KR20100085935A - 합성 5'ｕｔｒ, 발현 벡터, 및 전이유전자 발현의 증가방법 - Google Patents

합성 5'ｕｔｒ, 발현 벡터, 및 전이유전자 발현의 증가방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편 및 두번째 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 합성 5' UTR을 제공하고, 여기서 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편은 첫번째 진핵 유전자의 적어도 하나의 절단 부위를 포함하고, 두번째 폴리뉴클레오티드 단편은 두번째 진핵 유전자의 5' 비번역 영역의 적어도 일부를 포함하고, 상기 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편은 상기 두번째 폴리뉴클레오티드 단편의 5' 에 위치한다. 하나의 구체예에서, 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편은 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 두번째 인트론을 포함하고, 두번째 폴리뉴클레오티드 단편은 카세인 유전자의 5' 비번역 영역 (5'UTR)의 적어도 일부를 포함한다. 상기 합성 5'UTR은 발현 벡터 내에서 프로모터와 전이유전자 사이에 위치할 때 전이유전자의 발현을 증가시키는데 유용하다. 본 발명은 또한 하고; 또한 합성 5'UTR을 포함하는 벡터 및 합성 5'UTR을 이용하여 전이유전자의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.

Description

합성 5'ＵＴＲ, 발현 벡터, 및 전이유전자 발현의 증가방법{Synthetic 5'UTRs, expression vectors, and methods for increasing transgene expression}
본 발명은 바이오테크놀로지 분야이다. 구체적으로, 본 발명은 진핵세포에서 유전자 발현의 후-전사 조절에서의 개선에 관한 것이다.
진핵세포 유전자 발현은 DNA에서 일차 mRNA로의 전사 후에 여러 지점의 조절을 거친다. 일차 mRNA 전사체는 코딩 부분 (엑손)과 비코딩 부분 (인트론)으로 이루어진다. mRNA 스플라이싱하는 동안, 인트론은 잘려져 전사체로부터 제거되고 엑손끼리 연결되어 성숙한 메신저 RNA (mRNA)를 생성한다. 스플라이싱은 엑손의 첨가 및 제거의 다양한 조합을 거치면서 하나의 유전자로부터 다수의 단백질 이형체를 생성하는데 조절 지점의 역할을 한다. 대체적 스플라이싱으로 불리우는 이 과정은, 내부- 및 외부-세포 신호 경로의 조절하에 정교하게 조절되고, 스플라이세오좀(spliceosome)으로 불리우는 다수-구성요소적인 구조 내에서 일어난다.
단백질의 코딩 영역 내의 대체적 스플라이싱은 다양한 기능을 가진 다수의 이형체를 생성하는 결과를 가져온다. 또한, 스플라이싱은 포유류 세포에서 단백질 합성을 현저하게 증가시키는 것으로 나타난다 (Huang and Gorman, 1990 Nucleic Acids Research 18(4):937-947). 이에 대한 메커니즘은 알려져 있지 않다. 대체적 스플라이싱은 또한 전사체의 비번역 영역에서 일어날 수 있는데, 이는 단백질의 증가된 번역을 가져오는, 최종 전사체에 대한 인핸서나 안정화 도메인에 기여할 수 있다.
합성 유전자 컨스트럭트에서 5'조절 영역에서의 스플라이싱 요소의 첨가는 핵에서 세포질까지의 증가된 mRNA 수송의 결과로 인해 이론적으로 유전자 발현을 증가시키는 것으로 알려져 왔다(Huang and Gorman, supra; Choi et al., 1991 Molecular and Cellular Biology l l(6):3070-3074). 이러한 작업의 결과로서, 인트론은 종종 상업적으로 구입가능한 포유류 발현 벡터의 프로모터와 멀티플 클로닝 부위 사이에 포함된다. 그러나, 인트론과 다른 조절 영역과의 조합은 증가하는 유전자 발현에 대하여 평가되어지지 않았다.
발명의 요약
본 발명은 숙주 세포에서 합성 유전자 컨스트럭트의 전이유전자(transgene) 구성요소의 발현을 증가시키도록 고안된 합성 5'UTR 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 이론에 의해 제한되지 않았지만, 상기 합성 5'UTR은 전이유전자의 발현이 증가된 RNA 전사와 안정성을 통해 증가되도록 고안되었다.
상기 합성 5'UTR 서열은 RNA 및 단백질 레벨에서 안정적인 두번째 진핵 유전자의 5'UTR 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편에 융합된 첫번째 진핵 유전자의 절단 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다. 하나의 구체예에서, 합성 5'UTR 서열은 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 절단 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편 및 적어도 카세인 유전자의 5'UTR의 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 키메릭 서열이다.
본 발명의 상기 합성 5'UTR 폴리뉴클레오티드 서열은 합성 유전자 컨스트럭트내의 관심 서열 또는 관심있는 코딩 영역의 발현을 증가시키는 용도를 가진다. 상기 합성 5'UTR 서열은 재조합 DNA 기술을 이용하여 바이러스 또는 비-바이러스 벡터 내에서 프로모터와 관심있는 핵산 서열 사이에 삽입될 수 있다. 상기 합성 5'UTR 서열은 제한 엔도뉴클레아제 부위와 제한 엔도뉴클레아제 활성에 필요한 다른 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 인접한다. 상기 인접서열은 벡터 내에 클로닝 부위를 임의로 제공한다.
본 발명은 또한 합성 5'UTR을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 상기 벡터는 진핵 발현 벡터이다.
본 발명은 또한 진핵 세포에서 전이유전자의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 절단 부위를 포함하는 첫번째 진핵 유전자의 폴리뉴클레오티드 단편 및 적어도 5'UTR의 일부를 포함하는 두번째 진핵 유전자의 폴리뉴클레오티드 단편을 융합시켜서 키메릭 폴리뉴클레오티드 서열을 생성함으로써 합성 5'UTR 서열을 생성하는 단계, 및 상기 키메릭 폴리뉴클레오티드 서열을 발현 벡터 내의 프로모터와 관심 서열 사이에 삽입하는 단계를 포함한다.
본 출원인은 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편을 적어도 카세인 유전자의 일부를 포함하는 콜리뉴클레오티드 단편에 융합하여 생성된 합성 5'UTR 서열이 증가된 유전자 발현을 가져온다는 놀라운 발견을 하였다. 하기에서 상세히 기술하는 바와 같이, 합성 5'UTR 의 두 개의 다른 구체예는 상기 합성 5'UTR을 포함하는 발현 벡터로 트랜스펙트된 두 개의 다른 세포 유형에서 대조구와 비교하여, 리포터 유전자의 발현을 증가시켰다.
따라서, 본 발명의 하나의 목적은 진핵 세포에서 전이유전자의 발현을 증가시키기 위하여 적어도 이종 5' 비번역 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편에 융합된 절단 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 합성 5' UTR 서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 진핵 세포에서 전이유전자의 발현을 증가시키기 위하여 적어도 이종 5' 비번역 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편에 융합된 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 합성 5'UTR 서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 진핵 세포에서 전이유전자의 발현을 증가시키기 위하여 적어도 이종 5' 비번역 영역의 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편에 융합된, 이웃하는 엑손의 인접 5' 및 3' 부분을 가지는 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 합성 5'UTR 서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 벡터로의 삽입이 호환가능한 합성 5'UTR 서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 합성 5'UTR을 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 합성 5'UTR을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 것이다.
서열의 설명
서열번호 1은 Mlul 제한 부위, 서열번호 2, Kpnl 제한 부위, 서열번호 3, Mfel 제한 부위를 포함하는 합성 5'UTR 서열의 하나의 구체예를 나타낸다. 서열번호 1은 또한 하기에서 5U2로 나타낸다.
서열번호 2는 돌연변이된 추정 컨센서스 폴리-A 부위를 갖는, 5' 말단에서 엑손 2 인접 일부와 3' 말단에서 엑손 3 인접 일부를 갖는 카세인 SERCA2 인트론 2 서열의 구체예를 나타낸다. 서열번호 2는 카니스 패밀리 염색체 26, 전체 게놈 샷건 서열 (공개 등록 번호 NC 006608.2)의 돌연변이된 부분 서열이다.
서열번호 3은 소 카세인 5'UTR 서열의 구체예를 나타낸다. 서열번호 3은 전장 보스 타우루스 카세인 베타 mRNA (공개 등록 번호 NM_181008)의 부분 서열이다.
서열번호 4는 5' 말단에 있는 엑손 2 인접부위(flanking) 일부 및 3' 말단에 있는 엑손 3 인접부위 일부를 가진 개 야생형 SERCA2 인트론 2 서열의 구체예를 나타낸다. 서열번호 4는 카니스 패밀리 염색체 26, 전체 게놈 샷건 서열 (공개 등록 번호 NC 006608.2)의 부분 서열이다.
서열번호 5는 5' 말단에 있는 엑손 2 인접부위 및 3' 말단에 있는 엑손 3 인접부위을 갖는 인간 야생형 SERCA2 인트론 2 서열의 구체예를 나타낸다. 서열번호 5는 호모 사피언스 염색체 12, 레퍼런스 어셈블리, 전체 서열 (공개 등록 번호 NC OOOO 12)의 부분 서열이다.
서열번호 6은 5'말단에 있는 엑손 2 인접부위 및 3' 말단에 있는 엑손 3 인접부위를 갖는 마우스 야생형 SERCA2 인트론 2 서열의 구체예를 나타낸다. 서열번호 6은 무스 무스쿨루스 염색체 5, 레퍼런스 어셈블리 (공개 등록 번호 NC 000071)의 부분 서열이다.
서열번호 7은 AscI 제한 부위, MluI 제한 부위, 서열번호 4, KpnI 제한 부위, 서열번호 3, MfeI 제한 부위를 포함하는 합성 5'UTR 서열의 구체예를 나타낸다. 서열번호 7은 또한 여기서 INXN-1로 알려져 있다.
서열번호 8은 마우스의 카세인 5'UTR 서열의 구체예를 나타낸다. 서열번호 8은 무스 무스쿨루스 카세인 베타, mRNA (cDNA 클론 MGC :91065) (공개 등록 번호 BC080709)의 부분 서열이다.
서열번호 9는 래트의 카세인 5'UTR 서열의 구체예를 나타낸다. 서열번호 9는 라투스 노르베기쿠스 카세인 베타 (Csn2), mRNA (공개 등록 번호 NM_017120)의 부분 서열이다.
서열번호 10은 양의 카세인 5'UTR 서열의 구체예를 나타낸다. 서열번호 10은 오비스 아리에스 카세인 베타 (CSN2), mRNA (공개 등록 번호 NM OO 1009373)의 부분 서열이다.
서열번호 11은 카세인 SERCA2의 엑손 3을 나타낸다. 서열번호 11은 카니스 패밀리 염색체 26, 전체 게놈 샷건 서열 (공개 등록 번호 NC 006608.2)의 부분 서열이다.
서열번호 12는 합성 5'UTR을 포함하는 벡터 서열의 구체예를 나타낸다. 상기 서열번호 12로 나타낸 벡터는 서열번호 1을 포함하고 도 10에 개략적으로 도시되어 있다.
서열번호 13은 합성 5'UTR을 포함하는 벡터 서열의 다른 구체예를 나타낸다. 상기 서열번호 13으로 나타낸 벡터는 서열번호 7을 포함하고 도 11에 개략적으로 도시되어 있다.
서열번호 14는 조절 (폴리G) 합성 5'UTR을 포함하는 벡터를 나타낸 것이고 도 9에 개략적으로 도시되어 있다.
상기 서열들 중에서, T (티미딘)은 U (우라실)로 대체될 수 있다.
발명의 상세한 설명
하기 정의는 후술하는 본 설명 전체, 도면 및 청구항에 적용될 것이다. 그러나 하기에서 정의되지 않은 명세서 및 청구범위에서 사용되는 용어는 당해 기술에서 이해되는 일반적인 의미를 갖는다.
용어 "하나(one)", "하나(a)" 또는 "하나(an)"는 본 설명에서 사용되는 경우, 별도 지시되지 않는 한 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미한다.
"핵산", "핵산 분자", "핵산 서열", "올리고뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드 서열", "뉴클레오티드 서열", "폴리뉴클레오티드", 및 "폴리뉴클레오티드 서열"은 상호교환적으로 사용되며, 리보뉴클레오시드 (아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오시드 (데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘, 또는 데옥시시티딘; "DNA 분자")의 인산 에스테르 고분자 형, 또는 단일가닥 형 또는 이중가닥 헬릭스 형태에 있는 포스포로티오에테스 및 티오에스테르와 같은 그의 임의의 인산에스테르 유사체를 말한다. 이중 가닥의 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 헬릭스가 가능하다. 상기 용어 핵산 분자, 구체적으로 DNA 또는 RNA 분자는 상기 분자의 1차 및 2차 구조만을 말하며, 임의의 특정한 3차 형태로 제한되지 않는다. 따라서, 상기 용어는 알려진 이중-가닥 DNA, 그 중에서도, 선형 또는 구형의 DNA 분자 (예, 제한 단편)형태인 것, 플라스미드, 슈퍼코일 DNA 및 염색체를 포함한다. 특정한 이중-가닥 DNA 분자의 구조를 검토함에 있어서, 서열은 DNA의 비-전사된 가닥을 따라 5'에서 3' 방향으로 된 서열만을 제공하는 일반 컨벤션에 따라 설명할 것이다 (예, mRNa에 동종인 서열을 가지는 가닥). "재조합 DNA 분자"는 분자 생물학적 조작을 거친 DNA 분자이다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 합성 DNA, 및 세미-합성 DNA를 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
폴리뉴클레오티드 서열과 관련하여 사용하는 용어 "단편" (예, "폴리뉴클레오티드 단편")은 참고 핵산에 관련된 감소된 길이의 뉴클레오티드 서열을 말하며, 일반적인 부분을 넘어, 참고 핵산과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명에 따른 그러한 핵산 단편은 구성요소로 있는 더 큰 폴리뉴클레오티드내에 적절하게 포함될 수 있다. 그러한 단편은 본 발명에 따른 핵산의 적어도 6, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 39, 40, 42, 45, 48, 50, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 70, 75, 78, 80, 90, 100, 105, 120, 135, 150, 200, 300, 500, 720, 900, 1000 또는 1500개의 연속적인 뉴클레오티드 길이에 해당하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 또는 대안적으로 이루어진다.
용어 "키메릭(chimeric)"은 자연 상태와 근접하지 않은 단편으로 이루어진 것을 의미한다. 예를 들면, 키메릭 폴리뉴클레오티드는 자연 상태와 근접하지 않은 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
폴리뉴클레오티드 서열과 관련하여 사용되는 용어 "합성"은 야생형 폴리뉴클레오티드 서열과는 다른 비-자연적인 폴리뉴클레오티드이다 (또는 폴리뉴클레오티드의 일부). 예를 들면, 합성 유전자 (또는 유전자의 일부)는 자연에서 근접하지 않는 하나 이상의 핵산 서열 (키메릭 서열)을 포함할 수 있고, 및/또는 치환, 삽입, 및 결실 및 그의 조합을 포함할 수 있다.
"유전자"는 기능적 분자 (예, 폴리펩티드 또는 RNA)를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 말하며, cDNA 또는 게놈 DNA 핵산을 포함한다. 폴리펩티드 또는 RNA를 코딩하는 게놈 DNA는 성숙 mRNA로부터 절단되어서 동일한 폴리펩티드 또는 RNA를 코딩하는 cDNA에는 존재하지 않는 비-코딩 영역 (예, 인트론)을 포함한다고 일반적으로 이해되고 있다. "유전자"는 특정 RNA, 단백질 또는 폴리펩티드를 발현하는 핵산 단편을 포함할 수 있다. 상기 "유전자"는 코딩 서열의 앞에 오는 조절 서열 (5' 비-코딩 서열) 및 뒤에 오는 조절 서열 (3' 비-코딩 서열)을 더 포함할 수 있다. 상기 "유전자"는 또한 트리플렉스-형성 올리고뉴클레오티드 (TFOs)를 포함할 수 있다. "천연 유전자"는 그 자체의 조절 서열을 가진 자연에서 발견되는 유전자를 말한다. "키메릭 유전자" 또는 "재조합 유전자"는 천연 유전자가 아닌 임의의 유전자를 말하며, 자연에서 함께 발견되지 않은 조절 서열 및/또는 코딩 서열을 포함한다. 따라서, 키메릭 유전자는 다른 출처로부터 유래된 조절 서열 및 코딩 서열, 또는 동일한 출처로부터 유래된 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있으나, 자연에서 발견되는 것과는 다른 방식으로 조정될 수 있다. 키메릭 유전자는 다른 출처로부터 유래한 코딩 서열 및/또는 다른 출처로부터 유래된 조절 서열을 포함할 수 있다. "내생적 유전자"는 유기체의 게놈 내의 자연적 위치에 있는 천연 유전자를 말한다.
"외래" 유전자 또는 "외생적" 유전자 또는 "이종의" 유전자 또는 "전이유전자"는 숙주 세포 또는 유기체에서 일반적으로 발견되지 않으나, 숙주 세포 또는 유기체에 유전자 전이에 의해 도입된 유전자를 말한다. 전이유전자는 비-천연 유기체, 또는 키메릭 또는 합성 유전자 내로 삽입된 천연 유전자를 포함할 수 있다. 전이유전자는 또한 내생 유전자의 cDNA 버전일 수 있다. 전이유전자 유전자는 또한 내생 돌연변이된 유전자의 돌연변이되지 않은 버전일 수 있거나 내생 돌연변이되지 않은 유전자의 돌연변이된 버전일 수 있다. 전이유전자 유전자는 또한 치료 유전자 또는 리포터 같이 실험 유전자일 수 있다. 전이유전자는 숙주 세포의 목표 세포로 직접 도입될 수 있거나 숙주 유기체 내로 형질전환된 세포, 예를 들면, 자가 세포(autologous cell)의 전이에 의해 간접적으로 도입될 수 있다.
