KR20100132982A - Ｈｅｒ2/ｎｅｕ-특이적 항체 및 그것의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 공지된 4D5 항체와 비교하여 감소된 글리코실화를 가진 HER2/neu에 특이적으로 결합하는 항체, 특히 HER2/neu에 대한 키메라 4D5 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 암, 자가면역 질환, 염증성 장애, 및 감염성 질환과 같은 질환의 진단, 예측 및 치료에서 4D5 항체 및 이들을 포함하는 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

ＨＥＲ2/ＮＥＵ-특이적 항체 및 그것의 사용 방법{HER2/NEU-SPECIFIC ANTIBODIES AND METHODS OF USING SAME}

관련 출원의 참조:

본 출원은 2008년 4월 2일 제출된 미국 특허출원 제61/041,649호(계류중)의 우선원을 주장하며, 이 출원은 그 전문이 본원에 참고자료로 포함된다.

서열목록의 참조:

본 발명은 37 C.F.R. 1.821 등에 따라서 하나 이상의 서열목록을 포함하며, 이들은 지면과 컴퓨터 판독가능한 매체에 모두 개시되고, 지면 및 컴퓨터 판독가능한 개시물은 그 전체가 본원에 참고자료로 포함된다.

기술분야:

본 발명은 HER2/neu와 특이적으로 결합하는 신규의 4D5 항체, 특히 HER2/neu에 대한 신규의 키메라 4D5 항체에 관한 것으로서, 이들은 공지된 4D5 항체와 비교하여 감소된 글리코실화와 변경된 이펙터 기능을 가진다. 또한, 본 발명은 암, 자가면역 질환, 염증성 장애, 및 감염성 질환과 같은 질환의 진단, 예측, 및 치료에 있어서 이러한 항체 및 이들을 포함하는 조성물의 사용 방법에 관한 것이다.

관련 분야의 설명:

HER2 / neu 및 HER2 / neu 수용체

세포 성장 및 분화 과정은 티로신 키나제와 같은 특이적 수용체를 통해 작용하는 성장인자를 수반한다. 리간드와 티로신 키나제 수용체의 결합은 연쇄 사건을 촉발하여 결국에는 세포 증식 및 분화를 이끈다(Carpenter et al. (1979) Biochem. 48:193-216; Sachs et al. (1987) Cancer Res. 47:1981-8196). 티로신 키나제 수용체는 서열 유사성 및 상이한 특징들에 기초하여 몇 개의 그룹으로 분류될 수 있다. 이러한 과 중 하나가 ErbB 또는 표피 성장인자 수용체 과인데, 이것은 HER-1(erbB-1 또는 EGFR라고도 한다), HER-2 또는 HER2/neu(erbB-2, c-neu 또는 p185라고도 한다), HER-3(erbB-3라고도 한다) 및 HER-4(erbB-4라고도 한다)로 알려진 여러 수용체들을 포함한다(예를 들어, Carpenter et al. 상동; Semba et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82:6497-6501; Coussens et al. (1985) Science, 230:1130-1139, Bargmann et al. (1986) Cell 45:649-657; Kraus et al. (1989) PNAS 86:9193-9197; Carraway et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:14303-14306; 및 Plowman et al. (1993) Nature 366:473-475; Tzahar et al. (1994) Biol. Chem. 269:25226-25233 참조).

ErbB 수용체는 정상적인 발달 과정과 인간 종양형성 과정 모두에서 세포 증식, 분화, 이동, 및 아폽토시스를 조절하는 신호를 전파하는데 있어서 중요한 역할을 한다(Slamon et al. (1989) Science 244:707-712). 예를 들어, erbB 수용체의 활성화는 하류 MAPK-Erk1/2 및 포스포이노시티드-3-키나제(PI3K)/AKT 성장 및 생존 경로와 연결되어 이들을 자극한다. 암에서 이들 경로의 조절장애는 질환 진행 및 치료 불응과 관련되었다(Fukazawa et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:14554-14559; Tzahar et al. (1996) Mol. Cell. Biol. 16:5276-5287; Lange et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:31308-31316; Olayioye et al. (1998) Mol. Cell. Biol. 18:5042-5051; Hackel et al. (1999) Curr. Opin. Cell Biol. 11:184-189). PI3K/AKT의 활성화는 세포 생존 및 증진된 종양 공격성을 촉진하며, AKT2는 HER2/neu-과발현 유방암에서 활성화되고 과발현된다고 보고되었다(Shak (1999) Semin. Oncol. Suppl. 12:71-77; Huang et al. (2000) Clinical Cancer Res. 7:2166-2174; Bacus et al. (2002) Oncogene 21:3532-3540).

리간드 결합에 의해 ErbB 과의 수용체에 의한 신호화가 개시되고, 이것이 호모- 또는 헤테로-수용체 다이머화, 세포질 꼬리의 상호 티로신 인산화, 및 세포내 신호전달 경로의 활성화를 촉발한다(Cirri et al. (2003) Exp. Cell Res. 284:54). ErbB 수용체와 결합하여 그것을 활성화하는 리간드의 효용은 특정 단백질의 세포 표면 엑토도메인 셰딩(ectodomain shedding)을 촉매하는, ADAM(A Disintegrin and Metalloprotease) 과의 아연-의존성 메탈로프로테아제와 같은, 다양한 메탈로프로테아제에 의해서 매개된다(Chang and Werb (2001) Trends in Cell Biology 11:537-543; Moss and Lambert (2002) Essays in Biochemistry 38:141-153; Seals and Courtneidge (2003) Genes and Development 17:7-30 참조). 구체적으로, ADAM 과는 APP 및 Notch와 같은 ErbB 수용체의 활성화를 초래하는 리간드를 절단하는 것으로 밝혀졌다(Blobel (2005) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6:32-43).

ErbB 과의 중요한 멤버인 HER2/neu는 185 kDa 수용체 단백질인데, 원래는 화학적으로 처리된 래트의 신경모세포종 유전자의 형질전환 산물로서 확인되었었다. HER2/neu는 몇 가지 인간 암종 및 포유류의 발생에서 갖는 역할로 인하여 광범위하게 조사되었다(Hynes and Stern (1994) Biochim. et Biophys. Acta 1198:165-184; 및 Dougall et al. (1994) Oncogene 9:2109-2123; Lee et al. (1995) Nature 378: 394-398). 인간 HER2/neu 유전자와 HER2/neu 단백질은 Semba et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82:6497-6501 및 Yamamoto et al. (1986) Nature 319: 230-234에서 설명되고, 서열은 GenBank에서 수탁번호 X03363로서 이용할 수 있다. HER2/neu는 4개의 도메인, 즉 리간드가 결합되는 세포외 도메인, 친지질성 막통과 도메인, 보존성 세포내 티로신 키나제 도메인, 및 인산화될 수 있는 몇 개의 티로신 잔기를 숨기고 있는 카르복실-말단 신호화 도메인을 포함한다(Plowman et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:1746-1750). HER2/neu 세포외(ECD) 도메인의 서열은 Franklin et al. (2004) Cancer Cell. 5(4):317-328에 의해 설명되었고, Protein DataBank Record 1S78(2004)에서 이용할 수 있다.

HER2/neu는 성장인자 수용체로서 기능하며, 유방암, 난소암 및 폐암과 같은 종양에 의해서 주로 발현된다. HER2/neu는 인간 유방암과 난소암의 25-30%에서 과발현되고, 이런 환자들에서 공격적인 임상진행 및 불량한 예후와 관련된다(Slamon et al. (1987) Science 235:177-182; Slamon et al. (1989) Science 244:707-712). 또한, HER2/neu의 과발현은 위, 자궁내막, 침샘, 폐, 신장, 결장, 갑상선, 췌장 및 방광의 암종을 포함하는 다른 암종들에서도 관찰되었다(예를 들어, King et al. (1985) Science 229:974; McCann et al. (1990) Cancer 65:88-92; Yonemura et al. (1991) Cancer Research 51:1034).

HER2/neu 활성화는 유방암 환자에서 호르몬 치료에 대한 임상 반응성 감소와 상관있었다(Wright et al. (1989) Cancer Res. 49:2087-2090; Kurokawa & Arteaga (2001) Clin. Cancer Res. 7:4436s-42s, 4411s-4412s). 실제로 HER2/neu의 발현은 항에스트로겐 내성을 전달하는데 충분하다(Benz et al. (1993) Breast Cancer Res. Treat. 24:85-95). HER2/neu뿐만 아니라 HER-3 역시 전립선암 환자에서 호르몬 내성의 개시에 관련되는 것 같다. 전립선암 환자의 약 1/3은 고환 및 부신의 안드로겐의 작용을 파괴할 목적으로 호르몬 치료를 받는다. 유방암과 마찬가지로 내성은 피할 수 없다. 최근 데이터는 HER2/neu와 HER-3에서 나오는 신호가 "호르몬-불응" 상태를 유도한다고 시사한다(Mellinghoff et al. (2004) Cancer Cell 6:517-527).

HER2/neu의 몇 가지 끝이 잘린 버전과 스플라이스 버전이 알려져 있다. 예를 들어, 일부 위암종 세포의 핵주위 세포질에 위치한 끝이 잘린 ECD는 인트론 내의 폴리아데닐화 신호를 사용하여 발생된 선택적 전사체에 의해 생산된다(Yamamoto et al. (1986) Nature 319:230-234; 및 Scott et al. (1993) Mol. Cell. Biol. 13:2247-2257). 이 끝이 잘린 ECD 폴리펩티드에 의해서 얻어진 특정한 치료, 진단 또는 연구 효용은 아직 없다. 또한, HER2/neu의 ECD는 배양물 중의 유방암종 세포로부터 단백질 분해되어 방출될 수 있으며, 일부 암 환자의 혈청에서 발견되고, 이 경우 전이성 유방암 및 전반적인 불량한 예후의 혈청 마커일 수 있다(Petch et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:2973-2982; Leitzel et al. (1992) J. Clin. Oncol. 10:1436-1443; Scott et al. (1993) Mol. Cell. Biol. 13:2247-2257; 및 Lee and Maihle (1998) Oncogene 16:3243-3252). 일부 HER2/neu 과발현 종양 세포에서는, 잘 알려진 메탈로프로테아제 활성인자인 4-아미노페닐머큐릭 아세테이트(APMA)가 ADAM10 및 ADAM15와 같은 메탈로프로테아제를 활성화하여 HER2/neu 수용체를 두 부분, 즉 p95로 알려진 끝이 잘린 막-관련 수용체 및 p105 또는 ECD105로 알려진 가용성 ECD로 절단한다(예를 들어, Molina et al. (2001) Cancer Res. 61:4744-4749; U.S. 특허 공개 No. 2004/0247602 참조). ECD의 손실은 p95 수용체를 구성적으로 활성인 티로신 키나제로 만들며, 이것은 성장 및 생존 신호를 암 세포로 송달할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 No. 6,541,214 참조).

HER2/neu 과발현 유방암 세포에서 화학치료제(예를 들어, 시스플라틴, 독소루비신, 탁솔)와 병용하여 HER2/neu에 특이적인 항체를 사용한 치료가 화학치료제 단독 치료에 비해 더 높은 세포독성 반응을 도출한다는 것이 여러 연구들에서 밝혀졌다(Hancock et al. (1991) Cancer Res. 51:4575-4580; Arteaga et al. (1994) Cancer 54:3758-3765; Pietras et al. (1994) Oncogene 9:1829-1838). HER2/neu 항체가 화학치료제에 대한 반응을 증진시킬 수 있는 한 가능한 기전은 HER2/neu 단백질 발현의 조정을 통해서, 또는 DNA 수선을 방해함으로써 이루어진다(Stancovski et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:8691-8695; Bacus et al. (1992) Cell Growth & Diff. 3:401-411; Bacus et al. (1993) Cancer Res. 53: 5251-5261; Klapper et al. (1997) Oncogene 14:2099-2109; Klapper et al (2000) Cancer Res. 60:3384-3388; Arteaga et al. (2001) J. Clinical Oncology 19(18s): 32s-40s).

HER-1 또는 HER2/neu를 표적으로 하는 단클론 항체 및 소분자 티로신 키나제 억제제가 많이 개발되었다. 예를 들어, 4D5로 알려진 뮤린 단클론 항체는 막통과 영역에 아주 가깝게 위치한 HER2/neu의 시스테인-부화 II 도메인 내의 세포외 에피토프(아미노산 529-627)를 인식한다. 4D5에 의한 유방암 세포의 처리는 수용체 인산화 분석으로 측정했을 때 HER2/neu-HER-3 복합체의 NDF/헤레굴린 활성화를 부분적으로 차단한다(Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; Sliwkowski et al. (1999) Sem. in Oncol. 26:60-70; Ye et al. (1999) Oncogene 18:731-738; Vogel et al. (2001) Oncology 61(suppl 2):37-42; Vogel et al. (2002) Journal of Clinical Oncology 20(3):719-726; Fujimoto-Ouchi et al. (2002) Cancer Chemother. Pharmacol. 49:211-216). 그러나, 사람에게 4D5를 투여한 것은 환자들에서 HAMA 반응이 빠르게 발생하여 인간화된 형태가 발생했기 때문에 임상에서 실패했다. 인간화된 항체 4D5의 서열 및 결정 구조는 미국 특허 No. 6,054,297, Carter et al.(상동) 및 Eigenbrot et al. (1993) J. Mol. Biol. 229: 969-95에서 설명되었다

4D5의 인간화된 형태인 트라스투주맙(Genentech, Inc.에서 Herceptin®로 판매중)이 개발되었고, 유방암을 포함하여 HER2/neu의 과발현이나 유전자 증폭이 수반되는 암의 치료에 대해서 승인되었다(Cobleigh et al. (1999) J. Clin. Oncol. 17:2639-2648). 트라스투주맙은 HER2/neu가 ECD와 p95로 APMA-매개 절단되는 것을 시험관내 억제하며, HER2/neu 셰딩을 억제할 가능성을 포함하여 여러 다른 기전을 통해서 시험관내 작동한다고 생각된다(Pegram et al. (1998) Journal of Clinical Oncology 16(8):2659-2671; Baselga et al. (2001) Seminars in Oncology 28(5) (suppl. 16):4-11; Baselga et al. (2001) Annals of Oncology 12 (suppl. 1):S35-S41). 그러나, 트라스투주맙 치료는 일부 환자에서 심장독성 및 HAHA 반응 발생과 같은 여러 단점을 가진다.

따라서, 암치료에서 사용하기 위한 HER2/neu 항체의 신규 또는 개선된 형태, 예를 들어 증가한 친화성 또는 특이성, HAMA 또는 HAHA 반응의 감소된 가능성, 변경된 이펙터 기능 등을 가진 4D5 항체가 필요하다.

Fc 수용체

면역 시스템에서 항체-항원 복합체와 세포의 상호작용은 항체-의존성 세포독성, 비만세포 탈과립화 및 포식작용과 같은 이펙터 기능에서부터 림프구 증식 및 항체 분비의 조절과 같은 면역조정 신호에 이르는 범위의 폭넓은 반응을 가져온다. 이들 상호작용은 모두 항체 또는 면역 복합체의 Fc 도메인과 조혈세포 상의 특화된 세포 표면 수용체인 Fc 수용체의 결합을 통해서 개시된다. 항체 및 면역 복합체에 의해서 촉발된 세포 반응의 다양성은 Fc 수용체의 구조적 이질성 때문이다. Fc 수용체는 구조적으로 관련된 리간드 결합 도메인을 공유하며, 이들이 아마도 세포내 신호화를 매개할 것이다.

면역글로불린 유전자 상과 단백질의 멤버인 Fc 수용체는 면역글로불린 분자의 Fc 부분과 결합할 수 있는 표면 당단백질이다. 이 과의 각 멤버는 Fc 수용체의 α 사슬 상의 인식 도메인을 통해 하나 이상의 이소타입의 면역글로불린을 인식한다. Fc 수용체는 면역글로불린 서브타입에 대한 특이성에 따라 정의된다. Fc 수용체들은 IgG에 대해 "FcγR", IgE에 대해 "FεR", IgA에 대해 "FcαR"라고 한다. 상이한 보조 세포들이 상이한 이소타입의 항체에 대한 Fc 수용체를 보유하며, 항체의 이소타입이 보조 세포가 주어진 반응에 관련될 것인지를 결정한다(Billadeau et al. (2002) J. Clin. Investigat. 2(109):161-81; Gerber et al. (2001) Microbes Infection 3:131-139; Ravetch et al. (2001) Annu. Rev. Immunol. 19:275-290; Ravetch et al. (2000) Science 290:84-89; Ravetch (1994) Cell 78 (4):553-560; Ravetch et al. (1991) Annu. Rev. Immunol. 9:457-492; 또한 Immunobiology: The Immune System in Health and Disease(fourth ed. 1999), Elsevier Science Ltd/ Garland Publishing, New York 참조). 다양한 수용체들에 대한 개략적인 내용이 표 1에 제시된다.

각 Fcγ 수용체("FcγR")는 C2-군의 면역글로불린-관련 도메인에 관련된 세포외 도메인, 단일 막 스패닝 도메인 및 가변 길이의 세포질내 도메인을 지닌 통합 막 당단백질이다. FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16) 및 FcγRIV라고 칭하는 4개의 FcγR가 알려져 있다. 이 수용체들은 서로 다른 유전자들에 의해 암호화되지만, 과의 멤버들 간의 광범한 상동성은 이들이 유전자 복제에 의해서 아마도 공통된 선조로부터 발생했으리라는 것을 시사한다.

활성화 신호와 억제 신호는 모두 리게이션 후 FcγR을 통해서 전달된다. 이러한 정반대 기능은 상이한 수용체 이소폼들의 구조적 차이에 의한 것이다. 면역수용체 티로신 베이스 활성화 모티프(ITAM) 또는 면역수용체 티로신 베이스 억제 모티프(ITIM)라고 하는 수용체의 세포질 신호화 도메인 내의 2개의 상이한 도메인이 상이한 반응을 유도한다. 이들 구조로 상이한 세포질 효소들이 모이는 것에 따라 FcγR-매개 세포 반응의 결과가 정해진다. ITAM-함유 FcγR 복합체는 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA, 및 FcγRIV를 포함하지만, ITIM-함유 복합체는 FcγRIIB만을 포함한다.

FcγRI는 항체 불변영역에 대한 높은 친화성과 제한된 이소타입 특이성을 나타낸다(Hulett and Hogarth (1994) Adv Immunol. 57:1-127). FcγRII 단백질은 40 kDa 통합 막 당단백질이며, 모노머 Ig에 대한 낮은 친화성(106 M-1)으로 인하여 복합체화된 IgG와만 결합한다. 이 수용체는 가장 광범하게 발현되는 FcγR로서, 단핵구, 대식세포, B 세포, NK 세포, 호중구, 비만세포, 및 혈소판을 포함하는 모든 조혈세포 상에 존재한다. FcγRII은 면역글로불린 결합 사슬 내에 단지 2개의 면역글로불린-유사 영역을 가지며, 따라서 FcγRI보다 IgG에 대한 친화성이 훨씬 더 낮다. 3개의 공지된 인간 FcγRII 유전자(FcγRII-A, FcγRII-B, FcγRII-C)가 있으며, 이들은 모두 응집체 또는 면역 복합체의 IgG와 결합한다. 인간의 호중구는 FcγRIIA 유전자를 발현한다. FcγRIIB 유전자는 B 림프구 상에서 발현되고, 그것의 세포외 도메인은 FcγRIIA와 96% 동일하며, 구별할 수 없는 방식으로 IgG 복합체와 결합한다.

FcγRII-A와 FcγRII-B의 세포질 도메인 내의 구별되는 차이가 수용체 리게이션에 대해 기능적으로 이질적인 두 반응을 만든다. FcγRII-A 이소폼은 세포내 신호화를 개시하여 포식작용 및 호흡터짐과 같은 세포 활성화를 유도하지만, FcγRII-B 이소폼은, 예를 들어 B-세포 활성화를 억제하는 억제 신호를 개시한다. 면역 복합체 또는 특이적 항체 가교에 의한 FcγRIIA 클러스터화가 ITAM을 수용체-관련 키나제와 함께 응집시키는 작용을 하고, 이것은 ITAM 인산화를 촉진한다. ITAM 인산화는 Syk 키나제의 도킹 부위로서 작용하고, Syk 키나제의 활성화가 하류 기질(예를 들어, PI3K)의 활성화를 이끈다. 세포 활성화는 전염증성 매개인자의 방출을 이끈다. FcγRIIA 또는 FcεRI와 같은 ITAM을 가진 활성화 FcγR와 함께 공-리게이션 또는 응집된 경우, FcγRIIB의 ITIM이 인산화되어 src 상동체 2-함유 이노시톨 포스파타제(SHIP)의 SH2 도메인을 모으고, 이것이 계속해서 인산화되고 She와 회합된다(Ott (2002) J. Immunol. 162(9):4430-439; Yamanshi et al. (1997) Cell 88:205; Carpino et al. (1997) Cell 88:197). SHIP는 ITAM-함유 FcγR-매개 티로신 키나제 활성화의 결과로서 방출된 포스포이노시톨 메신저를 가수분해하며, 그 결과 세포내 Ca++의 유입이 방지되고, FcγR 리게이션에 대한 세포 반응성이 감퇴한다. 따라서, B 세포 활성화, B 세포 증식 및 항체 분비가 중지되고, FcγR-매개 포식작용이 하향조절된다(Tridandapani et al. (2002) J. Biol. Chem. 277(7): 5082-89).

구체적으로, FcγRIIA와 FcγRIIB의 응집은 세포 조절에 수반되어 아폽토시스를 억제하는 작용을 하는 세린-트레아닌 키나제인 Akt의 인산화의 하향조절을 가져오고, 비만세포에서 FcγRIIB와 고 친화성 IgE 수용체 FcεRI의 응집은 항원-유도 탈과립화, 칼슘 동원, 및 사이토카인 생산의 억제를 이끈다(Long (1999) Annu. Rev. Immunol 17:875; Metcalfe et al. (1997) Physiol. Rev. 77:1033). FcγRIIB와 B 세포 수용체(BCR)의 응집은 BCR-매개 신호화의 억제와 세포 주기 진행 및 세포 생존의 억제를 이끈다. BCR 신호화의 FcγRIIB-매개 억제의 많은 이펙터 기능들이 SHIP를 통해서 매개되지만, SHIP 결핍 마우스의 리포다당(LPS)-활성화 B 세포가 칼슘 동원, Ins(1,4,5)P3 생산, 및 Erk 및 Akt 인산화의 유의한 FcγRIIB-매개 억제를 나타낸다는 것이 최근에 증명되었다(Brauweiler et al. (2001) Journal of Immunology 167(1):204-211).

FcγRIII의 크기는 이 부류 내에서의 이종성으로 인하여 마우스와 사람에서 40 내지 80 kDa 범위이다. 2개의 인간 유전자가 2개의 전사체, 즉 통합 막 당단백질 FcγRIIIA와 글리코실포스파티딜-이노시톨(GPI)-결합 버전 FcγRIIIB를 암호화한다. 1개의 뮤린 유전자는 막 스패닝 인간 FcγRIIIA와 상동성인 FcγRIII를 암호화한다. FcγRIII은 나머지 두 FcγR 각각과 구조적 특징을 공유한다. FcγRII과 마찬가지로 FcγRIII은 낮은 친화성으로 IgG와 결합하고, 상응하는 2개의 세포외 Ig-유사 도메인을 함유한다. FcγRIIIA는 비만세포인 대식세포에서 발현되며, NK 세포의 유일한 FcγR이다. GPI-결합된 FcγRIIIB는 인간 호중구에서 유일하게 발현되는 것으로 현재 알려져 있다.

FcγRIV(mFcRIV라고도 한다)는 골수양 세포 상에서 최적의 발현과 기능을 위해서 FcR 감마-사슬의 회합을 필요로 하며, 그것의 신호화 가능성은 어뎁터 분자인 Crk-L과 포스파티딜이노시톨-3-OH 키나제를 모으는 세포질 "YEEP" 모티프에 의해서도 역시 증진된다. FcγRIV는 b 알로타입(IgEb)의 면역글로불린 E 항체뿐만 아니라 IgG2a 및 IgG2b 항체와 우선적으로 결합한다. 항원-IgEb 면역 복합체에 의한 FcγRIV의 리게이션은 대식세포-매개 포식작용, T 세포에 대한 항원 제시, 전염증성 사이토카인 생산 및 말기 피부 알레르기 반응을 촉진한다(Hirano et al. (2007) Nature Immunology 8:762-771). FcγRIV는 최근 확인된 수용체인데, 모든 포유류 종들에서 보존되며, 중간 친화성과 제한된 아부류 특이성을 가진다(Nimmerjahn et al. (2005) Immunity 23:41-51; Mechetina et al. (2002) Immunogenetics 54:463-468; Davis et al (2002) Immunol Rev 190:23-36). FcRIII와 FcRIV는 세포독성 항체 또는 병원성 면역 복합체에 의해 촉발되는 염증성 질환을 매개하기 위한 생리학적으로 중요한 활성화 FcR이다. FcRIV는 수지상 세포, 대식세포 및 호중구 상에서 발견된다.

이러한 모든 진전에도 불구하고, 자가면역, 암, 염증성 질환, 및/또는 이식의 치료에서 치료적 효용을 지니며, Fc 수용체로부터의 이펙터 기능을 매개하는 개선된 능력을 나타내는 항-HER2/neu 항체에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 본 발명은 이런 필요 및 그외 다른 필요에 관한 것이다.

본 발명의 구체예는 다양한 폴리펩티드, 예를 들어 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드, SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄를 포함하는 폴리펩티드, 및 N65S 치환을 포함하는 키메라 4D5 면역글로불린 경쇄를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 다른 구체예는 SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄를 포함하는 폴리펩티드, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, 및 SEQ ID NO: 13으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄를 포함하는 폴리펩티드, 및 여러 치환을 포함하는 4D5 면역글로불린 중쇄를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.

