EA020184B1

EA020184B1 - БЕЛОК, УЧАСТВУЮЩИЙ В РАЗЛОЖЕНИИ СУБСТРАТА, ПРЕДСТАВЛЯЮЩЕГО СОБОЙ н-АЛКАН, ИЛИ ЕГО ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ФРАГМЕНТ, КОДИРУЮЩАЯ ИХ МОЛЕКУЛА НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, ХИМЕРНЫЙ ГЕН, ВЕКТОР И МИКРООРГАНИЗМ, СОДЕРЖАЩИЕ УКАЗАННУЮ МОЛЕКУЛУ, И СПОСОБ РАЗЛОЖЕНИЯ УКАЗАННОГО н-АЛКАНА

Info

Publication number: EA020184B1
Application number: EA200900058A
Authority: EA
Inventors: Ханс Кристиан Котлар; Тронд Эллингсен; Сергей Зотчев; Александер Венцель; Мимми Троне-Хольст
Original assignee: Статойл Аса
Priority date: 2006-06-23
Filing date: 2007-06-25
Publication date: 2014-09-30
Also published as: EA200900058A1; EP2041285B1; MX2008016420A; CA2656707A1; CN101528928A; CA2656707C; WO2007148121A3; BRPI0713341A2; EP2041285A2; GB0612538D0; ATE528399T1; WO2007148121A2; BRPI0713341B1

Abstract

Предложена молекула нуклеиновой кислоты, включающая последовательность, указанную в SEQ ID NO:1, соответствующую последовательность белка, указанную в SEQ ID NO:2, и их варианты и функциональные фрагменты. Также предложены соответствующие химерные гены, векторы и микроорганизмы. Белок участвует в разложении длинноцепочечных н-алканов, и его можно использовать для модификации свойств субстратов, содержащих длинноцепочечные н-алканы. Также предложены способы применения белка по этому изобретению, например, для того, чтобы вызывать разложение длинноцепочечных н-алканов, а также способы идентификации ферментов, необходимых для метаболизма какого-либо субстрата.

Description

Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые кодируют ферменты, участвующие в метаболизме твердых компонентов неочищенной нефти, кодируемым ферментам, бактериям, содержащим такие молекулы нуклеиновой кислоты и кодируемые ферменты, и способам применения таких бактерий и ферментов с целью биологического разложения восков, присутствующих в нефти, в частности, для снижения температуры потери текучести нефти, например, в промышленных процессах.

Для того, чтобы оптимизировать извлечение нефти в промышленных способах получения нефти, выгодно снижать вязкость нефти так, что нефть становится способной легко течь. Когда нефть может течь, ее можно более легко нагнетать и перемещать и более легко извлекать из геологических формаций. Снижение вязкости нефти должно также помогать в удалении любой нежелательной нефти с почвы, когда она присутствует в качестве загрязнителя. Однако такого снижения вязкости трудно достичь, особенно в холодных областях, таких как Арктика и Антарктика, и в областях, где получают нефть, имеющую содержание н-алканов, которое делает температуру потери текучести нефти высокой, таких как Азербайджан.

В попытках преодолеть эти проблемы, в настоящее время используют различные методики, такие как применение ингибиторов отложения воска или применение нагреваемых труб для транспортировки неочищенной нефти. Однако эти применяемые в настоящее время способы являются дорогими в осуществлении и сложными в логистическом отношении для доставки на место.

Как упомянуто выше, особенно важны попытки препятствовать эффектам, которые возникают из-за высокого содержания длинноцепочечных н-алканов в неочищенной нефти, особенно в областях, где нефть от природы богата длинноцепочечными н-алканами. Температура плавления у алканов с более длинной цепью выше, чем у алканов с более короткой цепью, и они образуют твердые вещества при более высоких температурах. С10-С20 н-Алканы в общем, являются жидкими, но это также зависит от конкретных условий, которым подвергают эти алканы, например, от температур, которым их подвергают.

Вместо внедрения корректирующих способов справляться с вредными эффектами высокого содержания н-алканов может быть возможным в обход некоторых или всех этих проблем путем разложения длинноцепочечных н-алканов, например, в неочищенной нефти. Эстерификация н-алканов, которая тоже может происходить во время разложения, также влияет на вязкость нефти (и имеет дополнительное преимущество повышения топливной отдачи нефти). Также известно, что привлекательным является превращение соединений нефти в активированные промежуточные соединения, например, для полимерной и общей химической промышленности, потому что функционализация углеводородов химическими способами является сложной, затратной по энергии и вредной для среды. Действительно, желательны новые промышленные синтетические способы для трудно синтезируемых комплексных молекул, таких как вторичные метаболиты (стероиды, поликетиды, терпены и т.д.) и фармацевтических и агрохимических промежуточных соединений.

Аэробное и неаэробное разложение н-алканов является широко распространенным явлением в природе, и некоторые микробные штаммы и ферменты, участвующие в аэробном разложении н-алканов, выделены и изучены довольно подробно (рассмотрено в уап Вейеп аий ЕннНоГГ. 2005, Сигг Ορίη Вю1ее11ηοΐ, 16(3): 308-14), например, цитохром Р450, монооксигеназа и диоксигеназа. В частности, охарактеризованы ферменты, разлагающие короткоцепочечные н-алканы, и, таким образом, существуют встречающиеся в природе ферменты, которые потенциально могут использоваться для разложения таких короткоцепочечных н-алканов.

Алкановые молекулы являются химически инертными и должны быть активированы для возможности дальнейших метаболических стадий. Хорошо исследован один из путей аэробного разложения коротко- и среднецепочечных алканов. В этом пути связанная с мембраной монооксигеназа А1кВ (которая также известна как А1кМ) исходно активирует алканы, окисляя их с образованием соответствующих первичных спиртов. Дальнейшие стадии (осуществляемые алкогольдегидрогеназами, альдегиддегидрогеназами и ацил-КоА-синтетазой) вызывают окисление получившихся спиртов и альдегидов до жирных кислот и поступление жирных кислот в путь β-окисления.

Хотя известно множество ферментов, разлагающих н-алканы, они главным образом являются ферментами, разлагающими короткоцепочечные н-алканы. Желательны дополнительные ферменты, разлагающие н-алканы (то есть, ферменты, которые катализируют одну или более чем одну стадию, которые включает в себя разложение н-алканов, как определено здесь), в частности те, которые могут разлагать длинноцепочечные н-алканы. В частности, очень желательны ферменты, которые могут разлагать длинноцепочечные н-алканы, имеющие 26 или более, 28 или более или 30 или более атомов углерода, и ферменты и микроорганизмы, содержащие такие ферменты, можно применять в способах добычи нефти.

Однако идентификация таких ферментов трудна. Для идентификации ферментов, ответственных за определенный фенотип, эффективным способом является комбинация случайного транспозонного мутагенеза и тщательная стратегии селекции, и он имеет широкое применение (рассмотрено в Науек, 2003, Аппиа1 Яеу1е\у оГ Сепейек 37: 3-29). Тем не менее, в настоящее время нет способа специфичной селекции для идентификации ферментов, участвующих в метаболизме твердых компонентов неочищенной нефти (например длинноцепочечных н-алканов). Таким образом, также желательны способы идентификации

- 1 020184 бактерий, утилизирующих длинноцепочечные н-алканы, и конкретных ферментов в этих бактериях, которые отвечают за это свойство.

В работе, приведшей к этому изобретению, изобретатели идентифицировали бактериальный штамм, способный использовать н-алканы с длиной цепи в диапазоне от декана (С₁₀Н₂2) до тетраконтана (С₄₀Н₈₂) в качестве единственного источника углерода. Это штамм изолировали при использовании системы для скрининга микроорганизмов, способных расти на парафине (смешанные длинноцепочечные налканы). Изолят, идентифицированный в соответствии с его последовательностью 16Б-рРНК как Асше1оЬас1ег уепейапи5, обозначен как Асше1оЬас1ег 5р. Ό8Μ17874. Штамм Ό8Μ17874 был депонирован в Ό8ΜΖ в открытой коллекции (номер депонирования Ό8Μ17874 на Μίιηιηί Тйгопе-НоШ), а также на условиях Будапештского договора 20 июня 2007 на Б1а1оП АБА, под номером доступа Ό8Μ19446.

При использовании этого штамма было показано, что паралоги аП/Μ (а1кΜа, ;·111<ΜΕ) играют центральную роль в утилизации алканов от С10 до С18.

Это было достигнуто получением и анализом роста мутантов Асте1оЬас1ег 5р. Ό8Μ17874 (обозначены в Т11гопе-Но151 е1 а1., 2006 как А. уепеДапи5 6А2) с нарушенными генами а1кΜа и а1кΜЬ и двойного мутанта а1кΜа/а1кΜЬ (Тйгопе-Но151 е1 а1., 2006 Арр1 Μ^ι^^Ι Вю1ес11по1 73(10):3327-32). Однако, поскольку двойные мутанты и оба мутанта по одному гену были способны расти на н-алканах с длинами цепи С20 и длиннее, был сделан вывод, что в Асте1оЬас1ег 5р. Ό8Μ17874 должен существовать по меньшей мере еще один дополнительный фермент для утилизация этих н-алканов.

Для идентификации дополнительных ферментов в Асте1оЬас1ег 5р. Ό8Μ17874, которые ответственны за использование н-алканов с длинами цепи больше чем С20, был разработан новый высокопроизводительный способ. В этом новом способе генерировали мутантные штаммы Асте1оЬас1ег 5р. Ό8Μ17874 и выращивали их на планшетах при использовании длинноцепочечного алкана в качестве источника углерода (например, н-алкана С32), внесенного в виде порошка. Жизнеспособные клоны идентифицировали ш 5Йи окрашиванием хлоридом йоднитротетразолия (ΙΝΤ), и ущербные по росту клоны подвергали стадии контрселекции, например, на ацетате и короткоцепочечных алканах. Только те клоны, которые были ущербными по росту на длинноцепочечных алканах и которые могли расти на альтернативном субстрате, анализировали для идентификации генов, которые мутировали в этих клонах и которые, следовательно, нужны для роста на длинноцепочечных н-алканах. Это способ является особенно полезным, поскольку исходный штамм может расти как на субстрате С32, так и на альтернативном субстрате. Как таковое, присутствие стадии контрселекции (то есть, стадии идентификации клонов, которые растут на альтернативной субстанции, но не могут расти на С32) удаляет из исследования любые мутантные штаммы, которые имеют мутации, влияющие на другие пути, чем те, которые нужны для роста на субстрате, представляющем собой н-алкан С32 (то есть, мутации, который влияют на общую жизнеспособность клеток). Другими словами, если мутантный штамм может расти на альтернативном субстрате, но не на субстрате, представляющем собой длинноцепочечный н-алкан, тогда как исходный штамм мог расти на обоих, мутированный ген, вероятно, представляет интерес, поскольку он специфично влияет на способность штамма расти на субстрате, представляющем собой длинноцепочечный налкан (например С32).

Указанный способ использовали для идентификации гена а1тА, который, как было показано, необходим для роста Асте1оЬас1ег 5р. Ό8Μ17874 на длинноцепочечных алканах, таких как С32 и С36, но не нужен для роста на других субстратах (например С16, С20 или С4). Эти признаки показывают, что А1тА играет центральную роль в утилизации н-алканов С32 и С36.

Последовательность нуклеиновой кислоты гена а1тА указана в БЕО ΙΌ N0:1 (фиг. 6), тогда как последовательность кодируемого белка представлена в БЕО ΙΌ N0:2 (фиг. 7). Также идентифицирован дополнительный ген огГ1 (также обозначен здесь как а1тВ) на основании его близости к а1тА в геноме Асте1оЬас1ег 5р. ^БΜ17874. Последовательность нуклеиновой кислоты гена огГ1 (а1тВ) указана в БЕО ΙΌ N0:3 (фиг. 8), тогда как последовательность кодируемого белка представлена в БЕО ΙΌ N0:4 (фиг. 9). Локус а1тА-о1Г1 (а1тАВ) представлен в БЕО ΙΌ N0:5 (фиг. 10), и схожесть организации этой области с областью, окружающей АОА03192 в АЭР1 Асте1оЬас1ег 5р., показана на фиг. 5.

Таким образом, в этом изобретении предложена молекула нуклеиновой кислоты, предпочтительно выделенная молекула нуклеиновой кислоты, включающая или состоящая из молекулы нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из:

(1) молекулы нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, указанной в БЕО ΙΌ N0:1, 3 или 5, (2) молекулы нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 50%, предпочтительно по меньшей мере на 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98% и более предпочтительно по меньшей мере на 99% идентична последовательности молекулы нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, указанной в любой БЕО ΙΌ N0:1, 3 или 5, (3) молекулы нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с комплементом (1) в следующих условиях гибридизации: 0,1 х ББС (стандартный солевой раствор), 0,1% БЭБ (додецилсульфат натрия), 65°С; и условиях отмывки: 2хББС, 0,1% БЭБ, 65°С, с последующим 0,1хББС, 0,1% БЭБ, 65°С (условия высо

- 2 020184 кой жесткости), (4) молекулы нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с комплементом (1) в следующих условиях гибридизации: 0,2-2х88С, 0,1% 8Ό8, 55°С; и условиях отмывки: 2х88С, 0,1% 8Ό8, 55°С, с последующим 0,2-2х88С, 0,1% 8Ό8, 55°С (условия умеренной жесткости); и (5) молекулы нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, комплементарной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты по любому из (1) до (4).

Иными словами, в этом изобретении предложена молекула нуклеиновой кислоты, предпочтительно выделенная нуклеиновая кислота, включающая или состоящая из молекулы нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из:

(1) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок с аминокислотной последовательностью, указанной в 8ЕО ГО N0:2 или 4, (2) молекулы нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 50%, предпочтительно по меньшей мере на 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98% и более предпочтительно по меньшей мере на 99% идентична последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок с аминокислотной последовательностью, указанной в 8ЕО ГО N0:2 или 4, (3) молекулы нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с комплементом (1) в следующих условиях гибридизации: 0,1х88С, 0,1% 8Ό8, 65°С; и условиях отмывки: 2х88С, 0,1% 8Ό8, 65°С, с последующим 0,1х88С, 0,1% 8Ό8, 65°С (условия высокой жесткости), (4) молекулы нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с комплементом (1) в следующих условиях гибридизации: 0,2-2х88С, 0,1% 8Ό8, 55°С; и условиях отмывки: 2х88С, 0,1% 8Ό8, 55°С, с последующим 0,2-2х88С, 0,1% 8Ό8, 55°С (условия умеренной жесткости) и (5) молекулы нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, комплементарной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты по любому из (1) до (5).

В случае 8ЕО ГО N0:1 или последовательности, кодирующей 8Е0 ГО N0:2, уровень идентичности последовательности представляет собой предпочтительно по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95, 98% и более предпочтительно по меньшей мере 99%.

Предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты кодирует белок, который играет роль в разложении длинноцепочечных н-алканов, более предпочтительно роль в разложении н-алканов, имеющих 28 или более или 30 или более атомов углерода (например, С30-С36).

Этот фермент может катализировать концевую и/или субконцевую модификацию алкана, например он может осуществлять окисление (моно- или диоксигеназа), например алкана в спирт. Продукты таких модификаций алкана могут включать в себя спирты, альдегиды, кислоты или сложные эфиры.

Активность кодируемого белка можно альтернативно или дополнительно определять одним или более чем одним следующим способом.

Было показано, что после экспозиции субстрата, содержащего длинноцепочечный н-алкан, кодируемому белку можно обнаружить образование спиртов, кислот и/или сложных эфиров. В некоторых случаях наблюдали эстерификацию до 70% субстрата. Это является выгодным, поскольку увеличивает топливную отдачу субстрата. Как таковую, в одной из альтернатив, активность кодируемого белка можно определять как вызывающую образование спиртов, кислот и/или сложных эфиров из н-алкана, предпочтительно из длинноцепочечного н-алкана, более предпочтительно длинноцепочечного н-алкана, имеющего по меньшей мере 26 или по меньшей мере 30 атомов углерода. Такие взаимодействия могут включать в себя снижение длины цепи н-алкана, или длина цепи может оставаться той же.

Эту активность можно измерять экспонированием надлежащего субстрата кодируемому белку. Это можно осуществить с использованием очищенного белка или микроорганизма, который способен предоставлять указанный белок, или клеточного экстракта такого микроорганизма, за время и в условиях, которые делают возможными эти взаимодействия. Подходящие условия взаимодействия являются, например, такими, как указано в Маеид с1 а1, 1996 1. Вае1епо1. 178 (13): 3695. Например, субстрат (например н-алкан С32, например 100 мкМ, добавленный к 100 мл 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,5), содержащим 1 мг детергента Р1укшТ А210О (Όαίίοΐιί Кодуо 8еиуаку, Куо1о, 1араи)) можно смешать с надлежащим количеством фермента и инкубировать при приблизительно 30 °С в течение 3 мин при встряхивании.

Можно измерять либо потребление субстрата, либо образование продуктов, например, с помощью газовой хроматографии (ГХ) или газовой хроматографии/масс-спектрометрии (ГХ/МС). Таким образом, можно оценивать потребление субстрата, образование одного или более чем одного продукта и/или весь профиль или фингерпринт субстрата. Например, превращение алканов в соответствующие первичные спирты можно измерять с помощью ГХ и ГХ/МС, как это сделано у Ееид е1 а1., 2007 РNА8 104:56025607, где использовали реакционные смеси, содержащие 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,5), 1 мМ гексадекана (или других индивидуальных алканов), по 1 мМ каждого ХАЭН и Мд80₄ и адекватное количество тестируемого фермента. Смесь без фермента использовали в качестве контроля. Эти смеси инкубировали при 60°С при встряхивании в течение 5 мин и затем экстрагировали циклогексаном, и алкановые остатки в экстракте анализировали с помощью ГХ. Идентификацию продукта этого взаимодействия осуществляли с помощью ГХ/МС. Удельную активность выражали в единицах/мг фермента. Одну единицу активно

- 3 020184 сти фермента можно определить как количество фермента, которое катализирует потребление 1,0 мкмоль субстрата в этих условиях. Предпочтительно по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% субстрата потреблено или превращено в продукт после такого инкубирования.

Подходящий клеточный экстракт можно получать путем суспендирования промытых клеток в буфере (например 50 мМ Трис-С1) и разрушения клеток ультразвуком. Неочищенный экстракт или супернатант, полученный из экстракта, можно затем использовать в качестве источника фермента.

В дополнительной альтернативе активность кодируемого белка можно определять как способность снижать температуру потери текучести субстрата, содержащего н-алкан, такого как неочищенная нефть.

Температуру потери текучести определяют как температуру, при которой жидкость прекращает течь, то есть самую низкую температуру (в °Б или °С), при которой жидкость остается переливаемой (то есть, все еще ведет себя как жидкость). Как отмечено выше, в нефтепродуктах температуру потери текучести обычно повышает высокое содержание парафина (или весьма длинноцепочечного н-алкана). Высокие значения температуры потери текучести обычно имеют место в неочищенных нефтепродуктах, которые имеют значительное содержание парафина. Парафины (или воски) должны начинать осаждаться при снижении температуры. В некоторой точке выпавшие в осадок продукты накапливаются до того, что жидкость больше не может течь. Температуру потери текучести для нефти можно определять способами, указанными в тесте ΆδΤΜ Ό-97 на температуру потери текучести, в котором температуру потери текучести определяют как такую температуру, при которой нефть прекращает течь, когда пробу держат под 90° вертикально в течение пяти секунд.

Выгодно снижать температуру потери текучести субстрата, такого как неочищенная нефть, так, чтобы он становился менее вязким и, следовательно, его было легче транспортировать и извлекать. Снижение температуры потери текучести субстрата даже в малой степени может влиять на способность субстрата течь и, следовательно, на способность транспортировать и извлекать этот субстрат.

