BRPI0817231B1 - vetor de expressão, método para expressar uma sequência de interesse em uma célula hospedeira e kit compreendendo o dito vetor - Google Patents
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Abstract
vetor de expressão, método para expressar uma sequência de interesse em uma célula hospedeira e kit compreendendo o dito vetor a presente invenção fornece 5utrs sintéticas que compreendem um primeiro fragmento de polinucleotídeo e um segundo fragmento de polinucleotídeo, em que o primeiro fragmento de polinucleotídeo compreende pelo menos um sítio de união de um primeiro gene eucariótico, o segundo fragmento de polinucleotídeo compreende pelo menos uma porção de região não traduzida 5 de um segundo gene eucariótico, e o primeiro fragmento de polinucleotídeo está localizado na porção 5 do segundo fragmento de polinucleotídeo. em uma modalidade, o primeiro fragmento de polinucleotídeo compreendo o segundo íntron de um gene de atpase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático e o segundo fragmento de polinucleotídeo compreende pelo menos uma porção da região não traduzida 5 (5'utr) de um gene eucariótico de caseína. as 5utrs sintéticas são usadas para aumentar a expressão de um transgene quando posicionado entre um promotor e um transgene em um vetor de expressão. a presente invenção também fornece vetores que compreendem 5utrs sintéticas e métodos para aumentar a expressão de um transgene usando 5utrs sintéticas.
Description
“VETOR DE EXPRESSÃO, MÉTODO PARA EXPRESSAR UMA SEQUÊNCIA DE INTERESSE EM UMA CÉLULA HOSPEDEIRA E KIT COMPREENDENDO O DITO VETOR”
Antecedentes da invenção
Campo da Invenção
[001]Esta invenção está no campo da biotecnologia. Em particular, ela diz respeito a melhorias no controle pós-transcricional de expressão de gene em células eucarióticas.
Antecedentes da invenção
[002]A expressão de gene eucariótico submete-se a diversos pontos de controle após transcrição de RNAm primário de DNA. O transcrito de RNAm primário compreende porções que codificam (éxons) e porções que não codificam (íntrons). Durante a união do RNAm, íntrons são cortados e removidos do transcrito e éxons são unidos uns nos outros para gerar RNA mensageiro maduro (RNAm). A união serve como um ponto de controle para gerar isoformas de proteínas múltiplas de um gene único por meio da adição e remoção de éxons em várias combinações. Este processo, denominado união alternativa, ocorre em estruturas de multicomponentes rigorosamente reguladas denominadas spliceossomas, que estão no controle de caminhos de sinalização intra e extracelular.
[003]União alternativa na região que codifica de uma proteína pode resultar na geração de múltiplas isoformas com diversas funções. Adicionalmente, mostrouse que a união aumenta muito a síntese protéica em células de mamíferos (Huang e Gorman, 1990 Ácidos nucléicos Research 18(4):937-947). O mecanismo para isto é desconhecido. União alternativa também pode ocorrer nas regiões não traduzidas do transcrito, que podem contribuir como melhoradores ou nos domínios de estabilização do transcrito final, resultando em maior tradução de proteína.
[004]A adição de elementos de união na região regulatória 5' em um cons
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2/60 tructo de gene sintético mostrou aumentar a expressão de gene, teoricamente em decorrência de um melhor transporte de RNAm do núcleo para o citoplasma (Huang e Gorman, supra; Choi et al., 1991 Molecular e Cellular Biology l l(6):3070-3074). Como um resultado deste trabalho, íntrons são frequentemente incluídos entre o promotor e sítio de clonagem múltipla de vetores de expressão de mamíferos disponíveis comercialmente. Entretanto, combinações de íntrons com outras regiões regulatórias não foram avaliadas para aumentar a expressão de gene.
Sumário da invenção
[005]A presente invenção fornece sequências de polinucleotídeo de 5'UTR sintética que são projetadas para aumentar a expressão de um componente de transgene de um constructo de gene sintético em uma célula hospedeira. Sem ficar preso à teoria, as 5'UTRs sintéticas são determinadas de forma que a expressão de um transgene possa aumentar por meio do maior transporte e estabilidade de RNA.
[006]As sequências de 5'UTR sintéticas compreendem um fragmento de polinucleotídeo compreendendo um sítio de união de um primeiro gene eucariótico fundido a um fragmento de polinucleotídeo que codifica uma sequência de 5'UTR de um segundo gene eucariótico que é estável no RNA e em níveis protéicos. Em uma modalidade, a sequência de 5'UTR sintética é uma sequência quimérica que compreende um fragmento de polinucleotídeo compreendendo um sítio de união de um gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático e um fragmento de polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma porção de uma 5'UTR de um gene de caseína.
[007]As sequências de polinucleotídeo de 5'UTR sintética da invenção têm utilidade para aumentar a expressão de uma sequência de interesse ou região que codifica de interesse em um constructo de gene sintético. A sequência sintética de 5'UTR pode ser inserida em vetores virais ou não virais entre um promotor e uma sequência de nucleotídeo de interesse usando técnicas de DNA recombinante. As
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3/60 sequências sintéticas de 5'UTR são opcionalmente flanqueadas pela sequência de nucleotídeos compreendendo sítios de restrição de endonuclease e outros nucleotídeos necessários para a atividade de restrição de endonuclease. As sequências de flanqueamento fornecem opcionalmente sítios de clonagem em um vetor.
[008]A presente invenção também fornece vetores que compreendem 5'UTRs sintéticas. Em uma modalidade da invenção, o vetor é um vetor de expressão eucariótico.
[009]A presente invenção também fornece métodos para aumentar a expressão de um transgene em uma célula eucariótica. Os métodos compreendem as etapas de criar uma sequência sintética de 5'UTR fundindo um fragmento de polinucleotídeo de um primeiro gene eucariótico compreendendo um sítio de união e um fragmento de polinucleotídeo de um segundo gene eucariótico compreendendo pelo menos uma porção de uma 5'UTR para criar uma sequência de polinucleotídeo quimérico, e inserir a sequência de polinucleotídeo quimérico em um vetor de expressão entre um promotor e uma sequência de interesse.
[0010]O Requerente fez a surpreendente descoberta de que uma sequência sintética de 5'UTR criada pela fusão de um fragmento de polinucleotídeo compreendendo um íntron de um gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático com um fragmento de polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma porção de um gene da caseína resulta em maior expressão de gene. Da maneira aqui descrita em detalhes, duas diferentes modalidades de uma 5'UTR sintética aumentaram a expressão de um gene repórter, comparadas ao controle, em dois tipos diferentes de célula transfectada com um vetor de expressão compreendendo a 5 ‘UTR sintética.
[0011]Assim, é um objetivo da invenção fornecer uma sequência sintética de 5'UTR que compreende um fragmento de polinucleotídeo compreendendo um sítio de união fundido a um fragmento de polinucleotídeo compreendendo pelo menos
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4/60 uma porção de uma região não traduzida 5' heteróloga para aumentar a expressão de um transgene em uma célula eucariótica.
[0012]É um outro objetivo da invenção fornecer uma sequência sintética de 5'UTR que compreende um fragmento de polinucleotídeo compreendendo um íntron fundido a um fragmento de polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma porção de região não traduzida 5' heteróloga para aumentar a expressão de um transgene em uma célula eucariótica.
[0013]É um outro objetivo da invenção fornecer uma sequência sintética de 5'UTR que compreende um fragmento de polinucleotídeo compreendendo um íntron que inclui flanquear porções 5' e 3' de éxons vizinhos fundidos a um fragmento de polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma porção de uma região não traduzida 5' heteróloga para aumentar a expressão de um transgene em uma célula eucariótica.
[0014]É um outro objetivo da invenção fornecer uma sequência sintética de 5'UTR que é compatível para inserção em um vetor.
[0015]É um outro objetivo da invenção fornecer vetores que compreendem 5'UTRs sintéticas.
[0016]É um outro objetivo da invenção fornecer células hospedeiras que compreendem 5'UTRs sintéticas.
Descrição das sequências
[0017]SEQ ID NO:1 representa uma modalidade de uma sequência sintética de 5'UTR que compreende: sítio de restrição de Mlul, SEQ ID NO:2, sítio de restrição Kpnl, SEQ ID NO:3, sítio de restrição Mfel. SEQ ID NO:1 também é aqui conhecida como 5U2.
[0018]SEQ ID NO:2 representa uma modalidade de uma sequência 2 de íntron SERC A2 canina com um sítio poli-A de consenso putativo mutado, com uma porção de éxon 2 que flanqueia na extremidade 5' e uma porção de éxon 3 que flan
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5/60 queia na extremidade 3'. SEQ ID NO:2 é uma sequência parcial mutada do cromossomo 26 de Canis familiaris, sequência do tipo espingarda de todo o genoma (acesso público número NC_006608.2).
[0019]SEQ ID NO:3 representa uma modalidade de uma sequência para caseína bovina de 5'UTR. SEQ ID NO:3 é uma sequência parcial do RNAm de beta caseína de Bos taurus de comprimento total (acesso público número NM_181008).
[0020]SEQ ID NO:4 representa uma modalidade de uma sequência 2 tipo selvagem canina de íntron SERC A2, com uma porção de éxon 2 que flanqueia na extremidade 5' e uma porção de éxon 3 que flanqueia na extremidade 3'. SEQ ID NO:4 é uma sequência parcial do cromossomo 26 de Canis familiaris, sequência do tipo espingarda de todo o genoma (acesso público número NC_006608.2).
[0021]SEQ ID NO: 5 representa uma modalidade de uma sequência 2 tipo selvagem humana de íntron SERC A2, com éxon 2 que flanqueia na extremidade 5' e éxon 3 que flanqueia na extremidade 3'. SEQ ID NO: 5 é uma sequência parcial de cromossomo 12 de Homo sapiens, montagem de referência, sequência completa (acesso público número NC_0000 12).
[0022]SEQ ID NO: 6 representa uma modalidade de uma sequência 2 tipo selvagem de camundongo de íntron SERC A2, com éxon 2 que flanqueia na extremidade 5' e éxon 3 que flanqueia na extremidade 3'. SEQ ID NO: 6 é uma sequência parcial do cromossomo 5 de Mus musculus, montagem de referência (acesso público número NC_000071).
[0023]SEQ ID NO:7 representa uma modalidade de uma sequência sintética de 5'UTR que compreende sítio de restrição Ascl, sítio de restrição MIuI, SEQ ID NO:4, sítio de restrição Kpnl, SEQ ID NO:3, sítio de restrição Mfel. SEQ ID NO: 7 também é aqui conhecida como INXN-I.
[0024]SEQ ID NO:8 representa uma modalidade de uma sequência de 5'UTR para caseína de camundongo. SEQ ID NO:8 é uma sequência parcial de Mus
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6/60 musculus para beta caseína, RNAm (clone de DNAc MGC :91065) (acesso público número BC080709).
[0025]SEQ ID NO:9 representa uma modalidade de uma sequência para caseína de rato de 5'UTR. SEQ ID NO:9 é uma sequência parcial de beta caseína de Rattus norvegicus (Csn2), RNAm (acesso público número NM_017120).
[0026]SEQ ID NO:10 representa uma modalidade de uma sequência para caseína de ovelha de 5'UTR. SEQ ID NO: 10 é uma sequência parcial para beta caseína de Ovis aries (CSN2), RNAm, (acesso público número NM OO 1009373).
[0027]SEQ ID NO: 11 representa éxon 3 de canino SERC A2. SEQ ID NO: 11 é uma sequência parcial do cromossomo 26 de Canis familiaris, sequência do tipo espingarda de todo o genoma (acesso público número NC_006608.2) .
[0028]SEQ ID NO: 12 representa uma modalidade de uma sequência de vetor que compreende uma 5'UTR sintética. O vetor representado por SEQ ID NO: 12 compreende SEQ ID NO:1 e é representado esquematicamente na figura 10.
[0029]SEQ ID NO: 13 representa uma outra modalidade de uma sequência de vetor que compreende uma 5'UTR sintética. O vetor representado por SEQ ID NO:13 compreende SEQ ID NO:7 e é representado esquematicamente na figura 11.
[0030]SEQ ID NO: 14 representa um vetor que compreende uma 5'UTR sintética controle (poliG) e é representado esquematicamente na figura 9.
[0031]Em quaisquer destas sequências, T (timidina) pode ser substituída por U (Uracila).
Descrição dos desenhos
[0032]A figura 1A descreve uma representação esquemática do polinucleotídeo de SEQ ID NO:4.
[0033]A figura 1B descreve uma representação esquemática do polinucleotídeo de SEQ ID NO: 5 e do polinucleotídeo de SEQ ID NO:6.
[0034]A figura 1C representa os polinucleotídeos de SEQ ID NO:2 e SEQ ID
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NOS:4-6. O segundo íntron de SERCA2 é destacado em negro. Éxons vizinhos ou suas porções não são destacados.
[0035]A figura 2 A descreve uma representação esquemática do polinucleotídeo de SEQ ID NO:1.
[0036]A figura 2B descreve uma representação esquemática do polinucleotídeo de SEQ ID NO:7.
[0037]A figura 3 A descreve uma representação esquemática de uma 5'UTR sintética inserida em um vetor de expressão entre um promotor e uma sequência de interesse.
[0038]A figura 3B descreve uma representação esquemática de uma 5'UTR sintética inserida em um vetor de expressão entre um promotor e um sítio de clonagem.
[0039]A figura 4 representa resultados de modalidades 5'UTR sintética teste da invenção em células HEK- 293.
[0040]A figura 5 representa resultados de modalidades 5'UTR sintética teste da invenção em células 1080.
[0041]A figura 6 representa resultados de modalidades 5'UTR sintética teste da invenção como o aumento da dobra com relação ao controle em células HEK-293 e células 1080, em que valores controle são normalizados em 1.
[0042]A figura 7 representa um vetor controle usado no exemplo 1 (VVN-
2712) , em que a sequência codificante beta- galactosidase (LacZ) necessita de uma 5'UTR e está operavelmente ligada ao promotor CMV.
[0043]A figura 8 representa um vetor controle usado no exemplo 1 (VVN-
2713) , em que o vetor necessita de uma 5'UTR e LacZ.
[0044]A figura 9 representa um vetor usado no exemplo 1 (VVN-8318), em que sequência codificante beta-galactosidase (LacZ) está operavelmente ligada a poliG 5'UTR e ao promotor CMV.
