KR20080098598A

KR20080098598A - 알파-갈락토스 전이 효소 활성을 가진 갈락토시다제

Info

Publication number: KR20080098598A
Application number: KR1020087018907A
Authority: KR
Inventors: 게오르지오스 쵸르치스; 아타나시오스 케이. 고울라스; 테오도로스 고울라스
Original assignee: 클라사도 인크.
Priority date: 2006-01-31
Filing date: 2007-01-23
Publication date: 2008-11-11
Anticipated expiration: 2027-01-23
Also published as: PL1979473T3; US20090110770A1; KR101342472B1; JP4960974B2; GB2447006B; GB2447006A; IL192892A0; ATE507287T1; RU2441913C2; WO2007088324A1; AU2007211356B2; AU2007211356A1; IL192892A; CA2637219A1; EP1979473B1; UA95944C2; NO20082780L; EP1979473A1; GB0812896D0; CA2637219C

Abstract

본 발명은 비피도박테리움 비피덤으로부터 분리된 갈락토스 전이 활성을 가진 β-갈락토시다제에 관한 것이다. 상기 β-갈락토시다제는 락토스를 β-연결되어 있으며 예상치 못하게 알파-연결된 이당류 알파1-6 갈락토바이오스를 생성하는 올리고당 혼합물로, 전환시킬 수 있다. 상기 혼합물은 장에서 비피도박테리아의 증식을 촉진시켜 장 건강을 향상시키고 병원성 균총의 증식을 억제하기 위해 수많은 식품 또는 동물 사료에 혼합할 수 있다.

Description

알파-갈락토스 전이 효소 활성을 가진 갈락토시다제{GALACTOSIDASE WITH ALPHA-GALACTOSYLTRANSFERASE ACTIVITY}

본 발명은, 락토스를, β-연결되어 있으며 예상치 못하게 알파-연결된 2당류 알파1-6 갈락토바이오스를 생성하는 올리고당 혼합물로, 전환시킬 수 있는 갈락토스 전이 활성을 가진 β-갈락토시다제에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 최근 발견된 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) 균주로부터 분리된 β-갈락토시다제에 관한 것이다.

본 발명은 특히 분리된 β-갈락토시다제 효소를 코딩하는 DNA 서열, 상기한 DNA 서열에 의해 코딩되는 효소, 및 상기 DNA 서열을 포함하는 숙주 세포 또는 상기 DNA 서열이 도입된 재조합 벡터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 올리고당을 생산하기 위한, DNA 서열에 의해 코딩되는 효소, DNA 서열을 포함하는 숙주 또는 재조합 벡터의 용도에 관한 것이다.

비피도박테리아는 원래, 상부 장관에 존재하는 숙주와 미생물에 의해 우선적으로 단당류 및 2당류가 소비됨에 따라 상기 단당류 및 2당류가 부족한 환경으로 되는 하부 장관에서 군집한다. 비피도박테리아는 하부 장관에서 생존하기 위해, 다양한 탄수화물을 이용할 수 있는 다양한 종류의 엑소- 및 엔도-글리코시다제를 표면에 결합된 형태 및/또는 세포외 형태로 생산한다.

비피도박테리아의 일부 효소들은 하이드롤라제 활성 이외에도 트랜스퍼라제 활성을 보인다. 이러한 글리코시다제의 당 전이 활성은 다양한 올리고당의 효소적 합성에 널리 이용되며, 비피도박테리아 증식 촉매 인자로 작용하는 것으로 입증되었다.

비피도박테리아 속 균들은 락토스의 박테리아 대사에 관여하는 β-갈락토시다제 효소를 생산하는 것으로 알려져 있다. Moller, P.L. et al in Appl & Environ . Microbial., (2001), 62, (5), 2276-2283에는 비피도박테리움 비피덤 균주로부터 3종의 β-갈락토시다제 유전자의 분리 및 특성화가 기재되어 있다. 이들은, 3종의 β-갈락토시다제 모두가 갈락토스 전이에 의해 β-연결된 갈락토올리고당의 생성을 촉매할 수 있다는 것을 확인하였다.