Как таковую, температуру потери текучести субстрата, содержащего н-алканы, можно измерять до и после экспозиции субстрата белку, который, как полагают, имеет общую активность с А1тА, за время и в условиях, которые достаточны для модификации температуры потери текучести указанного субстрата, и, если температура застывания была снижена, считают, что белок имеет общую активность с белком А1тА. Предпочтительно, температуру потери текучести снижают по меньшей мере на 0,1, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или более градусов.

Упомянутые выше тесты можно также осуществлять параллельно с экспозицией того же субстрата ферменту А1тА, и степень или количество образования продукта, или потребления субстрата, или изменения температуры потери текучести, которые вызывает экспозиция белку, можно сравнивать, с тем, что достигают с этим ферментом. Предпочтительно потребляется по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90% н-алканового субстрата при сравнении со степенью потребления, которую достигают после экспозиции того же субстрата белку, кодируемому геном а1тА, за то же время в тех же условиях. Альтернативно или дополнительно получают по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90% продукта при сравнении с количеством продукта (например, одного или более чем одного спирта, кислоты или сложного эфира), которое достигают после экспозиции того же субстрата белку, кодируемому геном а1тА, за то же время в тех же условиях. Альтернативно, снижение температуры застывания представляет собой по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90% того, что достигают после экспозиции того же субстрата белку, кодируемому геном а1тА, за то же время в тех же условиях.

В дополнительной альтернативе активность кодируемого фермента можно описать как способность к комплементации мутации в гене а1тА Асше1оЬас1ег кр. Ό8Μ17874, то есть, способность к комплементации мутации, ведущей к инактивации гена, кодируемого или соответствующего 8ЕО Ш N0: 1 в Асше1оЬас1сг кр. Ό8Μ17874. Авторы настоящего изобретения показали, что этому штамму продукт гена а1тА нужен для способности расти, когда единственным предоставленным источником углерода является налкан С32. Подходящий анализ для определения жизнеспособности или способности конкретного штамма расти на н-алкане С32 также раскрыт здесь в другом месте, хотя альтернативно можно использовать любой подходящий способ определения жизнеспособности или роста клеток. Белки, которые имеют общую каталитическую функцию с ферментом, кодируемого а1тА, следует считать способными к комплементации мутации в а1тВ штамма Ό8Μ17874 Асше1оЬас1ег кр., который иначе не может расти на субстрате, представляющем собой длинноцепочечный н-алкан, такой как н-алкан С32.

Наличие или отсутствие этой способности у белка, который считают имеющим общую каталитическую активность с А1тА и/или 0гН (А1тВ), можно легко тестировать экспрессией гена, который кодирует этот белок, в мутантном штамме микроорганизма, который не содержит функциональный ген а1тА и/или ген огГ1 (а1тВ) и который не может расти на субстрате, представляющем собой н-алкан С32, (например при использовании штамма Ό8Μ17874 Асше1оЬас1ег кр., в котором ген а1тА и/или ген огГ1 (а1тВ) был разрушен, удален или иным образом изменен так, что это предотвращает экспрессию функционального белка А1тА и/или 0гГ1 (А1тВ)). Поскольку генные последовательности для этих двух белков сейчас известны, это можно делать очевидным образом (см. например Т11гопе-Но1к1 Μ е1а1. 2007 Арр1 Еиу1гои Μ^с^оЬ^о1. 73(10):3327-32).

- 4 020184

Г еном, кодирующим белок, который считают имеющим общую каталитическую активность с А1тА и/или А1тВ, можно трансфецировать мутантный штамм, или можно ввести этот ген в него при использовании стандартных методик, которые известны в данной области. Его необходимо поместить под контроль надлежащего промотора и/или других регуляторных последовательностей так, что он экспрессируется в мутантном микроорганизме.

Затем после определенного периода времени можно определить комплементацию или отсутствие комплементации мутации экзогенным геном в мутантном штамме, то есть, определить, сделала ли экспрессия мутантный штамм жизнеспособным для роста на субстрате, представляющем собой н-алкан С32, и компенсировала ли она отсутствие функционального А1тА и/или ОгГ1 (А1тВ). Это можно осуществить тестированием признаков бактериального роста на субстрате, представляющем собой н-алкан С32. Если экспрессия экзогенного белка позволяет мутантным штаммам выживать, то есть, она может компенсировать отсутствие экспрессии функционального А1тА, говорят, что экзогенный белок осуществил комплементацию мутации. Г ены, чья экспрессия может приводить к комплементации мутации в гене а1тА, например, в штамме Ό8Μ17874 Асше1оЬас1ег8р. (например, штамме МАУ1, описанном в примерах), считают имеющими общую активность с белком А1тА. Гены, чья экспрессия может приводить к комплементации мутации в гене огГ1 (а1тВ), например, в штамме Ό8Μ17874 Асше1оЬас1ег 5р.. считают имеющими общую активность с белком огГ1 (А1тВ).

Это изобретение также охватывает функциональные фрагменты указанных молекул нуклеиновой кислоты, под чем подразумевают фрагменты, которые кодируют белок, который имеет ту же или, по существу, ту же активность (например, каталитическую или ферментативную активность), какую имеет полноразмерный белок, как определено выше. Тесты для определения того, имеет ли белок, кодируемый таким фрагментом, такую же или, по существу, такую же активность (например, каталитическую или ферментативную активность), как и полноразмерный белок, определенный выше, включают в себя обсужденные выше. В норме эти функциональные фрагменты должны иметь только малые делеции молекул нуклеиновых кислот относительно полноразмерных молекул нуклеиновых кислот, например делеции менее чем 50, 40, 30, 20 или 10 нуклеотидов, например, на 5'-конце, кодирующем Ν-конец белка, 3'конце, кодирующем С-конец белка, или внутри кодирующей области, хотя более крупные делеции, например, по меньшей мере 60, 70, 80, 90,100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 нуклеотидов, или делеции менее чем 60, 70, 80, 90,100,150, 200, 300, 400, 500, 600,700, 800, 900 или 1000 нуклеотидов также можно осуществлять, если фрагмент имеет ту же или, по существу, ту же активность (например, каталитическую или ферментативную активность), как и полноразмерный белок, как определено выше.

Активность кодируемого белка можно легко тестировать для определения того, может ли он иметь общую активность с полноразмерным белком, например, как указано выше.

Более короткие фрагменты молекулы нуклеиновой кислоты по этому изобретению можно использовать как зонды, например для способов ПЦР или гибридизации. Более короткие фрагменты могут быть, например, 10-30, 20-25 нуклеотидов в длину. Такие зонды полезны в способах идентификации дополнительных молекул нуклеиновой кислоты, которые имеют гомологию с молекулами нуклеиновой кислоты по этому изобретению.

Термин молекула нуклеиновой кислоты при использовании здесь относится к полимеру РНК или ДНК, который представляет собой единичную или двойную цепь, возможно включающему в себя синтетические, неприродные или измененные нуклеотидные основания. Примеры таких полинуклеотидов включают в себя кДНК, геномную ДНК и двухцепочечную РНК, среди прочего. Предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты представляет собой ДНК.

При том, что последовательности нуклеиновой кислоты, упомянутые здесь, содержат тимидиновые (1) нуклеотиды, будет понятно, что это изобретение также относится к соответствующим последовательностям, где тимидин заменен уридином (и).

Разложение длинноцепочечных н-алканов означает ферментативное применение длинноцепочечного н-алкана, как описано здесь, в качестве источника углерода. По альтернативному определению, оно означает ферментативное окисление длинноцепочечного н-алкана или ферментативное превращение молекулы длинноцепочечного н-алкана в алкан, имеющий более короткую длину цепи. Разложение алканов может приводить к образованию сложных эфиров, альдегидов, спиртов и/или кислот.

Разложение может, таким образом, содержать или включать в себя одну или более чем одну стадию окисления или взаимодействия н-алкана, например, для превращения н-алкана в спирт, альдегид, кислоту или сложный эфир. Превращение может приводить к спирту, альдегиду, кислоте или сложному эфиру, имеющему такую же длину цепи, какую имеет н-алкан до разложения, или это может приводить к продукции молекулы, имеющей меньше атомов углерода, чем имеет н-алкан до разложения.

н-Алкан означает алкан с прямой цепью. Длинноцепочечный н-алкан означает н-алкан, имеющий 20 или более чем 20 атомов или молекул углерода, например 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 или более атомов углерода. Предпочтительными длинноцепочечными алканами являются те, которые имеют 26 или более атомов углерода, или 32 или более атома углерода (например 26-36, 2834 или 30-32 молекул углерода). Напротив, среднецепочечные н-алканы представляют собой н-алканы,

- 5 020184 имеющие от 11 до 20 атомов углерода, и короткоцепочечные алканы имеют 1-10 атомов углерода. Длинноцепочечные н-алканы также иногда называют парафинами.

Это изобретение также относится к вариантам молекул нуклеиновой кислоты, определенной выше. Термин вариант включает в себя молекулы нуклеиновой кислоты, которые имеют единственные или множественные изменения нуклеотидов при сравнении с молекулами нуклеиновой кислоты по этому изобретению. Например, варианты могут иметь 1, 2, 3, 4 или 5 добавлений, замен, вставок или делеций одного или более чем одного нуклеотида.

Это изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, чьи последовательности являются вырожденными относительно последовательностей по этому изобретению, то есть, к молекулам, чьи последовательности содержат изменения нуклеотидов, которые не приводят к изменению в кодируемой аминокислотной последовательности. Однако в общем, такие варианты и вырожденные молекулы удовлетворяют критериям последовательности, которые указаны выше.

В дополнительном аспекте в этом изобретении предложен белок, включающий или состоящий из последовательности аминокислот, выбранной из группы, состоящей из:

(1) аминокислотной последовательности, указанной в 8ЕО Ш N0:2 или 4, или (2) аминокислотной последовательности, которая идентична по меньшей мере на 50%, предпочтительно по меньшей мере на 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98% и более предпочтительно по меньшей мере на 99% аминокислотной последовательности, указанной в 8ЕО Ш N0:2 или 4.

Эта аминокислотная последовательность предпочтительно идентична по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% аминокислотной последовательности, указанной в 8Е0 Ш N0:2.

Этот белок можно альтернативно определить с учетом последовательностей кодирующих нуклеиновых кислот и, как таковой, белок по этому изобретению может кодировать любая молекула нуклеиновой кислоты по этому изобретению, описанная выше.

Это изобретение также включает функциональные фрагменты указанных белковых молекул, что означает фрагменты, которые имеют ту же или, по существу, ту же активность, что и полноразмерные белки, определенные выше, то есть, их надо считать функционально эквивалентными вариантами. Как отмечено здесь в другом месте, на это свойство можно тестировать различными способами прямым образом. В норме эти функциональные фрагменты должны иметь только малые делеции относительно полноразмерной белковой молекулы, например, менее чем 50, 40, 30, 20 или 10 аминокислот, хотя, как отмечено выше в связи с молекулами нуклеиновой кислоты, подходящими могут быть делеции большего размера, например до 60, 70, 80, 90,100,150, 200 аминокислот или по меньшей мере 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 аминокислот. Во всех случаях фрагменты должны иметь ту же или, по существу, ту же активность, что и полноразмерные белки, определенные выше, то есть, их надо считать функционально эквивалентными вариантами. Эти делеции могут быть на Ν-конце, С-конце, или они могут быть внутренними делециями.

Белок по этому изобретению, определенный выше, включает в себя варианты конкретных указанных последовательностей, то есть, последовательности, имеющие определенные уровни идентичности последовательности указанным последовательностям. Такие варианты могут быть встречающимися в природе вариантами, такими как сравнимые белки или гомологи, найденные в других видах, или, более конкретно, варианты, найденные в других микроорганизмах (которые имеют общие функциональные свойства с кодируемым белком, как определено здесь в другом месте).

Варианты встречающегося в природе белка, как определено здесь, можно также получать синтетическим путем, например, при использовании стандартных методик молекулярной биологии, которые известны в данной области, например, стандартных методик мутагенеза, таких как направленный или случайный мутагенез (например, при использовании генной перестановки или подверженной ошибкам ПЦР). Такие методики мутагенеза можно использовать для разработки ферментов, которые имеют улучшенные или иные каталитические свойства.

Таким образом, в еще дополнительном аспекте этого изобретения предложен способ идентификации остатков в разлагающем длинноцепочечные н-алканы белке, как определено здесь, который важен для осуществления разложения длинноцепочечных н-алканов, включающий стадии:

(1) мутации или иного изменения одного или более аминокислотных остатков в разлагающем длинноцепочечные н-алканы белке и (2) тестирования влияния этих мутаций или изменений на свойство разложения длинноцепочечных н-алканов.

В таком способе стадию (2) можно осуществлять путем оценки способности мутированного или иным образом измененного белка, разлагающего длинноцепочечные н-алканы, вызывать разложение субстрата, представляющего собой длинноцепочечный н-алкан, например, при использовании способов и анализов, описанных здесь в другом месте. Способность мутированного или иным образом измененного белка, разлагающего длинноцепочечные н-алканы, вызывать разложение длинноцепочечных налканов можно затем сравнивать относительно немутированного или иным образом измененного белка, разлагающего длинноцепочечные н-алканы. Таким образом, свойства мутированного или иным образом

- 6 020184 измененного белка, разлагающего длинноцепочечные н-алканы, например, продукцию различных продуктов, потребление субстратов и способность модифицировать температуру потери текучести субстрата, содержащего н-алканы, можно сопоставлять прямо с последовательностью дикого типа или исходной последовательностью, из которой произведен мутированный или иным образом измененный белок, разлагающий длинноцепочечные н-алканы.

В таких способах мутации могут не иметь влияния на свойства разложения или могут улучшать или снижать, или ингибировать влияние на разложение. Остатки, которые, когда они мутированы, имеют положительное или отрицательное влияние на свойства разложения, затем идентифицируют как важные для функции. В зависимости от предложенного применения белка, разлагающего длинноцепочечные налканы, такие остатки либо представляют собой цели для дополнительной мутации (см. ниже), либо идентифицируются как остатки, которые должны быть сохранены в немодифицированной форме для того, чтобы сохранить важное функциональное свойство разложения длинноцепочечных н-алканов.

Поэтому при альтернативном рассмотрении предложен способ получения белка, разлагающего длинноцепочечные н-алканы, с улучшенной или повышенной способностью вызывать разложение длинноцепочечного н-алкана.

В настоящем изобретении дополнительно предложен способ идентификации, разработки или получения других белков, разлагающих длинноцепочечные н-алканы, или их вариантов, которые имеют способность действовать на другие субстраты/полимеры, включающий стадии:

(1) получения или иного предоставления белка, разлагающего длинноцепочечные н-алканы, как определено здесь, (2) мутирования или иного изменения одного или более чем одного аминокислотного остатка в белке, разлагающем длинноцепочечные н-алканы, (3) оценки способности указанного мутированного или измененного белка, разлагающего длинноцепочечные н-алканы, разлагать или усиливать разложение субстрата, представляющего интерес, (4) идентификации мутированных или измененных белков, разлагающих длинноцепочечные налканы, проявляющих желаемые свойства.

Подходящие субстраты для использования в указанных способах могут представлять собой любой субстрат, представляющие интерес, в частности любой длинноцепочечный н-алкан.

Белок, разлагающий длинноцепочечные н-алканы, используемый в этих способах, имеет свойства, определенные здесь в другом месте, и может быть вновь идентифицированным белком, разлагающим длинноцепочечные н-алканы, или может быть известной молекулой, чьи свойства разложения длинноцепочечных н-алканов стали известными только в результате применения способов и анализов по этому изобретению, определенных здесь в другом месте.

Также можно использовать производные белка, определенного здесь. Производное означает белок, описанный выше, или его вариант, который вместо встречающейся в природе аминокислоты содержит структурный аналог этой аминокислоты. Дериватизация или модификация (например, введение метки, гликозилирование, метилирование аминокислот в белке) также может иметь место постольку, поскольку не оказывает нежелательного влияния на функцию белка.

Структурный аналог означает нестандартную аминокислоту. Примерами таких нестандартных или структурных аналогов аминокислот, которые можно использовать, являются Ό-аминокислоты, изоэфиры амидов (такие как Ν-метиламид, ретроинвертированный амид, тиоамид, тиоэфир, фосфонат, кетометилен, гидроксиметилен, фторвинил, (Е)-винил, метиленамино, метилентио или алкан), Б-Νметиламинокислоты, Ό-α-метиламинокислоты, Ό-Ν-метиламинокислоты.

Идентичность последовательности можно оценивать любым удобным способом. Однако для определения степени идентичности последовательности между последовательностями полезны компьютерные программы, которые осуществляют множественные выравнивания последовательностей, к примеру, С1из!а1 (Тйотрзои, 1. Ό е! а1., 1994, СББ8ТАБ ^.: 1тргоушд 1йе зеизШуйу οί ргодгезз1уе тиШр1е зес|испсс айдитеи! 1бгоидб зесщепее те1дббид, розйюи-зресШе дар реиаШез аиб \уещ1И табзх сНоюе. Νυс1е1с Ас1б Вез 22: 4673-4680). Программы, которые сопоставляют и выравнивают пары последовательностей, такие как АБ-ΙΟΝ (Е. Муегз аиб МШег, 1988, Орбса1 АбдитеШз т Бтеаг Зрасе, САВ1ОЗ 4:1117), БАЗТА (\У.В Реагзои аиб Ό.Τ Ыртаи, 1988, 'Ттргоуеб !оо1з Бог Ью1одюа1 зесщеисе аиа1уз1з, ΡΝΑ3 85:2444-2448, аиб \У.В Реагзои, 1990, Вар1б аиб зеизШуе зециеисе сотрапзои \\61ι БАЗТР аиб БАЗТА МеИобз 1и Епхуто1оду 183:63-98) и учитывающая пробелы программа ВБА8Т (А11зсйи1. 8.Б. е! а1., 1997, Сарреб ВБА8Т аиб Р81-ВБА8Т: а иеху деиегабои оГ рго!еш ба!аЬазе зеагсб ргодгатз. ШсШс Ас1б Вез. 25: 3389-3402), также полезны для этой цели. Более того, сервер Иаб при Европейском институте биоинформатики (Еигореаи ВюшГогтабсз 1изб1и1е) предлагает выравнивание последовательностей белков на основе их структуры (Но1т, 1993, Б. Мо1. Вю1оду, 233: 123-38; Но1т, 1995, Тгеибз т Вюсйет1са1 Зстеисез, 20: 478-480; Но1т, 1998, ШсШс Ас1б Везеагсб, 26: 316-9).

Множественные выравнивания последовательностей и вычисления процента идентичности предпочтительно осуществлять при использовании стандартных параметров ВБА8Т (при использовании последовательностей из всех доступных организмов, табзх В1озит 62, дар соз!з: ех1з1еисе 11, ехЮизюи 1).

В дополнительном воплощении этого изобретения предложен химерный ген, содержащий изолиро

- 7 020184 ванную молекулу нуклеиновой кислоты по этому изобретению, функциональным образом связанную с одной или более чем одной подходящей регуляторной последовательностью. Предпочтительно одна или более регуляторные последовательности представляют собой гетерологичные регуляторные последовательности, например гетерологичный промотор.

В контексте этого изобретения термин функциональным образом связаны относится к ассоциации двух или более чем двух молекул нуклеиновой кислоты на одном фрагменте нуклеиновой кислоты, так что функция одной находится под влиянием другой. Например, промотор функциональным образом связан с кодирующей последовательностью, когда он способен влиять на экспрессию этой кодирующей последовательности (то есть, кодирующая последовательность находится под транскрипционном контролем промотора). Кодирующие последовательности могут быть функциональным образом связаны с регуляторными последовательностями в смысловой или антисмысловой ориентации.