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[0045]A figura 10 representa um vetor usado no exemplo 1 (VVN-8277), em que sequência codificante beta-galactosidase (LacZ) está operavelmente ligada a uma 5'UTR da invenção (5U2) e ao promotor CMV.
[0046]A figura 11 representa um vetor usado no exemplo 1 (VVN-8276), em que sequência codificante beta-galactosidase (LacZ) está operavelmente ligada a uma 5'UTR da invenção (INXN-I) e ao promotor CMV.
[0047]A figura 12 é uma tabela que contém os dados do exemplo 1 representados nas figuras 4-6.
[0048]A figura 13 representa uma porção de um alinhamento das sequências de SERC A2 genômica e RNAm do Equus caballus que inclui o segundo íntron e éxon 2 e éxon 3. As extremidades 5'e 3' do segundo íntron são indicadas por setas.
[0049]As figuras 7-11 usam as seguintes abreviações: CMV pro = promotor de Citomegalovirus, LacZ = sequência codificante LacZ, SV40pA = poliA SV40, Amp= Gene de resistência à ampicilina, Neo= Gene de resistência à neomicina, MCS = Sítio de clonagem múltipla, SPL-I = porção de éxon 2 SERC A2+ íntron 2 SERC A2 + porção de éxon 3 SERC A2, UTR-I = porção de caseína de 5'UTR.
Descrição detalhada da invenção
[0050]As definições a seguir podem ser aplicadas em toda esta descrição, aos desenhos e às reivindicações que seguem. Entretanto, termos usados na especificação e reivindicações não definidos aqui apresentam significados comuns compreendidos na técnica.
[0051]Quando os termos um ou uma são usados nesta revelação, eles significam pelo menos um ou um ou mais, a menos que de outra forma declarada.
[0052]Ácido nucléico, molécula de ácido nucléico, sequência de ácido nucléico, oligonucleotídeo, sequência de oligonucleotídeo, sequência de nucleotídeo, polinucleotídeo e sequência de polinucleotídeo são usados indiferente
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9/60 mente e se referem à forma polimérica de éster de fosfato de ribonucleosídeos (adenosina, guanosina, uridina ou citidina; moléculas de RNA) ou desoxirribonucleosídeos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina ou desoxicitidina; moléculas de DNA), ou quaisquer análogos de fosfoéster destes, tais como fosforotioatos e tioésteres, tanto na forma de fita simples, ou um hélice fita dupla. Hélices fita dupla DNA- DNA, DNA-RNA e RNA-RNA são possíveis. O termo molécula de ácido nucléico e, em particular, molécula de DNA ou RNA, referem-se apenas à estrutura primária e secundária da molécula, e não limitam-se a nenhuma das formas terciárias particulares. Assim, este termo inclui DNA de fita dupla encontrado, inter alia, em moléculas lineares ou circulares de DNA (por exemplo, fragmentos de restrição), plasmídeos, DNA superespiralado e cromossomos. Na discussão da estrutura de moléculas de DNA de fita dupla particular, as sequências podem ser aqui descritas de acordo com as regras normais de dar apenas a sequência na direção 5'a 3' ao longo da fita não transcrita de DNA (isto é, a fita com uma sequência homóloga ao RNAm). Uma molécula de DNA recombinante é uma molécula de DNA que se submeteu a uma manipulação biológica molecular. O DNA inclui, mas sem limitação, DNAc, DNA genômico, DNA plasmidial, DNA sintética, e DNA semissintético.
[0053]O termo fragmento, usado com relação a uma sequência de polinucleotídeo (por exemplo, fragmento de polinucleotídeo), refere-se a uma sequência de nucleotídeo de menor comprimento com relação ao ácido nucléico de referência e que compreende, com relação à porção comum, uma sequência de nucleotídeo idêntica ao ácido nucléico de referência. Um fragmento de ácido nucléico como este, de acordo com a invenção, pode ser, quando apropriado, incluído em um polinucleotídeo maior do qual ele é um constituinte. Tais fragmentos compreendem, ou consistem alternativamente em, polinucleotídeos que variam em comprimento de pelo menos (6, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 39, 40, 42, 45, 48, 50, 51, 54, 57, 60, 63 , 66, 70, 75, 78 , 80, 90, 100, 105 , 120, 135, 150, 200, 300, 500, 720,
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900, 1.000 ou 1.500 nucleotídeos consecutivos de um ácido nucléico de acordo com a invenção.
[0054]O termo quimérico significa compreendido de fragmentos que não são contíguos em seu estado natural. Por exemplo, um polinucleotídeo quimérico significa um polinucleotídeo compreendendo fragmentos que não são contíguos em seu estado natural.
[0055]O termo sintético usado com relação a uma sequência de polinucleotídeo é um polinucleotídeo não natural (ou porção de um polinucleotídeo) que difere de uma sequência de polinucleotídeo tipo selvagem. Por exemplo, um gene sintético (ou porção de um gene) pode conter uma ou mais sequências de ácidos nucléicos não contíguos na natureza (sequências quimérica), e/ou pode incluir substituições, inserções e deleções e combinações destes.
[0056]Um gene refere-se a um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos que codificam uma molécula funcional (por exemplo, um polipeptídeo ou RNA)., e inclui DNAc ou ácidos nucléicos de DNA genômico. entende-se em geral que o DNA genômico que codifica um polipeptídeo ou RNA inclui regiões não codificantes (isto é íntrons) que são uniões de RNAm maduro e, portanto, não estão presentes no DNAc que codifica o mesmo polipeptídeo ou RNA. Gene pode compreender um fragmento de ácido nucléico que expressa um RNA, proteína ou polipeptídeo específicos. O gene pode compreender adicionalmente sequências regulatórias que precedem (sequências não codificantes 5') e seguem (sequências não codificantes 3') a sequência codificante. O gene também pode compreender oligonucleotídeos que formam triplex (TFOs). Gene nativo refere-se a um gene da maneira observada na natureza com suas próprias sequências regulatórias. Gene quimérico ou gene recombinante refere-se a qualquer gene que não é um gene nativo, compreendendo sequência codificante e/ou regulatória que não são observadas juntas na natureza. Dessa maneira, um gene quimérico pode compreender sequências
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11/60 regulatórias e sequências codificantes que são derivadas de diferentes fontes, ou sequências regulatórias e sequências codificantes derivadas da mesma fonte, mas arranjadas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza. Um gene quimérico pode compreender sequências codificantes derivadas diferentes fontes e/ou sequências regulatórias derivadas de diferentes fontes. Gene endógeno refere-se a um gene nativo em seu local natural no genoma de um organismo.
[0057]Um gene estrangeiro ou gene exógeno ou gene heterólogo ou transgene refere-se a um gene normalmente não encontrado na célula ou organismo hospedeiro, mas que é introduzido na célula ou organismo hospedeiro por transferência de gene. Transgenes podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo, ou genes quiméricos ou sintéticos. Um transgene também pode ser uma versão de DNAc de um gene endógeno. Um gene transgene também pode ser uma versão não mutada de um gene endógeno mutado ou uma versão mutada de um gene não mutado endógeno. Um gene transgene também pode ser um gene terapêutico ou um gene experimental, tal como um repórter. Um transgene pode ser diretamente introduzido nas células alvo de um organismo hospedeiro, ou indiretamente introduzido pela transferência de células transformadas, por exemplo, células autólogas, no organismo hospedeiro.
[0058]A região 5' não traduzida inicial ou 5'UTR de um gene também é entendida como aquela parte de um gene que é transcrito em um transcrito de RNA primário (pré-RNAm) e cuja parte está localizada à montante da sequência codificante. O transcrito primário é o produto de RNA inicial, contendo íntrons e éxons, produzido por transcrição de DNA. Muitos transcritos primários têm que se submeter ao processamento de RNA para formar a espécie de RNA fisiologicamente ativa. O processamento em um RNAm maduro pode compreender apara das extremidades, remoção de íntrons, tamponamento e/ou corte de moléculas individuais de RNA de seus RNAs precursores. Assim, a 5'UTR de um RNAm é aquela parte do RNAm que
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12/60 não é traduzida em proteína e que está localizada à montante da sequência codificante. Em uma sequência genômica, a 5'UTR é tipicamente definida como a região entre o sítio de iniciação de transcrição e o códon inicial. As regiões 5' não traduzidas (5 'UTRs) de RNAm de vertebrados podem ser pouco mais de dez bases a várias centenas bases em comprimento (Crowe et al., 2006 BMC Genomics 7:16).
[0059]Uma 5’UTR sintética é uma 5'UTR não natural que difere de uma sequência de polinucleotídeo 5’UTR tipo selvagem. Uma 5’UTR sintética pode conter uma ou mais sequências de ácidos nucléicos não contíguos na natureza (sequências quimérica), e/ou pode incluir substituições, inserções, e deleções e combinações destes.
[0060]Uma junção de união, junção de união de íntron-éxon , ou sítio de união são regiões nos limites de um íntron em pré-mRNAs eucarióticos reconhecidos por aparelhos de união da célula onde dois éxons vizinhos são unidos e o íntron é deletado. Os sítios de união são representados por sequências conservadas nos limites 5' e 3' de íntron/éxon. Para a grande maioria de íntrons, as principais sequências conservadas são GU que flanqueia a extremidade 5’ do íntron e AG que flanqueia na extremidade 3’. Entretanto, exceções destas sequências consenso também são conhecidas, tais como íntrons com sítios de união AU-AC. O sítio de união 5’ em um limite de íntron-éxon é conhecido como um sítio doador de união. O sítio de união 3' em um limite de íntron-éxon é conhecido como um sítio aceptor de união.
[0061]Um spliceossoma é um grande complexo ribonucleoprotéico que serve como o aparelho de união da célula. O spliceossoma é compreendido de pequenas subunidades de ribonucleoproteínas nucleares (snRNP) que se montam em um substrato pre-RNAm. Os snRNPs são eles mesmos compreendidos de pequenos RNAs nucleares (RNA sns) e diversas subunidades protéicas. Durante a reação de união, o reconhecimento de sítios de união no pre-RNAm é realizado por meio de pareamento de bases com RNA sns.
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[0062]DNA heterólogo refere-se a DNA localizado não naturalmente na célula, ou em um sítio cromossomal da célula. Portanto, o DNA heterólogo inclui um gene estrangeiro à célula. DNA heterólogo também pode incluir um gene que existe naturalmente na célula, mas que existe em um local não nativo. Além do mais, uma molécula heteróloga de DNA pode ser uma molécula de DNA que contém um segmento de DNA não hospedeiro, ligado operavelmente a um segmento de DNA hospedeiro, por exemplo, um promotor de transcrição. Ao contrário, uma molécula heteróloga de DNA pode compreender um gene endógeno ligado operavelmente a um promotor exógeno. Adicionalmente, heterólogo pode referir-se a uma molécula ou fragmento de DNA que é derivado de um gene que não compartilha uma origem evolutiva comum com uma molécula ou fragmento de DNA de referência.
[0063]O termo genoma inclui DNA ou RNA cromossomal, bem como mitocondrial, de cloroplasto e viral DNA ou RNA.
[0064]O termo sonda refere-se a uma molécula de fita simples de ácido nucléico que pode parear base com um ácido nucléico de fita simples complementar alvo para formar uma molécula de fita dupla.
[0065]Uma sequência codificante de DNA refere-se a uma sequência de DNA de fita dupla que codifica um polipeptídeo e pode ser transcrita e traduzida em um polipeptídeo em uma célula in vitro ou in vivo ou no exterior de uma célula, por exemplo, em um tubo, quando colocada no controle de sequências regulatórias apropriadas. O termo sequências regulatórias adequadas refere-se à sequência de nucleotídeos localizados à montante (sequências não codificantes 5'), à jusante (sequências não codificantes 3') de uma sequência codificante ou na mesma, e que influencia a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA, ou tradução da sequência codificante associada. Sequências regulatórias podem incluir promotores, sequências líderes de tradução, íntrons, sequências de reconhecimento de poliadenilação, sítio de processamento de RNA, sítio de ligação efetor e estrutura do tipo
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14/60 haste e lupa. Os limites da sequência codificante são determinados por um códon inicial na terminação 5' (amino) e um códon de parada de tradução na terminação 3' (carboxil). Uma sequência codificante pode incluir, mas sem limitação, sequências procarióticas, eucarióticas ou quiméricas, DNAc de RNAm, sequências de DNA genômico, e ainda sequências sintéticas de DNA.
[0066]Quadro de leitura aberta é abreviado como ORF e refere-se a um comprimento de sequência de ácido nucléico, tanto DNA, DNAc quanto RNA, que compreende um sinal inicial de tradução ou códon de iniciação, tal como um ATG ou AUG, e um códon de terminação e pode ser potencialmente traduzido em uma sequência de polipeptídeo.
[0067]O termo à jusante refere-se a uma sequência de nucleotídeo que está localizada na região 3' de uma sequência referência de nucleotídeo. Em particular, sequência de nucleotídeos à jusante diz respeito em geral às sequências que seguem o ponto inicial de transcrição. Por exemplo, o códon de iniciação de tradução de um gene está localizado à jusante do sítio inicial de transcrição.
[0068]O termo à montante refere-se a uma sequência de nucleotídeo que está localizada 5' de uma sequência referência de nucleotídeo. Em particular, sequência de nucleotídeos à montante diz respeito em geral às sequências que estão localizadas no lado 5' de uma sequência codificante ou ponto inicial de transcrição. Por exemplo, a maioria dos promotores está localizada à montante do sítio inicial de transcrição.
[0069]Quimicamente sintetizado, da maneira relacionada à uma sequência de DNA, significa que os nucleotídeos componentes foram montados in vitro. A síntese química manual de DNA pode ser realizada usando procedimentos bem estabelecidos, ou a síntese química automatizada pode ser realizada usando uma das inúmeras máquinas comercialmente disponíveis. Dessa maneira, os genes podem ser adaptados para expressão ideal de gene com base na otimização de sequência
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15/60 de nucleotídeo para refletir a tendência do códon da célula hospedeira. Os versados na técnica percebem a probabilidade de expressão bem sucedida de gene se códon usual for tendencioso para aqueles códons favorecidos pelo hospedeiro. A determinação de códons preferidos pode ser baseada em uma avaliação de genes derivados da célula hospedeira quando a informação da sequência está disponível.