상기 폴리펩티드들은 항체일 수 있으며, 인간 HER2/neu와 특이적으로 결합할 수 있다. 폴리펩티드 및 항체는 하나 이상의 변형을 포함하는 변이체 Fc 도메인을 포함할 수 있고, 이것은 변경된 이펙터 기능, 증가 또는 감소된 FcγR와의 결합 등을 포함하여 폴리펩티드 또는 항체에 대한 표현형 변경을 부여할 수 있다. 또한, 본 발명의 구체예는 상기 폴리펩티드 및 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 이 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 이 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 폴리펩티드 및 항체의 생산 방법과 각종 질환 및 장애의 치료 방법이 또한 제공된다.

상세히 말하면, 본 발명은 N65S 치환을 포함하는 키메라 4D5 면역글로불린 경쇄를 포함하는 폴리펩티드, 및 특히 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 이러한 폴리펩티드의 구체예를 제공한다.

본 발명은 특히 폴리펩티드가 항체, 더 구체적으로는 Fc 도메인에 적어도 하나의 변형을 가진 변이체 Fc 도메인을 포함하는 항체인 이러한 폴리펩티드의 구체예에 관한 것이다. 본 발명은 특히 변형이 L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I, 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 포함하는 구체예에 관한 것이다.

더 나아가, 본 발명은 Fc 도메인 내의 변형이

(A) F243L, D270E, R292P, S298N, Y300L, V305I, A330V, 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환;

(B) F243L 및 P396L; F243L 및 R292P; 및 R292P 및 V305I로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 2개의 치환;

(C) F243L, R292P 및 Y300L; F243L, R292P 및 V305I; F243L, R292P 및 P396L; 및 R292P, V305I 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 3개의 치환; 또는

(D) F243L, R292P, Y300L 및 P396L; 및 F243L, R292P, V305I 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 4개의 치환

을 포함하는 이러한 항체의 구체예에 관한 것이며, 더 구체적으로는 Fc 도메인 내의 변형이

(1) F243L, R292P, 및 Y300L;

(2) L235V, F243L, R292P, Y300L, 및 P396L; 또는

(3) F243L, R292P, Y300L, V305I, 및 P396L

을 포함하는 항체에 관한 것이다.

더 나아가, 본 발명은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 변이체 Fc 도메인이

(A) 증진된 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC);

(B) FcγRIIA 또는 FcγRIIIA와의 증가된 결합;

(C) FcγRIIB와의 감소된 결합; 또는

(D) FcγRIIB와의 증가된 결합

을 나타내는 이러한 항체의 구체예에 관한 것이다.

더 나아가, 본 발명은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, 및 SEQ ID NO: 13으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다.

더 나아가, 본 발명은

(A) F243L, D270E, R292P, S298N, Y300L, V305I, A330V 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환;

(B) (1) F243L 및 P396L; (2) F243L 및 R292P; 및 (3) R292P 및 V305I로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 2개의 치환;

(C) (1) F243L, R292P 및 Y300L; (2) F243L, R292P 및 V305I; (3) F243L, R292P 및 P396L; 및 (4) R292P, V305I 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 3개의 치환;

(D) (1) F243L, R292P, Y300L 및 P396L; 및 (2) F243L, R292P, V305I 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 4개의 치환; 또는

(E) 적어도 F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396 치환

을 포함하는 4D5 면역글로불린 중쇄를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다.

더 나아가, 본 발명은 폴리펩티드가 항체인 이러한 폴리펩티드의 구체예에 관한 것이다.

더 나아가, 본 발명은 항체가 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, 또는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 더 포함하는 상기 설명된 항체의 구체예에 관한 것이다.

더 나아가, 본 발명은 항체가

(A) F243L, D270E, R292P, S298N, Y300L, V305I, A330V 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환;

(B) (1) F243L 및 P396L; (2) F243L 및 R292P; 및 (3) R292P 및 V305I로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 2개의 치환;

(C) (1) F243L, R292P 및 Y300L; (2) F243L, R292P 및 V305I; (3) F243L, R292P 및 P396L; 및 (4) R292P, V305I 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 3개의 치환;

(D) (1) F243L, R292P, Y300L 및 P396L; 및 (2) F243L, R292P, V305I 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 4개의 치환; 또는

(E) 적어도 F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396 치환

을 포함하는 상기 설명된 항체의 구체예에 관한 것이다.

더 나아가, 본 발명은 면역글로불린 경쇄가 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인을 포함하고, 면역글로불린 중쇄가 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 상기 설명된 항체의 구체예에 관한 것이다.

더 나아가, 본 발명은 항체가 F(ab')₂ 단편, F(ab) 단편, 단쇄 항체, 단클론 항체 또는 디아바디(diabody)인 상기 설명된 항체의 구체예에 관한 것이다.

더 나아가, 본 발명은 환자에서 암의 치료를 위한 의약의 제조에서 상기 설명된 항체의 사용에 관한 것이며, 특히 여기서 암은 HER2/neu-발현 암이고, 항체는 인간 HER2/neu와 결합한다.

더 나아가, 본 발명은 상기 설명된 항체의 유효량을 필요한 환자에게 제공하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법에 관한 것이며, 특히 여기서 암은 HER2/neu-발현 암이고, 항체는 인간 HER2/neu와 결합한다.

더 나아가, 본 발명은 치료가 항체와 동시에 또는 항체에 이어서 제 2 치료제를 투여하는 단계를 더 포함하는 이러한 항체의 사용에 관한 것이며, 여기서 제 2 치료제는 항혈관형성제, 항신생물제, 화학치료제, 및 세포독성제로 구성되는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 추가의 이점 및 특징이 본 발명의 바람직한 구체예를 예시하는 다음의 상세한 설명, 도면 및 실시예로부터 분명해질 것이다.

도 1은 바람직한 구체예(SEQ ID NO: 4)의 키메라 4D5 항체의 경쇄 가변 영역의 서열과 뮤린(SEQ ID NO: 3) 및 인간화된(SEQ ID NO: 5) 4D5 항체를 비교한 서열 정렬을 나타낸다.
도 2는 ch4D5-야생형 Fc("WT")(SEQ ID NO: 7), ch4D5-FcMT1("MT1")(SEQ ID NO: 9), ch4D5-FcMT2("MT2")(SEQ ID NO: 11), 및 ch4D5-FcMT3("MT3")(SEQ ID NO: 13)의 중쇄의 서열들의 비교를 나타낸다. CDR은 적합한 잔기의 아래에 그려진 검은색 막대로 표시된다.
도 3은 ch4D5-야생형 Fc(패널 A), ch4D5(패널 B) 및 트라스투주맙(패널 C) 결합의 BIACore 분석을 나타낸다.
도 4는 SKB R3 세포의 시험관내 증식에 대한 ch4D5의 효과를 나타낸다.
도 5는 비-트랜스젠 마우스에서 본 구체예의 다양한 항체들의 증진된 항종양 활성을 나타낸다.
도 6은 hCD16A 트랜스젠 마우스에서 본 구체예의 다양한 항체들의 증진된 항종양 활성을 나타낸다.
도 7은 비-트랜스젠 마우스와 트랜스젠 마우스에서 본 구체예의 다양한 항체들에 의한 종양 성장 억제에서 mFcRIV 및 hCD16A의 역할을 나타낸다.
도 8은 hCD16A 트랜스젠 마우스에서 본 구체예의 다양한 항체들의 증진된 항종양 활성을 나타낸다.
도 9는 HER2/neu에 대한 다양한 암 셀라인 유래 세포들의 대표적인 면역조직화학 염색을 예시한다. 각 패널은 상이한 셀라인을 나타내는데, 즉 패널 A: MDA-MB-435; 패널 B: MDA-MB-231; 패널 C: A549; 패널 D: OVCAR-8; 패널 E: MCF-7; 패널 F: BT-20; 패널 G: HT-29; 패널 H: ZR75-1; 패널 I: JIMT-I; 패널 J: MDA-MB-453; 패널 K: BT-474; 패널 L: SKBR-3; 및 패널 M: mSKOV-3을 나타낸다.
도 10은 HER2/neu 발현 수준이 매우 낮거나 전혀 없는(DAKO 점수 0) 암 셀라인(MDA-MB-435, 패널 A; MDA-MB-231, 패널 B)에서 ADCC를 매개하는 본 구체예의 다양한 ch4D5 항체들의 능력을 시험하기 위해 수행된 ADCC 분석의 결과를 나타낸다.
도 11은 HER2/neu 발현 수준이 낮은(DAKO 점수 1+) 암 셀라인(A549, 패널 A; OVCAR-8, 패널 B; MCF-7, 패널 C; BT-20, 패널 D; HT-29, 패널 E)에서 ADCC를 매개하는 본 구체예의 다양한 ch4D5 항체들의 능력을 시험하기 위해 수행된 ADCC 분석의 결과를 나타낸다.
도 12는 HER2/neu 발현 수준이 중간인(DAKO 점수 2+) 암 셀라인(ZR75-1, 패널 A; JIMT-1, 패널 B)에서 ADCC를 매개하는 본 구체예의 다양한 ch4D5 항체들의 능력을 시험하기 위해 수행된 ADCC 분석의 결과를 나타낸다.
도 13은 HER2/neu 발현 수준이 높은(DADO 점수 3+) 암 셀라인(MDA-MB-453, 패널 A; BT-474, 패널 B; SKBR-3, 패널 C; mSKOV-3, 패널 D)에서 ADCC를 매개하는 본 구체예의 다양한 ch4D5 항체들의 능력을 시험하기 위해 수행된 ADCC 분석의 결과를 나타낸다.

본 발명은 HER2/neu에 대한 항체를 사용하여 어떤 암을 치료, 진단 및 예측하기 위한 신규 항체 및 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 공지된 4D5 항체와 비교하여 감소된 글리코실화 및 변경된 이펙터 기능을 갖는, HER2/neu 과발현 세포에 대한 선택적 세포독성제로서 특히 유용한 항-HER2/neu 항체, 예를 들어 HER2/neu에 대한 키메라 4D5 항체를 제공한다. 또한, 본 발명은 암, 자가면역 질환, 염증성 장애, 및 감염성 질환과 같은 질환의 진단, 예측 및 치료에서 이러한 항체 및 이들을 포함하는 조성물의 사용 방법을 제공한다.

도면 및 이후의 실시예와 함께 상세히 작성된 본 발명의 현재 바람직한 구체예를 참조하여 본 발명의 원리를 설명할 수 있다. 이들 구체예는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있을 만큼 충분히 상세히 설명되며, 다른 구체예들도 이용될 수 있다는 것과, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 구조적, 생물학적 및 화학적 변화가 이루어질 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속한 분야의 당업자가 일반적으로 이해하고 있는 것과 같은 의미를 가진다. 당업자란 일반적인 이러한 정의나 본원에서 논의된 기술의 상세한 설명에 관한 일반적인 참조 문헌을 말할 수 있다. 이러한 문헌에는, 예를 들어 Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 및 2008년 3월까지의 증보판), Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Sambrook and Russell, third ed., 2001); Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual(Selvin & Ha, eds., Cold Spring Harbor Press, 2008); Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry(Beaucage et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., 2000); Current Protocols in Immunology(Coligan et al., eds., John Wiley & Sons, N. Y., 및 2008년 3월까지의 증보판), Making and Using Antibodies: A Practical Handbook(Howard & Kaser, eds, CRC, 2006); Using Antibodies: A Laboratory Manual(Harlow & Lane, Cold Spring Harbor Press, 1999); Binding and Kinetics for Molecular Biologists(Goodrich & Kugel, Cold Spring Harbor Press, 2007); Current Protocols in Pharmacology(Enna et al., eds., John Wiley & Sons, N. Y., 2008년 3월까지의 증보판), The Pharmacological Basis of Therapeutics(Goodman & Gilman, 11th ed., 2006), 및 Remington: The Science and Practice of Pharmacy(Lippincott Williams & Wilkins, 21st edition (2005)가 포함된다.

A. 정의

본원에 사용된 용어 "ADCC"는 FcγR을 발현하는 비-특이적 세포독성 세포(예를 들어, 자연살해(NK) 세포 및 대식세포와 같은 단핵구 세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하여 표적 세포의 세포용해를 일으키는 시험관내 세포-매개 반응인 항체 의존성 세포 세포독성을 말한다.

본원에 사용된 용어 "항체"는 단클론 항체, 다중특이적 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 다클론 항체, 낙타형 항체, 단쇄 Fv(scFv), 단쇄 항체, 면역학적으로 활성인 항체 단편(예를 들어, 에피토프와 결합할 수 있는 항체 단편, 예를 들어 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, Fv 단편, 항원과 면역특이적으로 결합하는 VL 또는 VH 도메인 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 함유하는 단편 등), 이중기능 또는 다기능 항체, 이황화물-결합된 이중특이적 Fv(sdFv), 인트라바디, 및 디아바디, 그리고 상기 언급된 것들 중 어느 것의 에피토프-결합 단편을 말한다. 특히, 항체란 용어는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 단편, 즉 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 포함하도록 의도된다. 면역글로불린 분자는 어떤 타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류에 속할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 공개 No.: 20040185045; 20050037000; 20050064514; 2005 0215767; 20070004909; 20070036799; 20070077246; 및 20070244303 참조).

"B 세포 항원 수용체" 또는 "BCR"에 관한 언급은 막 면역글로불린(m1g) 항원 결합 성분, 또는 그것의 생물학적 활성 부분(즉, 리간드와 결합할 수 있고 및/또는 전달인자 성분과 회합할 수 있는 부분), 및 전달인자 CD79a 및 CD79b 성분, 또는 그것의 생물학적 활성 부분(즉, 세포내 신호를 전달할 수 있고 및/또는 세포외 리간드 결합 부분과 회합할 수 있는 부분)을 포함하는 B 세포 항원 수용체에 관한 언급을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "암"은 세포의 비정상적인 조절 불가능한 성장으로 인한 신생물 또는 종양을 말한다. 본원에서 사용된 암은 분명히 백혈병 및 림프종을 포함한다. 어떤 구체예에서, 암은 국소적으로 유지되는 양성종양을 말한다. 다른 구체예에서, 암은 이웃한 신체 조직을 침입하여 파괴하고 먼 부위까지 전파되는 악성종양을 말한다. 어떤 구체예에서, 암은 특이적 암 항원과 관련된다.

용어 "세포 증식 장애" 및 "증식성 장애"는 어떤 정도의 비정상적 세포 증식과 관련된 장애를 말한다. 한 구체예에서, 세포 증식성 장애는 암이다.

항체를 언급할 때 용어 "키메라"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 한 종(예를 들어, 마우스) 또는 항체 부류 또는 하위부류로부터 유래된 항체와 동일하거나 상동성이고, 나머지 부분은 또 다른 종(예를 들어, 인간) 또는 항체 부류 또는 하위부류의 항체와 동일하거나 상동성인 항체를 말하며, 단 이들은 원하는 생물학적 활성을 나타내야 한다. 본원에서 관심 있는 키메라 항체는 비-인간 영장류(예를 들어, 구세계 원숭이, Ape 등)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열과 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화된" 항체를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항원 결합에 필수적인 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 말한다. 각 가변 도메인은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로서 확인된 3개의 CDR 영역을 가진다.

본원에 사용된 용어 "디아바디 분자"는 둘 이상의 폴리펩티드 사슬 또는 단백질의 복합체를 말하며, 이들 각각은 적어도 하나의 VL 및 하나의 VH 도메인 또는 그것의 단편을 포함하고, 두 도메인 모두 단일 폴리펩티드 사슬 내에 포함된다. 어떤 구체예에서, "디아바디 분자"는 Fc 또는 힌지-Fc 도메인을 포함하는 분자를 포함한다. 복합체의 상기 폴리펩티드 사슬은 동일하거나 상이할 수 있는데, 즉 디아바디 분자는 호모멀티머 또는 헤테로멀티머일 수 있다. 특정 양태에서, "디아바디 분자"는 VL과 VH 도메인을 모두 함유하는 다이머 또는 테트라머 또는 상기 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 멀티머 단백질을 포함하는 각 폴리펩티드 사슬은 사슬간 이황화물 결합에 의해 멀티머의 적어도 하나의 다른 펩티드와 공유적으로 연결될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "장애" 및 "질환"은 호환하여 사용되며, 피험자의 상태를 말하는데 사용된다. 특히, 용어 "자가면역 질환"은 용어 "자가면역 장애"와 호환하여 사용되며, 자신의 세포, 조직 및/또는 장기에 대한 피험자의 면역원성 반응에 의해서 야기되는 세포, 조직 및/또는 장기 손상을 특징으로 하는 피험자의 상태를 말한다. 용어 "염증성 질환"은 용어 "염증성 장애"와 호환하여 사용되며, 염증, 바람직하게는 만성 염증을 특징으로 하는 피험자의 상태를 말한다. 자가면역 장애는 염증과 관련될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 더욱이, 염증은 자가면역 장애에 의해 야기될 수도 있고 그렇지 않을 수 있다. 따라서, 어떤 장애는 자가면역 장애와 염증성 장애를 모두 특징으로 할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "이펙터 세포"는 하나 이상의 Fc 수용체를 발현하고 하나 이상의 이펙터 기능을 매개하는 면역 시스템의 세포를 말한다. 이펙터 세포는, 제한은 아니지만, 단핵구, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 호산구, 비만세포, 혈소판, B 세포, 큰 과립 림프구, 랑게르한스 세포, 자연살해(NK) 세포를 포함하며, 제한은 아니지만, 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 원숭이를 포함하는 모든 생물체로부터 유래될 수 있다.

용어 "이펙터 기능"은 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드의 상호작용에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 말한다. 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 가질 수 있다. 항체 이펙터 기능의 비제한적인 예로는 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), C1q 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC), 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향조절, 옵소닌 작용, 옵소닌 포식작용, 세포 결합, 및 장미화(rosetting)을 포함한다. 이펙터 기능은 항원의 결합 후에 작동하는 것과 항원 결합과 독립적으로 작동하는 것을 모두 포함한다.

본원에 사용된 용어 "에피토프"는 항체에 의해 면역특이적으로 결합되는 폴리펩티드 또는 단백질 또는 비-단백질 분자의 부분을 말한다. 에피토프는 동물에서 항체 생산 반응을 도출하는 면역원성 활성을 가질 수 있다. 항체와 면역특이적으로 결합하는 에피토프의 능력은, 예를 들어 면역분석에 의해서 측정될 수 있다. 에피토프가 반드시 면역원성일 필요는 없다.

용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역과 결합하는 수용체를 설명하기 위해 본원에서 사용된다. 전형적인 FcR은 자생 서열 인간 FcR이다. FcR은 IgG 항체와 결합하는 것일 수 있으며(감마 수용체), FcγRI, FcγRII, FcγRIII, 및 FcγRIV 하위부류의 수용체를 포함하고, 이들 수용체의 대립형질 변이체 및 이들 수용체의 선택적 스플라스된 형태도 포함하는데, 예를 들어 적어도 2개의 FcγRII 수용체, 즉 FcγRIIA와 FcγRIIB가 알려져 있다. 또한, 용어 FcR은 신생아 수용체인 FcRn을 포함하는데, 이것은 모 IgG의 태아로의 전달을 초래한다.

본원에 사용된 용어 "Fc 영역"은 IgG 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해서 사용된다. 경계는 약간 변할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226에서부터 카르복시 말단까지 펼쳐져 있다고 정의된다. IgG의 Fc 영역은 2개의 불변 도메인, 즉 CH2 및 CH3을 포함한다. 인간 IgG Fc 영역의 CH2 도메인("Cγ2" 도메인이라고도 한다)은 일반적으로 아미노산 231에서부터 아미노산 338까지 연장되어 있고, 인간 IgG Fc 영역의 CH3 도메인은 일반적으로 아미노산 342에서부터 447까지 연장되어 있다.

용어 "글리코실화 부위"는 당 잔기의 부착을 위한 장소로서 포유류 세포에 의해 인식되는 아미노산 잔기 또는 잔기들을 말한다. 올리고당과 같은 탄수화물이 부착되는 아미노산 잔기는 일반적으로 아스파라긴(N-결합), 세린(O-결합), 및 트레오닌(O-결합) 잔기이다. 특이적 부착 부위는 일반적으로 특징적인 아미노산 서열을 가지며, 이것을 "글리코실화 부위 서열"이라고 한다. N-결합 글리코실화의 글리코실화 부위 서열은 Asn-X-Ser/Thr이고, 여기서 X는 프롤린 이외의 다른 보존성 아미노산들 중 어느 것일 수 있다. 인간 IgG의 Fc 영역은 2개의 N-결합 글리코실화 부위를 가지는데, 각 CH2 도메인의 위치 297의 아스파라긴(Asn297)에 하나씩 존재한다.

본원에 사용된 용어 "HAMA 반응"은 인간 면역 시스템이 뮤린 항체를 외부물질로서 인식하여 그것을 공격할 때 발생하는 해로운 면역원성 반응인 인간 항-마우스 항체 반응을 말한다. HAMA 반응은 독성 쇼크나 사망을 일으킬 수 있다. 키메라 및 인간화된 항체는 투여되는 항체의 비-인간 부분을 감소시킴으로써 HAMA 반응 가능성을 감소시키지만, 이러한 항체에 대한 인간 항-인간 항체 반응("HAHA 반응") 면역반응의 가능성은 여전히 존재한다.

"중쇄", "경쇄"("CL"), "경쇄 가변 영역"("VL"), "중쇄 가변 영역"("VH"), "프레임워크 영역"("FR"), "중쇄 불변 도메인"("CH"), "경쇄 불변 도메인"("CL")란 용어들은 자연 발생 면역글로불린에 있는 도메인 및 합성(예를 들어, 재조합) 결합 단백질(예를 들어, 인간화된 항체)의 상응하는 도메인들을 말한다. 자연 발생 면역글로불린(예를 들어, IgG)의 기본적인 구조 단위는 2개의 경쇄와 2개의 중쇄를 가진 테트라머이다. 일반적으로 자연 발생 면역글로불린은 약 150 kDa의 당단백질로서 발현되지만, IgG는 비-글리코실화 형태로 생산될 수도 있다. 각 사슬의 아미노-말단("N") 부분은 약 100-110개 또는 그 이상의 아미노산으로 된 가변 영역을 포함하며, 이것이 주로 항원 인식을 담당한다. 각 사슬의 카르복시-말단("C") 부분은 불변 영역을 한정하며, 이때 경쇄는 단일 불변 도메인을 가지고, 중쇄는 일반적으로 3개의 불변 도메인과 힌지 영역을 가진다. 따라서, 자연 발생 IgG 분자의 경쇄의 구조는 N-VL-CL-C이고, IgG 중쇄의 구조는 N-VH-CH1-H-CH2-CH3-C(여기서 H는 힌지 영역이다)이다. IgG 분자의 가변 영역은 상보성 결정 영역(CDR)로 구성되는데, 이것은 항원과 접하는 잔기들과 프레임워크 세그먼트라고 하는 비-CDR 세그먼트를 함유하고, 프레임워크 세그먼트는 구조를 유지하고, CDR 루프의 위치를 결정한다. 따라서, VL 및 VH 도메인은 구조 N-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-C를 가진다.

본원에 사용된 용어 "이종성" 핵산은 숙주 세포에 도입되는 DNA, RNA 등을 나타낸다. 핵산은 게놈 DNA, mRNA, cDNA, 합성 DNA 및 이들의 융합체 또는 조합을 포함하는 여러 출처 중 어느 것으로부터 유래될 수 있다. 핵산은 숙주 또는 수여자 세포와 동일한 세포 또는 세포 타입의 폴리뉴클레오티드 또는 상이한 세포 타입, 예를 들어 포유류 또는 식물의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 선택적으로 마커 또는 선택 유전자, 예를 들어 항생제 내성 유전자, 온도 내성 유전자 등을 포함할 수 있다.

용어 "힌지 영역"은 일반적으로 인간 IgG1의 Glu216에서부터 Pro230까지 걸쳐 있는 것으로서 정의된다. 중쇄간 S-S 결합을 형성하는 처음과 마지막 시스테인 잔기를 동일한 위치에 위치시킴으로써 IgG1 서열과 다른 IgG 이소타입의 힌지 영역이 정렬될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "인간화된"은 본 분야에서의 일반적인 의미를 가진다. 일반적인 관점에서, 비-인간 항체의 인간화는 인간 프레임워크 영역에서 비-인간 면역글로불린 VL 및 VH 영역의 CDR 서열을 치환하는 것을 포함한다. 더 나아가, 본원에 사용된 "인간화된" 항체는 친화성을 증가시키기 위해서나 다른 목적을 위해서 도입되는 CDR 및/또는 프레임워크 영역 내의 추가의 치환 및 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 서열 내의 비-인간 프레임워크 잔기의 치환은 친화성을 증가시킬 수 있다. 결과의 가변 도메인은 비-인간 CDR 서열과 인간 항체 프레임워크 서열(들) 또는 인간 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 서열을 가진다. 여러 상이한 인간 프레임워크 영역이 인간화된 항체의 베이스로서 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "면역조정제" 및 이들의 변형들은 숙주의 면역 시스템을 조정하는 제제를 말한다. 어떤 구체예에서, 면역조정제는 면역억제제이다. 어떤 다른 구체예에서, 면역조정제는 면역자극제이다. 면역조정제는, 제한은 아니지만, 소분자, 펩티드, 폴리펩티드, 융합 단백질, 항체, 무기 분자, 의태제, 및 유기 분자를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "면역특이적으로 결합한다"는 항체와 항체가 인식하는 에피토프 사이에 나타나는 특이적 결합을 말한다. 이러한 결합은 전형적으로 적어도 약 0.1 mM, 더 일반적으로는 적어도 약 1 μM, 바람직하게 적어도 약 0.1 μM 이하, 가장 바람직하게 0.01 μM 이하의 K_D를 나타낸다. 바람직하게, 본 발명의 항체는 높은 친화성(예를 들어, 낮은 K_D)으로 단백질과 면역특이적으로 결합한다.