유전자의 "5 프라임 비번역 영역" 또는 "5'UTR"은 일차 RNA 전사체 (pre-mRNA)로 전사된 유전자의 부분으로 이해될 수 있으며, 상기 부분은 코딩 서열의 업스트림에 위치한다. 상기 일차 전사체는 초기 RNA 산물이며, 인트론과 엑손을 포함하며, DNA의 전사에 의해 생산된다. 많은 일차 전사체는 생리학적으로 활성인 RNA 종을 형성하기 위해 RNA 가공을 거쳐야 한다. 성숙 mRNA로의 가공은 말단의 트리밍, 인트론의 제거, 캐핑 및/또는 전구체 RNA로부터 개별 rRNA 분자의 분리를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 mRNA의 5'UTR은 단백질로 번역되지 않은 mRNA 부분이며 코딩 서열의 업스트림에 위치한다. 게놈 서열에서, 상기 5'UTR은 전사 개시 부위와 시작 코돈 사이에 있는 영역으로 일반적으로 정의된다. 척추동물 mRNA의 상기 5' 비번역 영역 (5'UTR)은 수 십 개의 염기에서 수 백개의 염기 길이에 이를 수 있다 (Crowe et al., 2006 BMC Genomics 7:16).
"합성 5'UTR"은 야생형 5'UTR 폴리뉴클레오티드 서열과는 다른 비-천연 5'UTR이다. 합성 5'UTR은 자연에 근접하지 않는 하나 이상의 핵산 서열 (키메릭 서열), 및/또는 치환, 삽입, 및 결실 및 그의 조합을 포함할 수 있다.
"절단 연결지점(splice junction)", "인트론-엑손 절단 연결지점" 또는 "절단 부위"는 두 개의 이웃하는 엑손이 연결되고 인트론이 결실되는 세포의 절단 기구에 의해 인식되는 진핵 pre-mRNA에서의 인트론 경계에 있는 영역이다. 절단 부위는 5' 및 3' 인트론/엑손 경계에서 보존 서열에 의해 나타난다. 대부분의 인트론에 대하여, 가장 보존되는 서열은 인트론의 상기 5' 말단에 인접하는 GU와 상기 3' 말단에서 인접하는 AG 이다. 그러나, 이들 보존 서열에 대한 예외는 또한 AU-AC 절단 부위를 가진 인트론으로서 알려져 있다. 인트론-엑손 경계에 있는 5' 절단 부위는 "절단 공여" 부위로 알려져 있다. 인트론-엑손 경계에 있는 3' 절단 부위는 "절단 수여" 부위로 알려져 있다.
"스플라이세오좀"은 세포의 스플라이싱 기구로 작용하는 거대한 리보뉴클레오단백질 컴플렉스이다. 스플라이세오좀은 pre-mRNA 기질에서 어셈블하는 작은 핵 리보뉴클레오단백질 (snRNP) 서브유닛으로 이루어진다. snRNP는 그 자체로 작은 핵 RNA (snRNA) 및 몇 개의 단백질 서브유닛으로 이루어진다. 스플라이싱 반응 동안, 상기 pre-mRNA 내의 절단 부위의 인식은 snRNA를 가진 염기-쌍을 통해 수행된다.
"이종" DNA는 세포 내에, 또는 세포의 염색체 위치에서 자연적으로 존재하지 않는 DNA를 말한다. 따라서, 이종 DNA는 세포에 외래적인 유전자를 포함한다. "이종" DNA는 또한 세포 내에 자연적으로 존재하는 유전자이나 비-천연 위치에 존재하는 유전자를 포함한다. 또한, "이종" DNA 분자는 숙주 DNA 단편, 예를 들면 전사 프로모터에 작동가능하게 연결된 비-숙주 DNA 단편을 포함하는 DNA 분자일 수 있다. 역으로, 이종 DNA 분자는 외생 프로모터와 작동가능하게 연결된 내생 유전자를 포함할 수 있다. 나아가, "이종" 은 참고 DNA 분자 또는 단편을 가진 공통 진화 기원을 공유하지 않는 유전자로부터 유래된 DNA 분자 또는 단편을 말할 수 있다.
용어 "게놈"은 염색체뿐만 아니라 미토콘드리아, 엽록체 및 바이러스 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다.
용어 "프로브"는 상보적인 단일 가닥의 목표 핵산과 염기 쌍을 이루어 이중-가닥 분자를 형성할 수 있는 단일-가닥 핵산 분자를 말한다.
DNA "코딩 서열"은 폴리펩티드를 코딩하고 전사되어 세포내에서 시험관내 또는 생체 내 또는 세포 밖에서, 예를 들면, 적절한 조절 서열의 조절 하에 놓여졌을때 튜브 내에서 폴리펩티드로 번역될 수 있는 이중 가닥 DNA 서열을 말한다. "적절한 조절 서열"은 코딩 서열의 업스트림 (5' 비-코딩 서열), 내부, 또는 다운스트림 (3' 비-코딩 서열)에 위치하며, 전사, RNA 가공 또는 안정성, 또는 관련 코딩 서열의 번역에 영향을 주는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐레이션 인지 서열, RNA 가공 부위, 이펙터 결합 부위 및 스템-루프 구조를 포함할 수 있다. 코딩 서열의 경계는 5' (아미노) 말단에서의 개시 코돈 및 3' (카르복실) 말단에서의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은 원핵, 진핵, 또는 키메릭 서열, mRNA 로부터의 cDNA, 게놈 DNA 서열, 및 심지어 합성 DNA 서열까지 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
"오픈 리딩 프레임(open reading frame)"은 약자로 ORF이며, ATG 또는 AUG 와 같은 번역 개시 신호 또는 개시 코돈, 및 종결 코돈을 포함하며, 폴리펩티드 서열로 잠재적으로 번역될 수 있는 DNA, cDNA 또는 RNA의 핵산 서열의 길이를 말한다.
용어 "다운스트림(downstream)"은 참고 뉴클레오티드 서열의 3' 쪽에 위치한 뉴클레오티드 서열을 말한다. 구체적으로, 다운스트림 뉴클레오티드 서열은 전사의 개시 포인트 뒤에 오는 서열과 일반적으로 관련된다. 예를 들면, 유전자의 번역 개시 코돈은 전사의 개시 부위의 다운스트림에 위치한다.
용어 "업스트림(upstream)"은 참고 뉴클레오티드 서열의 5' 쪽에 위치한 뉴클레오티드 서열을 말한다. 구체적으로, 업스트림 뉴클레오티드 서열은 전사의 개시 포인트 또는 코딩 서열의 5' 쪽에 위치하는 서열과 일반적으로 관련된다. 예를 들면, 대부분의 프로모터는 전사 개시 부위의 업스트림에 위치한다.
DNA의 서열과 관련하여, "화학적으로 합성된"은 구성요소 뉴클레오티드가 시험관 내에서 어셈블된 것을 의미한다. DNA의 매뉴얼 화학 합성은 잘 확립된 절차를 이용하여 수행될 수 있거나, 자동화된 화학 합성은 수많은 상업적으로 입수가능한 기계들 중 하나를 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 유전자는 숙주 세포의 코돈 바이어스를 반영한 뉴클레오티드 서열의 최적화에 기반하여, 최적의 유전자 발현을 위해 맞추어질 수 있다. 당업자는 코돈 사용이 숙주에 의해 선호되는 이들 코돈으로 바이어스된다면 성공적인 유전자 발현 가능성이 있음을 이해한다. 바람직한 코돈의 결정은 서열 정보가 입수가능한 숙주 세포로부터 유래한 유전자의 조사에 기반하여 할 수 있다.
용어 "제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한 효소"는 상호교환적으로 사용되며, 이중 가닥 DNA 내 특정한 뉴클레오티드 서열에 결합하고 자르는 효소를 말한다.
"폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되며, 공유결합된 아미노산 잔기로 이루어진 고분자 화합물을 말한다. 아미노산은 하기의 일반 식을 갖는다:
"중합효소 사슬 반응"은 약자로 PCR이며 특정 핵산 서열을 효소적으로 증폭시키는 시험관 내 방법을 말한다. PCR은 세 단계를 포함하는 사이클을 갖는 온도 사이클의 반복과 관련된다: 주형 핵산을 변성시켜 목표 분자 가닥을 분리하기, 주형 핵산에 단일 가닥 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 어닐링하기, 및 DNA 중합효소에 의한 어닐링된 프라이머의 신장하기.
용어 "상동성"은 두개의 폴리뉴클레오티드나 두개의 폴리펩티드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상응성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열 정보를 정렬하고 용이하게 입수가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 또한, 상동성은 상동 영역간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해(digestion)시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "상동"의 모든 문법적 형태나 스펠링 변이 형태는 슈퍼패밀리 유래 단백질 (예, 면역글로불린 슈퍼패밀리) 및 다른 종 유래의 상동 단백질 (예, 미오신 경쇄, 등)을 포함하여, "공통 진화 기원"을 갖는 단백질 간의 관계를 말한다 (Reeck et al., Cell 50:667 (1987)). 그러한 단백질 (및 그들의 코딩 유전자)은 높은 정도의 서열 유사성에 의해 반영되는 서열 상동성을 갖는다. 그러나, 일반적 사용과 본 출원에서, 용어 "상동"은 "매우 높은"과 같은 형용사에 의해 수식될 경우에는 서열 유사성을 말하는 것이고 공통 진화 기원을 의미하는 것은 아니다.
따라서, 용어 모든 문법적 형태의 "서열 유사성"은 공통 진화 기원을 공유하거나 하지 않을 수 있는 단백질의 핵산 서열이나 아미노산 서열 간의 동일성이나 상응성 정도를 말한다 (Reeck et al., Cell 50:667 (1987) 참고). 하나의 구체예에서, 두 개의 DNA 서열이 DNA 서열의 소정의 길이에 대해 뉴클레오티드 매치가 적어도 21% (바람직하게 적어도 약 50%, 가장 바람직하게 약 75%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)일 때, "실질적으로 상동" 또는 "실질적으로 유사"하다. 실질적으로 상동인 서열은 서열 데이터 은행에서 사용되는 표준 소프트웨어를 사용하거나, 예를 들면, 특정한 시스템을 위해 정의된 엄격한 조건 하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로서 확인할 수 있다. 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이다 (예, Sambrook et al., 1989, infra 참고).
본 발명에서, "실질적으로 유사한"은 하나 이상의 뉴클레오티드 염기의 변화가 하나 이상의 아미노산의 대체를 가져오지만 DNA 서열에 의해 코딩되는 단백질의 기능적 특성에 영향을 미치지 않는 핵산 단편을 말한다. "실질적으로 유사한"은 또한 하나 이상의 뉴클레오티드 염기의 변화가 핵산 단편의 활성에 영향을 미치지 않고 안티센스나 공-억제 기술에 의해 유전자 발현의 변경을 조절하기 위한 것인 핵산 단편을 말한다. "실질적으로 유사한"은 또한 결과 전사체의 기능적 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드 염기의 결실 또는 삽입과 같은 본 발명의 핵산 단편의 수식을 의미한다. 따라서, 본 발명은 특정한 예시적 서열 이상을 포함한다고 이해된다. 제안된 수식의 각각은 당해 기술에서 잘 알려져 있으며, 코딩된 산물의 생물학적 활성의 보유를 결정한다.
게다가, 당업자는 본 발명에 의해 포함되는 실질적으로 유사한 서열은 또한 엄격한 조건 하에서, 그들의 혼성화하는(hybridize) 능력에 의해 정의됨을 이해할 것이다. 핵산 분자의 단일 가닥 형태는 적절한 온도 및 용액 이온 세기의 조건하에서 다른 핵산 분자에 어닐링하는 경우, 핵산 분자는 cDNA, 게놈 DNA, 또는 RNA와 같은 다른 핵산 분자에 "혼성화할 수 있다" (Sambrook et al., 1989 infra 참고). 혼성화 및 세척 조건은 Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning에 잘 알려져 있고 예시되어 있다. A Laboratory Manual, 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), 특히, 11 장 및 도 11.1 참조. 온도 및 이온 세기 조건은 혼성화의 "엄격도(stringency)"를 결정한다.
엄격한 조건은 먼 친척관계인 유기체로부터의 상동 서열과 같은 적절하게 유사한 단편부터 매우 가까운 친척관계의 유기체로부터의 기능적 효소를 복제하는 유전자와 같은 매우 유사한 단편까지 스크린하기 위해 조정될 수 있다. 상동 핵산에 대한 예비 스크리닝에 대하여, 55℃의 Tm에 대응하는, 낮은 엄격도 혼성화 조건이 이용될 수 있으며, 예를 들면, 5XSSC, 0.1% SDS, 0.25% 밀크, 및 무 포름아미드; 또는 30% 포름아미드, 5XSSC, 0.5% SDS이다. 온화한 엄격도 혼성화 조건은 높은 Tm에 대응하며, 예를 들면, 5X 또는 6XSSC를 갖는 40% 포름아미드이다. 높은 엄격도 혼성화 조건은 가장 높은 Tm에 대응하며, 예를 들면, 50% 포름아미드, 5X 또는 6X SSC이다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 발명은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 여기 기술되거나 사용된 바와 같이 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함한다.
하나의 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상기 제시한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 Tm은 60℃이다; 다른 구체예에서, 상기 Tm은 63℃ 또는 65℃이다.
후-혼성화 세척은 또한 엄격도 조건을 결정할 수 있다. 바람직한 조건의 하나의 세트는 실온에서 15분간 6XSSC, 0.5% SDS를 가지고 시작한 후 45℃에서 30분 동안 2XSSC, 0.5% SDS로 반복하고 난 다음, 50℃에서 30분 동안 0.2XSSC, 0.5% SDS로 두번 반복하는, 일련의 세척을 사용한다. 엄격한 조건의 다른 예는, 세척은 0.2XSSC, 0.5% SDS에서 마지막 두 번의 30분간의 세척 온도가 60℃까지 증가하는 것을 제외하고는 상기 조건과 동일하되 더 높은 온도를 사용한다. 더 높은 엄격한 조건의 또다른 예는 65℃에서 0.1XSSC, 0.1% SDS에서의 두 번의 마지막 세척을 사용한다. 혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치가 가능할지언정, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 포함할 것을 요구한다.
핵산을 혼성화하는 적절한 엄격도는 핵산의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술에 잘 알려져 있다. 두 뉴클레오티드 서열 사이의 유사성 또는 상동성 정도가 더 클수록, 그러한 서열을 갖는 핵산의 하이브리드에 대한 Tm 값은 더 커진다. 핵산 혼성화의 상대적 안정성 (더 높은 Tm 에 대응하는)은 하기 순서로 감소한다: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. 길이가 100 뉴클레오티드보다 큰 하이브리드에 대하여, Tm 계산 수식은 유도되어져 있다 (Sambrook et al., supra, 9.50-0.51 참조). 더 짧은 핵산, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드와의 혼성화에 대하여, 미스매치 위치는 보다 더 중요할 것이고, 올리고뉴클레오티드의 길이가 그의 특이성을 결정한다 (Sambrook et al., supra, 11.7-11.8 참고).
하나의 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 500mM 염보다 낮고 적어도 37℃의 혼성화 단계, 및 적어도 63℃에서 2XSSPE에서의 세척 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하여 탐지될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 혼성화 조건은 200mM 염보다 낮고 적어도 37℃의 혼성화 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 혼성화 조건은 혼성화 및 세척 단계 모두에서 63℃ 및 2XSSPE를 포함한다.
혼성화 핵산의 길이는 예를 들면, 적어도 약 10 뉴클레오티드이다. 혼성화 핵산에 대한 최소 길이는 적어도 약 15 뉴클레오티드; 적어도 약 20 뉴클레오티드; 또는 적어도 30 뉴클레오티드일 수 있다. 게다가, 당업자는 온도 및 세척 용액 염 농도는 프로브의 길이와 같은 요소에 따라 필요할 경우 조절될 수 있음을 인식할 것이다.
본 발명의 실질적으로 유사한 핵산 단편은 DNA 서열이 여기 보고된 핵산 단편의 DNA 서열에 적어도 70% 동일한 핵산 단편이다. 본 발명의 핵산 단편은 DNA 서열이 여기 보고된 핵산 단편의 DNA 서열에 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, and 99% 동일한 핵산 단편을 포함한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "대응하는"은 정확한 위치가 유사성 또는 상동성이 측정되는 분자와 동일하거나 다를지라도, 유사 또는 상동 서열을 말한다. 핵산 또는 아미노산 서열 정렬은 스페이스를 포함할 수 있다. 따라서, 용어 "대응하는"은 서열 유사성을 말하며, 아미노산 잔기 또는 핵산 염기 수의 넘버링을 의미하는 것은 아니다.