Dumortier et al in Carbohydrate Research, 201, (1990), 115-123에는 비피도박테리움 비피덤 DSM 20456을 이용한 락토스 가수분해에서 당 전이 반응에 의한 β-연결된 올리고당의 생성에 대해 기술되어 있다. 생성된 올리고당 혼합물의 구조 분석에서, 연결은 β-(1->3), β-(1->6) 및 β-(1->4)-D-갈락토실 연결인 것으로 확인되었다. Dumortier는 비피도박테리움 비피덤에 의해 생산된 화합물이 대장내 박테리아 유착에 관여하는 것으로 제시하였다.

락토스를, 갈라바이오스(galabiose)(Gal(α1-6) - Gal)를 포함하는 2당류를 예상치 못할 정도로 최대 35%까지 포함하는 신규한 갈락토올리고당 혼합물로 전환시키는, 갈락토시다제 효소를 생산하는 비피도박테리움 비피덤 균주가 발견되었다. 상기 2당류는 장벽에 독소, 예컨대 시가 독소(Shiga toxin) 및 E. coli 등의 병원체 부착을 방지할 수 있는 항-부착제인 것으로 공지되어 있다(Paton, J.C. & Paton, A. W. (1998), Clin . Microbiol . Revs., 11, 450-479; Carlsson, K.A. (1989), Ann . Reviews Biochem., 58, 309-350).

이러한 비피도박테리움 비피덤 균주는 2003년 3월 31일에 영국 에버딘에 위치한 국립 산업 및 해양 박테리아 수집국(National Collection of Industrial & Marine Bacteria)에 기탁번호 NCIMB 41171로 기탁되었다. 또한, 영국 특허 2 412 380에 기술되어 있다.

이러한 비피도박테리움 비피덤 균주는 뜻밖에도 α-갈락토스 전이 효소 활성을 보이는, 수종의 β-갈락토시다제를 생산하는 것으로 현재 확인되고 있다. 이 효소는 β-연결되어 있는 다수의 상이한 올리고당 뿐만 아니라 알파-연결된 2당류 갈라바이오스를 만든다.

본 발명은 서열번호 2로 제시된 아미노산 서열의 단백질을 코딩하는 DNA 서열 또는 엄격한 조건하에서 상기 단백질을 코딩하는 상기 DNA 서열에 혼성화하는 DNA 서열을 제공한다. 상기 DNA 서열은 서열번호 1로 제공되며, 또는 그 단편이나 변성체(degenerative)를 포함할 수도 있다.

"변성체"란 표현은 서열번호 1과 50% 이상 상동한, 바람직하기로는 50 - 98% 상동한, 가장 바람직하기로는 75 - 95% 상동한 DNA 서열을 의미하는 것으로 해석된다.

이러한 DNA 서열은, 서열번호 2의 아미노산 서열에서 60% 미만이, 바람직하기로는 45% 미만이, 더 바람직하기로는 25% 미만이 변화되는, 뉴클레오타이드의 치환, 부가 또는 결손을 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 치환은 보존적인 아미노산 치환을 만들 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 전술한 바와 같은 DNA 서열에 의해 코딩되는 효소를 제공한다. 상기 효소는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 그 단편을 포함할 수 있다.

본 발명의 또다른 측면은 전술한 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터, 바람직하기로는 발현 벡터를 제공한다. 이러한 벡터는 박테리아, 효소 또는 진균 세포 등의 숙주 세포에 통합될 수 있다. 다른 예로, 상기 DNA 서열은 상기 숙주 세포에 통합될 수도 있다. 적합한 숙주 세포는 비피도박테리움, 락토코커스, 락토바실러스, 바실러스, 예컨대 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 또는 바실러스 서쿨란스(Bacillus circulans), 에스케리챠(Escherichia) 및 아스퍼질러스 예컨대 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 중에서 선택될 수 있다.