Термин регуляторные последовательности относится к нуклеотидным последовательностям, которые локализованы перед (5'-некодирующие последовательности), в пределах или после (3'некодирующие последовательности) кодирующей последовательности и влияют на транскрипцию, процессинг или стабильность РНК или трансляцию ассоциированной с ними кодирующей последовательности. Регуляторные последовательности могут включать в себя промоторы, операторы, энхансеры, лидерные последовательности трансляции, интроны и последовательности распознавания полиаденилирования.

При использовании здесь термин промотор относится к нуклеотидной последовательности, способной контролировать экспрессию кодирующей последовательности или РНК. В общем, кодирующая последовательность находится с 3'-стороны от промоторной последовательности. Промоторы могут полностью происходить из нативного гена или они могут состоять из разных элементов, происходящих из разных промоторов, находимых в природе, или даже содержать синтетические нуклеотидные сегменты. Специалисты должны понимать, что разные промоторы могут управлять экспрессией гена в разных типах тканей или клеток, или на разных стадиях развития, или в ответ на разные условия среды. Промоторы, которые вызывают экспрессию фрагмента нуклеиновой кислоты в большинстве типов клеток в большинстве моментов времени, в общем обозначают как конститутивные промоторы. Далее признано, что, поскольку в большинстве случаев точные границы регуляторных последовательностей определены не полностью, фрагменты нуклеиновой кислоты разных длин могут иметь идентичную промоторную активность.

В дополнительном воплощении этого изобретения предложен вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по этому изобретению, работоспособным образом связанную с одной или более чем одной подходящей регуляторной последовательностью.

Можно конструировать векторы, содержащие пример изолированной молекулы нуклеиновой кислоты по этому изобретению (или химерный ген по этому изобретению). Выбор вектора зависит от способа, который надо использовать для трансформации клеток-хозяев, от способа, который используют для экспрессии белка, или от другого намеченного применения вектора. Специалист хорошо осведомлен о генетических элементах, которые должны присутствовать на векторе для того, чтобы успешно трансформировать, подвергать селекции и размножать клетки-хозяева, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты или химерный ген по этому изобретению. Специалист также должен понимать, что разные независимые случаи трансформации должны приводить к разным уровням и паттернам экспрессии и, таким образом, что множественные случаи надо подвергать скринингу для получения линий, проявляющих желаемый уровень и паттерн экспрессии. Такой скрининг можно осуществлять §ои1йетп-анализом ДНК, Ыот1йегп-анализом экспрессии мРНК, ^ейетп-анализом экспрессии белка, среди прочего.

В этом изобретении дополнительно предложены микроорганизмы, которые содержат одну или более чем одну молекулу нуклеиновой кислоты по этому изобретению и, следовательно, способны экспрессировать один или более чем один белок по этому изобретению. Такие микроорганизмы могут быть встречающимися в природе микроорганизмами, или еще они могут быть подвергнуты генетическим манипуляциям, чтобы содержать надлежащую молекулу нуклеиновой кислоты по этому изобретению, или генетический конструкт, содержащий надлежащую молекулу нуклеиновой кислоты, или химерный ген по этому изобретению, например, в форме вышеописанных векторов по этому изобретению.

Примером микроорганизма, содержащего молекулы нуклеиновой кислоты по этому изобретению, который естественным путем экспрессирует эти молекулы нуклеиновой кислоты, является штамм Ό8Μ17874 Лс1пе1оЬас1ег ер. (депонирован как Ό8Μ 17874 31 января 2006 в ЭеЩвсНе §ашш1ипд νοη М1ктоотдапщшеп ипй 2е11ки11итеп СшЬН (Германская коллекция микроорганизмов и клеточных культур)). Этот штамм также депонирован в Ό8ΜΖ на условиях Будапештского договора 20 июня 2007 на 81а(оН Ά8Ά под номером доступа Ό8Μ19446. Таким образом, настоящее изобретение в одном из воплощений относится к штамму Ό8Μ17874 Лсше1оЬас1ег ер. (депонирован как Ό8Μ 17874 и как Ό8Μ 19446).

Дополнительным примером микроорганизма, который содержит одну из молекул нуклеиновой кислоты по этому изобретению, является вид Рвеийошопав. депонированный как ТСС55024. Как обсуждено в примерах, штамм М1 Лсше1оЬас1ег ер. и Лсше1оЬас1ег ер. РАС также содержат молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую высокие уровни идентичности последовательностей с 8ЕО ΙΌ N0:1. Такие микроор

- 8 020184 ганизмы можно описать как эндогенно содержащие одну или более чем одну молекулу нуклеиновой кислоты по этому изобретению.

В другом альтернативном воплощении микроорганизм не представляет собой Асше!оЬас!ег 5р. Ό8Μ17874 (депонирован как Ό8Μ 17874), Асше!оЬас!ег 5р. штамм М1, Асше!оЬас!ег 5р. КАО или вид Ркеибошоиак, депонированный как ТСС55024.

Или же микроорганизмы можно подвергать генетическим манипуляциям так, что они содержат одну или более чем одну молекулу нуклеиновой кислоты по этому изобретению, и/или так, что они экспрессируют белок, кодируемый одной или более чем одной молекулой нуклеиновой кислоты по этому изобретению. В первом случае кодирующую последовательность, то есть одну или более чем одну молекулу нуклеиновой кислоты по этому изобретению, искусственно вводят в микроорганизм. Она может быть в форме одного или более химерного гена по этому изобретению или одного или более вектора по этому изобретению. Такие микроорганизмы можно описать как экзогенно содержащие одну или более чем одну молекулу нуклеиновой кислоты по этому изобретению.

В дополнительной альтернативе микроорганизм эндогенно содержит одну или более молекулу нуклеиновой кислоты по этому изобретению, но этот микроорганизм подвергнут генетическим манипуляциям так, что это изменяет экспрессию продуктов, кодируемых одной или более молекулой нуклеиновой кислоты по этому изобретению. Это можно осуществить, например, введением дополнительной копии молекулы нуклеиновой кислоты по этому изобретению под контролем другого промотора, например сильного промотора или конститутивного промотора, или генетической манипуляцией с промотором, который контролирует экспрессию нуклеиновой кислоты по этому изобретению. В обоих указанных случаях в микроорганизме присутствует генетическое вещество, которое не присутствует в эквивалентном микроорганизме природного происхождения (то есть, присутствует экзогенное генетическое вещество).

Поэтому в предпочтительном воплощении микроорганизм содержит экзогенное генетическое вещество, то есть микроорганизм является генетически модифицированным.

В общем, экзогенное генетическое вещество вводят способом трансформации. Трансформация должна в типичных случаях включать в себя плазмидный вектор, который также должен содержать ген, который делает возможным идентификацию успешно трансформированных микроорганизмов, например ген устойчивости к антибиотику (например, к ампициллину). Другие способы селекции трансформантов известны специалисту и включают в себя применение светочувствительного вектора, 1их-гена, который вызывает свечение положительных колоний в темноте. Другие подходящие носители для трансформации бактерий включают в себя космиды и молекулы бактериофагов.

Микроорганизм предпочтительно представляет собой бактерию или архею. Микроорганизмы могут быть экстремофильными, например термофильными. Подходящие микроорганизмы могут также быть галофильными и анаэробными. Подходящие примеры включают в себя серовосстанавливающие бактерии, такие как штаммы Пе5и1Гоу1Ьгю-, Пе5и1ГоЬи1Ьи5-, Эе5и1ГоЬас1ег. Ие5и1Гососси5- и т.д., разные виды Васй1и5, виды С1о51пйшш, ТйегшоапаегоЬас!ег, ТйегшоапаегоЬшш, ТйегшоЬас!его1йе5, Тйегшойе5и1ГоЬас!егшш, некоторые Р5еийошопа5 и т.д. Некоторые серовосстанавливающие бактерии могут также использовать другие метаболические пути через лактат или ацетат.

Особые соображения нужны для клонирования генов в видах Тйегши5. Для клонирования гетерологичного гена в бактерии Тйегши5 соответствующий ген надо либо (1) клонировать во вставочный вектор между последовательностями, происходящими из Тйегши5, что после трансформации должно приводить к вставке гена в хромосому гомологичной рекомбинацией, либо (2) вставить в вектор, содержащий точку начала репликации для Тйегши5. Часто используют челночные векторы, содержащие точку начала репликации как для Е. сой, так и для Тйегши5, что позволяет конструировать варианты плазмид в Е. сой с последующей трансформацией Тйегши5 получившимися вариантами плазмид. Как таковые, общепринятые способы, используемые для клонирования генов в Е. сой, применяют для создания плазмидных конструктов Тйегши5 либо для вставки, либо для репликации. Затем бактерии Тйегши5 трансформируют плазмидной ДНК, изолированной из Е. сой. Два разработанных способа трансформации Тйегши5 раскрыты ниже.

В первом использована их натуральная система трансформации, и он основан на способе Коуаша е! а1., 1986, I. Вас!егю1. 166:388-340 и Епй)оп55оп е! а1., 1999 Арр1. Епупоп. МюгоЬюй 67:3955-3964).

Свежую ночную культуру Тйегши5 разбавляют 1:100 в среде Т162 (Иедгу5е Е. е! а1., 1978, Агсй. ΜίсгоЪю1. 117:189-196). Культуру выращивают при 65°С в течение 3-4 ч в присутствии 2 мМ МдС1₂ и СаС1₂соответственно или, пока культура не достигает оптической плотности около 0,8 при 600 нм (ОИ₆₀₀).Затем 500 мкл культуры переносят в пробирку Эппендорфа.

Затем добавляют в культуре трансформирующую ДНК и встряхивают культуру при 60°С в течение 1-2 ч. Количество ДНК зависит от источника и формы ДНК. Например, можно альтернативно использовать приблизительно 200 нг ДНК, происходящей из Тйегши5, или 1-3 нг ДНК из Е.сой (клонированной ДНК).

Затем культуру охлаждают на льду приблизительно 5 мин и высевают на среду Т162 при использо

- 9 020184 вании надлежащего селекционного агента(ов) и выращивают при 60° в течение 48 ч.

Альтернативный способ основан на электропорации (например Тйегтик НВ8 и НВ27 (бе Стабо с1 а1., (1999) Ρϊ;ΐ5ΐιικΙ. 42:241-5).

Клетки выращивают экспоненциально до ΘΌ₆₀₀ около 0,8 и осаждают центрифугированием при 5000 д в течение 5 мин. Затем промывают клетки два раза в 10%-ном растворе глицерина при комнатной температуре и после второй промывки концентрируют в 10 раз. Это приводит к плотности клеток, достигающей 2х10¹⁰ (НВ8) и 5х10¹⁰ (НВ27) соответственно.

Аликвоты по 100 мкл клеток инкубируют при 4°С в течение 5 мин с 1 пг ДНК. Клетки подвергают электропорации при использовании силы тока 12,5 кВ/см (максимум) в течение импульса в 5 мс. Эти параметры идентичны условиям Вюгаб Мтсгорикег при использовании предустановленной программы Ес2 при использовании 0,2-см кюветы (см. конкретные подробности в руководстве к Вютаб МкгоРикег (Са1. Νο 165-2100) рр 4).

Клеткам дают восстанавливать их состояние в течение 2 ч при 65-70Х при аэрации и затем высевают на среду Т162 при использовании надлежащего селекционного агента(ов).

Вдобавок к вышеописанным свойствам микроорганизма возможно дополнительно манипулировать микроорганизмом для добавления или удаления ферментативных или других активностей из микроорганизма. Как отмечено выше, можно ввести дополнительный ген, кодирующий, например, белок устойчивости к антибиотику, чтобы помочь процессу селекции генетических трансформантов. Альтернативно или дополнительно, можно также ввести в микроорганизм молекулы нуклеиновой кислоты, которые предназначены влиять на разложение н-алканов или других соединений.

Как хорошо известно, введение экзогенных молекул нуклеиновой кислоты в микроорганизм может приводить к тому, что микроорганизм будет иметь активность, которую не находят в немодифицированном микроорганизме (например, если микроорганизм снабжают дополнительной активностью, такой как молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент, который не находят в немодифицированном микроорганизме), или экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты, которая предназначена для введения, можно сконструировать так, что она вмешивается в нормальную транскрипцию и/или трансляцию одного или более чем одного гена, чей продукт в ином случае должен экспрессироваться в микроорганизме (то есть, экспрессию одного или более чем одного гена в модифицированном микроорганизме снижают, нарушают или элиминируют).

Последнее можно осуществить различными способами, такими как разрушение гена после гомологичной рекомбинации или применение антисмысловой или малой интерферирующей РНК.

В предпочтительном примере микроорганизм экспрессирует один или более чем один белок по этому изобретению (либо эндогенно, либо по причине введения экзогенных нуклеиновых кислот, как описано выше) и, вдобавок, не экспрессирует гены, которые кодируют ферменты, участвующие в разложении короткоцепочечных н-алканов, или не экспрессирует гены, которые кодируют ферменты, участвующие в разложение среднецепочечных н-алканов или н-алканов с длиной цепи С20-С24.

Например, микроорганизм может не содержать эндогенные гены, которые кодируют ферменты, которые участвуют в разложении короткоцепочечных н-алканов, или не содержать эндогенные гены, которые кодируют ферменты, участвующие в разложение среднецепочечных н-алканов или н-алканов с длиной цепи С20-С24. Такой микроорганизм можно трансформировать при использовании надлежащей молекулы нуклеиновой кислоты так, что он экспрессирует один или более чем один белок по этому изобретению.

Альтернативно, микроорганизм может содержать эндогенные гены, которые кодируют ферменты, которые участвуют в разложении короткоцепочечных н-алканов, и/или гены, который кодируют ферменты, участвующие в разложении среднецепочечных н-алканов или н-алканов с длиной цепи С20-С24, но в экспрессию одного или более чем одного этого эндогенного гена можно вмешаться, например, при использовании методик, упомянутых выше. Вдобавок микроорганизм должен экспрессировать один или более чем один белок по этому изобретению (либо эндогенно, либо по причине введения экзогенной нуклеиновой кислоты).

Во всех случаях ферменты, участвующие в разложении среднецепочечных алканов или короткоцепочечных алканов, могут представлять собой любой фермент, который катализирует по меньшей мере одну стадию этого процесса (например, монооксигеназы, рубредоксины, редуктазы рубредоксинов, алкогольдегидрогеназы, альдегиддегидрогеназы, алкангидроксилазы и ацил-КоА-синтетазы/лигазы жирной кислоты и КоА).

Примерами генов, которые кодируют ферменты, участвующие в разложении н-алканов с длиной цепи С10-С18, являются гены А1кМа и/или А1кМЬ (имеющие номера доступа в СепВапк 00009004 и 00009005 соответственно). Таким образом, предпочтительный микроорганизм является мутантом штамма Ό8Μ17874 Асте1оЬас1ет 5р. (депонирован как Ό8Μ 17874), в котором экспрессия генов А1кМа и/или А1кМЬ была нарушена или модифицирована, например, был получен нокаутный или делеционный мутант по гену А1кМа и/или А1кМЬ. Дополнительно предпочтительными воплощениями являются штаммы, которые не содержат гены А1кМа и/или А1кМЬ или их функциональные эквиваленты эндоген

- 10 020184 но, но которые содержат молекулу нуклеиновой кислоты по этому изобретению (либо эндогенно, либо по причине введения экзогенных нуклеиновых кислот, как описано выше).

Белок по этому изобретению или микроорганизмы по этому изобретению (или их клеточные экстракты), описанные выше, можно приготавливать в виде препарата с жидкостью-носителем. Это может быть в форме, в которой белок по этому изобретению или микроорганизмы по этому изобретению наносят на субстрат, содержащий н-алкан. Таким образом, в этом изобретении предложена композиция, содержащая эти компоненты.

При рассмотрении в другом аспекте, в этом изобретении предложено применение белка по этому изобретению или микроорганизмов по этому изобретению (или их клеточного экстракта), как описано выше, для изготовления обрабатывающих композиций для разложения длинноцепочечных н-алканов, снижения температуры потери текучести субстрата, содержащего длинноцепочечные н-алканы, или осуществления эстерификации длинноцепочечных н-алканов. Во всех случаях указанный длинноцепочечный н-алкан предпочтительно имеет по меньшей мере 26 или 32 атомов углерода в длину.

Известны различные полимерные, олигомерные, неорганические и другие дисперсные носители, к которым можно присоединять белки и/или микроорганизмы, например частицы ионообменной смолы (см. υδ-Ά-4787455), частицы акриламидного полимера (см. ЕР-А-193369), желатиновые капсулы (см. И8-3676363), олигомерные матрицы и капсулы (см. υδ-Α-4986353 и υδ-Α-4986354), керамические частицы (см. \νϋ 99/54592, νθ 96/27070 и ЕР-А-656459) и частицы самого обрабатываемого химического соединения (см. νθ 97/45625).

При рассмотрении в дополнительном аспекте в этом изобретении, таким образом, предложены частицы, импрегнированные белком по этому изобретению или микроорганизмами по этому изобретению, как описаны выше.

Белок по этому изобретению или микроорганизмы по этому изобретению, как описаны выше, можно также присоединить к фильтру (например, для размещения в скважине).

В этом изобретении предложен способ разложения длинноцепочечных н-алканов в субстрате, содержащем длинноцепочечные алканы, предпочтительно в неочищенной нефти, включающий экспонирование указанного содержащего длинноцепочечные н-алканы субстрата белку, который способен разлагать длинноцепочечные н-алканы (например, белку по этому изобретению). Как обсуждено выше, этот процесс разложения может иметь несколько следствий, например он может приводить к образованию соединений, содержащих более короткую н-алкановую цепь, например, дополнительных н-алканов, или к образованию сложных эфиров, спиртов, альдегидов и/или кислот. Альтернативно или дополнительно, можно снижать температуру потери текучести субстрата.

Субстрат, содержащий длинноцепочечные н-алканы, означает любой субстрат, который содержит один или более чем один длинноцепочечный н-алкан, как определено выше. Предпочтительно этот субстрат представляет собой неочищенную нефть. Он может альтернативно содержать или состоять из очищенных или частично очищенных длинноцепочечных н-алканов, углеводородных фракций (например, углеводородной фракции, которую получают из неочищенной нефти фракционной перегонкой) и растительных и животных жиров или масел.

Таким образом ясно, что в модификации разных субстратов в соответствии с этим изобретением имеются различные преимущества. Снижение вязкости субстрата в контексте получения и очистки нефти должно помогать в получении и перемещении нефти. Вдобавок, разложение субстрата, как описано выше, может изменять состав субстрата, например так, что он будет содержать более высокую долю спиртов, кислот, сложных эфиров или альдегидов. Эти различные компоненты можно разделять в соответствии со стандартными способами и использовать для различных химических синтезов. Альтернативно, также известно, что нефть, содержащая окисленные компоненты, может быть более ценной. Следовательно, свойствами субстрата можно манипулировать, как это желательно, путем выбора надлежащего субстрата и контроля экспозиции субстрата белкам, разлагающим н-алканы.

Экспонирование субстрата, содержащего длинноцепочечные н-алканы, белку, который способен разлагать длинноцепочечные н-алканы (например белку по этому изобретению), означает, что субстрат и белок приводят в контакт в надлежащем контексте и в надлежащих условиях так, что это позволяет белку взаимодействовать с компонентом субстрата, представляющего собой длинноцепочечные н-алканы, так что белок может оказывать свое действие, например, на длинноцепочечные н-алканы.

Таким образом, субстрат, содержащий длинноцепочечные н-алканы, смешивают или приводят в контакт с надлежащим белком или источником белка в подходящих условиях так, что это делает возможным это взаимодействие. Поэтому подходящий контакт должен быть осуществлен между белком и длинноцепочечным н-алканом так, чтобы это позволило этим двум компонентам взаимодействовать. Таким образом, белок можно просто привести в контакт с субстратом, представляющим собой длинноцепочечный н-алкан, например, его добавлением прямо в субстрат, представляющий собой длинноцепочечный н-алкан. Этот контакт можно осуществить в биореакторе, который может быть периодическим биореактором или непрерывным биореактором. Или же, контакт можно осуществить в процессе промышленного получения нефти, например, в трубе, трубопроводе или скважине.