항원과 면역특이적으로 결합하는 항체는, 예를 들어 면역분석인 BIAcore 또는 본 분야에 알려진 다른 분석법으로 측정했을 때 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들과는 더 낮은 친화성으로 결합할 수 있다. 바람직하게, 항원과 특이적으로 결합하는 분자는 다른 단백질과 교차반응하지 않는다. 항원과 특이적으로 결합하는 분자는, 예를 들어 면역분석인 BIAcore, 또는 당업자에게 알려진 다른 기술에 의해 확인될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "항체조작 기술분야"는 2007년 12월 19일 제출된 미국 가 특허출원 No. 60/781,564; 60/945,523; 61/015,106; 및 2008년 1월 4일 제출된 61/019,051; US 20040185045; US 20040197347; US 20040197866; US 20050037000; US 20050064514; US 20050215767; US 20060134709; US 20060177439; US 2007 0004909; US 20070036799; US 20070037216; US 20070077246; US 20070244303; US 20080044429; US 20080050371; 11/869,410; 11/952,568; U.S. 특허 No. 7,112,439; WO 04/063351; WO 06/088494; WO 07/024249; WO 06/113665; WO 07/021841; WO 07/ 106707; 또는 PCT/US07/86793에 개시된 기술들을 말한다.

본원에 사용된 용어 "단클론 항체"는 실질적으로 상동성인 항체들의 집단으로부터 얻어진 항체를 말하며, 즉 집단을 이루는 각 항체가 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다는 것이고, 본원에 사용된 용어 "다클론 항체"는 이종성 항체들의 집단으로부터 얻어진 항체를 말한다. 단클론 항체는 매우 특이적이며, 단일 에피토프에 대해 지정된다. 이들의 특이성에 더하여, 단클론 항체는 이들이 다른 항체에 의한 오염 없이 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 용어 "단클론"은 실질적으로 상동성인 항체들의 집단으로부터 얻어진 항체의 성격을 나타내며, 항체의 생산에 어떤 특정한 방법이 요구된다는 것을 구성하지는 않는다.

본원에 사용된 용어 "핵산" 및 "뉴클레오티드 서열"은 DNA 분자(예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA), RNA 분자(예를 들어, mRNA), DNA와 RNA 분자의 조합 또는 하이브리드 DNA/RNA 분자, 및 DNA 또는 RNA 분자의 유사체를 포함한다. 이러한 유사체는, 예를 들어, 제한은 아니지만, 이노신 또는 트리틸화된 염기를 포함하는 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 생산될 수 있다. 이러한 유사체는 변형된 백본을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 포함할 수 있으며, 이 분자에 의해서, 예를 들어 뉴클레아제 내성이나 세포막을 가로지르는 능력의 증가와 같은 유리한 점이 얻어진다. 핵산 또는 뉴클레오티드 서열은 단일가닥, 이중가닥일 수 있고, 단일가닥과 이중가닥 부분을 모두 함유할 수 있고, 삼중가닥 부분을 함유할 수 있지만, 이중가닥 DNA가 바람직하다.

본원에 사용된 "실질적인 서열 동일성"은 최대 상응으로 정렬하여 비교하였을 때 적어도 약 80% 아미노산 잔기 동일성, 바람직하게 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 동일성을 갖는 둘 이상의 서열 또는 하위서열(예를 들어, 도메인)을 말한다. 두 유사한 서열(예를 들어, 항체 가변 영역) 사이의 서열 동일성은 Smith & Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482[국소 상동성 알고리즘], Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443[상동성 정렬 알고리즘], Pearson & Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.) 85:2444[유사성 방법 탐색], 또는 Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10[BLAST 알고리즘]의 알고리즘과 같은 알고리즘에 의해 측정될 수 있다. 상술된 알고리즘 중 어느 것을 사용하는 경우, 디폴트 파라미터(창 길이, 갭 패널티 등에 대해)가 사용된다. 서열 동일성도가 적어도 약 70% 동일한, 바람직하게 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 또는 심지어 적어도 약 95% 동일한 경우 아미노산 서열이 제 2 서열과 "실질적으로 유사"하다고 말한다. 핵산 서열은 (1) 서열 동일성도가 적어도 약 70% 동일, 바람직하게 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 또는 심지어 약 95% 동일하거나, 또는 핵산 서열이 제 2 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 적어도 약 70% 동일한, 바람직하게는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 또는 심지어 적어도 약 95% 동일한 폴리펩티드를 암호화할 때 제 2 서열과 "실질적으로 유사"하다고 말한다. 실질적으로 동일한 서열들은 또한 실질적으로 유사하다.

항체를 말할 때, 각 도메인에 대한 아미노산의 배정은 Kabat, Sequences Of Proteins Of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 및 1991)에 따르며, 이것은 참고자료로 본원에 분명히 포함된다. 본 명세서 전체에서 IgG 중쇄의 잔기의 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 지수의 넘버링이며, 인간 IgG1 EU 항체의 넘버링을 말한다.

B. 항체

본 발명은 특히 HER2/neu, 바람직하게 인간 HER2/neu와 특이적으로 결합하는 키메라 항체 및 폴리펩티드를 포함한다. 상기 항체는 경쇄의 가변 영역에 있는 글리코실화 부위의 제거로 인해 뮤린 4D5 및 트라스투주맙와 같은 공지된 4D5 항체와 비교하여 감소된 글리코실화를 가진다. 자생 뮤린 4D5에서는 위치 65, 66 및 67에 N-R-S 서열이 포함되는데, 본 항체는 특히 이 경쇄 가변 영역에서 글리코실화 부위를 결여한다. 자생 4D5 항체와 비교하여, 항체는 바람직하게 HER2/neu에 대한 증진된 결합 친화성을 가지며, 더 바람직하게 항체는 증진된 이펙터 기능을 가진다.

상기 항체는 경쇄 가변 영역의 위치 65, 66 및 67에 N-결합 글리코실화 부위를 결여한 키메라 4D5 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 특정 구체예에서, 항체는 경쇄(VL)의 가변 영역의 위치 65에 변형, 바람직하게는 치환을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 항체는 SEQ ID NO: 1의 핵산 서열에 의해 암호화된 경쇄를 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 바람직한 경쇄의 핵산 및 아미노산 서열이 아래 제시된다:

키메라 경쇄 핵산 서열(SEQ ID NO: 1):

gacatcgtga tgacccagtc ccacaagttc atgtccacct ctgtgggcga tagggtcagc 60

atcacctgca aggccagcca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca gcagaaacca 120

ggacattctc ccaaactgct gatttactcc gcatccttcc ggtacactgg agtccctgat 180

cgcttcactg gcagcagatc tgggacagat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240

gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatacta cacctcccac cttcggaggg 300

ggtaccaagg tggagatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645

키메라 경쇄 아미노산 서열(SEQ ID NO: 2):

DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLIYS ASFRYTGVPD 60

RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYTTPPTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP 120

SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT 180

LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC 214

VL 영역의 위치 65에 변형을 가진 이들 항체는 도 1에서 볼 수 있는 대로 자생 뮤린 4D5 항체에서 발견되는 N-결합 글리코실화 부위를 결여하며, 도 1은 N65S 변형을 가진 키메라 4D5 항체(SEQ ID NO: 4)와 자생 뮤린(SEQ ID NO: 3)과 인간화된(SEQ ID NO: 5) 4D5 항체의 VL 영역 아미노산 서열의 전형적인 비교를 나타낸다. 다른 바람직한 구체예에서, 항체는 VL 영역에 N65S 변형을 포함하며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 4의 VL 영역 아미노산 서열을 가진다. 이들 서열이 아래 제시된다:

자생 뮤린 VL 영역 아미노산 서열(SEQ ID NO: 3):

DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLIYS ASFRYTGVPD 60

RFTGNRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYTTPPTFGG GTKLEIKRA 109

키메라 VL 영역 아미노산 서열(SEQ ID NO: 4):

DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLIYS ASFRYTGVPD 60

RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYTTPPTFGG GTKVEIKRT 109

인간화된 VL 영역 아미노산 서열(SEQ ID NO: 5):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLESGVPS 60

RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ GTKVEIKRT 109

한 구체예에서, 중쇄는 뮤린 4D5 야생형 Fc 영역을 가지며, 이것은 바람직하게는 SEQ ID NO: 6의 핵산 서열에 의해 암호화되거나, 또는 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 가진다. 이들 서열이 아래 제시된다:

야생형 Fc 영역 핵산 서열을 가진 중쇄(SEQ ID NO: 6):

caggttcagc tgcagcagtc tggccctgag ctggtgaagc caggggcctc actcaagttg 60

tcctgtacag cttctggctt caacatcaaa gacacctata tccactgggt gaaacagagg 120

cctgaacagg gcctggaatg gattggaagg atttatccta ccaatggcta tactagatat 180

gacccaaagt tccaggacaa ggccactatc acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240

ctgcaagtca gccgcctgac atctgaggac actgccgtct attactgctc ccggtgggga 300

ggggacggct tctatgctat ggactactgg ggtcagggag cctccgtgac cgtgagctcc 360

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1353

야생형 Fc 영역 아미노산 서열을 가진 중쇄(SEQ ID NO: 7):

QVQLQQSGPE LVKPGASLKL SCTASGFNIK DTYIHWVKQR PEQGLEWIGR IYPTNGYTRY 60

DPKFQDKATI TADTSSNTAY LQVSRLTSED TAVYYCSRWG GDGFYAMDYW GQGASVTVSS 120

ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 180

GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 240

PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN 300

STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE 360

LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW 420

QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 450

다른 구체예에서, 중쇄는 뮤린 4D5 항체 중쇄의 변이체이며, 이것은 바람직하게는 변이체 Fc 영역을 포함하고, 더 바람직하게는 FcMT1, FcMT2, 또는 FcMT3와 같은 변이체 Fc 영역을 포함한다. 이들 서열이 아래 제시된다:

FcMT1 변이체 Fc 영역 핵산 서열을 가진 중쇄(SEQ ID NO: 8):

caggttcagc tgcagcagtc tggccctgag ctggtgaagc caggggcctc actcaagttg 60

tcctgtacag cttctggctt caacatcaaa gacacctata tccactgggt gaaacagagg 120

cctgaacagg gcctggaatg gattggaagg atttatccta ccaatggcta tactagatat 180

gacccaaagt tccaggacaa ggccactatc acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240

ctgcaagtca gccgcctgac atctgaggac actgccgtct attactgctc ccggtgggga 300

ggggacggct tctatgctat ggactactgg ggtcagggag cctccgtgac cgtgagctcc 360

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720

ccgtcagtct tcctcttacc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgccggagga gcagtacaac 900

agcacgctcc gtgtggtcag catcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctctcgtg 1200

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1353

FcMT1 변이체 Fc 영역 아미노산 서열을 가진 중쇄(SEQ ID NO: 9):

QVQLQQSGPE LVKPGASLKL SCTASGFNIK DTYIHWVKQR PEQGLEWIGR IYPTNGYTRY 60

DPKFQDKATI TADTSSNTAY LQVSRLTSED TAVYYCSRWG GDGFYAMDYW GQGASVTVSS 120

ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 180

GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 240

PSVFLLPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPPEEQYN 300

STLRVVSILT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE 360

LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPLV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW 420

QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 450

FcMT2 변이체 Fc 영역 핵산 서열을 가진 중쇄(SEQ ID NO: 10):

caggttcagc tgcagcagtc tggccctgag ctggtgaagc caggggcctc actcaagttg 60

tcctgtacag cttctggctt caacatcaaa gacacctata tccactgggt gaaacagagg 120

cctgaacagg gcctggaatg gattggaagg atttatccta ccaatggcta tactagatat 180

gacccaaagt tccaggacaa ggccactatc acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240

ctgcaagtca gccgcctgac atctgaggac actgccgtct attactgctc ccggtgggga 300

ggggacggct tctatgctat ggactactgg ggtcagggag cctccgtgac cgtgagctcc 360

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cgtgggggga 720

ccgtcagtct tcctcttacc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgccggagga gcagtacaac 900

agcacgctcc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctctcgtg 1200

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1353

FcMT2 변이체 Fc 영역 아미노산 서열을 가진 중쇄(SEQ ID NO: 11):

QVQLQQSGPE LVKPGASLKL SCTASGFNIK DTYIHWVKQR PEQGLEWIGR IYPTNGYTRY 60

DPKFQDKATI TADTSSNTAY LQVSRLTSED TAVYYCSRWG GDGFYAMDYW GQGASVTVSS 120

ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 180

GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELVGG 240

PSVFLLPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPPEEQYN 300

STLRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE 360

LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPLV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW 420

QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 450

McMT3 변이체 Fc 영역 핵산 서열을 가진 중쇄(SEQ ID NO: 12):

caggttcagc tgcagcagtc tggccctgag ctggtgaagc caggggcctc actcaagttg 60

tcctgtacag cttctggctt caacatcaaa gacacctata tccactgggt gaaacagagg 120

cctgaacagg gcctggaatg gattggaagg atttatccta ccaatggcta tactagatat 180

gacccaaagt tccaggacaa ggccactatc acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240

ctgcaagtca gccgcctgac atctgaggac actgccgtct attactgctc ccggtgggga 300

ggggacggct tctatgctat ggactactgg ggtcagggag cctccgtgac cgtgagctcc 360

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720

ccgtcagtct tcctcttacc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgccggagga gcagtacaac 900

agcacgctcc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1353

McMT3 변이체 Fc 영역 아미노산 서열을 가진 중쇄(SEQ ID NO: 13):

QVQLQQSGPE LVKPGASLKL SCTASGFNIK DTYIHWVKQR PEQGLEWIGR IYPTNGYTRY 60

DPKFQDKATI TADTSSNTAY LQVSRLTSED TAVYYCSRWG GDGFYAMDYW GQGASVTVSS 120

ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 180

GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 240

PSVFLLPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPPEEQYN 300

STLRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE 360

LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW 420

QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK 450

한 구체예에서, 변이체 4D5 중쇄는 Fc 영역에 변형을 가지며, SEQ ID NO: 8의 핵산 서열에 의해 암호화되거나 또는 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 10의 핵산 서열에 의해 암호화되거나 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO:12의 핵산 서열에 의해 암호화되거나 또는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 항체는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 및 SEQ ID NO: 12로 구성되는 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해 암호화되거나, 또는 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 13으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.

한 구체예에서, 항-HER2/neu 항체는 VL 영역에 N65S 변형을 가진 면역글로불린 경쇄, 및 변형된 Fc 영역을 가진 면역글로불린 중쇄를 포함한다. 바람직하게, 항-HER2/neu 항체는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 가진 경쇄, 및 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, 및 SEQ ID NO: 13로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 중쇄를 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인에 융합된 경쇄 불변 도메인을 더 포함하며, 어떤 구체예에서 경쇄 가변 도메인은 적어도 SEQ ID NO: 4를 포함한다. 다른 구체예에서, 항체는 변형된, 단편, 또는 변형된 단편이다.

활성화 저-친화성 Fc 수용체와의 결합은 증진되고, 저-친화성 억제제 수용체 CD32B(FcγRII-B)와의 결합은 변경하지 않거나 단치 최소한만 증가되도록 한, 키메라 4D5 항체들이 본 발명의 여러 구체예에 따라서 구성되었다. 이 항체들은 다음의 야생형 및 Fc-최적화된 항체들을 포함한다:

* ch4D5-야생형 Fc, 이것은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 가진 경쇄, 및 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 가진 중쇄를 가진다. ch4D5-야생형 Fc는 경쇄 상에 N65S 치환을 가지며, 그 결과 글리코실화 제거된 경쇄가 얻어진다.

* ch4D5-FcMT1, 이것은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 가진 경쇄, 및 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 가진 중쇄를 가진다. ch4D5-FcMT1은 경쇄 상에 글리코실화 제거된 경쇄를 만드는 N65S 치환과 중쇄 상에 F243L, R292P, Y300L, V305I, 및 P396L 치환을 가진다(모두 Kabat에 따라서 넘버링). ch4D5-FcMT1은 인간 CD16A (FcγRIII-A)와의 결합에 10배의 증가를 나타내고, CD16-158phe와의 결합은 CD16-158Val와의 결합보다 비율상 더 많은 방식으로 증진된다.

* ch4D5-FcMT2, 이것은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 가진 경쇄, 및 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 가진 중쇄를 가진다. ch4D5-FcMT2는 경쇄 상에 글리코실화 제거된 경쇄를 만드는 N65S 치환과 중쇄 상에 L235V, F243L, R292P, Y300L, 및 P396L 치환을 가진다(모두 Kabat에 따라서 넘버링). 이 항체는 ch4D5-FcMT1 항체를 더 개량한 것으로서, CD16A와의 결합 특성은 유사하지만, CD32B(FcγRII-B)와의 결합은 더 순조롭게 감소한다.

* ch4D5-FcMT3, 이것은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 가진 경쇄, 및 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 가진 중쇄를 가진다. ch4D5-FcMT3은 경쇄 상에 글리코실화 제거된 경쇄를 만드는 N65S 치환과 중쇄 상에 F243L, R292P, 및 Y300L 치환을 가진다(모두 Kabat에 따라서 넘버링). 이 항체는 ch4D5-FcMT1 항체를 더 개량한 것으로서, CD16A와의 결합 특성은 유사하지만, CD32B(FcγRII-B)와의 결합은 더 순조롭게 감소한다.

* ch4D5-Ag

* ch4D5-N297Q, 이것은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 가진 경쇄, 및 N297Q 치환을 가진 중쇄를 가진다(Kabat에 따라서 넘버링).

ch4D5-야생형 Fc와 Fc-최적화된 변이체 ch4D5-FcMT1, ch4D5-FcMT2 및 ch4D5-FcMT3의 중쇄 서열의 비교가 도 2에 도시된다. CDR은 적합한 잔기 아래에 그려진 검은색 막대로 표시된다.

본 발명에서 고찰되는 폴리펩티드(특히 항체)는 본 발명의 어떤 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 구체예에서 폴리펩티드는 N65S 치환을 가진 뮤린 4D5 면역글로불린 경쇄를 포함하고, 다른 구체예에서 폴리펩티드는 뮤린 4D5 면역글로불린 중쇄 변이체를 포함한다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 가진 면역글로불린 경쇄 가변 도메인, 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 가진 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 변이체 Fc 도메인, 또는 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, 또는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 가진 면역글로불린 중쇄, 또는 F243L, R292P, 및 Y300L 치환을 포함하는 4D5 면역글로불린 중쇄를 포함한다.

본 발명에서 고찰되는 폴리펩티드(특히 항체)는 서로 또는 다른 비-면역글로불린 폴리펩티드(예를 들어, 효소, 호르몬, 구조 단백질 등)과의 복합체로 존재할 수 있다. 예를 들어, 한 구체예는 2개의 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 복합체를 제공할 수 있으며, 여기서 상기 폴리펩티드 중 하나는 중쇄를 포함하고, 나머지 폴리펩티드는 변이체 경쇄를 포함하거나, 아니면 두 폴리펩티드가 모두 동일한 서열을 포함한다. 복합체화는 본원에 설명된 것들과 같은 다이머화/멀티머화 도메인에서의 다이머화/멀티머화 또는 공유 상호작용(이황화물 결합을 통한 것 등)(어떤 문맥에서 이것은 다이머화 도메인의 일부인데, 예를 들어 다이머화 도메인이 류신 지퍼 서열 및 시스테인을 함유할 수 있다)에 의한 것을 포함하여, 어떤 적합한 기술에 의해 매개될 수 있다. 다른 구체예에서, 조성물이 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있는데, 예를 들어 조성물은 본원에 설명된 폴리펩티드들 중 어느 것을 복수 개 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 키트 또는 제조 물품(선택적으로 설명서, 버퍼 등과 함께 포장된)의 형태로 존재할 수 있다.

또한, 폴리펩티드 변이체(및 특정 항체 변이체로)가 제조될 수 있다. 폴리펩티드 변이체는 자생 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 서열 내의 원하는 위치에 서열 변형(예를 들어, 치환, 결실 및/또는 부가)를 지닐 수 있다. 당업자는 아미노산 변화가 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변화 또는 막 고정 특징의 변경 등, 항체 또는 폴리펩티드의 번역-후 프로세스를 변경시킬 수 있다는 것을 인정할 것이다. 바람직한 구체예에서, 항체 및 폴리펩티드 변이체는 Fc 영역 변이체이다.

변이체는 자생 항체 또는 폴리펩티드와 비교하여 동일한 또는 변경된 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 변이체는 동일한 활성을 가지는 것이 바람직할 수 있지만, 예를 들어, U.S. 특허 No. 5,739,277에 설명된 바와 같은, 항체와 알부민 또는 구제 수용체(salvage receptor) 결합 에피토프를 콘쥬게이션하는 것에 의해, 더욱 안정하거나 더 긴 생체내 반감기를 가지도록 하는 방식으로 변경될 수 있다. 또는, 예를 들어, 항체는 항원에 대한 증가된 결합 친화성 및 자생 항체와 동일한 이펙터 기능을 가지는 것이 바람직할 수 있거나, 또는 항체는 항원에 대한 동일한 결합 친화성 및 감소된 이펙터 기능을 가지는 것이 바람직할 수 있다. 활성은, 예를 들어 ELISA 분석, 표면 플라스몬 공명 분석, 방사성 표지 단백질 결합 분석(RIA), 또는 면역침전 분석과 같은 시험관내 분석법을 사용하여 시험될 수 있다.

기능 또는 면역학적 동일성의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어, 시트 또는 나선 입체구조인 변형 영역의 폴리펩티드 백본 구조, (b) 표적 부위에 존재하는 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 부피를 유지하는데 대한 효과에 유의한 차이를 가지는 상이한 변형들을 선택함으로써 달성될 수 있다. 또한, 스캐닝 아미노산 분석을 사용하여 연속 서열을 따라 있는 하나 이상의 아미노산을 확인할 수 있으며, 이것은 예를 들어, Cunningham and Wells (1989) Science 244:1081-1085에서 설명된다. 특히, 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 작은 중성 아미노산들, 예를 들어 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인이다. 전형적으로 알라닌이 이 그룹 중에서도 바람직한 스캐닝 아미노산인데, 그 이유는 알라닌이 가장 흔한 아미노산이고, 매립된 위치와 노출된 위치에서 모두 빈번히 발견되기 때문이며, 그것이 베타-탄소를 넘는 측쇄를 제거하고, 변이체의 주쇄 입체구조를 변경할 가능성이 적기 때문이다. 알라닌 치환이 충분한 양의 변이체를 제공하지 못한다면, 등입체성 아미노산이 사용될 수 있다. 더 나아가, 항체 또는 폴리펩티드의 적절한 입체구조를 유지하는데 관련되지 않는 어떤 시스테인 잔기가, 일반적으로 세린으로 치환될 수 있으며, 이로써 분자의 산화 안정성이 개선되고 비정상적인 가교가 방지된다. 그러나, 어떤 환경에서는, 특히 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우에는, 시스테인 결합(들)이 항체 또는 폴리펩티드에 부가되어 안정성이 개선될 수 있다.

B1. Fc 도메인 변이체

본 발명의 폴리펩티드는 변이체 Fc 도메인을 가질 수 있다. Fc 도메인의 변형은 일반적으로 변경된 표현형, 예를 들어 변형된 혈청 반감기, 변경된 안정성, 변경된 세포 효소에 대한 감수성 또는 변경된 이펙터 기능을 가져온다. 이펙터 기능과 관련하여 본 발명의 항체를 변형하는 것이 바람직할 수 있으며, 이로써 예를 들어, 암의 치료에서 항체의 유효성이 증진될 수 있다. 이펙터 기능의 감소 또는 제거는 어떤 경우, 예를 들어 작용 기전이 표적 항원을 지닌 세포의 차단 또는 길항작용을 수반하지만, 그것을 죽이지는 않는 항체의 경우 바람직하다. 증가된 이펙터 기능은 일반적으로 바람직하지 않은 세포, 예를 들어 FcγR이 낮은 수준으로 발현되는 종양 및 외래 세포, 예를 들어 낮은 수준의 FcγRIIB를 가진 종양 특이적 B 세포(예를 들어, 비-호지킨 림프종, CLL 및 버킷 림프종)에 관해서 바람직하다. 상기 구체예에서, 이펙터 기능 활성이 부여되거나 변경된 본 발명의 분자는 이펙터 기능 활성의 효능 증진이 바람직한 질환, 장애 또는 감염의 치료 및/또는 예방에서 유용하다.

어떤 구체예에서, 본 발명의 분자는 하나 이상의 FcγR 수용체에 대한 Fc 영역과 그에 따른 본 발명의 분자의 친화성 및 항체항원 결합력을 감소시키는 하나 이상의 변형을 Fc 도메인의 아미노산에 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 분자는 하나 이상의 FcγR 수용체에 대한 Fc 영역과 그에 따른 본 발명의 분자의 친화성 및 항체항원 결합력을 증가시키는 하나 이상의 변형을 Fc 도메인의 아미노산에 포함한다. 다른 구체예에서, 분자는 변이체 Fc 도메인을 포함하며, 여기서 상기 변이체는 Fc 도메인을 포함하지 않거나 야생형 Fc 도메인을 포함하는 분자와 비교하여 ADCC 활성 증가 및/또는 FcγRIIA와의 결합 증가를 부여하거나 매개한다. 다른 구체예에서, 분자는 변이체 Fc 도메인을 포함하며, 여기서 상기 변이체는 Fc 도메인을 포함하지 않거나 야생형 Fc 도메인을 포함하는 분자와 비교하여 ADCC 활성(또는 다른 이펙터 기능) 감소 및/또는 FcγRIIB와의 결합 증가를 부여하거나 매개한다.

어떤 구체예에서, 본 발명은 변이체 Fc 영역을 포함하는 분자들을 포함하며, 이 변이체 Fc 영역은 야생형 Fc 영역을 포함하는 비교가능한 분자에 비하여 어떤 FcγRd와도 검출가능한 결합을 나타내지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명은 변이체 Fc 영역을 포함하는 분자들을 포함하며, 이 변이체 Fc 영역은 하나의 FcγR과만, 바람직하게는 FcγRIIA, FcγRIIB, 또는 FcγRIIIA 중 하나와만 결합한다.

