KR100680624B1

KR100680624B1 - 높은 염분농도에서 수소생성능이 우수한 광합성 세균 로도박터 스페로이데스 균주를 이용한 수소생산방법

Info

Publication number: KR100680624B1
Application number: KR1020050032476A
Authority: KR
Inventors: 김미선; 백진숙; 이정국
Original assignee: 한국에너지기술연구원
Priority date: 2005-04-19
Filing date: 2005-04-19
Publication date: 2007-02-08
Also published as: KR20060110390A

Abstract

본 발명은 광합성에 의해 수소를 생산할 수 있으며, 3％ NaCl의 염분농도에서 광합성이 가능한 로도박터 스페로이데스에 속하는 새로운 균주를 제공한다. 본 발명에 의하면 상기 광합성 세균은 셔틀벡터인 pRK415를 함유할 수 있어 유전자 조작이 가능하며, 수소의 생성능이 종래 알려진 로도박터 스페로이데스 2.4.1 균주에 비하여 4배 이상 높다.

로도박터, 광합성, 수소

Description

높은 염분농도에서 수소생성능이 우수한 광합성 세균 로도박터 스페로이데스 균주를 이용한 수소생산방법{Producing method of hydrogen gas using novel Strain of Rhodobacter sphaeroides Having High productivity of Hydrogen and Capable of Photosynthesis in High Concentration of Salts}

도 1은 본 발명 실시예를 통해 분리된 9종의 신규 광합성 세균에 대한 광합성 기구에 의한 흡수파장의 측정결과 그래프이다.

도 2a는 로도박터 스페로이데스 2.4.1의 염색체 DNA 구조로서 1) hupSL 유전자 부위, 2) phbC 유전자 부위를 나타낸다.

도 2b는 서던분석결과로서 1) 하이드로게나아제(hupSL), 2) PHB(phbC)를 나타낸다.

도 3은 본 발명에 따른 광합성 세균인 로도박터 스페로이데스 KD131과 로도박터 스페로이데스 2.4.1의 염분농도에 따른 성장곡선도이다.

여기서 ◆: 로도박터 스페로이데스 2.4.1를 0.05％ NaCl이 함유된 노말 시스트롬 배지에서 배양했을 경우, ●: 로도박터 스페로이데스 KD131을 0.05％ NaCl이 함유된 노말 시스트롬 배지에서 배양했을 경우, ▲: 로도박터 스페로이데스 KD131을 3％ NaCl이 함유된 노말 시스트롬 배지에서 배양했을 경우, ○: 로도박터 스페로이데스 KD131을 5％ NaCl이 함유된 노말 시스트롬 배지에서 배양했을 경우, ◇: 로도박터 스페로이데스 2.4.1를 3％ NaCl이 함유된 노말 시스트롬 배지에서 배양했을 경우, □: 로도박터 스페로이데스 2.4.1를 5％ NaCl이 함유된 노말 시스트롬 배지에서 배양했을 경우

도 4는 본 발명에 따른 광합성 세균인 로도박터 스페로이데스 KD131과 로도박터 스페로이데스 2.4.1의 광합성 기구의 양 비교 그래프이다.

이중 A)는 B800-850 복합체 양을, B)는 B875 복합체의 양을 각각 나타내며, 여기서, 1. 로도박터 스페로이데스 2.4.1를 0.05％ NaCl이 함유된 노말 시스트롬 배지에서 배양했을 경우, 2. 로도박터 스페로이데스 KD131을 0.05％ NaCl이 함유된 노말 시스트롬 배지에서 배양했을 경우, 3. 로도박터 스페로이데스 KD131을 3％ NaCl이 함유된 노말 시스트롬 배지에서 배양했을 경우, 4. 로도박터 스페로이데스 KD131을 5％ NaCl이 함유된 노말 시스트롬 배지에서 배양했을 경우를 각각 나타낸다.

도 5는 본 발명에 따른 로도박터 스페로이데스 KD131의 균체성장 및 수소생산 정도를 나타내는 그래프이다.

여기서, △: 총 생산 수소, □: 세포농도, ○: 배양액의 pH

도 6은 본 발명에 따른 로도박터 스페로이데스 KD131의 배양 중 광세기 변화에 따른 배양액 색소 변화 그래프이다.

(A) 무광, (B) 3∼3.5 klux/㎡, (C) 7∼8 klux/㎡, (D) 15∼16 klux/㎡,

(E) 30∼32 klux/㎡, (F) 50∼52 klux/㎡, (G) 100∼110 klux/㎡

도 7은 본 발명에 따른 로도박터 스페로이데스 KD131의 D-, L-, D,L-말레이 트의 분해율 비교 그래프

도 8은 본 발명에 사용된 수직평판형 반응기의 아크릴 두께가 수소생산에 미치는 영향을 나타내는 그래프(세포배양에는 탄소원으로 30mM 락테이트가 사용되었고, 질소원으로는 D, L-글루타메이트가 사용되었다.)

본 발명은 신규한 광합성 세균을 이용한 수소의 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 광합성 작용에 의해 수소를 생성하며, 3％ NaCl의 염분농도에서 광합성이 가능한 신규한 로도박터 스페로이데스 종에 속하는 광합성 세균을 이용한 수소의 생산방법에 관한 것이다.

미생물이 수소가스를 발생하거나 흡수하는 성질은 일부 광합성 미생물과 혐기세균들에 의해 관찰되었으며, 이들이 갖는 수소생산 메카니즘은 광원의 유무에 따라 수소생산 발생경로가 다를 뿐만 아니라, 기질의 종류 및 생육 조건 등에 따라서도 영향을 받는다.

수소를 생산하는 미생물은 크게 광합성 세균 (Photosynthetic bacteria), 혐기성 세균(Non-photosynthetic anaerobic bacteria), 조류(algae) 등으로 구분되고, 이들의 수소 생성 기작, 사용가능 기질 및 수소 발생량은 상당한 차이가 있다.

광합성세균은 홍색비유황세균 (purple non-sulfur bacteria), 홍색유황세균 (purple sulfur bacteria), 및 녹색유황세균 (green sulgur bacteria)으로 분리되 고, 이중 홍색비유황세균은 유기물로부터 전자를 얻고, 광합성 반응에 의해서 수소를 생산한다. 일반적으로 유기화합물이 함유되어 있으면서 H₂S가 존재하지 않거나 미량 존재하는 담수의 호수나 연못에서 서식한다. 이중에서도 로도박터(Rhodobactor)속은 박테리오클로로필이라고 불리우는 자체의 붉은 색소가 있어 장파장의 빛을 받아 전자전달 기작에 의해 질소 고정화를 수행한다. 질소고정화에 관여하는 최종 효소는 나이트로게나제(nitrogenase)이며, 주변에 질소, 암모니아, 암모늄이온(NH₄ ⁺) 등의 질소원이 존재하지 않을 때는 양성자(H⁺)을 수소(H₂)로 환원하여 수소가스를 발생한다.

또한 로도박터 속 미생물은 다양한 대사작용으로 호기적 및 혐기적 어둠조건에서도 모두 성장할 수 있을 뿐만 아니라, 광합성을 할 수 있다고 알려졌다. 광합성 미생물 중에서도 홍색비유황세균은 수소생산성이 다른 그룹보다 좋고, 이러한 다양성 때문에 기질 이용 효율에 차이는 있지만 단당류, 이당류 및 각종 유기산을 모두 배양기질로 사용할 수 있다.