아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 "실질적 일부"는 당업자에 의해 서열의 수작업 평가에 의해서든 아니면 컴퓨터-자동화된 서열 비교 및 BLAST와 같은 알고리즘을 이용한 동정에 의해서든 간에, 폴리펩티드나 유전자를 추정적으로 동정하기에 충분한 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., J. MoI. Biol. 215:403 410 (1993)); BLAST는 World Wide Web 상에서 일반적으로 사용가능하다. 일반적으로, 10개 이상의 인접한 아미노산 서열 또는 30개 이상의 뉴클레오티드 서열이 알려진 단백질 또는 유전자에 상동인 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 추정적으로 동정하기 위하여 필요하다. 게다가, 뉴클레오티드 서열에 관하여, 20 내지 30 개의 인접한 뉴클레오티드를 포함한 유전자 특이적 올리고 뉴클레오티드 프로브가 유전자 동정의 서열-의존 방법 (예를 들면, 써던 혼성화) 및 단리 (예를 들면, 박테리아 콜로니 또는 박테리오파지 플라크의 in situ 혼성화)에서 이용될 수 있다. 게다가, 12개 내지 15개 염기의 짧은 올리고뉴클레오티드가 프라이머를 포함하는 특정한 핵산 단편을 얻기 위해 PCR에서 증폭 프라이머로서 이용될 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 서열의 "실질적 일부"는 서열을 포함하는 핵산 단편을 특이적으로 동정하고/동정하거나 단리하기에 충분한 서열을 포함한다.
당해 기술에서 알려진 용어, "퍼센트 유사성"은 서열을 비교하여 결정되는, 둘 이상의 폴리펩타이드 서열 또는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계이다. 당해 기술에서, "동일성(identity)"은 또한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 서열 관련성 정도를 의미하며, 서열 줄 간의 매치 여부에 의해 결정될 수 있다. "동일성" 및 "유사성"은 알려진 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있으며 하기 방법을 포함하며 이에 제한되는 것은 아니다: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); and Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991). 동일성을 결정하는 방법은 테스트하는 서열간의 최적 매치를 가져오도록 고안된다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 일반적으로 사용가능한 컴퓨터 프로그램에서 체계적으로 분류된다. 서열 정렬 및 퍼센트 동일성 계산은 LASERGENE bioinformatics computing suite (DNASTAR Inc., Madison, WI)의 메갈린(Megalign) 프로그램을 사용하여 수행할 수 있다. 서열의 다수 비교는 디폴드 파라미터 (GAP PENALTY=IO, GAP LENGTH PENALTY=IO)를 갖는 Clustal method of alignment (Higgins et al., CABIOS. 5:151 153 (1989))를 사용하여 수행될 수 있다. Clustal 방법을 사용하는 쌍정렬을 위한 디폴트 파라미터가 선택될 수 있다: KTUPLE 1, GAP PENALTY=3, WINDO W=5 and DIAGONALS SAVED=5.
용어 "서열 분석 소프트웨어"는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 분석에 유용한 임의의 컴퓨터 알고리즘 또는 소프트웨어 프로그램을 말한다. "서열 분석 소프트웨어"는 상업적으로 입수가능하거나 개별적으로 개발될 수 있다. 일반적인 서열 분석 소프트웨어는 GCG 슈트(suite) 프로그램을 포함하나 이에 한정되지 않는다 (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI), BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. MoI. Biol. 215:403 410 (1990)), and DNASTAR (DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA). 본 출원의 범주 내에서, 서열 분석 소프트웨어는 분석을 위해 사용될 경우, 분석 결과는 달리 규정되지 않는 한, 참고된 프로그램의 "디폴트 값(default value)"에 기반한 것임이 이해될 것이다. 여기 사용된 "디폴트 값"은 처음 초기화될 때 소프트웨어에 처음부터 로드되는 임의의 값 또는 파라미터 세트를 의미할 것이다.
본 발명에서 사용하는 용어, "발현" 또는 "유전자 발현"은 유전자의 "전사"를 통해 (즉, RNA 중합효소의 효소적 활동을 통해), 유전자에 코딩된 유전 정보를 RNA (예를 들면, mRNA, rRNA, tRNA, 또는 snRNA)로 전환하고, 단백질 코딩 유전자에 대하여, mRNA의 "번역"을 통해 단백질로 전환하는 과정을 말한다. 상기 과정에서 유전자 발현은 여러 단계에서 조절될 수 있다. "상향조절(upregulation)" 또는 "활성화"는 유전자 발현 산물 (즉, RNA 또는 단백질)의 생산을 증가시키는 조절인 반면에, "하향-조절(down-regulation)" 또는 "억제"는 생산을 감소시키는 조절을 말한다. 상향-조절 또는 하향-조절에 관련된 인자들 (예를 들면, 전사 인자)은 종종 각각 "활성인자" 및 "억제인자"로 불리운다. 본 발명의 목적을 위하여, 목표 유전자는 하향-조절하는 RNA 분자에 특이적인 상호작용을 통해서 "후-전사적으로" (즉, RNA 전사체의 수준에서) 하향-조절될 수 있다.
용어 "전사적 및 번역적 조절 서열"은 프로모터, 인핸서, 터미네이터 등과 같이 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현을 제공하는 DNA 조절 서열을 말한다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 하나의 기능이 다른 것에 의해 영향받도록 단일 핵산 단편에 핵산 서열을 결합시키는 것을 말한다. 예를 들면, 프로모터는 코딩 서열의 발현에 영향을 줄 수 있는 경우 (즉, 코딩 서열은 프로모터의 전사적 조절 하에 있음), 코딩 서열과 작동가능하게 연결된다. 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 오리엔테이션에서 조절 서열과 작동가능하게 연결될 수 있다.
"벡터"는 숙주 세포로 핵산의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위 (replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 핵산을 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 매개물을 포함한다. 용어 "벡터"는 또한 미니구형 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 박테리아 DNA 서열을 갖지 않는 플라스미드일 수 있다. CpG 영역에서 풍부한 박테리아 DNA 서열의 제거는 전이유전자 발현 사일런싱을 감소시키고 플라스미드 DNA 벡터로부터 보다 지속적인 발현을 가져오기 위해 행해지고 있다 (예를 들면, Ehrhardt, A. et al. (2003) Hum Gene Ther 10: 215-25; Yet, N. S. (2002) MoI Ther 5: 731-38; Chen, Z. Y. et al. (2004) Gene Ther 11 : 856-64) 참조. 용어 "벡터"는 또한 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)같은 트랜스포존(Izsvak et al. J. MoI. Biol. 302:93-102 (2000)), 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다.
당해 기술에서 잘 알려진 수많은 벡터는 핵산을 조작하고 유전자 등에 프로모터나 반응 단위를 통합시키거나 숙주 세포내로 핵산을 전이시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 사용가능한 벡터는 플라스미드나 람다 변이체와 같은 박테리오파지를 포함하는 변형된 바이러스, 또는 pBR322 또는 pUC 플라스미드 변형체와 같은 플라스미드, 또는 블루스크립트 벡터를 포함한다. 인공 염색체 (박테리아 (BAC), 효모 (YAC), 또는 인간 (HAC)) 와 같은 큰 벡터가 더 큰 삽입에 적합하도록 사용할 수 있다. 예를 들면, 적절한 벡터로의 반응 단위 또는 프로모터에 대응하는 DNA 단편의 삽입은 적절한 DNA 단편을 상보적인 점착 말단을 갖는 선택된 벡터 내로 결합시킴에 의해 수행될 수 있다. 또한, DNA 분자의 말단은 효소적으로 변형될 수 있거나 임의의 부위가 뉴클레오티드 서열 (링커)을 DNA 말단에 결합시킴에 의해 생산될 수 있다. 그러한 벡터는 벡터로 형질전환되거나 트랜스펙트되는 세포의 선택을 위해 제공되는 선택적 마커 유전자를 포함하도록 공학적으로 조작될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터는 그들의 증폭 또는 발현이 추구되는 세포 숙주내에서 하나 이상의 복제 기원, 마커 또는 선택적 마커를 포함할 수 있다.
용어 "선택적 마커"는 동정하는 인자를 말하며, 일반적으로 마커 유전자의 효과에 기반하여 선택될 수 있는, 즉, 항체적, 제초제 저항성, 측색적 마커, 효소, 형광 마커 등의 항체 또는 화학적 저항성 유전자이며, 여기서 상기 효과는 관심 핵산의 유전을 추적하고/추적하거나 관심 핵산을 물려받은 세포 또는 유기체를 동정하거나 선택하기 위해 이용된다. 공지되었거나 당해 기술에서 사용되는 선택적 마커 유전자의 예는 하기를 포함한다: 앰피실린, 스트렙토마이신, 젠다마이신, 카나마이신, 하이그로마이신, 비알라포스 제초제, 설폰아미드 등에 저항성을제공하는 유전자; 및 표현형 마커로서 사용되는 유전자, 즉, 안토시아닌 조절 유전자, 이소펜타닐 전이효소 유전자 등.
용어 "리포터 유전자"는 리포터 유전자의 효과에 기초하여 동정될 수 있는 동정하는 인자를 코딩하는 핵산을 말하며, 여기서 상기 효과는 관심 핵산의 유전을 추적하거나 관심 핵산을 물려받은 세포나 유기체를 동정하기 위해, 및/또는 유전자 발현 유도 또는 전사를 측정하기 위해 사용된다. 공지되고 당해 기술에서 사용되는 리포터 유전자의 예는 하기를 포함한다: 루시퍼라제 (Luc), 녹색 형광 단백질 (GFP)와 같은 형광 단백질, 클로르암페니콜 아세틸전이효소 (CAT), 베타-갈락토시다아제 (LacZ), 베타-글루쿠로니다아제 (Gus) 등. 선택적 마커 유전자는 또한 리포터 유전자로 간주될 수 있다.
용어 "플라스미드"는 세포의 중추적 대사의 일부가 아닌 유전자를 종종 전달하는 외부-염색체 단위를 말하며, 일반적으로 원형 이중-가닥 DNA 분자의 형태를 한다. 그러한 단위는 자가 복제 서열, 게놈 인테그레이팅 효소, 파지 또는 뉴클레오티드 서열, 임의의 출처로부터 유래된 선형, 원형, 또는 슈퍼 코일형, 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 많은 수의 뉴클레오티드 서열이 세포 내로 적절한 3' 비번역 서열과 함께 프로모터 단편 및 선택된 유전자 산물에 대한 DNA을 도입시킬 수 있는 특정 컨스트럭션 내로 결합되어지거나 재조합된다.
"클로닝 벡터"는 핵산의 단위 길이인 "복제단위", 예를 들면, 플라스미드, 파지 또는 코스미드와 같은 복제 기원을 포함하고 순차적으로 복제하며, 다른 핵산 단편이 결합되어, 결합된 단편의 복제를 가져오기 위한 것인 DNA를 말한다. 클로닝 벡터는 하나의 세포 유형에서 복제가 가능할 수 있고, 다른 유형에서는 발현이 가능할 수 있다 ("셔틀 벡터").
"발현 벡터"는 삽입된 핵산 서열이 숙주 세포 내로 형질전환되어 발현되도록 하는 벡터, 플라스미드 또는 매개체를 말한다. 클론된 유전자, 즉, 삽입된 핵산 서열은 일반적으로 프로모터, 최소 프로모터, 또는 인핸서 등과 같은 조절 인자의 조절 하에 놓여진다. 숙주 세포에서 핵산의 발현을 유도하는데 유용한 초기 조절 영역 또는 프로모터는 당해 기술에서 다수이며 잘 알려져 있다.
벡터는 당해 기술에서 알려진 방법, 예를 들면, 트랜스펙션, 전기천공법, 미세주입법, 트랜스덕션, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 칼슘 인산 침전, 리포펙션 (리소좀 융합), 유전자 총의 사용, 또는 DNA 벡터 운반자에 의해 원하는 숙주 세포내로 도입될 수 있다 (예를 들면, Wu et al, J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992); Wu et al, J. Biol. Chem. 263:14621-14624 (1988); 및 Hartmut et al., Canadian Patent Application No. 2,012,311, filed March 15, 1990 참조).
진핵 벡터의 예는 스트라타진에서 입수가능한 pW-LNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl 및 pSG; 아머샴 파마시아 바이오테크에서 입수가능한 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL; 및 클론테크에서 입수가능한 pCMVDsRed2-express, pIRES2-DsRed2, pDsRed2-Mito, pCMV-EGFP.
예를 들면, 빠른 삽입을 위한 분자적 삽입 피봇과 유전자 프로그램의 인자들의 제거를 포함한 유용한 벡터는 미국 공개 특허 출원 제2004/0185556호, 미국 특허 출원 제 11/233,246호 및 국제공개출원 제WO 2005/040336호 및 제WO 2005/116231호에 개시되어 있다.
"프로모터" 및 "프로모터 서열" 은 교환가능하게 사용되며 코딩 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 말한다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열에 대하여 3' 에 위치한다. 프로모터는 천연 유전자로부터 그 전체가 유래할 수도 있고, 또는 자연에서 발견되는 서로 다른 프로모터로부터 서로 다른 요소들로 구성될 수도 있고, 또는 합성 DNA 절편을 포함할 수도 있다. 당업자는 서로 다른 프로모터가 서로 다른 조직 또는 세포 타입에서, 또는 발생의 서로 다른 단계에서, 또는 서로 다른 환경적 또는 생리학적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있음을 이해할 수 있다.
유전자가 대부분의 시간에 대부분의 세포 타입에서 발현되도록 하는 프로모터를 보통 "구성적 프로모터(constitutive promoter)" 라고 한다. 유전자가 특정한 세포 타입에서 발현되도록 하는 프로모터를 보통 "조건적 프로모터(conditional promoder)" 라고 한다. 조건적 프로모터의 비제한적인 예로는 "세포 특이적 프로모터(cell-specific promoter)" 또는 "조직 특이적 프로모터(tissue-specific promoter)" 가 있다. 유전자가 발생 또는 세포 분화의 특이적 단계에서 발현되도록 하는 프로모터를 보통 "발생학적으로 특이적인 프로모터(developmentally-specific promoter)" 또는 "세포 분화 특이적 프로모터(cell differentiation-specific promoter)" 라고 한다. 프로모터를 유도하는 제제, 생물학적 분자, 화합물, 리간드, 빛 등을 세포에 노출시키거나 처리한 후에 유전자가 발현되도록 하고 유도되는 프로모터를 보통 "유도성 프로모터(inducible promoter)" 라고 한다. 유도성 프로모터의 비제한적인 예로는 TetO 유도성 프로모터가 있다. 또한 대부분의 경우 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 정의되지 않고 있기 때문에, 다른 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있음이 알려져 있다.
프로모터 서열은 전형적으로 전사 개시 부위에 의하여 그 3' 말단에 경계가 생기며, 상기 배경을 검출할 수 있는 수준에서 전사를 개시하는데 필요한 최소한의 염기 또는 요소를 포함하기 위하여 상류 (5' 방향) 로 확장한다. 프로모터 서열 내에는 RNA 중합효소의 결합을 맡고 있는 단백질 결합 도메인 (보존 서열) 뿐만 아니라 (예를 위해서 편의상 정의하면, 뉴클레아제 S1 의 맵핑에 의해) 전사 개시 부위가 발견될 것이다.
코딩 서열은 RNA 중합효소가 코딩 서열을 mRNA 로 전사할 때 세포에서 전사 및 번역 조절 서열의 "조절 하에" 있으며, 다음으로 (만약 코딩 서열이 인트론을 포함하는 경우) 트랜스-RNA로 절단되고 코딩 서열에 의해 코딩되는 단백질로 번역된다.
말단 조절 영역, 즉, 터미네이터 또는 폴리아데닐화 서열 또한 바람직한 숙주에 본래 있는 다양한 유전자로부터 유래할 수 있다. 선택적으로, 말단 부위는 불필요할 수 있으나, 포함될 수 있다. 본 발명의 하나의 구체예로서, 말단 조절 영역은 합성 서열, 합성 폴리아데닐화 시그널, SV40 후기 폴리아데닐화 시그널, SV40 폴리아데닐화 시그널, 우성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 시그널, 바이러스 말단 서열 등에서 유래하거나 포함될 수 있다.
용어 "트랜스펙션" 은 세포에 외생의 또는 이종의 RNA 또는 DNA 가 도입되는 것을 말한다. 세포는 외생 또는 이종의 RNA 또는 DNA 가 세포 안으로 도입되었을 때 외생 또는 이종의 RNA 또는 DNA 에 의해 "트랜스펙션되었다". 트랜스펙션된 RNA 또는 DNA 는 숙주 세포의 게놈을 구성하는 염색체 DNA 안으로 삽입(공유결합적으로 연결)될 수 있다.
"형질전환" 은 핵산 단편이 숙주 유기체의 게놈 안으로 이동하여 유전적으로 안정한 유전을 일으키는 것을 말한다.
용어 "조절하다(modulate)" 및 "조절하다(modulates)" 는 핵산 또는 유전자 발현을 유도하거나 감소시키거나 억제하여, 단백질 또는 폴리펩티드 생산 각각의 유도, 감소 또는 억제를 일으키는 것을 의미한다.