본 발명의 폴리펩티드는 활성화 및/또는 억제성 Fcγ 수용체에 대해 변경된 친화성을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 항체 또는 폴리펩티드는 야생형 Fc 영역을 가진 비교가능한 분자에 비하여 FcγRIIB에 대한 증가된 친화성 및 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 감소된 친화성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 야생형 Fc 영역을 가진 비교가능한 분자에 비하여 FcγRIIB에 대한 감소된 친화성 및 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 증가된 친화성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 야생형 Fc 영역을 가진 비교가능한 분자에 비하여 FcγRIIB에 대한 감소된 친화성 및 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 감소된 친화성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 야생형 Fc 영역을 가진 비교가능한 분자에 비하여 FcγRIIB에 대한 불변된 친화성 및 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 감소된(또는 증가된) 친화성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함한다.

어떤 구체예에서, 본 발명은 면역글로불린이 증진된 이펙터 기능, 예를 들어 항체 의존성 세포 매개 세포독성을 가지도록 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 변경된 친화성을 가진 변이체 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린을 포함한다. 이펙터 세포 기능은 비제한적인 예로는 항체-의존성 세포 매개 세포독성(ADCC), 항체-의존성 포식작용, 포식작용, 옵소닌 작용, 옵소닌 포식작용, 세포 결합, 장미화, C1q 결합, 및 보체 의존성 세포 매개 세포독성을 포함한다.

바람직한 구체예에서, 친화성 또는 이펙터 기능의 변경은 야생형 Fc 영역을 포함하는 비교가능한 분자에 비하여, 적어도 2배, 바람직하게 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 변이체 Fc 영역은 야생형 Fc 영역을 포함하는 분자에 비하여, 적어도 65%, 바람직하게 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 또는 250% 이상의 친화성으로 하나 이상의 FcR과 면역특이적으로 결합한다. 이러한 측정은 생체내 또는 시험관내 분석법으로 행해질 수 있으며, 바람직한 구체예에서는 ELISA 또는 표면 플라스몬 공명 분석과 같은 시험관내 분석이 행해진다.

상이한 구체예에서, 분자는 변이체 Fc 도메인을 포함하며, 여기서 상기 변이체는 FcγR 수용체의 적어도 하나의 활성에 대해 효현작용을 하거나, 또는 FcγR 수용체의 적어도 하나의 활성에 대해 길항작용을 한다. 바람직한 구체예에서, 분자는 FcγRIIB의 하나 이상의 활성, 예를 들어 B 세포 수용체-매개 신호화, B 세포 활성화, B 세포 증식, 항체 생산, B 세포의 세포내 칼슘 유입, 세포 주기 진행, FcεRI 신호화의 FcγRIIB-매개 억제, FcγRIIB의 인산화, SHIP 모집, SHIP 인산화 및 She와의 회합, 또는 FcγRIIB 신호 전달 경로에 있는 하나 이상의 하류 분자(예를 들어, MAP 키나제, JNK, p38, 또는 Akt)의 활성에 대해 효현작용(또는 길항작용)을 하는 변이를 포함한다. 다른 구체예에서, 분자는 FcεRI의 하나 이상의 활성, 예를 들어 비만세포 활성화, 칼슘 동원, 탈과립화, 사이토카인 생산, 또는 세로토닌 방출에 대해 효현작용(또는 길항작용)을 하는 변이를 포함한다.

어떤 구체예에서, 분자는 둘 이상의 IgG 이소타입(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)로부터의 도메인 또는 잔기를 포함하는 Fc 도메인을 포함한다. 다양한 IgG 이소타입은 이들의 힌지 및/또는 Fc 도메인의 아미노산 서열의 차이로 인하여 혈청 반감기, 보체 고정, FcγR 결합 친화성 및 이펙터 기능 활성(예를 들어, ADCC, CDC 등)을 포함하는 물리적 및 기능적 특성에 차이를 나타내며, 이것은 예를 들어, Flesch and Neppert (1999) J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156; Chappel et al. (1993) J. Biol. Chem. 33:25124-25131; Chappel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:9036-9040; Briggemann et al. (1987) J. Exp. Med 166: 1351-1361에 설명된다. 이런 타입의 변이체 Fc 도메인은 단독으로, 또는 아미노산 변형과 조합하여 사용될 수 있으며, 이로써 Fc-매개 이펙터 기능 및/또는 결합 활성에 영향을 미칠 수 있다. 조합에서, 아미노산 변형과 IgG 힌지/Fc 영역은 유사한 기능성(예를 들어, FcγRIIA에 대한 증가된 친화성)을 나타낼 수 있으며, 추가로 또는 더 바람직하게는 상승작용적으로 작용함으로써 야생형 Fc 영역을 포함하는 본 발명의 분자에 비하여 본 발명의 분자에서 이펙터 기능성을 변형시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 아미노산 변형과 IgG Fc 영역은 반대의 기능성(예를 들어, 각각 FcγRIIA에 대한 증가된 친화성 및 감소된 친화성)을 나타낼 수 있으며, Fc 영역을 포함하지 않거나 동일한 이소타입의 야생형 Fc 영역을 포함하는 본 발명의 분자에 비하여 본 발명의 분자에서 특이적 기능성이 선택적으로 경감되거나 감소하도록 작용할 수 있다.

바람직한 특정 구체예에서, 분자는 변이체 Fc 영역을 포함하며, 여기서 상기 변이체 Fc 영역은 야생형 Fc 영역과 비교하여 상기 분자가 FcR에 대한 변경된 친화성을 가지도록 하는 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하며, 단 상기 변이체 Fc 영역은 Sondermann et al. (2000) Nature 406:267-273에 개시된 것들과 같은 Fc-FcR 상호작용의 결정학적 및 구조적 분석에 기초하여 FcγR과 직접 접하게 되는 위치에는 치환을 가지지 않아야 한다. FcγR과 직접 접하게 되는 Fc 영역 내의 위치의 예는 아미노산 잔기 234-239(힌지 영역), 아미노산 잔기 265-269(B/C 루프), 아미노산 잔기 297-299(CVE 루프), 및 아미노산 잔기 327-332(F/G 루프)이다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 분자는 구조적 및 결정학적 분석에 기초하여 FcγR과 직접 접하지 않는, 예를 들어 Fc-FcγR 결합 부위 내에 있지 않는 적어도 하나의 잔기의 변형을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함한다.

변이체 Fc 도메인은 본 분야에 잘 알려져 있으며, 어떤 공지된 Fc 변이체를 본 발명에서 사용함으로써, 예를 들어 NK 의존성 또는 대식세포 의존성 분석에서 기능적으로 분석되는, Fc 도메인(또는 이들의 일부분)을 포함하는 본 발명의 분자에 의해 나타나는 이펙터 기능을 부여하거나 변형할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 기능을 변경한다고 확인된 Fc 도메인 변이체가 항체조작 기술분야에 개시되며, 거기에 개시된 어떤 적합한 변이체가 본 발명의 분자에 사용될 수 있다.

어떤 구체예에서, 분자는 하나 이상의 영역에 하나 이상의 아미노산 변형을 가진 변이체 Fc 영역을 포함하며, 이 변형(들)은 억제성 FcγR(FcγRIIB 같은)에 비하여 변이체 Fc 영역 대 활성화 FcγR(FcγRIIA 또는 FcγRIIIA 같은)의 친화성 비를 변경한다(야생형 Fc 영역에 비하여):

Fc 변이체가 1보다 큰 친화성 비를 가지는 경우, 본 발명의 방법은 FcγR에 의해 매개되는 이펙터 세포 기능(예를 들어, ADCC)의 증진된 효능이 바람직한 질환, 장애 또는 감염, 예를 들어 암 또는 감염성 질환의 치료적 또는 예방적 치료, 또는 이들의 증상의 완화를 제공하는데 있어서 특정 용도를 가진다. Fc 변이체가 1보다 적은 친화성 비를 가지는 경우, 본 발명의 방법은 FcγR에 의해 매개되는 이펙터 세포 기능(예를 들어, ADCC)의 감소된 효능이 바람직한 질환, 장애 또는 감염, 예를 들어 자가면역 또는 염증성 장애의 치료적 또는 예방적 치료, 또는 이들의 증상의 완화를 제공하는데 있어서 특정 용도를 가진다. 표 2에 친화성 비가 1보다 큰지 또는 1보다 적은지에 따른 전형적인 단일, 이중, 삼중, 사중 및 오중 돌연변이를 나타낸다. 다양한 돌연변이에 대한 특이적 결합 데이터는 표 3에 나타내며, 이들 돌연변이에 관한 추가의 정보는 항체조작 기술분야에서 찾을 수 있다.

다른 구체예에서, 분자는 하나 이상의 아미노산 치환을 가진 변이체 Fc 영역을 포함하며, 이 치환은 변이체 Fc 영역의 결합을 변경시키는데(야생형 Fc 영역에 비하여), 예를 들어 활성화 FcγR(FcγRIIA 또는 FcγRIIIA 같은)과의 결합을 증진시키고 및/또는 억제성 FcγR(FcγRIIB 같은)과의 결합을 감소시킨다. 하나 이상의 아미노산 변화를 가진 다양한 Fc 돌연변이가 조작되었고, 표 4에 나타낸 대로, K_off에 대해 표면 플라스몬 공명에 의해서 분석되었다. 다양한 FcγR과의 결합에 대한 해리속도 상수가 BIAcore 분석에 의해 측정되었고, 야생형 Fc에 대한 것과 직접 비교되었으며, 비(x = WT k_off/돌연변이 k_off)는 시험된 각 FcγR과 관련하여 표 4의 우측 칼럼에 표시된다.

또한, 바람직한 변형에 관하여 항체조작 기술분야는 광범위하게 안내하고 있다. 어떤 환경에서 바람직할 수 있는 전형적인 변형이 아래 제시된다:

특정 구체예에서, 변이체 Fc 영역에서, 위치 235, 240, 241, 243, 244, 247, 262, 263, 269, 298, 328, 또는 330 중 어느 것에 어떤 아미노산 변형(예를 들어, 치환)이 존재하며, 바람직하게는 잔기 A240, 1240, L241, L243, H244, N298, I328 또는 V330 중 하나 이상이다. 상이한 특정 구체예에서, 변이체 Fc 영역에서, 위치 268, 269, 270, 272, 276, 278, 283, 285, 286, 289, 292, 293, 301, 303, 305, 307, 309, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439 중 어느 것에 어떤 아미노산 변형(예를 들어, 치환)이 존재하며, 바람직하게는 잔기 H280, Q280, Y280, G290, S290, T290, Y290, N294, K295, P296, D298, N298, P298, V298, I300 또는 L300 중 하나 이상이다.

바람직한 구체예에서, 변형된 친화성으로 FcγR와 결합하는 변이체 Fc 영역에서, 위치 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439 중 어느 것에 어떤 아미노산 변형(예를 들어, 치환)이 존재한다. 바람직하게, 변이체 Fc 영역은 잔기 A256, N268, Q272, D286, Q286, S286, A290, S290, A298, M301, A312, E320, M320, Q320, R320, E322, A326, D326, E326, N326, S326, K330, T339, A333, A334, E334, H334, L334, M334, Q334, V334, K335, Q335, A359, A360 또는 A430 중 어느 것을 가진다.

상이한 구체예에서, 감소된 친화성으로 FcγR(Fc 영역을 통해)과 결합하는 변이체 Fc 영역에서, 위치 252, 254, 265, 268, 269, 270, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 또는 439 중 어느 것에 어떤 아미노산 변형(예를 들어, 치환)이 존재한다.

상이한 구체예에서, 증진된 친화성으로 FcγR(Fc 영역을 통해)과 결합하는 변이체 Fc 영역에서, 위치 280, 283, 285, 286, 290, 294, 295, 298, 300, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398 또는 430 중 어느 것에 어떤 아미노산 변형(예를 들어, 치환)이 존재한다. 상이한 구체예에서, 증진된 친화성으로 FcγRIIA와 결합하는 변이체 Fc 영역에서, 잔기 A255, A256, A258, A267, A268, N268, A272, Q272, A276, A280, A283, A285, A286, D286, Q286, S286, A290, S290, M301, E320, M320, Q320, R320, E322, A326, D326, E326, S326, K330, A331, Q335, A337 또는 A430 중 어느 것이다.

다른 구체예에서, 본 발명은 본 분야에 공지된 어떤 Fc 변이체의 사용을 포함하며, Fc 변이체는, 예를 들어 Jefferis et al. (2002) Immunol Lett 82:57-65; Presta et al. (2002) Biochem Soc Trans 30:487-90; Idusogie et al. (2001) J. Immunol. 166:2571-75; Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Idusogie et al. (2000) J. Immunol. 164:4178-84; Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925-33; Xu et al. (2000) Cell Immunol. 200:16-26; Armour et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29:2613-24; Jefferis et al. (1996) Immunol. Lett. 54:101-04; Lund et al. (1996) J. Immunol. 157:4963-69; Hutchins et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92:11980-84; Jefferis et al. (1995) Immunol. Lett. 44:111-17; Lund et al. (1995) FASEB J. 9:115-19; Alegre et al. (1994) Transplantation 57:1537-43; Lund et al. (1992) Mol. Immunol. 29:53-59; Lund et al. (1991) J. Immunol. 147:2657-62; Duncan et al. (1988) Nature 332:563-64; U.S. 특허 No. 5,624,821; 5,885,573; 6,194,551; 7,276,586; 및 7,317,091; 및 PCT 공보 WO 00/42072 및 PCT WO 99/58572에 개시된 것들이다.

바람직한 변이체는 위치 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 271, 273, 275, 281, 284, 291, 296, 297, 298, 299, 302, 304, 305, 313, 323, 325, 326, 328, 330 또는 332 중 어느 것에 하나 이상의 변형을 포함한다.

특히 바람직한 변이체는 다음 그룹 A-AI로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 포함한다:

A. 228E, 228K, 228Y 또는 228G;

B. 230A, 230E, 230Y 또는 230G;

C. 231E, 231K, 231Y, 231P 또는 231G;

D. 232E, 232K, 232Y, 232G;

E. 233D;

F. 234I 또는 234F;

G. 235D, 235Q, 235P, 235I 또는 235V;

H. 239D, 239E, 239N 또는 239Q;

I. 240A, 240I, 240M 또는 240T;

J. 243R, 243, 243Y, 243L, 243Q, 243W, 243H 또는 243I;

K. 244H;

L. 245A;

M. 247G, 247V 또는 247L;

N. 262A, 262E, 262I, 262T, 262E 또는 262F;

O. 263A, 263I, 263M 또는 263T;

P. 264F, 264E, 264R, 264I, 264A, 264T 또는 264W;

Q. 265F, 265Y, 265H, 265I, 265L, 265T, 265V, 265N 또는 265Q;

R. 266A, 266I, 266M 또는 266T;

S. 271D, 271E, 271N, 271Q, 271K, 271R, 271S, 271T, 271H, 271A, 271V, 271L, 271I, 271F, 271M, 271Y, 271W 또는 271G;

T. 273I;

U. 275L 또는 275W;

V. 281D, 281K, 281Y 또는 281P;

W. 284E, 284N, 284T, 284L, 284Y 또는 284M;

X. 291D, 291E, 291Q, 291T, 291H, 291I 또는 291G;

Y. 299A, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 2991, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W 또는 299Y;

Z. 302I;

AA. 304D, 304N, 304T, 304H 또는 304L

AB. 305I;

AC. 313F;

AD. 323I;

AE. 325A, 325D, 325E, 325G, 325H, 325I, 325L, 325K, 325R, 325S, 325F, 325M, 325T, 325V, 325Y, 325W 또는 325P;

AF. 328D, 328Q, 328K, 328R, 328S, 328T, 328V, 328I, 328Y, 328W, 328P, 328G, 328A, 328E, 328F, 328H, 328M 또는 328N;

AG. 330L, 330Y, 330I 또는 330V;

AH. 332A, 332D, 332E, 332H, 332N, 332Q, 332T, 332K, 332R, 332S, 332V, 332L, 332F, 332M, 332W, 332P, 332G 또는 332Y; 및

AL. 336E, 336K 또는 336Y.

더욱 특히 바람직한 변이체는 하기 그룹 1-105로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 포함한다:

이펙터 기능은 항체조작 기술분야에 설명된 것들과 같은 기술에 의해서, 또는 다른 수단에 의해서 변형될 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)이 Fc 영역에 도입될 수 있고, 이로써 이 영역에서의 사슬간 이황화물 결합 형성이 허용되며, 그 결과 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개 세포 사멸 및 ADCC를 가질 수 있는 호모다이머 항체가 생성된다. Caron et al. (1992) J. Exp Med. 176:1191 -1195; 및 B. Shopes (1992) J. Immunol. 148:2918-2922를 참조한다. 또한, 증진된 항종양 활성을 갖는 호모다이머 항체는 Wolff et al. (1993) Cancer Research 53:2560-2565에 설명된 헤테로이작용성 가교제를 사용하여 제조될 수도 있다. 또는 달리, 항체는 이중 Fc 영역을 가지도록 조작될 수 있고, 이로써 증진된 보체 세포용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있다. Stevenson et al. (1989) Anti-Cancer Drug Design 3:219-230을 참조한다.

B2. 서열 변형

일반적으로 서열 변형은 자생 서열과 비교하여 아미노산 서열의 변화를 가져오는 항체 또는 폴리펩티드의 하나 이상의 잔기의 치환, 결실, 또는 부가일 수 있다. 원하는 활성에 부정적인 영향을 미치지 않고 아미노산 잔기가 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는지 결정하는데 있어서의 길잡이는 해당 항체 또는 폴리펩티드의 서열과 기지의 상동성 단백질 분자의 서열을 비교하고, 상동성이 높은 영역에서 생기는 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 찾을 수 있다. 허용되는 변동은 해당 서열의 아미노산에 삽입, 결실 또는 치환을 조직적으로 만들고, 전장 또는 성숙 자생 서열이 나타내는 활성에 대해서 얻어진 변이체를 시험함으로써 결정될 수 있다.

아미노산 치환은 하나 이상의 잔기의 보존성 또는 비-보존성 치환을 수반할 수 있다. 이러한 치환은 본 분야에 잘 알려져 있는데, 예를 들어 보존성 치환은 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 가진 다른 아미노산으로 대체하는 것을 수반하며, 예를 들어 세린에 의한 류신의 대체가 있다. 비-보존성 치환은 일반적으로 아미노산을 상이한 구조적 및/또는 화학적 특성을 가진 다른 아미노산으로 대체하는 것을 수반하며, 예를 들어 산성 아미노산(예를 들어, Glu 또는 Asp)이 염기성 아미노산(예를 들어, Lys 또는 Asn)으로 대체될 수 있다.

특히 바람직한 타입의 치환형 변이체는 모 항체(예를 들어, 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반하며, 이로써 모 항체에 비하여 생물학적 특성이 개선된 변이체 항체가 얻어질 수 있다. 이러한 치환형 변이체를 생성하는 편리한 방식은 파지디스플레이를 이용한 친화성 성숙을 수반한다. 간단히 말해서, 몇 개의 초가변 영역 부위가 돌연변이되어 각 부위에 모든 가능한 아미노 치환이 만들어지고, 이로써 항체 변이체가 파지 상에 디스플레이되고, 이어서 파지-디스플레이된 변이체가 이들의 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화성)에 대해 스크리닝된다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해서, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여 항원 결합에 상당히 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 또는 달리 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 항체와 그것의 항원 사이의 접촉점을 확인하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기들이 본원에 고안된 기술에 따른 치환의 후보이다. 일단 이러한 변이체가 생성되면, 일군의 변이체에 대해 본원에 설명된 대로 스크리닝이 행해지고, 하나 이상의 관련 분석에서 우수한 특성을 나타낸 항체가 추가의 전개를 위해 선택될 수 있다.

또한, 변형은 비천연 아미노산의 편입(예를 들어, 치환 또는 부가에 의한)을 수반할 수 있으며, 이것은 예를 들어, Wang et al. (2002) Chem. Comm. 1:1-11; Wang et al. (2001) Science 292:498-500; 및 van Hest et al. (2001) Chem. Comm. 19:1897-1904에 설명된 것들과 같은 방법에 의한다. 아미노 아실-tRNA의 생합성을 초래하는 효소에 초점을 맞추는 대안적인 전략들도 있으며, 예를 들어 Tang et al. (2001) J. Am. Chem. 123(44):11089-11090; 및 Kiick et al. (2001) FEBS Lett. 505(3):465에 설명된다.

바람직한 구체예에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개 아미노산 잔기가 변형되었다. 추가로 또는 다른 방식으로, 이러한 변형은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개의 변형된 아미노산 잔기를 넘지 않는 것을 특징으로 할 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 1개 이상 10개 이하의 잔기가 변형되었다. 추가로 또는 다른 방식으로, 이러한 변형은 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2개의 변형된 아미노산 잔기를 넘지 않는 것을 특징으로 한다. 변형은 전부 치환, 전부 결실, 전부 부가일 수도 있고, 치환, 결실 또는 부가의 어떤 조합일 수도 있다.

아미노산 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 본 분야에 공지된 여러 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들 방법은, 제한은 아니지만, 천연 공급원으로부터의 분리(자연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 올리고뉴클레오티드-매개(또는 부위-지정) 돌연변이유발, 제한 선택 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 항체의 앞서 제조된 변이체 또는 비-변이체 버전의 카세트 돌연변이유발에 의한 제조를 포함한다.

B3. 기타 변형

본 발명의 폴리펩티드 변이체(특히 항체 변이체)는, 예를 들어 어떤 타입의 분자의 공유 부착에 의해 변형된 유사체 및 유도체들을 포함하는데, 단 이러한 공유 부착은 항체가 그것의 에피토프 결합 면역특이성을 계속 보유하도록 해야 한다. 제한은 아니지만, 예를 들어, 항체의 유도체 및 유사체는, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 세포 항체 단위나 다른 단백질의 결합 등에 의해서 더 변형된 것들을 포함한다. 많은 화학적 변형들 중 어느 것이, 제한은 아니지만, 특이적 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 투니카마이신의 존재하의 대사합성 등을 포함하는 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다. 추가로, 유사체 또는 유도체는 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유할 수 있다.

항체 및 폴리펩티드는, 바람직하게는 항체의 원하는 기능성, 예를 들어 결합 활성의 변경 없이, 항체에 하나 이상의 글리코실화 부위를 도입하거나, 항체로부터 하나 이상의 글리코실화 부위를 결실시키거나, 또는 항체 상의 기존의 글리코실화 부위를 이동시킴으로써 변형될 수 있다. 글리코실화 부위는 본 분야에 공지된 방법에 의해 항체의 가변 및/또는 불변 영역에 도입되거나, 거기로부터 결실될 수 있다. 예를 들어, 항체의 아미노산 서열을 변형하거나 돌연변이시킴으로써 본 발명의 항체에 글리코실화 부위가 도입될 수 있으며, 이로써 원하는 서열(예를 들어, Asn-X-Thr/Ser)이 얻어지고, Fc 영역의 위치 296을 변형함으로써 글리코실화 부위가 이동될 수 있으며, 이로써 위치 297이 아니라 위치 296이 글리코실화된다. 단백질의 탄수화물 함유량(글리코실화)을 변형하는 방법은 본 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 U.S. 특허 No. 6,472,511 및 6,218,149; U.S. 특허 공개 No. 2003 0115614 및 20020028486; EP 0359096 B1; 및 WO 03/035835에 설명된다.

어떤 구체예에서, 본 발명의 분자는 변경된 글리코실화 패턴 또는 변경된 글리코 형태를 포함하도록 조작된다. 조작된 글리코 형태는, 제한은 아니지만, 이펙터 기능 증진을 포함하여 여러 목적에 사용될 수 있다. 조작된 글리코 형태는 당업자에게 공지된 어떤 방법에 의해서, 예를 들어 조작된 또는 변이체 발현 균주의 사용, 하나 이상의 효소, 예를 들어 N-아세틸글리코사미닐트랜스페라제 III(GnT-III)와의 공-발현, 다양한 생물체 또는 다양한 생물체 유래의 셀라인에서 본 발명의 항체의 발현, 또는 항체의 발현 및 정제 후 탄수화물(들)의 변형에 의해서 생성될 수 있다. 조작된 글리코 형태를 생성하는 방법은 본 분야에 알려져 있으며, 제한은 아니지만, 예를 들어 Okazaki et al. (2004) JMB 336:1239-1249; Shinkawa et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:3466-3473; Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Davies et al. (2001) Biotechnol. Bioeng. 74:288-294; Umana et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:176-180; U.S. 특허 No. 6,602,684; U.S. 특허 공개 No. 20030157108, 20030115614, 및 20030003097; WO 02/311140; WO 02/30954; WO 01/292246; WO 00/61739에 설명된 것들; Biowa, Inc.(프린스톤, NJ)로부터 이용가능한 Potillegent™ 기술; 및 GLYCART biotechnology AG(취리히, 스위스)로부터 이용가능한 GlycoMAb™ 글리코실화 조작 기술을 포함한다.

B4. 폴리펩티드 콘쥬게이트

본 발명의 폴리펩티드는 이종성 폴리펩티드 또는 그것의 일부분에 재조합 융합되거나 화학적으로 콘쥬게이트(공유 및 비-공유 콘쥬게이션을 모두 포함한다)되어 융합 단백질을 생성할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드(특히 항체)는 이종성 폴리펩티드의 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90 또는 적어도 100개 아미노산과 융합되어 바람직한 융합 단백질을 생성한다. 융합은 반드시 직접 이루어질 필요는 없고, 링커 서열을 통해서 발생할 수도 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 고체 지지체 또는 반고체 지지체에 부착될 수 있으며, 이것은 면역분석이나 표적 항원의 정제에 특히 유용하다. 이러한 지지체 및 매트릭스는, 제한은 아니지만, 유리, 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 아가로스 비드, 아크릴아미드 비드, 나일론, 폴리스티렌, 염화폴리비닐 또는 폴리프로필렌을 포함한다. 부착은, 예를 들어 Methods in Enzymology, 44 (1976)에 설명된 방법에 의해 달성될 수 있다.