[0070]Os termos endonuclease de restrição e enzima de restrição são usados indiferentemente e referem-se a uma enzima que se liga e corta em uma sequência específica de nucleotídeo no DNA de fita dupla.
[0071]Polipeptídeo, peptídeo e proteína são usados indiferentemente e referem-se a um composto polimérico compreendido de resíduos de aminoácidos ligados covalentemente. Os aminoácidos apresentam a seguinte estrutura geral:
[0072]Reação em cadeia da polimerase é abreviada por PCR e refere-se a um método in vitro para amplificar enzimaticamente uma sequência específica de ácidos nucléicos. A PCR envolve uma série repetitiva de ciclos de temperatura com cada ciclo compreendendo três estágios: desnaturação do molde de ácido nucléico para separar as fitas da molécula alvo, anelamento de um oligonucleotídeo iniciador de PCR de fita simples ao molde de ácido nucléico, e a extensão do(s) iniciador(s) anelado(s) por DNA polimerase.
[0073]O termo homologia refere-se ao percentual de identidade entre dois polinucleotídeo ou duas frações de polipeptídeo. A correspondência entre a sequência de uma fração para uma outra pode ser determinada por técnicas conhecidas na tecnologia. Por exemplo, a homologia pode ser determinada por uma comparação direta da informação de sequência entre duas moléculas de polipeptídeo alinhado a informação da sequência e usando programas de computado facilmente disponíveis. Alternativamente, a homologia pode ser determinada por hibridização de polinucleotídeos em condições que formam duplexes estáveis entre regiões homólogas, seguida por digestão com nuclease(s) específica(s) de fita simples e determinação do
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16/60 tamanho dos fragmentos digeridos.
[0074]Da maneira aqui usada, o termo homólogo em todas as suas formas gramaticais e variações de ortografia refere-se à relação entre proteínas que possuem uma origem evolutiva comum, incluindo proteínas de superfamílias (por exemplo, a superfamília imunoglobulina) e proteínas homólogas de espécies diferentes (por exemplo, cadeia leve de miosina, etc.) (Reeck et al., Cell 50:667 (1987)). Tais proteínas (e seus genes codificantes) apresentam homologia de sequência, da maneira refletida por seu alto grau de similaridade de sequência. Entretanto, no uso comum e no presente pedido, o termo homólogo, quando modificado com um advérbio tal como altamente, pode se referir à similaridade de sequência e uma origem evolutiva não comum.
[0075]Dessa maneira, o termo similaridade de sequência em todas as suas formas gramaticais refere-se ao grau de identidade ou correspondência entre ácido nucléico ou sequências de aminoácidos de proteínas que podem ou não compartilhar uma origem evolutiva comum (ver Reeck et al., Cell 50:667 (1987)). Em uma modalidade, duas sequências de DNA são substancialmente homólogas ou substancialmente similares quando pelo menos cerca de 21 % (preferivelmente pelo menos cerca de 50 %, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 75 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 %) dos nucleotídeos igualam o comprimento definido das sequências de DNA. As sequências que são substancialmente homólogas podem ser identificadas comparando as sequências usando software padrão disponível em bancos de dados de sequência, ou em um experimento de hibridização Southern em, por exemplo, condições restritivas da maneira definida para aquele sistema particular. A definição apropriada de condições de hibridização é realizada pelos versados na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, infra).
[0076]Da maneira aqui usada, substancialmente similar refere-se a fragmentos de ácido nucléico, em que mudanças em uma ou mais bases de nucleotí
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17/60 deos resultam na substituição de um ou mais aminoácidos, mas não afetam as propriedades funcionais da proteína codificada pela sequência de DNA. Substancialmente similar também refere-se a fragmentos de ácido nucléico, em que mudanças em uma ou mais bases de nucleotídeos não afetam a capacidade do fragmento de ácido nucléico mediar a alteração da expressão de gene por tecnologia antissentido ou de co-supressão. Substancialmente similar também refere-se a modificações dos fragmentos de ácido nucléico da presente invenção tal como deleção ou inserção de uma ou mais bases de nucleotídeos que não afetam substancialmente as propriedades funcionais do transcrito resultante. Portanto, entende-se que a invenção inclui mais que as sequências exemplares específicas. Cada uma das modificações propostas encontra-se na rotina dos versados na técnica, já que é determinação de conservação da atividade biológica dos produtos codificados.
[0077]Além do mais, os versados na técnica reconhecem que sequências substancialmente similares incluídas por esta invenção também são definidas por sua capacidade de hibridizar em condições restritivas. Uma molécula de ácido nucléico é hibridizável em uma outra molécula de ácido nucléico, tais como um DNAc, DNA genômico, ou RNA, quando uma forma de fita simples da molécula de ácido nucléico pode anelar com outra molécula de ácido nucléico nas condições apropriadas de temperatura e concentração iônica de solução (ver, Sambrook et al., 1989 infra). Condições de hibridização e lavagem são bem conhecidas e exemplificadas em Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), particularmente capítulo 11 e tabela 11.1. As condições de temperatura e concentração iônica determinam a severidade da hibridização.
[0078]Condições de severidade podem ser ajustadas para selecionar fragmentos moderadamente similares, tais como sequências homólogas de organismos relacionados de maneira distante, para fragmentos altamente similares, tais como
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18/60 genes que duplicam enzimas funcionais de organismos relacionados de maneira muito próxima. Para seleção preliminar de ácidos nucléicos homólogos, condições de hibridização de baixa severidade, correspondentes a um Tm de 55 °C, podem ser usadas, por exemplo, 5XSSC, SDS 0,1 %, leite 0,25 %, e nenhuma formamida; ou formamidea 30 %, 5XSSC, SDS 0,5 %. Condições de hibridização de severidade moderada correspondem a um maior Tm, por exemplo, formamida 40 %, com 5X ou 6XSSC. Condições de hibridização de alta severidade correspondem ao maior Tm, por exemplo, formamida 50 %, 5X ou 6X SSC.
[0079]A hibridização exige que os dois ácidos nucléicos contenham sequências complementares, embora dependa da severidade da hibridização, o mal emparelhamento entre bases é possível. O termo complementaridade é usado para descrever a relação entre bases de nucleotídeos que são capazes de hibridizar uma na outra. Por exemplo, com relação ao DNA, a adenosina é complementar à timina e a citosina é complementar à guanina. Dessa maneira, a presente invenção também inclui fragmentos isolados de ácido nucléico que são complementares à sequências completas da maneira aqui revelada ou usada, bem como aquela sequência substancialmente similar de ácidos nucléicos.
[0080]Em uma modalidade, os polinucleotídeos são detectados empregando condições de hibridização que compreendem uma etapa de hibridização em Tm de 55 °C, e utilizando condições apresentadas anteriormente. Em uma outra modalidade, o Tm é 60 oC; em certas modalidades, o Tm é 63 °C ou 65 °C.
[0081]Lavagens após a hibridização também determinam condições de severidade. Um ajuste de condições preferidas usa uma série de lavagens iniciando com 6XSSC, SDS 0,5 % em temperatura ambiente por 15 minutos (min), a seguir repetido com 2XSSC, SDS 0,5 % a 45 °C por 30 minutos, e a seguir repetido duas vezes com 0,2XSSC, SDS 0,5 % a 50 oC por 30 minutos. Um outro exemplo de condições restritivas usa temperaturas mais altas nas quais as lavagens são idênticas
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19/60 àquelas anteriores com exceção para a temperatura das duas lavagens finais por 30 minutos em 0,2XSSC, SDS 0,5 % aumentou para 60 oC. Ainda um outro exemplo de condições altamente restritivas usa duas lavagens finais em 0,1IXSSC, SDS 0,1 % a 65 °C. A hibridização exige que os dois ácidos nucléicos compreendam sequências complementares, embora dependam da severidade da hibridização, o mal emparelhamento entre bases é possível.
[0082]A severidade apropriada para hibridizar ácidos nucléicos depende do comprimento dos ácidos nucléicos e do grau de complementação, varáveis bem conhecidas na técnica. Quanto maior o grau de similaridade ou homologia entre duas sequências de nucleotídeos, tanto maior o valor de Tm para híbridos de ácidos nucléicos com aquelas sequências. A estabilidade relativa (que corresponde ao maior Tm) das hibridizações de ácido nucléico diminui na seguinte ordem: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para híbridos maiores que 100 nucleotídeos em comprimento, equações para calcular Tm foram derivadas (ver, Sambrook et al., supra, 9.50-0.51). Para hibridização com ácidos nucléicos menores, isto é, oligonucleotídeos, a posição de maus emparelhamentos torna-se mais importante, e o comprimento do oligonucleotídeo determina sua especificidade (ver Sambrook et al., supra, 11.7-11.8).
[0083]Em uma modalidade, polinucleotídeos são detectados empregando condições de hibridização que compreendem uma etapa de hibridização em menos que 500 mM de sal e pelo menos 37 °C, e uma etapa de lavagem em 2XSSPE em pelo menos 63 °C. Em uma outra modalidade, as condições de hibridização compreendem menos que 200 mM de sal e pelo menos 37 °C para a etapa de hibridização. Em certas modalidades, as condições de hibridização compreendem 2XSSPE e 63 °C tanto para a etapa de hibridização quanto para a etapa de lavagem.
[0084]O comprimento para um ácido nucléico hibridizável é, por exemplo, de pelo menos cerca de 10 nucleotídeos. Um comprimento mínimo para um ácido nucléico hibridizável pode ter pelo menos cerca de 15 nucleotídeos; pelo menos cerca
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20/60 de 20 nucleotídeos; ou pelo menos 30 nucleotídeos. Além do mais, os versados na técnica reconhecerão que a temperatura e concentração de sal na solução de lavagem podem ser ajustados de maneira necessária, de acordo com fatores tal como comprimento da sonda.
[0085]Fragmentos substancialmente similares de ácido nucléico da presente invenção são aqueles fragmentos de ácido nucléico cujas sequências de DNA são pelo menos 70 % idênticas à sequência de DNA dos fragmentos de ácido nucléico aqui relatada. Os fragmentos de ácido nucléico da presente invenção incluem aqueles fragmentos de ácido nucléico cujas sequências de DNA são pelo menos 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, e 99 % idênticas à sequência de DNA dos fragmentos de ácido nucléico aqui relatada.
[0086]O termo correspondente a é aqui usado para referir-se às sequências similares ou homólogas, se a posição exata é idêntica ou diferente da molécula para a qual a similaridade ou homologia é medida. Um alinhamento de sequência de ácido nucléico ou aminoácido pode incluir espaços. Assim, o termo correspondente a refere-se à similaridade de sequência e não à numeração dos resíduos de aminoácidos ou bases de nucleotídeos.
[0087]Uma porção substancial de uma sequência de aminoácido ou de nucleotídeo compreende quantidade suficiente da sequência de aminoácido de um polipeptídeo ou da sequência de nucleotídeo de um gene para identificar putativamente este polipeptídeo ou gene, tanto por avaliação manual da sequência pelos versados na técnica, quanto por comparação e identificação de sequência automatizada em computador usando algoritmos tal como BLAST (Ferramenta de pesquisa de alinhamento local básico; Altschul et al., J. MoI. Biol. 215:403 410 (1993)); BLAST está publicamente disponível na rede de alcance mundial. Em geral, uma sequência de dez ou mais aminoácidos contíguos ou trinta ou mais nucleotídeos é necessária a fim de identificar putativamente uma sequência de polipeptídeo ou de ácido nucléico
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21/60 como homólogo a uma proteína ou gene conhecidos. Além disso, com relação à sequência de nucleotídeos, sondas de oligonucleotídeo de gene específico compreendendo 20 a 30 nucleotídeos contíguos podem ser usadas em métodos dependentes de sequência de identificação de gene (por exemplo, hibridização Southern) e isolamento (por exemplo, hibridização in situ de colônias bacterianas ou placas de bacteriófago). Além do mais, oligonucleotídeos pequenos de 12 a 15 bases podem ser usados como oligonucleotídeos iniciadores de amplificação em PCR a fim de obter um fragmento particular de ácido nucléico que compreende os oligonucleotídeos iniciadores. Dessa maneira, uma porção substancial de uma sequência de nucleotídeo compreende quantidade suficiente da sequência para identificar especificamente e/ou isolar um fragmento de ácido nucléico que compreende a sequência.
[0088]O termo similaridade percentual, da maneira conhecida na técnica, é uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeos ou duas ou mais sequências de polinucleotídeos, determinada comparando as sequências. Na técnica, identidade também significa o grau de ligação de sequência entre polipeptídeo ou sequências de polinucleotídeos, uma vez que o caso pode ser da maneira determinada pelo emparelhamento entre cadeias de tais sequências. Identidade e similaridade podem ser facilmente calculadas por métodos conhecidos, incluindo, mas sem limitações, aqueles descritos em: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genoma Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analisys of Sequency Data, Part I (Griffin, A. M., e Griffin, H. G., eds.) Human Press, New Jersey (1994); Sequency Analisys in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); e Sequency Analisys Primer (Gribskov, M. e Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991). Métodos para determinar a identidade são designados para fornecer o melhor emparelhamento entre as sequências testadas. Métodos para determinar a identidade e similaridade são codificados em programas
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22/60 de computador publicamente disponíveis. Os alinhamentos de sequência e cálculos de identidade percentual podem ser realizados usando o programa Megalign do conjunto computacional de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). Alinhamentos múltiplos das sequências podem ser realizados usando o método de alinhamento Clustal (Higgins et al., CABIOS. 5:151 153 (1989)) com os parâmetros padrões (PENALIDADE DE INTERVALO=IO, COMPRIMENTO DE PENALIDADE DE INTERVALO=IO). Os parâmetros default para alinhamentos no sentido de pareamento usando o método Clustal podem ser selecionados: KTUPLE 1, PENALIDADE DE INTERVALO=3, WINDO W=5 e DIAGONALS SAVED=5.
[0089]O termo software de análise de sequência refere-se a qualquer programa de software ou algoritmo de computador que é usado para a análise de nucleotídeo ou sequências de aminoácidos. Software de análise de sequência pode ser comercialmente disponível ou desenvolvido independentemente. Software típicos de análise de sequência incluirão, mas sem limitação, o conjunto GCG de programas (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI), BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. MoI. Biol. 215:403 410 (1990)), e DNASTAR (DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA). No contexto deste pedido, entende-se que quando o software de análise de sequência é usado para análise, os resultados da análise serão baseados nos valores padrões do programa recomendado, a menos que de outra forma declarada. Da maneira aqui usada valores padrões significarão qualquer ajuste de valores ou parâmetros que carregam originalmente com o software quando inicializados primeiro.