이론적인 수소생성량은 포도당 한 분자와 6분자의 물로부터 12 분자의 수소가스가 생성될 수 있으며, 유기산인 아세테이트, 락테이트 및 부티레이트로부터는 각각 한 분자에서 4, 6 및 7 분자의 수소가 생성된다. 그러나 광합성 세균인 로도박터는 속에 따라 유기물을 수소로 변환하는 효율의 차이가 있으며, 최대 기질 변환율은 포도당의 경우 30∼40％이고, 락테이트는 85∼90％까지 가능한 것으로 알려져 있다. 또한 기질에 따라 분해되지 않는 유기산이나 당도 존재한다. 조류나 광합 성 세균으로부터 생산되는 생물학적 수소로의 변환효율은 빛에너지를 이용할 수 있는 최대 양자 효율이 높을수록 많은 수소를 생산한다고 알려져 있으며, 이는 균주내의 광화학적 변수인 광반응센터의 수 및 안테나 크기 등에 비례한다.

로도박터 속 미생물을 이용하여 유기물로부터 광합성에 의한 수소생산을 최대화하기 위한 여러 가지 방법이 연구되고 있다.

첫째, 수소발생에 관여하는 효소인 나이트로게나제 유전자의 변형 및 발생한 수소를 재사용하는 업테이크 하이드로게나제(uptake hydrogenase (Hup)) 유전자의 제거 등의 관련 유전자를 조작하는 연구, 빛 이용효율에 영향을 주는 광반응 관련 유전자에 관한 연구 등 유전공학적 연구가 진행되고 있다. 또한 미생물이 수소와 동시에 대사산물로 축적하는 폴리히드록시부티레이트 (PHB), 아미노레불론산(aminolevulonic acid)와 같은 고분자물질의 생성경로의 제거에 의해 수소발생을 최대화하는 대사관련 분자 생물학 연구가 수행되고 있다.

둘째, 광합성 수소생산 생물반응기의 형태 및 최적 수소생산 조건에 관련한 연구가 활발히 수행되고 있는데, 이는 대규모 반응기의 실질적인 적용에 초점을 두고 효율적인 광공급 및 분산을 목표로 진행되고 있다. 각 형태의 광합성 생물 배양기는 균체 대량생산 및 수소 발생과 관련하여 장단점이 있으나 대부분은 균체를 대량 확보할 목적으로 개발되었으며, 가스 생산에 적절하게 연구된 형태는 아직 없다.

셋째, 광합성 미생물 배양기술은 우수한 미생물의 확보나 적절한 반응기의 개발만큼 생물수소생산에 중요한 부분으로, 최대의 균체를 배양액 중에 확보하기 위한 균체 고정화기술과 유기성폐수나 폐자원을 적용할 경우 발생하는 각종 염이나 암모니아를 제거하기 위한 전처리, 온도 및 광도조절이 주로 연구되고 있다.

이와 같은 연구노력에도 불구하고, 현재까지 알려진 로도박터 속 미생물의 수소생산능력에는 한계가 있으며, 더욱이 유기성 폐수와 같은 고염분농도를 가지는 기질을 적용하는 경우에는 그 활성을 잃거나 사멸되어 버려 수소를 생산할 수 없어 산업적으로 이용할 수 없게 되는 문제가 발생한다.

본 발명은 상기 종래기술이 가지는 문제를 해결하기 위하여 제시되는 것으로,

본 발명의 목적은 염분이 높은 환경속에서도 광합성이 가능하며, 유기폐수물로부터 광합성 작용에 의해 종래 알려진 균주에 대하여 4배 이상의 수소를 생산하는 능력을 가지는 새로운 광합성 세균을 이용한 수소의 생산방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 수단으로 본 발명은 광합성에 의해 수소를 생산할 수 있으며, 3％ NaCl의 염분농도에서 광합성이 가능한 로도박터 스페로이데스를 이용한 수소의 생산방법을 제공한다.

본 발명에 의하면 상기 광합성 세균은 셔틀벡터인 pRK415를 함유할 수 있어 유전자 조작이 가능한 로도박터 스페로이데스이다.

본 발명에 의하면 상기 광합성 세균은 로도박터 스페로이데스 KD131 KCTC 12085인 것을 특징으로 하는 로도박터 스페로이데스이다.
이하, 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.

삭제

본 발명에 따른 광합성 세균은 홍색비유황세균으로서 로도박터 속에 속한다. 특히 본 발명에 따른 광합성 세균은 고농도의 염분에 대하여도 생육이 가능하여 염분농도가 높은 유기폐수의 처리에도 적합한 특성을 가진다.

본 발명에 따른 광합성 세균은 바람직하게는 염분 농도가 3％ NaCl인 조건에서 생육이 가능한 로도박터 스페로이데스 종에 속하며, 바람직하게는 셔틀벡터로 알려진 pRK415을 모빌라이제이션 하는 경우에 상기 플라즈미드를 함유하는 콜로니 형성능을 가지며 이는 유전자 조작을 가능하게 한다.

상기한 바와 같이 콜로니 형성능을 가지는 균주를 KD131으로 명명하고, 동 균주는 한국생명공학연구원 유전자 은행에 KCTC 12085로 (2002년 5월 6일)에 기탁되어졌다. 또한, 상기 균주는 호기적 내지는 혐기적 조건의 어느 환경에서도 광합성이 가능하다.

상기 로도박터 스페로이데스 KD131 균주는 16S rRNA의 염기서열의 분석결과에서 이미 알려진 균주로서 로도박터 스페로이데스 2.4.1, 로도박터 스페로이데스 IFO2203, 로도박터 스페로이데스 IL106과 99.5％의 유사성을 보인다.

또한, 염분 농도가 3％ NaCl인 조건에서도 약 3시간의 세대시간(doubling time)을 보이며, 광기구의 양에 있어서 로도박터 스페로이데스 2.4.1에 대해 2배 이상 많으며, 수소생산성은 4배 이상의 차이를 가진다. 이로부터 본 발명에 따른 광합성 세균은 폐수의 처리와 수소가스의 생성이라는 이중의 목적을 달성할 수 있음을 확인할 수 있다.

본 발명에 따른 로도박터 스페로이데스 KD131 균주는 유기산 또는 당, 바람직하게는 유기산을 이용하여 수소를 효율적으로 생산할 수 있다. 유기산으로는 특별한 한정을 요하는 것은 아니지만, 바람직하게는 아세테이트, 락테이트, 부티레이트, 말레이트 등이 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 로도박터 스페로이데스 KD131 균주를 배양하는 경우에는 지엘(GL) 배지 또는 시스트롬(sistrom) 배지가 이용되어질 수 있으며, 바람직하게는 GL 배지의 미네랄과 무기물을 이용하는 경우 수소생성 효율면에서 좋다. 시스트롬 배지를 사용하는 경우 탄소원으로는 말레이트가 다른 유기산에 비하여 우수하며, 지엘 배지를 사용하는 경우에는 부티레이트가 타 유기산에 비하여 우수한 것으로 나타났다.

또한 상기 균주는 나이트로게나아제에 의해 수소를 생산하므로 질소원의 농도가 높으면 나이트로게나아제는 주반응인 질소고정과정을 거치며 균체성장이 활발해지며, 질소가 부족한 환경에서는 양성자(H⁺)를 수소(H₂)로 환원하는 반응을 수행하여 수소생성량을 증가시킬 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 로도박터 스페로이데스 KD131 균주의 배양을 위한 배양기는 원통형, 코일형, 수직 평판형의 배양기가 사용되어질 수 있으나, 수직평판형 배양기가 수소 생산량의 측면에서 권장되며, 바람직하게는 빛의 투과도가 우수 하도록 전면이 투명한 재질(예를 들어, 아크릴)의 배양기를 사용하는 것이 좋다. 이 경우 약 8∼10 klux/㎡의 빛이 조사될 때 가장 균체성장과 수소생산성이 높다.

