KR100315662B1

KR100315662B1 - 로도슈도모나스 팔루스트리스 ｐ４ 및 이에 의한 수소 생산

Info

Publication number: KR100315662B1
Application number: KR1019990030641A
Authority: KR
Inventors: 박성훈; 정규열; 김중래; 정현옥
Original assignee: 박성훈
Priority date: 1999-07-27
Filing date: 1999-07-27
Publication date: 2001-11-30
Also published as: KR20010011333A

Abstract

본 발명은 높은 성장속도와 높은 수소전환속도를 갖는 신규한 미생물, 즉 로도슈도모나스 팔루스트리스 P4 (기탁번호 제 KFCC-11086 호) 및 이에 의한 수소생산방법을 제공하여, 기존의 수소 생산 광합성 미생물들이 성장과 수소생산에 모두 빛이 필요한 것과 비교하여, 성장단계와 전환단계가 분리되어 빛을 이용하여 높은 속도로 성장하고, 빛이 없는 조건에서 높은 속도로 수소를 생산하며 높은 일산화탄소 분압에서도 기질 저해가 없으므로 산업적 응용 가능성이 매우 높은 균주 및 수소 생산 방법이다. 현재 버려지고 있는 일산화탄소를 유용한 수소로 전환함으로써 폐기물의 재활용으로 경제적 이익이 증대되고 환경오염을 방지할 수 있으며, 생성된 수소를 청정에너지원으로 직접 사용할 수 있을 뿐만 아니라 연료전지, 화학공업의 원료, 환원제로 사용될 수 있어서 그 이용범위가 넓다.

Description

로도슈도모나스 팔루스트리스 Ｐ４ 및 이에 의한 수소 생산{RHODOPSEUDOMONAS PALUSTRIS P4 AND PREPARATION FOR HYDROGEN BY USING THE SAME }

본 발명은 일산화탄소를 이용하여 유용한 물질인 수소를 다량으로 생산하는매우 유용한 신규 미생물, 이의 분리, 배양 및 이를 이용한 수소 생산 방법에 관한 것이다.

산업공정에서 발생하는 폐가스는 매우 많은 양의 일산화탄소, 이산화탄소, 수소, 황, 질소 산화물들을 포함하고 있다. 이들 중 일산화탄소등은 유용한 에너지원임에도 그냥 버려지고 있어 경제적인 손실 뿐만 아니라 대기환경에도 악영향을 미치고 있다. 특히 제철소에서 발생하는 COG(코오크스로 가스), BFG(고로가스), LDG(전로가스), 카본블랙 제조시 발생하는 폐가스 등은 일산화탄소와 이산화탄소를 다량 함유하는 데 이렇게 발생하는 폐가스의 양은 광양, 포항제철소에서만 연간 3 X 10¹⁰m³에 이르며, 이들의 일산화탄소 비율은 최고 70 % 에 이른다. 국가 기간산업인 제철소의 부생가스의 경우 재활용 실적이 부진하여 극히 일부만 회수되고 나머지는 모두 폐기되고 있는 실정이다. 특히 수소는 에너지원으로 활용될 수 있을 뿐만 아니라 연료전지, 화학공업의 원료, 환원제로 사용될 수 있어서 그 이용범위가 매우 넓다. 따라서, 부존자원이 부족한 우리 나라의 경우 자원의 효율적인 활용이라는 측면에서 본 기술의 개발이 시급하며 또한 매우 유용할 것이다.

일산화탄소와 물로부터 수소를 생산하는 공정은 크게 화학적 공정과 생물학적 공정으로 나눌 수 있다. 화학적 공정의 경우, 높은 압력과 온도가 필요하며, 수율이 낮고, 부반응이 쉽게 일어난다는 단점이 있다. 반면에 생물학적 공정은 일산화탄소를 수소로 전환하는 미생물을 이용하는 것으로 여타의 생물학적 공정과 마찬가지로 상온, 상압의 온화한 조건에서 높은 전환속도를 얻을 수 있다는 장점이 있다.