[0090]Da maneira aqui usada, os termos expressão ou expressão de gene referem-se ao processo de converter informação genética codificada em um gene no RNA (por exemplo, RNAm, RNAr, RNAt, ou RNA sn) por meio de transcrição do gene (isto é, por meio da ação enzimática de uma RNA polimerase), e para genes codificantes de proteína, em proteína por meio da tradução de RNAm.
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[0091]A expressão de gene pode ser regulada em muitos estágios no processo. Suprarregulação ou ativação refere-se à regulação que aumenta a produção de expressão de produtos de gene (isto é, RNA ou proteína), enquanto infrarregulação ou repressão refere-se à regulação que diminui a produção. Fatores (por exemplo, fatores de transcrição) que estão envolvidos na suprarregulação ou infrarregulação são frequentemente denominados “ativadores” e “repressores”, respectivamente. Com os propósitos da invenção, um gene alvo pode ser infrarregulado pós-transcricionalmente (isto é, no nível do transcrito de RNA) por meio de interação específica com uma molécula de RNA infrarregulada.
[0092]O termo Sequências controle transcricionais e translacionais referese a sequências de DNA regulatórias, tais como promotores, melhoradores, terminadores e similares, que fornecem a expressão de uma sequência codificante em uma célula hospedeira.
[0093]O termo ligado operavelmente refere-se à associação de sequência de ácidos nucléicos em um fragmento único de ácido nucléico de forma que o função de um seja afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor está operavelmente ligado a uma sequência codificante quando é capaz de afetar a expressão daquela sequência codificante (isto é, que a sequência codificante está no controle transcricional do promotor). Sequências codificantes podem estar ligadas operavelmente às sequências regulatórias na orientação sentido ou antissentido.
[0094]Um vetor refere-se a qualquer veículo para a clonagem de e/ou transferência de um ácido nucléico em uma célula hospedeira. Um vetor pode ser um replicon no qual um outro segmento de DNA pode ser anexado de maneira a promover a replicação do segmento anexado. Um replicon refere-se a qualquer elemento genético (por exemplo, plasmídeo, fago, cosmídeo, cromossomo, vírus) destas funções como uma unidade autônoma de replicação de DNA in vivo, isto é, capaz de replicação em seu próprio controle. O termo vetor inclui tanto veículos
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24/60 virais quanto não virais para introduzir o ácido nucléico em uma célula hospedeira in vitro, ex vivo ou in vivo. O termo vetor também pode incluir DNAs em minicírculos. Por exemplo, o vetor pode ser um plasmídeo sem sequências bacterianas de DNA. A remoção de sequências bacterianas de DNA que são ricas em regiões CpG mostrou diminuir a expressão de silenciamento de transgene e resulta em expressão mais persistente de vetores de DNA plasmidial (ver, por exemplo, Ehrhardt, A. et al. (2003) Hum Gene Ther 10: 215-25; Yet, N. S. (2002) MoI Ther 5: 731-38; Chen, Z. Y. et al. (2004) Gene Ther 11 : 856-64). O termo vetor também pode incluir transposons tal como Sleeping Beauty (Izsvak et al. J. MoI. Biol. 302:93-102 (2000)), ou cromossomos artificiais.
[0095]Um grande número de vetores conhecidos na técnica pode ser usado para manipular ácidos nucléicos, incorporar elementos de resposta e promotores nos genes, etc.ou transferir um ácido nucléico em uma célula hospedeira. Vetores possíveis incluem, por exemplo, plasmídeos ou vírus modificados incluindo, por exemplo, bacteriófagos, tais como derivados lambda, ou plasmídeos tais como derivados de plasmídeo pBR322 ou pUC, ou o vetor Bluescript. Vetores maiores tais como cromossomos artificiais (bactérias (BAC), levedura (YAC) ou humano (HAC)) podem ser usados para acomodar inserções maiores. Por exemplo, a inserção dos fragmentos de DNA que correspondem aos elementos de resposta ou promotores em um vetor adequado pode ser realizada elemento de ligação os fragmentos de DNA apropriados em um vetor de escolha que apresenta terminações coesivas de complementaridade. Alternativamente, as extremidades das moléculas de DNA podem ser enzimaticamente modificadas ou qualquer sítio pode ser produzido ligando a sequência de nucleotídeos (ligantes) nas terminações de DNA. Tais vetores podem ser modificados por engenharia para conter genes marcadores selecionáveis que fornecem a seleção de células transferidas ou transformadas com o vetor. Um vetor recombinante que compreende um polinucleotídeo de acordo com a invenção
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25/60 pode incluir uma ou mais origens para replicação nos hospedeiros celulares, nos quais sua amplificação ou sua expressão é procurada, marcadores ou marcadores selecionáveis.
[0096]O termo marcador selecionável refere-se a um fator de identificação, em geral um gene de resistência à antibiótico ou composto químico, que é capaz de ser selecionado com base no efeito do gene marcador, isto é, resistência a um antibiótico, resistência a um herbicida, marcadores colorimétricos, enzimas, marcadores fluorescentes e similares, em que o efeito é usado para localizar a herança de um ácido nucléico de interesse e/ou para identificar ou selecionar uma célula ou organismo que herdou o ácido nucléico de interesse. Exemplos de genes marcadores selecionáveis conhecidos e usados na técnica incluem: genes que fornecem resistência à ampicilina, estreptomicina, gentamicina, canamicina, higromicina, herbicida bialafos, sulfonamida e similares; e genes que são usados como marcadores fenotípicos, isto é, genes reguladores de antocianina, gene isopentanil transferase e similares.
[0097]O termo gene repórter refere-se a um ácido nucléico que codifica um fator de identificação que é capaz de ser identificado com base no efeito do gene repórter, em que o efeito é usado para localizar a herança de um ácido nucléico de interesse, para identificar uma célula ou organismo que herdou o ácido nucléico de interesse, e/ou para medir a expressão de indução ou transcrição de gene. Exemplos de genes repórteres conhecidos e usados na técnica incluem: luciferase (Luc), proteínas fluorescentes tais como proteína fluorescente verde (GFP), cloranfenicol acetiltransferase (CAT), beta-galactosidase (LacZ), beta-glucuronidase (Gus) e similares. Genes marcadores selecionáveis também podem ser considerados genes repórteres.
[0098]O termo plasmídeo refere-se a um elemento extracromossômico que frequentemente carrega um gene que não faz parte do metabolismo central da célu
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26/60 la, e está comumente na forma de moléculas de DNA circular fita dupla. Tais elementos podem ser autonomamente sequências de replicação, sequências que integram o genoma, fago ou sequência de nucleotídeos, linear, circular, ou superespiralada, de um DNA ou RNA de fita dupla ou simples, derivada de qualquer fonte, na qual inúmeras sequências de nucleotídeos são unidas ou recombinadas em uma construção exclusiva que é capaz de introduzir um fragmento promotor e sequência de DNA para um produto de gene selecionado junto com sequência não traduzida 3' apropriada em uma célula.
[0099]Um vetor de clonagem refere-se a um replicon, que é um comprimento de unidade de um ácido nucléico, por exemplo, DNA, que replica sequencialmente e que compreende uma origem de replicação, tal como um plasmídeo, fago ou cosmídeo, no qual um outro segmento de ácido nucléico pode ser anexado de maneira a promover a replicação do segmento anexado. Vetores de clonagem podem ser capazes de replicação em um tipo de célula e expressão em um outro tipo (vetor de transporte).
[00100]O termo vetor de expressão refere-se a um vetor, plasmídeo ou veículo designado para permitir a expressão de uma sequência inserida de ácido nucléico após a transformação em uma célula hospedeira. O gene clonado, isto é, a sequência inserida de ácido nucléico, é em geral colocada no controle de elementos de controle tais como um promotor, um promotor mínimo, um melhorador ou similares. Regiões de iniciação de controle ou promotores, que são usados para dirigir a expressão de um ácido nucléico na célula hospedeira são numerosos e familiares aos versados na técnica.
[00101]Vetores podem ser introduzidos nas células hospedeiras desejadas por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, transfecção, electroporação, microinjeção, transdução, fusão celular, dextran DEAE, precipitação de fosfato de cálcio, lipofecção (fusão de lisossomo), uso de uma arma genética, ou um transporta
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27/60 dor de vetor de DNA (ver, por exemplo, Wu et al, J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992); Wu et al, J. Biol. Chem. 263:14621-14624 (1988); e Hartmut et al., pedido de patente Cadadense 2.012.311, depositado em 15 de março de 1990).
[00102]Exemplos de vetores eucarióticos incluem, mas sem limitação, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl e pSG disponíveis pela Stratagene; pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL disponíveis pela Amersham Pharmacia Biotech; e pCMVDsRed2express, pIRES2-DsRed2, pDsRed2-Mito, pCMV-EGFP disponíveis pela Clontech. Muitos outros vetores são bem conhecidos e disponíveis comercialmente.
[00103]Por exemplo, vetores usados, que compreendem eixos de inserção molecular para inserção e remoção rápida de elementos de programas de gene, são descritos no pedido de patente publicada dos Estados Unidos 2004/0185556, pedido de patente dos Estados Unidos 11/233.246 e pedidos internacionais publicados WO 2005/040336 e WO 2005/116231.
[00104]Promotor e sequência promotora são usados indiferentemente e referem-se a uma sequência de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência codificante ou RNA funcional. Em geral, uma sequência codificante está localizada na região 3' em uma sequência promotora. Os promotores podem ser derivados na sua totalidade de um gene nativo, ou ser composto de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou ainda compreender segmentos sintéticos de DNA. Os versados na técnica entendem que promotores diferentes podem dirigir a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos celulares, ou em diferentes estágios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientai ou fisiológicas.
[00105]Promotores que fazem com que um gene seja expresso na maioria dos tipos celulares são na maioria das vezes comumente referidos como promotores constitutivos. Promotores que causam um gene a ser expresso em um tipo celular específico são comumente referidos como promotores condicionais. Exemplos
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28/60 não limitantes de promotores condicionais são promotores específicos de célula ou promotores específicos de tecido. Promotores que fazem com que um gene seja expresso em um estágio específico de desenvolvimento ou diferenciação celular são comumente referidos como promotores específicos para o desenvolvimento ou promotores específicos para diferenciação celular. Promotores que são induzidos e fazem com que gene seja expresso após exposição ou tratamento da célula a um agente, molécula biológica, elemento químico, elemento de ligação, luz, ou similares que induzem o promotor, são comumente referidos como promotores indutíveis ou promotores reguláveis. Um exemplo não limitante do promotor indutível é um promotor indutível TetO. Reconhece-se adicionalmente que uma vez que na maioria dos casos os limites exatos de sequências regulatórias não são completamente definidos, fragmentos de DNA de diferentes comprimentos podem ter atividade promotora idêntica.
[00106]A sequência promotora é tipicamente ligada em sua terminação 3' pelo sítio de iniciação de transcrição e estende-se à montante (direção 5') para incluir o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar a transcrição em níveis detectáveis no ambiente anterior. Na sequência promotora será encontrado um sítio de iniciação de transcrição (convenientemente definido, por exemplo, mapeando com nuclease Sl), bem como domínios de ligação de proteína (sequências consenso) responsáveis pela ligação de RNA polimerase.
[00107]Uma sequência codificante está no controle de sequências controle transcricionais e translacionais em uma célula quando a RNA polimerase transcreve a sequência codificante no RNAm, que é então unido em trans-RNA (se a sequência codificante contiver íntrons) e traduzida na proteína codificada pela sequência codificante.
[00108]Regiões controle de terminação, isto é, sequências terminadoras ou de poliadenilação, também podem ser derivadas de vários genes nativos nos hos
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29/60 pedeiros preferidos. Opcionalmente, um sítio de terminação pode ser desnecessário, entretanto, pode ser incluído. Em uma modalidade da invenção, a região controle de terminação pode ser compreendida ou derivada de uma sequência sintética, sinal de poliadenilação sintético, um sinal de poliadenilação posterior SV40, um sinal de poliadenilação SV40, um sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino (BGH), sequências terminadoras virais ou similares.
[00109]O termo transfecção refere-se à absorção de RNA ou DNA exógeno ou heterólogo por uma célula. Uma célula é transfectada por RNA ou DNA exógeno ou heterólogo quando tal RNA ou DNA é introduzido na célula. O RNA ou DNA transfectado pode estar integrado (ligado covalentemente) no DNA cromossômico compondo o genoma da célula hospedeira.
[00110]“Transformação” refere-se à transferência de um fragmento de ácido nucléico no genoma de um organismo hospedeiro, resultando em herança geneticamente estável.
[00111]As palavras “modular” e “modula” significam induzir, reduzir, ou inibir a expressão do ácido nucléico ou do gene, o que resulta na indução, redução ou inibição respectivas de produção de proteína ou de polipeptídeo.
[00112]Transcrito de RNA refere-se ao produto que resulta da transcrição catalisada pela RNA polimerase de uma sequência de DNA. Quando o transcrito de RNA é uma cópia complementar perfeita da sequência de DNA, ele é referido como o transcrito primário ou pode ser uma sequência de RNA derivada de processamento pós-transcricional do transcrito primário e é referido como o RNA maduro. RNA mensageiro (RNAm) refere-se ao RNA que está sem íntrons e que pode ser traduzido em proteína pela célula. DNAc refere-se a um DNA de fita dupla que é complementar ao RNAm e derivado do mesmo. RNA sentido refere-se ao transcrito de RNA que inclui o RNAm e pode ser assim traduzido em proteína pela célula.
[00113]Uma modalidade da invenção é um polinucleotídeo de 5'UTR sintéti
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30/60 ca compreendendo um primeiro fragmento de polinucleotídeo e um segundo fragmento de polinucleotídeo, em que:
a. o primeiro fragmento de polinucleotídeo compreende pelo menos um sítio de união de um primeiro gene eucariótico;
b. o segundo fragmento de polinucleotídeo compreende pelo menos uma porção de região não traduzida 5' de um segundo gene eucariótico; e
c. o primeiro fragmento de polinucleotídeo está localizado na região 5' do segundo fragmento de polinucleotídeo.