주어진 생물학적 반응을 변형하거나, 치료제의 혈청 반감기에 영향을 미치거나(예를 들어, 증가), 또는 특정 하위군의 세포에 치료제를 표적화하기 위해서 항체 및 폴리펩티드가 치료제에 콘쥬게이트될 수 있다. 또한, 이들은 용이한 정제를 위해서 마커 서열(예를 들어, 헥사-히스티딘 펩티드 또는 "플랙" 택)에 융합될 수 있다. 이러한 치료제 부분과 항체를 콘쥬게이션하는 기술은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery(2nd ed., Robinson et al. (eds.), 1987, pp. 623-53, Marcel Dekker, Inc.)을 참조한다.

추가의 융합 단백질이 유전자-셔플링, 모티프-셔플링, 엑손-셔플링, 및/또는 코돈-셔플링의 기술을 통해서 생성될 수 있다(종합하여 "DNA 셔플링"이라고 한다). DNA 셔플링을 사용하여 본 발명의 분자의 활성을 변경할 수 있다(예를 들어, 더 높은 친화성과 더 낮은 해리속도를 가진 항체). 본 발명의 항체 및 폴리펩티드, 또는 이들의 암호화 핵산은 재조합 전에 오차-지향 PCR, 무작위 뉴클레오티드 삽입 또는 다른 방법에 의한 무작위 돌연변이유발을 행함으로써 더 변경될 수 있다. 본 발명의 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 부분은 하나 이상의 이종성 분자의 하나 이상의 성분, 모티프, 섹션, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합될 수 있다.

B5. 단편

본 발명은 추가로 항체 및 다른 폴리펩티드 단편을 제공한다. 이러한 단편은, 예를 들어 전장 자생 항체 또는 단백질과 비교하여, N-말단이나 C-말단에서 끝이 잘릴 수 있거나, 또는 내부 잔기를 결여할 수 있다. 어떤 단편은 원하는 생물학적 활성에 반드시 필요하지 않은 아미노산 잔기를 결여할 수 있다. 이들 단편은 많은 종래의 기술 중 어느 것에 의해서 제조될 수 있다. 원하는 펩티드 단편은 화학적으로 합성될 수 있다. 대안적인 접근법은 효소 분해에 의한 항체 또는 폴리펩티드 단편의 생성을 수반하며, 예를 들어 특정 아미노산 잔기에 의해 한정된 부위에서 단백질을 절단한다고 알려진 효소로 단백질을 처리하거나, 또는 적합한 제한 효소로 DNA를 분해하고 원하는 단편을 분리하는 것이 있다. 또 다른 적합한 기술은 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 원하는 항체 또는 폴리펩티드 단편을 암호화하는 DNA 단편을 분리하여 증폭시키는 것을 수반한다. DNA 단편의 원하는 말단을 한정하는 올리고뉴클레오티드가 PCR에서 5' 및 3' 프라이머에 사용된다. 바람직하게, 항체 및 폴리펩티드 단편은 본원에 개시된 자생 항체 또는 폴리펩티드와 적어도 하나의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 공유한다.

어떤 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 다이머화 도메인을 더 포함하며, 이것은 다이머화 서열 및/또는 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서, 다이머화 도메인은 항체 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인과 바이러스 코팅 단백질의 적어도 일부분 사이에 위치되며, 하나 이상의 이황화물 결합 및/또는 단일 다이머화 서열이 다이머화 도메인에 존재하여 2가 디스플레이를 제공할 수 있다. 어떤 구체예에서, F(ab)2의 중쇄는 힌지 영역을 포함하지 않는 다이머화 도메인에서 다이머화될 것이다. 다이머화 도메인은 류신 지퍼 서열을 포함할 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드 단편은 다른 폴리펩티드의 아미노산 서열의 적어도 5 연속 아미노산 잔기, 적어도 10 연속 아미노산 잔기, 적어도 15 연속 아미노산 잔기, 적어도 20 연속 아미노산 잔기, 적어도 25 연속 아미노산 잔기, 적어도 30 연속 아미노산 잔기, 적어도 40 연속 아미노산 잔기, 적어도 50 연속 아미노산 잔기, 적어도 60 연속 아미노산 잔기, 적어도 70 연속 아미노산 잔기, 적어도 80 연속 아미노산 잔기, 적어도 90 연속 아미노산 잔기, 적어도 100 연속 아미노산 잔기, 적어도 125 연속 아미노산 잔기, 적어도 150 연속 아미노산 잔기, 적어도 175 연속 아미노산 잔기, 적어도 200 연속 아미노산 잔기, 또는 적어도 250 연속 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드의 단편은 그 폴리펩티드의 적어도 하나의 기능을 보유한다.

B6. 디아바디 및 DART

또한, 디아바디 및 이중 친화성 재표적화 시약("DART")이 본 발명에 의해 제공된다. 디아바디 및 DART는 본 발명의 항체 및 폴리펩티드로부터 일반적으로 유래하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 디아바디 및 DART의 설계 및 구축은, 예를 들어 2008년 1월 4일 제출된 U.S. 가 특허출원 No. 61/019,051 및 2007년 1월 21일 제출된 No. 60/945,523; 2006년 4월 17일 제출된 U.S. 특허출원 No. 11/409,339; Marvin et al. (2005) Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658; Olafsen et al. (2004) Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448에 설명된다. 디아바디 분자의 각 폴리펩티드 사슬은 동일하거나 상이한 항체로부터의 VL 도메인과 VH 도메인을 포함하며, 이들은 공유 결합되어 도메인들이 자체 회합에 의해 속박된다. 2개의 폴리펩티드 사슬의 상호작용은 2개의 VL-VH 페어링을 만들어, 2개의 에피토프 결합 부위, 즉 2가 분자를 형성한다. VH나 VL 도메인은 폴리펩티드 사슬 내의 어떤 위치에 속박되지도 않고, 이 도메인들은 서로 관련된 위치에 제한되지도 않는다. 유일한 제한은 상보성 폴리펩티드 사슬을 이용하여 기능적 디아바디를 형성할 수 있다는 것이다. 도메인은 펩티드 링커에 의해 분리될 수 있고, 폴리펩티드 사슬은 각 사슬 상에 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하도록 조작될 수 있으며, 이로써 사슬간 이황화물 결합이 형성되어 디아바디가 안정화될 수 있다.

VL과 VH 도메인이 동일한 항체로부터 유래하는 경우, 두 상보성 폴리펩티드 사슬이 동일할 수 있고, 이 경우 2가의 단일특이적 항체가 생기고, 상이할 수도 있으며, 이 경우 2가의 이중특이적 항체(예를 들어, 동일한 항원 상의 2개의 상이한 에피토프와 결합하는 것)가 생긴다. VL과 VH 도메인이 상이한 항원에 특이적인 항체로부터 유래하는 경우, 기능적 이중특이적 디아바디의 형성은 두 상이한 폴리펩티드 사슬의 상호작용, 즉 헤테로다이머의 형성을 필요로 한다. 특정 구체예에서, 디아바디의 적어도 하나의 에피토프 결합 부위는 특정 세포, 예를 들어 B 세포 또는 T 세포, 포식작용 세포, 자연살해(NK) 세포 또는 수지상 세포 상의 항원에 대해 특이적이다.

다양한 구체예에서, 디아바디의 폴리펩티드 사슬 중 하나 이상은 Fc 도메인을 포함한다. 디아바디 분자의 폴리펩티드 사슬 내의 Fc 도메인은 우선적으로 다이머화하며, 그 결과 면역글로불린-유사 특성, 예를 들어 Fc-FcγR 상호작용을 나타내는 디아바디 분자가 형성된다. Fc를 포함하는 디아바디는 다이머일 수 있는데, 예를 들어 2개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 다이머이며, 각각이 VH 도메인, VL 도메인 및 Fc 도메인을 포함한다. 다양한 구체예에서, 디아바디의 폴리펩티드 사슬 중 하나 이상은 힌지 도메인을 포함하며, 이것은 IgA, IgD, IgG, IgE 및 IgM을 포함하는 어떤 면역글로불린 이소타입 또는 알로타입으로부터 유래될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 힌지 도메인은 IgG로부터 유래하며, 여기서 IgG 이소타입은 IgGl, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 또는 이들의 알로타입이다. 힌지 도메인은 사슬의 다른 도메인이나 부분에 대하여 어떤 위치에서 폴리펩티드 사슬 내로 조작되어 넣어질 수 있고, 어떤 환경에서는 Fc 도메인과 함께 조작되어 넣어질 수 있으며, 이로써 디아바디 분자는 힌지-Fc 도메인을 포함하게 된다.

다른 구체예에서, Fc 도메인을 포함하는 디아바디 분자는 테트라머일 수 있으며, 이것은 2개의 "더 무거운" 폴리펩티드 사슬(즉, VL, VH 및 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬), 및 2개의 "더 가벼운" 폴리펩티드 사슬(즉, VL 및 VH를 포함하는 폴리펩티드 사슬)을 포함할 수 있다. 이러한 더 가벼운 사슬과 더 무거운 사슬들이 상호작용하여 모노머를 형성하며, 이들의 언페어드 Fc 도메인을 통해 상호작용하여 Ig-유사 분자를 형성하는데, 이것이 바로 DART 분자일 수 있다. 이러한 Ig-유사 디아바디는 4가이며, 단일특이적, 이중특이적 또는 사중특이적일 수 있다. Ig-유사 DART 종은 독특한 특성을 가지는데, 그것의 도메인이 동일한 에피토프(이 경우 4개의 동일한 항원 분자와 결합할 수 있는 4가의 단일-에피토프 특이적 Ig-유사 DART가 형성된다), 또는 상이한 에피토프나 항원과 결합하도록 설계될 수 있기 때문이다. 예를 들어, 그것의 도메인은 동일한 항원의 2개의 에피토프(이 경우 4가의 단일-항원 특이적, 이중-에피토프 특이적 Ig-유사 DART가 형성된다), 또는 상이한 항원 분자들의 에피토프(이 경우 제 1 항원에 특이적인 한 쌍의 결합 부위와 제 2 항원에 특이적인 두 번째 쌍의 결합 부위를 가진 4가 Ig-유사 DART가 형성된다)와 결합하도록 설계될 수 있다. 이러한 속성의 조합을 가진 하이브리드 분자는 쉽게 생산될 수 있다.

특정 작용 기전과 결부되도록 의도하는 것은 아니지만, 본 발명의 디아바디 분자는 본 분야에 공지된 치료 항체에 비하여 증진된 치료 효능을 나타내는데, 이것은 일정 부분은, 예를 들어 디아바디-에피토프 상호작용의 개선된 항원항체 결합력으로 인해 표적 세포 상에 더 오래 머무르는 디아바디의 능력으로 인하여, 특정 항원(예를 들어, FcγR)을 감소된 수준으로 발현하는 표적 세포와도 면역특이적으로 결합하는 디아바디의 능력 때문이다. 따라서, 본 발명의 디아바디는 표적 항원이 표적 세포 집단에서 낮은 수준으로 발현되는 모집단에서 암과 같은 질환이나 장애의 치료, 예방 또는 관리에 있어서 특정한 용도를 가진다.

이들의 증가된 원자가, 낮은 해리속도 및 순환계로부터의 빠른 청소(작은 크기의 디아바디에 대해, 또는 약 50 kDa 이하에서)로 인하여, 본 분야에 공지된 디아바디 분자는 종양 영상화 분야에서도 역시 특정한 용도를 가진다고 알려져 있다(Fitzgerald et al. (1997) Protein Eng. 10:1221). 또한, 디아바디 에피토프 결합 도메인은 T 림프구, 자연살해(NK) 세포 또는 다른 단핵세포 상에서 발현되는 CD3, CD16, CD32, 또는 CD64와 같은 어떤 면역 이펙터 세포의 표면 결정소를 향해 갈 수 있다. 많은 연구에서, 이펙터 세포 결정소, 예를 들어 Fcγ 수용체(FcγR)와 결합한 디아바디도 역시 이펙터 세포를 활성화하는 것으로 판명되었다(Holliger et al. (1996) Protein Eng. 9:299-305; Holliger et al. (1999) Cancer Res. 59: 2909-2916). 일반적으로 이펙터 세포 활성화는 Fc-FcγR 상호작용을 통한 항원 결합된 항체와 이펙터 세포의 결합에 의해 촉발된다. 따라서, 이와 관련하여, 본 발명의 디아바디 분자는 이들이 Fc 도메인을 포함하는지의 여부와는 무관하게 Ig-유사 기능성을 나타낼 수 있다. 종양과 이펙터 세포가 가교 결합함으로써, 디아바디가 종양 세포의 근처로 이펙터 세포를 데려올 뿐만 아니라, 효과적인 종양 사멸을 유도한다. Cao and Lam (2003) Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-97을 참조한다.

본 발명의 디아바디 분자는 새로운 단백질 합성 및 결합 단백질을 암호화하는 핵산의 재조합 발현을 포함하여 여러 가지 방법에 의해 생산될 수 있다. 재조합 방법(예를 들어, 원하는 폴리뉴클레오티드의 먼저 제조된 변이체의 PCR 돌연변이유발), 또는 고체상 DNA 합성에 의해서 원하는 핵산 서열이 생산될 수 있다. 재조합 방법이 사용되는 것이 바람직하다. 한 양태에서, 본 발명은 CD16A VH 및/또는 VL을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 CD32B VH 및/또는 VL을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 유전자 코드의 축퇴성 때문에, 여러 개의 핵산 서열이 각 면역글로불린 아미노산 서열을 암호화하며, 본 발명은 본원에 설명된 결합 단백질을 암호화하는 모든 핵산을 포함한다.

B7. 항체의 생산

본 발명의 바람직한 구체예의 항체는 다양한 방식 중 어느 것에 의해서 생산되거나 얻어질 수 있다. 예를 들어, 이러한 항체는 혈장으로부터, 합성에 의해, 재조합에 의해 또는 트랜스젠 방식으로, 세포(예를 들어, 하이브리도마 배양물)를 통해서 얻어질 수 있다. 합성 단백질의 생산은, 예를 들어 Dawson et al. (2000) Ann. Rev Biochem. 69:923-960; Wilken et al. (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9(4):412-426; 및 Kochendoerfer et al. (1999) Curr. Opin. Chem. Biol. 3(6): 665-671에 설명되어 있다.

재조합 및 트랜스젠 항체의 생산은, 예를 들어 Wang et al. (2007) IDrugs 10(8):562-565; Hagemeyer et al. (2007) Semin. Thromb. Hemost. 33(2):185-195; Rasmussen et al. (2007) Biotechnol. Lett. 29(6):845-852; Gasser et al. (2007) Biotechnol. Lett. 29(2):201-212; Aubrey et al. (2006) J. Soc. Biol. 200(4): 345-354; Laffly et al. (2006) J. Soc. Biol. 200(4):325-343; Jefferis (2005) Biotechnol Prog. 21(1):11-16; Smith et al. (2004) J. Clin. Pathol. 57(9):912-917; Kipriyanov et al. (2004) Mol. Biotechnol. 26(1):39-60; Fischer et al. (2003) Vaccine 21(7-8):820-825; Maynard et al. (2000) Ann. Rev. Biomed. Eng. 2:339-376; Young et al. (1998) Res. Immunol. 149(6):609-610; 및 Hudson (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9(4):395-402에 설명되어 있다.

세포(예를 들어, 하이브리도마) 배양물을 통한 항체의 생산은, 예를 들어 Laffly et al. (2006), 상동; Aldington et al. (2007) J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848(1):64-78; S.S. Farid (2006) J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848(1):8-18; Birch et al. (2006) Adv. Drug Deliv. Rev. 58(5-6):671-685; Even et al. (2006) Trends Biotechnol. 24(3):105-108; Graumann et al. (2006) Biotechnol. J. 1(2):164-86; U.S. 특허 공개 No. 20070037216 및 20040197866; 및 U.S. 특허 No. 7,112,439에 설명되어 있다.

항체는 파지디스플레이 방법을 통해 생산될 수 있으며, 예를 들어 Brinkman et al (1995) J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al. (1995) J. Immunol. Methods 184:177-86; Kettleborough et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:952-58; Persic et al (1997) Gene 187:9-18; Burton et al (1994) Advances in Immunology 57:191-280; PCT 공보 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 U.S. 특허 No. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 및 5,969,108에 설명된 방법을 이용한다. 또한, 파지디스플레이 기술을 사용하여 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다. 친화성 돌연변이라고 하는 기술은 초기 항원이나 모 항원과 비교하여 항원과 더 높은 친화성으로 결합하는 항체를 확인하기 위해서 돌연변이유발 또는 CDR 워킹 및 동족 항원을 이용한 재선택을 채택한다. 예를 들어, Glaser et al. (1992) J. Immunology 149:3903; Wu et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 95:6037; Yelton et al. (1995) J. Immunology 155:1994; Schier et al. (1996) J. Mol. Bio. 263:551를 참조한다.

단클론 항체는 당업자에게 공지된 여러 방법에 의해서, 예를 들어 Kohler et al. (1975) Nature 256:495, Kozbor et al. (1983) Immunology Today 4:72, 또는 Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96에 설명된 하이브리도마 방법, 또는 U.S. 특허 No. 4,816,567에 설명된 재조합 DNA 방법에 의해서 제조될 수 있거나, 또는 단클론 항체는, 예를 들어 Clackson et al (1991) Nature 352:624-628 및 Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597에 설명된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 본 분야에 공지된 다양한 과정이 관심의 항원에 대한 다클론 항체의 생산에 사용될 수 있다. 예를 들어, 제한은 아니지만, 토끼, 양, 염소, 개, 마우스, 래트 및 기니피그를 포함하는 다양한 숙주 동물이 관심의 항원 또는 그것의 유도체를 주사하여 면역화될 수 있고, 면역학적 반응이 이루어진 후, 면역화된 동물의 혈청으로부터 항체가 확인될 수 있다.

또한, 이중특이적 항체는, 예를 들어 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공-발현을 통해 제조될 수도 있는데, 이 경우 이 두 사슬은 상이한 특이성을 가지고, 이후 Milstein et al. (1983) Nature 305:537-39, WO 93/08829, Traunecker et al. (1991) EMBO J. 10:3655-59에 설명된 대로 친화성 크로마토그래피를 사용하여 원하는 분자가 정제된다. 상이한 접근법에서, 원하는 결합 특이성을 가진 항체 가변 도메인(항체-항원 조합 부위)가 적어도 힌지, CH2 및 CH3 영역의 부분을 포함하는 면역글로불린 불변 도메인 서열, 예를 들어 중쇄 불변 도메인에 융합된다. 이들 융합체를 암호화하는 핵산이 동일한 또는 상이한 발현 벡터에 삽입될 수 있고, 적합한 숙주 생물체에서 발현된다.

전체 인간 항체(완전 인간 항체라고도 한다)는 내인성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자는 발현할 수 있지만 인간 중쇄 및 경쇄 유전자는 발현할 수 없는 트랜스젠 마우스를 사용하여 생산될 수 있다. 트랜스젠 마우스는 선택된 항원으로, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드의 전부 또는 일부로 일반적인 방식으로 면역화된다. 트랜스젠 마우스에 숨겨진 인간 면역글로불린 트랜스젠은 B 세포 분화 동안 재배열되고, 계속해서 부류 전환 및 체세포 돌연변이를 겪는다. 따라서, 이러한 기술을 사용하여 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산하는 것이 가능하다. 인간 항체의 생산을 위한 이러한 기술의 개략적인 내용이, 예를 들어 Lonberg and Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93, 및 U.S. 특허 No. 5,633,425에 설명된다. 또한, 전체 인간 항체는 Hoogenboom and Winter (1991) J. Mol. Biol. 227:381 및 Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581에 설명된 것과 같은 파지디스플레이 라이브러리를 포함하여, 본 분야에 공지된 다른 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 또한, 전체 인간 항체는, 예를 들어 Abgenix, Inc.(프레몬트, 캘리포니아) 및 Genpharm(세너제이, 캘리포니아)로부터 상업적으로 입수될 수 있다. 선택된 에피토프를 인식하는 전체 인간 항체는 "유도 선택"(guided selection)이라고 하는 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 이 접근법에서는 선택된 비-인간 단클론 항체, 예를 들어 마우스 항체를 사용하여 동일한 에피토프를 인식하는 완전 인간 항체의 선택을 유도하며, 이것은 예를 들어, Jespers et al. (1994) Biotechnology 12:899-903에 설명된다.

또한, 본 발명은 폴리펩티드 및 항체를 포함하는 본 발명의 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 본 분야에 공지된 어떤 방법에 의해, 예를 들어 재조합 DNA 기술, 부위 지정 돌연변이유발, PCR 등에 의해서 본 발명의 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 얻어지고, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 결정된다. 한 구체예에서, 본 분야에서 입수가능한 인간 라이브러리 또는 어떤 다른 라이브러리가 본 분야에 공지된 표준 기술에 의해 스크리닝될 수 있고, 이로써 본 발명의 분자를 암호화하는 핵산이 클로닝될 수 있다.

B8. 항체의 특성화

본 발명의 항체는 여러 방식으로 특성화될 수 있다. 특히, 본 발명의 항체는 항원, 예를 들어 HER2/neu와 특이적으로 결합하는 능력에 대해 분석될 수 있거나, 또는 분자가 Fc 도메인(또는 그것의 일부분)을 포함하는 경우, Fc-FcγR 상호작용, 즉 Fc 도메인(또는 그것의 일부분)과 FcγR의 특이적 결합을 나타내는 능력에 대해 분석될 수 있다. 이러한 분석은 용액 중에서(예를 들어, Houghten (1992) Bio/Techniques 13:412-421), 비드 상에서(Lam (1991) Nature 354:82-84), 칩 상에서(Fodor(1993) Nature 364:555-556), 박테리아 상에서(U.S. 특허 No. 5,223,409), 포자 상에서(U.S. 특허 No. 5,571,698; 5,403,484; 및 5,223,409), 플라스미드 상에서(Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:1865-1869) 또는 파지 상에서(Scott and Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 249:404-406; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87:6378-6382; 및 Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310) 수행될 수 있다. 다음에, 항원과 면역특이적으로 결합하는 것으로 확인된 분자가 항원에 대한 특이성 및 친화성에 대해 분석될 수 있다.

면역특이적 결합, 교차-반응성, 및 Fc-FcγR을 분석하는데 사용될 수 있는 면역분석법은, 제한은 아니지만, 웨스턴 블롯, 방사선 면역분석, ELISA(효소 결합 면역흡착 분석), "샌드위치" 면역분석, 면역침전 분석, 침강소 반응, 겔 확산 침강소 반응, 면역크로마토그래피 분석, 면역확산 분석, 응집 분석, 보체-고정 분석, 면역방사 계수측정 분석, 형광 면역분석, 및 단백질 A 면역분석 등과 같은 기술을 이용하는 경쟁 및 비-경쟁 분석 시스템을 포함한다(예를 들어, Ausubel et al, 2008, Current Protocols in Molecular Biology 참조).

전형적으로 표적 항원에 대한 결합 친화성은 표준 항체-항원 분석, 예를 들어 Biacore 경쟁 분석, 포화 분석, 또는 ELISA 또는 RIA 같은 면역분석에 의해서 측정되거나 결정된다.

바람직하게, 당업자에게 공지된 기술들 중 어느 것을 이용한 형광 활성화 세포 정렬(FACS)이 본 발명의 분자를 특성화하기 위한 면역학 또는 기능 기반 분석에 사용된다. 유동 정렬기는 본 발명의 분자에 의해 결합된, 예를 들어 옵소닌화된 다수의 개별 세포를 신속히 시험할 수 있다(예를 들어, 시간당 10-100백만 세포). 추가로, 항체 거동의 최적화에 사용되는 특정 변수들은, 제한은 아니지만, 항원 농도, 동력학적 경쟁 시간, 또는 FACS 긴축도를 포함하며, 이들 각각은 특이적 결합 특성을 나타내는 항체 분자의 선택을 위하여 변할 수 있다. 생물학적 세포를 정렬하고 시험하기 위한 유세포계수기는 본 분야에 공지되어 있다. 알려진 유세포계수기는, 예를 들어 U.S. 특허 No. 4,347,935; 5,464,581; 5,483,469; 5,602,039; 5,643,796; 및 6,211,477에 설명된다. 이외의 알려진 유세포계수기로서는 Becton Dickinson and Company에 의해 판매되는 FACS Vantage™, 및 Union Biometrica에 의해 판매되는 COPAS™ 시스템이 있다.

항원-결합 도메인 또는 Fc-FcγR 결합의 동력학적 변수를 특성화하기 위해서 표면 플라스몬 공명-기반 분석이 사용될 수 있다. 당업자에게 공지된 어떤 방법, 예를 들어 Dong et al. (2002) Review in Mol. Biotech. 82:303-323; Mullet et al. (2000) Methods 22:77-91; Rich et al. (2000) Current Opinion in Bio-technology 11:54-61; Fivash et al. (1998) Current Opinion in Biotechnology 9:97-101; 및 U.S. 특허 No. 6,373,577; 6,289,286; 5,322,798; 5,341,215; 및 6,268,125에 설명된 기술이 사용될 수 있다. 이 데이터를 사용하여 결합 곡선을 그려, 속도 상수, 예를 들어 K_on, K_off, 및 겉보기 평형 결합상수 K_n을 결정할 수 있으며, 이것은 예를 들어, Myszka (1997) Current Opinion in Biotechnology 8:50-57; O'Shannessy et al. (1996) Analytical Biochemistry 236:275-283; Morton et al. (1995) Analytical Biochemistry 227:176-185; Fisher et al. (1994) Current Opinion in Biotechnology 5:389-95; O'Shannessy (1994) Current Opinion in Biotechnology 5:65-71; 및 Chaiken et al. (1992) Analytical Biochemistry 201: 197-210에 설명된다. 바람직한 구체예에서, SPR 분석을 사용하여 결정된 동력학적 변수가 분자가 기능 분석, 예를 들어 ADCC에서 어떻게 기능할지를 예측하는 기준으로 사용될 수 있다.