지금까지 알려져 있는 일산화탄소 전환 균주는 광합성 세균, 혐기성 세균 등으로 나눌 수 있는데 이에 포함되는 것들로는 로도슈도모나스 젤라티노사 (Rhodopseudomonas gelatinosa), 로도스피릴룸 루브룸 (Rhodospirillum rubrum) 등의 광합성 세균과, 메타노사르시나 바커리 (Methanosarcina barkeri) (O'Brien, J. N., Wolkin, R. H., Moench, T. T., Morgan, J. B., and Zeikus, J. G. (1984) J. Bacteriol. 158, 373-375) 등의 절대 혐기성 미생물들이 알려져 있다. 이들 중 광합성 세균인 로도스피릴룸 루브룸이 가장 높은 전환속도를 가지고 있는 미생물로 알려져 있으나 (Klasson, K. T., Lundback, K. M. O., Clausen, E. C., and Gaddy, J. L. (1993) J. Biotechnol., 29, 177-188), 매우 낮은 성장속도와 낮은 세포 농도로 인해 그 상업적 적용에 한계를 가지고 있다 (Cowger, J. P., Klasson, K. T., Ackerson, M. D., Clausen, E. E., and Gaddy, J. L. (1992) Appl. Biochem. Biotechnol., 34/35, 613-624). 따라서, 일산화탄소로부터 수소를 효율적으로 생산하는 생물학적 공정개발에 있어서, 높은 전환속도와 성장속도를 가진 새로운 미생물의 개발은 필수적이다.

이러한 광합성 세균들은 성장속도 및 전환속도가 느리며, 높은 분압의 기질이 있을 경우에 기질 저해가 심하다. 또한 빛이 안정성에 중요한 인자로 작용하여 빛이 존재하는 경우에만 수소 생성능이 오랫동안 지속될 수 있으며, 성장과 전환이 동시에 이루어져 생산성이 감소한다.

상기와 같은 문제점을 해결하고자, 본 발명은 일산화탄소로부터 수소로의 전환속도가 매우 높고, 성장속도가 빠른 신규한 미생물을 제공하고자 한다. 또한 본 발명은 일산화탄소로부터 수소로의 전환속도가 매우 높고 성장속도가 빠른 미생물에 대한 빛 조사하에서 배양하고, 이어서 빛을 차단함으로써 일산화탄소로부터 수소로 전환하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris) P4 의 투과전자현미경 사진 (X 40,000)을 나타낸다.

도 2는 빛이 로도슈도모나스 팔루스트리스 P4의 성장 및 수소 생산에 미치는 영향을 나타내는 것으로서, 다른 조건을 동일하게 하고 빛의 조사시간을 각각 48시간, 24 시간, 0 시간으로 하였으며, 각각은 도 2-1, 2-2 및 2-3 으로 나타냈다.

도 3은 빛의 차단시간이 로도슈도모나스 팔루스트리스 P4에 의한 일산화탄소 소비 및 수소생산에 미치는 영향을 나타내는 것으로서, 차단시간은 각각 48 시간, 300 시간으로서 도 3-1 및 3-2에 나타냈으며, ●표시는 배양액 1리터당 12시간동안 소비된 일산화탄소의 양을 나타내며, ○표시는 배양액 1리터당 12시간동안 생산된 수소의 양을 나타낸다.

본 발명은 일산화탄소로부터 수소를 생산하는 신규한 미생물, 이의 배양 및 수소생산방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는 일산화탄소에서부터 수소로의 높은 전환속도를 갖고 성장속도가 빠른 미생물은 균주인 로도슈도모나스 팔루스트리스 P4 및 이를 이용하여 일산화탄소에서 수소를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 일산화탄소를 탄소원으로 하는 수소전환균주인 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris) 균주에 관한 것이다. 이 균주를 한국종균협회에 기탁하였으며 기탁번호는 제 KFCC-11086 호이다.

상기 균주에 대해, 형태학적 분석 및 16S rDNA를 분석하였다. 형태학적 분석에 의하면, 라멜라 형의 내막구조를 가지며, 짧은 막대 형태이고, 그람 음성 세균이었다. 또한 통성혐기성 세균이었으며, 광합성독립영양균으로, 화학종속영양상태에서도 성장하였다. 그러나, 광합성 독립영양상태 및 혐기성 조건에서만 자주색 색소를 생산하였다. 이러한 특성은 로도슈도모나스 속의 전형적인 특성이다 (Truper H.G. and Imfoff, J. F. (1989) Arch. Mikrobiol., 55: 245-256).

또한, 16S rDNA의 분석을 위하여, Sequence_Match 프로그램을 이용하여 분석한 결과, 로도슈도모나스 팔루스트리스와 많은 유사성을 보였다. BLAST 프로그램에 의한 분석 결과, 본 발명의 균주와 GenBank 의 데이터베이스의 로도슈도모나스 팔루스트리스와 높은 유사성을 나타내었다. 이 미생물에 대한 전자현미경 사진을 도 1에 나타내었다.

