ES2614402T3 - 5'UTR sintéticas, vectores de expresión y métodos para aumentar la expresión transgénica - Google Patents
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Abstract
Un vector de expresion que comprende una construccion de un gen sintetico que comprende, cuando se dispone desde 5' a 3', un promotor, un polinucleotido quimerico y una secuencia de interes que se va a expresar, en donde: a. el polinucleotido quimerico comprende el segundo intron de un gen de la calcio ATPasa del reticulo sarcoplasmico/endoplasmatico y al menos una porcion de la region 5' no traducida (5'UTR) de un gen de la caseina; y b. el polinucleotido quimerico esta situado entre el promotor y la secuencia de interes que se va a expresar, en donde el segundo intron del gen de la calcio ATPasa del reticulo sarcoplasmico/endoplasmatico esta situado hacia el promotor y el fragmento de polinucleotido de la region 5' no traducida (5'UTR) del gen de la caseina esta situado hacia la secuencia de interes que se va a expresar.
Description
longitud, se han derivado las ecuaciones para calcular la Tm (véase Sambrook et al., supra, 9,50-0,51). Para la hibridación con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos, la posición de los emparejamientos incorrectos se vuelve más importante, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook et al., supra, 11,7-11,8).
5
En una realización, los polinucleótidos se detectan empleando condiciones de hibridación que comprenden una etapa de hibridación en menos de 500 mM de sal y al menos 37 °C, y una etapa de lavado en 2 X SSPE al menos a 63°C. En otra realización, las condiciones de hibridación comprenden menos de 200 mM de sal y al menos 37 °C para la etapa de hibridación. En determinadas realizaciones, las condiciones de hibridación comprenden 2 X SSPE y 63 °C para las etapas de hibridación y lavado.
La longitud de un ácido nucleico hibridable es, por ejemplo, al menos aproximadamente 10 nucleótidos. Una longitud mínima para un ácido nucleico hibridable puede ser al menos aproximadamente 15 nucleótidos; al menos aproximadamente 20 nucleótidos; o al menos 30 nucleótidos. Además, el técnico experto reconocerá que la
15 temperatura y la concentración salina de la solución de lavado se pueden ajustar según sea necesario de acuerdo a factores tales como la longitud de la sonda.
Los fragmentos de ácidos nucleicos sustancialmente similares de la presente invención son aquellos fragmentos de ácidos nucleicos cuyas secuencias de ADN son al menos idénticas en un 70 % a la secuencia de ADN de los fragmentos de ácidos nucleicos notificados en el presente documento. Los fragmentos de ácidos nucleicos de la presente invención incluyen aquellos fragmentos de ácidos nucleicos cuyas secuencias de ADN son al menos idénticas en un 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, y 99 % a la secuencia de ADN de los fragmentos de ácidos nucleicos notificados en el presente documento.
25 El término "correspondiente a" se usa en el presente documento para referirse a secuencias similares u homólogas, tanto si la posición exacta es idéntica o diferente de la molécula de la cual se mide la similitud o la homología. La alineación de una secuencia de ácido nucleico o aminoácidos puede incluir espacios. Por lo tanto, el término "correspondiente a" se refiere a la similitud de secuencias, y no a la numeración de los restos de aminoácidos o bases de nucleótidos.
Una "porción sustancial" de una secuencia de aminoácidos o nucleótidos comprende suficiente de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o la secuencia de nucleótidos de un gen para identificar presuntamente este polipéptido
o gen, tanto mediante evaluación manual de la secuencia por un experto en la materia, como mediante comparación e identificación de secuencias automatizada informáticamente utilizando algoritmos tales como BLAST (Basic Local 35 Alignment Search Tool (Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica; Altschul y col., J. Mol. Biol. 215:403 410 (1993)); BLAST está públicamente disponible en la World Wide Web. En general, es necesaria a menudo una secuencia de treinta o más aminoácidos o nucleótidos contiguos para identificar presuntamente una secuencia de polipéptidos o ácidos nucleicos como homóloga a una proteína o gen conocido. Además, con respecto a las secuencias de nucleótidos, las sondas de oligonucleótidos específicas de genes que comprende 20 a 30 nucleótidos contiguos se pueden usar en métodos dependientes de secuencias de identificación de genes (por ejemplo, hibridación Southern) y aislamiento (por ejemplo, hibridación in situ de colonias bacterianas o placas de bacteriófagos). Además, se pueden usar oligonucleótidos cortos de 12 a 15 bases como cebadores de la amplificación por PCR a fin de obtener un fragmento de ácido nucleico concreto que comprenda los cebadores. De acuerdo con ello, una "porción sustancial" de una secuencia de nucleótidos comprende suficiente de la secuencia para identificar y/o aislar
45 específicamente un fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia.