[00114]Em uma outra modalidade da invenção, a 5'UTR sintética é um polinucleotídeo quimérico compreendendo um primeiro fragmento de polinucleotídeo e um segundo fragmento de polinucleotídeo, em que:
a. o primeiro fragmento de polinucleotídeo compreende o segundo íntron de um gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático;
b. o segundo fragmento de polinucleotídeo compreende pelo menos uma porção da região não traduzida 5' (5'UTR) de um gene da caseína; e
c. o primeiro fragmento de polinucleotídeo está localizado na região 5' do segundo fragmento de polinucleotídeo.
[00115]O fragmento de polinucleotídeo compreendendo o segundo íntron de um gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático pode ser derivado de qualquer gene eucariótico de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático. Em uma modalidade da invenção, o fragmento de polinucleotídeo compreendendo o segundo íntron de um gene eucariótico de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático é derivado de um gene SERCA2. Em outras modalidades, ele é derivado de um gene SERC A1 ou SERC A3. O gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático que é a fonte do fragmento de polinucleotídeo compreendendo o segundo íntron pode ser de qualquer espécie eucariótica. Em uma modalidade, o gene de ATPase de cálcio do retículo
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31/60 sarcoplasmático/endoplasmático é de uma espécie de mamífero. Em uma outra modalidade, o gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático é de uma espécie de ave. Em uma outra modalidade, o gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático é de uma espécie de peixe. Em modalidades específicas, o fragmento de polinucleotídeo compreendendo o segundo íntron é derivado do gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático de um humano, um cachorro ou um camundongo. Em outras modalidades específicas, o fragmento de polinucleotídeo compreendendo o segundo íntron é derivado do gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático de um rato, de um chimpanzé, de uma galinha, de um cavalo, de uma vaca, de um alce, de um porco, de um gato, de um macaco reso ou de um peixe zebra.
[00116]Em uma outra modalidade da invenção, o fragmento de polinucleotídeo compreendendo o segundo íntron de um gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático compreende uma porção de éxon 2 que flanqueia na extremidade 5' e uma porção de éxon 3 que flanqueia na extremidade 3'. Em uma outra modalidade, o fragmento de polinucleotídeo compreendendo o segundo íntron de um gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático compreende todo o éxon 2 que flanqueia na extremidade 5' e todo o éxon 3 que flanqueia na extremidade 3'.
[00117]O fragmento de polinucleotídeo compreendendo o segundo íntron de um gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático pode ter pelo menos cerca de 50 nucleotídeos em comprimento. Em outras modalidades, o fragmento de polinucleotídeo compreendendo o segundo íntron de um gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático pode ter pelo menos cerca de 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, ou 250 nucleotídeos em comprimento.
[00118]Em uma outra modalidade da invenção, o fragmento de polinucleotí
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32/60 deo compreendendo o segundo íntron de um gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático é mutado em um sítio poliA de consenso putativo. Em uma outra modalidade, o fragmento de polinucleotídeo que compreende o segundo íntron de um gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático compreende uma região 5' que flanqueia porção de éxon 2 e uma região 3' que flanqueia porção de éxon 3, e é mutado em um sítio poliA de consenso putativo, e é derivado de um gene SERCA2 canino; em uma modalidade específica e;e representado pela SEQ ID NO:2.
[00119]Em outras modalidades, o fragmento de polinucleotídeo compreendendo o segundo íntron de um gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático é uma sequência SERCA2 tipo selvagem ou parcialmente mutada. O fragmento de polinucleotídeo pode ser derivado de qualquer gene SERCA2 de comprimento total de qualquer espécie. Por exemplo, em uma modalidade, o fragmento de polinucleotídeo compreendendo o segundo íntron de um gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático é uma sequência SERCA2 genômica tipo selvagem parcial canina que compreende uma porção de éxon 2 que flanqueia na extremidade 5' e uma porção de éxon 3 que flanqueia na extremidade 3'; em uma modalidade específica, é representado por SEQ ID NO:4. SEQ ID NO:4 é representado esquematicamente na figura 1A e figura 1C. Em uma outra modalidade, o fragmento de polinucleotídeo compreendendo o segundo íntron de um gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático é uma sequência SERCA2 genômica tipo selvagem parcial humana que compreende éxon 2 que flanqueia na extremidade 5' e éxon 3 que flanqueia na extremidade 3'; em uma modalidade específica, é representado por SEQ ID NO:5. Em uma outra modalidade, o fragmento de polinucleotídeo compreendendo o segundo íntron de um gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático é um SERC A2 de sequência genômica tipo selvagem parcial de murino que compreende éxon 2 que
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33/60 flanqueia na extremidade 5' e éxon 3 que flanqueia na extremidade 3'; em uma modalidade específica, é representado por SEQ ID NO:6. SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 são representados esquematicamente na figura 1B e figura 1C. Em outras modalidades, o fragmento de polinucleotídeo compreendendo o segundo íntron de um gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático é um mutante ou tipo selvagem parcial
[00120]A sequência de SERCA2 de Rattus norvegicus, sequência de SERCA2 de Equus caballus, sequência de SERCA2 de Bos Taurus, sequência de SERCA2 de Pan troglodytes, sequência de SERCA2 de Felis catus, sequência de SERCA2 de Ortolagus cuniculus, sequência de SERCA2 de Sus scrofa, sequência de SERCA2 de Macaca mulatta, sequência de SERCA2 de Cervus elaphus, sequência de SERCA2 de Gallus gallus, ou sequência de SERCA2 de Danio rerio.
[00121]O fragmento de polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma porção de um gene para região 5' não traduzida para caseína pode ser de qualquer espécie de mamífero. Em uma modalidade, o fragmento de polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma porção da região 5' não traduzida é de um gene beta bovino para caseína; em uma modalidade específica, é representado por SEQ ID NO:3. Em uma outra modalidade, o fragmento de polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma porção de região não traduzida 5' é de um gene beta caseína de camundongo; em uma modalidade específica, é representado por SEQ ID NO:8. Em uma outra modalidade, o fragmento de polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma porção de região não traduzida 5' é de um gene beta caseína de rato; em uma modalidade específica, é representado por SEQ ID NO:9. Em uma outra modalidade o fragmento de polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma porção de região não traduzida 5' é de um gene beta caseína de ovelha; em uma modalidade específica, é representado por SEQ ID NO: 10. Em outras modalidades, o fragmento de polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma porção da região 5' não traduzida
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34/60 é de um gene beta de Bubalus bubalis para caseína, um gene beta de Capra hircus para caseína, um gene beta de Equus caballus para caseína, um gene beta de Sus scrofa para caseína, um gene beta de Camelus dromedaries, de Oryctolagus cuniculus para caseína, ou um gene beta de Canis lupus para caseína.
[00122]O fragmento de polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma porção de um gene para região 5' não traduzida para caseína pode ter pelo menos cerca de 25 nucleotídeos em comprimento. Em outras modalidades, o fragmento de polinucleotídeo de gene da caseína compreendendo pelo menos uma porção de o 5'UTR pode ter pelo menos cerca de 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 85, 90, 100 ou mais nucleotídeos em comprimento. Em uma outra modalidade, o fragmento de polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma porção de um gene da caseína 5'UTR pode representar pelo menos cerca de 50 % da sequência natural de 5’UTR. Em outras modalidades, o fragmento de polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma porção de um gene da caseína 5'UTR pode representar pelo menos cerca de 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou mais da sequência natural de 5’UTR. Em uma outra modalidade, o fragmento de polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma porção de um gene da caseína 5'UTR pode representar toda a sequência natural de 5’UTR.
[00123]Em outras modalidades, variantes funcionais dos componentes individuais (o fragmento de polinucleotídeo compreendendo o segundo íntron de um gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático e o fragmento de polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma porção de 5'UTR de um gene da caseína) são usadas para criar uma 5’UTR sintética. Variantes funcionais incluem variantes de substituição, inserção e deleção e combinações destas. Variantes de substituição são aquelas em que pelo menos uma base na sequência de nucleotídeo foi removida e uma base diferente foi inserida neste local. Variantes insercionais de um ácido nucléico são aquelas em que um ou mais nucleotídeos são introduzidos
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35/60 em um sítio pré-determinado na sequência. Variantes de deleção de um ácido nucléico são caracterizadas pela remoção de um ou mais nucleotídeos do ácido nucléico. Qualquer combinação de substituição(s), deleção(s) ou inserção(s) pode ocorrer, desde que a funcionalidade do componente permaneça essencialmente a mesma, isto é, que a variante funcional, quando usada em uma 5'UTR sintética da presente invenção, causa maior expressão de uma sequência, gene sintético ou transgene de interesse.
[00124]Adicionalmente, as sequências homólogas às modalidades específicas do fragmento de polinucleotídeo compreendendo o segundo íntron de um gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático aqui reveladas (SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, e SEQ ID NO:6) e as sequências homólogas às modalidades específicas do fragmento de polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma porção de 5'UTR de caseína (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, e SEQ ID NO:10) podem ser usadas para construir uma 5'UTR sintética. Da maneira mencionada anteriormente, fontes adequadas de um fragmento para criar uma 5'UTR sintética incluem um gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático de qualquer espécie eucariótica e um gene da caseína de qualquer espécie de mamífero. Em uma modalidade, o fragmento de polinucleotídeo compreendendo o segundo íntron de um gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático é derivado de um ortólogo de SERCA2 canino, SERCA2 de camundongo ou SERCA2 humano. Em uma outra modalidade, o fragmento de polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma porção de o 5'UTR de caseína é derivado de um ortólogo de beta caseína bovina, beta caseína de camundongo, beta caseína de rato ou beta caseína de ovelha.
[00125]Métodos para a pesquisa e identificação de homólogos de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático ou homólogos de caseína 5 'UTR são conhecidos pelos versados na técnica. Tais métodos compreendem a
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36/60 comparação das sequências representadas por SEQ ID NOS:2-6 e 8-10, em um formato legível em computador, com sequências que estão disponíveis em bases de dados públicas disponíveis na rede de alcance mundial tais como MIPS, GenBank, ou base de dados de sequência de nucleotídeos EMBL, usando algoritmos bem conhecidos na técnica para o alinhamento ou comparação de sequências, tais como GAP (Needleman e Wunsch, J. MoL Biol. 48; 443453 (1970)), BESTFIT (Miller, W., Myers, E. W. & Lipman, D. J., J. MoL Biol. 215:403-410 (1990)), FASTA e TFASTA (W. R. Pearson e D. J. Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444- 2448 (1988)). O software para realizar análise BLAST está disponível publicamente por meio do Centro Nacional para informação de Biotecnologia. Homólogos adequados podem ser identificados usando parâmetros padrões BLAST (matriz BLOSUM62, penalidade de abertura de folga 11 e penalidade de extensão de folga 1).
[00126]Adicionalmente, homólogos à SERCA2 canino, humano ou de camundongo também podem ser identificados pesquisando nas sequências conservadas com o gene SERC A2. Por exemplo, a sequência completa de éxon 3 canino de SERC A2 tal como SEQ ID NO:11 pode ser usada como uma sequência de consulta em uma pesquisa BLAST. Espera-se que usando a sequência éxon como a sequência de consulta na pesquisa BLAST recupere-se um elevado número de homólogos de SERCA2 do que usando uma sequência que compreende a sequência íntron. Similarmente, homólogos à beta caseína bovina, de camundongo, de rato, ou de ovelha podem ser identificados usando uma porção codificante como a sequência de consulta.
[00127]A análise de sequências genômicas para a identificação de homólogos de ATPase de cálcio de retículo sarcoplasmático/endoplasmático ou homólogos de caseína 5'UTR também é possível. Vários algoritmos e ferramentas de software para a identificação de genes na sequência original de DNA são disponíveis. Em geral, estas ferramentas combinam análise de parâmetros estatísticos na sequência
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37/60 de DNA com métodos a base de homologia para identificar sequências homólogas nas bases de dados. Embora nenhum destes métodos sozinhos seja confiável o suficiente para uma boa predição, a combinação de vários programas fornece em geral bons resultados. Exemplos bem conhecidos de tais ferramentas que estão publicamente disponíveis na rede de alcance mundial incluem GeneMark (Borodovsky, M. e Mclninch J. GeneMark: Parallel Gene Recognition for both DNA Strands. Computers & Chemistry, 17, 123-133 (1993)), Gene Locator and Interpolated Markov Modeler (GLIMMER) (A. L. Delcher et al. Improved microbial gene identification with GLIMMER. Nucleic acids Research, 27, 4636-4641. (1999)), Gene Recognition and Assembly Internet Link (GRAIL), GenScan (Burge, C. e Karlin, S. Prediction of complete gene structures in human genomic DNA. J. MoL Biol. 268, 78-94 (1997)), e GeneBuilder (Milanesi L. et al. GeneBuilder: interactive in silico prediction of genes structure. Bioinformatics, 15 (7):612- 621 (1999)). Uma análise combinada pode ser realizada com o programa TIGR Combiner (J. E. Allen et al. Computational gene prediction using multiple sourcer of evidence. Genoma Research, 14(1), 142-148 (2004)) que prediz modelos de gene usando o produto de outro software de anotação tais como GeneMark, GlimmerM, GRAIL, GenScan, e Fgenes. Usa um algoritmo estatístico para identificar padrões de evidência correspondentes aos modelos de gene.
[00128]O segundo íntron de um gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático pode ser identificado por meio de métodos de rotina tal como comparar a sequência de DNA genômico do gene com aquela de sua sequência de RNAm ou DNAc em um programa de alinhamento de base. As regiões de homologia representam éxons, interferindo ao mesmo tempo nas sequências que estão ausentes na sequência de DNAc, mas presentes no DNA genômico que representam íntrons. O início e o final da sequência íntron podem ser identificados por meio de suas regiões que flanqueiam 5' GT e que flanqueiam 3' AG. Usando esta
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38/60 abordagem, a sequência de RNAm de SERC A2 canino representada pelo acesso público número NM 00 1003214 é usada para identificar íntrons em uma sequência genômica de SERC A2 canina, enquanto as sequências RNAm de SERCA2 de humano e de camundongo (NM_170665 e NM_009722, respectivamente) podem ser usadas para identificar íntrons nas suas respectivas sequências genômicas.
[00129]Homólogos de ATPase de cálcio de retículo sarcoplasmático/endoplasmático ou homólogos de caseína 5'UTR também podem ser identificados sondando uma biblioteca de fragmentos genômicos ou de DNAc de uma outra espécie. Por exemplo, DNA genômico de uma espécie de interesse pode ser fragmentado em porções de tamanhos aproximados para a inserção em um vetor escolhido tal como um plasmídeo ou vetor lambda. O vetor é então digerido com uma enzima de restrição apropriada e a seguir ligado à mistura completa de fragmentos genômicos. Células bacterianas são transformadas com vetor e então colocadas em placas de agarose. A colônia ou placa de fago de DNA é então anexada a uma membrana. Em uma modalidade, os fragmentos representados pelas SEQ ID NOS:2-6 e 8-10 ou porções destes são usados como sondas marcadas para hibridização no DNA de um clone de biblioteca que contém uma sequência homóloga. Procedimentos similares podem ser usados para selecionar uma biblioteca de DNAc. Adicionalmente, os homólogos podem ser identificados usando os fragmentos representados por SEQ ID NOS:2-6 e 8-10 ou porções destes como sondas marcadas para um experimento de hibridização Southern genômica ou de DNAc. Em outras modalidades, mais sequências conservadas tais como aquelas que compreendem uma região que codifica um gene de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático (tal como SEQ ID NO:11) ou um gene da caseína ou uma porção destes são usadas como sondas em um experimento de hibridização Southern ou para selecionar uma biblioteca.
[00130]Condições apropriadas de hibridização podem ser escolhidas para
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39/60 permitir hibridização de um fragmento com uma sonda de uma outra espécie (híbridos alvo de sonda parcialmente mal emparelhada) reduzindo a severidade do experimento de hibridização por meio de uma combinação apropriada de temperatura, concentração de sal, ou % de formamida. Por exemplo, severidade do experimento de hibridização pode ser menor diminuindo a temperatura para aumentar a concentração de sal. Procedimentos para identificar condições apropriadas de hibridização são bem conhecidas na técnica e são descritas em Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York.
[00131]Uma outra modalidade da invenção é um polinucleotídeo pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntico a um polinucleotídeo representado por uma de SEQ ID NOS: 1- 10.
[00132]Uma outra modalidade da invenção é uma 5'UTR sintética que compreende um polinucleotídeo representado por uma de SEQ ID NOS:2 e 4-6 e um polinucleotídeo representado por uma de SEQ ID NOS:3 e 8-10.
[00133]Uma outra modalidade da invenção é uma 5'UTR sintética que compreende um polinucleotídeo que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntico à um polinucleotídeo representado por uma de SEQ ID NOS :2 e 4-6 e um polinucleotídeo que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntico a um polinucleotídeo representado por uma de SEQ ID NOS:3, e 8-10.
[00134]Uma outra modalidade da invenção é um constructo de gene sintético que compreende um polinucleotídeo que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntico a um polinucleotídeo representado por SEQ ID NO:1.
[00135]Uma outra modalidade da invenção é um constructo de gene sintético que compreende um polinucleotídeo que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %,
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40/60 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntico à um polinucleotídeo representado por SEQ ID NO:7.
[00136]Em uma outra modalidade, a sequência sintética de 5'UTR necessita de sítios de restrição que interferem com a inserção no sistema de produção UltraVector (Intrexon Corp., Blacksburg, VA) da maneira descrita em WO 2007/038276, aqui incorporado pela referência. Em uma modalidade específica, a sequência sintética de 5'UTR necessita de sequências de reconhecimento interno para as seguintes endonucleases de restrição: AsiS I, Pac I, Sbf I, Fse I, Asc I, MIu I, SnaB I, Not I, Sal I, Swa I, Rsr II, BsiW I, Mfe I, Nhe I, Nsi I, CIa I, Nde I, Nsi I, Kpn I, Nco I e Pst I.
[00137]A sequência sintética de 5'UTR inclui opcionalmente sítios de restrição na extremidade 5' e extremidade 3' para facilitar a clonagem em um vetor. Em uma modalidade específica, a sequência sintética de 5'UTR inclui sequências de reconhecimento para for MIu I na extremidade 5' e sequências de reconhecimento para Mfe I na extremidade 3'.
[00138]Em uma modalidade específica, a 5'UTR sintética é representada por SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:1 compreende as seguintes características: sítio de restrição MIuI, SEQ ID NO:2, sítio de restrição Kpnl, SEQ ID NO:3, sítio de restrição Mfel. SEQ ID NO:1 é representada esquematicamente pela figura 2A.
[00139]Em uma outra modalidade específica, a 5'UTR sintética é representada por SEQ ID NO:7. SEQ ID NO:7 compreende as seguintes características: sítio de restrição Ascl, sítio de restrição MIuI, SEQ ID NO:4, sítio de restrição Kpnl, SEQ ID NO:3, sítio de restrição Mfel. SEQ ID NO:7 é representada esquematicamente pela figura 2B.
[00140]Em uma modalidade, a sequência sintética de 5'UTR é menor que cerca de 500 nucleotídeos em comprimento. Em uma outra modalidade, a sequência sintética de 5'UTR é menor que cerca de 400 nucleotídeos em comprimento. Em uma outra modalidade, a sequência sintética de 5'UTR é menor que cerca de 350
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41/60 nucleotídeos em comprimento. Em uma outra modalidade, a sequência sintética de 5'UTR é menor que cerca de 300 nucleotídeos em comprimento. Em uma outra modalidade, a sequência sintética de 5'UTR é menor que cerca de 240 nucleotídeos em comprimento. Em uma outra modalidade, a sequência sintética de 5'UTR é menor que cerca de 200 nucleotídeos em comprimento.
[00141]Em uma outra modalidade da invenção, o polinucleotídeo de 5'UTR sintética é um componente de um vetor de expressão eucariótico, compreendendo um primeiro fragmento de polinucleotídeo e um segundo fragmento de polinucleotídeo, em que:
a. o primeiro fragmento de polinucleotídeo compreende pelo menos um sítio de união de um primeiro gene eucariótico;
b. o segundo fragmento de polinucleotídeo compreende pelo menos uma porção de região não traduzida 5' (5'UTR) de um segundo gene eucariótico; e
c. o primeiro fragmento de polinucleotídeo está localizado na região 5' do segundo fragmento de polinucleotídeo.
[00142]Em uma modalidade, o fragmento de polinucleotídeo compreendendo pelo menos um sítio de união é um fragmento de um gene eucariótico de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático aqui descrito. Em uma outra modalidade, o fragmento de polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma porção da região 5' não traduzida é um fragmento de um gene da caseína aqui descrito.
[00143]A presente invenção também fornece vetores que compreendem uma 5'UTR sintética aqui descrita. Considera-se que os vetores incluem quaisquer das modalidades das sequências de polinucleotídeo de 5'UTR sintética aqui descrita. Por exemplo, uma modalidade da invenção é um vetor que compreende uma sequência 5'UTR sintética de polinucleotídeo que compreende um fragmento de polinucleotídeo compreendendo o segundo íntron de um gene eucariótico de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático e um fragmento de polinucleotí
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42/60 deo compreendendo pelo menos uma porção de uma 5'UTR de um gene da caseína.
[00144]Uma outra modalidade da invenção é um vetor que compreende um polinucleotídeo que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntico a um polinucleotídeo representado por uma de SEQ ID NOS:l-10.
[00145]Em uma outra modalidade, o vetor é um vetor de expressão compreendendo um constructo de gene sintético que compreende uma 5'UTR sintética. O constructo de gene sintético pode compreender um promotor que flanqueia em uma extremidade da 5'UTR sintética e uma sequência de interesse a ser expressa que flanqueia na outra extremidade da 5'UTR sintética. O constructo de gene sintético pode compreender adicionalmente um sítio de poliadenilação.
[00146]Por exemplo, uma outra modalidade da invenção é um vetor de expressão compreendendo um constructo de gene sintético que compreende, da maneira arranjada de 5' patra 3', um promotor, um polinucleotídeo quimérico, e uma sequência de interesse a ser expressa, em que:
a. o polinucleotídeo quimérico compreende um fragmento de polinucleotídeo de um primeiro gene eucariótico compreendendo pelo menos um sítio de união e um fragmento de polinucleotídeo de um segundo gene eucariótico compreendendo pelo menos uma porção de região não traduzida 5'; e
b. o polinucleotídeo quimérico está posicionado entre o promotor e a sequência de interesse a ser expressa, em que o fragmento de polinucleotídeo do primeiro gene eucariótico está posicionado no sentido do promotor e fragmento de polinucleotídeo do segundo gene eucariótico está posicionado no sentido da sequência de interesse a ser expressa.
[00147]A figura 3A representa esquematicamente uma modalidade de um constructo de gene sintético da invenção inserido em uma espinha dorsal do vetor. Nesta modalidade, SPL na figura 3A refere-se ao fragmento de polinucleotídeo com
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43/60 preendendo pelo menos um sítio de união, e UTR refere-se ao fragmento de polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma porção de uma região não traduzida 5'. SPL e UTR juntos compõem um 5 'UTR sintético. O promotor do constructo do gene sintético está posicionado para dirigir a expressão de RNA da 5 ‘UTR sintética e a sequência de interesse. Adicionalmente, a sequência de interesse a ser expressa compreende um códon inicial para tradução começar.
[00148]Vetores exemplares de expressão compreendendo esta arquitetura de vetor estão esquematicamente representados na figura 10 e figura 11. A sequência do vetor da figura 10 é fornecida na SEQ ID NO: 12; a sequência do vetor da figura 11 é fornecida na SEQ ID NO: 13.
[00149]Em uma outra modalidade, o vetor é um vetor de expressão compreendendo, da maneira arranjada de 5' para 3', um promotor, um polinucleotídeo quimérico, e um sítio de clonagem, em que:
a. o polinucleotídeo quimérico compreende um fragmento de polinucleotídeo de um primeiro gene eucariótico compreendendo pelo menos um sítio de união e um fragmento de polinucleotídeo de um segundo gene eucariótico compreendendo pelo menos uma porção de região não traduzida 5'; e
b. o polinucleotídeo quimérico está posicionado entre o promotor e o sítio de clonagem, em que o fragmento de polinucleotídeo do primeiro gene eucariótico está posicionado no sentido do promotor e fragmento de polinucleotídeo do segundo gene eucariótico está posicionado no sentido do sítio de clonagem.
[00150]O sítio de clonagem do vetor de expressão pode compreender um ou mais sítios de restrição exclusivos de forma que uma sequência de interesse possa ser inserida. Em uma outra modalidade, o sítio de clonagem compreende sítios de anexação de recombinase de forma que uma sequência de interesse possa ser inserida por recombinação sítio específica.
[00151]Uma modalidade do vetor de expressão é representada esquemati
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44/60 camente na figura 3B. Na figura 3B, SPL refere-se ao fragmento de polinucleotídeo compreendendo o sítio de união e UTR refere-se ao fragmento de polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma porção da região 5' não traduzida. SPL e UTR juntos compõem uma 5'UTR sintética.
[00152]O fragmento de polinucleotídeo compreendendo o sítio de união no vetor de expressão pode ser um fragmento de qualquer gene eucariótico. Fragmentos de polinucleotídeo exemplares que podem ser usados no vetor de expressão incluem aqueles que compreendem um sítio de união de um gene eucariótico de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático aqui descrito. Adicionalmente, o fragmento de polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma porção de região não traduzida 5' pode ser um fragmento de qualquer gene eucariótico. Fragmentos de polinucleotídeo exemplares que podem ser usados no vetor de expressão incluem aqueles que compreendem pelo menos uma porção de uma 5'UTR de um gene da caseína aqui descrita.
[00153]Os vetores de expressão da invenção podem compreender adicionalmente uma ou mais sequências adicionais de polinucleotídeos à jusante da sequência de interesse ou sítio de clonagem para criar uma fusão em quadro com o polipeptídeo codificado pela sequência de interesse. Por exemplo, os polinucleotídeos adicionais à jusante da sequência de interesse podem codificar um epítopo tag, um repórter, ou purificação tag. Epítopos tag são conhecidos na técnica e incluem myc, hemaglutinina (HA), e FLAG. Exemplos de repórteres incluem proteína fluorescente verde e seus variantes, beta-galactosidase (LacZ), beta-glucuronidase (Gus), clorafenicol acetiltransferase (CAT) e luciferase. Exemplos de tag de purificação incluem HiS6 e GST. O vetor de expressão também pode compreender um sítio poliA à jusante da sequência de interesse ou sítio de clonagem.
[00154]Dependendo do efeito desejado, a porção promotora do vetor de expressão contendo uma 5' UTR sintética pode ser um promotor constitutivo, um pro
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45/60 motor não constitutivo, um promotor específico de tecido (constitutivo ou não constitutivo), um promotor relacionado à patogênese ou doença, um promotor de desenvolvimento específico, ou um promotor seletivamente controlado tal como um promotor indutível. Promotores seletivamente controlados diferentes são controlados por mecanismos diferentes. Por exemplo, um promotor que induz tetraciclina é ativado para expressar uma sequência codificante à jusante quando a célula que contém o promotor e outros fatores celulares necessários é tratada com tetraciclina. Outros promotores indutíveis são ativados por outros medicamentos ou fatores. RHEOSWITCH é um sistema promotor indutível disponível pela New England Biolabs (Ipswich, MA). Os promotores sensíveis à temperatura também podem ser usados para aumentar ou diminuir a expressão de gene. Uma modalidade da invenção compreende um constructo de gene que contém uma 5'UTR sintética cuja expressão é controlada por um promotor indutível.
[00155]A invenção inclui modalidades em que o vetor principal que compreende a 5'UTR sintética compreende sequências adequadas para expressão de uma sequência de interesse em uma célula eucariótica. Em uma modalidade, o vetor principal que compreende a 5'UTR sintética compreende sequências adequadas para expressão de uma sequência de interesse em uma célula de mamífero. Vetores de expressão de mamíferos podem compreender elementos não transcritos tais como uma origem de replicação, um promotor e melhorador adequados ligados à sequência de interesse a ser expressa, e outra sequência 5' ou 3' que flanqueia sequências não transcritas, e sequências 5' ou 3' não traduzidas, tais como sítios de ligação de ribossomo necessário, um sítio se poliadenilação, e sequências de terminação transcricional. Exemplos de vetores de expressão de mamíferos são bem conhecidos na técnica e incluem pcDNA3 (Invitrogen) e pRSVneo (ATTC).