상기 미생물의 성장 및 수소생성 배지조성은 다음과 같다.

배지성분

배지성분	함유량
박토이스트 추출물	1 g/l
소량광물	50 ml/l
미량금속	1 ml/l
복합비타민	5 ml/l

여기서 소량광물은 KH₂PO₄, MgCl₂, NH₄Cl, CaCl₂·2H₂O 이고, 미량금속은 ZnSO₄·7H₂O, MnCl₂·4H₂O, H₃BO₃, CoCl₂·6H₂O, CuSO₄·5H₂O, Na₂MO₂·2H₂O, NiCl₂·6H₂O, FeSO₄·7H₂O 이며, 복합비타민으로는 바이오틴, 엽산, 피리독살염산, 리포산, 리보플라빈, 티아민염산, D-판토텐산 칼슘, 시아노코발아민, p-아미노벤조산, 니코틴산으로 이루어진다.

본 발명은 또한 빛조사 하에서 일산화탄소를 유일탄소원으로 하여 로도슈도모나스 팔루스트리스 P4의 미생물을 배양하고, 이어서 빛을 차단함으로써 일산화탄소를 전환기질로 하여 수소를 생산하는 방법을 따른다. 즉, 빛을 에너지원으로 하여 성장하지만 수소 생산활성을 유지하기 위해서는 빛의 조사가 필요하지 않고, 일산화탄소로부터 수소를 생산할 때 발생하는 에너지만으로도 장시간 수소 생산이 가능하다. 따라서, 미생물 성장기에 빛을 사용하고, 수소 생산기에 빛을 차단하는 이단계 배양법을 사용하였다.

빛이 성장 및 수소 생산에 미치는 영향-빛을 조사한 경우에는 높은 속도로 성장할 수 있으며, 도 2-2에서부터, 대수성장기의 중간인 24시간째에 빛을 차단하면 빛의 차단과 동시에 성장이 중단되며, 도 2-3에서부터, 처음부터 빛을 공급하지 않은 경우에 세포는 성장하지 않는다. 이러한 사실로부터 로도슈도모나스 젤라티노사 (Uffen, R. L. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 3298-3302) 와 달리, 로도슈도모나스 팔루스트리스는 성장에 빛이 필수적임을 나타낸다.

빛이 상기 균주의 성장 및 수소생성에 미치는 영향을 조사하기 위해서, 빛 조사함과 동시에, CO-Ar 혼합기체 (20:80, v/v)를 매 12시간마다 공급하는 조건하에서 로도슈도모나스 팔루스트리스를 배양한 후에, 48시간 (대수성장기 말기)와 300 시간 (정상기) 경과한 후에 빛을 차단하고 100 % 일산화탄소를 매 12시간마다 공급하면서 400 시간동안 수소 생성능을 조사한다. 도 3-1에서와 같이 48시간에 수소생성단계로 전이한 경우에 400 시간까지 높은 수소 생성능을 나타내고 일산화탄소 소비속도는 수소생성속도와 일치함에 반해, 도 3-2에서와 같이 성장을 멈춘 후에 빛을 조사하여 수소생성단계로 전이한 경우에 일산화탄소 소비능은 단지 100 시간까지 지속되고 수소의 축적은 없을 뿐만 아니라, 빛을 차단한 후에는 일산화탄소의 소비 및 수소의 축적이 모두 없다. 이러한 사실은 성장을 멈춘 후에 빛이 일산화탄소 소비를 비가역적으로 억제함을 나타낸다.

다음의 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나, 다음의 실시예로 본원 발명의 보호범위를 한정하고자 하는 의도는 아니다.

실시예

실시예 1: 균주의 분리, 배양

부산시에 소재하는 혐기성 폐수조에서 과립슬러지로부터 얻은 시료를 표 1에 기재된 선택배지 45 ml 에 접종하였다. 그리고 CO-Ar 혼합기체 (20:80, v/v) 하에서 연속적인 혐기성 배양으로 30 ℃에서 집적배양하였다. 혼탁배양한 후에 배양액 5 ml를 상기와 같은 조성의 선택배지 45 ml 에 접종하였다. 이러한 배양을 수회 반복한 후에, 적절한 양의 배양액을 선택배지를 포함하는 한천배지 상에 깔고 빛의 조사 하에 배양하였다. 2-3 일 경과 후에 빠르게 성장하는 콜로니를 분리하였다. 분리된 균주를 로도슈도모나스 팔루스트리스 P4로 명명하고, 1999년 4월 30일 한국종균협회에 기탁하였다 (기탁번호: 제 KFCC-11086 호). 본 발명의 투과전자현미경 사진을 도1에 나타내었다.