Надо отметить, что во время этого процесса можно использовать любые надлежащие условия, и

- 11 020184 стадия экспонирования субстрата, представляющего собой длинноцепочечный н-алкан, белку по этому изобретению может иметь место в любом надлежащем контексте, например в биореакторе или перемешиваемом баке, или в контексте процесса промышленного получения нефти (например, в трубопроводе, трубе или скважине), в каковом случае стадия экспозиции может иметь место в наклонной скважине. Например, подходящие белки, лизаты или целые микроорганизмы, иммобилизованные или в свободной форме, можно инъецировать в область возле бура. Во всех случаях можно использовать иммобилизованные белки, лизаты или организмы, также как свободные живые организмы, как обсуждено подробно здесь в другом месте.

Специалист должен понимать, что необходимое время инкубации, рН, температура, концентрации субстрата и концентрации белка не являются независимыми друг от друга. Таким образом, можно предвидеть большой диапазон условий, который легко может оценить специалист в данной области.

В способе по этому изобретению белок, микроорганизм или его клеточный экстракт можно помещать ίη δίΐιι до и/или после субстрата. Предпочтительно белок, микроорганизм или его клеточный экстракт помещают ίη δίΐιι до субстрата, особенно в случае изготовления труб или других сосудов.

Вышеописанную стадию экспозиции субстрата надлежащему белку или источнику белка можно осуществить приведением субстрата в контакт прямо с белком, или же приведением субстрата в контакт с микроорганизмом, который способен экспрессировать этот белок. Белок можно экспонировать субстрату в отдельности или в комбинации с одним или более чем одним другим белком. Примеры других белков, которые можно использовать, включают в себя монооксигеназы, рубредоксины и редуктазы рубредоксинов, алкогольдегидрогеназы, альдегиддегидрогеназы, алкангидроксилазы и ацил-КоАсинтетазы/лигазы жирной кислоты и КоА. В дополнительной альтернативе можно использовать экстракт микроорганизма, который способен экспрессировать белок. Подходящие микроорганизмы включают в себя те, которые экспрессируют надлежащий белок (например, белок по этому изобретению), и они обсуждены выше. Можно использовать любые обсужденные выше микроорганизмы.

Подходящие формы белка по этому изобретению и его варианты и т.д., которые можно использовать в способах по настоящему изобретению, раскрыты выше. Таким образом, присутствующий белок по этому изобретению может быть во многих разных формах, например изолированным, экстрагированным или очищенным из различных источников или синтезированным различными способами.

Например, используемый белок (например, белок по этому изобретению (или его вариант и т.д.)) может быть синтетическим белком, который был синтезирован химическим способом. Химические синтезы можно осуществлять способами, хорошо известными в данной области, включающими, в случае пептидов, циклические последовательности взаимодействий, представляющих собой снятие защиты с функциональных групп концевой аминокислоты и сочетание селективно защищенных аминокислотных остатков, за чем в конце следует полное снятие защиты со всех функциональных групп. Белки по этому изобретению для применения в этом изобретении могут быть существенно очищенными, например апирогенными, например, более чем на 70%, особенно предпочтительно более чем на 90% чистыми (при оценке, например в случае пептидов или белков, надлежащей методикой, такой как картирование, секвенирование или хроматография пептидов). Очистку можно осуществлять, например, хроматографией (например ВЭЖХ, эксклюзионная, ионообменная, аффинная, гидрофобная, с обращенной фазой) или капиллярным электрофорезом.

Рекомбинантная экспрессия белков также хорошо известна в данной области, и подходящую последовательность нуклеиновой кислоты можно использовать для экспрессии подходящего белка (например, белка по этому изобретению (или его варианта, и т.д.)) для последующей экспрессии и возможной очистки при использовании методик, которые хорошо известны в данной области. Например, надлежащую последовательность нуклеиновой кислоты можно функциональным образом связать с промотором для экспрессии белка в бактериальных клетках, например Е сой. Может быть удобно экспрессировать белок под контролем индуцируемого промотора, в этом случае экспрессию белка надо индуцировать в культуре, чтобы вызвать экспрессию.

В качестве альтернативы осуществлению очистки, лизаты или экстракты клеток, экспрессирующих молекулу нуклеиновой кислоты по этому изобретению, могут служить в качестве альтернативного источника белка (например белка по этому изобретению). Клеточные экстракты или лизаты можно получать в соответствии со стандартными методиками, которые известны в данной области, например, обработкой ультразвуком или другими способами разрушения клеток, использованием детергентов. Лизат и/или очищенный белок можно затем смешать с надлежащей жидкостью или раствором для введения в субстрат или добавления к субстрату, который надо ему экспонировать. Это подход является применимым как к рекомбинантным бактериям, так и к бактериям, которые естественно синтезируют белок (например, белок по этому изобретению).

Также можно частично очищать или концентрировать подходящий белок из лизата бактерии, которая естественно продуцирует белок или экспрессирует белок рекомбинантным путем. Подходящие примеры осуществления этого для достижения требуемой концентрации или чистоты хорошо известны в данной области техники.

Альтернативно, микроорганизм, который экспрессирует подходящий белок, можно привести в кон

- 12 020184 такт с субстратом, содержащим длинноцепочечный н-алкан. Это подход является применимым как к рекомбинантным бактериям, так и к бактериям, которые естественно синтезируют такой белок (например белок, по этому изобретению).

Микроорганизм, лизат или его экстракт или белок можно доставлять на место, где он должен действовать на субстрат, сам по себе или внутри или на частицах, например пористых неорганических частицах (например, кремнезем, глинозем и т. д.) или полимерных частицах, либо в капсулах, например коллоидных, и т.д. Эти частицы-носители могут также нести питательные вещества для бактерий. Такие частицы обсуждены выше и хорошо известны в данной области техники.

Как отмечено выше, стадия экспонирования субстрата надлежащему белку может происходить в биореакторе или трубах, или трубопроводах, или в скважине или других сосудах, или еще где-либо в промышленном нефтяном процессе.

Стадии способа, который раскрыт выше, можно альтернативно использовать для достижения снижения температуры потери текучести субстрата, содержащего длинноцепочечные н-алканы, такого как неочищенная нефть.

Эти стадии способа можно также альтернативно использовать для достижения увеличения потока субстрата, содержащего длинноцепочечные н-алканы, такого как неочищенная нефть, например в трубопроводах, и/или для превращения длинноцепочечных н-алканов в спирты, кислоты и/или сложные эфиры.

Указанные выше ссылки на снижение в контексте этих способов означают, что после стадий способа, надлежащий параметр был снижен на любое количество, например, статистически достоверное количество. Например, в связи со снижением температуры потери текучести, это означает, что температуру потери текучести снижают, например, по меньшей мере на 0,1, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20° (в °Е или °С) относительно субстрата, который не был экспонирован белку или микроорганизму по этому изобретению.

Как обсуждено выше, авторы настоящего изобретения смогли идентифицировать вышеописанный ген, благодаря разработке высокопроизводительного способа скрининга, который позволил им идентифицировать гены, которые участвуют в разложении субстратов, представляющих собой длинноцепочечный н-алкан. В этом способе использованы мутантные штаммы, которые тестируют на их способность расти на субстратах в две или более чем две стадии селекции, и комбинация этих двух стадий позволяет идентифицировать мутации, которые специфично влияют на способность мутации, присутствующей в каждом мутантном штамме, влиять на рост на одном конкретном субстрате. Субстраты выбирают так, что немутированный или родительский штамм может расти на каждом субстрате, который используют в способе селекции (например, длинноцепочечном н-алкане, таком как н-алкан С32, и среднецепочечном н-алкане, таком как н-алкан С16). Ген, представляющий интерес, распознают идентификацией мутантных штаммов, которые не растут на одном субстрате (например, длинноцепочечном н-алкане, таком как н-алкан С32), но являются жизнеспособными на другом субстрате (например, среднецепочечном налкане, таком как н-алкан С16). Таким образом, мутантные штаммы, которые имеют эти свойства, содержат мутацию, которая является специфичной для пути разложения только одного субстрата. Таким образом, комбинация стадий селекции в этом способе устраняет идентификацию мутантов, которые содержат мутации, которые влияют на общую жизнеспособность клетки и не являются специфичными для разложения субстрата, представляющего интерес.

Таким образом, в этом изобретении предложен способ идентификации гена в микроорганизме, кодирующего белок, необходимый для метаболизма субстрата, включающий стадии, на которых:

а) предоставляют библиотеку мутантных штаммов бактерий, которые получены мутагенезом родительского штамма микроорганизмов,

б) подвергают эти мутантные штаммы совокупности условий роста для отрицательной селекции,

в) идентифицируют клоны, ущербные по росту или нежизнеспособные в этой совокупности условий роста,

г) подвергают эти мутантные штаммы совокупности условий роста для положительной селекции,

д) идентифицируют клоны, которые могут расти или являются жизнеспособными в этой совокупности условий роста, и

е) идентифицируют мутировавший ген в идентифицированных клонах, причем родительский микроорганизм растет или является жизнеспособным, когда его подвергают совокупности условий роста для отрицательной селекции, и растет или является жизнеспособным, когда его подвергают совокупности условий роста для положительной селекции, и причем совокупность условий роста для отрицательной селекции является такой, что присутствует субстрат, представляющий интерес, и совокупность условий рост для положительной селекции является такой, что отсутствует субстрат, представляющие интерес, и присутствует другой субстрат.

Указанный способ можно использовать для идентификации генов в любом микроорганизме. Предпочтительно микроорганизм представляет собой бактерию или архею.

В экспериментальных условиях микроорганизмы могут расти на различных субстратах или ростовых средах. Во многих случаях возможен рост микроорганизмов на очень простой смеси питательных

- 13 020184 веществ и солей. В то время как в естественных условиях любой конкретный микроорганизм может расти, метаболизируя или разлагая многочисленные источники углерода и энергии, которые присутствуют там, где он растет, узнать больше о конкретных метаболических требованиях микроорганизмов можно выращиванием микроорганизмов на базальной или минимальной ростовой среде и обогащая базальную ростовую среду конкретным субстратом или хорошо определенной совокупностью субстратов. Затем определяют способность микроорганизмов расти на этих субстратах. Например, базальную ростовую среду можно обогатить конкретным н-алканом в виде жидкости или твердого вещества в отдельности или в комбинации с другими н-алканами или другими субстратами.

Часто имеет место ряд субстратов, на которых может расти микроорганизм, и способность микроорганизма расти на любом одном субстрате указывает на то, что этот микроорганизм имеет один или более чем один ген, который кодирует белок, который может разлагать этот субстрат. Аналогичным образом, неспособность мутантного штамма микроорганизма расти на таком субстрате может указывать на то, что этот мутантный штамм имеет мутацию в гене, которая влияет на способность штамма разлагать субстрат, на котором его выращивают, или еще что он может иметь мутацию в гене, который иным образом влияет на жизнеспособность штамма. Как обсуждено выше, способ по этому изобретению различает мутации в генах, которые являются специфичными для разложения конкретного субстрата, и в генах, которые иным образом влияют на рост и/или жизнеспособность клеток.

Более того, поскольку метаболические пути в микроорганизмах не являются все отдельными линейными путями, в микроорганизме существуют белки, которые нужны микроорганизму для способности метаболизировать множество родственных или отличных субстратов (как в пути а1к, где имеют место несколько копий исходного фермента, гидроксилирующего алканы, А1кМ).

Эти варианты одного и того же фермента имеют слегка разные субстратные специфичности. После исходной стадии последующее разложение идет одним и тем же путем. Способ, описанный выше, учитывает это наличием стадии контрселекции (положительной селекции). Два субстрата, используемые для стадий отрицательной и положительной селекции, можно выбрать так, чтобы идентифицировать белок, который находится в метаболическом пути субстрата, представляющего интерес, в соответствующем положении. Например, если надо идентифицировать белок, который нужен для метаболизма субстрата, представляющего собой н-алкан С32, то выбирают родительский штамм, который растет на этом субстрате, а также на другом субстрате, таком как субстрат, который представляет короткоцепочечный (например С6) н-алкан или среднецепочечный н-алкан (например С16), и мутантные штаммы тестируют на их способность расти на этих двух субстратах. Такой способ должен идентифицировать гены, кодирующие белки, который являются необходимыми для разложения н-алканов С32, но не для разложения налканов С16, и его использовали для идентификации генов по этому изобретению, и, хотя возможно, что такой способ может идентифицировать гены, чьи продукты нужны для метаболизма н-алканов С32, 36, 20 и 24, продукт гена а1тА, оказывается ненужным, по меньшей мере, для роста на алканах С20 и С24, хотя он нужен для роста на алканах С32 и С36 (см. Пример 2).

Если требуется идентифицировать белок, который специфично необходим для метаболизма субстрата, представляющего собой н-алкан С32, но не другие длинноцепочечные алканы, такие как алканы С20 и С24, можно осуществить стадию контр-селекции на таком субстрате, как С20 и/или С24, или еще можно осуществить одну или более чем одну дополнительную стадию контр-селекции на дополнительных субстратах, таких как С20 и/или С24. Действительно, в примере 2 стадия исходной селекции была основана на отсутствии роста мутантных клонов на С32, но наличии роста на С16. Дополнительную характеризацию ростовых способностей мутантов (выращиванием их на выборке разных субстратов) также можно осуществлять для сужения процедуры селекции, и экспозицию этим разным условиям роста можно осуществлять параллельно или последовательно.

Ввиду указанных соображений можно видеть, что необходимый для метаболизма означает любую молекулу, такую как белок (в частности, фермент), которая необходима микроорганизму для роста на определенном субстрате, но не является таковой для общей жизнеспособности клетки. Предпочтительно этот способ используют для идентификации молекул, например белков, которые необходимы для специфичного метаболизма определенного субстрата в том смысле, что они не нужны для метаболизма других отличающихся субстратов. Поэтому этот способ предпочтительно используют для идентификации молекул, например генов, кодирующих белки, которые необходимы для роста на длинноцепочечных налканах (или по меньшей мере одном длинноцепочечном н-алкане), но не нужны для роста на среднеили короткоцепочечных н-алканах. Более предпочтительно этот способ используют для идентификации генов, кодирующих белки, которые необходимы для роста на длинноцепочечных н-алканах (или, по меньшей мере, одном длинноцепочечном н-алкане), имеющих по меньшей мере 26, 28, 30, 32 или 34 атома углерода, но не нужны для роста на н-алканах с более короткими цепями, таких как С24 или С16.

Из вышеизложенного ясно, что специалист должен быть способен идентифицировать и выбрать надлежащую комбинацию микроорганизма и субстратов на основании предоставленной выше информации так, чтобы быть способным осуществить этот способ для того, чтобы идентифицировать ген, имеющий конкретное свойство.

Библиотека означает коллекцию или совокупность индивидов. Мутантные штаммы, которые явля

- 14 020184 ются членами библиотеки, все происходят из одного и того же родительского штамма в том смысле, что получены мутагенезом одного и того же родительского штамма. Таким образом, они имеют общие характеристики и признаки с родительским штаммом, но отличаются в том, что содержат мутации в своем геноме.

Мутации можно вызывать любым удобным способом, таким как экспозиция родительского штамма химическим мутагенам, или инсерционный мутагенез, такой как применение транспозонного мутагенеза, как указано в примере 1. Предпочтительно мутагенез осуществляют так, что каждый член библиотеки содержит единичную мутацию.

Как обсуждено выше, условия роста выбирают так, что в первой совокупности условий роста присутствует субстрат, представляющий интерес. Этот субстрат можно добавить к ростовой среде в любой подходящей форме. Например, твердые н-алканы можно добавлять в виде порошка на ростовую среду на поверхности твердой ростовой среды или в виде капель в жидкую ростовую среду, и жидкие н-алканы можно добавлять в виде капли жидкости либо в твердую, либо в жидкую ростовую среду.

Ростовой средой может быть любая стандартная основная или минимальная среда, которая делает возможным рост микроорганизма при добавлении подходящего источника углерода в форме добавленного субстрата, представляющего интерес. Можно также добавлять, где необходимо, другие подходящие добавочные соединения (например, антибиотики для селекционных целей).

Примеры подходящих субстратов включают в себя длинноцепочечные н-алканы, например один или более чем один н-алкан С20, С22, С24, С26, С28, Ο3Ό, С32, С34, С36, С38, С40, С42, С44. Как обсуждено выше, подходящие субстраты выбирают в зависимости от природы гена, который надо идентифицировать.

Субстрат, представляющий интерес, добавляют к ростовой среде в соответствующей концентрации для возможности постоянного роста в течение достаточного времени для образования колонии, например, в течение по меньшей мере 2-3 суток, предпочтительно, по меньшей мере 3-5 суток.

В общем, для этой стадии культуры клоны высевают, например, в 96-луночные планшеты или планшеты Ошийгау так, что местоположение каждого клона в пределах планшета является известным. Сохранение реплик планшетов должно быть полезным для возможности пересева идентифицированных клонов. Можно использовать любой подходящий культуральный аппарат, который делает возможным последующее осуществление идентификации клонов.

В общем, штаммы инкубируют в течение 2-3 суток в подходящих условиях культивирования (например, приблизительно 30 или 37°С, 70-75°С или 65°, в зависимости от природы микроорганизма).

Эту стадию можно осуществлять параллельно для более чем одного субстрата или источника углерода, в зависимости от природы гена, который надо идентифицировать, например должно быть возможно выращивать клоны как на С16, так и на С32 одновременно, и затем идентифицировать те, которые были способный расти на С16, но не на С32, чтобы подвергнуть их дополнительному анализу.

Как обсуждено выше, условия роста выбирают так, что в положительной совокупности условий роста отсутствует субстрат, представляющий интерес, и присутствует альтернативный источник углерода или субстрат. Как это имеет место и в случае первого субстрата (то есть, субстрата, представляющего интерес), альтернативный субстрат можно добавлять к ростовой среде в любой подходящей форме.

Как уже обсуждено выше, ростовая среда может представлять собой любую стандартную минимальную среду, которая делает возможным рост микроорганизма при добавлении подходящего источника углерода в форме добавленного субстрата, представляющего интерес. Ростовая среда для этой совокупности условий может быть такой же (не считая добавленного субстрата) или другой, чем ростовая среда для отрицательной совокупности условий роста, но предпочтительно, она является такой же, то есть, она имеет тот же состав. Также можно добавлять, где необходимо, другие надлежащие добавочные соединения, (например антибиотики для селекционных целей).

Примеры подходящих субстратов для включения во вторую совокупность условий роста включают в себя короткоцепочечные н-алканы, среднецепочечные н-алканы или длинноцепочечные алканы с менее чем 30 атомами углерода, например один или более чем один н-алкан С6, С8, С10, С12, С14, С15, С18, С20, С22, С24, С26, С28. Дополнительной альтернативой является использование ацетата, поскольку это позволяет исключать любые мутанты, несущие мутации в генах домашнего хозяйства. Как обсуждено выше, подходящие субстраты можно выбирать в зависимости от природы гена, который надо идентифицировать, например, генов, кодирующих белки, участвующие в метаболических путях, общих для всех микроорганизмов.

Субстрат, представляющий интерес, добавляют к ростовой среде в надлежащей концентрации для возможности постоянного роста в течение по меньшей мере 2-3 суток, предпочтительно по меньшей мере 3-5 суток.

В общем, для этой стадии культуры клоны высевают, например в 96-луночные планшеты или планшеты Ошийгау так, что местоположение каждого клона в пределах планшета является известным. Реплики планшетов можно сохранять для возможности пересева.

В общем, штаммы инкубируют в течение 2-3 суток в соответствующих условиях культивирования

- 15 020184 (например, приблизительно 30 или 37°С, 70-75°С или 65°, в зависимости от природы микроорганизма).

