製作した。具体的に、mch及びmfh2水素化酵素それぞれの大きなサブユニット(TON_023及びTON_1569)の隣接地域を含むDNA断片をFlk−mchまたはFlk−mfh2に対するプライマー組(表3)を用いてT. onnurineus NA1のゲノムDNAから増幅させた。それぞれの増幅された断片はHincIIで切断されたpUC118に接合させた。その後、鋳型(Flk−mch_pUC118またはFlk−mfh2_pUC118組換えプラスミド)からプライマー組(Ivs−mchまたはIvs−mfh2)(表3)を用いて逆PCRを行い、次いで、Pgdh−hmgPfuカセットに接合させた(Sapra, R., K. Bagramyan, and M. W. W. Adams. 2003. A simple energy-conserving system: Proton reduction coupled to proton translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7545-7550)。その後、前記接合された結果物をEscherichia coli DH5a細胞に形質転換させた。組換えプラスミド(mch::Pgdh−hmgPfu及びmfh2::Pgdh−hmgPfu)はプラスミドミニキット(Qiagen, Hilden, Germany)により準備した。最後に、前記プラスミドをSato et al.(Sato, T., T. Fukui, H. Atomi, and T. Imanaka. 2003. Targeted gene disruption by homologous recombination in the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis KOD1. J. Bacteriol. 185:210-220., Sato, T., T. Fukui, H. Atomi, and T. Imanaka. 2005. Improved and versatile transformation system allowing multiple genetic manipulations of the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis. Appl. Environ. Microbiol. 71:3889-3899)の僅かな変形された方法によりT. onnurineus NA1に形質転換させた。形質転換体は10μMシンバスタチンの存在下でASW−YT−S培地によりスクリーニングされ(Matsumi, R., K. Manabe, T. Fukui, H. Atomi, T. Imanaka. 2007. Disruption of a sugar transporter gene cluster in a hyperthermophilic archaeon using a host-marker system based on antibiotic resistance. J. Bacteriol. 189:2683-2691)、標的遺伝子が除去されたと思われる候補群はPCR増幅を通じて標的地域内Pgdh−hmgPfuカセットの存在有無により除去有無を確認することができた。
成長は目視確認した。試料を海塩(30.0g/L)、ホルマリン(2.5%)、及び4’−6’−ジアミジノ−2−フェニルインドール(0.01%)を含む滅菌水に希釈させ(Sato, T., T. Fukui, H. Atomi, and T. Imanaka. 2005. Improved and versatile transformation system allowing multiple genetic manipulations of the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis. Appl. Environ. Microbiol. 71:3889-3899)、ブラックポリカーボネート膜フィルターによりろ過した後(孔径;0.2μm, Whatman)、位相差顕微鏡(Zeiss Axioplan)により計数した。水素ガスはHP−PLOT Molesieve column (Agilent)及びTCD検出器を備えたガスクロマトグラフHP5890series II(Hewlett Packard)を用いて測定した。アルゴンがガス運搬体として用いられた。オーブンの温度は40℃であった。分析のための10μlのガス試料は培養瓶のブチルゴムを通じてガスタイトシリンジにより取り出した。検出された水素ガスの測定はピーク面積を、窒素に40%水素を含む標準ガスを用いた回帰分析により行われた補正曲線と比較することにより計算された。
1)T. onnurineus NA1水素化酵素のイン・シリコ分析
先のT. onnurineus NA1の遺伝体分析は8反復の水素化酵素遺伝子クラスターの存在を示し(Porter, K. G. and Y. S. Feig. 1980. The use of DAPI for identifying and counting microflora. Limnol. Oceanogr. 25:943-948)、5個の膜結合[NiFe]−水素化酵素(Mbh,TON_1583−1595;Mbx,TON_0486−0498;Mfh1,TON_0273−0278;Mfh2,TON_1566−1573;Mch,TON_1021−1024)、及び3個の細胞質内[NiFe]−水素化酵素(Fru,TON_1559−1562;SulfI,TON_0533−0544;SulfII,TON_0051−0055)を含む。ゲノムシークエンスが完了したThermococcales菌株との水素化酵素遺伝子クラスターの比較分析結果をみるとき、Mfh1、Mfh2、またはMchクラスターに相同性があるクラスターは極めて稀であると考えられ、T. barophilus MP(Mfh1、Mch相同遺伝子)、Thermococcus sp. AM4(Mfh1、Mch相同遺伝子)(Unfinished sequence, GenBank accession number, ABXN00000000)、及びT. gammatolerans(Mfh1及びMfh2相同性)(GenBank accession number、CP001398)のように最近にゲノム配列が決定されたThermococcales菌株から発見される。T. onnurineus NA1のfdh1−mfh1−mnh1(Lee, H. S., S. G. Kang, S. S. Bae, J. K. Lim, Y. Cho, Y. J. Kim, J. H. Jeon, S.