실시예 2: 균주의 동정

실시예 1에서 분리된 균주의 동정을 위해 형태학적 분석과 퀴논 분석 및 16S rDNA 부분 염기서열 분석을 행하였다. 상기 실시예 1의 배지성분과 동일한 배지에서 배양하였다.

현미경 관찰법 및 그람 염색법 등을 통하여, 상기 균주는 라멜라 형의 내막구조를 가졌으며, 짧은 막대 형태이고, 그람 음성 세균이었다. 또한, 통성 혐기성 세균이었으며, 광합성 독립영양세균으로, 화학종속영양상태에서도 성장함을 알 수 있었다. 그러나, 광합성 독립영양상태 및 혐기적 조건에서만 자주색 색소를 생산하였다. 이러한 특징은 로도슈도모나스 속의 전형적인 특징이다 (Truper H.G. and Imfoff, J. F. (1989) Arch. Mikrobiol., 55: 245-256). 보다 정확한 동정을 위하여, 상기 로도슈도모나스 속 균주의 16S rDNA를 TaKaRa PCR 증폭 키트 (Takara Shuzo Co., Ltd. Shiga, Japan)로 16S rDNA 유전자를 증폭하였다. 본 발명의 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머는 Lane, D. J. 16S/23S rRNA sequencing, p. 115-147 In Stackebrandt, E. and Goodfellow, M. (ed.) 에 기재된 27f 와 1492r을 사용하여 약 1.5 kb의 16S rDNA를 증폭하였다. 반응조건은 2분간 94℃ (1분), 55℃ (1분) 및 72℃ (3분)으로 30 사이클로 PCR을 수행하였다. 30 사이클이 종료한 후에, 최종 사슬연장을 72℃에서 5분간 행했다. 증폭된 산물의 크기를 아가로스 (1%, w/v)로 확인하였다. pGEM-T Easy vector system II (Promega, Madison, WI, USA)로 PCR 산물을 클로닝하였다. EcoRI (Promega 사 제품)으로 분해한 후에 전기영동으로 클로닝을 확인하였다. 클로닝된 16S rDNA를 DNA 서열 분석기 (Applied Biosystems model 373A, Foster City, CA, USA) 로 부분적으로 시퀀싱하고 분석하였다. Ribosomal Database Project (RDP) 와 GenBank database 에 대해서 Sequence_Match 와 BLAST 프로그램을 사용하여 얻어진 서열을 스크리닝하였다.

Sequence_Match 분석 결과, 로도슈도모나스 팔루스트리스와 많은 유사성을 보였으며, BLAST 프로그램에 의한 분석한 결과 또한 로도슈도모나스 팔루스트리스와 상당히 높은 유사성을 보였다. 따라서, 상기 분리된 미생물은 로도슈도모나스 팔루스트리스로 동정되었다.

실시예 3: 균주 배양과 수소생산으로의 전환

균주의 배양을 위해서는, 백열등 (1,500 럭스) 및 CO-Ar (20:80, v/v) 혼합기체하에서 표 1의 성분으로 이루어진 배양액에 로도슈도모나스 팔루스트리스 P4를 배양하였다. 빛을 차단한 상태에서 다양한 일산화탄소 분압 하에서, 일산화탄소로부터 수소로의 전환반응을 수행하였다. 배양은 150 ml 혈청병에서 50 ml 부피로 배양하였다. 기체의 분석은 열전도도 측정장치와 Molecular Sieve 5A가 충진된 컬럼이 장착된 가스크로마토그래피를 사용하여 분석하였다.