또한, 본 발명에 따른 광합성 세균은 광합성 도중 중금속을 자신의 체내에 축적하므로 중금속의 제거 목적으로도 사용되어질 수 있다.

이하 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되어지는 것으로 해석되어져서는 아니된다.

<실시예 1> 균의 분리 및 동정

(1) 국내 토착 광합성 세균의 확보

수소생성능이 높고, 염도에 내성이 있는 균주를 확보하기 위해, 바다가 인접한 경기도 화성군 대부도 지역에서 수계토양 채집을 실시하였다. 염도에 내성이 있는 균주선별은 균주 개량 후, 그 균주의 이용성이 염도에 의해 저해되는 것을 미리 막기 위해서이다. 약 9 곳의 시료들 중 5곳에서 채집한 시료들이 3％ NaCl 함유 배지에서 성장 가능하였고, 분리균 중 상대적으로 높은 수소 생성능을 보였다. 이들 분리균의 광합성 기구에 의한 흡수파장을 측정한 결과, 전형적인 비유황자색 광합성 세균의 광합성 기구의 양상을 보였다 (도 1).

(2) 선택된 분리균의 동정

도 1에 나타낸 분리균 모두에 광합성 세균과 대장균의 셔틀벡터로 알려져 있 는 pRK415(Keen NT et al. 1988)를 가동화(mobilization)하여 보았다. 그 결과 KD131만이 플라즈미드를 함유한 콜로니를 형성하였다. KD131의 동정을 위해, 16S rRNA를 코딩하는 유전자 일부를 업스트림 프라이머 5'-ACA CAT GYA AGT CGA RCG-3'와 다운스트림 프라이머 5'-TCC CAT GGT GTG ACG GGC-3'의 디제너레이티드 프라이머(degenerated primer)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과, 5' 말단으로부터 60번째 뉴클레오티드로부터 1339번째 뉴클레오티드 까지의 1.28kb의 DNA 단편을 얻었다. 그 부분을 서열분석한 결과 로도박터 스페로이데스 2.4.1, IFO2203, IL106과 99.5％의 상동성을 보였고 따라서 이 균주를 로도박터 스페로이데스 KD131로 명명 (KCTC 12085)하였다.

(3) 분리균들의 업테이크 하이드로게나제 유전자, PHB 형성 유전자와 실험실 균주 해당 유전자들과의 유사성 조사

이를 위해 로도박터 스페로이데스 2.4.1의 하이드로게나제 유전자(Dischert W. et al. 1999) 와 PHB 형성유전자(Kim JH, Lee JK 1997)를 탐침으로 이용하여 서던블롯분석을 수행하였다 (하이드로게나제 유전자 탐침: PstI-HindIII hupSL의 5,023bp, PHB 유전자 탐침: XhoI-XhoI phbC 의 1,869bp). 분리균들의 서던블롯분석 결과 KD131의 균주가 로도박터 스페로이데스 2.4.1의 게놈 DNA와 높은 유사성을 보이고 있었다 (도 2). 따라서, 다른 분리균과 비교하여 수소생성능이 우수하며, DNA 서열의 유사성이 종래 균주와 큰 것으로 보이는 KD131을 이후의 실험에 이용하였다.

수소생산성에 있어서 KD131은 종래 균주에 비해 약 4배 정도 높은 수소생성률을 보였다 (표 1).

<표 1> 로도박터 스페로이데스 KD131과 로도박터 스페로이데스 2.4.1.의 수소생성율 비교

균 주	수소생성율
로도박터 스페로이데스 2.4.1.	48 uL/hr KU*
로도박터 스페로이데스 KD131	228 uL/hr KU

*KU = 1×10⁷ cells

<실시예 2> 균의 생리적 특성

본 발명에 따른 로도박터 스페로이데스 KD131 균주의 기본적인 생리특성을 조사하였다. 염분 농도(0.05％, 3％, 5％ NaCl)에 따른 성장유무와 광합성 기구에 의한 흡수 파장을 측정한 결과, KD131은 0.05％, 3％, 5％ NaCl을 함유한 시스트롬 최소배지(Sistrom's minimal media)(Sistrom WR 1962)에서 1.6, 3.1, 9.5 시간의 배증기(doubling time)를 보였으며 (도 3), 광기구 양에 있어서는 로도박터 스페로이데스 2.4.1에 비해 B875 복합체, B800-850 복합체의 양이 각각 2배까지 많은 것으로 나타났다 (도 4).

본 발명에 따른 광합성 세균은 높은 농도(3％)의 NaCl에서도 수소 생성이 가능하다. 따라서 높은 염농도가 함유된 유기성 폐기물로부터 수소를 생성할 수 있으므로, 폐수처리와 수소가스 생성의 이중 효과를 거둘 수 있다. 또한 광합성 세균은 광합성 도중 중금속을 자신의 체내에 축적할 수 있으므로, 폐수처리시 중금속 제거 의 목적으로도 응용될 수 있다. 특히 광기구의 형성이 증진된 경우, 색소체와 전자 전달체등 생리활성물질의 농도도 높아져 세계적으로 연간 1억 달러 이상의 시장 규모인 사료로서의 부가가치가 더욱 높아질 수 있다.

<실시예 3> 배양조건의 최적화

가. 사용균주

(1) 사용균주

본 발명에서는 통성혐기성 광합성 균주인 로도박터 스페로이데스 (Rb. sphaerodies) KD131 (KCTC 12085) 균주를 사용하였다. 비교균주로서 사용한 로도박터 스페로이데스 RV는 일본 National Institute of Bioscience and Health의 Dr. J. Miyake로부터 분양 받아 사용하였다.

(2) 배지조성

로도박터 스페로이데스 KD131은 종배양을 위해서는 균체성장용 수정 시스트롬 합성배지 (표 2)를 사용하였으며, 본배양을 위해서는 수소생산용 수정 시스트롬 (표 3)을 사용하였다. 탄소원으로 첨가된 유기산 (아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 락테이트, 말레이트) 및 포도당은 30 mM을 멸균 후 따로 첨가하였다. 로도박터 스페로이데스 RV 균주는 GL 및 aSY배지 (표 4)를 이용하여 균체성장과 수소생산을 관찰하였다.

(3) 배양조건

로도박터 스페로이데스 KD131의 모든 배양은 초기 균체농도가 660nm서 흡광도 0.5가 되도록 접종하고, 배양기 내를 아르곤으로 치환하여 혐기조건을 만든 후 30℃ 항온실에서 이루어졌다. 광원으로 할로겐등을 사용하였으며 한쪽에서만 8 klux/㎡으로 비추었다. 배지는 종배양용으로 숙시네이트를 탄소원으로 함유하는 수정 시스트롬 균체배양용 배지를 사용하고, 본배양용으로는 말레이트를 탄소원으로 함유한 수정 시스트롬 수소생산용 배지를 사용하였다. 유기산의 종류에 따른 로도박터 스페로이데스 KD131의 수소생산성을 비교하기 위해서는 말레이트, 아세테이트, 또는 락테이트를 함유한 GL배지를 2N KOH를 이용하여 pH 6.8로 맞춘 후 멸균하여 사용하였다. 태양광을 이용한 옥외배양시에는 멸균하지 않은 배지를 사용하였다. 시럼 병(Serum bottle) 배양의 경우 하루에 2∼3회 흔들어주어 균체를 섞어주었고, 3.6L 배양기는 자기 교반기로 100rpm으로 교반하였으며, 50 L 배양기는 임펠러를 이용하여 균체를 교반하였다. 로도박터 스페로이데스 RV 균주는 aSy 배지(표 4)에 액체 상태로 보관된 균주 5％를 새로운 aSY 배지에 접종하여 30℃로 유지하고, 8 klux를 조사하면서 24시간 배양한 후, 다시 aSY 배지에 25％ 접종하여 동일한 조건으로 배양한 후에 gL 배지를 이용하여 수소생산을 관찰하였다. 이때 균체 접종 농도는 25％로 로도박터 스페로이데스 KD131 보다 높았다.