Как обсуждено выше, идентифицированные клоны можно подвергать дополнительной стадии селекции на основании природы гена, который надо идентифицировать. Например, если ищут ген, участвующий в метаболизме н-алканов С32, первая совокупность условий роста может представлять собой рост на С32, условия контр-селекции или второй стадии роста могут представлять собой рост на С16, и то, что не растет на С32, но растет на С16, можно затем подвергать выращиванию на дополнительных налкановых субстратах, таких как С20 или С24. Такие дополнительные стадии можно осуществлять, например, если число клонов, которые идентифицированы на стадии (д), является большим. Дополнительной альтернативой является использование ацетата, поскольку это позволяет исключать любые мутанты, несущие мутации в генах домашнего хозяйства, например генов, кодирующих белки, участвующие в метаболических путях, общих для всех микроорганизмов.

На стадиях (в) и (г), указанных выше, делают различие между ущербными по росту клонами и теми, которые являются жизнеспособными. На каждой этой стадии необходимо идентифицировать те клоны, которые могут расти в конкретных условиях роста, которым их подвергали. Это означает, что клоны, которые не способны расти или выживать на конкретном субстрате, отличаются от тех, которые способны расти.

Жизнеспособные клетки, которые растут в конкретных использованных условиях роста, можно идентифицировать наблюдением измеримого или детектируемого количества клеточного роста, например, может иметь место статистически достоверное увеличение числа клеток, например, по меньшей мере пятикратное, десятикратное, двадцатикратное, тридцатикратное или пятидесятикратное увеличение числа клеток, например, при измерении надлежащим способом, например спектрофотометрическим определением увеличения поглощения клеточной культурой (например ростовой средой) или увеличения оптической плотности, например ΟΌ₆₀₀, или другими спектрофотометрическими или колориметрическими анализами на белки или другие клеточные компоненты, например, окрашиванием колоний соединением, которое может детектировать жизнеспособные клоны, таким как ΙΝΤ (хлорид йоднитротетразолия) или измерением количества белка на литр культуры. Этот рост можно детектировать любым удобным или желательным способом.

Клон признают ущербным по росту, если после инкубации в определенных условиях роста отсутствует увеличение числа клеток, если после инкубации в определенных условиях роста имеет место только ограниченное увеличение числа клеток, и/или если после инкубации в определенных условиях роста отсутствует детектируемых живых клеток. Нежизнеспособные клоны определяют по отсутствию детектируемых живых клеток после инкубации в определенных условиях роста. Ограниченное увеличение должно относиться к малому числу делений клеток, например, представляющему собой 2-5 делений клеток.

Идентификацию растущих и нерастущих, и жизнеспособных и нежизнеспособных клонов можно облегчить с помощью соответствующих контролей. Например, в качестве положительного контроля параллельно с тестируемыми планшетами на каждой стадии культуры можно реплицировать клоны в контрольный планшет и инкубировать в условиях, которые известны поддержанием роста родительского штамма, предпочтительно, в условиях, в которых нельзя ожидать, что на рост любых мутантных штаммов влияют мутации гена, представляющего интерес. В этих условия должны расти все штаммы. Подходящей ростовой средой для применения в таком положительном контроле должна быть ростовая среда, которая содержит смесь разных источников углерода, такая как широко распространенный бульон ЬВ. Дополнительным положительным контролем является использование родительского штамма и измерение или наблюдение роста этого штамма в различных условиях тестовой культуры. Негативную пробу или планшет можно помещать в условия, которые известны тем, что не поддерживают рост родительского штамма, например, это основная или минимальная ростовая среда без любого дополнительного источника углерода.

Сравнения количества роста, наблюдаемого в этих положительных и отрицательных контролях, с клонами должны помочь в определении того, считать или не считать любой конкретный клон ущербным по росту или жизнеспособным в любых конкретных условиях тестирования.

Клоны можно экспонировать условиям роста в любом порядке, то есть, стадия культивирования и ассоциированная с ней стадия идентификации клонов, которые являются ущербными по росту в совокупности культуральных условий для отрицательной селекции, могут иметь место до, после или параллельно стадии для идентификации клонов, которые являются жизнеспособными в совокупности условий культуры для положительной селекции.

Однако последовательное осуществление этих стадий облегчает этот процесс, поскольку каждая стадия идентификации будет исключать необходимость в дополнительном исследовании конкретных клонов. Как таковой, в предпочтительном воплощении, это способ содержит стадии, на которых:

а) предоставляют библиотеку мутантных штаммов бактерий, которые были получены мутагенезом родительского штамма микроорганизмов,

б) подвергают мутантные штаммы совокупности условий роста для отрицательной селекции,

в) идентифицируют клоны, которые являются ущербными по росту или нежизнеспособными в этой

- 16 020184 совокупности условий роста,

г) подвергают клоны, идентифицированные на стадии (в) совокупности условий роста для положительной селекции,

е) идентифицируют ген, который является мутированным в идентифицированных клонах, причем родительский микроорганизм может расти или является жизнеспособным, когда его подвергают совокупности условий роста для отрицательной селекции, и может расти или является жизнеспособным, когда его подвергают совокупности условий роста для положительной селекции, и причем совокупность условий роста для отрицательной селекции является такой, что присутствует субстрат, представляющий интерес, и совокупность условий роста для положительной селекции является такой, что отсутствует субстрат, представляющий интерес, и присутствует другой субстрат.

В дополнительном предпочтительном воплощении этот способ включает стадии, на которых:

б) подвергают мутантные штаммы совокупности условий роста для положительной селекции,

в) идентифицируют клоны, которые могут расти или являются жизнеспособными в этой совокупности условий роста,

г) подвергают клоны, идентифицированные на стадии (в) совокупности условий роста для отрицательной селекции,

д) идентифицируют клоны, которые являются ущербными по росту или нежизнеспособными в этой совокупности условий роста,

г) идентифицируют ген, который является мутированным в идентифицированных клонах, причем родительский микроорганизм может расти или является жизнеспособным, когда его подвергают совокупности условий роста для отрицательной селекции, и может расти или является жизнеспособным, когда его подвергают совокупности условий роста для положительный селекции, и причем совокупность условий роста для отрицательной селекции является такой, что присутствует субстрат, представляющий интерес, и совокупность условий роста для положительной селекции является такой, что отсутствует субстрат, представляющий интерес, и присутствует другой субстрат.

Как обсуждено выше, можно добавлять дополнительные стадии селекции, как подходит.

После идентификации мутантных клонов, которые отвечают требованиям этого способа к росту, идентифицируют ген, который был разрушен или мутирован в клоне. Это можно осуществлять при использовании стандартных методик молекулярной биологии, известных в данной области, например, способами на основе ПЦР и/или ЗоШйегп-блоттинга. Если библиотека мутантов была генерирована транспозонным мутагенезом, должно быть возможно в помощь клонированию мутированной области использовать известные последовательности из последовательности транспозона. Таким образом, этот способ возможно включает в себя дополнительные стадии клонирования и секвенирования мутированного гена.

Это изобретение теперь будет описано подробнее в следующих неограничивающих примерах, в которых:

На фиг. 1 показана физическая карта рЬ0ЕКт. Указаны ген транспозазы и маркер устойчивости к канамицину; т1И1-Ти10 фланкирован двумя вставочными последовательностями 1810.

На фиг. 2 показано изображение планшета 0тийгау, заполненного твердой средой СВ с С32, нанесенном на ее верх в виде порошка. Клетки реплицировали на этот планшет из 96-луночного планшета и выращивали в течение ночи при 30°С. Затем приблизительно 20 мл верхнего агара ЮТ наносили для детектирования жизнеспособных клеток. Некоторые пятна колоний отсутствуют из-за остановки роста соответствующих клонов в выбранных условиях (показывая отсутствие роста этих колонии на С32).

На фиг. 3 показаны физические карты р80К804 (А) и рЬАЬ50 (В). 0п: точка начала репликации рВК322; Ат¹/ маркер, придающий устойчивость к апрамицину; опТ: точка начала переноса. Указаны рестрикционные сайты (ХЬа1 и ВатН1) и клонированные фрагменты.

На фиг. 4 показаны кривые роста штаммов Асте1оЬас1ег 8р. Ό8Μ17874 (дикий тип), АУМ1004А7 (мутированный транспозоном штамм) и МАУ1 (штамм, нокаутный по а1тА), выращиваемых в среде СВ с антибиотиками и С20, С24, С32 и С36 в качестве исключительных источников углерода.

На фиг. 5 показано схематическое изображение окружающих областей для гомологичных генов а1тА в Асте1оЬас1ег уеиейаиш 6А2 (Асте1оЬас1ег 8р. ЭЗМ17874) и АС1АЭ3192 в Асте1оЬас1ег 8р. АЭР1 обозначает предполагаемую монооксигеназу из флавин-связывающего семейства. гр8М, гр8К, гроА и гр10 представляют собой рибосомальные белки, ГабЕ кодирует ацил-СоА-дегидрогеназу. а1тВ представляет собой потенциально секретируемый белок с пока еще неизвестной функцией. Участие 0гГ1 (А1тВ) в метаболизме алканов, возможно связанное с А1тА, в настоящее время исследуется. Непомеченные элементы являются теоретическими.

На фиг. 6 показана нуклеотидная последовательность кодирующей области а1тА.

На фиг. 7 показана пептидная последовательность белка А1тА.

На фиг. 8 показана нуклеотидная последовательность кодирующей области огГ1 (а1тВ).

- 17 020184

На фиг. 9 показана пептидная последовательность белка 0гГ1 (А1тВ).

На фиг. 11 показана пептидная последовательность М-1 А1тА Асте1оЬас1ег кр.

На фиг. 12 показана нуклеотидная последовательность М-1 А1тА Асте1оЬас1ег кр.

На фиг. 13 показаны результаты комплементации активности а1тА в дефицитном по а1тА мутанте Асте1оЬас1ег кр. ΜАV1 с геном а1тА на плазмиде. Рост Асше1оЬас1ег кр. Ό8Μ 17874/р^^Μ02.1 (о), Ас1ие1оЬас1ег кр. ΜАV1/р^^Μ02.1 (^п), Асте1оЬас1ег кр. ΜАV1/рЛ^ΜАI и Ас1ие1оЬас1ег кр. ΜАV1/рАСIЛ^I О) в 100 мл среды СВ, обогащенной семью 50-мкл твердыми каплями С32 (А) или С36 (Б). Рост измеряли по увеличению белка в культурах с течением времени. Представленные величины являются средними по двум независимым экспериментам.

Примеры

Пример 1. Получение транспозонной библиотеки Асте1оЬас1ег уеиейаиик 6А2 (Асте1оЬас1ег кр. Ό8Μ17874)

Транспозонную библиотеку штамма Ό8Μ17874 Асте1оЬас1ег кр. конструировали конъюгационным переносом Е. со11 817-1 (λ ри), несущей плазмиду, содержащую рЬ0РКт, в штамм Ό8Μ17874 Асте1оЬас1ег кр. и селекцией по хромосомной интеграции транспозона.

Асте1оЬас1ег кр. Ό8Μ17874 пересевали из культуры в 25%-ном глицерине при -80°С на ЬВпланшеты, содержащие 25 мкг/мл хлорамфеникола. Е. со11817-1 (λ р1г), несущие плазмиду рЬ0РКт (фиг. 1), пересевали из культуры в 25%-ном глицерине при -80°С на ЬВ-планшеты, содержащие 150 мкг/мл ампициллина и 75 нг/мл канамицина. Оба типа планшетов инкубировали в течение ночи при 30°С. 50 мл среды ЬВ (на литр: 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г №С1; для планшетов: дополнительно 15 г/л бактериального агара), содержащей указанные концентрации антибиотиков, инокулировали веществом из планшетов и инкубировали в течение ночи при 30°С.

На следующие сутки 50 мл среды ЬВ, содержащей указанные концентрации антибиотиков, инокулировали при использовании 500 мкл из двух 50-мл предварительных культур. Культуру Е. со11 начинали через 2 ч после культуры 6А2. После роста Асте1оЬас1ег кр. Ό8Μ17874 в течение 4,5 ч и Е. со11 817-1( λ, р1г)/рЬ0РКт в течение 2,5 ч культуры показали 0Ό₆₀₀ приблизительно 0,4. По 1 мл каждой из двух культур смешивали и центрифугировали при 8000 об/мин, 5 мин, К.Т. Осадок ресуспендировали в 100 мкл среды ЬВ и помещали в виде капли на верх ЬВ-планшета, содержащего 500 мкМ изопропил-β-Οтиогалактопиранозида (ΙΡΤ6). Планшет герметизировали парафильмом и инкубировали вверх дном при 30°С в течение ночи.

На следующие сутки клетки собирали из ЬВ/1РТ6-планшета в 500 мкл среды ЬВ и высевали в разведениях на ЬВ-планшеты, содержащие 150 мкг/мл ампициллина и 75 мкг/мл канамицина (10⁵, 10⁶, 10⁷), содержащие 25 мкг/мл хлорамфеникола (10⁵, 10⁶, 10⁷), и на транспозон-селективные планшеты. Для последних из них 43 порции по 100 мкл разведений 10х высевали на 43 больших ЬВ-планшета, содержащих 25 мкг/мл хлорамфеникола, 75 мкг/мл канамицина и 500 мкМ ΙΡΤ6. Все планшеты инкубировали в течение ночи при 30°С. На следующие сутки соотношение донора и реципиента определяли как 1:587, и суммарное число изолированных клонов определяли как составляющее приблизительно 6800. Эти клоны из транспозон-селективных планшетов собирали и при использовании робота Ор|х переносили в 71 96луночный планшет ^^^^^^^7^), которые содержали на лунку 150 мкл среды ЬВ, содержащей 75 мкл/мл канамицина. Эти планшеты в количестве 71 формировали АА^-библиотеку. Планшеты инкубировали в течение ночи при 30°С со встряхиванием при 500 об/мин в инкубаторе при 85% влажности.

Планшеты реплицировали в новые 96-луночные планшеты, содержащие 150 мкл среды ЬВ с 75 мкг/мл канамицина на лунку. Эти так называемые планшеты серии Б (АVΜ1В-АVΜ71В) снова инкубировали при 30°С со встряхиванием при 500 об/мин в инкубаторе при 85% влажности в течение ночи. После репликации исходных планшетов с получением серии Б и репликации для эксперимента со скринингом по С32 (см. ниже) исходные планшеты и планшеты серии Б после добавления 50 мкл 50%-ного глицерина на лунку и герметизации планшетов замораживали при -80°С.

Пример 2. Высокопроизводительный скрининг на штаммы, ущербные по росту на С32

Для эксперимента по высокопроизводительному скринингу исходные библиотечные планшеты от АугША до АVΜ71А реплицировали в планшеты 0тийгау с твердой средой СВ (на литр: 3 г NаN0з, 1 г К₂НР0₄, 0,5 г Μ§80₄, 0,5 г КС1, 0,01 г Ре80₄; для планшетов: дополнительно 15 г/л бактериального агара), содержащие 75 мкг/мл канамицина, на которые добавляли алкан С32 в виде порошка при использовании стерильного чайного ситечка. Твердый алкан получали помещением стерильных капель н-алкана в стерильную ступку, добавлением жидкого азота и тщательным перетиранием капель. Планшеты инкубировали при 30°С в течение двух (АVΜ36А-АVΜ71 А) и трех суток (АVΜ1А-АVΜ35А) соответственно.

Для идентификации клонов в АVΜ-библиотеке, не способных расти на С32, реплицированные планшеты 0тш1гау, содержащие твердую среду СВ (75 мкг/мл канамицина, добавлен алкан С32), окрашивали добавлением приблизительно 20 мл верхнего агара с ΙΝΤ (среда СВ, 0,05% ΙΝΤ, 1,5% агара) к каждому планшету 0тийгау. После нескольких минут колонии становились видимыми, проявляя красную окраску (пример см. фиг. 2).

Мутанты, которые показали плохой рост или отсутствие роста при использовании алкана С32 в ка

- 18 020184 честве единственного источника углерода (475 клонов), переносили при использовании робота Ορίχ (Сепейх) в 6 96-луночных планшетов со 120 мкл среды ЬВ, содержащей 75 мкг/мл канамицина, на лунку. Перенос делали при использовании планшетов АУМ1В-АУМ71В серии Б, которых во время перенесения оттаивали и снова замораживали. После переноса инкубировали планшеты (АУМ1001-АУМ1004 для клонов без роста и АУМ1005-АУМ1006 для клонов с плохим ростом) в течение ночи при 30°С со встряхиванием при 500 об/мин в инкубаторе при 85%-ной влажности.

Клоны из планшетов после переноса АУМ1001-АУМ1006 реплицировали на нижеследующие планшеты Отпйгау:

ЬВ + 75 мкг/мл канамицина;

ЬВ + 75 мкг/мл канамицина + 25 мкг/мл хлорамфеникола;

СВ + 75 мкг/мл канамицина + 0,5 % ацетата натрия;

СВ + 75 мкг/мл канамицина + алкан С16 (400 мкл алкана С16 наносили на крышки для планшетов, капли получали автоклавированием твердых н-алканов и пипетированием жидкости 50-мкл аликвотами на стерильную чашку Петри);

СВ + 75 мкг/мл канамицина + алкан С32 (алкан С32 добавляли в виде порошка).

Планшеты инкубировали в течение ночи при 30°С. Это высевание реплик с контр-селекцией необходимо для идентификации клонов с нарушенным или отсутствующим ростом только на алкане С32. Идентификация генов, участвующих в разложении длинноцепочечных алканов, возможна только из мутантных клонов, показывающих нарушенный рост исключительно на длинноцепочечных алканах и проявляющих нормальный рост на более короткоцепочечных алканах и на комплексной среде. Эта процедура исключает мутантные клоны с транспозонными нарушениями в генах, не участвующих в разложении алкана С32.

Из реплицированных планшетов 20 клонов показали отсутствие роста на алканах С16 и С32 и нормальный рост на среде ЬВ и на среде СВ, содержащей ацетат. 34 клона не росли при использовании алкана С32 в качестве единственного источника углерода, но показали рост на алкане С16, ЬВ и СВ + ацетат. Эти последние 34 клона характеризовали дополнительно в отношении роста на различных алканах.

По 1 мкл (при использовании 1-мкл инокуляционных петель) каждого из 34 мутантов ресуспендировали в 200 мкл среды ЬВ. Эти клеточные суспензии использовали для посева штаммов на твердую среду СВ, содержащую 75 мкг/мл канамицина с добавлением одного из нижеследующих источников углерода: 0,5%-ный ацетат, алканы С12, С16, С20, С22, С24, С32, С36. Жидкие алканы добавляли в виде 400 мкл на покрышки, твердые алканы добавляли в виде порошков. Планшеты инкубировали при 30°С. Рост клонов регистрировали, и 12 мутантных штаммов, все еще растущих на алкане С24 и в то же время не растущих на алканах С32 и С36, выбирали для дополнительного анализа. 12x3 мл среды ЬВ, содержащей 25 мкг/мл хлорамфеникола и 75 мкг/мл канамицина, инокулировали 12-ю соответствующими мутантными штаммами (АУМ1001Н3, Е6, А11; АУМ1002С8, АУМ1003Е4, Е5, С6; АУМ1004А2, С4, Ό5, А6, А7). Культуры инкубировали в течение ночи при 30°С и 200 об/мин на встряхиваемом инкубаторе для консервации штаммов и получения хромосомной ДНК. После инкубации клоны замораживали при 80°С при конечной концентрации глицерина 25%.

Пример 3. Идентификация а1тА

Из 2 мл каждой из 11 культур, указанных выше, получали хромосомную ДНК при использовании набора ПЫАеаку Т155ие Κίΐ (01адеп) в соответствии с протоколом для грамотрицательных бактерий. Хромосомную ДНК расщепляли рестриктазой ΗίηάΙΙΙ и затем снова лигировали после термальной инактивации этой эндонуклеазы.