실시예 4: 빛이 세포성장 및 수소생성에 미치는 영향

실시예 3의 배지조성에 따라 로도슈도모나스 팔루스트리스 P4를 배양하였다. 빛을 공급한 경우에는 세포가 최대 비성장속도 0.3 h^-1의 속도로 대수적으로 성장하였다. 최종 세포 농도는 48 시간 후에 약 0.95 g/l 이었다 (도 2-1). 대수성장기의 중간인 24시간째에 빛을 차단한 경우에, 거의 동시에 성장이 중단되었으며 (도 2-2), 처음부터 빛을 차단한 경우에는 성장이 거의 관찰되지 않았다 (도 2-3). 이러한 사실로부터 로도슈도모나스 팔루스트리스 P4는 성장에 빛이 필수적임을 나타낸다.

실시예 5: 빛의 차단시간이 세포성장 및 수소생산에 미치는 영향

실시예 4의 배지조건에서 빛의 조사 하에서 로도슈도모나스 팔루스트리스 P4를 배양하였다. 이 후에 빛의 차단시간이 로도슈도모나스 팔루스트리스 P4의 수소생성능에 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위하여 48시간 (대수기 말기) 와 300 시간 (정상기) 에 빛을 차단하고 400 시간동안 수소 생성능을 조사하였다. 혈청병내의 상부공간에 매 12시간마다 CO-Ar 혼합기체를 재충진하였는데, 빛의 조사하에서 성장기간 동안에는 CO-Ar 혼합기체 (20:80, v/v)를 공급하고, 빛의 차단조건에서 수소생성기에는 20 - 100 % 의 다양한 농도의 일산화탄소를 공급하였다. 48 시간 동안 빛 조사하에서 배양 후, 빛을 차단한 경우, 400 시간까지 높은 수소 생성능을 유지하였으며, 최대 수소비생산속도는 23.2 mmol/g cell·h 에 이르렀다. 소비된 일산화탄소의 양과 생성된 수소의 양이 일치하였다 (도 3-1). 300 시간까지 빛을 조사한 경우, 100 시간 이후에는 일산화탄소 소비 활성과 수소 축적을 나타내지 않았다 (도 3-2). 뿐만 아니라, 300 시간 후, 빛을 차단하였을 경우에도, 일산화탄소의 소비와 수소의 생산이 더 이상 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 성장을 멈춘 후에 빛이 일산화탄소 소비를 비가역적으로 억제함을 나타낸다.

세포성장과 일산화탄소 분압

일산화탄소 분압 (기압)	비성장속도 (h^-1)
0.06	0.02
0.07	0.02
0.10	0.05
0.15	0.1
0.20	0.3
0.32	0.3
0.41	0.26
0.52	0.25
0.59	0.1
0.67	0.07
0.78	0.03
0.89	0.02
0.95	0.01
1.02	0.01

일산화탄소 분압과 수소생산속도

일산화탄소 분압 (기압)	수소 비생산속도 (mmol/g cell·h)
0.06	4.60
0.07	5.24
0.20	8.70
0.22	10.80
0.23	11.31
0.24	11.52
0.25	16.49
0.27	17.80
0.29	16.00
0.32	19.44
0.34	16.23
0.35	21.53
0.37	23.20
0.38	21.09
0.41	22.0
0.45	21.0
0.46	20.18
0.52	19.24
0.53	16.02
0.59	15.87
0.67	14.02
0.78	13.24
0.89	11.02
0.95	11.0
1.0	10.14

본 발명은 높은 성장속도와 높은 수소전환속도를 갖는 신규한 미생물, 로도슈도모나스 팔루스트리스 P4 및 이에 의한 수소생성방법을 제공함으로써, 성장단계와 전환단계가 분리되어 빛을 이용하여 높은 속도로 성장하고 빛이 없는 조건에서 높은 속도로 수소를 생산할 뿐만 아니라, 높은 분압의 일산화탄소 하에서도 기질 저해가 없으므로 산업상 매우 유용하다. 또한 현재 버려지고 있는 일산화탄소를 유용한 수소로 전환함으로써 폐기물의 재활용으로 경제적 이익이 증대되고 환경오염을 방지할 수 있으며, 생산된 수소를 청정에너지원으로 다양한 이용이 가능하다는장점이 있다.

Claims

일산화탄소를 탄소원 및 수소전환기질로 하는 수소전환균주인 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris) P4. (기탁번호 제 KFCC-11086 호)
빛의 조사 하에서 일산화탄소를 유일 탄소원으로하여 제 1 항의 미생물을 배양하고, 이어서 빛을 차단함으로써 일산화탄소를 전환기질로하여 수소를 생산하는, 제 1 항의 미생물을 이용하여 일산화탄소에서 수소를 생산하는 방법.