<표 2> 시스트롬 배지(균체성장용)

KH₂PO₄			2.72g
(NH₄)₂SO₄			0.5g
숙시네이트			4.0g
L-아스파테이트			0.04g
NaCl			0.5g
니트릴로트리아세테이트			0.2g
MgCl₂ㆍ6H₂O			0.244g
5％ CaCl₂ㆍ2H₂O (5g/100ml)			0.668ml
2％ FeSO₄ㆍ7H₂O (2g/100ml)			0.1ml
미량원소용액 /100ml	EDTA	1.765g	0.1ml
	ZnSO₄ㆍ7H2O	10.95g
	MnSO₄ㆍH2O	1.54g
	CuSO₄ㆍ5H2O	0.392g
	Co(NO₃)₂ㆍ6H2O	0.248g
	H₃BO₃	0.114g
	Na₂MoO₄ㆍ2H₂O	0.75g
	FeSO₄ㆍ7H₂O	5g
비타민 용액 /100ml	니코틴산	1g	0.1ml
	티아민ㆍHCl	0.5g
	바이오틴	0.01g
최종 부피			1L

* KOH로 pH 6.8∼7.0 으로 조정 후 멸균하여 사용한다.

<표 3> 시스트롬 배지 (수소생성용)

DL-말레이트			4.023g
KH₂PO₄			2.72g
L-글루타메이트			1.2g
니트릴로트리아세테이트			0.2g
MgCl₂ㆍ6H₂O			0.244g
5％ CaCl₂ㆍ2H₂O (5g/100ml)			0.668ml
2％ FeSO₄ㆍ7H₂O (2g/100ml)			0.1ml
미량원소용액 /100ml	EDTA	1.765g	0.1ml
	ZnSO₄ㆍ7H₂O	10.95g
	MnSO₄ㆍH₂O	1.54g
	CuSO₄ㆍ5H₂O	0.392g
	Co(NO₃)₂ㆍ6H₂O	0.248g
	H₃BO₃	0.114g
	Na₂MoO₄ㆍ2H₂O	0.75g
	FeSO₄ㆍ7H₂O	5g
비타민용액 /100ml	니코틴산	1g	0.1ml
	티아민ㆍHCl	0.5g
	바이오틴	0.01g
최종 부피			1L

* KOH로 pH 6.8∼7.0 으로 조정 후 멸균하여 사용한다.

<표 4> GL 및 aSY 배지 조성

aSY 배지(기본배지 1ℓ당)
암모늄설페이트	1.25g
소디움숙시네이트	9.8g
효모추출물	1.0g
GL배지(기본배지 1ℓ당)
L-글루타메이트모노소디움	1.872g
소디움 DL-락테이트 (또는 락테이트)	9.34g (7.15g)
소디움 하이드로겐카보네이트	1.5g
※ 기본배지
K₂HPO₄	0.75g
KH₂PO₄	0.85g
H₃BO₃	2.8㎎
Na₂MoO₄ㆍ2H₂O	0.75㎎
ZnSO₄ㆍ7H₂O	0.24㎎
MnSO₄ㆍ4H₂O	2.1㎎
Cu(NO₂)₂ㆍ3H₂O	0.04㎎
CaCl₂ㆍ2H₂O	0.75㎎
EDTA	2.0㎎
MgSO₄ㆍ7H₂O	0.2㎎
FeSO₄ㆍ7H₂O	10㎎
비타민 B1	3.783㎎
3.566㎎
바이오틴
P-아미노벤조에이트	5.25㎎
니코틴아마이드	6.48㎎
♧ 최종적으로 2N NaOH로 pH를 6.8로 조절.

나. 생물배양기

(1) 50㎖ 및 150㎖ 용량의 시럼 병(serum bottle)

50 ㎖와 150㎖ 용량 배양기는 파이렉스(pyrex) 재질의 원통형으로 30℃ 항온실에서 배양하였다. 균체는 30℃에서 3∼4일간 종배양한 것을 660nm에서 흡광도가 0.5가 되도록 접종하여 고무마개로 닫고 알루미늄 덮개로 밀폐하고, 아르곤으로 10분 치환하여 혐기조건을 만들었다. 초기 pH는 멸균된 2N KOH를 사용하여 6.8로 맞추고 할로겐등을 8∼10 klux/㎡가 되도록 조사하면서 배양하였다. 생성된 가스는 시린지로 측정하였고 수소함량은 시럼병 헤드공간을 가스 타이트(tight) 시린지로 100 ㎕ 채취하여 GC로 분석하였다.

(2) 1ℓ컬럼형 광합성 생물배양기

컬럼형 반응기는 내경 3.5 cm, 높이 26 cm 의 원통형 자켓 배양기로 총부피는 1ℓ이고 실용량은 0.9ℓ이다. 수소생산을 위하여 10％ 종배양균을 접종하였고, 배양 온도는 30℃, pH는 6.8∼7.0을 유지하면서 배양하였다. 배양액 0.8 L에 균체를 접종한 후 아르곤으로 30분간 치환하여 배양기 내를 혐기조건으로 하였다. 광원은 할로겐으로 한쪽 면에서만 조사하였으며, 조도는 8∼10 klux를 유지하였다. 배양기간 중 온도는 30℃, 초기 pH는 6.8∼7.0으로 조절하였고, 자기 교반기로 교반하며 배양하였다. 가스 발생량은 메스실린더를 이용해서 측정하였으며 수소함량은 GC로 측정하였다.

(3) 3.6ℓ용량 평판 광합성 생물반응기

3.6 L 평판 생물배양기는 20×30×6cm (가로×세로×깊이) 스테인레스 스틸로 제작되었는데 양쪽면은 유리로 되어 있으나 유리의 특성상 양쪽 옆면은 스테인레스 스틸로 제작되어 양쪽 앞면에서만 빛을 받을 수 있도록 제조되었다. 3.6ℓ 평판 생물배양기는 전면이 투명 아크릴로 제작되어 빛투과율을 높일 수 있었다. 두 가지 배양기 모두 총 부피는 3.6ℓ이고 실용량은 3ℓ로 하였다. 배양액 3ℓ에 균체를 접종한 후 아르곤으로 30분간 치환하여 배양기 내를 혐기조건으로 하였다. 광원 은 할로겐으로 한쪽 면에서만 조사하였으며, 조도는 8∼10 klux을 유지하였다. 배양기간 중 온도는 30℃, 초기 pH는 6.8∼7.0으로 조절하였고, 자기 교반기로 교반하며 배양하였다. 가스 발생량은 메스실린더를 이용해서 측정하였으며 수소함량은 GC로 측정하였다.

다. 분석방법

(1) 가스분석

배양 중 발생하는 전체 가스는 물을 담은 매스실린더에 포집하거나, 가스미터로 측정하였다. 수소 함량은 발효조내 헤드 공간 가스를 가스 타이트 마이크로시린지로 100 ㎕ 채취하여 가스크로마토그라피 (Shimazu 14-B)로 분석하였다. 사용된 칼럼은 300㎜ ×2㎜ (길이×지름) 유리로 분자체 5A (Supelco Inc.)를 충진물질로 사용했으며, 열전도측정기 (TCD)로 분석하였다. 발생가스 중 수소 가스 정량을 위한 GC의 조건은 칼럼 온도 80℃, 주입기 온도 100℃, 검출기 온도 120℃이었으며, 운반 가스는 아르곤으로 유속 35 ㎖/분으로 유지하였다.