El término "porcentaje de similitud", como se conoce en la materia, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, que se determina comparando las secuencias. En la técnica, "identidad" significa también el grado de correspondencia entre secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, según el caso, que se determina por la correspondencia entre cadenas de dichas secuencias. "Identidad" y "similitud" pueden calcularse fácilmente por métodos conocidos, incluyendo, pero no de forma limitativa, los descritos en: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, Nueva York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, Nueva York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Parte I (Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds.) Humana Press, Nueva Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology
55 (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); y Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. y Devereux, J., eds.) Stockton Press, Nueva York (1991). Los métodos para determinar la identidad están diseñados para proporcionar la mejor correspondencia entre las secuencias ensayadas. Los métodos para determinar la identidad y la similitud están públicamente disponibles en programas informáticos. Se pueden llevar a cabo alineaciones de secuencias y cálculos del porcentaje de identidad utilizando el programa Megalign de la suite de cálculo bioinformático (DNASTAR Inc., Madison, Wl). Se pueden llevar a cabo múltiples alineaciones de las secuencias utilizando el método de alineación Clustal (Higgins et al., CABIOS. 5:151 153 (1989)) con los parámetros por defecto (PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=10). Se pueden seleccionar los parámetros por defecto para las alineaciones por pares utilizando el método Clustal: KTUPLE 1, PENALIZACIÓN POR HUECO=3, VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5.
65
El término "software de análisis de secuencias" se refiere a cualquier algoritmo informático o programa de software que
9
caseína de Capra hircus, un gen de la beta caseína de Equus caballus, un gen de la beta caseína de Sus scrofa, un gen de la beta caseína de Camelus dromedaries, un gen de la beta caseína de Oryctolagus cuniculus, o un gen de la beta caseína de Canis lupus.
5 El fragmento de polinucleótido que comprende al menos una porción de una región 5' no traducida del gen de la caseína puede tener al menos aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. En otras realizaciones, el fragmento de polinucleótido del gen de la caseína que comprende al menos una porción de la 5'UTR puede tener al menos aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 85, 90, 100 o más nucleótidos de longitud. En otra realización, el fragmento de polinucleótido que comprende al menos una porción de 5'UTR de un gen de la caseína puede representar al menos aproximadamente un 50 % de la secuencia 5'UTR natural. En otras realizaciones, el fragmento de polinucleótido que comprende al menos una porción de 5'UTR de un gen de la caseína puede representar al menos aproximadamente un 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más de la secuencia 5'UTR natural. En otra realización, el fragmento de polinucleótido que comprende al menos una porción de 5'UTR de un gen de la caseína puede representar la secuencia 5'UTR completa natural.
15 En otras realizaciones, las variantes funcionales de los componentes individuales (el fragmento de polinucleótido que comprende el segundo intrón de un gen de la calcio ATPasa del retículo sarcoplásmico/endoplasmático y el fragmento de polinucleótido que comprende al menos una porción de 5'UTR de un gen de la caseína), se usan para crear una 5'UTR sintética. Las variantes funcionales abarcan variantes de sustitución, inserción y deleción y sus combinaciones. Las variantes de sustitución son aquellas, en donde se ha eliminado al menos una base en la secuencia de nucleótidos y se ha insertado una base diferente en su lugar. Las variantes de inserción de un ácido nucleico son aquellas, en donde se introducen uno o más nucleótidos en un sitio predeterminado de la secuencia. Las variantes de deleción de un ácido nucleico se caracterizan por la eliminación de uno o más nucleótidos del ácido nucleico. Se puede producir cualquier combinación de sustitución(ones), deleción(ones) o inserción(ones) con la condición de que la funcionalidad
25 del componente siga siendo esencialmente la misma, es decir, que la variante funcional, cuando se usa en una 5'UTR sintética de la presente invención, dé lugar a una expresión aumentada de una secuencia de interés, un gen sintético,
o transgén.
Adicionalmente, las secuencias homólogas a las realizaciones específicas del fragmento de polinucleótido que comprende el segundo intrón de un gen de la calcio ATPasa del retículo sarcoplásmico/endoplasmático divulgadas en el presente documento (SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, y SEQ ID NO:6) y las secuencias homólogas a las realizaciones específicas del fragmento de polinucleótido que comprende al menos una porción de la 5’UTR de caseína (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, y la SEQ ID NO: 10) se pueden usar para construir una 5'UTR sintética. Como se ha mencionado anteriormente, las fuentes adecuadas de un fragmento para crear una 5'UTR
35 sintética incluyen un gen de la calcio ATPasa del retículo sarcoplásmico/endoplasmático de cualquier especie eucariota y un gen de la caseína de cualquier especie de mamífero. En una realización, el fragmento de polinucleótido que comprende el segundo intrón de un gen de la calcio ATPasa del retículo sarcoplásmico/endoplasmático se deriva de un ortólogo de SERCA2 de canino, SERCA2 de ratón, o SERCA2 de ser humano. En otra realización, el fragmento de polinucleótido que comprende al menos una porción de la 5'UTR de la caseína se deriva de un ortólogo de la beta caseína de bovino, beta caseína de ratón, beta caseína de rata, o beta caseína de oveja.
Las personas expertas en la materia conocerán métodos para investigar e identificar los homólogos de la calcio ATPasa de retículo sarcoplásmico/endoplasmático o de los homólogos de 5'UTR de la caseína. Dichos métodos comprenden la comparación de las secuencias representadas por las SEQ ID NO: 2-6 y 8-10, en un formato
45 informáticamente legible, con secuencias que están disponibles es bases de datos públicas en la World Wide Web tales como M IPS, GenBank, o base de datos de secuencias de nucleótidos del EMBL, utilizando algoritmos bien conocidos en la técnica para la alineación o comparación de secuencias, tales como GAP (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48; 443453 (1970)), BESTFIT (Miller, W., Myers, E. W. y Lipman, D. J., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)), FASTA y TFASTA (W. R. Pearson y D. J. Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448 (1988)). El software para llevar a cabo los análisis BLAST está públicamente disponible del National Centre for Biotechnology Information. Se pueden identificar los homólogos adecuados utilizando los parámetros por defecto de BLAST (matriz BLOSUN62, penalización por apertura de hueco de 11 y penalización por extensión de hueco de 1).
Adicionalmente, los homólogos de SERCA 2 de canino, ser humano, o ratón pueden identificarse también
55 investigando sobre secuencias conservadas en el gen SERCA2. Por ejemplo, la secuencia completa del exón 3 de SERCA2 de canino tal como la SEQ ID NO: 11 se puede usar como secuencia de consulta en la investigación mediante BLAST. Se anticipa que utilizando la secuencia del exón como secuencia de consulta en la investigación mediante BLAST se recuperaran mayores cantidades de homólogos de SERCA2 que utilizando una secuencia que comprende la secuencia del intrón. De manera similar, se pueden identificar homólogos de beta caseína de bovino, ratón, rata, u oveja utilizando una porción codificante tal como la secuencia de consulta.
Es también posible el análisis de secuencias genómicas para identificar homólogos de la calcio ATPasa de retículo sarcoplásmico/endoplasmático u homólogos de 5'UTR de la caseína. Están disponibles algunos algoritmos y herramientas de software para identificar genes en la secuencia de ADN bruto. Usualmente estas herramientas 65 combinan el análisis de parámetros estadísticos en la secuencia de ADN con métodos basados en la homología para identificar secuencias homólogas en bases de datos. Aunque ninguno de estos métodos en solitario es
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- Número de acceso
- Descripción Cobertura de consulta Valor E Identidad Máxima
- EU365364
- Gen twich 2 (ATP2A2) que ralentiza el transporte de ATPasa CA++ del músculo cardiaco de Homo sapiens, exones 2, 3 y cds parcial. 99 % 2e-16 77 %
- AM 137440
- Gen atp2A2 para la calcio ATPasa 2 del retículo sarcoplásmico/endoplasmático de Equus caballus, exones 1-20. 51 % 3e-14 90 %
- M33834
- Gen Ca-2+■ ATPasa (SERAC2) de retículo sarcoplásmico/endoplasmático de Oryctolagus cuniculus, exones 1-3 y cds parcial 53 % 5e-05 80 %
Un fragmento de genoma de Equus caballus identificado a partir de los resultados de la investigación de BLAST indicada en la Tabla 1 (número de acceso público AM 137440) se comparó con la secuencia NM_001081765 del ARNm de SERCA2 de Equus caballus utilizando la función de alineamiento por pares en el programa DNA Strider 5 1.4f17 públicamente disponible (véase Marck, C, Nucleic Acids Research 16(5):1829-1837 (1988) y Douglas, S, Molecular Biotechnology 3(1):37-45 (1995) para las descripciones del DNA Strider). Las secuencias se alinearon utilizando el método Blocks utilizando parámetros por defecto para la penalización por emparejamiento incorrecto y la penalización por hueco. En la Figura 13 se muestra una porción de la alineación de la secuencia genómica de Equus caballus y ARNm, con flechas marcando el comienzo y el final del segundo intrón del gen SERCA2 de Equus caballus.
10 La región de homología que es 5' para el intrón representa el exón 2, y la región de homología que es 3' para el intrón representa el exón 3.
A continuación se sintetizó un oligonucleótido que representaba un fragmento del gen SERCA2 de Equus caballus comprendiendo el segundo intrón, que se fusionó con la SEQ ID NO: 3 utilizando técnicas de ADN recombinante para 15 crear una 5'UTR sintética. A continuación se insertó la 5'UTR sintética en un vector entre un promotor de citomegalovirus humano (CMV) y un gen indicador de la luciferasa. A continuación se usaron el vector y un vector control con una poliG 5'UTR para transfectar células 3T3. Se midió la actividad de la luciferasa utilizando un luminómetro y se compararon unidades de luz relativas entre ambos conjuntos de células. La expresión del indicador en células transfectadas con el vector que contenía la 5'UTR sintética se elevó en comparación con las células
20 transfectadas con el vector que contenía la poliG 5'UTR.
Ejemplo 3
Una investigación en la base de datos pública de nucleótidos no redundantes del GenBank, utilizando el algoritmo
25 blastn con parámetros por defecto, utilizando la SEQ ID NO: 3 como secuencia de consulta dio como resultado los siguientes homólogos representativos relacionados en la Tabla 2. La SEQ ID NO: 3 representa el componente de la 5’UTR de la caseína de bovino de la 5’UTR sintética representada por la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 7.
Tabla 2
- Número de acceso
- Descripción Cobertura consulta de Valor E Identidad Máxima
- DQ317447
- ARNm de la beta caseína de Bubalus bubalis, cds completo 77 % 5e-10 97 %
- NM_001009373
- Beta caseína de Ovis aries (CSN2), ARNm. 77 % 6e-09 95 %
- AY311384
- Gen de la beta caseína de Capra hircus, promotor y exón 1. 56 % 5e-04 96 %
- NM_001081852
- Beta caseína de Equus caballus (CSN2), ARNm. 58 % 0,002 93 %
- AY452035
- Gen de la beta caseína de Sus scrofa, Región promotora, exón 1, y secuencia parcial. 56 % 0,006 93 %
- AJ409279
- Gen parcial de la beta caseína de Camelus dromedarius, región 5' flanqueante. 56 % 0,006 93 %
- NM_001082759
- Pre-beta-caseína de (AA-15 to 213) (LOC100009539) de Oryctolagus cuniculus, ARNm. 66 % 0,006 88 %
- NM_001003086
- Beta caseína (CSN2) de Canis lupus familiaris, ARNm. 67 % 0,88 83 %
El segundo intrón de cada gen SERCA2 representativo relacionado en la Tabla 1 se identifica usando un programa de 22
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-
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