-S. Cha, K. K. Kwon, H.-T. Kim, C.-J. Park, H.-W. Lee, S. I. Kim, J. Chun, R. R. Colwell, S.-J. Kim,及びJ.-H. Lee. 2008. The complete genome sequence of Thermococcus onnurineus NA1 reveals a mixed heterotrophic and carboxydotrophic metabolism. J. Bacteriol. 190:7491-7499.の論文においてHyg4−Iと命名される。)、fdh2−mfh2−mnh2(Hyg4−III)、及びcodh−mch−mnh3(Hyg4−II)クラスターの配列分析は前記クラスターがそれぞれホルム酸塩脱水素化酵素(FDH)及びCO脱水素化酵素(Codh)などの酸化還元酵素を含むということを示す。特に、CO条件における成長により現れる一酸化炭素栄養代謝はCOを酸化させることにより水素生成経路においてエネルギーを提供するCodh−Mch−Mnh3の機能的役割を示唆する。
T. onnurineus NA1がCO条件下で成長しながら水素を産生することができるかどうかを調べてみた。図7に示すように、YPS培地においては水素産生を探知することができなかったが、COが添加された培地1においては培養時間が長くなるにつれて総水素ガスと細胞数が増大した。
転写体分析は、codhと近くにクラスターされたmch水素化酵素が(図9A)T. onnurineus NA1において一酸化炭素栄養水素の生成過程に重要な役割を果しうるということを示唆する。しかしながら、fdh2−mfh2−mnh2クラスターの上向き調節及び他の水素化酵素mRNAの多くの反復数はcodh−mch−mnh3が単独にて前記過程に関与するものであるか、それとも、他の水素化酵素が脱水素化酵素と複合体を形成したり脱水素化酵素と連合してFADH2やNADHなどの電子運搬体を再活用することによりmchに対して代替的経路になりうるかに関して疑問を引き起こす。このため、本発明者らは、mchまたはmfh2水素化酵素それぞれの大きなサブユニットの欠損突然変異を製造した(Matsumi, R., K. Manabe, T. Fukui, H. Atomi, T. Imanaka. 2007. Disruption of a sugar transporter gene cluster in a hyperthermophilic archaeon using a host-marker system based on antibiotic resistance. J. Bacteriol. 189:2683-2691)。製作方法は、図9Aに示してある。標的領域における相同組換えによるPgdh−hmgPfuカセットの挿入不活性化及びそれによるhmg−CoA遺伝子の過発現によりMchまたはMfh2水素化酵素遺伝子クラスターそれぞれの大きなサブユニットが破壊される。標的遺伝子破壊は、10μMシンバスタチンが添加されたYPS培地における生存により候補群を選別した後、PCR増幅を通じてのPgdh−hmgPfuカセットの存在により確認された(図9B)。破壊候補群(△mchTNA1及び△mfh2TNA1)においてPgdh−hmgPfuが増幅可能であるのに対し、mchまたはmfh2の大きなサブユニットの増幅には失敗した。これらの結果は、T. kodakaraensis KOD1(Sapra, R., K. Bagramyan, and M. W. W. Adams. 2003. A simple energy-conserving system: Proton reduction coupled to proton translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:7545-7550)に報告された遺伝子破壊システムがT. onnurinues NA1にも適用可能であることを示す。
[配列表]
Claims (20)
- 配列番号1乃至配列番号8よりなる群から選ばれたいずれか一種以上のアミノ酸配列からなる水素化酵素。
- 請求項1に記載の水素化酵素を暗号化する遺伝子。
- 前記遺伝子は、配列番号12乃至配列番号19よりなる群から選ばれたいずれか一種以上の塩基配列を含むことを特徴とする請求項2に記載の水素化酵素を暗号化する遺伝子。
- 培養容器に培地を生成するステップと、Thermococcus spp.を前記培養容器において培養するステップと、前記培養容器から水素を抽出するステップと、を含むことを特徴とするThermococcus spp.から水素を産生する方法。
- 前記Thermococcus spp.は、Thermococcus onnurineus NA1(寄託番号:KCTC 10859BP)であることを特徴とする請求項4に記載の水素を産生する方法。
- 前記培地は、一酸化炭素、ホルム酸塩及び澱粉よりなる群から選ばれるいずれか一種以上の物質が添加された培地であることを特徴とする請求項4または請求項5に記載の方法。
- 前記培養は80℃の高温において行われることを特徴とする請求項4から請求項6のいずれかに記載の方法。
- 前記培養は嫌気的条件下で行われることを特徴とする請求項4から請求項6のいずれかに記載の方法。
- 配列番号9乃至配列番号11よりなる群から選ばれたいずれか一種以上のアミノ酸配列からなる脱水素化酵素。
- 請求項9に記載の脱水素化酵素を暗号化する遺伝子。
- 前記遺伝子は、配列番号20乃至配列番号22よりなる群から選ばれたいずれか一種以上の塩基配列を含むことを特徴とする請求項10に記載の水素化酵素を暗号化する遺伝子。
- 配列番号21及び配列番号16(CODH−MCH−MNH3クラスターを構成する遺伝子)の遺伝子が作動可能に連結された組換えベクター。
- 請求項12に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
- 請求項13に記載の形質転換体を用いて水素を産生する方法において、
培養容器に培地を生成するステップと、前記培養容器のガス層に一酸化炭素を供給するステップと、前記形質転換体を前記培養容器において培養するステップと、前記培養容器から水素を抽出するステップと、を含むことを特徴とする方法。 - 配列番号22及び配列番号18(FDH2−MFH2−MNH2クラスターを構成する遺伝子)の遺伝子が作動可能に連結された組換えベクター。
- 請求項15に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
- 請求項16に記載の形質転換体を用いて水素を産生する方法において、