"RNA 전사체" 는 DNA 서열의 RNA 중합효소-촉매된 전사에 의한 산물을 말한다. RNA 전사체가 DNA 서열의 완벽한 상보적인 카피일 때, 이를 일차 전사체(primary transcript) 라고 부르며, 또는 일차 전사체의 번역 후 프로세싱에서 유래한 RNA 서열일 수 있어 이를 성숙한 RNA 라고 부른다. "메신저 RNA(mRNA)" 는 인트론이 없는 RNA를 말하며 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있다. "cDNA" 는 mRNA 로부터 유래하고 mRNA 에 상보적인 이중 가닥 DNA 를 말한다. "센스" RNA 는 mRNA 를 포함하는 RNA 전사체를 말하며 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예는 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편 및 두번째 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 합성 5'UTR 폴리뉴클레오티드로서, 상기에서 :
a. 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편은 첫번째 진핵 유전자의 적어도 하나의 절단 부위를 포함하고;
b. 두번째 폴리뉴클레오티드 단편은 두번째 진핵 유전자의 5' 비번역 영역의 적어도 일부를 포함하고; 및
c. 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편은 두번째 폴리뉴클레오티드 단편의 5' 에 위치한다.
본 발명의 또다른 구체예로서, 합성 5'UTR 은 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편 및 두번째 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 키메릭 폴리뉴클레오티드로서, 상기에서 :
a. 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편은 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 두번째 인트론을 포함하고;
b. 두번째 폴리뉴클레오티드 단편은 카세인 유전자의 5' 비번역 영역(5'UTR)의 적어도 일부를 포함하고; 및
c. 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편은 두번째 폴리뉴클레오티드 단편의 5' 에 위치한다.
근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 두번째 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 임의의 진핵 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자에서 유래할 수 있다. 본 발명의 하나의 구체예로서, 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 두번째 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 SERCA2 유전자에서 유래할 수 있다. 또다른 구체예로서, 그것은 SERCA1 또는 SERCA3 유전자에서 유래한다. 두번째 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편의 기원이 되는 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자는 임의의 진핵생물 종에서 유래할 수 있다. 하나의 구체예로서, 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자는 포유동물 종에서 유래된다. 또다른 구체예로서, 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자는 조류 종에서 유래된다. 또다른 구체예로서, 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자는 어류 종에서 유래된다. 특정한 구체예로서, 두번째 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 인간, 개, 또는 마우스의 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자에서 유래된다. 또다른 특정한 구체예로서, 두번째 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 랫트, 침팬지, 닭, 말, 소, 엘크(elk), 돼지, 고양이, 붉은털원숭이(rhesus macaque), 또는 제브라피쉬의 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자에서 유래된다.
본 발명의 또다른 구체예로서, 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 두번째 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 5' 말단에 인접한 엑손 2의 부분 및 3' 말단에 인접한 엑손 3의 일부를 포함한다. 또다른 구체예로서, 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 두번째 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 5' 에 인접한 엑손 2의 전체 및 3' 말단에 인접한 엑손 3의 전체를 포함한다.
근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 두번째 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 적어도 약 50 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 또다른 구체예로서, 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 두번째 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 적어도 약 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 또는 250 길이일 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예로서, 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 두번째 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 보존(consensus) 폴리 A 부위로 추정되는 곳에서 돌연변이된다. 또다른 구체예로서, 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 두번째 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 엑손 2의 5' 인접 부분 및 엑손 3의 3' 인접 부위를 포함하고, 보존 폴리 A 부위로 추정되는 곳에서 돌연변이되고, 및 개의 SERCA2 유전자에서 유래한다; 특정한 구체예에서 서열번호 2에 의해 나타낸다.
또다른 구체예로서, 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 두번째 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 야생형 또는 돌연변이된 부분적 SERCA2 서열이다. 폴리뉴클레오티드 단편은 임의의 종의 임의의 전장 SERCA2 유전자에서 유래될 수 있다. 예를 들어, 하나의 구체예에서, 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 두번째 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 5' 말단에 인접한 엑손 2의 일부 및 3' 말단에 인접한 엑손 3의 일부를 포함하는 야생형 개의 부분적 SERCA2 게놈 서열이다; 특정한 구체예에서 서열번호 4로 나타낸다. 서열번호 4는 도 1a 및 도 1c 에 도식적으로 나타냈다. 또다른 구체예로서, 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 두번째 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 5' 말단에 인접한 엑손 2의 일부 및 3' 말단에 인접한 엑손 3의 일부를 포함하는 야생형 인간의 부분적 SERCA2 게놈 서열이다; 특정한 구체예에서 서열번호 5로 나타낸다. 또다른 구체예로서, 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 두번째 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 5' 말단에 인접한 엑손 2의 일부 및 3' 말단에 인접한 엑손 3의 일부를 포함하는 야생형 쥐의 부분적 SERCA2 게놈 서열이다; 특정한 구체예에서 서열번호 6으로 나타낸다. 서열번호 5 및 서열번호 6은 도 1b 및 도 1c 에 도식적으로 나타냈다. 또다른 구체예로서, 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 두번째 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 돌연변이 또는 야생형의 부분적인 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus) SERCA2 서열, 에쿠우스 카발루스(Equus caballus) SERCA2 서열, 보스 타우루스(Bos Taurus) SERCA2 서열, 판 트로글로디테스(Pan troglodytes) SERCA2 서열, 펠리스 카투스(Felis catus) SERCA2 서열, 오르토라구스 쿠니쿠루스(Ortolagus cuniculus) SERCA2 서열, 수스 스크로파(Sus scrofa) SERCA2 서열, 마카카 뮤라타(Macaca mulatta) SERCA2 서열, 세르부스 에라푸스(Cervus elaphus) SERCA2 서열, 갈루스 갈루스(Gallus gallus) SERCA2 서열, 또는 다니오 레리오(Danio rerio) SERCA2 서열이다.
카세인 유전자 5' 비번역 영역의 적어도 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 적어도 약 25 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 또다른 구체예에서, 적어도 5'UTR 의 부분을 포함하는 카세인 유전자의 폴리뉴클레오티드 단편은 적어도 약 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 85, 90, 100 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 또다른 구체예로서, 적어도 카세인 유전자 5'UTR 의 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 천연의 5'UTR 서열의 적어도 약 50% 를 나타낼 수 있다. 또다른 구체예로서, 적어도 카세인 유전자 5'UTR 의 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 천연의 5'UTR 서열의 적어도 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상을 나타낼 수 있다. 또다른 구체예로서, 적어도 카세인 유전자 5'UTR 의 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 전체 천연의 5'UTR 서열을 나타낼 수 있다.
또 하나의 구체예로서, 개별 구성요소의 기능적 변이체(근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 두번째 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편 및 카세인 유전자의 5'UTR 의 적어도 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편)는 합성 5'UTR을 생성하는데 사용된다. 기능적 변이체는 치환, 삽입 및 결실 변이체 및 이들의 조합을 포함한다. 결실 변이체는 뉴클레오티드 서열에서 적어도 하나의 염기가 제거되고 다른 염기가 그 자리에 삽입된 변이체이다. 핵산의 삽입 변이체는 하나 이상의 뉴클레오티드가 서열 내 미리 결정된 부위에 도입된 변이체이다. 핵산의 결실 변이체는 하나 이상의 뉴클레오티드가 핵산으로부터 제거된 것으로 특징지워진다. 치환, 결실 또는 삽입의 임의의 조합은 구성요소의 기능이 온전히 동일하게 남아 있도록, 즉 본 발명의 합성 5'UTR 을 사용하였을 때 기능성 변이체가 관심있는, 합성 유전자, 또는 전이유전자(transgene) 서열의 증가된 발현을 유도하도록 한다.
또한, 본원에 개시된 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 두번째 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편의 특정한 구체예에 상동인 서열(서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 5, 및 서열번호 6) 및 적어도 카세인의 5'UTR 의 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편의 특정한 구체예에 상동인 서열(서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 9, 및 서열번호 10) 은 합성 5'UTR 을 제조하는데 사용될 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 합성 5'UTR 을 제조하기 위한 단편의 적당한 기원은 임의의 진핵생물 종의 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자 및 임의의 포유동물 종의 카세인 유전자를 포함한다. 하나의 구체예로서, 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 두번째 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 개의 SERCA2, 마우스 SERCA2, 또는 인간 SERCA2 의 상동유전자(orthologue) 에서 유래한다. 또다른 구체예로서, 카세인의 5'UTR 의 적어도 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 소의 카세인-베타, 마우스 카세인-베타, 랫트 카세인-베타, 또는 양의 카세인 베타의 상동유전자(orthologue) 에서 유래한다.
근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 상동체 또는 카세인 5'UTR 상동체의 검색 및 확인 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 방법은 컴퓨터로 판독가능한 포맷에서, GAP (Needleman and Wunsch, J. MoL Biol. 48; 443453 (1970)), BESTFIT (Miller, W., Myers, E. W. & Lipman, D. J., J. MoL Biol. 215:403-410 (1990)), FASTA and TFASTA (W. R. Pearson and D. J. Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444- 2448 (1988))와 같은, 서열의 정렬 또는 비교를 위해 당업계에 잘 알려진 알고리즘을 사용하여, 서열번호 2-6 및 8-10 으로 나타내는 서열과 MIPS, GenBank, 또는 EMBL 뉴클레오티드 서열 데이터베이스와 같은 월드 와이드 웹상에서 이용가능한 공용의 데이터베이스에서 이용가능한 서열을 비교하는 것을 포함한다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립생물정보센터(National Centre for Biotechnology Information) 를 통해 공개적으로 이용하능하다. 적절한 상동체는 BLAST 디폴트 파라미터(BLOSUM62 매트릭스, 갭 오프닝 페널티 11 및 갭 엑스텐션 패널티 1) 를 사용하여 확인할 수 있다.
또한, 개, 인간, 또는 마우스 SERCA2 에 대한 상동체는 SERCA2 유전자 내에 보존된 서열을 검색함으로써 확인할 수도 있다. 예를 들어, 서열번호 11과 같은 개의 SERCA2 의 엑손 3의 전체 서열은 BLAST 검색에서 쿼리(query) 서열로 사용될 수 있다. 인트론 서열을 포함하는 서열을 사용하는 것보다 BLAST 검색에서 쿼리 서열로서 엑손 서열을 사용하는 것이 더 많은 수의 SERCA2 상동체를 검색할 것이다. 유사하게, 소, 마우스, 랫트 또는 양의 카세인-베타에 대한 상동체는 쿼리 서열로서 코딩 부분을 사용함으로써 확인할 수 있다.
근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 상동체 또는 소 카세인 5'UTR 상동체의 확인을 위한 게놈 서열의 분석 역시 가능하다. 로(raw) DNA 서열에서 유전자의 확인을 위한 여러 알고리즘 및 소프트웨어를 이용할 수 있다. 보통 이러한 도구들은 DNA 서열에서 통계적 파라미터들의 분석과, 데이터베이스에서 상동성 있는 서열을 확인하기 위한 상동성-기반 방법을 조합한다. 비록 이들 방법 중 어느 것도 단독으로는 타당한 예측에 충분하다고 신뢰를 할 수 없지만, 다양한 프로그램의 조합은 보통 타당한 결과를 가져온다. 웰드 와이드 웹 상에서 공공적으로 이용가능한 이러한 도구들의 잘 알려진 예로는 GeneMark (Borodovsky, M. and Mclninch J. GeneMark: Parallel Gene Recognition for both DNA Strands. Computers & Chemistry, 17, 123-133 (1993)), Gene Locator 및 Interpolated Markov Modeler (GLIMMER) (A. L. Delcher et al. Improved microbial gene identification with GLIMMER. Nucleic Acids Research, 27, 4636-4641. (1999)), Gene Recognition 및 Assembly Internet Link (GRAIL), GenScan (Burge, C. and Karlin, S. Prediction of complete gene structures in human genomic DNA. J. MoL Biol. 268, 78-94 (1997)), 및 GeneBuilder (Milanesi L. et al. GeneBuilder: interactive in silico prediction of genes structure. Bioinformatics, 15 (7):612- 621 (1999)) 를 포함한다. 조합된 분석은 GeneMark, GlimmerM, GRAIL, GenScan, 및 Fgenes 와 같은 다른 주석프로그램(annotation software)으로부터의 결과물을 사용하여 유전자 모델을 예측할 수 있는 TIGR Combiner 프로그램(J. E. Allen et al. Computational gene prediction using multiple sources of evidence. Genome Research, 14(1), 142-148 (2004)) 으로 수행할 수 있다.
근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 두번째 인트론은 쌍정렬(pairwise alignment) 프로그램에서 유전자의 게놈 DNA 서열을 그의 mRNA 또는 cDNA 서열과 비교하는 것과 같은 통상적인 방법을 통하여 확인될 수 있다. cDNA 서열 내에는 없으나 게놈 DNA 에는 존재하는 개재 서열(intervening sequence)이 인트론을 나타내ㄱ고상동성 영역은 엑손을 나타낸다. 인트론 서열의 시작과 끝은 그의 인접한 5' GT 및 인접한 3' AG 를 통하여 확인될 수 있다. 이러한 접근을 사용하여, 인간 및 마우스 SERCA2 mRNA 서열(각각 NM_170665 및 NM_009722) 이 각 게놈 서열에서 인트론을 확인하는데 사용되고, 공공의 등록번호 NM_001003214로 나타내는 개 SERCA2 mRNA 서열은 개 SERCA2 게놈 서열 내의 인트론을 확인하는 데 유용하다.
근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 상동체 또는 카세인 5'UTR 상동체는 다른 종의 게놈 또는 cDNA 단편 라이브러리를 탐지함으로써 확인될 수 있다. 예를 들어, 관심있는 종의 게놈 DNA 는 플라스미드 또는 람다 벡터와 같은 선택된 벡터 안으로 삽입되기 위하여 적절한 크기의 단편으로 단편화될 수 있다. 이 벡터는 다음으로 적절한 제한효소에 의해 절단되고 게놈 단편의 완전한 혼합물로 연결된다. 박테리아 세포가 벡터로 형질전환 되고 아가로스 플레이트에 접종된다. 그 후 콜로니 또는 파지 플라크 DNA 는 막에 부착된다. 하나의 구체예로서, 서열번호 2-6 및 8-10으로 나타내는 단편 또는 그의 부분은 상동성 서열을 포함하는 라이브러리의 클론의 DNA 에 혼성화하기 위하여 표지된 프로브로서 사용된다. 유사한 과정이 cDNA 라이브러리를 선별하는데 사용될 수 있다. 또한, 상동체는 게놈 또는 cDNA 써던 혼성화 실험(Southern hybridization experiment)을 위해 표지된 프로브로서 서열번호 2-6 및 8-10으로 나타내는 단편 또는 그의 부분을 사용함으로써 확인될 수 있다.다른 구체예로서, (서열번호 11과 같은) 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자 또는 카세인 유전자 또는 그의 부분의 코딩 영역을 포함하는 것들과 같은 보다 보존된 서열은 써던 혼성화 실험에서 프로브로서 또는 라이브러리 스크리닝을 위하여 사용된다.
적절한 혼성화 조건은 온도, 염 농도, 또는 % 포름아미드의 적절한 조합을 통하여 혼성화 실험의 엄밀도(stringency)를 감소시킴으로써 다른 종으로부터의 프로브를 단편(부분적으로 미스매치된 프로브-타겟 하이브리드)과 혼성화되도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 염 농도를 증가시키는 온도를 감소시킴으로써 혼성화 실험의 엄밀도(stringency)가 낮아질 수 있다. 절절한 혼성화 조건을 확인하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York 에 기재되어 있다.
본 발명의 다른 구체예는 서열번호 1-10 중의 하나로 나타내는 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명의 다른 구체예는 서열번호 2 및 4-6 중의 하나로 나타내는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 3 및 8-10 중의 하나로 나타내는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 합성 5'UTR 이다.
본 발명의 다른 구체예는 서열번호 2 및 4-6 중의 하나로 나타내는 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 3 및 8-10 중의 하나로 나타내는 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 합성 5'UTR 이다.
본 발명의 다른 구체예는 서열번호 1로 나타내는 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 합성 유전자 컨스트럭트이다.
본 발명의 다른 구체예는 서열번호 7로 나타내는 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 합성 유전자 컨스트럭트이다.
또다른 구체예로서, 합성 5'UTR 서열은 본원에 참고문헌으로서 전체가 통합되는, WO 2007/038276에 기재된 바와 같이 UltraVector Production System (Intrexon Corp., Blacksburg, VA)으로 삽입되는 것을 방해할 수 있는 제한부위를 결여한다. 특정한 구체예로서, 합성 5'UTR 서열은 다음의 제한 엔도뉴클레아제들에 대한 내부 인지 서열을 결여한다 : AsiS I, Pac I, Sbf I, Fse I, Asc I, Mlu I, SnaB I, Not I, Sal I, Swa I, Rsr II, BsiW I, Mfe I, Nhe I, Nsi I, Cla I, Nde I, Nsi I, Kpn I, Nco I 및 Pst I.
합성 5'UTR 서열은 벡터에 클로닝을 촉진하기 위하여 5' 및 3' 말단에 제한부위를 선택적으로 포함한다. 특정한 구체예로서, 합성 5'UTR 서열은 5' 말단에 Mlu I 인지 서열 및 3' 말단에 Mfe I 인지 서열을 포함한다.
특정한 구체예로서, 합성 5'UTR 은 서열번호 1로 나타낸다. 서열번호 1은 다음의 특징을 포함한다 : Mlu I 제한부위, 서열번호 2, Kpn I 제한부위, 서열번호 3, Mfe I 제한부위. 서열번호 1은 도 2a 에 도식적으로 나타낸다.
또다른 특정 구체예로서, 합성 5'UTR 은 서열번호 7로 나타낸다. 서열번호 7은 다음의 특징을 포함한다 : Asc I 제한부위, Mlu I 제한부위, 서열번호 4, Kpn I 제한부위, 서열번호 3, Mfe I 제한부위. 서열번호 7은 도 2b에 도식적으로 나타낸다.