(2) 유기산 분석

발효액을 일정시간 간격으로 채취하여, 10,000g에서 5 분간 원심분리하여 균체와 상등액을 분리한 후 상등액을 0.45 ㎛ 필터로 여과한 시료를 유기산 분석에 사용하였다. 시료 20 ㎕ 배양 상등액을 주입하고, 0.01 N H₂SO₄을 이동상으로 하여 유속 0.6 ㎖/분으로 용출하였다. 유기산 분석은 Aminex HPX-87H, 300×7.8 mm (길이×내경)를 장착한 HPLC (Shimadzu LC-10AT)를 사용하여 30℃에서 분석하였으며, UV 검출기를 이용하여 파장 210 nm에서 측정하였다.

유기산(포르메이트, 아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 락테이트) 분해 및 생성을 계산하기 위하여 농도가 알려진 용액으로 표준곡선을 작성하였다. 이 표준곡선에 배양액의 분석 결과를 적용하여 분해율과 생성율을 계산하였다.

라. 균주의 특성 및 수소생산능 측정

(1) 균주의 종균 배양 조건과 수소생산성 비교

통성혐기성 균주인 로도박터 스페로이데스 KD131 종균 배양조건에 따른 균체 성장 및 수소생산성을 알아보았다. 배지는 시스트롬 합성배지를 사용하였다. 종균배양은 각각 혐기/광 조건과 호기/암 조건으로 나누어 이루어졌다. 먼저 혐기/광조건 종배양은 시럼 병에 10％ 시드를 접종하고 고무마개와 알루미늄덮개로 덮은 후 아르곤으로 치환하여 혐기조건을 만들고 할로겐등 아래서 약 8klux로 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 호기/암조건 종배양은 삼각플라스크에 10％ 시드를 접종하고 솜마개를 하여 호기조건, 어둠에서 30℃로 24시간 동안 배양하였다. 두 가지 방법으로 배양된 종균은 각각 수소생산에 이용, 50㎖ 시럼 병에 각각 10％ 씩 접종하여 실용량 20㎖에서 아르곤으로 5분 치환하여 혐기조건을 만든 후 할로겐등 아래서 약 8klux로 30℃에서 배양하였다. 배양액은 하루에 두 번 흔들어 균체를 섞어주었다. 초기 pH는 7.0으로 조절되었고 배양시간 경과에 따른 pH 변화 및 헤드공간의 총 가스량을 측정하고 GC를 이용하여 수소 생산량을 산출하였다.

종배양 조건이 혐기/암인 경우 균체는 고동색을 띄고 (형광등에서는 녹색) 성장이 좋은 반면, 호기/암 인 경우 붉은색을 띄고 같은 배양시간에 비교 하였을 때 성장이 늦었다. 따라서 혐기/광 배양이 수소생산의 종배양 조건으로 적당하였다.

혐기/광 및 호기/암 조건에서 종배양을 시드로 사용하여 혐기/광조건에서 본배양한 결과를 표 5에 나타내었다. 혐기/광조건 시드의 경우, 72시간 배양 후 2.6 ㎖ H₂/㎖-배양액 수소가 생산된 반면, 호기/암 조건 시드의 경우 초기 수소생산 속도도 느렸고 72시간 배양 후 2.2 ㎖ H₂/㎖-배양액로 혐기/광조건 시드 보다 수소생산에 적합하지 않았다.

(2) 균주의 균체성장곡선

로도박터 스페로이데스 KD131은 말레이트 30mM이 탄소원으로 첨가되고 L-글루타메이트 및 (NH₄)₂SO₄가 질소원으로 첨가된 시스트롬 합성배지에서 할로겐 등을 이용한 8 Klux광도의 광합성 조건에서 균체가 성장하고 수소를 생산하였다 (도 5).

로도박터 스페로이데스 KD131의 성장 대수기 (logarithmic growth phase)는 약 배양 40시간까지 지속되었으며, 수소 생산은 대수기의 중간인 약 24시간부터 시작되었고, 균체 성장이 정지된 후 까지도 계속 되었다. 배양 초기 pH는 7.0이었으며 균체가 성장하면서 증가하기 시작하여 약 20∼24시간에는 8.6∼8.8까지 증가하 였고, 배양 20시간 이 후부터 7.4∼7.7로 감소하였다.

(3) 광세기 비교

말레이트 30mM을 포함하는 시스트롬 합성배지 20㎖ (초기 pH 6.8∼7.0) 을 50㎖ 시럼 병에 넣고 종배양한 균주를 균체농도가 흡광도 0.5 (660nm)가 되도록 균체를 첨가하여 30℃에서 정치배양하였다. 할로겐등을 이용하여 각각 3∼3.5 klux, 7∼8 klux, 15∼16 klux의 조도로 구분하여 광합성 균주가 담긴 시럼 병의 한 면에 빛을 조사하였다. 배양 중 하루에 2∼3회 균체를 섞어주며 이틀간 배양하였고 균체 성장 및 수소생산량을 도 6에 나타내었다.

균체농도는 광세기가 3∼3.5 klux 와 7∼8 klux 일 때 가장 높았다. 이 균주는 100∼110 klux 이상으로 조사한 경우 균체성장에 저해를 받았으며 3∼3.5 klux 와 7∼8 klux 경우와 비교하여 약 50％의 성장률을 보였다. 조사량 100∼110 klux 이상일 때를 제외한 그 외의 광세기의 경우 균체는 비교적 비슷한 성장률을 보였으나 조사량 30∼32 klux 이상의 경우 배양시간이 경과하면서 균체 고유의 색인 적벽돌색이 색소를 잃고 배양액이 표백화되는 현상을 보였다.

이와 같은 현상은 수소생산량에 영향을 주어서 50∼52 klux 의 경우 7∼8 klux 의 경우보다 수소생산량이 약 30％ 감소하였다. 또한 100∼110 klux 의 경우에는 균체성장도 낮았으며 동시에 수소생산량도 7∼8 klux의 경우보다 70∼90％ 가량 감소하였다.

<표 5> 로도박터 스페로이데스 KD131 균체 성장 및 수소 생산에 미치는 광 세기 효과

광세기 (Klux)	pH	균체농도 (abs.660nm)	생산된 H₂ (㎖ H₂/㎖-배양액)
0	6.84∼6.88	0.32∼0.35	0
3∼3.5	7.43∼7.53	3.02∼3.39	0.65∼0.76
7∼8	7.51∼7.75	2.90∼3.39	0.94∼1.00
15∼16	7.70∼7.79	2.62∼3.12	0.59∼0.90
30∼32	7.80∼7.85	2.66∼3.02	0.61∼0.78
50∼52	7.84∼7.96	2.82∼2.83	0.64∼0.68
100∼110	7.50∼7.72	1.64∼1.74	0.11∼0.28

(4) 균체성장 및 수소생산에 미치는 pH의 영향

로도박터 스페로이데스 KD131의 초기 pH를 5.2∼7.08로 조절할 때, 간간이 균체가 뭉치는 현상을 보였으나, 초기 pH 7.22이상일 경우는 뭉치는 현상을 관찰할 수 없었다. 초기 pH 범위가 7.1∼7.3일 때, 균체 성장이 활발하여 초기 균체 농도가 Abs. 660nm에서 1.5∼1.6가 배양 19시간 후 4.44∼4.75로 증가하였고, 이때 pH도 7.3∼7.4로 상승하였다. 초기 pH를 5.73으로 조절하였을 때는 19시간 후 pH가 6.72로 증가하고 이때 균체 농도는 흡광도 3.5이었다. 수소생산은 pH 범위가 7.4∼7.5일 때 약 1.4∼1.5㎖ H₂/㎖-배양액으로 가장 우수하였고 pH 범위가 6.7∼7.0일 때는 0.54∼0.83㎖ H₂/㎖-배양액으로 pH 7.4∼7.5일 때 생성된 양보다 낮았지만, 이때는 균체 농도도 상대적으로 낮았다. 본 실험에서는 초기 pH 범위를 5.3∼7.6으로 조절하였으나, 배양 0시간에는 모든 pH 범위에서 수소 발생을 측정할 수 없었으나, 균체가 광합성을 하면서 배양 6시간 이후부터 수소생성을 측정할 수 있었다. 수소생성용 합성배지는 L-글루타메이트가 질소원으로 첨가되었기 때문에 균체 성장이 지속되었으며, 질소원이 고갈된 후에 수소도 발생하였다.