培養容器にホルム酸塩を含む培地を生成するステップと、
前記形質転換体を前記培養容器において培養するステップと、
前記培養容器から水素を抽出するステップと、
を含むことを特徴とする方法。 - 配列番号20及び配列番号13(FDH1−MFH1−MNH1クラスターを構成する遺伝子)の遺伝子が作動可能に連結された組換えベクター。
- 請求項18に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
- 請求項19に記載の形質転換体を用いて水素を産生する方法において、
培養容器に澱粉を含む培地を生成するステップと、
前記形質転換体を前記培養容器において培養するステップと、
前記培養容器から水素を抽出するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020080087806A KR20090060124A (ko) | 2007-12-08 | 2008-09-05 | Thermococcus spp.로부터 분리된 신규한 수소화효소, 이를 암호화하는 유전자 및 그 유전자를 갖는 미생물을 이용하여 수소를 생산하는 방법 |
KR20080087794 | 2008-09-05 | ||
KR10-2008-0087806 | 2008-09-05 | ||
KR10-2008-0087794 | 2008-09-05 | ||
PCT/KR2009/005060 WO2010027233A2 (ko) | 2008-09-05 | 2009-09-07 | Thermococcus supp.로부터 분리된 신규한 수소화효소, 이를 암호화하는 유전자 및 그 유전자를 갖는 미생물을 이용하여 수소를 생산하는 방법 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014184415A Division JP2015015959A (ja) | 2008-09-05 | 2014-09-10 | Thermococcus属から分離された新規な水素化酵素、これを暗号化する遺伝子及びその遺伝子を有する微生物を用いて水素を産生する方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2012501645A true JP2012501645A (ja) | 2012-01-26 |
JP5735425B2 JP5735425B2 (ja) | 2015-06-17 |
Family
ID=41797682
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011525990A Active JP5735425B2 (ja) | 2008-09-05 | 2009-09-07 | Thermococcus属から分離された新規な水素化酵素、これを暗号化する遺伝子及びその遺伝子を有する微生物を用いて水素を産生する方法 |
JP2014184415A Pending JP2015015959A (ja) | 2008-09-05 | 2014-09-10 | Thermococcus属から分離された新規な水素化酵素、これを暗号化する遺伝子及びその遺伝子を有する微生物を用いて水素を産生する方法 |
JP2018115354A Pending JP2018138060A (ja) | 2008-09-05 | 2018-06-18 | Thermococcus属から分離された新規な水素化酵素、これを暗号化する遺伝子及びその遺伝子を有する微生物を用いて水素を産生する方法 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014184415A Pending JP2015015959A (ja) | 2008-09-05 | 2014-09-10 | Thermococcus属から分離された新規な水素化酵素、これを暗号化する遺伝子及びその遺伝子を有する微生物を用いて水素を産生する方法 |
JP2018115354A Pending JP2018138060A (ja) | 2008-09-05 | 2018-06-18 | Thermococcus属から分離された新規な水素化酵素、これを暗号化する遺伝子及びその遺伝子を有する微生物を用いて水素を産生する方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US8597926B2 (ja) |
EP (1) | EP2333054A4 (ja) |
JP (3) | JP5735425B2 (ja) |
KR (9) | KR101833975B1 (ja) |
RU (2) | RU2499831C2 (ja) |
WO (1) | WO2010027233A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20190021455A (ko) * | 2016-07-08 | 2019-03-05 | 한국해양과학기술원 | 고농도의 써모코커스 온누리누스 480t 균주 및 이를 이용한 수소생산방법 |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101833975B1 (ko) * | 2008-09-05 | 2018-03-06 | 한국해양과학기술원 | Thermoccus spp.을 이용하여 수소를 생산하는 방법 |
KR20120103238A (ko) * | 2011-03-10 | 2012-09-19 | 한국해양연구원 | 써모코쿠스 속 균주를 이용한 수소 가스 생산 방법 |
KR101401603B1 (ko) * | 2012-06-19 | 2014-06-27 | 한국해양과학기술원 | 수소생산능이 증가된 써모코코스 온누리우스 엔에이원 돌연변이 균주 및 이를 이용한 수소생산방법 |
KR101736485B1 (ko) | 2013-03-28 | 2017-05-16 | 한국해양과학기술원 | 포름산염으로부터 수소생산능이 증가된 써모코코스 돌연변이체 및 이를 이용한 수소생산방법 |
KR101580488B1 (ko) | 2013-11-13 | 2015-12-28 | 한국해양과학기술원 | 써모코커스 온누리누스 mc02 및 이를 이용한 수소생산방법 |
KR101534483B1 (ko) * | 2013-11-13 | 2015-07-07 | 한국해양과학기술원 | 써모코커스 온누리누스 wtc155t 균주 및 이를 이용한 수소생산방법 |