하나의 구체예로서, 합성 5'UTR 은 약 500 뉴클레오티드 미만의 길이이다. 다른 구체예로서, 합성 5'UTR 은 약 400 뉴클레오티드 미만의 길이이다. 다른 구체예로서, 합성 5'UTR 은 약 350 뉴클레오티드 미만의 길이이다. 다른 구체예로서, 합성 5'UTR 은 약 300 뉴클레오티드 미만의 길이이다. 다른 구체예로서, 합성 5'UTR 은 약 240 뉴클레오티드 미만의 길이이다. 다른 구체예로서, 합성 5'UTR 은 약 200 뉴클레오티드 미만의 길이이다.
본 발명의 다른 구체예로서, 합성 5'UTR 폴리뉴클레오티드는 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편 및 두번째 폴리뉴클레오티를 포함하는, 진핵 발현 벡터의 구성요소이며, 상기에서 :
a. 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편은 첫번째 진핵 유전자의 적어도 하나의 절단 부위를 포함하고;
b. 두번째 폴리뉴클레오티드 단편은 두번째 진핵 유전자의 5' 비번역 영역(5'UTR)의 적어도 일부를 포함하고; 및
c. 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편은 두번째 폴리뉴클레오티드 단편의 5' 에 위치한다.
하나의 구체예로서, 적어도 하나의 절단 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 본원에 기재된 진핵 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 단편이다. 다른 구체예로서, 5' 비번역 영역의 적어도 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 본원에 기재된 카세인 유전자의 단편이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 합성 5'UTR 을 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터는 본원에 기재된 합성 5'UTR 폴리뉴클레오티드 서열의 임의의 구체예를 포함하도록 고려될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 구체예는 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 두번째 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편 및 카세인 유전자의 5'UTR 의 적어도 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 합성 5'UTR 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터이다.
본 발명의 다른 구체예는 서열번호 1-10 중의 하나로 나타내는 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다.
다른 구체예로서, 벡터는 합성 5'UTR 을 포함하는 합성 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터이다. 합성 유전자 컨스트럭트는 합성 5'UTR 의 한 말단에 인접한 프로모터 및 합성 5'UTR 의 다른 말단에 인접하여 발현될 관심 서열을 포함할 수 있다. 합성 유전자 컨스트럭트는 폴리아데닐화 부위를 더욱 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 다른 구체예는 5'에서 3' 방향으로, 프로모터, 키메릭 폴리뉴클레오티드, 및 발현될 관심 서열을 포함하는 합성 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터이며, 상기에서 :
a. 키메릭 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 절단 부위를 포함하는 첫번째 진핵 유전자의 폴리뉴클레오티드 단편 및 5' 비번역 영역(5'UTR)의 적어도 일부를 포함하는 두번째 진핵 유전자의 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하고; 및
b. 키메릭 폴리뉴클레오티드는 프로모터 및 발현될 관심 서열 사이에 위치하고, 상기에서 첫번째 진핵 유전자의 폴리뉴클레오티드 단편은 프로모터 방향에 위치하고 두번째 진핵 유전자의 폴리뉴클레오티드 단편은 발현될 관심 서열 방향에 위치한다.
도 3a 는 벡터 골격(backbone)에 삽입된 본 발명의 합성 유전자 컨스트럭트의 구체예를 도식적으로 나타낸다. 이 구체예에서, 도 3a에서 SPL 은 적어도 하나의 절단 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편을 말하며 UTR 은 5' 비번역 영역의 적어도 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편을 말한다. SPL 및 UTR 은 함께 합성 5'UTR 을 구성한다. 합성 유전자 컨스트럭트의 프로모터는 합성 5'UTR 및 관심 서열의 RNA 발현을 지시하도록 위치한다. 또한, 발현될 관심 서열은 전사를 개시하기 위한 개시 코돈을 포함한다.
이러한 벡터 구성을 포함하는 대표적인 발현 벡터가 도 10 및 도 11에 도식적으로 표현되어 있다. 도 10의 벡터의 서열은 서열번호 12로 제공되며; 도 11의 벡터의 서열은 서열번호 13으로 제공된다.
또다른 구체예로서, 벡터는 5'에서 3' 방향으로, 프로모터, 키메릭 폴리뉴클레오티드, 및 클로닝 부위를 포함하는 발현 벡터이며, 상기에서 :
a. 키메릭 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 절단 부위를 포함하는 첫번째 진핵 유전자의 폴리뉴클레오티드 단편 및 5' 비번역 영역(5'UTR)의 적어도 일부를 포함하는 두번째 진핵 유전자의 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하고; 및
b. 키메릭 폴리뉴클레오티드는 프로모터 및 발현될 관심 서열 사이에 위치하고, 상기에서 첫번째 진핵 유전자의 폴리뉴클레오티드 단편은 프로모터 방향에 위치하고 두번째 진핵 유전자의 폴리뉴클레오티드 단편은 발현될 관심 서열 방향에 위치한다.
발현 벡터의 클로닝 부위는 관심서열이 삽입될 수 있도록 하나 이상의 고유 제한부위를 포함할 수 있다. 다른 구체예로서, 클로닝 부위는 관심 서열이 부위 특이적 재조합에 의해 삽입될 수 있도록 재조합 효소(recombinase) 부착 부위를 포함할 수 있다.
발현 벡터의 구체예는 도 3b 에 도식적으로 표현되어 있다. 도 3b 에서, SPL 은 절단 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편을 말하며 UTR 은 5' 비번역 영역의 적어도 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편을 말한다. SPL 및 UTR 은 함께 합성 5'UTR 을 구성한다.
발현 벡터에서 절단 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 임의의 진핵 유전자의 단편일 수 있다. 발현 벡터 내에 사용될 수 있는 대표적인 폴리뉴클레오티드 단편은 본원에 기재된 진핵 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 절단 부위를 포함하는 것들을 포함한다. 또한, 5' 비번역 영역의 적어도 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 임의의 진핵 유전자의 단편일 수 있다. 발현 벡터 내에 사용될 수 있는 대표적인 폴리뉴클레오티드 단편은 적어도 본원에 기재된 카세인 유전자의 5'UTR 의 부분을 포함하는 것들을 포함한다.
본 발명의 발현 벡터는 관심 서열에 의해 코딩된 폴리펩타이드와 인프레임 융합을 생성하기 위하여, 관심 서열 또는 클로닝 부위의 다운스트림에 하나 이상의 추가적인 폴리뉴클레오티드 서열을 더욱 포함할 수 있다. 예를 들어, 관심 서열의 다운스트림의 추가적인 폴리뉴클레오티드는 에피톱 태그, 리포터, 또는 정제 태그를 코딩할 수 있다. 에피톱 태그는 당업게에 알려져 있으며 myc, 헤마글루티닌 (HA), 및 FLAG 를 포함한다. 리포터의 예로는 녹색 형광 단백질 및 이의 변이체, 베타-갈락토시다아제(LacZ), 베타-글루쿠로니다아제(Gus) 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT) 및 루시페라아제를 포함한다. 정제 태그의 예로는 His6 및 GST 를 포함한다. 발현 벡터는 또한 관심 서열 또는 클로닝 부위의 다운스트림에 폴리A 부위를 포함할 수 있다.
바람직한 결과에 따라, 합성 5'UTR 을 포함하는 발현 벡터의 프로모터 부분은 구성적 프로모터, 비-구성적 프로모터, 조직-특이적 프로모터 (구성적 또는 비-구성적), 발병(pathogenesis) 또는 질환 관련 프로모터, 발생학적으로 특이적인 프로모터, 또는 유도성 프로모터와 같이 선별적으로 조절된 프로모터일 수 있다. 다른 선별적으로 조절된 프로모터는 다른 메커니즘에 의하여 조절된다. 예를 들어, 테트라사이클린-유도성 프로모터는 프로모터 및 다른 필요한 세포성 인자들을 포함하는 세포에 테트라사이클린을 처리했을 때 다운스트림 코딩 서열이 발현하도록 활성화된다. 다른 유도성 프로모터는 다른 약물 또는 인자들에 의해 활성화된다. RHEOSWITCH 는 New England Biolabs (Ipswich, MA) 로부터 이용가능한 유도성 프로모터 시스템이다. 온도 민감성 프로모터 또한 유전자 발현을 증가시키거나 감소시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 구체예는 유도성 프로모터에 의해 그 발현이 조절되는 합성 5'UTR 을 포함하는 유전자 컨스트럭트를 포함한다.
본 발명은 합성 5'UTR을 포함하는 벡터 골격이 진핵 세포에서 관심 서열의 발현에 적절한 서열을 포함하는 구체예를 포함한다. 하나의 구체예로서, 합성 5'UTR 을 포함하는 벡터 골격은 포유동물 세포에서 관심 서열의 발현에 적합한 서열을 포함한다. 포유동물 발현 벡터는 복제원점과 같은 비-전사되는 요소, 발현될 관심 서열에 연결된 적절한 프로모터 및 인핸서, 및 기타 5' 및 3' 인접 비번역 서열, 및 필수 리보솜 결합 부위, 폴리-아데닐화 부위, 및 전사 종결 서열과 같은 5' 또는 3' 비번역 서열을 포함할 수 있다. 포유동물 발현 벡터의 예는 당업게에 잘 알려져 있으며 pcDNA3 (Invitrogen) 및 pRSVneo (ATTC) 를 포함한다.
예를 들어, 합성 5'UTR 을 포함하는 발현 벡터의 프로모터 부분은 동물 또는 포유동물의 프로모터일 수 있다. 대표적인 동물 또는 포유동물의 프로모터는 SV40 초기(SN40e) 프로모터 영역, 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus, RSV) 의 3' 긴 말단 반복(LTR) 에 포함되는 프로모터, E1A 의 프로모터 또는 아데노바이러스(Ad) 의 주요 후기 프로모터(major late promoter, MLP), 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 프로모터, 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 티미딘 키나아제 (TK) 프로모터, 신장인자 1 알파(EF1) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터, 유비퀴틴(Ubc) 프로모터, 알부민 프로모터, 마우스 메탈로티오닌-L 프로모터의 조절 서열 및 전사 조절 영역, 유비쿼터스 프로모터 (HPRT, 비멘틴, 베타-액틴, 튜불린 등), 중간섬유의 프로모터 (데스민, 신경섬유, 케라틴, GFAP 등), (MDR, CFTR 또는 factor VIII type 등의) 치료 유전자의 프로모터, 발병 또는 질환 관련 프로모터, 및 형질전환 동물에서 사용되며 조직 특이성을 나타내는 프로모터로서 예컨대 췌장 선포세포 (pancreatic acinar cell)에서 활성있는 엘라스타아제 I 유전자 조절 부위; 췌장 베타 세포에서 활성있는 인슐린 유전자 조절 부위, 림포이드 세포에서 활성 있는 면역글로불린 유전자 조절 부위, 고환, 유방, 림포이드 및 비만 세포에서 활성 있는 마우스 유방 종양 바이러스 조절 부위; 간에서 활성 있는 알부민 유전자, Apo AI 및 Apo AII 조절 부위, 간에서 활성 있는 알파-페토단백질 유전자 조절 부위, 간에서 활성 있는 알파 1-안티트립신 유전자 조절 부위, 골수 세포에서 활성 있는 베타-글로빈 유전자 조절 부위, 뇌의 희돌기아교세포(oligodendrocyte cell) 에서 활성 있는 미엘린 염기성 단백질 유전자 조절 부위, 골격근에서 활성 있는 미오신 경사슬-2 유전자 조절 부위, 및 시상하부에서 활성 있는 성선 자극 호르몬 분비 호르몬 유전자 조절 부위, 피루베이트 키나아제 프로모터, 빌린 프로모터, 장 단백질에 결합하는 지방산의 프로모터, 평활근 세포 베타-액틴의 프로모터 등을 포함한다. 발현 백터 내의 프로모터는 인핸서 또는 조절서열 등의 추가에 의해 변형될 수 있다.
합성 5'UTR 을 포함하는 발현 벡터의 관심 부분 서열은 임의의 진핵 유전자 또는 이의 부분, 또는 자연적 또는 비-자연적 코딩 또는 비-코딩 서열로부터 유래한 서열일 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 코딩 서열의 비제한적인 예로는 리포터를 코딩하는 서열(예컨대, 루시페라아제, 베타-갈락토시다아제, 형광 단백질), 에피톱, 실험적 폴리펩타이드(experimental polypeptide), 또는 치료 폴리펩타이드를 포함한다. 관심 핵산 서열의 추가적인 예로는 스몰 RNA, 마이크로 RNA, 리보솜 RNA, 치료적 RNA, 및 라이보자임과 같은 RNA 분자를 포함한다.
본 발명의 다른 양태로서, 다양하고 비중복(nonredundant)된 합성 5'UTR 이 하나의 벡터 내에서 다유전자적(multigenic) 유전자 컨스트럭트의 맥락에서 사용될 수 있다.
또다른 구체예로서, 벡터는 합성 5'UTR 을 포함하는 합성 유전자 컨스트럭트를 포함하는 유전자 치료 벡터이다. 유전자 치료 벡터는 비바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함하여, 당업계에 알려진 임의의 유전자 치료 벡터일 수 있다. 합성 유전자 컨스트럭트는 도 3a 에 나타낸 바와 같이 합성 5'UTR의 5' 말단에 인접한 프로모터 및 합성 5'UTR의 3' 말단에 인접한 관심 치료 유전자를 포함할 수 있다. 프로모터는 구성적 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 및 유도성 프로모터, 또는 본원에 기재된 다른 프로모터일 수 있다. 유전자 치료 벡터에 포함될 수 있는 관심 치료 유전자의 분류의 예로는, 이에 제한됨이 없이, 사이토카인, 케모카인, 호르몬, 항체, 제작된 면역글로불린 유사 분자, 단일 사슬 항체, 융합 단백질, 효소, 면역 공동자극 분자, 면역조절 분자, 목적 단백질의 트랜스도미넌트 음성 돌연변이, 독소, 조건적 독소(conditional toxin), 화학치료 또는 방사선 치료 증감제, 항원, 종양 억제 단백질, 성장 인자, 막 단백질, 혈관활성 단백질 및 펩타이드, 항바이러스 단백질 또는 이의 변이체를 포함한다.
관심 치료 유전자의 특정한 예는 무수히 많으며, 이에 제한됨이 없이, 에리쓰로포이에틴, 인슐린, VEGF, FGF, Factor VIII, Factor IX, 엔도스타틴, 안지오스타틴, GDNF, BDNF, NGF, EGF, CFTR, PEGF, IFN-알파, IFN-감마, IL-I, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL- 10, IL-12, IL-21, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, TNF-α, TNF-β, TGF-α, TGF-β, CD40, 히루딘 등을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 키트를 제공한다. 예를 들어, 하나의 구체예로서, 본 발명은 서열번호 1-10 중의 하나로 나타내는 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 상기 벡터 또는 그 조립을 가능하게 하는 구성요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 사용자가 합성 5'UTR 또는 합성 5'UTR의 개별 구성요소를 삽입할 수 있도록 하는 부위에서 제한 효소로 절단하여 선형화될 수 있는 벡터를 포함할 수 있다. 키트는 제한 효소, 리가아제, 버퍼 등과 같은 벡터의 조립을 위한 추가적인 구성요소를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 숙주 세포에서 유전자 산물 또는 관심 서열을 발현시키기 위한 방법을 제공한다.
예를 들어, 본 발명의 다른 구체예는 숙주세포에 본원에 기재된 합성 5'UTR 을 포함하는 합성 유전자 컨스트럭트를 트랜스펙션하는 것을 포함하는 유전자 산물을 발현하는 방법이다.
본 발명의 또다른 구체예는 숙주세포에 서열번호 1 또는 서열번호 7 로 나타내는 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 합성 유전자 컨스트럭트를 트랜스펙션하는 것을 포함하는 유전자 산물을 발현하는 방법이다.
본 발명의 다른 구체예는 :
a. 숙주 세포에 본원에 기재된 합성 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터를 트랜스펙션하는 단계; 및
b. 상기 숙주세포를 상기 관심 서열의 발현을 얻기에 적절한 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 숙주세포에 관심 서열을 발현하는 방법이다.
숙주세포에서 관심 서열을 발현하는 또다른 방법은, 관심 서열이 프로모터, 합성 5'UTR, 및 클로닝 부위를 포함하는 본원에 기재된 발현 벡터 안으로 삽입되는 것이다. 예를 들어, 본 발명의 다른 구체예는
a. 프로모터, 합성 5'UTR, 및 클로닝 부위를 포함하는 본원에 기재된 발현 백터 내에서 발현될 관심 서열을 클로닝 부위에 삽입하는 단계로서, 상기 발현될 관심 서열은 RNA 또는 폴리펩타이드 코딩 서열을 포함하고;
b. 숙주 세포에 발현 벡터를 트랜스펙션하는 단계; 및
c. 상기 숙주세포를 상기 관심 서열의 발현을 얻기에 적절한 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 관심 서열을 발현하는 방법이다.
숙주세포에서 관심 서열을 발현하는 또다른 방법은, 합성 5'UTR이 발현벡터 내 프로모터 및 관심 서열 사이로 삽입되어, 합성 5'UTR 내 진핵 유전자의 절단 요소가 포함된 부분은 프로모터 방향에 위치하고 다른 진핵 유전자의 5'UTR 의 적어도 일부를 포함하는 부분은 관심 서열 방향에 위치하는 것이다.