[00156]Por exemplo, a porção promotora de um vetor de expressão que contém uma 5'UTR sintética pode ser um promotor animal ou de mamífero. Promotores
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46/60 de animais ou de mamíferos exemplares incluem região promotora precoce SV40 (SV40e), o promotor contido na repetição de terminal 3' longa (LTR) de vírus do sarcoma de Rous (RSV), os genes promotores do promotor ElA ou do promotor posterior principal (MLP) de adenovírus (Ad), o promotor precoce de citomegalovírus (CMV), o promotor de timidina quinase (TK) d vírus herpes simplex (HSV), um promotor alfa de fator de alongamento 1 (EFl), um promotor fosfoglicerato quinase (PGK), um promotor de ubiquitina (Ubc), um promotor de albumina, as sequências regulatórias do promotor metalotioneina-L de camundongo e regiões de controle transcricional, os promotores ubíquos (HPRT, vimentina, beta-actina, tubulina e similares), os promotores dos filamentos intermediários (desmina, neurofilamentos, queratina, GFAP e similares), os promotores de genes terapêuticos (do MDR, CFTR ou fator tipo VIII e similares), promotores relacionados à patogênese ou doença, e promotores que exibem especificidade no tecido e foram utilizados em animais transgênicos, tal como a região controle de gene de elastase 1 que é ativa em células acinar pancreáticas; região controle de gene de insulina ativa nas células beta pancreáticas, região controle de gene de imunoglobulina ativa em células linfóides, região controle de vírus de tumor mamário em camundongo ativa em células testiculares, de mama, linfóides e mastócito; gene de albumina, regiões controle Apo AI e Apo All ativas no fígado, região controle de gene de alfa-fetoproteína ativa no fígado, região controle de gene de alfa 1 -antitripsina ativa no fígado, região controle de gene de beta-globina ativa em células mielóides, região controle de gene de proteína básica de mielina ativa em células oligodendrócitas no cérebro, região controle de gene de cadeia leve de miosina-2 ativa no músculo esquelético, e região controle de hormônio de liberação gonadotrópica ativa no hipotálamo, promotor piruvato quinase, promotor vilina, promotor da proteína intestinal de ligação do ácido graxo, promotor de beta actina em célula de músculo liso e similares. Os promotores no vetor de expressão podem ser modificados pela adição de melhorador ou sequências regulató
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47/60 rias e similares.
[00157]A porção de sequência de interesse de um vetor de expressão contendo uma 5'UTR sintética pode ser uma sequência de qualquer gene eucariótico ou porção deste, ou sequência natural ou codificante não natural ou não codificante. Exemplos não limitantes de sequências codificantes que podem ser usados na presente invenção incluem sequências que codificam repórteres (por exemplo, luciferase, beta-galactosidase, proteínas fluorescentes), epítopos, polipeptídeos experimentais ou polipeptídeos terapêuticos. Exemplos adicionais de sequência de ácidos nucléicos de interesse incluem moléculas de RNA, tais como RNAs pequenos, RNAs micro, RNAs ribossomais, RNAs terapêuticos e ribozimas.
[00158]Em um outro aspecto da invenção, 5'UTRs sintéticas múltiplas não redundantes são usadas no contexto de constructos de gene multigênico em um vetor único.
[00159]Em uma outra modalidade, o vetor é um vetor de terapia gênica que compreende um constructo de gene sintético que compreende uma 5'UTR sintética. O vetor de terapia gênica pode ser qualquer vetor de terapia gênica conhecido na técnica, incluindo vetores não virais ou vetores virais tais como um vetor adenoviral, um vetor viral associado a adeno (AAV) ou um vetor retroviral. O constructo de gene sintético pode compreender um promotor que flanqueia na extremidade 5' da 5'UTR sintética e um gene terapêutico de interesse que flanqueia na extremidade 3' da 5'UTR sintética da maneira mostrada na figura 3A. O promotor pode ser promotor constitutivo, um promotor específico para tecido, e promotor indutível, ou outro promotor aqui descrito. Exemplos de classes de genes terapêuticos de interesse que podem ser incluídos no vetor de terapia gênica incluem sem limitação, genes que codificam citocinas, quemocinas, hormônios, anticorpos, moléculas modificadas por engenharia genética semelhantes à imunoglobulina, anticorpos de cadeia única, proteínas de fusão, enzimas, moléculas co-estimulatórias imunes, moléculas imunomo
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48/60 dulatórias, mutantes negativos transdominantes de proteínas alvo, toxinas, toxinas condicionais, sensibilizadores de quimioterapia e radioterapia, antígenos, proteínas supressoras de tumor, fatores de crescimento, proteínas de membrana, proteínas vasoativas e peptídeos, proteínas antivirais ou variantes destas.
[00160]Exemplo específico de genes terapêuticos de interesse são incontáveis, e incluem, sem limitação, eritropoietina, insulina, VEGF, FGF, Fator VIII, Fator IX, endostatina, angiostatina, GDNF, BDNF, NGF, EGF, CFTR, PEGF, IFN-alfa, IFNgama, IL-I, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL- 10, IL-12, IL-21, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, TNFα, TNF-β, TGF-α, TGF-β, CD40, hirudina e similares.
[00161]A presente invenção também fornece kits que compreendem as sequências de polinucleotídeos da invenção. Por exemplo, em uma modalidade, a presente invenção fornece um kit que compreende pelo menos um polinucleotídeo que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntico a um polinucleotídeo que é representado por uma das SEQ ID NOS: 1-10. Os kits podem compreender os vetores ou componentes anteriores que permitem sua montagem. Por exemplo, o kit pode incluir um vetor que pode ser linearizado por meio de digestão com uma enzima de restrição em um sítio que permite o usuário inserir ao inserto uma 5'UTR sintética ou componentes individuais de uma 5’UTR sintética. O kit pode compreender adicionalmente mais componentes para montagem do vetor, tais como a enzima de restrição, ligase, tampão, e similares.
[00162]A presente invenção fornece adicionalmente métodos para expressar um produto de gene ou uma sequência de interesse em uma célula hospedeira.
[00163]Por exemplo, uma outra modalidade da invenção é um método de expressar um produto de gene que compreende transfectar uma célula hospedeira com um constructo de gene sintético que compreende uma 5’UTR sintética aqui descrita.
[00164]Uma outra modalidade da invenção é um método de expressar um
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49/60 produto de gene que compreende transfectar uma célula hospedeira com um constructo de gene sintético que compreende um polinucleotídeo pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntico a um polinucleotídeo representado por SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO:7.
[00165]Uma outra modalidade da invenção é um método para expressar uma sequência de interesse em uma célula hospedeira, compreendendo as etapas de:
a. transfectar uma célula hospedeira com um vetor de expressão compreendendo um constructo de gene sintético aqui descrito; e
b. cultivar a dita célula hospedeira em condições adequadas para obter expressão da dita sequência de interesse.
[00166]Em um outro método para expressar uma sequência de interesse em uma célula hospedeira, uma sequência de interesse pode ser inserida em um vetor de expressão aqui descrito que compreende um promotor, uma 5'UTR sintética e um sítio de clonagem. Por exemplo, uma outra modalidade da invenção é um método para expressar uma sequência de interesse em uma célula hospedeira, compreendendo as etapas de:
a. inserir uma sequência de interesse a ser expressa em um vetor de expressão aqui descrito que compreende um promotor, uma 5'UTR sintética, e um sítio de clonagem no sítio de clonagem, em que a sequência de interesse a ser expressa inclui um RNA ou uma sequência de polipeptídeo codificante;
b. transfectar uma célula hospedeira com a vetor de expressão; e
c. cultivar a dita célula hospedeira em condições adequadas para obter expressão da dita sequência de interesse.
[00167]Em um outro método para expressar uma sequência de interesse em uma célula hospedeira, uma 5'UTR sintética pode ser inserida no vetor de expressão entre o promotor e a sequência de interesse, de maneira tal que a porção que com
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50/60 preende o elemento de união de um gene eucariótico na 5'UTR sintética esteja posicionada na direção do promotor e a porção que compreende pelo menos uma porção de uma 5'UTR de um outro gene eucariótico esteja posicionada no sentido da sequência de interesse.
[00168]Por exemplo, uma outra modalidade da invenção é um método para expressar uma sequência de interesse em uma célula hospedeira, compreendendo as etapas de:
a. inserir uma 5'UTR sintética aqui descrita em um vetor de expressão entre um promotor e uma sequência de interesse a ser expressa, em que a sequência de interesse a ser expressa inclui um RNA ou uma sequência de polipeptídeo codificante;
b. transfectar uma célula hospedeira com o dito vetor de expressão; e
c. cultivar a dita célula hospedeira em condições adequadas para obter expressão da dita sequência de interesse.
[00169]Uma outra modalidade da invenção é um método para expressar uma sequência de interesse em uma célula hospedeira, compreendendo as etapas de:
a. inserir um polinucleotídeo pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntico a um polinucleotídeo representado por SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:7 em um vetor de expressão entre um promotor e uma sequência de interesse a ser expressa, em que a sequência de interesse a ser expressa inclui um RNA ou uma sequência de polipeptídeo codificante;
b. transfectar uma célula hospedeira com o dito vetor de expressão; e
c. cultivar a dita célula hospedeira em condições adequadas para obter expressão da dita sequência de interesse.
[00170]Os métodos da invenção são realizados usando técnicas de rotina. A menos que de outra forma declarada, técnicas de DNA recombinante são realizadas
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51/60 de acordo com protocolos padrões descritos em (Sambrook, supra) ou nos Volumes 1 e 2 de Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols.
[00171]A presente invenção também fornece células hospedeiras que compreendem uma 5'UTR sintética. Considera-se que as células hospedeiras incluem quaisquer das modalidades das sequências de polinucleotídeo de 5'UTR sintética aqui descrita. Por exemplo, uma outra modalidade da invenção é uma célula hospedeira que compreende uma sequência de polinucleotídeo de 5'UTR sintética que compreende um fragmento de polinucleotídeo compreendendo o segundo íntron de um gene eucariótico de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático fundido a um fragmento de polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma porção da região 5 'UTR de um gene da caseína.
[00172]Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula hospedeira de mamífero. Em modalidades específicas, a célula hospedeira é uma célula de hamster, uma célula de camundongo, uma célula de rato, uma célula de coelho, uma célula de gato, uma célula de cachorro, uma célula bovina, uma célula de carneiro, uma célula de vaca, uma célula de porco, uma célula de cavalo, uma célula de ovelha, uma célula de símio, uma célula de macaco, uma célula de chimpanzé ou uma célula humana. Exemplos específicos de células hospedeiras da invenção que compreendem uma 5'UTR sintética incluem, mas sem limitações, A549, ARPE-19, CH3/10T1/2, C2C12, aco2, COS7, FL-83B, HEK-293, HEPG2, HeLa, HT-1080, MDCK, P19, SH-SY5Y, Sol 8 e U87.
[00173]As células hospedeiras da invenção são transfectadas com um polinucleotídeo compreendendo uma 5'UTR sintética. A transfecção da célula hospedeira é bem conhecida na técnica e pode ser atingida por uma variedade de métodos incluindo, mas sem limitações, eletroporação, infecção viral, transfecção de plasmídeo/vetor, transfecção mediada por vetor não viral, bombardeamento de partícula e
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52/60 similares. Expressão de produtos de gene desejados envolve cultivar as células hospedeiras transfectadas em condições adequadas e medir expressão do gene transfectado. Condições de cultura e protocolos de expressão de gene em células eucarióticas são bem conhecidos na técnica.
[00174]A presente invenção também fornece organismos hospedeiros que compreendem uma 5' UTR sintética aqui descrita. As 5'UTRs sintéticas podem ser inseridas diretamente no genoma de um organismo hospedeiro in vivo. Por exemplo, em uma modalidade, uma 5'UTR sintética é introduzida em um organismo hospedeiro para substituir uma 5'UTR tipo selvagem, introduzindo diretamente nos organismos hospedeiros um vetor que contém uma 5'UTR sintética da invenção flanqueada por sequências homólogas às sequências que flanqueiam a 5 'UTR tipo selvagem que será substituída. Em uma outra modalidade, um constructo de gene sintético que compreende uma 5'UTR sintética é inserido no genoma de um organismo hospedeiro introduzindo um vetor de integração que compreende o gene constructo no organismo hospedeiro. A especificidade do tecido da inserção pode ser controlada, por exemplo, pela via de administração do vetor. Em uma outra modalidade, um constructo de gene sintético que compreende uma 5'UTR sintética é introduzida em um organismo hospedeiro introduzindo um vetor não integrante que compreende o gene constructo no organismo hospedeiro.
[00175]Uma 5'UTR sintética ou um constructo de gene sintético que compreende uma 5'UTR sintética também pode ser introduzido em um organismo hospedeiro por meio de abordagens ex vivo. Por exemplo, células autólogas ou não autólogas podem ser transformadas com um vetor que compreende uma 5'UTR sintética e a seguir introduzidas no organismo hospedeiro.
[00176]Em uma outra modalidade, uma 5'UTR sintética é introduzida no genoma de uma célula ou organismo hospedeiro usando um sistema de recombinase sítio específico tal como o sistema Cre/loxP. Nesta modalidade, a integração estável
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53/60 de um fragmento de DNA tal como um fragmento compreendendo uma 5'UTR sintética ou um constructo de gene sintético que compreende uma 5'UTR sintética no genoma é atingida introduzindo sítios lox modificáveis no genoma e no vetor doador que previnem a re-excisão do DNA integrado (ver Metzger e Feil, Current Opinion in Biotecnologia, 10:470-476 (1999), aqui incorporado pela referência). Adicionalmente, os sítios heteroespecíficos loxP podem ser introduzidos ('floxado') no genoma para flanquear uma região a ser substituída (Metzger e Feil, supra), tais como uma 5'UTR endógena e uma 5'UTR sintética em um plasmídeo doador. Animais transgênicos com sítio lox P cromossômico introduzido no genoma podem ser cruzados com camundongos transgênicos que expressam recombinase Cre dirigida por um promotor específico para tecido ou célula, que é conhecido na técnica. A administração de um plasmídeo doador, que compreende uma 5'UTR sintética, à progênie deste cruzamento resultará na integração em tipos específicos de tecidos ou células.