KR101732881B1 (ko) | 2014-07-18 | 2017-05-08 | 한국과학기술연구원 | 개미산으로부터의 수소 발생 방법 및 장치 |
JP6181678B2 (ja) | 2015-01-29 | 2017-08-16 | トヨタ自動車株式会社 | 車両制動制御装置 |
WO2018105790A1 (en) * | 2016-12-09 | 2018-06-14 | Korea Institute Of Ocean Science & Technology | Thermococcus onnurineus wtf-156t having mutation in formate transporter and methods of hydrogen production using thereof |
KR102192800B1 (ko) * | 2018-11-12 | 2020-12-21 | 한국해양과학기술원 | 전자전달 체인으로 작동하는 Fe-S 융합단백질 및 이의 용도 |
KR102050061B1 (ko) | 2019-05-28 | 2019-11-28 | (주)경동엔지니어링 | 미생물을 이용한 수소 가스 연속 생산 플랜트의 모니터링과 운전 안내 장치 및 방법 |
US11794893B2 (en) | 2020-09-08 | 2023-10-24 | Frederick William MacDougall | Transportation system for transporting organic payloads |
US11414962B2 (en) | 2020-09-08 | 2022-08-16 | Frederick William MacDougall | Coalification and carbon sequestration using deep ocean hydrothermal borehole vents |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000069971A (ja) * | 1998-08-28 | 2000-03-07 | Tadayuki Imanaka | 新規な耐熱性蟻酸脱水素酵素 |
KR100315662B1 (ko) | 1999-07-27 | 2001-11-30 | 박성훈 | 로도슈도모나스 팔루스트리스 p4 및 이에 의한 수소 생산 |
KR100315663B1 (ko) | 1999-07-27 | 2001-11-30 | 박성훈 | 사이트로박터속 균주 y19 및 이에 의한 수소 생산 |
US7432091B2 (en) | 2003-02-24 | 2008-10-07 | Research Institute Of Innovative Technology For The Earth | Highly efficient hydrogen production method using microorganism |
JP2006055127A (ja) * | 2004-08-23 | 2006-03-02 | Research Institute Of Innovative Technology For The Earth | 微生物の培養方法ならびに培養装置、生物的水素製造方法および燃料電池システム |
WO2006062130A1 (ja) | 2004-12-08 | 2006-06-15 | Research Institute Of Innovative Technology For The Earth | 水素生産能力に関する遺伝子を改良された微生物、及びその微生物を用いた水素の製造方法 |
KR100680624B1 (ko) | 2005-04-19 | 2007-02-08 | 한국에너지기술연구원 | 높은 염분농도에서 수소생성능이 우수한 광합성 세균 로도박터 스페로이데스 균주를 이용한 수소생산방법 |
JP4652124B2 (ja) * | 2005-05-18 | 2011-03-16 | 財団法人地球環境産業技術研究機構 | 水素生産能を有する微生物の培養方法および水素生産方法 |
JP4827547B2 (ja) * | 2006-02-10 | 2011-11-30 | 財団法人地球環境産業技術研究機構 | 水素生成能力に関する遺伝子が改良された微生物、その微生物の培養法及び水素生成方法 |
KR101833975B1 (ko) * | 2008-09-05 | 2018-03-06 | 한국해양과학기술원 | Thermoccus spp.을 이용하여 수소를 생산하는 방법 |
-
2009
- 2009-09-07 KR KR1020107013071A patent/KR101833975B1/ko active IP Right Grant
- 2009-09-07 RU RU2012103674/10A patent/RU2499831C2/ru active
- 2009-09-07 JP JP2011525990A patent/JP5735425B2/ja active Active
- 2009-09-07 KR KR1020137034429A patent/KR20140022081A/ko not_active Application Discontinuation
- 2009-09-07 WO PCT/KR2009/005060 patent/WO2010027233A2/ko active Application Filing
- 2009-09-07 KR KR1020137034431A patent/KR101736484B1/ko active IP Right Grant
- 2009-09-07 KR KR1020167020699A patent/KR20160108384A/ko not_active Application Discontinuation
- 2009-09-07 KR KR1020167023473A patent/KR20160114654A/ko not_active Application Discontinuation
- 2009-09-07 KR KR1020117014743A patent/KR20110093913A/ko not_active Application Discontinuation
- 2009-09-07 US US12/746,090 patent/US8597926B2/en active Active
- 2009-09-07 KR KR1020117014737A patent/KR20110094092A/ko not_active Application Discontinuation