예를 들어, 본 발명의 다른 구체예는
a. 본원에 기재된 합성 5'UTR 을 발현 벡터의 프로모터 및 발현될 관심 서열 사이에 삽입하는 단계로서, 상기 발현될 관심 서열은 RNA 또는 폴리펩타이드 코딩 서열을 포함하고;
b. 상기 발현 벡터를 숙주세포에 트랜스펙션하는 단계; 및
c. 상기 숙주세포를 상기 관심 서열의 발현을 얻기에 적절한 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 관심 서열을 발현하는 방법이다.
본 발명의 또다른 구체예는
a. 서열번호 1 또는 서열번호 7 로 나타내는 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터의 프로모터 및 발현될 관심 서열 사이에 삽입하는 단계로서, 상기 발현될 관심 서열은 RNA 또는 폴리펩타이드 코딩 서열을 포함하고;
b. 상기 발현 벡터를 숙주세포에 트랜스펙션하는 단계; 및
c. 상기 숙주세포를 상기 관심 서열의 발현을 얻기에 적절한 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 관심 서열을 발현하는 방법이다.
본 발명의 방법은 통상의 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 재조합 DNA 기술은 (Sambrook, 위에서 언급) 또는 Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols 제1권 및 제2권에 기재된 표준 프로토콜에 따라 수행된다.
본 발명은 또한 합성 5'UTR 을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 본원에 기재된 합성 5'UTR 뉴클레오티드 서열의 임의의 구체예를 포함하도록 고려된다. 예를 들어, 본 발명의 다른 구체예는 카세인 유전자의 5'UTR 영역의 적어도 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편에 융합된 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 두번째 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 합성 5'UTR 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주세포이다.
하나의 구체예로서, 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포이다. 특정한 구체예로서, 숙주세포는 햄스터 세포, 마우스 세포, 랫트 세포, 래빗 세포, 고양이 세포, 개(dog) 세포, 소(bovine) 세포, 거위 세포, 암소(cow) 세포, 돼지 세포, 말 세포, 양 세포, 원숭이(simian) 세포, 원숭이(monkey) 세포, 침팬지 세포, 또는 인간 세포이다. 합성 5'UTR을 포함하는 본 발명의 숙주 세포의 특정한 예는 A549, ARPE-19, CH3/10T1/2, C2C12, aco2, COS7, FL-83B, HEK-293, HEPG2, HeLa, HT-1080, MDCK, P19, SH-SY5Y, Sol 8, 및 U87 을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 숙주 세포는 합성 5'UTR 을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션된다. 숙주 세포 트랜스펙션은 당업계에 잘 알려져 있고 전기천공법, 바이러스 감염, 플라스미드/벡터 트랜스펙션, 비바이러스 벡터 매개성 트랜스펙션, 유전자총(particle bombardment) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 바람직한 유전자 산물의 발현은 적절한 조건 하에 트랜스펙션된 숙주 세포를 배양하고 트랜스펙션된 유전자의 발현을 측정하는 단계와 관련된다. 진핵 세포에서 배양 조건 및 유전자 발현 프로토콜은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 합성 5'UTR 을 포함하는 숙주 생물체를 제공한다. 합성 5'UTR 은 인 비보에서 숙주 생물체의 게놈 안으로 직접 삽입될 수 있다. 예를 들어, 하나의 구체예로서, 합성 5'UTR 은, 숙주 생물체에서 교체될 야생형 5'UTR의 인접한 서열에 상동인 서열 옆에 본 발명의 합성 5'UTR을 포함하는 벡터를 직접 도입함으로써 야생형 5'UTR 을 교체하기 위하여, 숙주 생물체 안으로 도입된다. 또다른 구체예로서, 합성 5'UTR 을 포함하는 합성 유전자 컨스트럭트는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 통합 벡터가 숙주 생물체에 도입됨으로써 숙주 생물체의 게놈 안으로 삽입된다. 삽입의 조직-특이성은, 예를 들어 벡터 투여 경로에 의하여 조절될 수 있다. 다른 구체예로서, 합성 5'UTR 을 포함하는 합성 유전자 컨스트럭트는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 비-통합 벡터가 숙주 생물체에 도입됨으로써 숙주 생물체에 도입된다.
합성 5'UTR 또는 합성 5'UTR 을 포함하는 합성 유전자 컨스트럭트는 또한 덱스 비보 접근을 통하여 숙주 생물체 안으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 자가 또는 비-자가 세포는 합성 5'UTR 을 포함하는 벡터로 형질전환된 후 숙주 생물체 안으로 도입될 수 있다.
다른 구체예로서, 합성 5'UTR 은 Cre/loxP 와 같은 부위-특이적 재조합 효소 시스템을 사용하여 숙주 세포 또는 생물체의 게놈 안으로 도입된다. 이 구체예에서, 합성 5'UTR 을 포함하는 단편 또는 합성 5'UTR을 포함하는 합성 유전자 컨스트럭트와 같은 DNA 단편의 게놈으로의 안정적인 통합은, 변형된 lox 부위(lox site)를 게놈 및 통합된 DNA 의 재-절제(re-excision)를 저해하는 공여 벡터에 도입함으로써 달성된다 (본원에 참고로 인용되는, Metzger and Feil, Current Opinion in Biotechnology, 10:470-476 (1999)를 참고하라). 또한, 이종특이적 loxP 부위는, 내생적 5'UTR 및 공여 플라스미드 상의 합성 5'UTR과 같은 교체될 부위에 인접하도록 게놈 안으로 도입('floxed')될 수 있다 (Metzger and Feil, 위에서 언급). 게놈 내 도입된 loxP 염색체 부위를 가진 형질전환 동물은 당업계에 알려진 조직 또는 세포 특이적 프로모터에 의해 작동되는 Cre 재조합 효소를 발현시키는 형질전환 마우스와 이종교배될 수 있다. 이러한 이종교배의 자손에게 합성 5'UTR 을 포함하는 공여 플라스미드의 투여는 특정한 조직 또는 세포 타입 내에서 통합을 초래할 것이다.
다른 구체예로서, 본원에 참고로 인용되는 미국 공개특허 제20060172377호에 기재된 다른 부위-특이적 재조합 시스템이 합성 5'UTR 을 숙주 생물체의 게놈 안으로 도입하는데 사용된다.
본 발명의 다른 구체예는 서열번호 1-10 으로 나타내는 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비-인간 생물체이다.
본 발명의 다른 구체예는 서열번호 1-10 으로 나타내는 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 합성 유전자 컨스트럭트를 포함하는 비-인간 생물체이다.
또한, 합성 5'UTR 을 포함하는 마우스 또는 합성 5'UTR 을 포함하는 유전자 컨스트럭트와 같은 형질전환 생물체가 제조될 수 있다. 예를 들어, 형질전환 마우스는 합성 5'UTR을 포함하는 적절한 벡터가 수정된 마우스 난모세포의 전핵(pronuclei) 안으로 주입됨으로써 제조될 수 있다. 대안적으로, 벡터는 마우스 배아 줄기 세포 안으로 도입된 후 마우스 배반포(blastocyst) 안으로 미세주입될 수 있다. 형질전환된 접합체(zygote) 또는 배반포는 다음으로 위임신(pseudopregnant)한 암컷 마우스 안으로 이식된다. 그 결과 생긴 자손은 PCT 또는 써던 브랏팅에 의하여 폴리뉴클레오티드의 존재로 선별된다. 이형접합된 형질전환 동물은 다음으로 동형 접합체를 생성하기 위하여 각자 교배된다. 하나의 구체예로서, 합성 5'UTR 는 상동 재조합을 통하여 형질전환 동물에서 관심 유전자의 내생적 5'UTR 와 교체된다.
따라서, 본 발명의 다른 구체예는 카세인 유전자의 5'UTR 영역의 적어도 일부를 포함하는 단편에 융합된 두번째 인트론을 포함하는 진핵 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 단편을 포함하는 합성 5'UTR 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 형질전환 동물이다.
본 발명의 다른 구체예는 서열번호 1-10 으로 나타내는 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환 생물체이다.
본 발명의 다른 구체예는 서열번호 1-10 으로 나타내는 폴리뉴클레오티드와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 합성 유전자 컨스트럭트를 포함하는 형질전환 생물체이다.
도 1a는 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드를 개략적으로 도시한 것이다.
도 1b는 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드를 개략적으로 도시한 것이다.
도 1c는 서열번호 2 및 서열번호 4-6의 폴리뉴클레오티드를 도시한 것이다. SERCA2의 두번째 인트론은 흑색으로 표시하였다. 이웃하는 엑손 또는 그의 일부는 표시하지 않았다.
도 2a는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 개략적으로 도시한 것이다.
도 2b는 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드를 개략적으로 도시한 것이다.
도 3a는 프로모터와 관심서열 사이의 발현 벡터 내로 삽입된 합성 5' UTR을 개략적으로 도시한 것이다.
도 3b는 프로모터와 클로닝 부위 사이의 발현 벡터 내로 삽입된 합성 5' UTR을 개략적으로 도시한 것이다.
도 4는 HEK-293 세포에서 본 발명의 합성 5'UTR의 구현예를 테스트한 결과를 도시한 것이다.
도 5는 1080 세포에서 본 발명의 합성 5'UTR의 구체예를 테스트한 결과를 도시한 것이다.
도 6은 HEK-293 세포 및 1080 세포에서 대조구에 대한 증가 배율로 본 발명의 합성 5'UTR의 구체예를 테스트한 결과를 도시한 것이며 상기 대조구 값은 1로 표준화되었다.
도 7은 실시예 1 (VVN-2712)에 사용된 대조구 벡터를 도시한 것이며, 여기서 베타-갈락토시다아제 (LacZ) 코딩 서열은 5'UTR이 없으며, CMV 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다.
도 8은 실시예 1 (VVN-2713)에 사용된 대조구 벡터를 도시한 것이며, 여기서 상기 벡터는 5'UTR과 LacZ를 가지고 있지 않다.
도 9는 실시예 1 (VVN-8318)에 사용된 벡터를 도시한 것이며, 여기서 베타-갈락토시다아제 (LacZ) 코딩 서열은 폴리G 5'UTR 및 상기 CMV 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다.
도 10은 실시예 1 (VVN-8277)에 사용된 벡터를 도시한 것이며, 여기서 베타-갈락토시다아제 (LacZ) 코딩 서열은 본 발명의 5'UTR (5U2) 및 CMV 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다.
도 11은 실시예 1 (VVN-8276)에 사용된 벡터를 도시한 것이며, 여기서 베타-갈락토시다아제 (LacZ) 코딩 서열은 본 발명의 5'UTR (INXN-1) 및 CMV 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다.
도 12는 도 4-6에 도시된 실시예 1의 데이터를 포함한 표이다.
도 13은 두번째 인트론과 엑손 2 및 엑손 3을 포함하는, 에쿠우스 카발루스 SERCA2 게놈과 mRNA 서열 비교의 일부를 도시한 것이다.
도 7-11은 하기 약자를 사용한다: CMV 프로 = 사이토메갈로바이러스 프로모터, LacZ = LacZ 코딩 서열, SV40pA = SV40 폴리A, Amp = 암피실린 저항성 유전자, Neo = 네오마이신 저항성 유전자, MCS = 멀티플 클로닝 부위, SPL-I = 엑손 2 SERCA2의 일부 + 인트론 2 SERCA2 + 엑손 3 SERCA2의 일부, UTR-1 = 5'UTR 카세인의 일부.
하기의 실시예는 본 발명의 구체예를 예시하는 것일 뿐 이에 제한되지 않는다. 당업자에게 자명한 기타 적절한 변형 및 적용이 본 발명의 정신 및 범위 내에서 이루어질 수 있다.
실시예 1.
세 개의 다른 버전의 합성 5'UTR 을 제조하였고, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터가 베타 갈락토시다아제 리포터(LacZ 코딩 서열)의 발현을 지시하는 벡터 안으로 삽입하였다. 첫번째 버전에서, 폴리G(12) 를 합성 5'UTR 으로서 프로모터와 베타-갈락토시다아제 리포터 사이에 삽입하였다 (도 9). 두번째 버전에서, 5U2 라 부르는, 서열번호 1을 합성 5'UTR 으로서 프로모터와 베타-갈락토시다아제 리포터 사이에 삽입하였다 (도 10). 세번째 버전에서, INXN-1 으로 부르는, 서열번호 7을 합성 5'UTR 으로서 프로모터와 베타-갈락토시다아제 리포터 사이에 삽입하였다 (도 11). 각 전이유전자는 3' 조절 영역에 SV40 폴리아데닐화 서열을 가진다. 5U2 또는 INXN-1 합성 5'UTR 을 포함하는 각 벡터의 일반적인 버전은 도 3a 에 도식적으로 나타내었다. HEK-293 세포 및 1080 세포에 각 발현 벡터를 일시적으로(transiently) 트랜스펙션하였다.
베타-갈락토시다아제는 Applied Biosystems (Cat Nos. BMlOOS, BM300S, BM2500S, BYlOOS, BY300S, BY2500S)의 Galacto-Star™ System 을 사용하여 세포로부터 측정하였다. 세포를 50 μL 용해 용액(Galacto-Star™ System) 으로 10분간 실온에서 용해시켰다. 100 μL 의 Galacton-Star® 기질을 희고 불투명한 96-웰 마이크로플레이트의 웰 안에 분취하였다. 10 μL 의 세포 용해물을 100 μL 의 Galacton-Star®에 첨가하고 30 분간 배양하였다. 광 신호를 마이크로플레이트 광도계를 사용하여 측정하였다.
HEK-293 세포에서의 결과를 도 4에 나타내었다. 베타-갈락토시다아제 리포터 발현은 합성 5'UTR 로서 폴리G 를 포함하는 벡터와 비교하여 INXN-1 또는 5U2 합성 5'UTR 을 포함하는 벡터로 형질전환된 HEK-293 세포에서 현저하게 증가하였다. 합성 5'UTR 로서 폴리G 를 포함하는 벡터와 비교하여 INXN-1 또는 5U2 을 포함하는 벡터로 형질전환된 1080 세포에서의 증가된 리포터 발현을 도 5에 나타내었다. 폴리G 5'UTR 를 포함하는 벡터에서 전이유전자의 발현 수준은 5'UTR 이 존재하지 않는 대조군과 비슷하였다 (VVN-2712, 도 7, 도 12의 데이터). 분석 백그라운드를 측정하기 위한 음성 대조군은 베타-갈락토시다아제가 없는 벡터를 사용했다 (VVN-2713, 도 8, 도 12의 데이터). 도 6 은 5'UTR 로서 폴리G 를 포함하는 합성 리포터 유전자와 비교하여 INXN-1 합성 5'UTR 을 포함하는 합성 베타-갈락토시다아제 리포터 유전자는 HEK-293 세포에서 약 7.5 배 높게 발현하였고 1080 세포에서는 약 2.5 배 높게 발현하였고, 5'UTR 로서 폴리G 를 포함하는 합성 리포터 유전자와 비교하여 5U2 합성 5'UTR 을 포함하는 합성 리포터 유전자는 HEK-293 세포에서 약 8 배 높게 발현하였고 1080 세포에서 약 2.5배 높게 발현하였다.
실시예 2.
쿼리 서열로 서열번호 4를 사용한, 디폴트 파라미터의 blastn 알고리즘을 사용한 비중복(nonredundant)된 뉴클레오티드 공공 데이터베이스인 GenBank 의 검색으로 표 1에 기재된 하기의 대표적인 SERCA2 상동체를 얻었다. 서열번호 4는 서열번호 7로 나타내는 합성 5'UTR 의 구성요소를 나타낸다.
등록번호
(Accession Number)		 설명 쿼리 일치도
(query coverage)		 E 값 최대 동일성
(Maximum Identity)
EU365364 호모 사이언스 ATP2A2 유전자 (APTase CA++ transporting cardiac muscle slow twitch2), 엑손 2, 3 및 부분적 cds 99% 2e-16 77%
AM137440 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 2 에 대한에쿠스 카발루스 atp2A2 유전자, 엑손 1-20 51% 3e-14 90%
M33834 오릭토라구스 쿠니쿠루스 근소포체/소포체 Ca2+-ATP아제 (SERAC2) 유전자, 엑손 1-3, 및 부분적 cds 53% 5e-05 80%
표 1 에 나타난 BLAST 검색 결과로부터 에쿠스 카발루사 게놈의 단편 (공공의 등록번호 AM137440) 을, 공공의 이용가능한 프로그램 DNA Strider 1.4fl7 (see Marck, C, Nucleic Acids Research 16(5):1829-1837 (1988) and Douglas, S, Molecular Biotechnology 3(l):37-45 (1995) for descriptions of DNA Strider) 에서 쌍정렬 기능을 사용하여 에쿠스 카발루사 SERCA2 mRNA 서열 NM_001081765 와 비교하였다. 이 서열들은 미스매치 패널티 및 갭 패널티를 위한 디폴트 파라마터를 사용하여 Blocks 법을 사용하여 정렬하였다. 에쿠스 카발루사 게놈 및 mRNA 서열의 정렬(alignment)의 일부를 도 13 에 나타내었고, 화살표는 에쿠스 카살루사 SERCA2 유전자의 두번째 인트론의 시작과 끝을 표시한 것이다. 인트론에 대하여 5' 상동성 영역은 엑손 2를 나타내고, 인트론에 대하여 3' 상동성 영역은 엑손 3을 나타낸다.