[00177]Em outras modalidades, outros sistemas de recombinação sítio específicos, tais como aqueles revelados na publicação de patente dos Estados Unidos 20060172377, aqui incorporada pela referência, são usados para introduzir uma 5'UTR sintética no genoma de um organismo hospedeiro.
[00178]Uma outra modalidade da invenção é um organismo não humano que compreende um polinucleotídeo pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntico a um polinucleotídeo representado por SEQ ID NOS: 1-10.
[00179]Uma outra modalidade da invenção é um organismo não humano que compreende um constructo de gene sintético que compreende um polinucleotídeo pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntico a um polinucleotídeo representado por SEQ ID NOS: 1-10.
[00180]Adicionalmente, um organismo transgênico tal como um camundongo que compreende uma 5'UTR sintética ou um gene constructo que compreende uma 5'UTR sintética pode ser criado. Por exemplo, camundongos transgênicos po
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54/60 dem ser gerados injetando um vetor apropriado que compreende a 5'UTR sintética no pró-núcleo de oócitos de camundongo fertilizado. Alternativamente, o vetor pode ser introduzido em células tronco embrionárias de camundongo, que são a seguir microinjetadas em blastocistos de camundongo. Os zigotos ou blastocistos transformados são então transplantados em camundongos fêmea pseudogestantes. Os filhotes resultantes são selecionados pela presença dos polinucleotídeos por PCR ou Southern blotting. Animais transgênicos heterozigotos são então cruzados uns com os outros para gerar homozigotos. Em uma modalidade, a 5'UTR sintética substitui uma 5'UTR endógena de um gene de interesse no animal transgênico por meio de recombinação homóloga.
[00181]Assim, uma outra modalidade da invenção é um animal transgênico que compreende uma sequência 5'UTR sintética de polinucleotídeo compreendendo um fragmento de um gene eucariótico de ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmático/endoplasmático que compreende o segundo íntron fundido a um fragmento compreendendo pelo menos uma porção da 5'UTR de um gene da caseína.
[00182]Uma outra modalidade da invenção é um organismo transgênico que compreende um polinucleotídeo pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntico a um polinucleotídeo representado por SEQ ID NOS: 1-10.
[00183]Uma outra modalidade da invenção é um organismo transgênico que compreende um constructo de gene sintético que compreende um polinucleotídeo pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntico a um polinucleotídeo representado por SEQ ID NOS: 1-10.
[00184]Os exemplos a seguir são ilustrativos, mas não limitantes, das modalidades da presente invenção. Outras modificações e adaptações adequadas que são óbvias aos versados na técnica estão no espírito e no escopo da invenção.
EXEMPLOS
Exemplo 1
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55/60
[00185]Três versões diferentes de uma 5'UTR sintética foram construídas e inseridas em um vetor em que um promotor de citomegalovírus humano (CMV) direciona a expressão de um reportes de beta-galactosidase (sequência codificante LacZ). Na versão um, poliG (12) foi inserido entre o promotor e o repórter betagalactosidase como uma 5'UTR sintética (figura 9). Na versão dois, denominada 5U2, SEQ ID NO:1 foi inserida entre o promotor e o repórter beta- galactosidase como uma 5'UTR sintética (figura 10). Na versão 3, denominada INXN-I, SEQ ID NO: 7 foi inserida entre o promotor e o repórter beta-galactosidase como uma 5'UTR sintética (figura 11). Cada transgene apresenta uma sequência de poliadenilação SV40 na região regulatória 3'. Uma versão genérica de cada vetor contendo uma 5U2 ou INXN-I 5'UTR sintética é mostrada esquematicamente na figura 3 A. Células HEK293 e células 1080 foram transfectadas transientemente com cada vetor de expressão.
[00186]Beta-galactosidase foi medida nas células usando o sistema GalactoStar™ da Applied Biosystems (Cat Nos. BMlOOS, BM300S, BM2500S, BYlOOS, BY300S, BY2500S) de acordo com o protocolo a seguir. As células foram lisadas em 50 pL de solução de lise (Galacto-Star™System) por 10 minutos em temperatura ambiente. 100 pL de substrato Galacton-Star® foram aliquotados em poços de uma microplaca branco opaco de 96 poços. Foram adicionados 10 pL de solução de lise celular à 100 pL de substrato de Galacton-Star® e incubados por 30 minutos. Um sinal claro foi medido usando um luminômetro de microplaca.
[00187]Os resultados das células HEK-293 são mostrados na figura 4. A expressão do repórter beta-galactosidase aumentou notavelmente em células HEK293 transfectadas com vetores contendo INXN-I ou 5U2 5'UTR sintética em comparação com vetores contendo poliG como a 5'UTR sintética. A maior expressão de repórter em células 1080 transfectadas com vetores contendo INXN-I ou 5U2 em comparação com vetores contendo poliG como o 5'UTR é mostrada na figura 5. O
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56/60 nível de expressão de transgenes em vetores contendo um poliG 5'UTR foi similar a um controle quando nenhuma 5'UTR está presente (VVN-2712, figura 7, dados na figura 12). O controle negativo para medir ensaios anteriores foi um vetor sem nenhuma beta-galactosidase (VVN-2713, figura 8, dados na figura 12). A figura 6 mostra que o gene repórter sintético beta- galactosidase contendo a INXN-I 5'UTR sintética foi expresso cerca de 7,5 vezes mais em células HEK-293 e cerca de 2,5 vezes mais em células 1080 em comparação a um gene sintético repórter contendo poliG como a 5'UTR, enquanto um gene sintético repórter contendo a 5U2 5'UTR sintética foi expressa cerca de 8 vezes mais em células HEK-293 e cerca de 2,5 vezes mais em células 1080 em comparação ao gene sintético repórter que contem poliG como 5'UTR
Exemplo 2
[00188]Uma pesquisa da base de dados pública de nucleotídeos não redundante GenBank usando o algoritmo blastn com parâmetros padrões, usando SEQ ID NO:4 como a sequência de consulta produziu os seguintes homólogos representativos SERC A2 listados na tabela 1. SEQ ID NO:4 representa um componente da 5'UTR sintética representado por SEQ ID NO:7.
Tabela 1
Número de acesso | Descrição | Cobertura da consulta | Valor E | Identidade máxima |
EU365364 | Gene de contração lenta do músculo cardíaco 2 (ATP2A2) que transporta ATPase de Ca++ de Homo sapiens, exons 2 e 3 e terminações parciais. | 99 % | 2e-16 | 77 % |
AM137440 | Gene atp2A2 de Equus caballus para ATPase de cálcio do retículo sarcoplasmáti- | 51 % | 3e-14 | 90 % |
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co/endoplasmático 2, exons 1- 20. | ||||
M33834 | Gene de ATPase de Ca 2+ de retículo sarco(endo)plasmático de Oryctolagus cuniculus | 53 % | 5e-05 | 80 % |
[00189]Um fragmento do genoma de Equus caballusa identificado a partir dos resultados de pesquisa BLAST na tabela 1 (acesso público número AM 137440) foi comparado à sequência de RNAm SERC A2 de Equus caballusa NM OO 1081765 usando a função de alinhamento por pareamento no programa de espaçadores 1.4fl7 de DNA publicamente disponível (ver Marck, C, Nucleic Acids Research 16(5):1829-1837 (1988) e Douglas, S, Molecular Biotecnology 3(l):37-45 (1995) para descrições de espaçadores de DNA). As sequências foram alinhadas usando o método em blocos que usa parâmetros padrões para penalidade de mal emparelhamento e penalidade de intervalo. Uma porção do alinhamento da sequência genômica de RNA m de Equus caballusa é mostrada na figura 13, com setas marcando o início e o fim do segundo íntron do gene de Equus caballusa SERCA2. A região de homologia que é 5' para o íntron representa éxon 2, e a região de homologia que é 3' para o íntron representa éxon 3.
[00190]Um oligonucleotídeo que representa um fragmento do gene de Equus caballusa SERC A2 que compreende o segundo íntron é então sintetizado e fundido à SEQ ID NO: 3 usando técnicas de DNA recombinante para criar uma 5'UTR sintética. A 5'UTR sintética é então inserida em um vetor entre um promotor citomegalovírus humano (CMV) e um gene repórter de luciferase. O vetor e um vetor controle com uma poliG 5'UTR são então usados para transfectar células 3T3. A atividade da luciferase é medida usando um luminometro e as unidades de luz relativas são comparadas entre os dois ajustes da célula. A expressão de repórter em células transfectadas com o vetor que contém a 5'UTR sintética é elevada comparada às
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58/60 células transfectadas com o vetor contendo a poliG 5 'UTR.
Exemplo 3
[00191]Uma pesquisa do banco de dados público de nucleotídeo não redundante GenBank usando o algoritmo blastn com parâmetros padrões, usando SEQ ID NO:3 como a sequência de consulta produziu os homólogos representativos a seguir listados na tabela 2. SEQ ID NO: 3 representa o componente 5 'UTR de caseína bovina da 5 ‘UTR sintética representado por SEQ ID NO : 1 e SEQ ID NO:7.
Tabela 2
Número de acesso | Descrição | Cobertura da consulta | Valor E | Identidade máxima |
DQ317447 | RNAm de betacaseína de Bubalus bubalis, cds completo | 77 % | 5e-10 | 97 % |
NM_0010009373 | Beta caseína de Ovis áries (CSN2), RNAm. | 77 % | 6e-09 | 95 % |
AY452035 | Gene de beta caseína de Capra hircus, promotor e éxon 1. | 56 % | 5e-04 | 96 % |
NM_001081852 | Beta caseína de Equus caballus (CSN2), RNAm. | 58 % | 0,002 | 93 % |
AY452035 | Gene de beta caseína Sus scrofa, região promotora, éxon 1 e sequência parcial | 56 % | 0,006 | 93 % |
AJ409279 | Gene parcial de | 56 % | 0.006 | 93 % |
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Camelus dromedarius para beta caseína, região 5'de flanqueamento | ||||
NM_001082759 | Pré-beta caseína de Oryctolagus cuniculus (AA-15 a 213) (LOC1000009539), RNAm. | 66 % | 0,006 | 88 % |
NM_001003086 | Beta caseína de Canis lupus familiaris (CSN2), RNAm | 67 % | 0,88 | 83 % |
[00192]O segundo íntron de cada gene SERCA2 representativo listado na tabela 1 é identificado usando um programa de alinhamento por pareamento comparando a sequência genômica com sua sequência de RNAm representativa. Um primeiro ajuste de oligonucleotídeos é sintetizado compreendendo o segundo íntron de SERCA2 para cada SERCA2 homólogo. Um segundo ajuste de oligonucleotídeos é então sintetizado representado pelo menos uma porção de 5'UTR para cada betacaseína homóloga identificada na tabela 2. A porção de 5'UTR compreende a porção de cobertura da consulta identificada nos resultados BLAST da tabela 2. Um ajuste de 5'UTRs sintéticas é então construído usando técnicas de DNA recombinante fundindo a um elemento exclusivo do primeiro ajuste de oligonucleotídeos que compreende o segundo íntron de SERCA2, ou um oligonucleotídeo representado por SEQ ID NOS :2 e 4-6 a um elemento exclusivo do segundo ajuste de oligonucleotídeos que compreende pelo menos uma porção de 5'UTR ou um oligonucleotídeo representado por SEQ ID NOS :3 e 8-10, em que o oligonucleotídeo que compreende o
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60/60 segundo íntron de SERC A2 está fundido na extremidade 5' do oligonucleotídeo que compreende a porção de 5'UTR. Os sítios de restrição são então adicionados a cada extremidade da 5'UTR sintética por meio de PCR. Cada 5'UTR sintética exclusiva é a seguir inserida em um vetor entre um promotor CMV humano e um promotor lacZ. As células 1080 em placas de 96 poços são então transfectadas com cada vetor, bem como um vetor controle com uma poliG 5 'UTR. A atividade de betagalactosidase é então medida usando o ensaio descrito no exemplo 1 e os níveis de expressão com relação à poliG 5 'UTR são então comparados.
[00193]Com a invenção agora completamente descrita, será entendido pelos versados na técnica que a mesma pode ser realizada em uma ampla e equivalente variação de condições e outros parâmetros sem afetar o escopo da invenção ou qualquer modalidade desta.
Claims (8)
- REIVINDICAÇÕES1. Vetor de expressão CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um constructo de gene sintético que compreende, de maneira arranjada de 5' para 3', um promotor, um polinucleotídeo quimérico, e uma sequência de interesse a ser expressa, em que:a. o polinucleotídeo quimérico compreende o segundo íntron de um gene da cálcio ATPase do retículo sarcoplasmático/endoplasmático, e pelo menos uma porção da região 5' não traduzida (5'UTR) de um gene de caseína; eb. o polinucleotídeo quimérico está posicionado entre o promotor e a sequência de interesse a ser expressa, em que o segundo íntron do gene da cálcio ATPase do retículo sarcoplasmático/endoplasmático está posicionado em direção ao promotor e o fragmento polinucleotídico da região 5' não traduzida (5'UTR) do gene da caseína está posicionado em direção à sequência de interesse a ser expressa, em que o vetor compreende uma sequência polinucleotídica compreendendo uma das SEQ ID NOS: 2 e 4 a 6 e uma sequência polinucleotídica compreendendo uma das SEQ ID NOS: 3 e 8 a 10.
- 2. Método para expressar uma sequência de interesse em uma célula hospedeira, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de:a. inserir uma sequência de interesse a ser expressa em um vetor de expressão, como definido na reivindicação 1, no sítio de clonagem;b. transfectar uma célula hospedeira com o vetor de expressão; ec. cultivar a dita célula hospedeira sob condições adequadas para obter expressão da dita sequência de interesse.
- 3. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor de expressão é um vetor de expressão eucariótico.
- 4. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor compreende SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3.
- 5. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor compreende SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 3.Petição 870200012849, de 27/01/2020, pág. 73/912/2
- 6. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor compreende uma sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 1.
- 7. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor compreende uma sequência polinucleotídica de SEQ ID NO:7.
- 8. Kit CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o vetor de expressão, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 e 3 a 7, em que o kit compreende ainda uma enzima de restrição, ligase e/ou tampão.
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