- 2009-09-07 KR KR1020117014736A patent/KR20110093912A/ko not_active Application Discontinuation
- 2009-09-07 RU RU2010119233/10A patent/RU2460789C2/ru active
- 2009-09-07 KR KR1020137034430A patent/KR101736482B1/ko active IP Right Grant
- 2009-09-07 EP EP09811732A patent/EP2333054A4/en not_active Withdrawn
-
2013
- 2013-11-29 US US14/093,150 patent/US9976124B2/en active Active
- 2013-11-29 US US14/093,152 patent/US9267115B2/en active Active
-
2014
- 2014-09-10 JP JP2014184415A patent/JP2015015959A/ja active Pending
-
2018
- 2018-06-18 JP JP2018115354A patent/JP2018138060A/ja active Pending
Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
JPN6014009607; J. Bacteriol., 2000, Vol. 182, No. 7, pp. 1864-1871 * |
JPN6014009609; J. Bacteriol., 2003, Vol. 185, No. 5, pp. 1705-1711 * |
JPN6014009610; J. Microbiol. Biotechnol., 2006, Vol. 16, No. 11, pp. 1826-1831 * |
JPN6014009612; J. Biotechnol., 2005, Vol. 116, No. 3, pp. 271-282 * |
JPN6014009614; Extremophiles, 2004, Vol. 8, No. 4, pp. 317-323 * |
JPN6014009615; BMC Microbiol., 2008.06.03, Vol. 8:88, doi: 10.1186/1471-2180-8-88 * |
JPN6014009617; J. Bacteriol., 2008.09.12, Vol. 190, No. 22, pp. 7491-7499 * |
JPN6014009618; Biotechnol. Lett., 2012, Vol. 34, No. 1, pp. 75-79 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20190021455A (ko) * | 2016-07-08 | 2019-03-05 | 한국해양과학기술원 | 고농도의 써모코커스 온누리누스 480t 균주 및 이를 이용한 수소생산방법 |
KR102284768B1 (ko) | 2016-07-08 | 2021-07-30 | 한국해양과학기술원 | 고농도의 써모코커스 온누리누스 480t 균주 및 이를 이용한 수소생산방법 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2460789C2 (ru) | 2012-09-10 |
KR20110093912A (ko) | 2011-08-18 |
KR20110093913A (ko) | 2011-08-18 |
RU2012103674A (ru) | 2013-08-10 |
WO2010027233A3 (ko) | 2010-08-19 |
KR20160108384A (ko) | 2016-09-19 |
US20140178960A1 (en) | 2014-06-26 |
KR20140022081A (ko) | 2014-02-21 |
EP2333054A4 (en) | 2012-09-12 |
KR101833975B1 (ko) | 2018-03-06 |
JP2015015959A (ja) | 2015-01-29 |
KR20160114654A (ko) | 2016-10-05 |
WO2010027233A2 (ko) | 2010-03-11 |
KR20110069744A (ko) | 2011-06-23 |
RU2010119233A (ru) | 2011-12-10 |
KR101736484B1 (ko) | 2017-05-30 |
US9976124B2 (en) | 2018-05-22 |
KR20110094092A (ko) | 2011-08-19 |
US20140248683A1 (en) | 2014-09-04 |
KR20140022082A (ko) | 2014-02-21 |
EP2333054A2 (en) | 2011-06-15 |
KR20140022083A (ko) | 2014-02-21 |
KR101736482B1 (ko) | 2017-05-30 |
JP2018138060A (ja) | 2018-09-06 |
JP5735425B2 (ja) | 2015-06-17 |
RU2499831C2 (ru) | 2013-11-27 |
US9267115B2 (en) | 2016-02-23 |
US8597926B2 (en) | 2013-12-03 |
US20100311142A1 (en) | 2010-12-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5735425B2 (ja) | Thermococcus属から分離された新規な水素化酵素、これを暗号化する遺伝子及びその遺伝子を有する微生物を用いて水素を産生する方法 | |
Yu et al. | Evidence for complete nitrification in enrichment culture of tidal sediments and diversity analysis of clade a comammox Nitrospira in natural environments | |
CN102770536A (zh) | 突变酶及其用途 | |
CN104093836B (zh) | 烃合成酶基因及其利用 | |
Lovell et al. | Community‐level analysis: key genes of CO2‐reductive acetogenesis | |