Fc 도메인(또는 그것의 일부분)을 포함하고 및/또는 FcγR에 특이적인 에피토프 결합 도메인을 포함하는 분자에 의한 FcγR에 대한 결합의 특성화는 항체조작 기술분야에 설명된 방법에 따라서 수행될 수 있다. 이펙터 세포 기능에 대한 분석은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Abdul-Majid et al. (2002) Scand. J. Immunol. 55:70-81; Perussia et al. (2000) Methods Mol. Biol. 121:179-192; Lehmann et al. (2000) J. Immunol. Methods 243(1-2):229-242; Ding et al. (1998) Immunity 8:403-411; Baggiolini et al. (1998) Experientia 44(10):841-848; Brown (1994) Methods Cell Biol. 45:147-164; 및 Munn et al. (1990) J. Exp. Med. 172:231-237에 설명된다.

예를 들어, FcγR-매개 포식작용에 대한 분석은 인간 단핵구를 사용하여, Tridandapani et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:20480-20487에 이미 설명된 방법에 의해 플루오레센스화된 IgG-옵소닌화된 양 적혈구(SRBC)에 포식작용하는 THP-1 세포의 능력을 측정함으로써, 또는 Bedzyk et al. (1989) J. Biol. Chem. 264(3): 1565-1569에 설명된 항체-의존성 옵소닌 포식작용 분석(ADCP)를 사용하여 수행될 수 있다. 당업자에게 알려진 표준 방법을 사용하여 Fc 도메인(또는 그것의 일부분)을 포함하는 본 발명의 분자에 의한 C1q의 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC)의 매개를 특성화할 수 있다. 예를 들어, C1q 결합을 결정하기 위해서 C1q 결합 ELISA가 수행될 수 있고, 보체 활성화를 평가하기 위해 보체 의존성 세포독성(CDC) 분석이 수행될 수 있으며, 이것은 예를 들어, Gazzano-Santoro et al. (1996) J. Immunol. Methods 202:163에 설명된다.

다른 구체예에서, 본 발명의 분자는 당업자에게 공지된, 예를 들어 Weng et al. (2003) J. Clin. Oncol. 21:3940-3947; Perussia et al. (2000) Methods Mol. Biol. 121:179-192; Ding et al. (1998) Immunity 8:403-411에 설명된 표준 방법들 중 어느 것을 사용하여, 이펙터 세포, 예를 들어 자연살해 세포에서 FcγR-매개 ADCC 활성에 대해 분석될 수 있다. 특정한 바람직한 구체예에서, 시간 분해 형광분석이 형광-표지된 표적 세포에 대한 ADCC 활성을 측정하는데 사용되며, 이것은 예를 들어, Blomberg et al. (1996) Journal of Immunological Methods 193:199-206에 설명된다. 본 발명의 ADCC 분석에서 사용되는 표적 세포는, 제한은 아니지만, 유방암 셀라인, 예를 들어 ATCC 수탁번호 HTB-30의 SK-BR-3(Tremp et al(1976) Cancer Res. 33-41); B-림프구; 버킷 림프종에서 유래된 세포, 예를 들어 ATCC 수탁번호 CCL-86의 Raji 세포(Epstein et al. (1965) J. Natl. Cancer Inst. 34:231-240), 및 ATCC 수탁번호 CCL-213의 Daudi 세포(Klein et al. (1968) Cancer Res. 28: 1300-1310)를 포함한다. 표적 세포는 분석되는 분자의 항원 결합 부위에 의해 인식되어야 한다. 바람직하게, 본 발명의 ADCC 분석에서 사용되는 이펙터 세포는 말초혈 단핵세포(PBMC)이며, 이것은 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여, 예를 들어 Ficoll-Paque 밀도 구배 원심분리를 사용하여 정상 사람 혈액으로부터 정제되는 것이 바람직하다.

C. 치료 방법 및 제약 조성물

본 발명의 조성물(예를 들어, 항체 및 폴리펩티드)의 투여는 "예방적" 또는 "치료적" 목적을 위해 이루어질 수 있거나, 또는 진단적 목적을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 투여량이 질환의 급성 증상에 대한 치료를 제공하기에 생리학적으로 유의할 경우 "치료적" 목적을 위해 투여된다고 한다. 치료적으로 제공되는 경우, 화합물은 급성 질환의 증상이 확인된 시점에(또는 바로 직후에) 제공되는 것이 바람직하다. 화합물의 치료적 투여는 이러한 질환의 중증도를 완화하거나 또는 그것의 진행을 역전시키는 작용을 한다. 본 발명의 조성물은 투여량이 잠재적 질환이나 상태에 대한 치료를 제공하기에 생리학적으로 유의할 경우 "예방적" 목적을 위해 투여된다고 한다. 예방적으로 제공되는 경우, 화합물은 어떤 증상에 앞서 제공되는 것이 바람직하다. 화합물의 예방적 투여는 어떤 후속 진행이나 질환의 재발을 예방 또는 완화하는 작용을 한다.

치료를 제공한다는 것 또는 "치료하는"은 경감, 진정, 증상의 감소, 또는 환자가 상처, 병적상태 또는 상태에 더 잘 견딜 수 있도록 만드는 것, 퇴행 또는 퇴화 속도의 감소, 최종 퇴행 시점에서 덜 쇠약하게 만드는 것, 또는 환자의 신체적 또는 정신적 안녕의 개선과 같은 객관적 또는 주관적 변수를 포함하는, 상처, 병적상태 또는 상태의 치료 또는 완화에 있어서의 어떤 성공의 징표를 말한다. 증상의 치료 또는 완화는 신체 시험, 신경정신과 시험, 및/또는 정신적 평가의 결과를 포함하는 객관적 또는 주관적 변수들에 기초할 수 있다.

치료를 위한 바람직한 피험자는 질환 및 다른 병리학적 상태에 걸린 동물을 포함하며, 가장 바람직하게는 포유류 종, 예를 들어 인간이나 그외 다른 영장류, 및 가축, 예를 들어 개, 고양이 등을 포함한다. "환자"는 피험자, 바람직하게는 포유류(인간을 포함한다)를 말한다.

본 발명의 어떤 구체예는 장애의 예방적 및/또는 치료적 치료를 할 수 있는, 하나 이상의 치료제를 포함하는 제약 조성물, 및 하나 이상의 치료제의 치료적 유효량을 투여하는 방법에 관한 것이다. 용어 "치료제"는 장애를 예방적으로 또는 치료적으로 치료할 수 있는 치료 효과를 가진 어떤 제제를 말한다. 예시적인 치료제는 본 발명의 항체 및 폴리펩티드, 뿐만 아니라 항체 또는 폴리펩티드와 조합하여 또는 콘쥬게이션되어 투여될 수 있는 다른 치료제들도 포함한다. 바람직한 구체예에서, 치료제는 본 발명의 항체이며, 항체 단편, 디아바디, Ig-유사 DART, 또는 융합 단백질이 바람직하다.

본 발명의 분자는 FcγR에 의해 매개된 이펙터 세포 기능(예를 들어, ADCC)가 바람직한 질환, 장애 또는 감염(예를 들어, 암, 감염성 질환)의 치료 및/또는 예방에 특히 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 분자는 면역 이펙터 세포(예를 들어, NK 세포) 상의 세포 표면 항원 및 FcγR(예를 들어, FcγRIIIA)과 결합할 수 있으며, 상기 세포에 대한 이펙터 기능(예를 들어, ADCC, CDC, 포식작용, 옵소닌화 등)을 자극한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 항체 및 폴리펩티드는 암의 치료에 특히 적합하다. 표준 단클론 항체 치료법의 효능은 피험자의 FcγR 다형성에 의존한다. Carton et al. (2002) Blood 99:754-758; Weng et al. (2003) J. Clin. Oncol. 21(21):3940-3947을 참조한다. 이들 수용체는 이펙터 세포의 표면에서 발현되고 ADCC를 매개한다. 고 친화성 대립형질이 ADCC를 매개하는 이펙터 세포의 능력을 개선한다. 본 발명의 항체 및 폴리펩티드는 이펙터 세포 상의 FcγR에 대한 증진된 친화성(야생형 Fc 도메인에 비하여)을 나타내는 변이체 Fc 도메인을 포함할 수 있으며, 이로써 FcγR 다형성에 관계없는 환자를 위한 더 좋은 면역치료제를 제공한다.

진단 목적을 위해서, 항체 또는 폴리펩티드는 검출가능한 물질에 결합될 수 있으며, 이들을 사용하여, 예를 들어 질환, 장애 또는 감염의 전개 또는 진행을 모니터할 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소(예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제, 베타-갈락토시다제 등), 보결분자단(예를 들어, 아비딘/바이오틴), 형광 물질(예를 들어, 움벨리페론, 플루오레세인 또는 피코에리트린), 발광 물질(예를 들어, 루미놀), 생체발광 물질(예를 들어, 루시페라제 또는 에쿼린), 방사선 활성 물질(예를 들어, 탄소-14, 망간-54, 스트론튬-85 또는 아연-65), 포지트론 방출 금속, 및 비-방사선 활성 상자성 금속 이온을 포함한다. 검출가능한 물질은 본 발명의 분자에 직접 결합 또는 콘쥬게이트되거나, 또는 본 분야에 알려진 기술을 이용하여 중간체(예를 들어, 링커)를 통해 간접적으로 결합 또는 콘쥬게이트될 수 있다.

C1. 치료가능한 장애

본 발명의 다양한 구체예에 의해서 치료될 수 있는 예시적인 장애는, 제한은 아니지만, 증식성 장애, 세포 증식 장애, 및 암, 자가면역 질환, 염증성 장애, 및 감염성 질환을 포함한다. 다양한 구체예에서, 본 발명은 질환 항원과 결합하는 하나 이상의 분자(항체 또는 폴리펩티드)의 치료적 유효량을 피험자에게 투여하는 것을 포함하는, 피험자에서 질환 또는 장애의 치료, 예방 또는 관리를 위한 방법 및 조성을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 분자는 원발성 종양, 암세포의 전이, 및 감염성 질환의 예방, 억제, 성장 감소 또는 후퇴에 특히 유용하다. 특정 작용 기전에 결부시키려는 것은 아니지만, 본 발명의 분자는 이펙터 기능을 매개함으로써 종양 청소, 종양 감소 또는 이들의 조합을 가져온다. 다른 구체예에서, 본 발명의 디아바디는 세포 표면 항원 및/또는 수용체의 가교결합, 및 증진된 아폽토시스 또는 음성 성장 조절 신호에 의해 치료 활성을 매개한다.

FcγRIIB에 대한 감소된 친화성 및 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 증가된 친화성을 가진 항체는 FcγR 결합시 증진된 활성화 반응을 이끌 수 있으며, 이로써 암의 치료 및/또는 예방에 있어서 치료 효능을 가진다. 본원의 방법에 의해 치료할 수 있는 암의 비제한적인 예로는 급성 골수성 림프종, 부신암종, 선암종, 기저암, 방광암, 골암, 골 및 연결조직 육종, 뇌암, 유방암, 기관지암, 자궁경부암, 융모막암종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결장암, 결직장암, 자궁내막암, 식도암, 안암, 난관암, 담관암, 위장암, 신경교종, 모양세포 백혈병, 간암종, 호지킨병, 간내담관암, 관절암, 카포시육종, 신장암, 후두암, 간암, 백혈병, 폐암, 림프모구성 백혈병, 림프종, 악성 중피종, 수질아세포종, 흑색종, 중피종, 중이암, 다발성 골수종, 골수종, 점액육종, 비강암, 비인두암, 신경모세포종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 비암, 구강암, 난소암, 췌장암, 페날캔서, 복막암, 인두암, 뇌하수체암, 전립선암, 직장암, 신장암, 침샘암, 피부암, 연조직육종, 편평세포암종, 위암, 고환암, 갑상선암, 요도암, 자궁암, 질암, 소포성 암, 외음암, 및 윌슨씨 종양을 포함한다.

어떤 구체예에서, 암은 조혈성 암 또는 혈액-관련 암, 예를 들어 림프종, 백혈병, 골수종, 림프양 악성물, 비장의 암, 및 림프절의 암이다. 바람직한 구체예에서, 암은 B 세포 관련 암, 예를 들어 말기, 중기 또는 초기 림프종(B 세포 림프종을 포함하며, 예를 들어 버킷 림프종, 미만성 거대세포 림프종, 여포성 림프종, 호지킨 림프종, 맨틀세포 림프종, 변연부 림프종, 점막-관련 림프양 조직 B 세포 림프종, 비호지킨 림프종, 소림프구 림프종, 및 T 세포 림프종) 및 백혈병(만성 림프구성 백혈병을 포함하며, 예를 들어 B 세포 백혈병(CD5+ B 림프구), 만성 골수성 백혈병, 림프양 백혈병, 예를 들어 급성 림프모구성 백혈병, 골수이형성증, 골수성 백혈병, 예를 들어 급성 골수성 백혈병, 및 속발성 백혈병), 다발성 골수종, 예를 들어 혈장세포 악성물, 및 다른 조혈성 및/또는 B 세포 또는 T 세포 관련 암들이다. 다른 예시적인 암은 다핵형 백혈구, 예를 들어 호염기구, 호산구, 호중구 및 단핵구를 포함하는 다른 조혈 세포, 수지상 세포, 혈소판, 적혈구 및 자연살해 세포의 암들이다.

어떤 구체예에서, 치료될 수 있는 암은 유방암, 전립선암, 자궁암, 난소암, 결장암, 자궁내막암, 부신암종, 또는 비소세포 폐암이다. 어떤 구체예에서, 암은 유방암 또는 전립선암이다. 어떤 구체예에서, 암은 HER2/neu가 과발현되는 암이다. 특정 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드의 부재하의 암세포의 성장에 비하여 암세포의 성장을 적어도 99%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 45%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 35%, 적어도 30%, 적어도 25%, 적어도 20%, 또는 적어도 10%까지 억제 또는 감소시킨다.

FcγRIIB에 대한 증가된 친화성과 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIA에 대한 감소된 친화성을 가진 항체는 FcγR 결합시 감소된 활성화 반응을 가져올 수 있고, 이로써 염증 및 자가면역 질환의 치료 및/또는 예방에 있어서 치료 효능을 가진다. 본원의 방법에 의해서 치료될 수 있는 자가면역 장애의 예로는, 제한은 아니지만, 원형탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 에디슨 질환, 부신의 자가면역 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역 혈소판 감소증, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근병증, 셀리악 스프루-피부염, 만성피로 면역기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 척-스트라우스 증후군, 반흔성 유천포창, CREST 증후군, 한랭응집소병, 크론병, 원판상 루푸스, 본태성 복합 한랭글로불린혈증, 섬유근통-섬유조직염, 사구체신염, 그레이브스병, 길랑-바레, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반병(ITP), IgA 신경병증, 소아 관절염, 편평 태선, 홍반성 루푸스, 메니에르병, 혼합 결합조직 질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 전층 동맥염, 다발성 연골염, 다선증후군, 류마티스성 다발성 근육통, 다발성 근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담관경화증, 건선, 건선성 관절염, 레이놀드 현상, 라이터 증후군, 류마티스성 관절염, 사르코이드증, 경피증, 쇼그렌 증후군, 강직-인간 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 타카야수 대동맥염, 측두 동맥염/거대세포 동맥염, 타입 1 또는 면역-관련 당뇨병, 궤양성 대장염, 포도막염, 맥관염, 예를 들어 포진성 피부염 맥관염, 백반증, 및 베게너 육아종증을 포함한다.

본원의 방법에 의해서 치료될 수 있는 염증성 장애의 비제한적 예로는 항원-특이적, 병리학적 면역반응에 의해 야기되어 지속되는 염증 상태인 면역-매개 염증성 장애를 포함한다. 이들 장애 중에서도 다양한 타입의 알레르기성 질환, 예를 들어 천식, 건초열, 및 두드러기, 관절염, 예를 들어 골관절염 및 류마티스성 관절염, 만성 염증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 연결조직 장애, 섬유증, 이식편 거부 및 이식편대숙주병, 염증성 장질환(예를 들어, 크론병 및 궤양성 대장염), 염증성 뼈용해, 인슐린-의존성 당뇨병, 폐 섬유증, 망막염, 미분화형 관절병증, 미분화형 척추관절병증, 및 포도막염이 있다. 또한, FcγRIIB에 대한 적어도 하나의 에피토프 결합 도메인 및/또는 FcγRIIB에 대한 증진된 친화성과 FcγRIIIA에 대한 감소된 친화성을 가진 변이체 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 분자는 이식 거부를 예방하는데 사용될 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 항염증성 폴리펩티드는 이러한 폴리펩티드를 받지 않은 동물에서의 염증에 비하여 동물에서 염증을 적어도 99%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 45%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 35%, 적어도 30%, 적어도 25%, 적어도 20%, 또는 적어도 10%까지 감소시킬 것이다.

어떤 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 감염원에 독성이며, 상기 분자의 부재하의 면역반응에 비하여, 상기 감염원에 대한 면역반응을 증진시키거나, 상기 감염원에 대한 이펙터 기능을 증진시킨다. 본 발명의 분자에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 감염성 질환은, 제한은 아니지만, 박테리아, 진균, 원충 및 바이러스를 포함하는 감염원에 의해 야기된다. 비제한적인 예시적 박테리아 질환은 Bacillus antracis(탄저균), Borrelia burgdorferi(라임병), 칸디다, 클라미디아, 콜레라, 디프테리아, E. coli , Enterococcus faecials , Heliobacter pylori , Klebsiella pneumoniae, 레지오넬라, 미코박테리움, 미코플라스마, 나이세리아, 백일해, 역병, Proteus vulgaris , Pseudomonas aeruginosa , S. pneumonia, 살모넬라, 포도상구균, 연쇄구균, 및 파상풍균에 의해서 야기되는 것들을 포함한다. 비제한적인 원충 질환은 콕지디오아(kokzidioa), 라이슈마니아, 말라리아, 또는 트리파노소마에 의해 야기된 것들을 포함한다.

바이러스 질환의 비제한적인 예로는 아데노바이러스, 아르보바이러스, 코로나바이러스, 콕사키 바이러스, 시토메갈로바이러스, 에볼라, 에치노바이러스, 에코바이러스, 엔도톡신(LPS), 엔테로바이러스, 엡스테인 바 바이러스, 간염 바이러스(예를 들어, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 뮤린 간염), 헤르페스 바이러스(예를 들어, 헤르페스 심플렉스 타입 I(HSV-I), 헤르페스 심플렉스 타입 II(HSV-II), 뮤린 감마 헤르페스 바이러스), 인간 면역결핍 바이러스 타입 I(HIV-I), 인간 면역결핍바이러스 타입 II(HIV-II), 한타바이러스, 인플루엔자, 백혈병 바이러스(예를 들어, 뮤린 백혈병, 고양이 백혈병 등); 홍역 바이러스, 이하선염 바이러스, 파필로마 바이러스, 파포바 바이러스, 폴리오 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 레트로바이러스, 리노바이러스, 우역, 로타바이러스, 루벨라 바이러스, 천연두, T 세포 림프종 바이러스 1, 우두, 바리셀라, 및 메닝기티스, 엔세팔리티스, 또는 뎅기 바이러스와 같은 바이러스 질환원에 의해서 야기되는 것들을 포함한다.

C2. 조제물

제약 조성물은 제약학적으로 유용한 조성물을 제조하는 공지된 방법에 따라서 조제될 수 있으며, 제약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. 조성물은 어떤 적합한 형태일 수 있으며, 몇 개의 비제한적 대용물을 들자면, 예를 들어 정제, 알약, 분말, 로젠지, 사셰, 엘리시르, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸(고체로서, 또는 액체 매질 중에), 활성 화합물을, 예를 들어 10중량%까지 함유하는 연고, 연질 및 경질 젤라틴 캡슐, 좌약, 멸균 주사용액, 및 멸균 포장된 분말이 있다. 이러한 조성물은 어떤 공지된 방법에 의해서, 예를 들어 멸균 조건에서 활성 성분과 담체(들) 또는 부형제(들)을 혼합함으로써 제조될 수 있다.

또한, 활성 성분은 본 분야에 공지된 과정을 사용하여 환자에게 투여된 후 활성 성분이 신속, 지속 또는 지연 방출되도록 조제될 수 있다. 본 발명의 조성물의 물리화학적 특성은 투여 방식 및 치료될 특정 질환이나 장애에 따라 본 분야의 기술에 의해서 변형되거나 최적화될 수 있다. 조성물은 단위 제형, 밀봉 용기, 또는 사용 설명서를 포함할 수 있는 키트의 부분으로서, 및/또는 복수의 단위 제형으로 제공될 수 있다.

특정 구체예에서, 치료제는, 예를 들어 리포솜 내 캡슐화, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 항체 또는 융합 단백질을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개 세포내이입(예를 들어, Wu and Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432 참조), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 부분으로서 핵산의 구성 등에 의해 조성물에 혼입될 수 있다. 다른 특정 구체예에서, 치료제는 밀폐 밀봉된 용기 안에 건조 멸균 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 공급되며, 예를 들어 물이나 식염수를 사용하여 환자에게 투여하기 적합한 농도로 복원될 수 있다.

바람직하게, 치료제는 적어도 5 mg, 더 바람직하게 적어도 10 mg, 적어도 15 mg, 적어도 25 mg, 적어도 35 mg, 적어도 45 mg, 적어도 50 mg, 또는 적어도 75 mg의 단위 용량으로 밀폐 밀봉된 용기 안에 건조 멸균 동결건조 분말로서 공급된다. 동결건조 분말은 그것의 원래 용기 안에 들은 채로 2 내지 8℃에서 보관되어야 하며, 분자는 복원 후 12시간 이내, 바람직하게는 6시간 이내, 5시간 이내, 3시간 이내, 또는 1시간 이내에 비경구 투여되어야 한다. 다른 구체예에서, 치료제는 치료제의 양 및 농도를 표시한 밀폐 밀봉된 용기 안에 액체 형태로 공급된다. 바람직하게, 액체 형태에서는 적어도 1 mg/ml, 더 바람직하게 적어도 2.5 mg/ml, 적어도 5 mg/ml, 적어도 8 mg/ml, 적어도 10 mg/ml, 적어도 15 mg/kg, 적어도 25 mg/ml, 적어도 50 mg/ml, 적어도 100 mg/ml, 적어도 150 mg/ml, 적어도 200 mg/ml의 분자가 밀폐 밀봉된 용기 안에 공급된다.

C3. 키트

또한, 조성물은 키트에 포함될 수 있다. 비제한적인 양태로서, 키트는 치료제를 포함하는 제약 조성물, 투여 설명서 및/또는 다른 성분들을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 키트는 바로 투여할 수 있는 조성물을 포함할 수 있다. 키트의 용기는 보틀, 디스펜서, 패키지, 컴파트먼트, 또는 그외 다른 타입의 용기를 포함할 수 있으며, 그 안에 성분이 담길 수 있다. 용기 표면에는 표시가 있을 수 있다. 이 표시는, 예를 들어 단어, 문구, 약자, 그림, 또는 기호일 수 있다. 용기는 성분(예를 들어, 본 발명의 조성물)의 정해진 양을 분배할 수 있다. 조성물은 스프레이, 에어로졸, 또는 액체 형태나 반고체 형태로 분배될 수 있다. 용기는 스프레이, 펌프, 또는 스퀴즈 메커니즘을 가질 수 있다. 어떤 양태에서, 키트는 본 발명의 조성물을 투여하기 위한 주사기를 포함할 수 있다.

하나 이상의 성분이 키트에 존재하는 경우(이들은 함께 패키지될 수 있다), 키트는 또한 일반적으로 제 2, 제 3 또는 다른 추가의 용기를 함유할 것이며, 여기에 추가의 성분들이 따로따로 담길 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 상업 판매에만 엄격히 한정하여 성분들을 수용하는 용기를 포함할 수도 있다. 이러한 용기는 사출 또는 취입-성형 플라스틱 용기를 포함할 수 있으며, 여기에 원하는 보틀, 디스펜서, 또는 패키지가 보유된다. 또한, 키트는 키트 성분을 사용하는 것에 관한 것뿐만 아니라, 키트에 포함되지 않은 어떤 다른 조성물, 화합물, 제제, 활성 성분, 또는 물체의 사용에 관한 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 실시될 수 있는 변형들을 포함할 수 있다. 설명서는, 예를 들어 제품 또는 조성물의 적용, 사용, 및 유지 방법에 관한 설명을 포함할 수 있다.

C4. 투여 및 용량

본 발명의 조성물을 위해 다양한 투여 경로가 이용될 수 있다. 특정 방식의 선택은 물론 선택된 특정 치료제, 투여가 질환의 예방, 진단 또는 치료 목적인지의 여부, 치료될 의학적 장애의 중증도 및 치료 효능에 필요한 용량에 따른다. 본 발명의 방법은 의료적으로 승인되는 어떤 투여 방식을 사용해서도 실시될 수 있으며, 임상적으로 허용되지 않는 부작용을 일으키지 않고 활성 화합물의 유효 수준을 달성한다. 이러한 투여 방식은, 제한은 아니지만, 경구, 협측, 설하, 흡입, 점막, 직장, 비내, 국소, 안구, 안구주위, 안내, 경피, 피하, 동맥내, 정맥내, 근육내, 비경구, 또는 주입에 의한 방법을 포함한다. 특정 구체예에서, 치료가 필요한 영역에만 국소적으로 본 발명의 제약 조성물을 투여하는 것이 바람직할 수 있고, 이것은, 제한은 아니지만, 예를 들어 국소 주입, 주사, 또는 삽입물에 의해서 달성될 수 있으며, 상기 삽입물은 시알라스틱 멤브레인 같은 멤브레인이나 섬유를 포함하는, 다공성, 비-다공성, 또는 젤라틴성 재료로 이루어진다.

본원에 사용된 용어 "치료적 유효량"은 환자에의 의미 있는 유익함, 즉 만성 상태의 치유 또는 완화, 증상의 감소, 이러한 상태의 치유 속도의 증가, 또는 치료된 조직이나 주변 조직에서 물질 수준의 검출가능한 변화를 나타내기에 충분한 제약학적 조성물 또는 방법에서의 각 활성 성분의 총량을 의미한다. 단독 투여된 개별 활성 성분에 적용되었을 때, 이 용어는 그 성분만을 말한다. 조합에 적용되었을 때, 이 용어는 조합 투여든 순차 투여든 또는 동시 투여든 치료 효과를 가져오는 활성 성분의 조합된 양을 말한다.