ПЦР на лигатах при использовании олигонуклеотидов Кап1(5'ССТСТАСАСССТСААСТСАСССТААТСС-3' 8ЕО ΙΌ N0:6) и Тп10:1 (5'-ССАТСАТАТСАСААСАТСТС-3' 8ЕО ΙΌ N0:7) в качестве праймеров давала продукты ПЦР для АУМ1001Н3, АУМ1001Е6, АУМ1003Е4, АУМ1003Е5, АУМ1003С6, АУМ1004А2 (2 продукта), АУМ1004А6, АУМ1004С4, АУМ1004Э5 и АУМ1004А7). Продукты ПЦР изолировали после гель-электрофореза на агарозе при использовании набора ΟίαςυίοΕ Се1 ЕхИасЕоп Κίΐ (01адеп). Прямое секвенирование осуществляли на очищенных продуктах ПЦР при использовании олигонуклеотидов Тп10:1 (АУМ81, 3-10,15-18) и Кап1 (АУМ82; только АУМ1001Н3) в качестве праймеров в последовательности циклов. АУМ83 и 7 (АУМ1001Е6 и АУМ1004А2) не дали читаемых последовательностей и были анализированы снова как АУМ815 и АУМ816, 17 на новой партии продуктов ПЦР. АУМ81, 6, 8 и 9 (АУМ1001Н3, АУМ1003С6, АУМ1004С4, АУМ1004Э5) оказались идентичными. Полученные последовательности использовали для поиска в базе данных В1а$1М

Клон АУМ1004А7, несущий транспозонное нарушение в предполагаемом гене монооксигеназы (позже названном как а1тА), потенциально участвующем у Асше!оЬас!ег 5р. Ό8Μ17874 в разложении длинноцепочечных алканов, исследовали в отношении роста на длинноцепочечных алканах в сравнении со сконструированным нокаутным мутантным штаммом МАУ1.

На основании результатов исходного секвенирования АУМ1004А7 можно определить олигонуклеотиды для амплификации хромосомной ДНК вокруг сайта вставки транспозона. На продукте ПЦР, полученном с олигонуклеотидами АУМ1004А7-1 (5'-АСССТСТАСААСССАТТАСС-3' 8Е0 ΙΌ N0:8) и

- 19 020184

АУМ1004А7-2 (5'-АСТТСТСАТСАТССССАСТС-3' 8Е0 ΙΌ N0:9), секвенирование осуществляли при использовании АУМ1004А7-1 и АУМ1004А7-2 (АУМ8 13-14) в качестве праймеров секвенирования. Результаты расширили известную информацию последовательности а1тА до приблизительно 600 пар нуклеотидов, достаточных для конструирования нокаутного мутантного штамма (МАУ1) при использовании вектора самоуничтожения.

Пример 4. Конструирование нокаутного мутантного штамма а1тА МАУ1

Для получения нокаутного мутантного штамма а1тА надо клонировать достаточно длинную последовательность ДНК а1тА в вектор, не способный к репликации в Асте1оЬас1ег 5р. Ό8Μ17874 и переносимый из Е. сой817-1 (А- рй) в Асте1оЬас1ет 5р. Ό8Μ17874 конъюгацией. Вектором, соответствующим этим требованиям, является р80К804 (8екитоуа е! а1., 2004, I Вас1епо1 186(5): 1345-54, фиг. 5А). При использовании хромосомной ДНК Асте1оЬас1ег 5р. Ό8Μ17874 в качестве матрицы осуществляли ПЦР при использовании олигонуклеотидов АУМ1004А7-3 5'-ССТСТАСАСТАТССТССТАТТССТТСАС-3' 8Е0 ΙΌ N0:10) и АУМ1004А7-4 5'-ССССАТССТАААТАССАССТТСС АТАСС-3' 8Е0 ΙΌ N0:1 1) в качестве праймеров. Продукт ПЦР изолировали из агарозного геля при использовании набора 01ацшск Се1 Ехйасйоп К11 (01адеп). Продукт ПЦР и вектор р80К804 расщепляли рестриктазами ВатН1 и ХЬа1. Фрагмент вектора и расщепленный продукт ПЦР изолировали гель-электрофорезом и далее экстракцией из геля при использовании набора 01ацшск Се1 Ехйасйоп Κί( (01адеп). Вектор и продукт ПЦР лигировали с получением плазмиды рЬАЬ50 (фиг. 3В). Компетентные клетки Е. сой 817-1 (λ рй) трансформировали продуктом лигирования. Плазмидную ДНК получали из трансформантов и клонирование фрагмента а1тА подтверждали рестрикционным анализом. Конъюгацию между Асте1оЬас1ег 5р. Ό8Μ17874 и Е. сой 817 1 (λ, р1г)/рЬАЬ50 осуществляли таким же способом, какой описан выше для получения транспозонной библиотеки. После селекции по устойчивости против апрамицина (которую обеспечивает интеграция рЬАЬ50) и хлорамфеникола (Асте1оЬас1ет 5р. Ό8Μ17874 обладает природной устойчивостью к хлорамфениколу), можно детектировать, два конъюганта Клоны МАУ1 были подтверждены 8ои1йегпблоттингом в соответствии с руководством Еосйе при использовании зонда, специфичного к а1тА.

Пример 5. Характеристика мутантных штаммов а1тА АУМ1004А7 и МАУ1

Из содержащих 25%-ный глицерин культур, хранящихся при -80°С, высевали клетки Асте1оЬас1ег 5р. Ό8Μ17874 (1), АУМ1004А7 (2) и МАУ1 (3) на ЬВ-планшеты, содержащие 30 нг/мл хлорамфеникола (1), 50 (мкг/мл канамицина (2) или 50 мкг/мл апрамицина (3). Планшеты инкубировали в течение ночи при 30°С. Отдельную колонию каждого штамма пересевали на содержащие антибиотики ЬВ-планшеты, которые снова инкубировали в течение ночи при 30°С. Затем два селективных ЬВ-планшета для каждого штамма инокулировали пересевами с планшетов после предыдущего пересева и использовали как предварительные культуры после еще одной инкубации в течение ночи с получением достаточной биомассы для инокуляции.

Клетки собирали из планшетов в каждые 6 мл среды СВ и использовали для инокуляции после определения 0Ό₆₀₀.

К 100 мл среды СВ, не содержащей антибиотики (1) или содержащей 50 мкг/мл канамицина (2) или 50 мкг/мл апрамицина (3), добавляли по 7х50 мкл твердых капель алканов С20, С24, С32 и С36. Среду инокулировали бактериальными клетками трех штаммов до конечной 0Ό₆₀₀ 0,05 (1: 0,064, 2: 0,056, 3: 0,066). Культуры выращивают при 30°С со встряхиванием при 200 об/мин в течение 2 недель. 2-мл пробы культур брали каждый 24 ч и бактериальные клетки из проб осаждали в микроцентрифуге (15000 об/мин, 5 мин, К.Т.). Супернатант отбрасывали и бактериальный осадок перед определением содержания белка хранили при -20°С. После последнего взятия проб все пробы серии оттаивали при К.Т. и бактериальный осадок редиспергировали в 400 мкл бН₂0 (2-мл реакционная пробирка). Пробу инкубировали в ультразвуковой бане в течение 10 мин и затем кипятили в водяной бане еще 10 мин. 2х 160 мкл равномерно диспергированной пробы анализировали в микротитровальном планшете в двух параллелях при использовании концентрата для анализа белка Вю-Ваб. Разведения, полученные с бН₂0, использовали при необходимости. Разведения бычьего сывороточного альбумина (В8А) (80, 70, 50, 30, 10, 8 и 5 мкг/мл в бН20) использовали в двух параллелях в качестве стандарта на каждом планшете. 40 мкл концентрата добавляли к разбавленным пробам и стандартам. Планшет инкубировали на планшетном шейкере МТ при 900 об/мин в течение 30 мин перед фотометрическим измерением при длине волны 595 нм. Концентрации белка в пробах определяли по стандартной кривой В8А и фактору разведения. Концентрации белка откладывали против времени с получением кривых роста при использовании 8щтаР1о1 9 (фиг. 4).

Все три штамма показали сравнимый рост на алканах С20 и С24, начиная немедленно после инокуляции. На алканах С32 и С36 штамм Асте!оЬас1ег 5р. Ό8Μ17874 рос хорошо (сравнимо с алканами С20 и С24 ), в то время как АУМ1004А7 сначала показывал отсутствие роста и начинал расти после приблизительно 100 ч инкубации. МАУ1 сначала показывал отсутствие роста до приблизительно 250 ч, прежде чем можно было детектировать рост культуры.

Эти результаты показывают, что присутствие функционального гена а1тА является необходимым для роста Асте1оЬас1ет 5р. Ό8Μ17874 на длинноцепочечных алканах, таких как С32 и С36, и из них следует центральная роль а1тА в утилизации этих н-алканов. Тот факт, что оба, АУМ1004А7 и МАУ1, на

- 20 020184 чинали расти в пределах времени эксперимента по росту, может быть результатом разложения антибиотиков канамицина и апрамицина. Отсутствие антибиотиков должно ослаблять селективное давление на поддержание интегрированного транспозона или вектора и может сделать возможной реверсию к дикому генотипу и фенотипу с функциональным а1тА гомологичной рекомбинацией или эксцизией транспозона.

Пример 6. Определения полной последовательности для гена а1тА

Хромосомную ДНК ΆνΜ1004Ά7 изолировали и расщепляли рестриктазой Руи1. Расщепленные фрагменты снова лигировали и использовали в качестве матрицы в последующих ПЦР. ПЦР при использовании олигонуклеотидов Тп10:1 и Кап2 в качестве праймеров давала продукт ПЦР размером приблизительно 4,1 нп. Прямое секвенирование осуществляли на этом продукте ПЦР при использовании олигонуклеотидов Тп10:1 и Кап2 в качестве праймеров. Последовательности (АА1, АА2) выявили последовательность ДНК перед геном а1тА (30Б-рибосомальный белок Б11).

Три ПЦР осуществляли для амплификации области а1тА в двух фрагментах. Первая ПЦР (1) при использовании ΆVΜ1004Ά7-4 и АVΜеxΐ2 (5'-САА66ТААТ6САТТ66СТТ666СТАССТСА0-3' БЕО ΙΌ N0:12) в качестве праймеров привела к продукту размером приблизительно 4,1 т.п.о. (5'-часть); вторая ПЦР (2) при использовании ΆVΜ1004Ά7-2 и АVΜеxι1 (5'-ТТСТАТ0ААААА0АА0ТТОТТССАААТАТТО-3' БЕО ΙΌ N0:13) в качестве праймеров привела к продукту размером приблизительно 2,6 т.п.о. (3'-часть); третья ПЦР (3) при использовании ΆVΜ1004Ά7-3 и АVΜеxΐ1 в качестве праймеров дала продукт размером приблизительно 3,2 т.п.о. (3'-часть, удлиненная). При использовании продуктов ПЦР (1) и (2) в качестве матриц прямое секвенирование осуществляли при использовании олигонуклеотидов ΆVΜ1004А7-1 (1: АА5) и ΆVΜ1004А7-2 (2: АА6). Эти результаты секвенирования (АА5, АА6) сделали возможным определение олигонуклеотидов для дополнительного секвенирования (АА6) и дали информацию о последовательностях, в том числе промоторного участка а1тА и старткодона АТС (АА5).

Продукт ПЦР (3) клонировали в плазмиду рΜ0БВ1ие при использовании набора для клонирования рΜ0БВ1ие ВйпИ-епбеб РСК (Атег5Йат). Секвенирование плазмидной ДНК, полученной из трех индивидуальных клонов (М3: АА15-17; М5: АА19-21; М6: АА23-25), осуществляли при использовании АVΜ1004А7-2 (АА15, АА19, АА23), АVΜ1004А7-3 (АА16, АА20, АА24) и АVΜ1004А7-5 (5'С6ТТТАТ6Т6ТТ6Т6ССА6АТ66Т0-3' БЕО ΙΌ N0:14, АА17, АА21, АА25). Последовательности АА5 и АА15-17, АА19-21 и АА23-25 объединяли с получением одного контига, включающего в себя полный ген а1тА, включая промоторную область и информацию о последовательности для области позади а1тА.

Пример 7. Определение полной последовательности гена огГ1 (а1тВ)

Из последовательностей АА17, АА21 и АА25 после интергенной области в 124нп можно идентифицировать старт-кодон для другой открытой рамки считывания. Для расширения информации о последовательности этого предполагаемого гена осуществляли дополнительное секвенирование при использовании вышеуказанных плазмидных клонов М3 (АА27, АА30), М5 (АА28, АА31) и М6 (АА29, АА32) в качестве матриц и олигонуклеотидов АVΜеxι3 (5'-0АААТАТС6С6ТАТАТТ6А6САСАТТА0-5' БЕО ΙΌ N0:15, АА27-29) и АVΜеxΐ4 (5'-АТТ0ТС6АТАТАТ6С6С6Т0С-3' БЕО ΙΌ N0:16, АА30-32) в качестве праймеров в ПЦР для секвенирования.

Эти две стадии блуждания праймера выявили полную последовательность новой открытой рамки считывания, далее называемой здесь а1тВ, и закрыли пробел до 3'-конца следующего позади гена ГабЕ (ацил-КоА-дегидрогеназа), ранее идентифицированного в качестве гена с противоположной ориентацией позади а1тА. Относительные положения всех идентифицированных генов показаны в фиг. 7.

Последовательности, полученные выше, были затем подтверждены следующим образом. Для амплификации нуклеотидной последовательности а1тАВ осуществляли четыре индивидуальных ПЦР при использовании хромосомной ДНК Асте!оЬас1ег 5р. ^БΜ17874 в качестве матрицы и праймеров: а1тАргот-ир (0АСАТ6Т6ТАТТ6ТСАААТТТ6Т0С БЕО ΙΌ N0:17) и а1тВ-епб-1о/огГ1-епб-1о (ССААТСАОАТСАТОбААОААС БЕО ΙΌ N0:18). Для минимизации возможных ошибок использовали смесь Ехрапб Н1дй Р1бе1йу Μίχ (Косйе), содержащую полимеразу с редактирующей активностью; предполагаемый продукт ПЦР размером 2272 нп получали во всех 4 ПЦР. Продукт прогоняли на 0,8%-ном агарозном геле и четыре продукта ПЦР вырезали и подвергали индивидуально экстракции с геля при использовании набора 01ас.|шск Се1 ЕхКасйоп Кй (01адеп).

Продукты ПЦР лигировали параллельно в вектор рΜ0БВ1ие из набора рΜ0Б В1ие ВйпИ-епбеб РСК С1оп1пд К11 (Атег5Йат) при последующей трансформации в соответствии с руководством от изготовителей. Шесть клонов каждого клонирования, показавших белые колонии, подвергли скринингу в ПЦР при использовании праймеров АVΜеxι3 (6АААТАТС6С6ТАТАТТ6А6САСАТТА0 БЕО ΙΌ N0:15) и а1тВ-епб-1о. Клоны, показавшие предполагаемый продукт ПЦР, идентифицировали для клонирований 1, 2 и 3.

Из этих клонов получили мини-плазмиды при использовании системы Αί/агб Р1и5 Μ^η^р^ер5 ^NА РппПсабоп Бу51ет (Рготеда). Рестрикционный анализ плазмидной ДНК при использовании ЕсоШ выявил клоны АВ1.1 (клонирование 1, клон 1), АВ2.6 (клонирование 2, клон 6) и АВ3.5 (клонирование 3,

- 21 020184 клон 5), показавшие ожидаемые полосы в анализе гель-электрофорезом. Эти три плазмидных клона использовали для определения последовательность области а1шАВ.

Секвенирование осуществляли при использовании нижеследующих праймеров в секвенирующих ПЦР от АА'109 до А^141.

Праймеры	Клон 1.1	Клон 2.6	Клон 3.5
прямые
а1тА-ргот-ир	Αννΐ09	Α1Λ/110	Αν\/111
ΑνΜ1004Α 7-2 ЗЕО Ю N0:9 (АсттсгедтсАГсебсдсгс)	АУЛ12	АУУ113	Α\Λ/114
АУМ1004А7-5 ЗЕО Ю N0:14 (СС ГГГА ГО ГС 776 Г6ССА6А гес Тв)	Αννΐ15	Αννΐ16	АУ7117
АУМех13	А1Л/118	Αννΐ19	АУУ120
Ы 1x1.1 ЗЕО Ю N0:19 (вТА ТбСвСТТАССААААвАТАТв ААСССА6САССА в ТА вСТв)	А\Л/121	АУУ122	АУУ123
обратные
АУМ1004А7-6 8ЕС1 Ю N0:20	Α1Λ/124	АУУ125	ΑΙΛ/126
(6ΑΘΑ6Α Т6ГАСА6СГААСССААГССС)
АУМ1004А7-1 ЗЕО Ю N0:8 (АСССТвТАСААСССА ТТАСв)	АУ/127	Αννΐ28	АУУ129
АУМ1004А 7-4 ЗЕО Ю N0:11 (СвввАТССТАААТАССАСвТТвСАТАСС)	АУ/130	ΑΧΛ/131	АУ/132

А7М1004А7-7-$рЬ ЗЕО Ю N0:21 (вСвСвСвСАТвСААТСАТСАТ ТСССАТАТТАОвСАС)	А1Л/133	АУУ134	АУУ135
Μ1χ1.2 ЗЕО Ю N0:22 (САС СТА СТвв ТССТСОСТТСА Т А ТСТТТТвв ТААвСОСА ТАС)	АУ/136	АУУ137	АУ/138
а1тВ-епс1-1о	Αννΐ39	АУУ140	АУУ141

Нижеследующие последовательности можно соединить с получением одного контига области а1шАВ (а1шА-огГ1): А№109-141 за исключением А№115, А№116, А№121, А№122, А№123, А№135, А\У137 и А\У138. Результаты представлены на фиг. 6-10.

Полученную консенсусную последовательность кодирующих областей а1шА и а1шВ (фиг. 6 и 8), предполагаемые пептидные последовательности А1шА и А1шВ, выведенные из генных последовательностей (фиг. 7 и 9), и последовательность полной области а1шАВ (а1шА-огГ1) (фиг. 10) показаны на основании прямых и обратных последовательностей трех независимых клонов.

Кодирующая область а1шА состоит из 1494 пар нуклеотидов, кодирующих белок из 498 аминокислот. Последовательности как для ДНК кодирующей области, так и для выведенного пептида представлены на фиг. 6 и 7. Пептидная последовательность А1шА показывает 76,0%-ную гомологию с белком из полностью секвенированного штамма Асте1оЬас1ег ер. АЭР1 (А. Ьау1у1 АЭР1) в простом поиске в В1ав1Р. Предсказано, что белок АС1АО3192 является предполагаемой флавин-содержащей монооксигеназой без конкретной функциональной привязки. Идентичность гена, кодирующего монооксигеназу АЭР1, последовательности а1шА определена на основе нуклеотидов при использовании Β1;·ιβΐΝ в 74,6%. Из предсказаний вторичной структуры (ТΜр^еά) следует, что А1шВ представляет собой предполагаемый мембранный белок внутренней бактериальной мембраны с тремя трансмембранными α-спиралями.

Также найдено, что А. Ьау1у1 АЭР1 и Асте1оЬас1ег ер. РАС-1 и М-1 растут при использовании С32 и С36 соответственно, в качестве единственного источника углерода (результаты не показаны, а также 8ака1, Υ е1 а1., 1994, Вювс1 Вю1ес1то1 ВюсНеш 58:2128-2130). Гены, гомологичные а1шА и а1шВ, также идентифицированы в Асте1оЬас1ег вр. РАС-1 и Асте1оЬас1ег вр. М-1 при использовании ПЦР с праймерами А1шА ргош-цр (САСАТСТСТАТТСТСАААТТТСТСС 8ЕС ΙΌ N0:17) и а1шВ-епй-1о и а1шВ-епй-1о (ССААТСАСАТСАТССААСААС 8Е0 ΙΌ N0:18) с последующим блужданием праймеров. Последовательность вышеуказанного гена АС1АЭ3192 Асте1оЬас1ег Ьау1у1 АЭР1 получена из СепВапк, № доступа N^005966 (2).