(5) 질소원 농도의 영향

탄소원의 농도가 30 mM로 일정할 때 로도박터 스페로이데스 KD131은 첨가된 질소원, L-글루타메이트의 농도 (2mM, 5mM, 8mM)에 따라 유기산 분해, pH 변화, 균체 성장, 수소 생산량에 유사한 결과를 표 6에 나타내었다. 즉 질소원의 첨가 농도가 5mM, 8mM로 첨가 할 때와 비교하여, 2mM일 때는 배양 48시간동안 pH상승이 가장 낮아서 약 7.27 이었으며, 균체 증식도 660nm에서 측정된 흡광도가 약 1.3∼1.4로 8mM 첨가할 때 보다 약 1.7 배 가량 낮았다. 그러나 배양액 단위 부피 당 생산되는 수소는 8mM 첨가할 때 보다 약 1.4 배 높았다. 이는 로도박터 스페로이데스의 나이트로게나제에 의해 수소가 생산되기 때문이다. 질소원이 풍부할 경우 균체는 성장과 나이트로게나제에 의한 질소고정 과정을 수행하며 질소원이 부족할 경우 균체는 나이트로게나제를 이용하여 수소를 생산하는 과정을 거친다.

<표 6> 질소원 농도가 로도박터 스페로이데스 KD131 균체생장 및 수소생산에 미치는 영향

L-글루타메이트 (mM)	DL-말레이트 (mM)	배양시간 (hr)	pH	세포농도 (Abs660)	H₂ (㎖.㎖-발효액)	유기산 분해
2	30	0	6.70	0.51	0	0
		24	7.24	1.99	0.69	38
		48	7.27	2.29	0.98	38
		72	7.33	2.24	1.38	61
		90	7.30	2.23	1.36	65
5	30	0	6.67	0.52	0	0
		24	7.27	2.41	0.79	37
		48	7.32	3.02	1.37	62
		72	7.50	3.01	1.42	76
		90	7.80	2.91	0.96	83
8	30	0	6.80	0.51	0	0
		24	7.32	2.21	0.77	37
		48	7.55	3.18	1.09	67
		72	7.83	3.12	0.93	75
		90	7.96	3.03	0.87	79

(6) 다양한 탄소원의 이용

시스트롬 배지에 다양한 탄소원을 첨가하여 이들에 대한 로도박터 스페로이데스 KD131 균체성장 및 수소생산량을 비교 분석하였다 (표 7).

탄소원은 모두 30mM 첨가되었고 전분은 1％ 첨가되었다. 배양은 50 ㎖ 시럼 병에서 20㎖ 용량으로 초기 pH 6.8로 맞춘 후 30℃ 항온실에서 48시간 동안 8 klux 할로겐등에서 이루어졌다. 글리세롤, 수크로스, 전분은 이 균주에 의해 이용되지 않았으며, 글루코스를 탄소원으로 이용할 때는 균체는 pH 6.0일 때까지 성장하였으나 글루코스가 소비되면서 pH가 낮아져서 균체 성장도 멈추고 수소 생산은 낮았다. DL-말레이트를 탄소원으로 이용하여 배양 48시간 동안 말레이트를 95％ 이상 분해하였고, 수소 생산량은 2.1㎖ H₂/㎖-배양액으로 락테이트나 아세테이트에 비하여 이 용율이 높았다. 아세테이트는 pH가 배양 후 48시간에 9 이상으로 상승하여 기질 분해 및 수소 생산이 낮았다. 이러한 pH 9 이상의 상승은 배양액 중에 β-D-하이드록시부티레이트가 축적하는 현상과 동시에 발생하였다. 아세테이트는 로도박터 스페로이데스 KD131 야생형이 균체 내에 폴리하이드록시부티레이트 (PHB)를 합성하기 위한 전구체이며, 이 실험에서는 배양시간이 경과하면서 세포 내에 PHB가 축적되었다. PHB는 세포 내에 축척 되는 고분자 물질이지만 합성 중 중간물질인 β-D-하이드록시부티레이트가 세포 밖으로 배출되어서 배양액의 pH를 상승시킨 것으로 분석된다.

<표 7> 시스트롬 배지에서 다양한 탄소원을 이용한 로도박터 스페로이데스 KD131 균체성장 및 수소생산

	pH	세포농도^a	생산된 H₂ (㎖ H₂/㎖ 배양액)	기질 가수분해 (％)
글루코스	6.26∼6.30	3.64	0.36	49.1
글리세롤	7.89∼8.19	1.35	0	ND^b
수크로스	7.47∼7.61	1.83	0.14	ND^b
전분	7.44∼7.53	0.81	0	< 1.8
말레이트	7.51∼7.75	3.10∼3.36	2.10	> 95.0
락테이트	7.19∼7.48	2.77	0.80	60.9
아세테이트	9.22∼9.43	3.10	0.24	55.2

^a균체농도는 660 nm에서의 흡광도를 의미한다.

^bND는 측정불가를 의미한다.

(7) 미네랄의 영향

미네랄의 영향을 비교하기 위해 GL 기본배지에 다양한 탄소원 30mM을 첨가하 였다. 각각 5㎖ 시럼 병에 20㎖ 실용량으로 초기 pH를 6.8로 맞춘 후 8klux할로겐등, 30℃에서 48시간 동안 배양되었으며 이를 표 8에 나타내었다. 로도박터 스페로이데스 KD131에 의한 수소 생산은 무기물질 및 비타민 등 미량원소의 종류에도 영향을 받았다. GL 배지(표 4)는 시스트롬 배지와 매우 유사한 조성을 가지나 미량원소인 미네랄 및 무기질의 종류 및 함량이 다르다. GL 합성배지를 이용할 경우 동일한 광합성 배양 조건에서 락테이트는 배양 48시간 동안 약 73.7％가 분해되었고, 수소는 2.79∼2.94 ㎖ H₂/㎖-배양액 발생하였다.

<표 8> GL 배지에서 다양한 탄소원을 이용한 로도박터 스페로이데스 KD131의 균체성장 및 수소생산

	pH	세포농도^a	생산된 H₂ (㎖ H₂/㎖ 배양액)	기질가수분해 (％)
락테이트	7.79∼7.87	3.41∼3.96	2.79∼2.94	73.7
아세테이트	8.46∼8.74	3.77∼4.15	1.28∼1.43	72.9
말레이트	7.35∼7.49	2.21∼2.62	2.41	95.9
부티레이트	7.67	4.12	2.13	32.9
부티레이트^b	7.34	4.02	4.11	42.3
부티레이트^c	7.20	3.80	6.76	64.3

모두 30 mM 유기산을 첨가하였으며, 부티레이트의 경우에는 70mM을 첨가하였다.

^a균체농도는 660 nm에서의 흡광도를 의미한다.

^b,c각각 96 및 144시간 배양시의 결과이다.