치료 및 예방 용도에 효과적인 용량 일정과 양, 즉 "투약 섭생"은 질환 또는 상태의 단계, 질환 또는 상태의 중증도, 환자의 일반적인 건강 상태, 환자의 신체 상태, 나이 등을 포함하는 다양한 요인들에 따를 것이다. 조성물의 치료 효능 및 독성은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 제약학, 약리학 및 독물학 과정에 의해서 결정될 수 있다. 예를 들어, ED₅₀(모집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)과 LD₅₀(모집단의 50%에서 치사적인 용량)를 결정하는 많은 방법이 존재한다. 치료 효과와 독성 효과 사이의 용량비가 치료 지수이며, ED_5O/LD₅₀ 비로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 조성물이 바람직하다. 세포 배양물 분석이나 동물 연구에서 얻어진 데이터가 인체에 대한 용량 범위를 공식화하는데 사용될 수 있다. 용량은 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED₅₀을 포함하는 농도 범위 내인 것이 바람직하며, 사용된 제형, 환자의 민감도, 및 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 변할 수 있다.

또한, 용량 섭생은 본 분야에 잘 알려진 약동학적 변수들, 즉 흡수율, 생체이용률, 대사작용, 청소율 등을 고려하여 정해진다(예를 들어, Hidalgo-Aragones (1996) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 58:611-617; Groning (1996) Pharmazie 51:337-341; Fotherby (1996) Contraception 54:59-69; Johnson (1995) J. Pharm. Sci. 84:1144-1146; Rohatagi (1995) Pharmazie 50:610-613; Brophy (1983) Eur. J. Clin. Pharmacol. 24:103-108; 최신판 Remington, 상동). 최신 기술에 의해 임상의는 각 개별 환자, 치료제 및 치료될 질환이나 상태에 맞는 용량 섭생을 결정할 수 있다. 본 발명의 조성물은 환자에게 필요하며 환자가 견딜 수 있는 용량 및 빈도에 따라 1회 또는 여러 번 투여될 수 있다. 예방 및 치료를 위한 치료기간은 치료될 특정 질환 또는 상태에 따라 변할 것이다. 일부 질환은 급성 치료에 알맞은 반면, 다른 것들은 장기 치료를 요한다. 만일 투여가 매일 이루어지는 것이 아니라며, 예를 들어 주사가 며칠마다, 몇 주마다 또는 몇 개월마다 주어진다면, 더 많은 치료제가 각 투여에 포함됨으로써 매일 방출되는 제제가 치료 요구를 충분히 충족하도록 할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 치료제는 장기간의 휴지기가 없는 연속 주입 또는 잦은 투여에 의해서 규칙적인 투약 섭생으로 투여된다. 이러한 규칙적인 투여는 휴지기 없이 일정한 간격으로 투약하는 것을 수반할 수 있다. 전형적으로 치료제, 특히 세포독성제는 더 낮은 용량으로 사용된다. 이러한 투약 섭생은 장기간 동안 비교적 낮은 용량을 만성적으로 매일 투여하는 것을 포함하는데, 이것은 독성 부작용을 최소화하고 휴식기를 없앨 수 있다. Kamat et al. (2007) Cancer Research 67:281-88을 참조한다. 어떤 구체예에서, 치료제는 약 24시간 내지 약 2일에서부터 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월에 이르는 범위에서 만성 저-용량 또는 연속 주입에 의해서 송달된다. 이러한 용량 섭생의 일정은 암전문의에 의해 최적화될 수 있다.

본 발명에 의해 포함되는 항체에 대해, 환자에게 투여되는 용량은 전형적으로 환자의 체중 kg을 기준으로 0.0001 mg/kg 내지 100 mg/kg이다. 바람직하게, 환자에게 투여되는 용량은 환자의 체중 kg을 기준으로 0.0001 mg/kg 내지 20 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 10 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 5 mg/kg, 0.0001 내지 2 mg/kg, 0.0001 내지 1 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 0.75 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 0.5 mg/ kg, 0.0001 mg/kg 내지 0.25 mg/kg, 0.0001 내지 0.15 mg/kg, 0.0001 내지 0.10 mg/ kg, 0.001 내지 0.5 mg/kg, 0.01 내지 0.25 mg/kg 또는 0.01 내지 0.10 mg/kg이다. 투여 용량 및 빈도는, 예를 들어 리피데이션(lipidation) 등의 변형에 의해 항체의 흡수 및 조직 침투를 증진시킴으로써 감소되거나 변경될 수 있다. 한 구체예에서, 환자에게 투여되는 항체의 용량은 단일 제제 요법으로서 사용되었을 경우 0.01 mg 내지 1000 mg/일이다. 다른 구체예에서, 항체는 다른 치료 조성물과 조합하여 사용되며, 환자에게 투여되는 용량은 상기 분자가 단일 제제 요법으로서 사용되는 경우보다 더 낮다. 바람직한 예에서, 피험자는 1 내지 10주, 바람직하게는 2 내지 8주, 더 바람직하게는 약 3 내지 7주, 더욱더 바람직하게는 약 4, 5 또는 6주 동안 주 1회씩 약 0.1 내지 30 mg/kg 체중의 범위에서 항체로 치료된다.

C5. 조합 치료

또한, 본 발명은, 제한은 아니지만, 현재 표준 및 실험적인 화학요법, 호르몬요법, 생물학적 요법, 면역요법, 방사선요법 또는 수술을 포함하여 암, 자가면역 질환, 염증 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방을 위한 당업자에게 알려진 다른 치료제와 조합하여 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 암, 자가면역 질환, 감염성 질환 또는 중독의 치료 및/또는 예방을 위한 당업자에게 알려진 하나 이상의 치료제의 치료적 또는 예방적 유효량과 조합하여 투여될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "조합"은 하나 이상의 치료제의 사용을 말한다. 용어 "조합"의 사용은 치료제가 장애를 가진 피험자에게 투여되는 순서에 제한이 있다거나, 치료제들의 정확히 동시에 투여된다는 의미는 아니고, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드와 다른 제제가 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드가 다른 제제와 함께 작용하여 이들이 다른 방식으로 투여되었을 때보다 증가된 이점을 제공할 수 있도록 하는 순서 및 시간 간격으로 포유류에게 투여된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 각 치료제(예를 들어, 화학요법, 방사선요법, 호르몬요법 또는 생물학적 요법)는 동시에 또는 어떤 순서로 상이한 시점에 순차적으로 투여될 수 있고, 동시에 투여되지 않는다면, 이들은 원하는 치료 또는 예방 효과를 제공할 수 있도록 충분히 가까운 시간 내에 투여되어야 한다. 각 치료제는 어떤 적합한 형태 및 어떤 적합한 경로에 의해, 예를 들어 개별적으로 투여될 수 있으며, 예를 들어 하나는 경구 투여로, 하나는 비경구 투여로 투여될 수 있다.

다양한 구체예에서, 제 1 치료제는 질환을 가진 피험자에게 제 2(또는 후속) 치료제 투여 전에(예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 전에), 동시에, 또는 이어서(예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 후에) 투여될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 둘 이상의 치료제는 동일한 환자 내원시, 12시간 간격을 넘지 않고, 24시간 간격을 넘지 않고 또는 48시간 간격을 넘지 않고 투여된다.

어떤 구체예에서, 치료제는 피험자에게 주기적으로 투여된다. 주기 요법은 일정 시간 기간 동안 제 1 치료제를 투여하고, 이어서 제 2 치료제 및/또는 제 3 치료제를 투여하며, 이런 순차 투여를 반복하는 것을 수반한다. 주기 요법은 치료요법 중 하나 이상에 대한 내성의 발생을 감소시키고, 치료요법 중 하나의 부작용을 피하거나 감소시키고, 및/또는 치료 효능을 개선할 수 있다. 예시적인 주기는 약 1주마다 1회, 약 10일마다 1회, 약 2주마다 1회, 및 약 3주마다 1회이다. 각 주기는 적어도 1주의 휴식, 적어도 2주의 휴식, 적어도 3주의 휴식을 포함할 수 있다. 투여 주기의 수는 약 1 내지 약 12 주기, 더 전형적으로 약 2 내지 약 10 주기, 더 전형적으로 약 2 내지 약 8 주기이다.

세포 증식성 장애의 치료에 관한 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 또 다른 치료제, 제한은 아니지만, 예를 들어 알킬화제(예를 들어, 메클로레타민 또는 시스플라틴), 혈관형성 억제제, 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신/다우노마이신 또는 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신, 블레오마이신 또는 안트라마이신), 항체(예를 들어, 베바시주맙(Genentech, Inc에서 AVASTIN®로 판매중) 등의 항-VEGF 항체, 파니투무맙(Amgen, Inc에서 VECTIBIX™로 판매중) 등의 항-EGFR 항체, 또는 나탈리주맙(Biogen Idee and Elan Pharmaceuticals, Inc.에서 TYSABRI®로 판매중) 등의 항-인테그린 항체), 항대사물질(예를 들어, 메토트렉세이트 또는 5-플루오로우라실), 항유사분열제(예를 들어, 빈크리스틴 또는 파클리탁셀), 세포독소(예를 들어, 세포증식억제제 또는 살세포제), 호르몬 치료제(예를 들어, 선택적 에스트로겐 수용체 조정제(예를 들어, 타목시펜 또는 랄록시펜), 아로마타제 억제제, 황체형성 호르몬-방출 호르몬 유사체, 프로게스테론제, 아드레노코르티모스테로이드, 에스트로겐, 안드로겐, 항-에스트로겐제, 안드로겐 수용체 차단제, 5-알파 환원효소 억제제, 부신 생성 억제제 등), 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제, 방사선활성 요소(예를 들어, 알파-에미터, 감마-에미터 등), 또는 어떤 다른 화학치료제와 콘쥬게이션되거나, 조합해서 투여된다.

적합한 혈관형성 억제제의 비제한적인 예로는 ABT-627; 안지오스타틴(플라스미노겐 단편); 안지오자임: 항혈관형성성 안티트롬빈 III; Bay 12-9566; 베네핀; 베바시주맙; BMS-275291; 비스포스포네이트; 연골-유래 억제제(CDI); CAI; CD59 보체 단편; CEP-7055; Col 3; 콤브레타스타틴 A-4; 엔도스타틴(콜라겐 XVIII 단편); 파네실 트랜스페라제 억제제(FTI); 피브로넥틴 단편; gro-베타; 할로푸지논; 헤파리나제; 헤파린 육당체 단편; HMV833; 인간 융모성 고나도트로핀(hCG); IM-862; 인터페론 알파/베타/감마; 인터페론 유도성 단백질(IP-10); 인터류킨-12; 크링글 5(플라스미노겐 단편); 마리마스타트; 메탈로프로테이나제 억제제(TIMP); 2-메톡시에스트라디올; MMI 270(CGS 27023A); MoAb IMC-IC11; 네오바스타트; NM-3; 판젬; PI-88; 태반 리보뉴클레아제 억제제; 플라스미노겐 활성인자 억제제; 혈소판 인자-4(PF4); 프리노마스타트; 프롤락틴 16kDa 단편; 프롤리페린-관련 단백질(PRP); PTK 787/ZK 222594; 레티노이드; 솔리마스타트; 스쿠알라민; SS3304; SU5416; SU6668; SU11248; 테트라히드로코르티솔-S; 테트라티오몰리브데이트; 탈리도미드; 트롬보스폰딘-1(TSP-1); TNP-470; 형질전환 성장인자-베타(TGF-b); 바스쿨로스타틴; 바소스타틴(칼레티쿨린 단편); ZD6126; 및 ZD6474를 포함한다.

세포 증식성 장애의 치료를 위한 추가 항체의 비제한적인 예로는 17-1A, αvβ3, AFP, CD3, CD18, CD20, CD22, CD33, CD44, CD52, CEA, CTLA-4, DNA-관련 단백질, EGF 수용체, Ep-CAM, GD2-강글리오시드, gp IIIb/IIIa, gp72, HER2, HLA-DR 10 베타, HLA-DR 항원, IgE, 강글리오시드 GD3, MUC-1, nuC242, PEM 항원, SK-1 항원, 종양 항원 CA125, 종양 항원 MUC1, VEGF, 및 VEGF-수용체에 대한 항체들을 포함한다.

상이한 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 염증성 장애의 치료를 위한 치료제 또는 치료제들, 제한은 아니지만, 예를 들어 항체, 항콜린성제, 베타-아고니스트, 메틸크산틴, 비스테로이드성 항염제(NSAIDs)(예를 들어, 아스피린, 이부프로펜, 셀레콕시브 또는 디클로페낙), 및 스테로이드성 항염제(예를 들어, 글루코코르티코이드, 덱사메타손, 코르티손, 프레드니손 또는 에이코사노이드)와 조합하여 투여될 수 있다. 추가 항체는 염증성 장애의 치료를 위한 어떤 적합한 항체, 제한은 아니지만, 예를 들어 알파4베타7, 베타2-인테그린, CBL, CD2, CD3, CD4, CD11a, CD11/18, CD14, CD18, CD23, CD25, CD40L, CD64 (FcR), CD80, CD147, 보체(C5), E-셀렉틴, Fact VII, gpIIbIIIa, ICAM-3, IgE, IL-4, IL-5, IL-8, TNF-알파, 및 VLA-4에 대한 항체들일 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 자가면역 장애의 치료를 위한 치료제 또는 치료제들, 제한은 아니지만, 예를 들어 항체, 브레퀴나르, 시클로포스파미드, 시클로스포린 A, 사이토카인 수용체 조정제, 데옥시스페구알린, 레플루노미드, 마크롤리드 항생제, 말로노니트릴로아미드(예를 들어, 레플루나미드), 메토트렉세이트, 메틸프레드니솔론, 미조리빈, 미코페놀레이트 모페틸, 라파마이신(시롤리무스), 스테로이드, 및 T 세포 수용체 조정제와 조합하여 투여될 수 있다. 추가 항체는 자가면역 장애의 치료를 위한 어떤 적합한 항체일 수 있으며, 비제한적인 예로는 a4b7 인테그린 수용체, CBL 항원, CD2, CD4, CD23, CD40, CD80, FcRI, 감마 인테그린, IL-8, 이노신 모노포스페이트 탈수소효소, ICE 인터류킨-1 베타, P38MAP 키나제, 및 TNF에 대한 항체들을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 감염성 질환의 치료를 위한 치료제 또는 치료제들, 제한은 아니지만, 예를 들어 항생제, 항진균제 또는 항바이러스제와 조합하여 투여될 수 있다. 본 발명의 분자와 조합하여 사용될 수 있는 항생제는, 제한은 아니지만, 2,4-디아미노피리미딘류(예를 들어, 브로디모프림), 아미노글리코시드류(예를 들어, 아프라마이신, 네오마이신 또는 스펙티노마이신), 암페니콜류(예를 들어, 클로람페니콜), 암포마이신류, 안사마이신류(예를 들어, 리파미드 및 리팜핀), 바시트라신류, 카르바세펨류(예를 들어, 로라카르베프), 카르바페넴류(예를 들어, 비아페넴 및 이미페넴), 세팔로스포린류(예를 들어, 세팔렉신 또는 세파드록실), 세파마이신류(예를 들어, 세프부페라존, 세프메타졸 및 세프미녹스), 클라리트로마이신류, 에리트로마이신류, 린코사미드류(예를 들어, 클린다마이신 및 린코마이신), 마크롤리드류(예를 들어, 토브라마이신), 모노박탐류(예를 들어, 카루모남), 니트로푸란류(예를 들어, 푸랄타돈 및 푸라졸리움 클로라이드), 옥사세펨류(예를 들어, 플로목세프 및 목살락탐), 페니실린류, 퀴놀론류(예를 들어, 오플록사신 또는 시프로플록사산), 술폰아미드류(예를 들어, 벤질술파미드 및 술파시틴), 술폰류(예를 들어, 디아티모술폰, 글루코술폰 나트륨 및 솔라술폰), 및 테트라사이클린류(예를 들어, 아피사이클린 및 클로르테트라사이클린)을 포함한다.

본 발명의 분자와 조합하여 사용될 수 있는 항진균제는, 제한은 아니지만, 암포테리신 B, 부토코나졸, 시클로피록스, 클로트리마졸, 에코나졸, 플루코나졸, 플루시토신, 그리세오풀딘, 할로프로그린, 인트라테칼, 이트라코나졸, 케토코나졸, 미코나졸, 나프티프메, 니스타틴, 테르비나프메, 테르코나졸, 티오코나졸, 및 운데실레네이트를 포함한다. 본 발명의 분자와 조합하여 사용될 수 있는 유용한 항바이러스제는, 제한은 아니지만, 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제, 뉴클레오시드 유사체, 뉴클레오시드 역전사효소 억제제, 및 프로테아제 억제제를 포함한다. 이러한 제제들의 비제한적인 예로는 아시클로비르, 아데포비르, 알파 인터페론, 아만타딘, 암프레나비르, 클레바딘, 엔테카비르, 포스카르네트, 강시클로비르, 인독수리딘, 인디나비르, 로피나비르, 플레코나릴, 리바비린, 리만타딘, 리토나비르, 사퀴나비르, 트리플루리딘, 비다라빈, 및 지도부딘이 있다.

C6. 치료 효용의 증명

바람직하게, 본 발명의 제약 조성물, 예방 또는 치료제는 인체에서 사용하기 전에 바람직한 치료 활성에 대해서 시험관 내에서, 세포 배양물 시스템에서, 및 설치류 동물 모델 시스템 같은 동물 모델 생물체에서 시험된다. 예를 들어, 특정 제약 조성물의 투여가 바람직한지의 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있는 분석법은 세포 배양물 분석인데, 여기서는 환자 조직 샘플이 배양물에서 성장되고, 본 발명의 제약 조성물에 노출되거나 접촉된 다음, 조직 샘플에 대한 이러한 조성물의 효과가 관찰된다. 조직 샘플은 환자로부터 생검에 의해 얻어질 수 있다. 이 시험에 의해서 각 개별 환자에 대한 치료적으로 가장 효과적인 예방 또는 치료 분자(들)가 확인될 수 있다. 다양한 특정 구체예에서, 시험관내 분석은 자가면역 또는 염증성 장애에 연루되는 세포 타입(예를 들어, T 세포)을 대표하는 세포를 가지고 수행될 수 있으며, 본 발명의 제약 조성물이 이러한 세포 타입에 대해 바람직한 효과를 가지는지가 결정된다.

적합한 동물 모델 시스템은, 제한은 아니지만, 래트, 마우스, 닭, 소, 원숭이, 돼지, 개, 토끼 등을 포함한다. 본 분야에 알려진 어떤 동물 시스템이라도 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, 예방 및/또는 치료제의 조합이 마우스 모델 시스템에서 시험된다. 본 발명의 방법에서 사용되는 바람직한 동물 모델은, 예를 들어 마우스 이펙터 세포 상에서 인간 FcγR을 발현하는 트랜스젠 마우스이며, 예를 들어 U.S. 5,877,396에 설명된 어떤 마우스 모델이 본 발명에서 사용될 수 있다.

항염증성 활성은 본 분야에 알려진 염증성 관절염의 다양한 실험 및 자발적 동물 모델을 사용하여 결정될 수 있으며, 이것은 Crofford L.J. and Wilder R.L., "Arthritis and Autoimmunity in Animals", in Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, McCarty et al.(eds.), Chapter 30 (Lee 및 Febiger, 1993)에 설명된다. 예를 들어, 애쥬번트-유발 관절염 모델, 예를 들어 래트, 햄스터, 토끼, 개 및 돼지의 카라게난-, 지모산-, 또는 콜라겐-유발 관절염이 항염증성 활성을 연구하는데 유용하고, 래트에서 카라게난-유발 발 부종의 억제가 대부분의 NSAID의 항염증성 활성에 대한 일차적인 생체내 스크린이며, 인체 효능의 전조로서 고려된다. 이들 모델은, 예를 들어 Winter et al. (1962) Proc. Soc. Exp. Biol Med. 111:544-47; 및 Hansra et al. (2000) Inflammation 24(2):141-55에 설명된다. 또한, 염증성 장질환에 대한 동물 모델을 사용하여 본 발명의 치료 효능을 평가할 수 있는데, 예를 들어 Strober (1985) Dig. Dis. Sci. 30(12 Suppl):3S-10S; Kim et al. (1992) Scand. J. Gastroentrol. 27:529-37에 설명된 모델이 있다. 이들 모델에서는 궤양성 대장염 및 크론병이 술페이트화 다당류, 덱스트란 술페이트 또는 화학적 자극제의 경구 투여에 의해 동물에게서 유발될 수 있다.

자가면역 장애의 치료 효능은 타입 1 당뇨병, 갑상선 자가면역, 전신 홍반성 루프스, 및 사구체신염과 같은 자가면역 장애에 관한 동물 모델을 사용하여 평가될 수 있으며, 예를 들어 Flanders et al. (1999) Autoimmunity 29:235-46; Krogh et al. (1999) Biochimie 81:511-15; Foster (1999) Semin. Nephrol. 19:12-24, 등에 설명된 모델이 있다.

또한, 치료제의 항암 활성이 인간 이종이식편을 가진 SCID 마우스 모델, 트랜스젠 마우스 또는 누드 마우스와 같은 암 연구를 위한 다양한 실험 동물 모델, 및 본 분야에 알려진 햄스터, 토끼 등과 같은 다른 동물 모델을 사용하여 결정될 수 있으며, 이것은 Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development (1999, eds. Fiebig and Burger); Contributions to Oncology (1999, Karger); The Nude Mouse in Oncology Research (1991 eds. Boven and Winograd); 및 Anticancer Drug Development Guide (1997 ed. Teicher)에 설명된다. 바람직한 동물 모델은 마우스 이종이식편 모델이다. 이종이식 종양의 기원으로 사용될 수 있는 종양 셀라인은, 제한은 아니지만, SKBR3 및 MCF7 세포를 포함하며, 이들은 유방 선암종 환자로부터 유래할 수 있다. 이들 세포는 erbB2와 프로락틴 수용체를 모두 가진다. SKBR3 세포가 ADCC 및 이종이식 종양 모델로서 본 분야에서 일반적으로 사용된다. 또는, 인간 난소 선암종으로부터 유래된 OVCAR3 세포가 이종이식 종양의 기원으로서 사용될 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 치료제는 인체에 사용하기 전에 바람직한 치료 또는 예방 활성에 대하여 시험관내 시험된 다음, 생체내 시험된다. 치료제 및 치료 방법은 종양 또는 악성물 셀라인의 세포를 사용하여 스크리닝될 수 있다. 본 분야의 많은 분석 표준을 사용하여 이러한 생존 및/또는 성장을 평가할 수 있다. 예를 들어, 세포 증식은 H-티미틴 혼입의 측정에 의해, 직접 세포 계수에 의해, 프로토-암유전자(예를 들어,fos, myc) 같은 기지 유전자나 세포 주기 마커의 전사 활성 변화의 검출에 의해 평가될 수 있다. 세포 생육성은 트리판 블루 염색에 의해 평가될 수 있고, 분화는 형태 변화, 연질 아가에서의 성장 및/또는 콜로니 형성 감소 또는 3차원 기저막 또는 세포외 매트릭스 제제에서의 관형 망구조 형성 등에 기초하여 육안 평가될 수 있다.

세포 배양물 분석과 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 인체에서 사용하기 위한 치료제의 용량 범위를 공식화하는데 사용될 수 있다. 바람직하게, 이러한 치료제의 용량은 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED₅₀을 포함하는 혈중 농도 범위 내이다. 용량은 사용된 제형 및 이용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 변할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 어떤 치료제에 대해서도 치료적 유효량이 세포 배양 분석에 기초하여 추정될 수 있다. 세포 배양물에서 결정된 IC₅₀(즉, 증상의 반-최대 억제를 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위한 용량이 동물 모델에서 공식화될 수 있다. 이러한 정보를 사용하여 인체에서 유용한 용량을 더 정확히 결정할 수 있다. 혈장 수준은, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.

D. 기타 방법

D1. 유전자 요법

특정 구체예에서, 본 발명의 분자를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산이 유전자 요법에 의해서 질환, 장애 또는 감염과 관련된 하나 이상의 증상을 치료, 예방 또는 완화하기 위해 투여된다. 유전자 요법은 발현된 또는 발현될 수 있는 핵산을 피험자에게 투여함으로써 수행되는 치료법을 말한다. 본 발명의 이 구체예에서, 핵산은 치료 또는 예방 효과를 매개하는 암호화된 항체 또는 융합 단백질을 생산한다. 본 분야에서 이용할 수 있는 유전자 요법을 위한 어떤 방법이라도 사용될 수 있으며, 예를 들어 Goldspiel et al. (1993) Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu (1991) Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev (1993) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) Science 260:926-932; 및 Morgan and Anderson (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:191-217에 설명된 방법이 있다.

바람직한 양태에서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 항체, 디아바디 또는 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하며, 상기 핵산은 적합한 숙주에서 항체를 발현하는 발현 벡터의 일부분이다. 특히, 이러한 핵산은 항체 코딩 영역에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 바람직하게는 이종성 프로모터를 가지며, 상기 프로모터는 유도성 또는 구성성이고, 선택적으로는 조직-특이적이다. 다른 특정 구체예에서, 항체 코딩 서열과 어떤 다른 바람직한 서열의 측면에 게놈의 원하는 부위에서의 상동성 재조합을 촉진하는 영역들이 존재하는 핵산 분자가 사용되고, 이로써 항체 암호화 핵산의 염색체내 발현이 제공되며, 이것은 Koller and Smithies (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:8932-35; 및 Zijlstra et al. (1989) Nature 342:435-38에 설명된다.

피험자에 핵산의 송달은 직접, 또는 간접적으로 이루어질 수 있는데, 직접 송달의 경우에는 피험자가 핵산 또는 핵산-보유 벡터에 직접 노출되고, 간접 송달의 경우에는 먼저 세포가 시험관 내에서 핵산으로 형질전환된 다음, 피험자에게 이식된다. 이들 두 접근법은 각각 생체내 또는 생체외 유전자 요법으로 알려져 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 생체내 투여되고, 이 경우 폴리뉴클레오티드가 발현되어 암호화된 폴리펩티드가 생산된다. 이것은 많은 방법 중 어느 것에 의해 달성될 수 있는데, 예를 들어 레트로바이러스 또는 다른 바이러스 벡터를 사용한 감염에 의해(예를 들어, U.S. 특허 No. 4,980,286; Miller et al. (1993) Meth. Enzymol. 217:581-599; Salmons and Gunzberg (1993) Human Gene Therapy 4:129-141; Grossman and Wilson (1993) Curr. Opin. in Genetics 및 Devel. 3:110-114; Kozarsky and Wilson (1993) Current Op. in Genetics and Dev. 3:499-503; Walsh et al. (1993) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300; Bout et al. (1994) Human Gene Therapy 5:3-10; Boesen et al. (1994) Biotherapy 6:291-302; Clowes et al. (1994) J. Clin. Invest. 93:644-651; Klein et al. (1994) Blood 83:1467-1473; 및 U.S. 특허 No. 5,436,146에 설명됨), 또는 네이키드 DNA의 직접 감염에 의해, 또는 미세입자 폭탄(예를 들어, 유전자 총)의 사용에 의해, 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 트랜스펙션 제제로의 코팅, 리포솜, 미세입자, 또는 미세캡슐 내 캡슐화에 의해, 또는 핵산으로 들어간다고 알려진 펩티드에 결합시켜 또는 수용체-매개 세포내이입 대상인 항원에 결합시켜 투여함에 의해(예를 들어, Wu and Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432; Joliot et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1864-1868; WO 92/06180; WO 92/22635; W092/20316; W093/14188; WO 93/20221)(이들은 수용체를 특이적으로 발현하는 세포 타입을 표적화하는데 사용될 수 있다)서 달성될 수 있다.

핵산이 세포에 도입된 후에 얻어진 재조합 세포가 생체내 투여될 수 있으며, 이것은, 예를 들어 WO 94/08598; Rheinwald (1980) Meth. Cell Bio. 21A:229; Pittelkow and Scott (1986) Mayo Clinic Proc. 61:771; Stemple and Anderson (1992) Cell 71:973-985에 설명된다. 얻어진 재조합 세포는 본 분야에 알려진 다양한 방법에 의해서 피험자에게 송달될 수 있다. 바람직하게, 재조합 혈액 세포(예를 들어, 조혈 줄기 또는 선조 세포)가 정맥내 투여된다. 사용이 고려되는 세포의 양은 원하는 효과, 환자 상태 등에 따르며, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 유전자 요법의 목적으로 핵산이 도입될 수 있는 세포는 어떤 바람직한 이용가능한 세포 타입을 포함하며, 제한은 아니지만, 상피세포, 내피세포, 각질세포, 섬유아세포, 근육세포, 간세포; 혈액 세포, 예를 들어 T 림프구, B 림프구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호산구, 거대핵세포, 과립구; 여러 줄기 또는 선조 세포, 특히 조혈 줄기 또는 선조 세포, 예를 들어 골수, 탯줄 혈액, 말초혈, 태아 간 등에서 얻어진 세포들을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 유전자 요법에 사용되는 세포는 피험자의 자가 세포이다.

D2. 백신 요법

어떤 구체예에서, 본 발명의 항체를 사용하여, 제한은 아니지만, 암 항원 및 감염성 질환 항원을 포함하는 항원 또는 면역원 인자에 대한 면역반응을 유도할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 면역반응의 발생이 바람직한 하나 이상의 항원 또는 면역원 인자를 포함하며, 여기서 하나 이상의 항원 또는 면역원 인자가 본 발명의 항체로 코팅된다. 본 발명의 백신 조성물은 면역반응, 특히 항원 또는 면역원 인자에 대한 보호 면역반응을 도출하는데 특히 효과적이며, 항원 또는 면역원 인자는 면역반응이 일어나는 것이 바람직한 바이러스, 또는 다른 바이러스 또는 비바이러스 병원체로부터 유래된 항원일 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 표면에서 항체를 발현하는 병원성 세포 또는 바이러스, 바람직하게는 감독된 바이러스를 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 투여함으로써 피험자에서 관용성을 유도하는 방법을 포함한다. 바람직하게, 피험자에서 관용성을 유도하는데 적합한 조성물은 본 발명의 항체로 코팅된 항원 또는 면역원 인자를 포함한다.

D3. 표적화 리포솜 또는 다른 마이크로캐리어 및 나노캐리어

어떤 구체예에서, 본 발명의 항체를 사용하여 원하는 치료 조성물(예를 들어, 항암제)를 표적 세포(예를 들어, 전립선 암세포 또는 다른 HER2/neu 발현 세포)로 송달하기 위한 표적화 리포솜을 제조할 수 있다. 항종양 약물의 표적화 송달을 위한 면역리포솜의 제조 및 사용은 Mastrobattista et al. (1999) Advanced Drug Delivery Reviews 40:103-127에서 검토된다. 리포솜은 지질 이중층에 기초한 소포 구조이다. 이들은 직경이 20nm만큼 작은 것에서부터 10μm만큼 큰 것까지 있을 수 있다. 이들은 단층(단지 하나의 이중층이 수성 코어를 둘러싸고 있다) 또는 다층(둘 이상의 이중층이 수성 코어 주위에 동심 배향되어 있다)일 수 있다. 다양한 표적화 제제(예를 들어, 본 발명의 항체)를 이용한 리포솜의 표적화는 본 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, U.S. 특허 No. 4,957,773 및 4,603,044를 참조한다. 표적화 제제와 리포솜을 결합시키는 표준 방법이 사용될 수 있다. 항체 표적화된 리포솜은, 예를 들어 단백질 A를 통합한 리포솜을 사용하여 구성될 수 있다. Renneisen et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:16337-16342; 및 Leonetti et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87:2448-2451을 참조한다.

바람직한 구체예에서, 리포솜은 일반적으로 중성 및 음으로 하전된 인지질과 스테롤, 예를 들어 콜레스테롤을 포함하는 표준 소포-형성 지질로부터 형성된다. 지질의 선택은 일반적으로 리포솜 크기 및 혈류 중 리포솜의 안정성을 고려하여 정해진다. 여러 방법이 리포솜 제조에 이용될 수 있으며, 예를 들어 Szoka et al. (1980) Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467; U.S. 특허 No. 4,235,871; 4,501,728; 및 4,837,028에 설명된다. 한 방법은 이종성 크기의 다층 소포를 생산한다. 이 방법에서는 소포 형성 지질이 적합한 유기 용매 또는 용매 시스템에 용해되고, 진공 또는 불활성 기체 하에서 건조되어 얇은 지질 박막이 형성된다. 바람직한 경우, 이 박막이 3차 부탄올 같은 적합한 용매에 재용해될 수 있고, 그 후 동결건조되어 더욱 균질한 지질 혼합물이 형성될 수 있는데, 이것은 더욱 쉽게 수화된 분말-유사 형태가 된다. 이 박막은 표적화된 약물과 표적화 성분(항체)의 수성 용액으로 덮이고, 전형적으로 교반하면서 15-60분에 걸쳐 수화된다. 얻어진 다층 소포의 크기 분포는 더 격렬한 교반 조건에서 지질을 수화시킴으로써, 또는 데옥시콜레이트 같은 가용화 세제를 첨가함으로써 더 작은 크기 쪽으로 이동될 수 있다.

D4. 면역분석법

본 발명의 항체를 사용하여 HER2/neu, 또는 HER2/neu를 발현하는 세포를 검출할 수 있다. 많은 방법 중 어느 것이 이러한 검출을 달성하기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역학적 결합 분석이 사용될 수 있다(예를 들어, U.S. 특허 No. 4,366,241; 4,376,110; 4,517,288; 및 4,837,168 참조). 일반적인 면역분석법에 대한 내용은 Asai (ed. 1993) Methods in Cell Biology Vol. 37, Academic Press, New York; Stites & Terr (eds. 1991) Basic and Clinical Immunology 7th Ed.를 참조한다.

따라서, 본 발명은 HER2/neu를 발현하는 세포를 검출하는 방법을 제공한다. 한 방법에서, 피험자에 대해 생검이 수행되고, 수집된 조직이 시험관내 시험된다. 다음에, 조직 또는 조직의 세포가 본 발명의 항-HER2/neu 항체와 접촉된다. 면역 복합체의 생성은 생검 샘플 중에 HER2/neu 단백질의 존재를 나타낸다. 이러한 검출을 용이하게 하기 위해서 항체는 방사선 표지되거나, 또는 검출가능한 표지인 이펙터 분자, 예를 들어 방사선 표지와 결합될 수 있다. 다른 방법에서, 세포는 전형적인 영상화 시스템을 사용하여 생체내 검출될 수 있다. 다음에, 표지의 국소화가 표지를 검출하는 공지된 방법 중 어느 것에 의해 측정된다. 진단 영상을 시각화하는 종래의 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상자성 동위원소가 MRI에 사용될 수 있다. 항체의 내재화는 순환계 청소와 연결된 세포외 효소 환경에 의한 청소에 민감한 세포외 결합에 의해 제공되는 것을 넘어서 생물체 내에서 항체의 수명을 연장하는데 중요할 수 있다.

또한, HER2/neu 단백질은 표준 면역분석 방법 및 본 발명의 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 표준 방법은, 예를 들어 방사선 면역분석, 면역크로마토그래피 방법, 샌드위치 면역분석(ELISA 포함), 면역형광 분석, 웨스턴 블롯, 친화성 크로마토그래피(고체상에 결합된 친화성 리간드), 및 표지된 항체를 이용한 인시츄 검출을 포함한다.

지금까지 본 발명이 일반적으로 설명되었지만, 다음의 실시예를 참조하여 본 발명은 더욱 쉽게 이해될 것이며, 이러한 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 특별히 언급되지 않는다면 본 발명을 제한하지 않는다.

실시예 1

BIACore 친화성 결정

용출, 정제된 항체의 결합에 관한 동력학적 변수들을 BIAcore 분석(BIAcore 기기 1000, BIAcore Inc., 피츠카타웨이, NJ.) 및 관련 소프트웨어를 사용하여 분석했다. HER-2를 아민 커플링 화학을 통해(NHS/EDC의 혼합물에 의한 카르복시메틸기의 변형에 의해서) 센서 칩 표면의 4개의 플로우 세포 중 하나(플로우 세포 2)에 고정시켰고, 이로써 수용체의 약 1000 반응 유닛(RU)이 표면에 고정되었다. 이후, 미반응 활성 에스테르를 1M Et-NH₂를 주사하여 마무리하였다. 일단 적합한 표면이 준비되었으면, ch4D5-FcWT(야생형 Fc), ch4D5, 및 트라스투주맙(대조군)을 180초 동안 70mL/분의 유속으로 표면 위를 지나게 해서 6.25 - 200nM의 농도로 주사했다.

일단 전체 데이터 세트가 수집되었으면, 얻어진 결합 곡선을 전체적으로 피팅하고, 속도 상수와 겉보기 평형 결합 상수를 BIAcore, Inc.에서 입수할 수 있는 BIAevaluation 소프트웨어 핸드북에 설명된 대로 제조자에 의해 제공된 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 계산했다. 도 3에 SPR 분석의 그래프 결과를 나타내며, 계산된 상수들은 표 5에 제공된다.

실시예 2

아폽토시스

다양한 셀라인을 ch4D5 및 ch4D5-FcMT1과 함께 하룻밤 콘쥬게이션했다. 아폽토시스를 FACS 분석에 의해 평가했고, 결과를 표 6에 나타낸다.

실시예 3

증식

SKBR3 세포 증식의 생화학적 지수로서 DNA로의 티미딘([3H]TdR) 혼입을 사용하여 본 발명의 구체예의 다양한 키메라 4D5 항체의 효과를 비교했다. CD16-158F+ 및 CD16-158V+ 세포에 대한 ch4D5-Ag, ch4D5 및 Ch4D-FcMT1의 효과를 연구하고, 대조군과 비교했다. 결과를 도 4에 나타낸다.

실시예 4

마우스에서의 항종양 활설 (유방암 모델)

다양한 항체의 항종양 활성을 비-트랜스젠 및 트랜스젠(hCD16A) 마우스를 사용하여 유방암 모델에서 연구했다. MacroGenics 사육군에서 가져온 Balb/c RAG2-/- 비-트랜스젠 마우스 50마리에 JMT-1 유방암 세포를 제0일째에 피하 주사했다. 마우스를 각 10마리씩 5 그룹으로 나누고, ch4D5 N297Q, ch4D5-야생형 Fc, ch4D5-FcMT1, ch4D5-FcMT2, 또는 PBS(음성 대조군)으로 8주 동안 매주 복강내 경로(IP)로 치료했다. 종양 전개를 캘리퍼스를 사용하여 매주 2회 모니터했으며, 종양 중량이 다음 식에 따라서 추정된다: 종양 중량 = (길이x폭²)/2. 결과를 도 5에 나타낸다. MacroGenics 사육군에서 가져온 Balb/c RAG2-/- mCD167- hCD16A+ 트랜스젠 마우스 23마리에 JIMT-1 유방암 세포를 제0일째에 피하 주사했다. 마우스를 3 그룹으로 나누고, ch4D5-야생형 Fc(n=8), ch4D5-FcMT1(n=8), 또는 PBS(음성 대조군; n=7)으로 8주 동안 매주 복강내(IP) 경로로 치료했다. 종양 전개를 캘리퍼스를 사용하여 매주 2회 모니터했으며, 종양 중량이 다음 식에 따라서 추정된다: 종양 중량 = (길이x폭²)/2. 결과를 도 6에 나타낸다.

실시예 5

마우스에서의 항종양 활성(난소암 모델)

다양한 항체의 항종양 활성을 비-트랜스젠 및 트랜스젠(hCD16A) 마우스를 사용하여 난소암 모델에서 연구했다. MacroGenics 사육군에서 가져온 R37- N/N 비-트랜스젠 마우스 22마리에 SKOV-3 난소암 세포를 제0일째에 피하 주사했다. 마우스를 4 그룹으로 나누고, ch4D5 N297Q(n=5), ch4D5-야생형 Fc(n=6), ch4D5-FcMT1(n =6), 또는 PBS(음성 대조군; n=5)으로 8주 동안 매주 복강내(IP) 경로로 치료했다. 종양 전개를 캘리퍼스를 사용하여 매주 2회 모니터했으며, 종양 중량이 다음 식에 따라서 추정된다: 종양 중량 = (길이x폭²)/2. 결과를 도 7의 패널 A에 나타낸다. MacroGenics 사육군에서 가져온 R37- N/N hCD16A+ 트랜스젠 마우스 32마리에 SKOV-3 난소암 세포를 제0일째에 피하 주사했다. 마우스를 4 그룹으로 나누고, ch4D5 N297Q(n=8), ch4D5-야생형 Fc(n=8), ch4D5-FcMT1(n=8), 또는 PBS(음성 대조군; n= 8)으로 8주 동안 매주 복강내(IP) 경로로 치료했다. 종양 전개를 캘리퍼스를 사용하여 매주 2회 모니터했으며, 종양 중량이 다음 식에 따라서 추정된다: 종양 중량 = (길이x폭²)/2. 결과를 도 7의 패널 B에 나타낸다. MacroGenics 사육군에서 가져온 mCD16-/- huCD16A FoxNl-/-(nu/nu) 트랜스젠 마우스 96마리에 SKOV-3 난소암 세포를 제0일째에 피하 주사했다. 마우스를 각 16마리씩 6 그룹으로 나누고, ch4D5-FcMT3, ch4D5-FcMT1, ch4D5-FcMT4, ch4D5, ch4D5Ag, 또는 PBS(음성 대조군)으로 8주 동안 매주 복강내(IP) 경로로 치료했다. 종양 전개를 캘리퍼스를 사용하여 매주 2회 모니터했으며, 종양 중량이 다음 식에 따라서 추정된다: 종양 중량 = (길이x폭²)/2. 결과를 도 8에 나타낸다.

실시예 6

다양한 암 셀라인에서 ADCC 분석

도 9에 HER2/neu에 대한 다양한 암 셀라인의 대표적인 면역조직화학 염색을 나타낸다. 셀라인은 DAKO HerceptTest™(DakoCytomation, 글로스트랍, 덴마크)로서 판매중인 HER2/neu 테스트 키트에 특정된 대로 셀라인의 HER2/neu 염색 강도에 따라서 순위가 매겨졌으며, HER2/neu 염색되지 않음(DAKO 점수 O); 약한 HER2/neu 염색(DAKO 점수 1+); 중간 HER2/neu 염색(DAKO 점수 2+); 및 강한 HER2/neu 염색 (DAKO 점수 3+)이다. 여러 패널은 표 7에 나타낸 다양한 셀라인을 나타낸다.

ch4D5-FcMT1, ch4D5- FcMT2, ch4D5-FcMT3, ch4D5-FcWT(야생형 Fc), ch4D5 N297Q 및 트라스투주맙(대조군)을 포함하여, Fc 변이체 도메인을 가진 ch4D5 항체를 포함한 몇 개의 ch4D5 항체를 암 셀라인에서 ADCC를 매개하는 능력에 대해 시험했다. 유효 분석의 데이터(SR ≤ 20% MR, AICC ≤ 50% MR)를 표 8에 기록하며, 여기서 EC₅₀ 추정치는 모델이 > 20%의 최대 용해에 맞는 경우에만 유효하다고 간주하였다. 섬 오브 스퀘어 F 테스트에 의해 Fc-최적화된 항체에 대해 얻어진 최대 맞춤 값이 Fc 야생형 ch4D5 항체에 대해 얻어진 것들과 통계적으로 달랐는지를 질문함으로써 EC₅₀과 최대 용해 변수의 비교를 수행했다. 또한, 데이터를 도 10-13에 나타낸 대로 S자형 용량-반응 모델에 맞게 피팅했다.

본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허들은 각 개별 간행물이나 특허출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 그것의 전문이 참고자료로 포함된다고 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참고자료로 포함된다. 본 발명은 특정한 구체예에 관하여 설명되었지만, 추가의 변형이 가능하다는 것이 이해될 것이며, 본 출원은 본 발명의 일반적인 원리에 따른 본 발명의 어떤 변화, 용도, 또는 개조를 포함하도록 의도되며, 본 개시내용으로부터의 이러한 벗어남이 본 발명이 속하는 분야에 공지된 또는 통상적인 관례 범위 내에 들어가고, 전술된 본질적인 특징에 적용될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> MacroGenics, Inc. Johnson, Leslie Huang, Ling Tuaillon, Nadine Bonvini, Ezio <120> HER2/neu-Specific Antibodies And Methods Of Using Same <130> 1301.0021I <150> US 61/041,649 <151> 2008-04-02 <160> 13 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chimeric (murine-human) <400> 1 gacatcgtga tgacccagtc ccacaagttc atgtccacct ctgtgggcga tagggtcagc 60 atcacctgca aggccagcca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca gcagaaacca 120 ggacattctc ccaaactgct gatttactcc gcatccttcc ggtacactgg agtccctgat 180 cgcttcactg gcagcagatc tgggacagat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240 gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatacta cacctcccac cttcggaggg 300 ggtaccaagg tggagatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 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Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 5 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized <400> 5 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 6 <211> 1353 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 caggttcagc tgcagcagtc tggccctgag ctggtgaagc caggggcctc actcaagttg 60 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Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 8 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chimeric (murine-human) <400> 8 caggttcagc tgcagcagtc tggccctgag ctggtgaagc caggggcctc actcaagttg 60 tcctgtacag cttctggctt caacatcaaa gacacctata tccactgggt gaaacagagg 120 cctgaacagg gcctggaatg gattggaagg atttatccta ccaatggcta tactagatat 180 gacccaaagt tccaggacaa ggccactatc acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240 ctgcaagtca gccgcctgac atctgaggac actgccgtct attactgctc ccggtgggga 300 ggggacggct tctatgctat ggactactgg ggtcagggag cctccgtgac cgtgagctcc 360 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720 ccgtcagtct tcctcttacc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgccggagga gcagtacaac 900 agcacgctcc gtgtggtcag catcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctctcgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1353 <210> 9 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric (murine-human) <400> 9 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Val Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg 290 295 300 Val Val Ser Ile Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Leu Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 10 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chimeric (murine-human) <400> 10 caggttcagc tgcagcagtc tggccctgag ctggtgaagc caggggcctc actcaagttg 60 tcctgtacag cttctggctt caacatcaaa gacacctata tccactgggt gaaacagagg 120 cctgaacagg gcctggaatg gattggaagg atttatccta ccaatggcta tactagatat 180 gacccaaagt tccaggacaa ggccactatc acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240 ctgcaagtca gccgcctgac atctgaggac actgccgtct attactgctc ccggtgggga 300 ggggacggct tctatgctat ggactactgg ggtcagggag cctccgtgac cgtgagctcc 360 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cgtgggggga 720 ccgtcagtct tcctcttacc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgccggagga gcagtacaac 900 agcacgctcc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctctcgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1353 <210> 11 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric (murine-human) <400> 11 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Val Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Val Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Leu Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 12 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chimeric (murine-human) <400> 12 caggttcagc tgcagcagtc tggccctgag ctggtgaagc caggggcctc actcaagttg 60 tcctgtacag cttctggctt caacatcaaa gacacctata tccactgggt gaaacagagg 120 cctgaacagg gcctggaatg gattggaagg atttatccta ccaatggcta tactagatat 180 gacccaaagt tccaggacaa ggccactatc acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240 ctgcaagtca gccgcctgac atctgaggac actgccgtct attactgctc ccggtgggga 300 ggggacggct tctatgctat ggactactgg ggtcagggag cctccgtgac cgtgagctcc 360 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720 ccgtcagtct tcctcttacc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgccggagga gcagtacaac 900 agcacgctcc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1353 <210> 13 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric (murine-human) <400> 13 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Val Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450

Claims (20)

1. N65S 치환을 포함하는 키메라 4D5 면역글로불린 경쇄를 포함하는 폴리펩티드.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 항체인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 항체가 Fc 도메인에 적어도 하나의 변형을 갖는 변이체 Fc 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 변형이 L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I, 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 변형이
   (A) F243L, D270E, R292P, S298N, Y300L, V305I, A330V, 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환;
   (B) F243L 및 P396L; F243L 및 R292P; 및 R292P 및 V305I로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 2개의 치환;
   (C) F243L, R292P 및 Y300L; F243L, R292P 및 V305I; F243L, R292P 및 P396L; 및 R292P, V305I 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 3개의 치환; 또는
   (D) F243L, R292P, Y300L 및 P396L; 및 F243L, R292P, V305I 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 4개의 치환
   을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 항체가
   (A) F243L, R292P, 및 Y300L;
   (B) L235V, F243L, R292P, Y300L, 및 P396L; 또는
   (C) F243L, R292P, Y300L, V305I, 및 P396L
   의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
9. 제 5 항에 있어서, 상기 변이체 Fc 도메인이 야생형 Fc 도메인과 비교하여
   (A) 증진된 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC);
   (B) FcγRIIA 또는 FcγRIIIA와의 증가된 결합;
   (C) FcγRIIB와의 감소된 결합; 또는
   (D) FcγRIIB와의 증가된 결합
   을 나타내는 것을 특징으로 하는 항체.
10. SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, 및 SEQ ID NO: 13으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 포함하는 폴리펩티드.
11. (A) F243L, D270E, R292P, S298N, Y300L, V305I, A330V 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환;
    (B) (1) F243L 및 P396L;
    (2) F243L 및 R292P; 및
    (3) R292P 및 V305I
    로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 2개의 치환;
    (C) (1) F243L, R292P 및 Y300L;
    (2) F243L, R292P 및 V305I;
    (3) F243L, R292P 및 P396L; 및
    (4) R292P, V305I 및 P396L
    로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 3개의 치환;
    (D) (1) F243L, R292P, Y300L 및 P396L; 및
    (2) F243L, R292P, V305I 및 P396L
    로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 4개의 치환; 또는
    (E) 적어도 F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396 치환
    을 포함하는 4D5 면역글로불린 중쇄를 포함하는 폴리펩티드.
12. 제 11 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 항체인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
13. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 항체가 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, 또는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
14. 제 13 항에 있어서, 상기 항체가
    (A) F243L, D270E, R292P, S298N, Y300L, V305I, A330V 및 P396L로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환;
    (B) (1) F243L 및 P396L;
    (2) F243L 및 R292P; 및
    (3) R292P 및 V305I
    로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 2개의 치환;
    (C) (1) F243L, R292P 및 Y300L;
    (2) F243L, R292P 및 V305I;
    (3) F243L, R292P 및 P396L; 및
    (4) R292P, V305I 및 P396L
    로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 3개의 치환;
    (D) (1) F243L, R292P, Y300L 및 P396L; 및
    (2) F243L, R292P, V305I 및 P396L
    로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 4개의 치환; 또는
    (E) 적어도 F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396 치환
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
15. 제 13 항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄가 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인을 포함하고, 상기 면역글로불린 중쇄가 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
16. 제 5 항, 제 6 항, 제 7 항, 제 8 항, 제 9 항, 제 13 항, 제 14 항 또는 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 F(ab')₂ 단편, F(ab) 단편, 단쇄 항체, 단클론 항체 또는 디아바디인 것을 특징으로 하는 항체.
17. 제 5 항, 제 6 항, 제 7 항, 제 8 항, 제 9 항, 제 13 항, 제 14 항, 제 15 항 또는 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
18. 환자에서 암의 치료를 위한 의약의 제조에서 제 5 항, 제 6 항, 제 7 항, 제 8 항, 제 9 항, 제 13 항, 제 14 항, 제 15 항 또는 제 16 항 중 어느 한 항의 항체의 사용.
19. 제 18 항에 있어서, 암이 HER2/neu-발현 암이고, 항체가 인간 HER2/neu와 결합하는 것을 특징으로 하는 사용.
20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 상기 치료가 항체와 동시에 또는 이어서 제 2 치료제를 투여하는 단계를 더 포함하고, 상기 제 2 치료제는 항혈관형성제, 항신생물제, 화학치료제, 및 세포독성제로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사용.
    
    

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