Гомолог а1шВ (огГ1) не присутствует в Асте1оЬас1ег вр. АЭР1. Гены а1шА и а1шВ (огГ1) имеют одну и ту же ориентацию и могут потенциально образовывать оперон. Ген а1шВ (огГ1) предположительно кодирует белок из 166 аминокислот, содержащий №концевую сигнальную последовательность для секреции предсказанного белка. Функция а1шВ (огГ1) в настоящее время неизвестна. Поиски в базах данных не выявили значительных гомологии с другими известными белками. Тем не менее, близкая ассоциация с А1шА может указывать на ассоциацию а1шВ со способностью Асте1оЬас1ег вр. Ό8Μ17874 разлагать длинноцепочечные н-алканы.

Пример 8. Комплементация активности а1шА в ущербном по а1шА мутанте ΜАV1 Асте1оЬас1ег вр.

- 22 020184

Введение гена а1тА на плазмиде в ущербный по а1тА штамм МЛУ1 восстанавливало способность штамма расти с алканами С32 и С36 в качестве единственного источника углерода почти до уровня дикого типа (фиг. 13). Плазмиду получали нижеследующим образом: ген а1тА Лстс1оЬас1сг 5р. Ό8Μ 17874 амплифицировали в ПЦР при использовании хромосомной ДНК из Лстс1оЬас1сг 5р. Ό8Μ 17874 в качестве матрицы. Продукт ПЦР расщепляли рестриктазами 8рЫ и Ыаг1 и лигировали в аналогичным образом расщепленный вектор рОЬМ02.1 с получением плазмиды рЛЬМЛЬ.

Это результат подтвердил, что ущербность по разложению длинноцепочечных алканов у МАУ1 не вызвана полярным эффектом в генах позади а1тА, и что ущербность по а1тА не является ответственной за неспособность мутанта МАУ1 использовать длинноцепочечные алканы.

Ген АС1АО3192 из А. Ьау1у1 АЭР1 является ближайшим гомологом гена а1тА, найденным в базах данных. Поэтому этот ген был выбран для гетерологичной функциональной комплементации ущербного по а1тА мутанта МАУ1 Асте1оЬас1ег 5р. Плазмиду получали нижеследующим образом: ген АС1АП3192 из А. Ьау1у1 АОР1 амплифицировали в ПЦР при использовании хромосомной ДНК из А. Ьау1у1 АОР1 в качестве матрицы. Продукт ПЦР расщепляли рестриктазами 8рЫ и Ыаг1 и лигировали аналогичным образом расщепленный вектор рЭЬМ02.1 с получением плазмиды рАСТАОК

МАУ1, несущий ген АСIЛ^3192 на плазмиде, показал рост с алканами С32 и С36 (фиг. 13), что ясно показывает, что продукт этого гена представляет собой функциональный гомолог А1тВ в пути утилизации длинноцепочечных алканов.

- 23 020184

Перечень последовательностей <110> ЗЬароИ АЗА <120> Молекулы нуклеиновой кислоты <130> 1.91614/01 <150> (3Β0612538.9 <151> 2006-06-23 <160> 24 <170> РаСёпИп νβΓδίοη 3.3 <210> 1 <211> 1491 <212> ДНК <213> АсхпеСоЬасЪег зр.

<400> 1

аСдяаааадс	аадЬСдаСдС	аССдасеаСб	дд1:дсадд£а	1сСсРдддаС	СдддСЬадсР	60
дСасаСсСсЬ	сЯаааааСЬд	Ессасаасдс	аааСЪ^дааа	ЮЬ^ададсд	Ссд^дааадс	120
ГЬЬддСддаа	сЪЬдддаСЪР	а^ЬссдсСаС	ссъдд£а££с	дь б.садатЛс	£даГаГдЬса	180
асдЕГОддИ	^РаасССсаа	дссаСдддса	ааадасааад	Гдс^ддсСад	сддСдсЬдад	240
аУсаааддс!	аЬРСаадСда	ЬдЪдаССадС	дааааГсадС	Ьаааадасаа	аасксаспе	300
ддбсаСсд^д	^асс^бсСдс	даассабда^	^сСасааада	аааааСддС6	адЕСдадаЬс	360
даадабааса	асаадааааа	асааасдбдд	(зсСдсааасС	ЬсдСаабддд	ССдЪасаддд	420
ЬасСаСаасЬ	асдаСсаадд	Сбабдсасс!	аадС^сссда	аасаадаада	СЫзсаааддб	480
садЬЬбаЬЬс	абссасадса	сбддссадаа	ааСЕСада^С	асасаддбаа	аааадСЬдЬд	540
аЬсаЬсддса	дСддЬдсаас	СдсааЫ:асс	с^Сд^ассс^	сСаСддСсаа	аддОддОдса	600
ддСсабдСда	сдард^Саса	асд!6сдсса	асд£а1аЪ£д	сдасдаИсс	ССсСаСсдас	660
СГЬаСОбаРд	аааааасасд	СааабЛЪабд	ЪсСдаадааа	сддсССабаа	аШасСсдб	720
дсасд!ааСа	ОбддСаСдса	асдЕддСаСС	1:а1:дсдс£ад	сдсаааадЪа	Ъссааааасб	780
дГасдСсдСС	Саг.бдССдаа	аддсаССдад	Ъ^дсадг^да	ааддсааадр	ддаЪаСдааа	840
сасЪЫасбс	саадСЬасаа	СссЫдддаб	саасдИСИаЪ	дСдЬСдСдсс	ада^ддЬдаС	900
ЫаЪЬсааад	саЫдсдСда	аддСсаддса	адЬд^Ёдада	садаЬсааа!	сдадаааССс	960
ассдсаааСд	дОаССсааСС	даааСсОддС	ааасаСШ^ад	аддсбдаЬаб	ЬдЬдаЫ:Ьса	1020
дсаасСддСС	ЪададаГЬса	даСССеаддб	дд£д£ссаад	дбСсааСсда	£дд!ааасса	1080
абдааСасаЬ	сЬсаасабаб	дсЪЪЪабсаа	ддсд^ЪаСдд	СдадсдабдЪ	дссЪааСабд	1140
дсааСдабса	1 ЪддЫабас	сааСдсдбса	ЪддасМ:Сда	аддГСдаСаС	СдсСдс1даЬ	1200

- 24 020184

саСаЬЫздсс	дСЬ сдаЬЬаа	ЕсаЕа^ддаС	ааааабддЫ:	ЬЕдаСдаддС	даССдсасас	1260
дссдаЬссЫ:	сасадсдсда	ааакдасасс	аОсаЬдддЬа	аааГдЬсаЕс	ЬддЬЬаЬаЬс	1320
дсссдсдсад	сддаЬдЬдаЬ	дссаааасаа	ддраадсаад	сассЬЬддаа	даЬсасаааЬ	1380
ааЕЬассССд	садаЬсдЬаа	ддадЕСаааа	даЬдсСаадб	СЬааЬдаЬдд	ЬдЬЬЬЬадаа	1440
Ытссабаадс	дсддйдадса	аасадсааас	сдЬаадссаа	аабСадбаСс	а	1491

<210> 2 <211> 497 <212> РЙТ <213> ЛстпеТоЬас!61 зр <400> 2

МеЬ 1

С1и

Ьуз

С1п

Уа1 5

Азр

Уа1

Ьеи 11е

Не С1у А1а 10

С1у

Не

Зег 15

Е1у

Не

С1у

Ьеи

А1а

Уа1

ΗΪ8

Ьеи

Зег

Ьуз

Азп

Суз

Рго

01п

Агд

Ьуз

РЬе

20

25

30

С1и

Не

Ьеи

61и

Агд

С1и

Зег

РЬе

С1у

61у

ТЬг

Тгр

Азр

Ьеи

РЬе

35

40

45

Агд

Туг

Рго

61у

Не

Агд

Зег

Азр

Зег

Азр

МеЬ

Зег

ТЬг

РЬе

С1у

РЬе

50

55

60

Азп

РЬе

Ьуз

Рго

Тгр

А1а

Ьуз

Азр

Ьуз

Уа1

Ьеи

А1а

Зег

С1у

А1а

61и

65

70

7 5

80

11е

Ьуз

Й1у

Туг

Ьеи

Зег

Азр

Уа1

Не

Зег

<31и

Азп

Й1п

Ьеи

Ьуз

Азр

85

90

95

Ьуз

Не

Низ

РЬе

<31 у

Н1з

Агд

Уа1

Ьеи

Зег

А1а

Азп

Туг

Азр

Зег

ТЬг

100

105

110

Ьуэ

ьуз

Ьуз

Тгр

Ьеи

Уа1

С1и

Не

С1и

Азр

Азп

Ьуз

С1п

115

120

125

ТЬг

Тгр

Зег

А1а

Азп

РЬе

Уа1

МеЬ

С1у

Суз

ТЬг

51у

Туг

Азп

Туг

130

135

140

Азр

С1п

61у

Туг

А1а

Рго

Ьуз

РЬе

Рго

Ьуз

61п

С1и

Азр

РЬе

Ьуз

61у

145

150

155

160

С1п

РЬе

Не

ΗΪ3

Рго

С1п

Н15

Тгр

Рго

е1и

Азп

Ьеи

Азр

Туг

ТЬг

61у

165

170

175

- 25 020184

Ьуз

УаЬ

УаЬ 180

ЬЬе

СЬу Зег

СЬу 185

АЬа

ТЬг

АЬа

ЬЬе

ТЬг 190

Ьеи

УаЬ

Рго

Зег

МеЬ

УаЬ

Ьуз

СЬу

СЬу АЬа

СЬу

НЬз

УаЬ

ТЬг

Мее

Ьеи

С1п

Агд

195

200

205

Зег

Рго

ТЬг

Туг

ЬЬе

АЬа

ТЬг ЬЬе

Рго

Зег

ЬЬе

Аэр

РЬе

11е

Туг

СЬи

2Ь0

215

220

Ьуз

ТЬг

Агд

Ьуз

РЬе

Меь

5ег СЬи

СЬи

ТЬг

АЬа

Туг

Ьуз

РЬе

ТЬг

Агд

225

230

235

240

АЬа

Агд

Азп

ЬЬе

СЬу

Мер

СЬп Агд

СЬу

ЬЬе

Туг

АЬа

Ьеи

АЬа

СЬп

Ьуз

245

250

255

Туг

Рго

Ьуз

ТЬг

УаЬ

Агд

Агд Ьеи

Ьеи

Ьуз

СЬу

ЬЬе

СЬи

Ьеи

СЬп

260

265

270

Ьеи

Ьуз

СЬу

Ьуз

УаЬ

Азр

МеЬ Ьуз

НЬз

РЬе

ТЬг

Рго

Эег

Туг

Азп

Рго

275

280

285

Тгр

Азр

СЬп

Агд

Ьеи

Суз

УаЬ УаЬ

Рго

Азр

СЬу

Азр

Ьеи

РЬе

Ьуз

АЬа

290

295

300

Ьеи

Агд

СЬи

СЬу

СЬп

АЬа

Зег УаЬ

СЬи

ТЬг

Азр

СЬп

ЬЬе

СЬи

Ьуз

РЬе

305

ЗЬО

315

320

ТЬг

АЬа

Азп

СЬу

ЬЬе

СЬп

Ьеи Ьуз

Зег

СЬу

Ьуз

НЬз

Ьеи

СЬи

АЬа

Азр

325

330

335

Не

УаЬ

Не

Зег

АЬа

ТЬг

СЬу Ьеи

СЬи

Не

сьп

Не

Ьеи

СЬу

УаЬ

340

345

350

СЬп

СЬу

Зег

1Ье

Азр

СЬу

Ьуз Рго

Мес

Азп

ТЬг

Зег

СЬп

НЬз

Мер

Ьеи

355

360

365

Туг

01 η

СЬу

УаЬ

МеЬ

УаЬ

Зег Азр

УаЬ

Рго

Азп

Ме£

АЬа

Мер

11е

Не

370

375

360

СЬу

Туг

Не

Азп

АЬа

Зег

Тгр ТЬг

Ьеи

Ьуз

УаЬ

Азр

Пе

АЬа

Азр

365

390

395

4 00

Туг

Не

Суз

Агд

Ьеи

11е

Азп Н1з

МеЬ

Азр

Ьуз

Азп

С1у

РЬе

Азр

СЬи

405

410

415

- 26 020184

Уа1

Не

А1а

НЬз А1а 420

Азр Рго Зег С1П Агд 01и 425

Азп Азр

ТЬг 430

Не

Мес

С1у

Ьуз

Меь

Зег

С1у

Туг

11е

А1а

Агд

А1а

Азр

νβΐ

Мес

Рго

435

440

445

Ьуз

С1п

С1у

Ьуз

С1п

А1а

Рго

Тгр

Ьуз

Не

ТЬг

Азп

Туг

Ьеи

А1а

4 50

455

4 60

Азр

Агд

Ьуз

С1и

Ьеи

Ьуз

Азр

А1а

Ьуз

РЬе

Азп

Азр

С1у

Уа1

Ьеи

61и

465

470

475

480

РЬе

Н1з

Ьуз

Агд

С1у

С1и

С1п

ТЫ

А1а

Азп

Агд

Ьуз

РГО

Ьуз

Ьеи

Уа1

485

4 90

4 95

Зег <210>3 <211>496 <212> ДНК <213> Ас1пеЬсЬаЫег зр <400> 3

аЬдадааааа	ЬсаЬсатЬ	ддддасЬаЬс	ЬПасЬЬадЬа	саЬЬсадЬЬа	ьдсьдаьдаь	60
дЬЬааасааа	адасадсааЬ	ЬдсЬдадаад	ЬЬддЫЬсдд	ЬЬдаЬддЬас	Ьдаасаадда	120
с':ЬдааааЬа	сддаЬааааЬ	даЬЬсЬЬдаа	саааЬЬсдЬа	ьдсдсььасс	аааадаЬаЬд	180
ссадсбааЫ	ЫЫсасЬда	ЬЬЬаасЬааа	аасЬЬаааЬа	дЬдаасаасд	ЬааасааСЫ	240
аНдЬьсадс	дЫаЬдЬдда	аасдЬЬЬадс	садааададЬ	Ьасаадссдс	ЫЬааасЬМ	300
ЬаЬсадЬсаа	аЬдаадддаа	ддсдЬдддса	аадааадсаа	дЬдаааЫдд	аддададдЫ	360
дсЬсаЫЬса	саасдсаааа	ЬдсьсдЬааЬ	дсЫЫаааса	сЬассаЬдса	адаасаЬдЬЬ	420
дадааЬсска	ссдЬааааса	дЫаабддсЬ	сд^абдаасс	садсассадб	адсЬдсддба	4 80
дааааадсьд	аасадааа					4 98

<210>4 <211> 166 <212> РКТ <213> АсхпеСоЬасЬег зр <400>4

МеЬ 1

Агд

Ьуз

11е

11е 5

11е

Ьеи С1у

ТЫ

11е 10

Ьеи

Зег

ТЬг

РЬе 15

Зег

Туг

А1а

Азр

Уа1

Ьуз

С1п Ьуз

ТЬг

А1а

11е

А1а

С1и

Ьуз

Ьеи

Уа1

- 27 020184

2530

Зег

Уа1

Азр 35

С1у ТЬг С1и С1п

<31у Ьеи С1и 40

Азп

ТЬг

Азр 45

Ьуз

МеЬ

11е

Ьеи

Й1и

61п

11е

Агд

МеЬ

Агд

Ьеи

Рго

Ьуз

Азр

МеЬ

Рго

А1а

Азп

РЬе

50

55

60

РЬе

ТЬг

Азр

Ьеи

ТЬг

Ьуз

Азп

Ьеи

Азп

Зег

С1и

С1п

Агд

ьуз

С1п

РЬе

65

70

75

80

Не

Уа1

С1п

Агд

Туг

Уа1

<31и

ТЬг

РЬе

Зег

51п

Ьуз

61и

Ьеи

01п

А1а

85

90

95

А1а

Ьеи

Азп

РЬе

Туг

С1п

Зег

Азп

<31и

<31у

Ьуз

А1а

Тгр

А1а

Ьуз

100

1.05

110

А1а

Зег

С1и

Не

С1у

С1и

А1а

Н18

РЬе

ТЫ

ТЬг

61п

Азп

А1а

115

12.0

125

Агд

Азп

А1а

Ьеи

Азп

ТНк

ТЬг

МеЬ

С1п

С1и

Н1з

Уа .1

С1и

Азп

Рго

ТЬг

130

135

140

Уа1

Ьуз

С1п

Ьеи

МеЬ

А1а

Агд

МеЬ

Азп

Рго

А1а

Рго

Уа1

А1а

Уа1

145

150

155

160

С1и

Ьуз

А1а

б1и

61п

Ьуз

165 <210>5 <211>2272 <212> ДНК <213> АсЬпеЬоЬасЬег зр <400> 5

дасаЬдЬдЬа	ЬЬдЬсаааЬС	ЬдЬдсЫЬаа	ЬааадЬсаЬд	дСЬЬаЬасад	ддЬаЬааааа	60
аааСддаааа	дсаадЬСдар	дЬаЬЬдаЬСа	ЬЬддЬдсадд	ьаСсЬсЬддд	аььдддььад	120
сЬдЬасаСсе	сЬсЬаааааЬ	ЬдЬссасаас	дсаааЫЬда	ааЬсЬЬадад	сдьсдьдааа	180
дсьььддьдд	аасЬСдддаЬ	ЬСаЬЬссдсЬ	аЬссЬддЬаЬ	ЬсдЬЬсадаЬ	ЬсСдаСаСдЬ	240
саасдЬСЬдд	ЬЬССаасЬЬс	аадссаЬддд	саааадасаа	адЬдЬЬддсЬ	адсддЬдсЬд	300
адаЬсааадд	сЬаЬЬЬаадЬ	даЬдСдаЬЬа	дЬдаааабса	дЬЬаааадас	ааааЬСсасЬ	360
ЫддЬсаЬсд	ЬдЬасЬЬЬсЬ	дсдаасЬаЬд	аСЬсСасааа	дааааааЬдд	ЬЬадЬЬдада	420
ЬсдаадаЬаа	саасаадааа	ааасааасдЬ	ддЬсЬдсааа	сЬЬсдЬааЬд	ддЬЬдЬасад	480