다음으로 두번째 인트론을 포함하는 에쿠스 카발루사 SERCA 유전자의 단편을 나타내는 올리고뉴클레오타이드를 합성하고 재조합 DNA 기술을 이용하여 서열번호 3 에 융합시켜 합성 5'UTR 을 제조하였다. 다음으로 합성 5'UTR 을 벡터의 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터 (CMV) 및 루시페라아제 리포터 유전자 사이에 삽입하였다. 다음으로 상기 벡터 및 폴리G 5'UTR 을 가진 대조군 벡터를 3T3 세포에 트랜스펙션하는데 사용하였다. 루시페라아제 활성을 광도계를 사용하여 측정하였고 양쪽 세포의 셋트 간에 상대적인 광 유닛을 비교하였다. 폴리G 5'UTR 을 포함하는 벡터로 트랜스펙션된 세포와 비교하여, 합성 5'UTR 을 포함하는 벡터로 트랜스펙션된 세포에서 리포터의 발현이 증가하였다.
실시예 3.
쿼리 서열로 서열번호 3를 사용한, 디폴트 파라미터의 blastn 알고리즘을 사용한 비중복(nonredundant)된 뉴클레오티드 공공 데이터베이스인 GenBank 의 검색으로 표 2에 기재된 하기의 대표적인 SERCA2 상동체를 얻었다. 서열번호 3은 서열번호 1 및 서열번호 7로 나타내는 합성 5'UTR 의 구성요소를 나타낸다.
등록번호
(Accession Number)		 설명 쿼리 일치도
(query coverage)		 E 값 최대 동일성
(Maximum Identity)
DQ317447 부바루스 부바리스 베타-카세인 mRNA, 완전한 cds 77% 5e-10 97%
NM_001009373 오비스 아리에스 카세인 베타(CSN2), mRNA 77% 6e-09 95%
AY311384 카프라 히르쿠스 베타-카세인 유전자, 프로모터 및 엑손 1 56% 5e-04 96%
NM_001081852 에쿠스 카발루스 카세인 베타(CSN2), mRNA 58% 0.002 93%
AY452035 수스 스크로파 베타 카세인 유전자, 프로모터 영역, 엑손 1, 및 부분 서열 56% 0.006 93%
AJ409279 카메루스 드로메다리우스 부분적 베타-카세인 유전자, 5' 인접 영역 56% 0.006 93%
NM_001082759 오릭토라구스 쿠니쿠루스 프리-베타-카세인 (AA -15 에서 213)(LOC100009539), mRNA 66% 0.006 88%
NM_001003086 카니스 루푸스 패밀리 카세인 베타(CSN2), mRNA 67% 0.88 83%
표 1에 기재된 각 대표적인 SERCA2 유전자의 두번째 인트론은 그 대표적인 mRNA 서열을 가진 게놈 서열과 비교함으로써 쌍정렬 프로그램 정렬 프로그램을 사용하여 확인하였다. 첫번째 올리고뉴클레오티드 셋트는 각 SERCA2 상동체에 대한 SERCA2 의 두번째 인트론을 포함하여 합성하였다. 다음으로 두번째 올리고뉴클레오티드 셋트는 표 2에서 확인된 각 베타-카세인 상동체에 대한 5'UTR의 적어도 일부를 대포하도록 합성하였다. 5'UTR 의 일부는 표 2의 BLAST 결과에서 확인된 쿼리 일치도의 부분을 포함한다. 다음으로 합성 5'UTR 의 셋트는 재조합 DNA 기술을 사용하여, SERCA2 의 두번째 인트론을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 서열번호 2 및 4-6으로 나타내는 올리고뉴클레오티드의 첫번째 셋트의 고유한 멤버를 5'UTR 의 적어도 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 서열번호 3 및 8-10 으로 나타내는 올리고뉴클레오티드의 두번째 셋트의 고유한 멤버와 융합시킴으로써 제조하였고, 상기 SERCA2 의 두번째 인트론을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 5'UTR 의 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 5' 에 융합시켰다. 다음으로 PCR 을 통해 합성 5'UTR 의 각 끝에 제한자리를 첨가하였다. 다음으로 각 고유의 합성 5'UTR 을 벡터의 인간 CMV 프로모터 및 lacZ 프로모터 사이에 삽입하였다. 다음으로 96 웰 플레이트 내 1080 세포에 각 벡터뿐 아니라 폴리G 5'UTR 을 가진 대조군 벡터를 트랜스펙션하였다. 다음으로 실시예 1 에 기재한 분석을 사용하여 베타-갈락토시다아제 활성을 측정하한 후 폴리G 5'UTR 와 상대적인 발현 수준을 비교하였다.
지금까지 본 발명을 충분히 설명하였으므로, 당업자는 본 발명의 범위 또는 특정한 구체예에 영향을 주지 않고 다양하고 동등한 조건 범위 및 다른 파라미터 내에서 발명을 실시할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
<110> Intrexon Corporation <120> SYNTHETIC 5'UTRs, EXPRESSION VECTORS, AND METHODS FOR INCREASING TRANSGENE EXPRESSION <130> IPA100230 <150> US60/975,407 <151> 2007-09-26 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 191 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 acgcgtcgaa gaaggtgagt aatcttaaca tgctcttttt tttttttttt gctaatccct 60 tttgtgtgct gatgttagga tgacatttac aacaaatgtt tgttcctgac aggaaaaacc 120 ttgctgggta ccttcgttgc cggacacttc ttgtcctcta ctttggaaaa aaggaattga 180 gagcccaatt g 191 <210> 2 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 cgaagaaggt gagtaatctt aacatgctct tttttttttt ttttgctaat cccttttgtg 60 tgctgatgtt aggatgacat ttacaacaaa tgtttgttcc tgacaggaaa aaccttgctg 120 120 <210> 3 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 3 ttcgttgccg gacacttctt gtcctctact ttggaaaaaa ggaattgaga gcc 53 <210> 4 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 4 cgaagaaggt gagtaatctt aacatgttct tttttttttt tttttttaat cccttttgtg 60 tgctgatgtt aggatgacat ttacaacaaa tgtttgttcc tgacaggaaa aaccttgctg 120 120 <210> 5 <211> 192 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 5 agttaccggc tgaagaaggt aatcttaaca tgctgtttct gttttttttc ctctgttggt 60 gtgctgatgg taagatgaca gttaaaacac atgtgtttgt ttcttacagg aaaaaccttg 120 ctggaacttg tgattgagca gtttgaagac ttgctagtta ggattttatt actggcagca 180 tgtatatctt tt 192 <210> 6 <211> 218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 6 aattgccggc tgaagaaggt aaataatatt aacatgttat tttggagaga tgatgtgtgc 60 aggctgattg atgtggacaa ttgaaacaaa tggtttgttt tttttttttt tttttttcct 120 ttccttttct aacaggaaaa accttgctgg aacttgtgat tgagcagttt gaagacttac 180 tagttagaat tttactgctg gcagcatgta tatctttc 218 <210> 7 <211> 199 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 7 ggcgcgccac gcgtcgaaga aggtgagtaa tcttaacatg ctcttttttt tttttttttt 60 taatcccttt tgtgtgctga tgttaggatg acatttacaa caaatgtttg ttcctgacag 120 gaaaaacctt 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gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata gcctctccac 1080 ccaagcggcc ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atggccgatc ccatggtggc 1140 tctagaggaa tagctcagag gccgaggcgg cttcggcctc tgcataaata aaaaaaatta 1200 gtcagccatg gggcggagaa tgggcggaac tgggcggagt taggggcggg atgggcggag 1260 ttaggggcgg gactatggtt gctgactaat tgagatgcat gctttgcata cttctgcctg 1320 ctggggagcc tggggacttt ccacacctgg ttgctgacta attgagatgc atgctttgca 1380 tacttctgcc tgctggggag cctggggact ttccacaccc taacaagctt gcccgggcag 1440 cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tagctgagct aactataacg 1500 gtcctaaggt agcgaatcga tgcgatcgct taattaacct gcagggatat cccatggggg 1560 ccgcgagctc tcccccgggg gaacagcatg cgtgtcatgc catggcctgg gactagttct 1620 agagcaccgg tgggcccgaa gatctggatc ccgaactgca ttagttatta atagtaatca 1680 attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta 1740 aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 1800 gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg 1860 taaactgccc 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gcccgaggcc gacaccgtgg tggtgcccag caactggcag atgcacggct 2760 acgacgcccc catctacacc aacgtgacct accccatcac cgtgaacccc cccttcgtgc 2820 ccaccgagaa ccccaccggc tgctacagcc tgaccttcaa cgtggacgag agctggctgc 2880 aggagggcca gaccaggatc atcttcgacg gcgtgaacag cgccttccac ctgtggtgca 2940 acggcaggtg ggtgggctac ggccaggaca gcaggctgcc cagcgagttc gacctgagcg 3000 ccttcctgag ggctggcgag aacaggctgg ccgtgatggt gctgaggtgg agcgacggca 3060 gctacctgga ggaccaggat atgtggagga tgagcggcat cttcagggac gtgagcctgc 3120 tgcacaagcc caccacccag atcagcgact tccatgtggc caccaggttc aacgacgact 3180 tcagcagggc cgtgctggag gccgaggtgc agatgtgcgg cgagctgagg gactacctga 3240 gggtgaccgt gagcctgtgg cagggcgaga cccaggtggc cagcggcacc gcccccttcg 3300 gcggcgagat catcgacgag aggggcggct acgccgacag ggtgaccctg aggctgaacg 3360 tggagaaccc caagctgtgg agcgccgaga tccccaacct gtacagggcc gtggtggagc 3420 tgcacaccgc cgacggcacc ctgatcgagg ccgaagcctg cgacgtgggc ttcagggagg 3480 tgaggatcga gaacggcctg ctgctgctga acggcaagcc cctgctgatc aggggcgtga 3540 acaggcacga gcaccacccc ctgcacggcc aggtgatgga cgagcagaca atggtgcagg 3600 acatcctgct gatgaagcag aacaacttca acgccgtgag gtgcagccac taccccaacc 3660 accccctgtg gtacaccctg tgcgacaggt acggcctgta cgtggtggac gaggccaaca 3720 tcgagaccca cggcatggtg cccatgaaca ggctgaccga cgaccccagg tggctgcccg 3780 ccatgagcga gagggtgacc aggatggtgc agagggacag gaaccacccc agcgtgatca 3840 tctggagcct gggcaacgag agcggccacg gcgccaacca cgacgccctg tacaggtgga 3900 tcaagagcgt ggaccccagc aggcccgtgc agtacgaggg cggcggcgcc gacaccaccg 3960 ccaccgacat catctgcccc atgtacgcca gggtggacga ggaccagccc ttccccgccg 4020 tgcccaagtg gagcatcaag aagtggctga gcctgcccgg cgagaccagg cccctgatcc 4080 tgtgcgagta cgcccacgct atgggcaaca gcctgggcgg cttcgccaag tactggcaag 4140 ccttcaggca gtaccccagg ctgcagggcg gcttcgtgtg ggactgggtg gaccagagcc 4200 tgatcaagta cgacgagaac ggcaacccct ggagcgccta cggcggcgac ttcggcgaca 4260 cccccaacga caggcagttc tgcatgaacg gcctggtgtt cgccgacagg accccccacc 4320 ccgccctgac cgaggccaag caccagcagc agttcttcca gttcaggctg agcggccaga 4380 ccatcgaggt gaccagcgag tacctgttca ggcacagcga caacgagctg ctgcactgga 4440 tggtggccct ggacggcaag cccctggcca gcggcgaggt gcccctggac gtggcccccc 4500 agggcaagca gctgatcgag ctgcccgagc tgccccagcc cgagagcgcc ggacagctgt 4560 ggctgaccgt gagggtggtg cagcccaacg ccaccgcctg gagcgaggct ggccacatca 4620 gcgcctggca gcagtggagg ctggccgaga acctgagcgt gaccctgccc gccgccagcc 4680 acgccatccc ccacctgacc acaagcgaga tggacttctg catcgagctg ggcaacaaga 4740 ggtggcagtt caacaggcag agcggcttcc tgagccagat gtggatcggc gacaagaagc 4800 agctgctgac ccccctgagg gaccagttca ccagggcccc cctggacaac gacatcggcg 4860 tgagcgaggc caccaggatc gaccccaacg cctgggtgga gaggtggaag gccgctggcc 4920 actaccaggc cgaggccgcc ctgctgcagt gtaccgccga caccctggcc gacgccgtgc 4980 tgatcaccac cgcccacgcc tggcagcacc agggcaagac cctgttcatc agcaggaaga 5040 cctacaggat cgacggcagc ggccagatgg ctatcaccgt ggacgtggag gtggccagcg 5100 acacccccca ccccgccagg atcggcctga actgccagct ggcccaggtg gccgagaggg 5160 tgaactggct gggcctgggc ccccaggaga actaccccga caggctgacc gccgcctgct 5220 tcgacaggtg 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attttggtca tgcctaggtg gcaaacagct attatgggta ttatgggtct 6960 accggtgcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 7020 gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 7080 tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 7140 ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 7200 taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 7260 gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 7320 gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 7380 ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 7440 aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 7500 gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 7560 cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 7620 actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 7680 caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 7740 gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 7800 ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 7860 caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 7920 tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcggga 7980 gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa a 8011 <210> 13 <211> 8011 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 13 taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tcacctggtc 60 ttaagggcta tggcagggcc tgccgccccg acgttggctg cgagccctgg gccttcaccc 120 gaacttgggg ggtggggtgg ggaaaaggaa gaaacgcggg cgtattggcc ccaatggggt 180 ctcggtgggg tatcgacaga gtgccagccc tgggaccgaa ccccgcgttt atgaacaaac 240 gacccaacac cgtgcgtttt attctgtctt tttattgccg tcatagcgcg ggttccttcc 300 ggtattgtct ccttccgtgt ttcactcgag tcagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa 360 ggcgatgcgc tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca 420 ttcgccgcca agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc 480 cgccacaccc agccggccac agtcgatgaa 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tacggtggga ggtctatata 2220 agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagcctt ggggtacccc ggccggccgg 2280 cgcgccacgc gtcgaagaag gtgagtaatc ttaacatgct cttttttttt ttttttttta 2340 atcccttttg tgtgctgatg ttaggatgac atttacaaca aatgtttgtt cctgacagga 2400 aaaaccttgc tgggtacctt cgttgccgga cacttcttgt cctctacttt ggaaaaaagg 2460 aattgagagc ccaattggcc accatgagat ctggcgaccc cgtggtgctg cagaggaggg 2520 actgggagaa ccccggcgtg acccagctga acaggctggc cgcccacccc cccttcgcca 2580 gctggaggaa cagcgaggag gccaggaccg acaggcccag ccagcagctg aggagcctga 2640 acggcgagtg gaggttcgcc tggttccccg cccccgaggc cgtgcccgag agctggctgg 2700 agtgcgacct gcccgaggcc gacaccgtgg tggtgcccag caactggcag atgcacggct 2760 acgacgcccc catctacacc aacgtgacct accccatcac cgtgaacccc cccttcgtgc 2820 ccaccgagaa ccccaccggc tgctacagcc tgaccttcaa cgtggacgag agctggctgc 2880 aggagggcca gaccaggatc atcttcgacg gcgtgaacag cgccttccac ctgtggtgca 2940 acggcaggtg ggtgggctac ggccaggaca gcaggctgcc cagcgagttc gacctgagcg 3000 ccttcctgag ggctggcgag aacaggctgg ccgtgatggt gctgaggtgg agcgacggca 3060 gctacctgga ggaccaggat atgtggagga tgagcggcat cttcagggac gtgagcctgc 3120 tgcacaagcc caccacccag atcagcgact tccatgtggc caccaggttc aacgacgact 3180 tcagcagggc cgtgctggag gccgaggtgc agatgtgcgg cgagctgagg gactacctga 3240 gggtgaccgt gagcctgtgg cagggcgaga cccaggtggc cagcggcacc gcccccttcg 3300 gcggcgagat catcgacgag aggggcggct acgccgacag ggtgaccctg aggctgaacg 3360 tggagaaccc caagctgtgg agcgccgaga tccccaacct gtacagggcc gtggtggagc 3420 tgcacaccgc cgacggcacc ctgatcgagg ccgaagcctg cgacgtgggc ttcagggagg 3480 tgaggatcga gaacggcctg ctgctgctga acggcaagcc cctgctgatc aggggcgtga 3540 acaggcacga gcaccacccc ctgcacggcc aggtgatgga cgagcagaca atggtgcagg 3600 acatcctgct gatgaagcag aacaacttca acgccgtgag gtgcagccac taccccaacc 3660 accccctgtg gtacaccctg tgcgacaggt acggcctgta cgtggtggac gaggccaaca 3720 tcgagaccca cggcatggtg cccatgaaca ggctgaccga cgaccccagg tggctgcccg 3780 ccatgagcga gagggtgacc aggatggtgc agagggacag gaaccacccc agcgtgatca 3840 tctggagcct gggcaacgag agcggccacg gcgccaacca cgacgccctg tacaggtgga 3900 tcaagagcgt ggaccccagc aggcccgtgc agtacgaggg cggcggcgcc gacaccaccg 3960 ccaccgacat catctgcccc atgtacgcca gggtggacga ggaccagccc ttccccgccg 4020 tgcccaagtg gagcatcaag aagtggctga gcctgcccgg cgagaccagg cccctgatcc 4080 tgtgcgagta cgcccacgct atgggcaaca gcctgggcgg cttcgccaag tactggcaag 4140 ccttcaggca gtaccccagg ctgcagggcg gcttcgtgtg ggactgggtg gaccagagcc 4200 tgatcaagta cgacgagaac ggcaacccct ggagcgccta cggcggcgac ttcggcgaca 4260 cccccaacga caggcagttc tgcatgaacg gcctggtgtt cgccgacagg accccccacc 4320 ccgccctgac cgaggccaag caccagcagc agttcttcca gttcaggctg agcggccaga 4380 ccatcgaggt gaccagcgag tacctgttca ggcacagcga caacgagctg ctgcactgga 4440 tggtggccct ggacggcaag cccctggcca gcggcgaggt gcccctggac gtggcccccc 4500 agggcaagca gctgatcgag ctgcccgagc tgccccagcc cgagagcgcc ggacagctgt 4560 ggctgaccgt gagggtggtg cagcccaacg ccaccgcctg gagcgaggct ggccacatca 4620 gcgcctggca gcagtggagg ctggccgaga acctgagcgt gaccctgccc gccgccagcc 4680 acgccatccc ccacctgacc acaagcgaga tggacttctg catcgagctg ggcaacaaga 4740 ggtggcagtt caacaggcag agcggcttcc tgagccagat gtggatcggc gacaagaagc 4800 agctgctgac ccccctgagg gaccagttca ccagggcccc cctggacaac gacatcggcg 4860 tgagcgaggc caccaggatc gaccccaacg cctgggtgga gaggtggaag gccgctggcc 4920 actaccaggc cgaggccgcc ctgctgcagt gtaccgccga caccctggcc gacgccgtgc 4980 tgatcaccac cgcccacgcc tggcagcacc agggcaagac cctgttcatc agcaggaaga 5040 cctacaggat cgacggcagc ggccagatgg ctatcaccgt ggacgtggag gtggccagcg 5100 acacccccca ccccgccagg atcggcctga actgccagct ggcccaggtg gccgagaggg 5160 tgaactggct gggcctgggc ccccaggaga actaccccga caggctgacc gccgcctgct 5220 tcgacaggtg ggacctgccc ctgagcgata tgtacacccc ctacgtgttc cccagcgaga 5280 acggcctgag gtgcggcacc agggagctga actacggccc ccaccagtgg aggggcgact 5340 tccagttcaa catcagcagg tacagccagc agcagctgat ggagaccagc cacaggcacc 5400 tgctgcacgc cgaggagggc acctggctga acatcgacgg cttccacatg ggcatcggcg 5460 gcgacgacag ctggagcccc agcgtgagcg ccgagttcca gctgagcgct ggcagatacc 5520 actaccagct ggtgtggtgc cagaagtaac atatgtgact aactaggtac gtagcggccg 5580 cgtcgacgat caggtaagtg tacccaattc gccctatagt gagtcgtatt acaattcact 5640 cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggagatcca atttttaagt 5700 gtataatgtg ttaaactact gattctaatt gtttgtgtat tttagattca cagtcccaag 5760 gctcatttca ggcccctcag tcctcacagt ctgttcatga tcataatcag ccataccaca 5820 tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat 5880 aaaatgaatg ccattgttgt tgttaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa 5940 agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt 6000 ttgtccaaac tcatcaatgt atcttaacgc gctgatttaa atcggtccgc gtacgatgca 6060 tattaccctg ttatccctac cgcggttact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga 6120 aaaccctggc gatgctcttc tcccggtgaa aacctctgac acatggctct tctaaatccg 6180 gagtttaaac gcttccttca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 6240 ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 6300 acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 6360 tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 6420 ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 6480 ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 6540 ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 6600 actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 6660 gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc 6720 tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 6780 caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 6840 atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 6900 acgttaaggg attttggtca tgcctaggtg gcaaacagct attatgggta ttatgggtct 6960 accggtgcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 7020 gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 7080 tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 7140 ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 7200 taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 7260 gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 7320 gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 7380 ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 7440 aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 7500 gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 7560 cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 7620 actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 7680 caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 7740 gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 7800 ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 7860 caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 7920 tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcggga 7980 gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa a 8011 <210> 14 <211> 7844 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 14 taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tcacctggtc 60 ttaagggcta tggcagggcc tgccgccccg acgttggctg cgagccctgg gccttcaccc 120 gaacttgggg ggtggggtgg ggaaaaggaa gaaacgcggg cgtattggcc ccaatggggt 180 ctcggtgggg tatcgacaga gtgccagccc tgggaccgaa ccccgcgttt atgaacaaac 240 gacccaacac cgtgcgtttt attctgtctt tttattgccg tcatagcgcg ggttccttcc 300 ggtattgtct ccttccgtgt ttcactcgag tcagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa 360 ggcgatgcgc tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca 420 ttcgccgcca agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc 480 cgccacaccc agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat 540 attcggcaag caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgcgcgc 600 cttgagcctg gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc 660 ctgatcgaca agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg 720 gtggtcgaat gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat 780 gatggatact ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc 840 gcccaatagc agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg 900 aacgcccgtc gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcctgcagtt cattcagggc 960 accggacagg tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac 1020 ggcggcatca gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata gcctctccac 1080 ccaagcggcc ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atggccgatc ccatggtggc 1140 tctagaggaa tagctcagag gccgaggcgg cttcggcctc tgcataaata aaaaaaatta 1200 gtcagccatg gggcggagaa tgggcggaac tgggcggagt taggggcggg atgggcggag 1260 ttaggggcgg gactatggtt gctgactaat tgagatgcat gctttgcata cttctgcctg 1320 ctggggagcc tggggacttt ccacacctgg ttgctgacta attgagatgc atgctttgca 1380 tacttctgcc tgctggggag cctggggact ttccacaccc taacaagctt gcccgggcag 1440 cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tagctgagct aactataacg 1500 gtcctaaggt agcgaatcga tgcgatcgct taattaacct gcagggatat cccatggggg 1560 ccgcgagctc tcccccgggg gaacagcatg cgtgtcatgc catggcctgg gactagttct 1620 agagcaccgg tgggcccgaa gatctggatc ccgaactgca ttagttatta atagtaatca 1680 attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta 1740 aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 1800 gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg 1860 taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac 1920 gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt 1980 cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg 2040 cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc 2100 attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt 2160 aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 2220 agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagcctt ggggtacccc ggccggccgg 2280 cgcgccacgc gtgggggggg ggggcaattg gccaccatga gatctggcga ccccgtggtg 2340 ctgcagagga gggactggga gaaccccggc gtgacccagc tgaacaggct ggccgcccac 2400 ccccccttcg ccagctggag gaacagcgag gaggccagga ccgacaggcc cagccagcag 2460 ctgaggagcc tgaacggcga gtggaggttc gcctggttcc ccgcccccga ggccgtgccc 2520 gagagctggc tggagtgcga cctgcccgag gccgacaccg tggtggtgcc cagcaactgg 2580 cagatgcacg gctacgacgc ccccatctac accaacgtga cctaccccat caccgtgaac 2640 ccccccttcg tgcccaccga gaaccccacc ggctgctaca gcctgacctt caacgtggac 2700 gagagctggc tgcaggaggg ccagaccagg atcatcttcg acggcgtgaa cagcgccttc 2760 cacctgtggt gcaacggcag gtgggtgggc tacggccagg acagcaggct gcccagcgag 2820 ttcgacctga gcgccttcct gagggctggc gagaacaggc tggccgtgat ggtgctgagg 2880 tggagcgacg gcagctacct ggaggaccag gatatgtgga ggatgagcgg catcttcagg 2940 gacgtgagcc tgctgcacaa gcccaccacc cagatcagcg acttccatgt ggccaccagg 3000 ttcaacgacg acttcagcag ggccgtgctg gaggccgagg tgcagatgtg cggcgagctg 3060 agggactacc tgagggtgac cgtgagcctg tggcagggcg agacccaggt ggccagcggc 3120 accgccccct tcggcggcga gatcatcgac gagaggggcg gctacgccga cagggtgacc 3180 ctgaggctga acgtggagaa ccccaagctg tggagcgccg agatccccaa cctgtacagg 3240 gccgtggtgg agctgcacac cgccgacggc accctgatcg aggccgaagc ctgcgacgtg 3300 ggcttcaggg aggtgaggat cgagaacggc ctgctgctgc tgaacggcaa gcccctgctg 3360 atcaggggcg tgaacaggca cgagcaccac cccctgcacg gccaggtgat ggacgagcag 3420 acaatggtgc aggacatcct gctgatgaag cagaacaact tcaacgccgt gaggtgcagc 3480 cactacccca accaccccct gtggtacacc ctgtgcgaca ggtacggcct gtacgtggtg 3540 gacgaggcca acatcgagac ccacggcatg gtgcccatga acaggctgac cgacgacccc 3600 aggtggctgc ccgccatgag cgagagggtg accaggatgg tgcagaggga caggaaccac 3660 cccagcgtga tcatctggag cctgggcaac gagagcggcc acggcgccaa ccacgacgcc 3720 ctgtacaggt ggatcaagag cgtggacccc agcaggcccg tgcagtacga gggcggcggc 3780 gccgacacca ccgccaccga catcatctgc cccatgtacg ccagggtgga cgaggaccag 3840 cccttccccg ccgtgcccaa gtggagcatc aagaagtggc tgagcctgcc cggcgagacc 3900 aggcccctga tcctgtgcga gtacgcccac gctatgggca acagcctggg cggcttcgcc 3960 aagtactggc aagccttcag gcagtacccc aggctgcagg gcggcttcgt gtgggactgg 4020 gtggaccaga gcctgatcaa gtacgacgag aacggcaacc cctggagcgc ctacggcggc 4080 gacttcggcg acacccccaa cgacaggcag ttctgcatga acggcctggt gttcgccgac 4140 aggacccccc accccgccct gaccgaggcc aagcaccagc agcagttctt ccagttcagg 4200 ctgagcggcc 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gcatattacc ctgttatccc taccgcggtt actggccgtc gttttacaac 5940 gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgatgctc ttctcccggt gaaaacctct gacacatggc 6000 tcttctaaat ccggagttta aacgcttcct tcatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 6060 ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 6120 atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 6180 aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 6240 gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 6300 ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 6360 ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 6420 acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 6480 gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 6540 ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 6600 ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 6660 gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 6720 ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgcctag gtggcaaaca gctattatgg 6780 gtattatggg tctaccggtg catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 6840 aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 6900 taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 6960 gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc 7020 agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 7080 cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 7140 tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 7200 gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc 7260 agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg 7320 gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc 7380 atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct 7440 gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc 7500 tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc 7560 atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 7620 agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 7680 gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 7740 cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 7800 tattgtctcg ggagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaa 7844

Claims (32)

  1. 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편 및 두번째 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하며,
    a. 상기 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편이 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 두번째 인트론을 포함하고;
    b. 상기 두번째 폴리뉴클레오티드 단편이 카세인 유전자의 5' 비번역 영역 (5'UTR)의 적어도 일부를 포함하고; 또한
    c. 상기 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편이 상기 두번째 폴리뉴클레오티드 단편의 5' 에 위치하는, 키메릭 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편은 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 엑손 2의 적어도 일부를 더 포함하는 키메릭 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편은 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자의 엑손 3의 적어도 일부를 더 포함하는 키메릭 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편은 카세인 SERCA2 유전자, 인간 SERCA2 유전자, 또는 마우스 SERCA2 유전자의 단편이고, 상기 두번째 폴리뉴클레오티드 단편은 소 베타-카세인 유전자, 마우스 베타-카세인 유전자, 랫트 베타-카세인 유전자, 또는 양 베타-카세인 유전자의 단편인 키메릭 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편은 서열번호 2 및 4-6 중 어느 하나와 적어도 80% 동일하고, 상기 두번째 폴리뉴클레오티드 단편은 서열번호 3 및 8-10 중 어느 하나와 적어도 80% 동일한 키메릭 폴리뉴클레오티드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편은 서열번호 4의 적어도 60 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 80% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 두번째 폴리뉴클레오티드 단편은 서열번호 3 의 적어도 30 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 80% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메릭 폴리뉴클레오티드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 첫번째 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2를 포함하고, 상기 두번째 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3을 포함하는 키메릭 폴리뉴클레오티드.
  8. 제1항에 있어서, 상기 첫번째 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4를 포함하고, 상기 두번째 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3을 포함하는 키메릭 폴리뉴클레오티드.
  9. 제1항에 있어서, 상기 키메릭 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1과 적어도 80% 동일한 키메릭 폴리뉴클레오티드.
  10. 제1항에 있어서, 상기 키메릭 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7과 적어도 80% 동일한 키메릭 폴리뉴클레오티드.
  11. 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편 및 두번째 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하며,
    a. 상기 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편이 첫번째 진핵 유전자의 적어도 하나의 절단 부위를 포함하고;
    b. 상기 두번째 폴리뉴클레오티드 단편이 두번째 진핵 유전자의 5' 비번역 영역 (5'UTR) 의 적어도 일부를 포함하고; 또한
    c. 상기 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편이 상기 두번째 폴리뉴클레오티드 단편의 5' 에 위치하며, 진핵 발현 벡터의 구성요소인 합성 5' UTR 폴리뉴클레오티드.
  12. 제11항에 있어서, 상기 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편은 첫번째 진핵 유전자의 인트론을 포함하는 합성 5' UTR 폴리뉴클레오티드.
  13. 제12항에 있어서, 상기 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편은 첫번째 진핵 유전자의 5' 인접부위(flanking) 엑손의 적어도 일부를 더 포함하는 합성 5' UTR 폴리뉴클레오티드.
  14. 제12항에 있어서, 상기 첫번째 폴리뉴클레오티드 단편은 첫번째 진핵 유전자의 3' 인접부위 엑손의 적어도 일부를 더 포함하는 합성 5' UTR 폴리뉴클레오티드.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 첫번째 진핵 유전자는 진핵 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자이고, 상기 두번째 진핵 유전자는 카세인 유전자인 합성 5' UTR 폴리뉴클레오티드.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 하기 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인지 서열을 결여한 폴리뉴클레오티드: AsiS I, Pac I, Sbf I, Fse I, Asc I, MIu I, SnaB I, Not I, Sal I, Swa I, Rsr II, BsiW I, Mfe I, Nhe I, Nsi I, CIa I, Nde I, Nsi I, Kpn I, Nco I and Pst I.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 벡터 내로 클로닝을 촉진하기 위한 5' 및 3' 말단에 제한 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  18. 제16항에 있어서, 상기 키메릭 폴리뉴클레오티드는 5' 말단에 Mlu I에 대한 인지 서열 및 3' 말단에 Mfe I에 대한 인지 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  19. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  20. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 합성 유전자 컨스트럭트.
  21. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
  22. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비-인간 유기체.
  23. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환 유기체.
  24. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키트.
  25. 5' 에서 3' 방향으로 배열된 프로모터, 키메릭 폴리뉴클레오티드, 및 발현될 관심 서열을 포함하며,
    a. 상기 키메릭 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 절단 부위를 포함하는 첫번째 진핵 유전자의 폴리뉴클레오티드 단편 및 5' 비번역 영역의 적어도 일부를 포함하는 두번째 진핵 유전자의 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하고; 또한
    b. 상기 키메릭 폴리뉴클레오티드는 프로모터와 발현된 관심 서열 사이에 위치하고, 상기 첫번째 진핵 유전자의 폴리뉴클레오티드 단편은 상기 프로모터 방향에 위치하고, 상기 두번째 진핵 유전자의 폴리뉴클레오티드 단편은 발현될 관심 서열 방향에 위치하는, 합성 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터.
  26. 5' 에서 3' 방향으로 배열된 프로모터, 키메릭 폴리뉴클레오티드, 및 클로닝 부위를 포함하며,
    a. 상기 키메릭 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 절단 부위를 포함하는 첫번째 진핵 유전자의 폴리뉴클레오티드 단편 및 5' 비번역 영역의 적어도 일부를 포함하는 두번째 진핵 유전자의 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하고; 또한
    b. 상기 키메릭 폴리뉴클레오티드는 프로모터와 클로닝 부위 사이에 위치하고, 상기 첫번째 진핵 유전자의 폴리뉴클레오티드 단편은 상기 프로모터 방향에 위치하고, 상기 두번째 진핵 유전자의 폴리뉴클레오티드 단편은 클로닝 부위 방향에 위치하는, 발현 벡터.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 첫번째 진핵 유전자는 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자이고, 상기 두번째 진핵 유전자는 카세인 유전자인 발현 벡터.
  28. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 키메릭 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 7과 적어도 80% 동일한 발현 벡터.
  29. a. 숙주 세포를 제25항의 발현 벡터로 트랜스펙팅하는 단계; 및
    b. 관심 서열의 발현을 얻기에 적절한 조건하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 관심 서열을 발현시키는 방법.
  30. a. 관심 서열을 제26항의 발현 벡터 내에서 발현되도록 클로닝 부위에 삽입하는 단계:
    b. 숙주 세포를 상기 발현 벡터로 트랜스펙팅하는 단계; 및
    c. 관심 서열의 발현을 얻기에 적절한 조건하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 관심 서열을 발현시키는 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 첫번째 진핵 유전자는 근소포체/소포체 칼슘 ATP아제 유전자이고, 상기 두번째 진핵 유전자는 카세인 유전자인 방법.
  32. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 키메릭 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 7과 적어도 80% 동일한 방법.
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