이는 시스트롬 배지에서 발생한 수소 양보다 같은 배양시간에 약 3.6배가 더 발생하였으며, 락테이트 분해도 1.2 배 높았다. 아세테이트는 시스트롬 배지에서와 동일한 경향의 pH 상승 현상을 보였으나, 기질 분해율과 수소 생산성은 GL배지를 이용했을 경우 각각 1.3 배, 5.7 배 증가하였다. 부티레이트는 다른 유기산에 비해 분해속도가 늦은 반면, 수소 생산은 우수하였다. 70 mM 부티레이트는 배양 48 시간 동안 약 33％가 분해되었고, 144 시간 경과 후에는 64.3％가 분해되었으며, 수소 생산은 6.76 ㎖ H₂/㎖-배양액으로 가장 우수하였다.

(8) 탄소원 농도의 영향

GL 배지에서 질소원의 농도를 L-글루타메이트 12.7 mM로 고정하고 탄소원의 농도를 변화하였을 때 로도박터 스페로이데스 KD131 균체성장 및 수소생산량을 비교하였다 (표 9 및 10). 락테이트의 농도는 30과 70 mM로 변화시켰고, 아세테이트의 농도는 30, 50, 70 mM로 변화시켰다. 락테이트의 농도가 높을수록 균체성장과 수소 생산이 모두 우수하였다. 배양 중 pH 변화는 6.8에서 7.6 사이로 큰 변화 없었다. 탄소원의 농도가 낮을 때는 배양 중 균체가 뭉치는 현상을 관찰하였다. 이와 같은 현상은 균체의 광합성 효율을 저하시켜 증식과 수소 생산을 저해하였다. 광합성 세균의 배양 중 균체가 뭉치는 현상은 여러 연구자에 의해 관찰되었지만 그 직접적인 원인은 밝혀지지 않았다. 아세테이트의 경우에는 탄소원의 농도가 높을수록 균체성장은 우수하였고 수소생산은 소량 증가하였다. 배양 중 pH 변화는 7.2∼9.6으로 아세테이트의 농도가 높을 수록 pH 상승폭이 컸다. 락테이트와 아세테이트의 유기산 분해율 대비 수소생산량을 비교하여 보면 락테이트의 경우 배양 72 시간째 유기산 분해율 91.43％에서 2.21㎖ H₂/㎖ 배양액을 생산하였고, 아세테이트의 경우 배양 24시간째 유기산 분해율 95.84％에서 1.02㎖ H₂/㎖ 배양액을 생산하여 락테이트를 탄소원으로 하였을 때 아세테이트 보다 2배 정도 높은 수소생산량을 보였다.

<표 9> GL 배지에서 락테이트 농도별 로도박터 스페로이데스 KD131 균체성장 및 수소생산

락테이트 (mM)	배양 시간	pH	세포농도 (Abs.660nm)	생산된 H₂ (㎖ H₂/㎖ 배양액)	유기산 분해율(％)
30	0	6.84	0.50	0	0
	24	7.44	1.85	0.83	44.86
	48	7.66	3.10	1.98	85.87
	72	7.56	2.83	2.21	91.43
70	0	6.55	0.47	0	0
	24	7.25	2.12	0.66	14.85
	48	7.3	4.39	2.10	50.14
	72	7.52	4.27	3.89	87.65

<표 10> GL 배지에서 아세테이트 농도별 로도박터 스페로이데스 KD131 균체성장 및 수소생산

아세테이트 (mM)	배양 시간	pH	세포농도 (Abs.660nm)	생산된 H₂ (㎖ H₂/㎖ 배양액)	유기산 분해율(％)
30	0	7.41	0.52	0	0
	24	8.85	3.97	1.02	96.44
	48	8.60	3.95	1.29	94.47
	72	8.14	3.43	1.66	95.58
50	0	7.39	0.51	0	0
	24	8.64	3.70	0.95	49.27
	48	8.75	5.31	2.02	97.98
	72	8.21	5.50	2.69	97.77
80	0	7.25	0.50	0	0
	24	9.38	4.71	0.92	42.76
	48	9.56	5.86	1.67	73.71
	72	9.33	6.40	3.06	92.38

(9) 광학이성질체 탄소원의 영향

탄소원 중에서도 광학이성질체의 영향을 시스트롬 배지를 기본으로 하여 탄소원으로 DL-, D-, L-말레이트를 비교하였다. 세 가지 유기산 모두 야생형 균주에 의해 기질로서 거의 같은 속도로 이용되었다 (도 7). HPLC 유기산 분석시 말레이트는 9.16분에 용출되었고, 알 수 없는 물질이 14.93분에 용출되었다. 14.93분에 용출되는 물질은 β-D-하이드록시부티레이트 (β-D-HB)로 추정되며 β-D-HB 표준물질로 HPLC에서 동일한 리텐션 타임(retention time)임을 확인하였다. D-말레이트 경우에는 배양시간 경과에 따라 탄소원인 말레이트를 소모하여 9.16분대 피크가 감소하였고, 14.93 분대 물질은 소량 축적되었다 (표 11). L-말레이트의 경우에는 역시 배양시간 경과에 따라 탄소원인 말레이트를 소모하여 9.16 분대 피크가 감소하였으나, D-말레이트의 경우와는 달리 14.93 분대 물질이 많이 축적되었다. DL-말레이트의 경우에는 배양 초기부터 14.93 분대 물질이 포함되어 있었고 이 물질은 D,L-말레이트와 더불어 배양시간 경과에 따라 감소하였다. 이는 D-형과 L-형에 따라 β-하이드록시부티레이트로의 전환 형태가 다르고, 이에 따라 PHB 고분자 물질의 합성과도 관련이 있는 것으로 사료된다.

<표 11> 로도박터 스페로이데스 KD131 배양 중 말레이트 및 하이드록시부티레이트 양의 변화

말레이트	인큐베이션 시간 (hrs)	피크면적 (면적×10^-3)
말레이트	인큐베이션 시간 (hrs)	말레이트 (9.16분)	하이드록시부티레이트 (14.93분)
D,L-말레이트	0	4,513	4,560
D,L-말레이트	24	2,850	4,870
D-말레이트	0	4,835	0
D-말레이트	24	2,923	101
L-말레이트	0	5,041	604
L-말레이트	24	2,605	11,946

(10) 배양기 영향

앞서 소개된 50㎖ 시럼 병, 1ℓ컬럼배양기, 3.6ℓ 스테인레스 측면 수직평판형 유리 배양기, 및 3.6ℓ 전면 아크릴 수직평판형 배양기를 이용하여 각각의 수소생산성을 비교하였다.

50㎖ 용량 유리 시럼 병, 3.6ℓ 용량 스테인레스 측면/유리 양면으로 제작된 수직평판형(flat vertical) 유리 배양기, 3.6ℓ 용량 아크릴로 제작된 수직평판형 배양기, 1ℓ 용량 유리 컬럼배양기 및 유리로 제작된 코일형배양기를 이용하여 각각의 수소생산성을 비교하였다. 광합성 세균에 의한 수소 생산을 최대화하기 위해서는 미생물의 낮은 빛 전환효율 개선, 높은 광 세기에서의 광 저해 현상, 암 조건에서의 수소소비현상 등 미생물 자체가 가지는 유전적인 인자를 개선해야 하지만 동시에 효율적인 광합성 생물 반응기, 즉 최적 균체 성장 및 수소생산을 유도할 수 있는 빛이 배양기의 모든 부분에서 골고루 분산되는 배양기를 경제성 있는 재질과 형태로 제작·고안하여 연속적으로 수소를 생산할 수 있는 연구가 필요하다. 이러한 연구는 아직 전 세계적으로 초기 상태에 있으나, 일부 베타 카로틴과 같은 고부가가치 물질의 추출을 위한 원료 바이오매스 생산용 녹조류 배양 개방 연못형 배양기가 상용화되었고, 그 외에는 코일형 배양시설, 태양광을 내부로 받아들인 내부 조명형, 생물배양시설, 수직 모듈과 형태, 호수 위에 띄운 플로우팅 형태 등이 각국에서 실험실 규모로 검토되고 있다. 본 발명에서는 칼럼 형태, 수직사각(vertical rectangular) 형태, 코일 형태의 광합성 배양기를 유사한 배양 조건에서 수소생산성과 균체 성장을 검토하였다.