- 28 020184

ддСасЪаЁаа	сГасдаСсаа	ддббабдсас	сбаадббссс	дааасаадаа	дабббсааад	540
дбсадСССаС	£саЕссасад	сасбддссад	аааабббада	ббасасаддб	аааааадббд	600
ГдаСсабсдд	садТддЕдса	асбдсаабба	сссббдбасс	ббсбабддбс	аааддбддбд	660
саддГсаСдЬ	дасдаТдГСа	саасдббсдс	саасдбабаб	бдсдасдабб	ссббсбабсд	720
асббГабЕГа	Сдааааааса	сдбаааббба	бдбсбдаада	аасддсббаб	ааабббасбс	780
д^дсасдбаа	баббддГаЬд	саасдбддба	бббабдсдсб	адсдсаааад	бабссааааа	840
сбдСасдЪсд	ЫЛаГСдГГд	аааддсаббд	адббдсадбб	даааддсааа	дбддабабда	900
аасасТЪСас	СссаадССас	аабссббддд	абсаасдббб	абдбдббдбд	ссадабддбд	960
абЫзаСЬсаа	адсаЪЬдедс	дааддбсадд	саадбдббда	дасадабсаа	абсдадаааб	1020
Ьсассдсааа	ЬддЬаЬЬсаа	ббдааабсбд	дбааасаббб	ададдсбдаб	аббдбдаббб	1080
садсаасЬдд	бГЬададаЬЬ	садаббббад	дбддбдбсса	аддббсаабс	дабддбааас	1140
сааГдааеас	аОсСсаасаС	абдсбббабс	ааддсдббаб	ддбдадсдаб	дбдссбааба	1200
ЪддсаабдаС	саЬСддСЛаЬ	абсаабдсдб	сабддасббб	дааддббдаб	аббдсбдсбд	1260
аСГабаЬЬЬд	ссдЬбСдаСб	аабсабабдд	абааааабдд	ббббдабдад	дбдаббдсас	1320
асдссдабсс	Ысасадсдс	даааабдаса	ссабсабддд	баааабдбса	бсбддббаба	1380
Ьсдсссдсдс	адсддабдбд	абдссаааас	ааддЬаадса	адсассббдд	аадабсасаа	1440
аГаабЬассе	СдсадаИсдТ	ааддадббаа	аадабдсбаа	дбббаабдаб	ддбдббббад	1500
ааОГссабаа	дсдсдд^дад	сааасадсаа	ассдбаадсс	ааааббадба	бсабаабббб	1560
СдсС+дааСа	аббсдааасс	сбабдсабдд	сабадддббб	бббабббдбд	сбсадддббб	1620
ааабсЬ^ада	ааба^сдсдЪ	абаббдадса	саббадаааа	бббабаббад	ддабаабасд	1680
а^дадааааа	Ί саб саб 6 б!:	ддддасбабс	ббасббадба	саббсадбба	бдсбдабдаб	1740
дбСааасааа	адасадсааб	бдсбдадаад	ббддбббсдд	ббдабддбас	бдаасаадда	1800
сЕГдааааГа	сддабааааб	даббсббдаа	саааббсдба	бдсдсббасс	аааадабабд	1860
ссадсЕааЫ	ббббсасбда	бббаасбааа	аасббаааба	дбдаасаасд	бааасааббб	1920
аегдбСсадс	дббабдбдда	аасдбббадс	садааададб	басаадссдс	бббааасббб	1980
бабсадбсаа	абдаадддаа	ддсдбдддса	аадааадсаа	дбдаааббдд	аддададдбб	2040
дсЕсаСЬСса	саасдсаааа	бдсбсдбааб	дсбббаааса	сбассабдса	адаасабдбб	2100
дадаабссОа	ссдбааааса	дббаабддсб	сдбабдаасс	садсассадб	адсбдсддба	2160
дааааадссд	аасадаааба	абсаабсааа	аадддабсаб	аабдабдабс	ссббббббаб	2220
дсЬаССбаГС	бббабададб	асдадаааба	адббсббсса	бдабсбсабб	дд	2272

- 29 020184

<210> 6 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная <220 <223> олигонуклеотид Кап1 <400> 6 дсСсЬадасс десаадесад сдЬааСдс <210> 7 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> олигонуклеотид Тп10:1 <400> 7 ддаИсаеаед асаадаедед <210> 8 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная <220 <223> олигонуклеотид АУМ1004А7-1 <400> 8 ассседСаса асссаССасд <210> 9 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> олигонуклеотид АУМ1004А7-2 <400> 9 адЫдСдаес аЬсддсадЬд <210 10 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> олигонуклеотид АУМ1004А7-3 <400> 10 дсесСадасС аСссСддСаИ СсдССсад <210> 11

- 30 020184 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> олигонуклеотид АУМ1004А7-4 <400>11 сдддабссба аа1:ассасде Сдсабасс28 <210> 12 <211>31 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> олигонуклеотид АУМех1:2 <400>12 сааддДааГд саСГддсСИд ддсЦассЪса д31 <21Э>13 <211>31 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<22 3> олигонуклеотид АУМехС1 <400>13

СТсСаСдааа аадаадг.сдь ЬссаааЬаЬг д31 <210>14 <211>25 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> олигонуклеотид АУМ1004А7-5 <400>14 сдСГОаГдСд Сбдсдссада Сддбд25 <210>15 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> олигонуклеотид АУМехЬЗ <400> 15 дааабаСсдс дСаСаССдад саса-ССад 28 <210> 16 <211> 21

- 31 020184 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> олигонуклеотид АУМехСЗ <400>16 аЫдСсдаба Ьабдсдсдбд с21 <210>17 <211>25 <212> ДНК

<213>	Искусственная
<220>
<223>	олигонуклеотид	а1т-ргот-ир
< 4 00>	17
дасаСдГдЬа ЕЕд£сааа£1:	£д£дс	25
<210>	18
<211>	21
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	олигонуклеотид	а1тВ-епд-1о
<400>	18
ссаа£дада£ саЬддаадаа	с	21
<210>	19
<211>	42
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	олигонуклеотид	£и£1х1.1
<400>	19
д£а£дсдс££ ассаааадаЪ	а£даасссад сассадЬадс £д	42
<210>	20
<211>	26
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	олигонуклеотид	АУМ1004А7-6
<400>	20
дадада£д£а садсЬаассс	ааЬссс	26

<210>	21
<211>	36
<212>	ДНК

- 32 020184 <213> Искусственная <220>

<223> олигонуклеотид А17М1004А7-75рЬ <400>21 дсдсдсдсаС дсааСсаСса СсдссаСаСС аддсас36 <210> 22 <211>42 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> олигонуклеотид Еи£1х1.2 <400>22 садсСасСдд СдсСдддССс аСаСсССссд дСаадсдсаС ас42 <210>23 <211>496 <212> РКТ <213> АсгпеСоЬасСег зр.

<400>23

Мес 1

61и

Ьуз

С1п

Уа1 Азр Уа1 5

Ьеи

11е

11е 10

61у

А1а

61у

11е

Зег 15

61у

Не

С1у

Ьеи

А1а

νβΐ

Н1з

Ьеи

Зег

Ьуз

Азп

Суз

Рго

01п

Агд

Ьуз

РЬе

20

25

30

С1и

Не

Ьеи

С1и

Агд

Азр

Зег

РЬе

С1у

ТЬг

Тгр

Азр

Ьеи

РЬе

35

40

45

Агд

Туг

Рго

61 у

Не

Агд

Зег

Азр

Зег

Азр

МеС

Зег

ТЬг

РЬе

С1у

РЬе

50

55

60

Азп

РЬе

Ьуз

Рго

Тгр

А1а

Ьуз

Азр

Ьуз

Уа1

Ьеи

А1а

Зег

61у

А1а

61и

65

70

75

80

11е

Ьуз

С1у

Туг

Ьеи

Зег

Азр

Уа1

Не

Зег

61и

Азп

61п

Ьеи

Ьуз

Азр

85

90

95

Ьуз

11е

Н13

РЬе

61у

Нхз

Агд

Уа1

Ьеи

Зег

А1а

Азп

Туг

Азр

Зег

А1а

100

105

110

Ьуз

Тгр

А1а

Уа1

С1и

Не

С1и

Азр

Зег

Азп

Ьуз

С1п

115

120

125

ТЬг

Тгр

5ег

А1а

Азп

РЬе

Уа1

Мес

61у

Суз

ТЬг

61у

Туг

Азп

Туг

130 135 140

АЗр 61η 145

61у Туг

А1а

Рго 150

Ьуз

РЬе

Рго

Ьуз

61п 155

61и Азр РЬе

Ьуз

61у 160

61η

Ьеи

Не

Н13

Рго

61п

НЬз

Тгр

Рго

61и

Азп

Ьеи

Азр

Туг

ТЬг

61у

165

170

175

Ьуз

Уа1

Не

51у

Зег

61у

А1а

ТЬг

А1а

Не

ТЬг

Ьеи

7а1

180

185

190

Рго

Зег

Мес

Уа1

Ьуз

61у

А1а

С1у

Н15

Уа1

ТЬг

МеС

Ьеи

61п

Агд

195

200

205

Зег

Его

Зег

Туг

Не

А1а

ТЬг

Не

Рго

Зег

Не

Азр

РЬе

Не

Туг

61и

210

215

220

Ьуз

ТЬг

Агд

Ьуз

РЬе

МеС

Зег

<51и

61 и

ТЬг

А] а

Туг

Ьуз

РЬе

ТЬг

Агд

225

230

235

240

А1а

Агд

Азп

Не

61у

Мес

61п

Агд

61у

Не

Туг

А1а

Ьеи

А1а

С1п

Ьуз

245

250

255

Туг

Рго

Ьуз

ТЬг

Уа1

Агд

Ьеи

Ьуз

<31у

Не

С1и

Ьеи

61п

260

265

270

Ьеи

Ьуз

<31у

Ьуз

Уа1

Азр

МеС

Ьуз

Н1з

РЬе

ТЬг

Рго

Зег

Туг

Азп

Рго

275

280

285

Тгр

Азр

61п

Агд

Ьеи

Суз

Уа1

Рго

Азр

61у

Азр

Ьеи

РЬе

Ьуз

А1а

290

295

300

Ьеи

Агд

61и

<31у

61п

А1а

Азп

Уа1

61и

ТЬг

Азр

61п

Не

С1и

Ьуз

РЬе

305

310

315

320

ТЬг

А1а

Азп

61 у

Не

61п

Ьеи

Ьуз

Зег

61у

Ьуз

Н13

Ьеи

61и

А1а

Азр

325

330

335

Не

Уа1

11е

Зег

А1а

ТЬг

61у

Ьеи

С1и

Не

61п

Не

Ьеи

61у

Уа1

34 0

345

350

Ьуз

61у

ТЬг

Не

А5р

С1у

Ьуз

Рго

МеС

Азр

ТЬг

Зег

61п

ΗΪ3

МеС

Ьеи

355

360

365

Туг

61п

61у

Уа1

Неб

Уа1

Зег

Азр

Уа1

Рго

Азп

Мес

А1а

МеС

Не

370 375 330

- 34 020184

С1у Туг 385

11е

Азп

А1а

Зег 390

Тгр

ТЬг Ьеи Ьуз

Уа1 Азр 11е 395

А1а

Азр 400

Туг

Не

Суз

Агд

Ьеи

Азп

Н13

МеС

Азр

Ьуз

Азп

С1у

Туг

Азр

С1и

405

410

415

Уа1

11е

А1а

Ηί£

А1а

Азр

Рго

А1а

Ьеи

Агд

С1и

С1п

Азр

ТЬг

11е

МеС

420

425

430

51у

Ьуз

Μβΐ:

8ег

Зег

С1у

Туг

11е

А1а

Агд

А1а

Азр

Уа1

МеС

Рго

435

440

445

Ьуз

С1п

61у

Ьуз

А1а

Рго

Тгр

Ьуз

Не

ТЬг

Азп

Туг

Ьеи

А1а

450

455

460

Азр

Агд

Ьуз

С] и

Ьеи

Ьуз

Азр

А1а

Зег

Рпе

Азп

Азр

Уа1

УаЬ

Ьеи

С1п

465

470

475

480

РЬе

Н13

Ьуз

Ага

С1у

О1и

С1п

Уа1

Азр

Агд

Ьуз

Рго

Ьуз

Ьеи

Уа!

5ег

485 490 495

<210> <211> <212> <213>

24 1491 ДНК АсгпеСоЬасСег зр.

<400> 24 асддаааадс	аадССдвсде	ангаагЬаСЬ	ддСдсаддСа	СсСседддаС	Сдддсеадсе	60
дСдсаСсСсС	сааадаасСд	СссасаасдС	аааССсдааа	СсССадаасд	СсдСдаСадс	120
ЬЬЬддСддда	сЬЬдддаСес	аЬЬссдСеас	сседдСаЬес	дССседасСс	ддаСаСдеса	180
асаСССддЫ:	ССааССЬСаа	ассаСдддса	ааадасааад	еаЬеддсаад	сддЬдсСдад	240
аСсаадддсС	аССЬаадсда	едСдаХ саде	дааааесаде	СаааадаСаа	ааЬЬсаесее	300
ддСсаСсдСд	СссСССсСдс	ааасСасдае	СсСдсааада	аааааедддс	СдС Сдаааее	360
даадасадеа	асаадааааа	дсааасеедд	есСдсаааСС	еедСдаЬддд	сЬдЬасаддс	420
СасСасаасС	аСдаСсаадд	СЬаСдсассд	аааеесссаа	аасаадаада	ГССсаааддс	480
сааЬСдаСсс	асссасадса	седдссСдаа	аассСадаСС	аСасаддсаа	дааадеддСд	540
аСсаССддСа	дСддСдсаас	адсааССасс	сссдеессее	сааЬддСдаа	аддсддедса	600
дддсаедсда	ссаьдьсаса	дсдсесСссе	есссаеаесд	сдасдаеьсс	еесааегдас	660
ССсаСЬСаСд	аааааасдсд	Саааеееаед	СсСдаддааа	ссдсееаЬаа	аеееасссдС	720
дсасдСааСа	ЬсддСасдса	асдеддеасе	еаЬдсассад	сасаааааеа	Сссаааааса	780
дСасдСсдсИ	СаЬСдЬСдаа	аддЬаЬСдад	седсадсьда	ааддЬааддС	ддаСаЬдааа	840
сасСССасас	саадсСаСаа	сссеЬдддаЬ	саасдеесаС	дСдСсдСасс	адасддсдае	900
ЬЬаССсаадд	саЬСасдЬда	аддссаадсс	ааЬдЬСдааа	садаЬеааае	СдаааааССс	960
асддсаааСд	дСаССсааСС	даадСседдС	ааасассеед	аадсадаеае	СдедаСССса	1020
дсаасаддСС	СадаааСсса	ааСсСЬдддЪ	ддсдСдааад	доасааСЬда	сддЬаадсеа	1080
аСддаСассС	сСсаасасаС	дССаСаСсаа	ддСдСдаСдд	СсадСдаедС	ассаааЬаСд	1140
дсааСдаСса	ССддсЬаСаС	сааСдсаесЬ	СддассССаа	аддССдаЬаС	СдсадсддаС	1200
ЬаСаессдСс	дСССдсСдаа	ЬсаСаСддас	аааааеддсС	аЬдаедааде	саСЬдсссае	1260
дсддаЬссад	сагсдсдСда	асаадаЬасс	аСЬаСдддЬа	аааСдесеес	СддССаСаСС	1320
дсасдСдсад	садаСдСааС	дссдаадсаа	дд!аааааад	сассдСддаа	ааесассааЬ	1380
аасЬагссСд	сддаСсдСаа	адааЬСдааа	даСдсаЬсаГ	есааьдасдС	ддессСдсаа	1440
сьссаьааас	дСддСдадса	адесдаСсде	аадссааадс	СадСдесдСа	а	1491

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

(1) кодируется молекулой нуклеиновой кислоты или ее функциональным фрагментом по любому из пп.1-7 или (2) включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из:

(а) аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2 или (б) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2.

(1) снижает температуру потери текучести указанного субстрата по меньшей мере на 30% от снижения, которое достигают после экспозиции того же субстрата в течение того же времени в тех же условиях с белком, кодируемым 8Е0 ΙΌ N0:1, или (2) снижает температуру потери текучести указанного субстрата, содержащего н-алкан, по меньшей мере на 0,25°С.

(1) потребляющий по меньшей мере 30% субстрата, представляющего собой н-алкан, по сравнению со степенью потребления, которая достигается после экспозиции того же субстрата в течение того же времени в тех же условиях с белком, кодируемым 8Е0 ΙΌ N0:1, или (2) продуцирующий по меньшей мере 30% продукта окисления по сравнению с количеством продукта, которое получают после экспозиции того же субстрата в течение того же времени в тех же условиях с белком, кодируемым 8Е0 ΙΌ N0:1.

(1) нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1 или (2) нуклеотидной последовательности, кодирующей белок с аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ N0:2.

(1) нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1;

1. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, представляющий собой монооксигеназу или диоксигеназу, который участвует в разложении субстрата, представляющего собой н-алкан, имеющий 26 или более атомов углерода, включающая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
2. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1, включающая нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:

(2) нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 80% идентична нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1;
3. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1 или 2, включающая нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:1 или нуклеотидную последовательность, кодирующую белок с аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0:2.

(3) нуклеотидной последовательности, кодирующей белок с аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ N0:2;
4. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1, кодирующая белок, вызывающий образование спиртов, кислот и/или сложных эфиров из субстрата, представляющего собой н-алкан, имеющий 26 или более атомов углерода, и:

(4) нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична нуклеотидной последовательности, кодирующей белок с аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0:2; и (5) нуклеотидной последовательности, комплементарной последовательности по любому из (1)-(4), причем указанный белок:

(а) осуществляет окисление субстрата, представляющего собой н-алкан, имеющий 26 или более атомов углерода, (6) вызывает образование спиртов, кислот и/или сложных эфиров из субстрата, представляющего собой н-алкан, имеющий 26 или более атомов углерода, (в) способен снижать температуру потери текучести субстрата, содержащего н-алкан, имеющий 26 или более атомов углерода, или (г) способен к комплементации мутации, ведущей к инактивации гена, кодируемого 8Е0 ΙΌ N0:1 в Асте1оЬас1ег кр. Ό8Μ17874.
5. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1, кодирующая белок, который способен снижать температуру потери текучести субстрата, содержащего н-алкан, имеющий 26 или более атомов углерода, и:
6. Функциональный фрагмент молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-5, имеющий по меньшей мере 60 нуклеотидов в длину.
7. Молекула нуклеиновой кислоты или ее функциональный фрагмент по любому из пп.1-6, где указанный н-алкан имеет 32 или более атомов углерода.
8. Белок, который участвует в разложении субстрата, представляющего собой н-алкан, имеющий 26 или более атомов углерода, представляющий собой монооксигеназу или диоксигеназу, который:
9. Белок по п.8, последовательность которого по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2.

- 36 020184
10. Белок по п.8 или 9, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ N0:2.
11. Функциональный фрагмент белка по любому из пп.8-10 с делецией до 200 аминокислот относительно полноразмерной белковой молекулы.
12. Химерный ген, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты или ее функциональный фрагмент по любому из пп.1-7, функциональным образом связанные с одной или более чем одной подходящей регуляторной последовательностью.
13. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты или ее функциональный фрагмент по любому из пп.1-7 или химерный ген по п.12.
14. Микроорганизм, подвергнутый генетическим манипуляциям таким образом, что он содержит молекулу нуклеиновой кислоты или ее функциональный фрагмент по любому из пп.1-7, химерный ген по п.12 или вектор по п.13 и способен экспрессировать белок по п.8.
15. Способ разложения н-алкана, имеющего 26 или более атомов углерода, в субстрате и снижения температуры потери текучести такого субстрата, включающий обеспечение взаимодействия указанного субстрата с:

(а) белком или его функциональным фрагментом по любому из пп.8-11, (б) микроорганизмом по п.14 или встречающимся в природе микроорганизмом, способным экспрессировать белок или его фрагмент по любому из пп.8-11; или (в) лизатом или экстрактом вышеуказанного микроорганизма.
16. Способ по п.15, где указанный субстрат представляет собой неочищенную нефть.
17. Способ по любому из пп.15 или 16, где на указанной стадии взаимодействия субстрата с указанным белком или его фрагментом используют белок или его фрагмент в выделенной, экстрагированной или очищенной форме.
18. Способ по п.15, где указанный микроорганизм является микроорганизмом по п.14.
19. Способ по любому из пп.15 или 16, где на указанной стадии взаимодействия субстрата с указанным белком или его фрагментом используют белок или его фрагмент в выделенной, экстрагированной или очищенной форме в комбинации с одним или более чем одним другим белком, причем указанный другой белок выбран из рубредоксина, редуктазы рубредоксина, алкогольдегидрогеназы, альдегиддегидрогеназы, алкангидроксилазы, ацил-КоА-синтетазы и КоА-лигазы жирных кислот.