락토스를 기질로 이용하여, 전술한 바와 같이 DNA 서열에 의해 코딩되는 효소는 Gal (β1-3) Glc, Gal (β1-3) Gal, Gal　(β1-6) Gal 및 Gal (α1-6) Gal을 포함하는 2당류 혼합물을 형성한다. 또한, 올리고당의 혼합물에는 3당류인 Gal (β1-6) Gal (β1-4) Glc, Gal (β1-3) Gal (β1-4) Glc, 4당류인 Gal (β1-6) Gal (β1-6) Gal (β1-4) Glc 및 5당류인 Gal (β1-6) Gal (β1-6) Gal (β1-6) Gal (β1-4) Glc도 존재한다.

전술한 바와 같이, 효소 또는 숙주 세포를 이용하여, 장 건강을 향상시키기 위한 제품의 일부분을 형성할 수 있는 Gal (α1-6) Gal(갈라바이오스) 등의 2당류 혼합물을 만들 수 있다. 상기한 제품은 유제품(예, 액상유, 전지분유, 탈지분유, 지방 대체 분유(fat filled milk powder), 유청과 같은 분유, 유아 우유, 유아 조제식(baby formula), 아이스크림, 요거트, 치즈, 발효 유제품), 과일 주스와 같은 음료, 유아 식품, 시리얼, 빵, 비스켓, 제과류, 케이크, 식품보조제, 식이보충제, 프로바이오틱 식료품, 프리바이오틱 식료품, 동물 사료, 가축 사료 또는 실질적인 임의의 기타 식품 또는 음료로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

다른 예로서, 그렇게 제조된 올리고당은 병원체나 병원체에 의해 생산된 독소의 장벽 부착을 방지하기 위한 약제, 예컨대 정제 또는 캡슐 형태의 제조에 이용할 수 있다. 약제는 예컨대 종종 정상적인 건강한 장내 균총(gut flora)을 변화시키거나 심지어 파괴하는 항생제 치료 과정 다음에 환자에게 투여할 수 있다.

본 발명의 또다른 측면은 전술한 숙주 세포를 전술한 효소의 발현을 허용하는 조건하에서 적정 배양 배지에서 배양하는 단계 및 배양물로부터 생산되는 효소를 회수하는 단계를 포함하는, 상기 효소의 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 전술한 효소 또는 전술한 숙주 세포를 올리고당 혼합물의 생성을 유도하는 조건하에서 락토스 함유 기질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 2당류 Gal (α1-6) Gal(갈라바이오스) 등의 올리고당 혼합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

적합한 락토스 함유 기질은 상업적으로 이용가능한 락토스, 전유(whole milk), 반-탈지유(semi-skimmed milk), 탈지유, 유장, 지방 대체유(fat-filled milk) 및 유청으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이들 유제품은 소, 버팔로, 양 또는 염소로부터 유래될 수 있다. 지방 대체유는 유지방을 제거하기 위해 탈지된 후, 식물성 유지나 오일 첨가에 의해 대체된 전유로 정의된다.

게놈 DNA를 Lawson et al. (1989) Ferns Microbiol Letters, 65, (1-2), 41-45의 방법을 이용하여 비피도박테리움 비피덤 균주(NCIMB 41171)로부터 분리하였다. 이 DNA를 제한 효소로 자르고, 가장 큰 15 kbp 단편을 동일한 제한 효소로 절단한 pSP72 벡터에 연결하였다. PstI, EcoRI, BamHI, KpnI, SmaI 또는 HindIII로 절단한 비피도박테리움 비피덤 염색체 DNA로 구성된 삽입물을 포함하는 벡터를 E. coli 세포에 형질전환하였다. p-니트로페닐, X-β-Gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토사이드) 및 이소프로필-β-D-티오갈락토사이드(IPTG)가 함유된 LB(Luria Bertani) 아가 플레이트 상에서 β-갈락토시다제 활성을 가진 클론을 선별하였다. BamHI 염색체 DNA와의 라이게이션 혼합물에서 7개의 β-갈락토시다제 양성 클론이 동정되었고, 이중에 하나는 pB1으로 동정되었다.