Yakimov et al. | Heterotrophic bicarbonate assimilation is the main process of de novo organic carbon synthesis in hadal zone of the H ellenic T rench, the deepest part of M editerranean S ea | |
Davidova et al. | Dethiosulfatarculus sandiegensis gen. nov., sp. nov., isolated from a methanogenic paraffin-degrading enrichment culture and emended description of the family Desulfarculaceae | |
Rodriguez-Castrejón et al. | Isolation and molecular identification of native As-resistant bacteria: As (III) and As (V) removal capacity and possible mechanism of detoxification | |
US10036072B2 (en) | Mercury methylation genes in bacteria and archaea | |
Matsumura et al. | Identification of a gene cluster responsible for hydrogen evolution in Vibrio tritonius strain AM2 with transcriptional analyses | |
CN113215122B (zh) | 一种羰基还原酶突变体及其编码基因和应用 | |
Cabrera Ospino | Phylogeny and diversity of genes for poorly characterized type of arsenite oxidase involved in anaerobic arsenic oxidation | |
Kanao et al. | Identification of a gene encoding a novel thiosulfate: quinone oxidoreductase in marine Acidithiobacillus sp. strain SH | |
KR20090060124A (ko) | Thermococcus spp.로부터 분리된 신규한 수소화효소, 이를 암호화하는 유전자 및 그 유전자를 갖는 미생물을 이용하여 수소를 생산하는 방법 | |
Ordóñez et al. | Transcription of the Hydrogenase Gene during H2 Production in Scenedesmus Obliquus and Chlorella Vulgaris | |
Jeong et al. | Muricauda lutisoli sp. nov., isolated from mudflat | |
CN117165564A (zh) | 一种ii型l-天冬酰胺酶及其应用 | |
JP2008306963A (ja) | 高速反応性カタラーゼの製造方法 | |
CN117946989A (zh) | 亚硝酸盐还原酶突变体及其应用 | |
Voordeckers | Physiology and molecular ecology of chemolithoautotrophic nitrate reducing bacteria at deep sea hydrothermal vents | |
Matson et al. | Selenium controls transcription of paralogous formate dehydrogenase genes in the termite gut acetogen, Treponema primitiaemi_2188 | |
Santana et al. | Desulfovibrio vulgaris Hildenborough transcriptomic analysis by Restriction fragment functional display (RFFD) | |
Arcadi et al. | Heterotrophic bicarbonate assimilation is the main process of de novo organic carbon synthesis in hadal zone of the Hellenic Trench, the deepest part of Mediterranean Sea. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120718 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140310 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20140610 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20140617 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20140710 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20140717 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20140811 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20140818 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140910 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150330 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150416 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5735425 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |