KR20100086079A

KR20100086079A - 골유도 단백질용 칼슘 포스페이트 전달 부형제

Info

Publication number: KR20100086079A
Application number: KR1020107014777A
Authority: KR
Inventors: 레베카 훙메이 리; 하워드 조엘 시허먼
Original assignee: 와이어쓰; 에텍스 코포레이션
Priority date: 2001-06-08
Filing date: 2002-06-06
Publication date: 2010-07-29
Also published as: PL367224A1; IL159136A0; KR100980164B1; JP2004535232A; HUP0401357A2; HK1062530A1; JP2009172425A; JP5091188B2; KR20040019300A; JP2010207653A; EP1404346A4; IL230994A0; JP2013226469A; US20080096797A1; EP1404346A2; AU2002314928B2; EP2260860A1; JP4414218B2; CA2449713A1; CA2449713C

Abstract

골 결함을 가지는 포유류 치료를 위한 조성물이 제공된다. 조성물은, 골유도 단백질, 전달제로서의 칼슘 포스페이트 물질 및 유효량의 기포제를 함유한다. 조성물 제조 방법 및, 골다공성 및/또는 골 감소성 뼈 치료를 위한 골유도 조성물을 사용하는 방법을 또한 개시한다.

Description

골유도 단백질용 칼슘 포스페이트 전달 부형제{CALCIUM PHOSPHATE DELIVERY VEHICLES FOR OSTEOINDUCTIVE PROTEINS}

본 발명은 골유도 단백질 전달 부형제로 유용한 칼슘 포스페이트 함유 복합 물질에 관계된다. 본 발명은 또한, 조직 수선 및 뼈 골절에서의 강화, 치아 이식, 골 이식 및 보철물 뿐 아니라, 골 재생 및 골 강화에 사용 가능한, 생물수용성 (生物受容性)인 골유도 복합물에 관련된다.

약물 전달 및 기타 수술 적용을 위한 효과적 이식 가능 부형제 개발에 생약학 분야의 많은 연구가 이루어졌다. 그러한 부형제는, 생물수용성이며, 또한 이들이 전달하고자 하는 임의의 생물 활성제의 활성을 보호 가능하여야한다. 많은 생물 활성제가 불안정하여 전달 물질로 혼입시 그들의 활성을 잘 잃어버린다. 단백질 활성의 보존은 특히 어려운 문제이다.

약물 전달 분야에서, 칼슘 포스페이트 세라믹은 이들의 공지의 생물수용성 및 단백질에 대한 친화성 때문에 잠정적 전달 부형제로 연구되어 왔다 (일례로, Ijntema 등, Int. J. Pharm. 112:215 (1994); Itokazu 등, J Orth. Res. 10:440 (1992); Shinto 등, J. Bone Joint Surg. 74-B:600 (1992); 및 Uchida 등, J. Orth. Res. 10:440 (1992)). 이들 물질 대부분은 미리 변형된, 과립 또는 블락 형태의 소결 히드록시아파타이트의 형태이다. 이들 제제는, 특히 블락의 경우 골격 결함에 부착되기 어려운 제한적 성질; (함께 결합하지 않는) 과립 구조의 전체성 (integrity) 부족; 블락 및 과립과 함께 결핍된 골격 조직의 형상으로 이식물을 만들기 어려운 것을 포함하는 많은 문제를 가진다. 히드록시아파타이트 블락 형태는 구조적 지지를 제공하나, 여러 가지 다른 문제 중, 그의 사용 및 미용 효과에 있어 심한 제한을 가하는 기계적 수단에 의해 지지될 것을 요구한다. 또한, 환자 개인 결함에 맞는 형상으로 히드록시아파타이트 블락을 잘라내는 것이 매우 어렵다. 과립형은 미용상 나은 결과를 도모하나, 구조적 안정성이 매우 낮아 수술 시술 동안 및 이후의 유지가 곤란하다. 일반적으로, 이들 제품 모두는 세라믹으로 고온 소결에 의해 제조되며, 각각은 결정이 아니고 그들 결정 경계가 융합된 상태이다. 대부분의 세라믹 타입 물질은 일반적으로 생물적으로 비흡수성으로 작용한다 (흡수율이 보통 1 년에 1% 정도를 초과하지 않음).

산호 기재의 다공성이며 비재흡수성 물질은 골과 함께 성장하나, 결국은 단지 약 20%가 뼈이며 나머지 80%는 흉터 조직으로 존재한다. Osteogen 사의 HA RESORB는 흡수성 히드록시아파타이트로, 시멘트가 아니다. 이는 과립으로 접착성이 아니다. HA RESORB

는, 위치에 접착적으로 패킹 되는 대신 헐렁하게 패킹된다. 다량 사용시, 이는 뼈에 의해 너무 빨리 대체된다. 치아 재료 시장에서, HAPSET

은 칼슘 포스페이트 과립 및 시멘트화 가능한 석고 Paris (황산칼슘)의 조성물이다. 이 물질은 진짜 히드록시아파타이트는 아니고 대부분 생물용으로는 황산칼슘을 너무 많이 함유한다. 이러한 조성물의 황산칼슘 성분은 재흡수성이나, 칼슘 포스페이트 과립은 그렇지 않다.

최소한 하나 이상 부류의 칼슘 포스페이트 조성물은 히드록시아파타이트 형성의 전구체로, 생물수용성이며, 다른 칼슘 포스페이트 물질에서는 수득되지 않는 2 가지 고유의 특성을 가진다: (1) 많은 의학 및 치과 적용을 위한 충분한 강도의 덩어리 형성을 위한 자체 경화, 및 (2) 골 이식 시, 물질이 서서히 재흡수되어 이식물을 수용하는 조직의 부피 또는 전체성의 손실 없이 새로운 골 형성에 의해 완전 대체됨. 미국 특허 Re. 33,221 및 Re. 33,161 (Brown 및 Chow)를 참조하며, 여기에는 칼슘 포스페이트 조성물에 기초한, 미세 결정성, 비세라믹의 서서히 흡수되는 히드록시아파타이트 물질 및 칼슘 포스페이트 재미네랄화 조성물의 제조를 개시하고 있다.

실질적으로 동일한 칼슘 포스페이트 시스템으로, 테트라칼슘 포스페이트 (TTCP) 및 모노칼슘 포스페이트 (MCP) 또는 이의 1수화물 (MCPM)으로 구성된 것이 공지이다 (Constantz 등, 미국 특허 5,053,212 및 5,129,905). 이 시스템은 MCP를 디칼슘 포스페이트으로 반복 전환시키는 것으로, 이는 TTCP와 반응하여 치아와 뼈의 주 미네랄 성분인 히드록시아파타이트 (HA)를 최종 생성물로 형성한다.

칼슘 포스페이트 조성물의 다른 타입은 무정형 인회석 (apatitic) 칼슘 포스페이트를 반응물로 함유하고, 프로모터 및 수성액을 함유하여 경화 페이스트를 만드는 것을 포함한다 (일례로, 미국 특허 5,650,176; 5,676,976; 5,683,461; 6,027,742; 및 Lee등에 허여된 6,117,456 참조). 이 시스템은 생물수용성이며, 생물 흡수성이고, 실온에서 장시간에 걸쳐 작업 가능한 생활성 세라믹 물질을 제공한다. 생활성 세라믹 물질은 저온에서 형성 가능하며, 용이하게 형성되고 및/또는 주입 가능하고, 추가 반응에 의해 고강도로 경화 가능한 것이다. 생활성 세라믹 물질은, 칼슘 대 인산 비 (Ca/P)가 천연 골 미네랄에 상응하며, 천연골에 유사한 강도와 골절 저항도를 가지는 저결정성 인회석 킬슘 인산 고체를 함유한다. 생활성 세라믹 복합 물질은 생물재흡수성이 강하여, 이의 생물재흡수성 및 활성은 특정 치료 및/또는 이식 부위의 요구에 맞게 조정 가능하다. 이 물질은 골 판, 골 스크류 및 기타 고정물 및 의료 장치로 제조되며, 이는 생물재흡수성 및/또는 골화가 강한 수의학적 적용을 포함한다.

*재생 수술 목적의 하나는, 환자 개인의 세포 또는 성장 촉진 단백질을 이용하여 손상 조직을 새 조직으로 대치하는 것이다. 일례로, 연구자들은, 중합체 뼈대 내에서, 분리된 연골을 손상 부위에 주사하여 연골 재생 시스템을 개발하고자 한다 (일례로, Atala 등, J. Urol. 150:747 (1993); Freed 등, J. Cell. Biochem. 51:257 (1993) 및 거기의 참조 문헌). 유사한 시딩 (seeding) 뼈대 시스템은 골 수선의 관점에서 연구되며, 여기서 골아 세포는 중합성 또는 세라믹 지지체와 함께 사용된다 (일례로, Elgendy 등, Biomater. 14:263 (1993); Ishaug 등, J. Biomed. Mater. Res. 28:1445 (1994)). 특히 흥미 있는 것은 골 형태생성 단백질 (일례로 재조합 인간 BMP-2), 탈미네랄화 골 매트릭스; 전환 성장 인자 (일례로, TGF-β); 및 골 형성을 유도하는 것으로 알려진 기타 각종 유기종과 같은 골 유도 물질이다.

3 가지 일반 타입의 칼슘 포스페이트 기재 뼈대 물질이 시딩된 조성물과의 사용을 위해 특별히 디자인되었다. 뼈대 물질의 한 타입은, 외부 표면에 결합하는 생활성 물질과 미리 성형된 칼슘 포스페이트 기재 과립으로 구성된다. 일반적으로는, 큰 과립 (이상적으로 100-1000 ㎛)이 염증 반응을 일으키지 않기 위해 필요하다. 그러나, 그와 같이 미리 변형된 과립은 경피 주사에 요구되는 작은 게이지 바늘로는 쉽게 주사되지 못한다. 또한, 인자들은 미리 제조된 과립들과만 혼합되므로, 매트릭스에 인자들이 잠기거나 분산되지 않고 표면 코팅될 뿐이다. 인자들을 잠기게 함에 의해서 매트릭스가 재흡수됨에 따라 생분자의 방출이 보다 조절되어진다. 미리 제조된 과립은 조작 및 응용이 보통 어렵다. 또한, 대부분 미리 제조된 히드록시아파타이트 과립은 소결 과정으로 제조되어, 본질적으로 비재흡수성이다.

시딩된 조성물의 제 2 뼈대 물질 타입은, 이식성 다공성 히드록시아파타이트 또는 트리칼슘 포스페이트 블락으로 구성된다. 이식성 다공성 블락은, 일반적으로 조절된 입자 크기의 반응물의 건조 혼합물을 사용하여, 다양한 정도의 다공성으로 제조된다. 다공성 증진을 위한 다른 방법은, 화학적 또는 물리적 에칭 (etching) 및 리칭 (leaching)이 있다. 이들 방법으로 충분한 지지를 얻을 수 있으나, 다공성 블락은 몇 가지 중요한 단점을 가진다. 먼저, 상기한 미리 변형된 과립처럼, 블락 뼈대는 부피 내에 잠긴 골유도 물질이 없어 활성 물질의 조절된 방출을 방해한다. 두 번째로, 이식성 블락은 주사 불가능하여, 보다 교란적인 이식 방법이 필요하다. 마지막으로, 그리고 중요하게, 모노리틱 (monolithic) 블락은, 회복의 보통 시간 동안 회복의 촉진이 필요한 임상 적용에서의 골 형성 속도를 방해한다. 이러한 지연은, 고체 담체의 느린 재흡수 및, 이에 따른 활성 물질의 느린 방출 때문이다. 모노리틱 매트릭스의 존재는, 골절 부위로의 세포의 이동 및 침투를 또한 방해한다. 다공들간에 상호 연결 통로가 블락 매트릭스에 의해 제공되어진다고 가정할 때, 새로운 골 성장은 다공 및 뼈대 벽의 경계에 의해 결정되어, 새로운 골 형성을 제한하게 된다.

뼈대 물질의 제 3 타입은 칼슘 포스페이트 시멘트이다. 미리 변형된 과립 및 모노리틱 블락과 달리, 시멘트는 쉽게 주사되고 또한 부피 내에 걸쳐 골유도 물질이 잠기게 한다. 그러나, 시멘트는 기본적으로 마이크로다공성인 모노리틱 응집물을 형성하는 경향이 있다. 생분해성 다공 형성제를 이용한 마크로다공성 물질 (PCT 공개 번호 WO 98/16209, 여기에 참고로 편입함)이 개발되었다고는 하지만, 이들 시멘트는 마이크로다공 과립 대신 통로를 함유하는 모노리틱 뼈대를 형성하여, 이는 상기한 바와 같이 새로운 골 성장을 심하게 억제하는 것이다.

따라서, 당 분야의 많은 수고에도 불구하고, 생물수용성이고, 용이하게 재흡수되며, 약물 활성에 해가 없는 약물 전달 부형제가 필요하다. 이상적으로, 부형제는 주사 가능하고; 각종 크기의 골절 및 결함 내로 주사 또는 이식되게 변형되며; 매트릭스에 걸쳐 생활성 물질을 균일하게 분산시키도록 촉진하여 활성 물질의 조절된 방출을 돕고; 그리고 마지막으로 수술 또는 결함 부위에 투여시 뚜렷한 마크로과립을 형성하는 것이다. 과립화는 세포외 골 매트릭스의 분비를 위한 세포 이동 및 침투의 촉진과, 혈관화 접근을 제공하기 위해 바람직하다. 과립은 또한, 증가된 세포-매트릭스 상호작용 뿐 아니라, 활성 물질의 증가된 재흡수 및 방출을 위한 고 표면적을 제공한다.

본 발명은, 약물 전달 및 조직 수선에 유용한 물질 및 조성물을 제공함으로서, 이들 문제를 해결하였다.

한 구현에서, 본 발명은, 칼슘 포스페이트 물질, 유효량의 기포제 및 생물 활성제를 포함하는, 골 결함을 가지는 포유류 처리용 조성물을 제공한다. 칼슘 포스페이트 물질은 무정형 인회석 칼슘 포스페이트, 히드록시아파타이트, 트리칼슘 포스페이트, 또는 플루오로아파타이트이다. 바람직한 구현에서, 칼슘 포스페이트 물질은 무정형 인회석 칼슘 포스페이트로, 일례로 저결정성 인회석 칼슘 포스페이트이다. 저결정성 인회석 칼슘 포스페이트는, 칼슘 대 인산 비 (Ca:P)가 천연 골 미네랄에 상응한다. 바람직한 구현에서, Ca:P 비는, 1:1.50 미만, 바람직하게는 약 1:1.40이다. 골생성 단백질은 골 형태생성 단백질 (BMP) 패밀리의 멤버일 수 있고, 이는 BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-10, BMP-12 및 BMP-13을 포함한다. 바람직한 구현에서, 골생성 단백질은 BMP-2 또는 BMP-6이다. 기포제는, 이산화탄소, 공기, 질소, 헬륨, 산소 및 아르곤으로 구성된 군에서 선택되는 기체이다. 바람직한 구현에서, 기포제는 중탄산나트륨이다. 중탄산나트륨은, 약 10 내지 약 40w/w % 농도로 존재한다. 조성물은, 약학적 허용 염, 폴리사카라이드, 펩티드, 단백질, 아미노산, 합성 중합체, 천연 중합체 및 계면활성제; 스폰지, 메쉬, 필름, 섬유, 젤, 필라멘트, 마이크로입자 및 나노입자와 같은 고체 구조; 콜라겐, 글리코겐, 키틴, 셀룰로스, 전분, 케라틴, 실크, 핵산, 탈미네랄화 골 매트릭스, 유도체화된 히알유론산, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스터, 폴리글리콜산, 폴리아세트산 및 이들의 공중합체 및 유도체와 같은 생분해성 중합체; 폴리(L-락타이드) (PLLA), 폴리(D,L-락타이드) (PDLLA), 폴리글리콜리드 (PGA), 폴리(락타이드-코(co)-글리콜리드) (PLGA), 폴리(D,L-락타이드-코-트리메틸렌 카보네이트) 및 폴리히드록시부티레이트 (PHB) 및 폴리안하이드라이드와 이들의 공중합체 및 유도체와 같은 α-히드록시카복시산; SiO₂, Na₂O, CaO, P₂0₅, A1₂0₃ 및 CaF₂; 및 폴리사카라이드, 펩티드 및 지방산과 같은 하나 이상의 보조 물질을 추가로 함유할 수 있다. 조성물은, 제 2 활성제로 헤지혹 (Hedgehog), 프래즐드 (Frazzled), 코르딘 (Chordin), 노긴 (Noggin), 세르베루스 (Cerberus) 및 폴리스타틴 (Follistatin) 단백질을 추가 함유 가능하다.

다른 구현에서, 본 발명은, 골생성 조성물의 유효량을 골 결함 부위에 투여함을 포함하는, 골 결함을 가지는 포유류 치료 방법에 관련되며, 골생성 조성물은 골 형태생성 단백질, 칼슘 포스페이트 물질, 및 기포제를 함유한다. 바람직한 구현에서, 기포제는 중탄산나트륨이다.

추가의 구현에서, 본 발명은 골 형태생성 단백질, 칼슘 포스페이트 물질, 및 기포제를, 골생성 단백질 전달 의약의 제조에 사용하는 용도에 관련된다.

본 발명은, 골 조직의 수선, 재생 및 강화에 사용되는 골유도 조성물에 관련된다. 조성물은 생물수용성이며 생물재흡수성인 칼슘 포스페이트 물질, 기포제 및 생물 활성제를 포함한다. 경화시, 칼슘 포스페이트 물질은 새로운 골 성장을 위한 재흡수성 뼈대를 구성한다. 기포제는, 칼슘 포스페이트의 경화 동안 분산되는 뚜렷한 마크로과립의 생성을 촉진하여, 칼슘 포스페이트가 균일한 모노리틱 구조를 형성하는 것을 방해한다. 생물 활성제는 존재, 또는 침투하는 프로제니터 (progenitor) 또는 기타 세포의 골생성 활성 증가를 촉진한다. 골 생성 조성물은, 뼈 골절, 치아 이식, 골 이식 및 보철 등의 조직 수선 및 강화뿐 아니라, 일례로, 골감소성 뼈에서의 골 강화 및 골 조직의 재생에 유용하다.

여기에서 사용한 '칼슘 포스페이트 물질'은, 주성분으로 칼슘 포스페이트를 함유하는 합성 골 대체 물질을 의미하는 것이다. 적절한 칼슘 포스페이트 기재 물질은 당업계 공지이며, 제한 없이, 무정형 인회석 칼슘 포스페이트, 히드록시아파타이트, 트리칼슘 포스페이트 및 플루오로아파타이트를 포함한다. 바람직한 구현에 있어서, 칼슘 포스페이트 물질은 저결정성 인회석 칼슘 포스페이트 고체로, 이는 칼슘 대 인산 비 (Ca/P)가 천연의 골 미네랄에 상응하는 것이다. 이들 물질은 무정형, 인회석 칼슘 포스페이트를 반응물로, 프로모터, 및 수성액을 조합해 경화 페이스트를 형성하여 제조한다. 다른 구현으로, 칼슘 포스페이트 미네랄은 결정성 칼슘 포스페이트 반응물의 고체상 산-염기 반응에 의해 결정성 히드록시아파타이트 고체를 형성함에 의해 제조한다.

'기포제'는, 버블, 기포 또는 기체 발생을 생성하는 기체상 물질 또는 물질을 의미한다.

여기에서 사용한 '무정형'은, 매우 큰 무정형 특성을 가지는 물질이다. 매우 큰 무정형 특성은, 75% 초과의 무정형 특성, 바람직하게는, 90% 초과의 무정형 특성을 가지고, 브로드하며 모양이 없는 X-선 회절 패턴을 그 특징으로한다.

'생활성'은, 이식물 내 및 주위에서 단단한 조직 형성을 유도하는 물질을 가리킨다. 연 조직 내에 이식시, 생활성 물질은 또한 성장 또는 영양성 (trophic) 인자의 존재, 또는 단단한 조직 형성 세포 타입과 이식물을 시딩할 것이 요구된다.

여기에 사용된 '생물수용성 (biocompatible)'이라는 용어는, 숙주 내에서 실질적인 유해 반응을 일으키지 않는 물질을 의미한다. 외래 물질을 생체 내에 도입시, 숙주에 부작용을 일으키는 염증 반응과 같은 면역 반응을 물질이 유도하는 것에 대한 염려가 항상 있어 왔다. 일례로, 히드록시아파타이트는 보통 '생물수용성'으로 여겨지나, 결정성 히드록시아파타이트 마이크로담체가 동물의 근육내 삽입될 때 심한 염증 및 조직 괴사가 관측되었다 (일례로, IJntema 등, Int. J. Pharm. 112:215 (1994)).

'생물재흡수성'은, 생체 내에서 물질이 재흡수될 수 있는 능력을 의미한다. 재흡수 과정은, 체액, 효소 또는 세포의 작용을 통해 원 이식 물질이 제거되는 것과 관련된다. 재흡수된 칼슘 포스페이트는, 일례로, 골 미네랄로 재침착되거나, 또는 체내에서 달리 사용되거나, 또는 배출된다. '강하게 생물재흡수성'이라고 사용된 용어는, 1년 이내에, 근육내 또는 피하 이식된 물질의 총 질량 중 80%이상이 재흡수된다는 의미이다. 바람직한 구현에서, 물질은, 9개월, 6개월, 3개월 및 이상적으로는 1개월 이내 재흡수된다.

기포제의 '유효량'은, 경화시 마크로과립을 형성하게 하는 충분한 양으로, 이는 사용한 칼슘 포스페이트 물질에 의존한다. 일반적으로, 기포제의 양은 약 1-90 중량%, 바람직하게는 약 1-50 중량%, 보다 바람직하게는 약 10-40 중량%의 양의 범위로 가한다.

여기에서 사용한 '마크로과립'은, 직경이 약 100마이크론 내지 1mm인 과립 또는 입자를 말한다. 본 발명의 칼슘 포스페이트 조성물의 경화에 의해 형성되는 마크로과립 물질은, 생물수용성 (즉, 염증 반응 유도를 피할 만큼 마크로입자가 충분한 크기를 가짐)이며, 마크로다공성으로, 하기한 바와 같다.

여기에서 사용한 '마크로다공성'은, 세포 이동 및 침투를 가능하게 하는 충분한 직경의 다공을 가지는 경화된 칼슘 포스페이트 물질이다. 바람직한 구현에서, 본 발명에 따라 형성된 마크로다공성 물질은 30 마이크론 초과의 구멍 직경, 보다 바람직하게는 약 30 내지 200 마이크론, 가장 바람직하게는 약 50 내지 100 마이크론의 직경을 가진다. 본 발명의 마크로다공성 물질은, 세포 기질 상호작용 증가뿐 아니라, 세포외 골 매트릭스의 분비를 위한 세포 이동 및 침투를 촉진한다.

생물 활성제의 '유효량'은, 존재하는 또는 침투된 프로제니터 또는 기타 세포의 골생성 활성 증가를 촉진할 만큼 충분한 양이다. 그 양은, 사용하는 칼슘 포스페이트 물질의 조성물 및, 처리하는 결함의 크기 및 성질에 의존한다. 일반적으로, 전달할 생물 활성제의 양은, 약 0.1 내지 약 100mg, 바람직하게는 약 1 내지 100mg, 가장 바람직하게는 약 10 내지 약 80mg 의 범위이다.

보조 물질의 '유효량'은, 복합물에 원하는 기계적 또는 화학적 성질을 부여하기에 충분한 양이다.

'경화'는, 이에 의해 변형성 칼슘 포스페이트 조성물이 경화된 칼슘 포스페이트 조성물로 변형되는 과정을 가리킨다. 칼슘 포스페이트 물질은, 실질적으로 비형성성 고체일 때 '경화된' 것으로 여겨진다. 이러한 경화 칼슘 포스페이트 물질은 압축도가 최저이고, 탄성 변형 대신 가소성 변형을 거친다.

'저결정성 인회석 칼슘 포스페이트', 'PCA 칼슘 포스페이트' 및 'PCA 물질'로 여기에 사용된 용어들은, 합성의 저결정성 인회석 칼슘 포스페이트를 가리킨다. 저결정성 인회석 (PCA) 물질은, X-선 회절 (XRD) 및 FT-IR 스펙트럼의 특성을 가지는 한, 단일한 칼슘 포스페이트 상에 국한되지 않는다. PCA 칼슘 포스페이트는, 뼈와 실질적으로 동일한 XRD 스펙트럼을 가진다. 스펙트럼은 일반적으로, 중심이 하나는 26°에 있고 다른 하나는 32°에 있는 20-35° 영역의 2 개의 브로드한 피크 및, 563cm^-1, 1034 cm^-1, 1638cm^-1 및 3432 cm^-1 (±2cm^-1)의 FT-IR 피크에 의해 특정화된다. 603 cm^-1 및 875 cm^-1에서 날카로운 쇼울더가 관측되며, 이중선은 1422cm^-1 및 1457cm^-1에서 최대값을 가진다.

'수화된 전구체'로 여기에 사용된 것은, 제한량의 수용액 (즉, 1g의 전구체 파우더 당 약 1ml 미만의 수용액) 존재하에서 건조 PCA 전구체의 수화에 의해 형성된 페이스트 또는 퍼티 (putty)를 의미한다. 수화된 전구체는, 전환이 진행되는 정도에 따라, 각종 조합으로 반응물 및 생성물 모두를 포함 가능하다. 여기에 기재된 '주사 가능한' 및 '형성 가능한' PCA 전구체 페이스트 모두는 수화된 전구체이다. 바람직한 '주사 가능한' 수화 전구체는, 18 게이지 피하 바늘을 통해 전달 가능한 적절 점도를 가지는 것이다.

여기에서 사용한 '프로모터'라는 용어는, 수화된 전구체의 경화를 촉진하여 무정형 칼슘 포스페이트 (ACP)를 PCA 칼슘 포스페이트로 전환하는 것을 제고하는 물질 또는 처리를 가리킨다. 프로모터의 일부는, PCA 물질에 혼입되며, 전환에 참가하는 것이다. 기타 '수동적' 프로모터로 알려진 것은, 전환에 참가하지 않는다.

여기에서 사용한 '반응성'이라는 용어는, 수화된 전구체 형성을 위해 액체와 혼합시, 전구체 물질의 경화와 함께 프로모터의 존재하에 PCA 물질로의 전환을 겪는 칼슘 포스페이트의 능력을 가리킨다. 바람직한 ACP는, 완전하게 전환되는 능력, 경화와 함께 신속히 전환되는 능력, 원래는 불활성인 화합물과 함께 전환되는 능력 및/또는 실질적으로 균질한 PCA 물질로 전환되는 능력에 의해 특정화된다. ACP가 제 2 칼슘 포스페이트와 반응시, '전환'은 ACP 및 제 2 칼슘 포스페이트 모두의 전환을 포괄한다. 경화의 정도 및 경화의 키네틱 또한 반응의 주요 요소이다. 일부 ACP는 다른 것보다 반응성이 크다. 디칼슘 포스페이트 2수화물 (DCPD)과 같은 약한 프로모터 존재하에서도 경화 및 전환되어 PCA 물질로 경화되는 ACP는 '고 반응성'으로 여겨진다. 바람직한 고 반응성 ACP는 37℃, 약 프로모터인 DCPD 존재하에서 12시간 내에 경화된 PCA 물질을 생성하며, 경화는 약 1 내지 5시간, 이상적으로는 10-30분 내에 실질적으로 종결된다.

칼슘 포스페이트 물질

본 발명의 칼슘 포스페이트 성분은 당업계 공지의 임의의 생물수용성인 칼슘 포스페이트 물질이다. 칼슘 포스페이트 물질은, 각종 방법 중 어느 것 및 적절한 출발 성분 어느 것으로부터도 제조되어진다. 일례로, 칼슘 포스페이트 물질은 무정형, 인회석 칼슘 포스페이트를 반응물로 하고, 프로모터, 및 수용액을 조합하여 경화된 페이스트를 형성함으로써 제조된다. 이와 다르게, 칼슘 포스페이트 물질은, 고체 상태 산-염기 반응에 의한 결정성 칼슘 포스페이트 반응물을 결정성 히드록시아파타이트 고체로 형성함에 의해 제조된다. 기타 칼슘 포스페이트 매트릭스 물질 제조 방법은, 당업계 공지이다.

저결정성 인회석 ( PCA ) 칼슘 포스페이트

한 구현에서, 칼슘 포스페이트 물질은 저결정성 인회석 (PCA) 칼슘 포스페이트이다. PCA 물질은 문헌에 기재되어 있고 (U.S.S.N. 출원 08/650,764 및 미국 특허 5,650,176), 이들 문헌 모두는 여기에 그 전체가 참고로 편입된다. 물질들은 관련 출원에 또한 기재된 바 있다 (제목은, "Delivery Vehicle," "Conversion of Amorphous Calcium Phosphate to Form a Novel Bioceramic," "Orthopedic and Dental Ceramic Implants," 및 "Bioactive Ceramic Composites," 각각은, 1997.10.16에 출원되고, ETEX Corporation (Cambridge, MA)의 것으로 이들은 모두 여기 참고로 편입된다). 이들 각 관련 출원의 개시 내용에 비추어, PCA 물질의 상세 내용은 여기 기재하지 않는다. 이들의 특성 요약이면 족할 것이다.

PCA 물질은, 그의 생물재흡수성 및 최소의 결정성에 의해 특정지워진다. 그의 결정 특성은, 천연 뼈와 실질적으로 동일하다. PCA 물질은 또한 생물수용성으로 숙주에 무해하다.

PCA 물질은 환자에게 페이스트 또는 퍼티 형태 (즉, 수화된 전구체)로 이식된다. 균일하면서도 마크로다공성인 칼슘 포스페이트 물질을 생성하는 본 발명 반응이 신체 밖에서 개시 가능하고 실온에서 서서히 진행하므로, 수술 부위 적용이전에 물질이 '고정화'되어 무용해지는 것을 최소화 할 수 있다. 반응은, 생체 조건 (즉, 신체 온도 및 압력)에서 상당히 촉진되며 놓여진 부위에서 물질이 경화된다. 이러한 면은, 이식 부위에 대한 장치의 맞춤 작업이 일반적으로 요구되는 수술 부위에서 특히 유용하다. 일례로, 기포제 및 생물 활성제를 함유하는 PCA 페이스트는, 골절 부위에 적용되어 이를 채우는데 사용되어진다.

이와 다르게, PCA 물질은, 원하는 생물 활성제와 기포제를 가해 체외에서 미리 경화시켜 이후 시간에 이식할 수 있다. 이러한 방법은, 맞춤 모양이 꼭 필요하지 않고, 많은 수의 이식물 제조가 필요한 경우 유용하다.

일반적으로, 본 발명의 형성 반응은 수술 부위 적용 이후 완성된다. 물질은 보통 5시간 미만에 경화하고, 생리학적 조건에서 실질적으로는 약 1 내지 5 시간에 경화한다. 바람직하게, 물질은 약 10-30분 이내에 실질적으로 경화한다. PCA 물질의 점도 및 형성성, 그리고 형성 반응의 속도는, 몇 개의 간단한 변수를 변형하는 치료적 요구에 따라 가변이다 (미국 특허, Lee 등에게 허여된 6,027,742, 이는 그 전체가 여기에 참고로 편입됨).

PCA 물질을 생성하는 전환 반응은, 건조 전구체 화합물의 혼합물에 물을 가하여 페이스트 또는 퍼티 형태의 점성의 수화된 전구체를 형성하는 것이다. 완충제, 식염수, 혈청 또는 조직 배양액과 같은 기타 수성 시약을 증류수 대신 가용 가능하다. 다른 구현에서, 충분한 양의 물을 전구체 분말에 가하여 페이스트를 형성하며, 이는 기타 발명의 성분의 첨가 이후, 18 게이지 바늘에 의해 쉽게 주사 가능해진다. 보다 종종, 결과의 생물재흡수성 칼슘 포스페이트는 '칼슘 결핍'인 것으로, 이는 히드록시아파타이트 경우 약 1.67인 이상적인 당량치보다 적은 1.5의 칼슘 대 인산비를 가진다.

적절한 PCA 물질은, PCA 전구체를 조합하고, 제한량의 물로 수화하여 (따라서 페이스트 또는 퍼티를 형성), 그리고 PCA 물질로 경화하게 하는 것이다. 적절한 전구체는, 습윤 환경 또는 신체 온도 주변에서 5시간 미만, 바람직하게는 10-30분 이내에 경화 가능한 것이다. 이러한 방식으로 경화하는 성분은, 시험 동물에게 근육 내 또는 피하로 놓여 경화된 후, 생물재흡수성을 체크한다. 적절한 물질은, 1-5g의 펠릿으로 이식 시, 1년 이내에 80% 이상이 재흡수되는 것이다. 바람직하게, 물질은 완전히 재흡수되는 것이다. 일반적으로, 피하 부위에서 물질의 재흡수 g량을 측정하는 것이 용이하다.

PCA 물질은, 하나 이상의 무정형 칼슘 포스페이트 (ACP) 전구체, 바람직하게는 활성화 또는 반응성 ACP (PCT 출원 WO 98/16209, 실시예 1-4 참조)를 사용하는 것이다. 어떤 경우, 반응은 단 하나의 전구체 ACP만을 사용하는데, 이는 PCA 물질로 부분 또는 전체가 제어된 형태로 전환된다. 또한, 활성화 ACP를 PCA 물질로 전환 촉진시키는데에 있어서 비참가 프로모터를 사용 가능하다. 어느 경우나, 반응은, 페이스트와 유사한 방식으로 시행하는 체외에서 시작되며, 이는, 37℃에서 강하게 촉진되어 경화된 칼슘 포스페이트 생성물이 매우 바람직하게 된다.

ACP가 PCA 물질로 전환되는 것은 물에 의해 촉진된다. 일반적으로, ACP는 파우더로 제공되어 다른 반응물 (일례로, 제 2 칼슘 포스페이트)과 조합되고, 제한된 량의 물에 노출되므로, 페이스트 또는 퍼티가 형성된다. 수화된 전구체는 이후 경화하게 되는데, 경화는 PCA 물질의 형성을 수반한다. ACP를 PCA 칼슘 포스페이트로 전환하는 것은, 페이스트 또는 퍼티로써의 제어된 방식으로 진행되어, 이는 예측적으로 경화하며, 치아, 정형 및 기타 치료적 적용의 용도를 가진다.

무정형 칼슘 포스페이트가 재흡수성 PCA 물질 생성을 위한 유일한 전구체로 사용되는 경우, ACP가 고결정성의 히드록시아파타이트로 전환되는 자연적 경향의 조절이 중요하다. 반면, 전환의 시간 진행은 수술상 유용도를 가질 만큼 빨라야 한다. 한 방법은, 결정 형성의 억제제를 함유하는 ACP 전구체 (일례로 WO 98/16209, 실시예 1 참조)를, 결정 형성 억제제를 함유하지 않는 ACP (일례로 프로모터)와 조합하는 것이다. 반응물은 억제제를 함유하는 ACP의 과량과 건조 상태에서 적절한 입자 크기로 혼합한다. 반응물을 이후 물을 가해 수화하고, 이후 승온하여 (일례로, 신체 내에 도입한 후 반응하는 것처럼), 반응물을 PCA 물질로 전환한다. 제어된 전환의 다른 방법은 촉매를 사용하는 것이다.

결정성 히드록시아파타이트

제 2 구현에서, 칼슘 포스페이트 물질은 결정성 히드록시아파타이트 (HA)이다. 결정성 HA는 문헌에 기재된 것으로 이는 모두 여기에 참고로 편입된다 (미국 특허 Re. 33,221 및 Re. 33,161, Brown 및 Chow에게 허여된 것). 상기한 특허들은, 칼슘 포스페이트 재미네랄화 조성물의 제조를 개시하며 동일한 칼슘 포스페이트 조성물에 기초한 미세 결정성의, 비세라믹, 서서히 재흡수되는 히드록시아파타이트 담체 물질의 제조를 개시한다. 유사한 칼슘 포스페이트 시스템으로, 테트라칼슘 포스페이트 (TTCP) 및 모노칼슘 포스페이트 (MCP) 또는 이의 1수화물 형태 (MCPM)로 구성된 것은 여기에 참고로 편입된 문헌에 개시되어 있다 (Constantz 등. 미국 특허 5,053,212 및 5,129,905). 한 구현에서, 칼슘 포스페이트 물질은 결정성 칼슘 포스페이트 반응물의 고체 상태 산-염기 반응에 의해 결정성 히드록시아파타이트 고체를 형성함에 의해 제조된다.

결정성 HA 물질 (달라이트라고 보통 불림)은 유동성, 성형성 및 그대로 경화될 수 있도록 제조된다 (Constantz 등. 미국 특허 5,962,028 참조). 이들 HA 물질 (카보네이트화 히드록시아파타이트로 보통 불림)은, 습윤 및 건조 반응물을 조합하여 실질적으로 균일한 혼합물을 형성하고, 혼합물을 적절한 모양으로 하여, 혼합물이 경화되게 함으로써 제조된다. 이와 다르게는, 전구체 반응 혼합물을 수술 부위에 적용하여 그 자리에서 경화 및/또는 성형되어지게 한다. 경화 중, 혼합물은 고체 및, 본질적으로 모노리틱인 인회석 구조로 결정화한다.

반응물은, 결합되지 않은 물이 실질적으로 없는 인산, 특히 칼슘원인 알칼리 토금속, 임의로 결정성 핵 특히 히드록시아파타이트 또는 칼슘 포스페이트 결정, 칼슘 카보네이트 및 각종 용질을 가지는 물과 같은 생리학적으로 수용되는 윤활제로 구성된다. 건조 성분은 혼합물로 미리 제조되고 실질적으로 균일한 혼합이 발생하는 조건 하에서 액체 성분과 이어서 혼합된다.

인산원은, 임의의 일부 중성화된 인산, 특히, 칼슘 포스페이트 일염기과 같이 제 1 프로톤이 거의 또는 완전히 중성화된 것이다. 이와 다르게 또는 추가로, 이는 가능하게는 결정형 형태인 오르쏘인산으로 구성되며, 이는 비결합된 물이 실질적으로 없는 것이다. 칼슘원은 일반적으로 카보네이트, 인산등의 짝이온을 함유하며, 특히 테트라칼슘 포스페이트 또는 트리칼슘 포스페이트과 같은 칼슘 포스페이트 및 인산의 2중 공급원을 포함한다.

각종 건조 성분을, 습윤 성분 첨가 전에 조합한다. 혼합에 의해 성분이 조합되고, 이는 성분간 반응 정도 조절에 사용된다. 임의 또는 전부의 건조 성분은 혼합 시작 전 또는 기계 혼합 종결 전에 가한다. 혼합 후, 잠잠하게 유지되는 동안 혼합물이 어닐링되게한 후, 혼합물이 경화하는 연장된 시간을 제공한다.

기포제

본 발명은 생리학적 조건 하에서 경화된 마크로과립 또는 마크로입자로 '자가 과립화' 및 분산되는 칼슘 포스페이트 매트릭스 또는 뼈대 물질을 제조하는 신규 방법을 제공한다. 칼슘 포스페이트 물질은, 생물수용성인 임의의 것으로, 상기한 PCA 칼슘 포스페이트 물질 및 결정성 히드록시아파타이트 물질과 같이 당업계에 칼슘 포스페이트 물질로 알려진 것이다. 놀랍게도, 본 발명자들은, 이들 칼슘 포스페이트 물질에 기포제를 가함에 의해 인산 물질의 생물학적, 화학적 및 기계적 특성을 실질적으로 변화시켜, 이의 치료적 유용성을 크게 증가시킬 수 있음을 발견하였다. 본 발명의 기포제는, 생리학적 온도 및/또는 압력하에서 버블 또는 기체를 생성하는 임의의 약학적으로 허용되는 물질이다.

시딩된 조성물을 사용하여 칼슘 포스페이트 물질을 제조하는 현재의 모든 방법은, 주사기 투여를 위한 제조 또는 제제화 동안의 과립 형성에 의한 제한된 주사 가능성을 포함하는, 특정의 본질적인 문제를 가진다. 생활성 물질이 부착되는 미리 변형된 칼슘 포스페이트 과립은, 염증 반응 유도를 막기 위해 커야만 한다 (이상적으로 100-1000 ㎛). 그러나, 이러한 큰 사이즈의 미리 변형된 과립은 경피 주사를 위해 필요한 작은 게이지 바늘로는 쉽게 주사되지 않는다. 또한, 이들 과립은 조작 및 적용이 보통 어렵고, 대부분이 소결 과정에 의해 제조되어 본질적으로 재흡수성을 가지지 않는다. 또한, 활성화제는 미리 형성된 과립과만 혼합되므로, 물질 내에 고르게 잠기거나 분산되는 대신 표면에만 코팅된다. 분산에 의해서, 매트릭스가 재흡수됨에 따라 생물질이 보다 제어된 방식으로 배출된다.

본 발명의 주요 면에서, 당업계 공지의 대체 골 복합 물질에 비해 본 발명의 생세라믹 물질은 수술 부위에서의 사용의 용이성이 상당히 개선된 것이다. 특히, 조성물의 기타 성분 (즉, 칼슘 포스페이트 물질 및 임의의 보조 물질)에 가한 기포제는 특정 조건 (일례로 생리학적 온도 및/또는 압력)에서 기체를 만들거나 버블을 만든다. 버블링 또는 기포화는, 생체 내에서 주사 또는 이식 시, 칼슘 포스페이트 물질의 과립화 및 분산화를 유도한다. 경화 및/또는 시멘트 반응 진행에 따라, 과립화가 동시에 진행되며, 활성제 (기타 성분과 혼합 또는 투여 직전 혼합물에 가해지는 것)는 각 과립의 부피 내에 균질하게 분산된다.

기포제는, 모노리틱 칼슘 포스페이트 덩어리가 형성되는 것을 막기에 적절한 양으로 가하여진다. 기포제는 칼슘 포스페이트 및 기타 칼슘 또는 인 함유 물질과 신속하게 및 완전히 반응하여 균질하고 주사 가능한 전달 부형제를 제공한다. 칼슘 포스페이트 물질의 특정 타입에 따라, 경화 및 시멘트화를 충분히 막을 수 있는 기포제를 선택하여, 상대적으로 균일한 과립을 형성하되, 칼슘 포스페이트 시멘트가 '비반응성'이 되도록 하는 정도로는 하지 않는다. 기포제의 첨가는 생체 내에서 주사 또는 이식 후에만 실질적 과립화가 일어나게 한다. 그 결과, 과립화는 칼슘 포스페이트 물질 제조 및/또는 주사 또는 이식 이전에 시멘트가 형성되는 동안에 발생하지 않는다. 기포제 존재하에 형성된 과립은, 충분히 커서 염증 반응을 억제하며 (보통 30㎛ 이상), 또한 표면적 대 부피비가 충분히 클수 있도록 충분히 작은 것이다. 표면적 대 부피비가 클수록 새로운 뼈가 재생됨에 따라 칼슘 포스페이트 물질의 재흡수가 촉진된다. 넓은 표면적은 또한 생물 활성제의 방출을 도우면서도, 골 유도에 필요한 적정 시간 길이 동안의 생물 활성제가 수술 부위에 유지되도록 한다. 또한, 표면적 대 부피비가 크면, 혈관화를 위한 접근을 제공할 뿐 아니라, 세포외 뼈 매트릭스의 분비를 위한 매트릭스 내로의 세포 이동 및 침투를 촉진하다. 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 생체 내에서 형성된 과립은 1-2000㎛ 범위, 바람직하게는 30-1000㎛ 범위, 보다 바람직하게는 30-500㎛ 범위, 그리고 가장 바람직하게는 50-100㎛ 범위이다.

한 구현에서, 기포제는, 수화된 칼슘 포스페이트 물질 내에 용해되는 기체이다. 이러한 기체는, 압력하에서 물질 내에 용해되는데, 즉, 시멘트 반응에는 불활성인 기체의 압력하에 복합 물질을 위치시키는 것이다. 기체는 이후 생리학적 온도 (즉 이식 또는 주사 시)에 노출시켜 방출해내는데, 이는 승온하에서 기체의 용해도가 감소하는 때문이다. 이러한 조건하에서, 기체 용해화 및 연이은 과립화는 생체 내에서 경화 중에서만 일어나고, 투여 이전에 일어나지 못한다. 이는, 주사기 내 실온에서의 과립화 발생이 바람직하지 않다는 관점에서 특히 유용하다. 단지 예로서, 적절한 기체는, 이산화탄소, 공기, 질소, 아르곤, 헬륨 및 산소를 포함한다.

다른 구현에서, 기포제는 생리학적 온도에서 휘발하는 휘발성 기체이다.

또 다른 구현에서, 기포제는 용해화시 기체를 발생하는 고체 물질이다. 일례로, 중탄산나트륨은, 불안정한 카본산 중간체로 전환됨에 따라 이산화탄소를 방출하며, 상기 중간체는 결국 이산화탄소 및 물을 방출한다.

생물 활성제

새로운 뼈 성장을 촉진 또는 자극하는 임의의 생물 활성제를, 본 발명의 칼슘 포스페이트 물질로부터 전달 가능하다. 특히 흥미 있는 것은 골 형태생성 단백질 (일례로 재조합 인간 BMP-2), 탈미네랄화 골 매트릭스, 전환 성장 인자 (일례로, TGF-β), 및 골 형성을 유도하는 것으로 알려진 기타 각종 유기종과 같은 골유도 물질이다. 추가로 또는 이와 다르게, 골화의 최적화를 위해, 골 형성 세포와 함께 전달 부형체를 시딩할 수 있다.

골유도 단백질

생물 활성제는, 전환 성장 인자 β (TGF-β) 단백질 수퍼패밀리로 알려진 단백질 패밀리에서 선택되며, 이는 액티빈, 인히빈 및 골 형태생성 단백질 (BMP)을 포함한다. 가장 바람직하게, 활성제는 골생성 활성 또는 기타 성장 및 분화 타입 활성을 가진 것으로 알려진 BMP로 알려진 단백질 하부클래스로부터 선택되는 단백질 하나 이상을 포함한다. 이들 BMP는 BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 및 BMP-7 단백질 (일례로 미국 특허 5,108,922; 5,013,649; 5,116,738; 5,106,748; 5,187,076; 및 5,141,905에 공지된 것); BMP-8 (PCT 공개 WO91/18098에 공지된 것); 및 BMP-9 (PCT 공개 WO93/00432에 공지된 것), BMP-10 (PCT 출원 WO94/26893에 공지된 것), BMP-11 (PCT 출원 WO94/26892에 공지된 것), 또는 BMP-12 또는 BMP-13 (PCT 출원 WO95/16035에 공지된 것), BMP-15 (미국 특허 5,632,372에 공지된 것) 또는 BMP-16 (미국 특허 5,965,403에 공지된 것)의 BMP 단백질을 포함한다. 본 발명에서 활성제로 유용한 기타 TGF-β 단백질은 Vgr-2 (Jones 등, Mol. Endocrinol. 6; 1961-1968, (1992))이며, PCT 출원 (WO94/15965, WO94/15949, WO95/01081, WO95/01082, WO94/21681, WO94/15966, WO95/10539, WO95/01845, WO96/02559 및 기타)에 개시된 것을 포함하는 임의의 성장 및 분화 인자 (GDF)를 포함한다. 본 발명에서 또한 유용한 것은 BIP로 WO94/01557에 개시된 것과, 일본 공개 번호 7-250688의 HP00269, 및 PCT 출원 WO93/16009에 개시된 MP52이다. 상기 출원의 내용 모두는 여기에 참고로 편입된다. 본 발명에서 바람직하게 사용되는 BMP의 하부군은, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-10, BMP-12 및 BMP-13을 포함한다. 활성제로 가장 바람직한 것은 BMP-2로써, 그 서열은 미국 특허 5,013,649에 개시되어 있고, 이의 내용은 여기에 참고로 편입된다. 당업계 공지의 기타 BMP 및 TGF-β 단백질 또한 사용 가능하다.

활성제는, 재조합 생성되거나 또는 단백질 조성물로부터 정제된다. 활성제가 BMP와 같은 TGF-β 또는 기타 이량체 단백질이면, 이는 호모 이량체 또는 기타 BMP와의 헤테로이량체일 수 있고 (즉, BMP-2 및 BMP-6 모노머 하나씩으로 구성된 헤테로이량체), 액티빈, 인히빈, 및 TGF-β1과 같은 TGF-β 수퍼패밀리의 기타 멤버와의 헤테로이량체일 수 있다 (일례로, 각 BMP의 한 모노머 및, TGF-β 수퍼패밀리의 관련 멤버 모노머 하나와의 헤테로이량체). 그러한 헤테로이량체 단백질의 예는 일례로 공개된 PCT 특허 출원 WO93/09229에 공지이며, 그 내용은 여기에 참고로 편입된다.

활성제는, 헤지혹 (Hedgehog), 프래즐드 (Frazzled), 코르딘 (Chordin), 노긴 (Noggin), 세르베루스 (Cerberus) 및 폴리스타틴 (Follistatin) 단백질과 같은 추가의 시약을 함유 가능하다. 이들 단백질 패밀리는 문헌에 공지이다 (Sasai 등, Cell 79:779-790 (1994) (Chordin); PCT 특허 공개 W094/05800 (Noggin); 및 Fukui 등, Devel. Biol. 159:131-139 (1993) (Follistatin)). 헤지혹 단백질은 WO96/16668, WO96/17924 및 WO95/18856에 개시되어 있다. 프래즐드 단백질 패밀리는 프리즐드 (Frizzled)로 알려진 수용체 단백질 패밀리의 세포외 바인딩 도메인과 고유사도를 가지는 최근 발견된 단백질 패밀리이다. 프리즐드 유전자 및 단백질 패밀리는 문헌에 공지이다 (Wang 등, J.Biol.Chem., 271:4468-4476 (1996)). 활성제는 또한, PCT 특허 공개 WO95/07982에 개시된 트렁케이션된 가용성 수용체와 같은 기타 가용성 수용체를 함유 가능하다. WO95/07982의 내용으로부터, 당업자는 다양한 다른 수용체 단백질로부터 트렁케이션된 가용성 단백질 제조가 가능함을 인지할 수 있다. 상기 문헌은 여기 참고로 편입된다.

본원에서 유용한 활성제의 양은 현존하거나 또는 침윤성인 기원세포 또는 기타 세포의 증가된 골생성 활성 자극에 유효한, 치료될 결함의 규모 및 특징 뿐만 아니라 사용될 담체에 따라 좌우되는 양이다. 일반적으로, 전달될 단백질의 양은 약 0.1 내지 약 100 mg 의 범위; 바람직하게는 약 1 내지 약 100 mg 의 범위; 가장 바람직하게는 약 10 내지 약 80 mg 의 범위이다.

골 형성 세포

한 구현예에서, 골화를 최적화하기 위해, 칼슘 포스페이트 조성물이 골 형성세포, 예컨대 기원 세포, 스템 세포 및 또는 조골모세포로 시딩 (seeding) 된다. 이는, 환자 자신의 골 형성 세포의 근원에 칼슘 포스페이트 조성물이 접촉하도록 위치시킴으로써 용이하게 달성될 수 있다. 상기 세포들은, 골막, 해면골 또는 골수를 포함하는, 골 또는 골 물질 또는 영역과 접촉되어 있는 외인성 유체를 포함하는, 골-연관 조직, 혈액 또는 유체에서 발견될 수 있다. 스크류 (screw) 및 핀 (pin) 과 같은 장치와 결합되어 사용되는 경우, 그의 골로의 도입에는 골막의 균열 (breach) 및/또는 출혈이 동반되며, 추가적인 시딩은 필요하지 않다.

피질 골에 대해서만 저항성인 플레이트에 대해서는, 장치와 접촉할 골막 병변의 유발이 권장된다. 또다른 구현예에서는, 이식 부위에서 피질 골의 부분을 제거함으로써 골 내에 외과적으로 시팅 (seating) 을 제조하는 것이 유용하다. 환자로부터 수합한 골 형성 세포는 골화 증진을 위해 그라프트에 도입될 수 있다. 골 형성 세포의 숙주 거부반응에 앞서 원하는 양의 골 재생성이 일어나는 경우, 비자가성 골 세포를 사용하는 것도 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 따라서, 1 차 근원, 세포주 또는 세포 은행으로부터 수득한 세포 또는 조직은 모두 특정 구현예에서 유용할 수 있다. 참고, 본원에 참고문헌으로 포함되는, Lee 등에게 허여된 U.S. 특허 제 6,132,463.

보조 물질

본 발명의 복합 물질은 칼슘 포스페이트 물질, 기포제 및 생물 활성제를 선택된 보조 물질과 배합함으로써 제조할 수 있다. 칼슘 포스페이트는 강화 물질, 매트릭스 또는 두 가지 모두로서 제공될 수 있다. 그의 초기의 수화된 형태에서 칼슘 포스페이트 물질은 전형적으로는 pH 를 약 6-7 로 유지하며, 따라서 악영향이 없는 광범위한 첨가제와 상용성이다. 보조 물질은 칼슘 포스페이트 및 기타 성분들과의 상용성, 및 특정 치료 목적에서 요망되는 특성들 (생물학적, 화학적 또는 기계적) 을 복합물에 부여하는 성능을 근거로 선택된다. 예를 들어, 보조 물질은 인장 강도 및 경도의 개선, 골절 인성 (fracture toughness) 의 증가, 이미징 능력 (imaging capability) 의 제공 및/또는 유동 특성 및 칼슘 포스페이트 물질의 셋팅 시간의 변경을 위해 선택된다.

보조 물질은, 예상하는 치료 용도에 따라, 각종 양 및 각종 물리적 형태로 칼슘 포스페이트 조성물에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 보조 물질은 스폰지, 메쉬, 필름, 섬유, 겔, 필라멘트 또는 마이크로 및 나노 입자를 포함하는 입자와 같은 고체 구조물의 형태일 수 있다. 보조 물질 자체가 복합물일 수 있다. 보조 물질은 재흡수성 칼슘 포스페이트와 직접 혼합되는 미립자 또는 액체 첨가제 또는 도프제 (doping agent) 일 수 있다. PCA 칼슘 포스페이트 물질과 직접 혼합하는 경우, 보조 물질은 육안으로 보이는 수준으로 시멘팅 반응 (cementing reaction) 을 방해할 수 있다. 상기는, 시멘트 입자 1 퍼센트를 코팅하는 보조 물질로 발생할 수 있으며, 코팅된 입자로 약한 시멘팅 반응이 일어나도록 한다. 대안적으로는, 액체 또는 고체가 반응 종들 사이에서 물리적인 분리를 초래하여, 시멘트 형성 (또는 과립) 의 진원 영역을 생성할 수 있다. 보조 물질은 매트릭스 내에 내입 또는 분산되는 칼슘 포스페이트용 매트릭스로서 제공될 수 있다. 대안적으로는, 칼슘 포스페이트가 그곳에 분산되는 보조 물질용 매트릭스로서 제공될 수 있다. 보조 물질은 칼슘 포스페이트체 상의 코팅으로서, 예를 들어, 체류 시간을 지연시키거나 또는 생체세라믹 물질 특성에 영향을 주기 위한 조립후 코팅으로서 적용될 수 있다. 최근에는, 보조 물질이 칼슘 포스페이트 조성물로 코팅될 수 있다.

보조 물질은 바람직하게는 생물수용성이며, 즉, 숙주에 도입시 물질에 의해 유도되는 불리한 반응이 없다. 다수의 경우, 보조 물질은 또한 생물 재흡수성인 것이 바람직하다. 보조 물질은, 칼슘, 인산 또는 칼슘 포스페이트에 대한 친화성을 가질 수 있으며, 이는 칼슘 포스페이트/보조 물질 상호작용의 강도를 증진시킨다. 친화성은 특이적이거나, 또는 비특이적인 이온성 상호작용을 통해 중재될 수 있다. 단지 예시의 수단으로, 조성물에서의 매트릭스로서 사용하기에 적합한 생분해성 중합체에는, 이에 한정되지 않으나, 콜라겐, 글리코겐, 키틴, 셀룰로오스, 전분, 케라틴, 실크, 핵산, 탈미네랄성 골 매트릭스 (demineralized bone matrix), 유도체화된 히알루론산, 폴리안하이드라이드, 폴리오르토에스테르, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 및 이들의 공중합체가 포함된다. 특히, α-히드록시카르복실산의 폴리에스테르, 예컨대 폴리(L-락타이드) (PLLA), 폴리(D,L-락타이드) (PDLLA), 폴리글리콜리드 (PGA), 폴리(락타이드-코-글리콜라이드 (PLGA), 폴리(D,L-락타이드-코-트리메틸렌 카르보네이트), 및 폴리히드록시부티레이트 (PHB), 및 다가무수물, 예컨대 폴리 (무수물-코-이미드) 및 이들의 공중합체가 생물재흡수성으로 공지되었으며, 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 또한, 생활성 유리 조성물 (bioactive glass composition), 예컨대 SiO₂, Na₂0, CaO, P₂0₅, Al₂0₃ 및/또는 CaF₂ 을 함유하는 조성물이, 본 발명의 칼슘 포스페이트 조성물과 배합되어 사용될 수 있다. 다른 유용한 생분해성 중합체에는 다당류, 펩티드 및 지방산이 포함된다.

생분해성 중합체는 유리하게는 생물재흡수성 하드웨어, 예컨대 이에 한정되지 않지만, 골 부위에서의 이식용 골수강 못 (intermedulary nail), 핀, 스크류, 플레이트 및 앵커 (anchor) 가 포함된다. 생물재흡수성 섬유는, 당 분야에 공지되어 있는 복합물 고안 및 조립의 원칙에 따라 칼슘 포스페이트와 상호작용하는 단결정 (whisker) 형태일 수 있다. 상기 하드웨어는 칼슘 포스페이트의 분말 미립자 혼합물 및 중합체의 가압에 의해 형성될 수 있다. 대안적으로는, 칼슘 포스페이트 매트릭스는, Tormala 등에 의해 기재된, 본원에 참고문헌으로 포함되는, 생분해성 자가 강화 복합물 (biodegradable self-reinforcing composite) 의 조립에 대한 문헌 (Clin. Mater. 10:29-34 (1992)) 의 것과 유사한 PLLA 섬유를 사용하여, PLLA 섬유로 강화될 수 있다.

생물재흡수성 중합체는 또한 하중 지지 상황에서 사용되는 퍼티 또는 골 접착제 (bone glue) 의 제조에 사용될 수 있다. 보조 물질은 골 접착제의 압축성 및 하중 지지 특성을 증가시키기 위해 첨가될 수 있다. 특히, 탄소 섬유 또는 다른 강화 섬유가 복합물에 첨가될 수 있다. 섬유 강화 골 치환 접착제의 제조에서, 칼슘 포스페이트/섬유 접면의 품질 및 강도를 개선하기 위해 섬유를 플라즈마-에칭 (plasma-etch) 하는 것이 유리할 수 있다. 칼슘 포스페이트는 또한 37℃ 에서 경화되거나, 미분화되거나 또는 단편화 (fragmented) 될 수 있으며, 골 접착제 시멘트, 필러, 석고, 에폭시드, 기타 칼슘 포스페이트와 같은 공지된 결합제, 또는 이에 한정되지 않지만, 황산칼슘, 알기네이트, 콜라겐 또는 시판되는 제품, 예컨대 Endobone (Merck), Hapset (Lifecore Biomedical), SRS

(Norian), Bonesource

(Leibinger), Collograft

(Zimmer), Osteograf

(CereMed), 및 Simplex

(Howmedica) 과 같은 겔과 혼합될 수 있다. 경화된 칼슘 포스페이트가 결합제 물질 내에서 분산되는 적용을 위해서는, 가장 빈번하게는 결합제가 당 분야에 공지된 방법으로 제조되며, 실제적인 비율은 원하는 밀착성 (consistency), 취급성 (workability) 및 접착성 (adherence) 의 조성물을 제조하기 위해 당 분야에 공지된 방법으로 다양화할 수 있지만, 적당히 동등한 부피로 미립자 칼슘 포스페이트와 혼합된다.

또다른 구현예에서, 생물수용성을 개선하기 위해, 전형적으로는 폴리에스테르로 제조되는 편복 봉합사 (braided suture) 가 본 발명의 칼슘 포스페이트 조성물로 코팅될 수 있다. 코팅된 봉합사는 칼슘 포스페이트 물질을 함유하는 슬러리에 봉합사를 침지시켜 제조할 수 있다. 칼슘 포스페이트 코팅에 대한 봉합사의 친화성은, 봉합사, 칼슘 포스페이트 입자 또는 두 가지 모두를 표면 처리함으로써 개선될 수 있다. 표면 처리에는 플라즈마 에칭 (plasma etching) 및/또는 화학물질 그라프트 (chemical grafting) 가 포함된다.

다른 구현예에서, 복합물은 칼슘 포스페이트 물질 및 비재흡수성이거나 또는 재흡수성이 열악한 물질을 함유하는 복합물이 제공된다. 비재흡수성이거나 또는 재흡수성이 열악한 물질로서 적합한 것에는, 덱스트란, 폴리에틸렌, 폴리메틸메타크릴레이트 (PMMA), 탄소 섬유, 폴리비닐 알콜 (PVA), 폴리(에틸렌 테트라프탈레이트)폴리아미드, 바이오글라스 (bioglass), 및 골 접착제 또는 퍼티에 사용되는 것으로 상기에 열거된 화합물들이 포함된다.

또다른 용도는 골 자체에 영구히 내입되는 유용한 물체들, 예컨대 핀 또는 강화 메쉬이다. 상기 물체는 원래 골에 대한 안정한 접착을 위한 앵커 (anchor) 로서 제공된다. 이는 특히 골에 대한 인대 및 힘줄의 접착에 유용하다. 재흡수성이며 칼슘 포스페이트 및 비재흡수성 하드웨어를 골화시키는 물체들은 골 내에 위치될 수 있으며, 골 접착제 제형물 내에서 추가적인 칼슘 포스페이트 물질 또는 복합 물질로 더 단단해질 수 있다. 하드웨어는 후속적으로 골로 내입되어 칼슘 포스페이트 물질을 재골화시킨다.

본 발명의 또다른 구현예에서, 조성물은 칼슘 포스페이트 또는 복합 물질을, 복합물의 재흡수 특성, 셋팅 시간 및/또는 유동 특징을 변경하는 첨가제와 블렌딩함으로써 제조된다. 예를 들어, 주사기를 통해 숙주에 전달하기 위한 복합물의 유동 특성을 개선하기 위해서는 실리콘 오일 또는 기타 윤활성 중합체 또는 액체를 복합물에 첨가할 수 있다. 윤활제는 바람직하게는 생물수용성이며, 골 치환 재료 복합물로부터 재빨리 물을 통과시킨 후 생체 내에서 칼슘 포스페이트 복합물을 고체화할 수 있다. 적합한 윤활제에는, 단지 예시의 수단으로서, 중합체 왁스, 액체 및 지방산이 포함된다. 윤활제는 약 0.1 내지 약 30 중량% 의 농도로 사용될 수 있다.

본 발명은 생물수용성이고, 용이하게 재흡수되며, 약물 활성에 해가 없는 약물 전달 부형제를 제공한다. 이상적으로, 부형제는 주사 가능하고; 각종 크기의 골절 및 결함 내로 주사 또는 이식되게 변형되며; 매트릭스에 걸쳐 생활성 물질을 균일하게 분산시키도록 촉진하여 활성 물질의 조절된 방출을 돕고; 그리고 마지막으로 수술 또는 결함 부위에 투여시 뚜렷한 마크로과립을 형성하는 것이다. 과립화는 세포외 골 매트릭스의 분비를 위한 세포 이동 및 침투의 촉진과, 혈관화 접근을 제공하기 위해 바람직하다. 과립은 또한, 증가된 세포-매트릭스 상호작용 뿐 아니라, 활성 물질의 증가된 재흡수 및 방출을 위한 고 표면적을 제공한다.

하기 실시예에서는 본 발명의 현재 바람직한 구현예를 상술한다. 본 명세서를 염두에 둔 당업자에게는, 그의 실시에서 다수의 개질 및 변형이 발생됨이 예상된다. 상기 개질 및 변형은 본원에 첨부된 특허청구범위에 포함되는 것으로 여겨진다. 하기 실시예는 본 발명을 어떤 수단으로든 한정하지 않는다. 본 출원을 통해 인용되는 모든 참고문헌, 특허 및 특허공보는 본원에 참고문헌으로서 포함된다.

본 실시예에서 사용되는 모든 성분들은 약제 등급이다. 칼슘 포스페이트 성분은 Etex Corporation (38 Sydney Street, Cambridge, MA 02139 소재) 에 의해 상표명 CEREDEX

로 시판되어 입수가능했다. 사용된 생물 활성제는 재조합 인간 골 형태생성 단백질-2 (rhBMP-2) 였다. BMP-2 의 제법 및 특징은 U.S. 특허 제 5,013,649 에 상세히 기재되어 있다.

실시예 1: 칼슘 포스페이트 조성물의 제조

저결정성 무정형 칼슘 포스페이트 인회석 페이스트를, 20 중량% 의 중탄산나트륨을 무정형 칼슘 포스페이트 (ACP) 분말 전구체에 첨가한 것을 제외하고 U.S. 특허 제 5,650,176 에 기재된 바와 같이 제조했다. 이어서 ACP 를 제한된 양의 물로 수화하여 페이스트를 형성하여, 실온에서 20-30 분 동안 취급가능하게 했다.

실시예 2: 생체내 이식 분석

칼슘 포스페이트 조성물을 실시예 1 에서와 같이 제조했다. 이어서, 수화된 페이스트를 체온의 식염수 조에 주입했다. 칼슘 포스페이트 물질은 생체 내 조건 (즉, 37℃) 으로 설정된 곳에서 거대과립으로 경화되었다.

실시예 3: 근육내 주입

20 중량% 중탄산나트륨을 함유하는 제 1 칼슘 포스페이트 조성물을 실시예 1 에 기재된 바와 같이 제조했다. 제 2 칼슘 포스페이트 페이스트를, 29 중량% 의 폴리에틸렌 글리콜을 무정형 칼슘 포스페이트 (ACP) 분말 전구체에 첨가한 것을 제외하고, U.S. 특허 제 5,650,176 에 기재된 바와 같이 제조했다. 이어서, 두 ACP 조성물을 제한된 양의 물로 수화시켜 2 개의 페이스트를 형성했으며, 둘 다 주입 후 수 시간 동안 약 100 - 1000 마이크론의 거대과립을 형성했다. 또한 (데이타는 나타내지 않음), 20 ㎍ 의 rhBMP-2 의 주입 후 발생하는 과립화는, 칼슘 포스페이트 모노리틱 셋팅 시멘트 또는 자가과립화 칼슘 포스페이트 조성물 중에 가해진다. 거대 과립 (칼슘 포스페이트) 조성물 중에 가해지는 rhBMP-2 를 사용하여 21 일째에 유도되는 골의 양은 대조군 물질 (모노리틱 시멘트) 보다 훨씬 많았다; 데이타는 나타내지 않음. 더욱이, 거대 과립 칼슘 포스페이트 물질을 이용하여 가해지는 rhBMP-2 의 지엽적인 방출은 대조군 물질보다 훨씬 적었다 (예를 들어, 약 30 % 대 75 %; 데이타는 나타내지 않음). 본 발명의 거대분자 조성물은, 매트릭스의 골파괴 세포 재흡수가 가능한 표면적의 증가로 인해 골유도 단백질의 더 빠른 방출을 제공한다. 차례로 상기 매트릭스 재흡수는 칼슘 포스페이트 물질로부터 가용성 rhBMP-2 를 방출한다.

실시예 4: 비골내 골절술 주입

20 중량% 의 중탄산나크륨을 함유하는 칼슘 포스페이트 조성물을 실시예 1 에서와 같이 제조했다. 20 ㎍ 의 rhBMP-2 를 수득한 ACP 조성물에 첨가하고, 이어서 제한된 양의 물로 수화시켜 페이스트를 형성했다. 0.5 cc 의 수화된 물질을 인간이 아닌 영장류 비골 골절술에 적용했다. 거대 과립의 과립화 및 분산은 1 일 후 확연했다. 대조적으로, 적용 1 주 후에는, 중탄산나트륨이 없는 표준 칼슘 포스페이트 물질 (대조군) 은 고체 단일 덩어리로 잔류했다 (데이타는 나타내지 않음).

실시예 5: 인간이 아닌 영장류 비골 골절술

20 중량% 의 중탄산나트륨을 함유하는 칼슘 포스페이트 조성물 (rhBMP-2/NaBSM20) 을 실시예 4 에 기재된 바와 같이 제조했다. 본 연구의 목표는, 성체 암컷 키노몰구스 원숭이에서 수술 7 일 후 단일 경피투여된 rhBMP-2/NaBSM20 의 비골 골절술 치유를 가속하는 약효를 결정하기 위한 것이었다. 상기 결과들은, 수술 3 시간 후 투여한 선행 연구와 비교했다 (데이타는 나타내지 않음). 소형 골수강 핀으로 안정화시킨 양측 비골 골절술은, 12 마리의 동물에서 시술했다. 6 마리 동물에서의 한 골절술에서는 골절술 수행 7 일 후 NaBSM20 의 mL 당 0.5 mL 내지 1.5 mg/mL rhBMP-2 를 주입했다. 대측 비골 골절술에서는 수술 제어 그대로 비처리로 남겨 두었다. 나머지 6 마리 동물에서의 한 골절술에서는 rhBMP-2 없이 완충액/NaBSM20 만을 주입하여, 담체 대조군을 제공했다. 대측 골절술에서 다시 비처리 수술 대조군을 제공했다.

수술 후 주 단위로 수집한 일련의 방사선 사진에서는 rhBMP-2/NaBSM 처리 골절술에서의 광물화 골 제형물 주입 1 주 후 조기에 드러났다. 주입 후 2 주째에, 방사선 사진으로 볼 수 있는 상당한 신생 골 형성이 있었다. 골절술을 통해 신생 골 가골 (new bone callus) 의 가교가 치료 후 3-5 주 (골절술 4-6 주 후)에 존재했다. 방사선 사진 상으로 골절술은 처리 7 주 째 (골절술 8 주 후) 에 치유되었다. 잔류하는 NaBSM 담체 물질이 상기 시점에 있다는 증거는 없었다. 대측 대조군에서의 신생 골 형성의 증거는 주입 약 3-4 주 후 (골절술 4-5 주 후) 에도 나타나지 않았다. 방사선 사진 상에서, rhBMP-2/NaBSM 처리군에서의 대측 수술 대조군에서 처리 7 주 후 (골절술 8 주 후) 에 가교 가골 또는 골절술 치유의 증거가 없었다. 두 번째 군의 동물에서 완충액/NaBSM 처리 및 대측 수술 대조군의 방사선 사진 외양은 rhBMP-2/NaBSM 처리근에서의 대측 수술 대조군의 것과 유사했다. 주입 7 주 후 (골절술 8 주 후) 완충액/NaBSM 처리 골절술에서는 잔류 담체의 증거가 여전히 있었다.

골절술 8 주 후 rhBMP-2/NaBSM20 처리 골절술의 비틀림 기계적 강도 (torsional mechanical strength) 는 정상 골의 강도 및 경도보다 훨씬 더 컸다 (1.58 ±0.40 대 1.24 ±0.26 Nm). 비틀림 강도는 또한 대측 수술 대조군 (0.72 ± 0.19 Nm) 및 상기 군의 완충액/Na/BSM20 처리군 및 대측 수술 처리 골절술에서의 것 (0.87 ± 0.29 및 0.74 ± 0.21 Nm) 보다 훨씬 컸다. 완충액/NaBSM20 골절술에서와 동일한 동물에서의 대측 수술 대조군 골절술 및 rhBMP-2/NaBSM 동물의 수술 대조군 비교시 이들 사이의 비틀림 기계적 강도에서는 현저한 상이성이 없었다. 비처리 수술 대조군 골절술에서는 약 14-16 주 후에나 정상 골의 기계적 강도에 접근했다. 유사한 결과가 골절술 경도에 대해서도 관찰되었다.

본 연구는 골절술 시술 후 7 일째에 rhBMP-2/NaBSM20 의 주입에 대한 응답으로 골절술 치유에서 50% 이상의 가속이 있다는 것을 나타낸다. 신생 골 형성의 출현은, 선행 연구에서의 골절술 3 시간 및 1 일 후 처리되는 rhBMP-2/NaBSM 및 rhBMP-2/aBSM 에서 관찰되는 것보다 훨씬 더 빠르다. 또한 골절술 7 일 후 처리된 동물에서의 비틀림 기계적 강도는 3 시간 및 1 일 처리에 비해 더 컸다. 골절술 치유의 가속은, 처리를 상기 두 시점에서 실시하는 경우 약 30-40% 이다. 1 차적인 결과는, 가속된 골절술 치유가 또한 골절술 시술 2 주 후 투여되는 처리로 달성될 수 있다는 것을 나타낸다. 상기 연구 결과들은 골절술 시술 후 3 시간 및 7 일 사이에 투여되는 경우 rhBMP-2/NaBSM 의 배합물이 골절술 치유를 가속한다는 것을 나타낸다.

Claims

생물 활성제로서의 골 형태생성 단백질 (Bone Morphogenic Protein: BMP), 담체로서의 칼슘 포스페이트 물질, 및 유효량의 기포제를 함유하고, 생리학적 조건하에서 과립을 형성하는, 골 결함이 있는 포유류 치료용 조성물.