수소 발생률은 동일한 직경의 칼럼 형이지만 50㎖ 시럼 병 배양기가 약 2배가량 높은 수소 생산율을 나타내었다. 이와 같은 형태이지만 크기가 대형화될 때 빛이 골고루 분산되는 것이 어렵고 일부 어두운 곳이 발생해서 수소 생산이 저하되는 것으로 사료된다. 태양광이 균체가 존재하는 배양기 내를 통과할 수 있는 깊이는 약 3cm로 보고되어 있으며, 예비 실험 결과 광합성 배양기가 평평한 형태는 칼럼형과 비교하여 빛의 분산이 일정하여 배양기 내부의 빛을 받는 세기가 비교적 일정하였다. 3.6ℓ 용량 스테인레스 측면/유리양면으로 제작된 수직평판형 유리배양기배양기와 3.6ℓ 용량 아크릴로 제작된 수직평판형 유리배양기는 빛을 받는 부분이 평평한 수직평판 형태의 광합성 배양기로 두께가 8mm인 유리와 투명아크릴을 재질로 사용하여 각각 제작하였다.

로도박터 스페로이데스 KD131은 전면이 투명 아크릴로 제작된 평판형 수직 배양기 (총부피 3.6ℓ, 배양액 부피 3ℓ)는 8∼9 klux 조도로 pH를 조절하지 않고 30℃에서 30 mM 말레이트를 첨가한 시스트롬 배지로 배양하였을 때 양면만 유리로 제작된 동일한 크기의 배양기에서보다 2배 이상의 수소를 생산하였다. 유리와 아크릴은 모두 투명재질이었으며 빛 투과도에 대한 비교는 같으나, 유리 반응기는 그 가공 특성상 전면을 유리로 하지 못하고 옆면은 스테인레스스틸로 지지하였기 때문에 빛을 받는 면적이 감소하였다.

파이렉스 유리로 제작된 코일형 광합성 생물배양기는 유리관 (외경 1.94cm, 내경 1.74cm)을 약 20cm 직경의 실린더 형태로 감아서 높이 55∼57cm이며, 부피는 약 3.0ℓ이었다.

아크릴로 제작된 배양기의 재질 두께를 각각 0.4 및 0.8cm로 사용할 때 균체 생성에 영향을 주었다(도 8). 즉 0.4cm 두께로 제작하였을 때 광합성에 의한 균체생성이 48시간 배양동안 약 1.4배 증가하였다.

그러나 수소생산은 오차범위 내에서 변화를 나타내지 않았다. 균체의 증가는 수소생산에 비례적인 증가를 유도할 수 있으나 부 실험에서는 이미 충분한 농도의 균체가 확보되어 오히려 높은 균체 농도는 빛 투과율을 저하시켜 수소생산에 증가적인 효과를 나타낼 수도 있다. 배양 중의 시간이 경과함에 따라 배양액을 교반할 때에도 균체가 뭉치거나 배양기 벽에 붙는 경우가 종종 발생하였으며 이러한 현상은 최종적으로 균체농도가 저하되는 것과 같은 현상을 나타내었다 (도 8).

코일형 생물배양기는 다른 생물 반응기와 비교하여 동일한 배양조건에서 균체를 순환하면서 교반하였을 때, 로도박터 스페로이데스 KD131은 약 24시간 후 균체 증식이 2배 이상 도달하였다. 그러나 수소발생량은 다른 형태의 배양기보다 낮았다. 이와 같은 이유는 배양액을 순환하기 때문에 발생한 수소가 외부로 모두 방출되지 않고 일부는 코일배양기 중에 갇히게 되거나 배양액과 같이 순환하였다. 이와 같은 현상은 배양액 중의 pH를 낮춰서 포름산이 대량 축적되었으며, 균체는 약 96시간 이후부터 pH 저하에 의한 표백화 현상을 보였다. 본 발명에서 검토된 컬럼형, 수직평판형 및 코일형 생물 배양기 중에서 수직평판형 배양기가 로도박터 스페로이데스 균체배양 및 수소생산에 가장 적합하였으며, 투명아크릴 재질이 비교적 가공이 간편하고 가격이 저렴하여 광합성 생물 배양기의 대형화에 적합하였다.

<표 12> 반응기 형태의 영향

배양기 모양	시럼 병	평면양면 유리	평면사면 아크릴	칼럼형	코일형
직경×높이(cm)	3.5 ×5.5	-		3.5×26	관 직경, 1.74 코일직경, 20 높이, 55
폭× 높이× 두께 (cm)	-	20 ×30 ×6	20×30×6	-	관 직경, 1.74 코일직경, 20 높이, 55
총 부피 (㎖)	50	3,600	3,600	1,000	3,000
워킹 부피 (㎖)	20	3,000	3,000	900	3,000
수소발생율 (㎖ H₂/㎖-발효액)	1.0∼1.6	0.37∼0.41	0.8∼1.0	0.51∼0.62	0.1∼0.15

(11) 수소생산성 비교

로도박터 스페로이데스 KD131과 현재까지 최고 수소생산성을 가지 균주로 알려진 로도박터 스페로이데스 RV를 비교하여 표 13에 나타내었다. 탄소원은 30 mM 말레이트, 질소원은 8 mM L-글루타메이트로 고정하여 각각 시스트롬 배지와 GL 배지에서 초기 균체농도가 660 nm에서 흡광도 0.5가 되도록 시드를 접종하고 72시간 배양 후 균체성장 및 수소생산량을 비교분석하였다.

균체배양은 50㎖ 시럼 병에 실용량 20㎖로 하였고 아르곤으로 5분 치환하여 혐기조건을 만든 뒤 30℃ 항온실에서 8 klux/㎡할로겐등을 비춰 배양하였다. 그 결과 시스트롬 배지에서는 KD131이 균체성장 및 수소생산량이 모두 좋았고 수소생산량은 약 2 배 높았다. 반면 GL 배지에서는 균체성장은 KD131이 약간 지체된 반면 수소생산량은 소량 높았다. KD131은 RV 균주와 함께 수소생산성이 우수하므로 각종 유전자 변이를 통해 더 높은 수소생산을 기대할 수 있을 것이다.

<표 13> 시스트롬 및 GL 배지에서 로도박터 스페로이데스 KD131과 로도박터 스페로이데스 RV 의 균체성장 및 수소생산성 비교

균주	배지	배양시간 (hr)	균체농도 (Abs. 660)	수소생산량 (㎖ H₂/㎖-배양액)
KD 131	GL	72	2.12	2.63
KD 131	시스트롬	72	3.19	1.02
RV	GL	72	2.56	2.59
RV	시스트롬	72	2.36	0.45

본 발명에 의한 광합성 세균은 염분이 높은 환경속에서도 생존이 가능하며, 유기폐수물로부터 광합성 작용에 의해 종래 알려진 균주에 대하여 4배 이상의 수소를 생산하는 능력을 가지고 있다. 또한, 본 발명에 따른 광합성 세균은 광합성의 과정에서 중금속을 자신의 체내에 축적하는 작용을 하므로 폐수로부터 중금속을 제거하기 위한 목적으로도 사용될 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims

3％ NaCl의 염분농도에서 생존이 가능한 로도박터 스페로이데스 KD131 KCTC 12085를 유기폐기물을 기질로 하여 수소를 생산하는 방법
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