DNA 삽입 단편인 B1의 DNA 서열분석을 생거(Russel P., 2002 iGenetics, Pearson Education, Inc., San Francisco, 187-189)의 다이데옥시 체인 종결 방법으로, BigDye Terminator V.3.0 사이클 시퀀싱 키트(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였다. B1의 DNA 서열은 도 1(서열번호 1)에 나타나 있다.

오픈 리딩 프레임(ORF)은 NCBI(National Center of Biotechnology Information)의 ORF 파인더를 이용하여 위치를 확인하였다. 도 1의 뉴클레오타이드 서열은 모두 6개의 가능한 리딩 프레임으로 번역되며, 추정의 β-갈락토시다제를 코딩하는 1052개의 아미노산으로 이루어진 하나의 오픈 리딩 프레임이 동정되었다. 번역 결과는 도 2(서열번호 2)에 나타나 있다.

도 1은 본 발명의 비피도박테리움 비피덤 β-갈락토시다제의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 1)을 나타낸 것이다.

도 2는 도 1의 뉴클레오타이드 서열에 대응하는 아미노산 서열(서열번호 2)을 나타낸 것이다.

도 3은 β-갈락토시다제와 기질로서 0.1M 인산 완충액(pH 6.0) 중의 40%(w/w) 락토스를 이용한 갈락토올리고당 합성 반응 동안의 시간 경과에 따른 반응을 나타낸 그래프이다.

도 4는 기질로서 0.1M 인산 완충액(pH 6.0) 중의 40%(w/w) 락토스를 이용하여 비피도박테리움 비피덤 NCIMB 41171 유래의 β-갈락토시다제에 의해 합성된 갈락토올리고당 혼합물의 고성능 음이온 교환 크로마토그램을 나타낸다(Glc = 글루코스, Gal = 갈락토스, Lac = 락토스, 알파(1-6) 갈락토바이오스, DP = 중합도).

본 발명은 하기 실시예를 들어 추가적으로 설명된다.

실시예 1

재료 및 방법

본 실험 전체에서 사용된 모든 화합물과 배지 조제물은 Sigma(Dorset, UK), Invitrogen(Paisley, UK), Oxoid(Basingstoke, UK), Qiagen(West Sussex, UK) 및 Promega(Southampton, UK)에서 구입하였다.

박테리아 균주

비피도박테리움 비피덤 균주(NCIMB 41171)는 마이크로뱅크 튜브내 냉동 비드상에서 -70 ℃에서 유지하였다. 나중 실험을 위해, 균주는 Wilkinson Chalgren(WC) 아가(Oxoid, UK) 및 TPY 배지(trypticase phytone yeast extract medium)에서 소생시키고, 37 ℃에서 48시간 동안 혐기적으로(CO₂ 및 N₂ 조성은 각각 80% 및 20%) 배양하였다. 콜로니 모양과 오염원의 부재는 그람 염색으로 테스트하였다.

E. coli 균주

E. coli 균주인 DH5a를 본 실험에 사용하였고, 이들은 일반적으로 LB(Luria Bertani) 아가나 브로스(Sambrook J. and Russell, W.D., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York)에서, 37 ℃로 호기적으로 배양하였으며, 때에 따라 항생제(lOO ㎍/ml 암피실린 및/또는 15 ㎍/ml 클로람페니콜)와 40 ㎕의 2% X-α-Gal을 보충하였고, 7 ㎕의 20% IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토사이드)를 미리 만들어둔 90 mm 아가 플레이트 표면에 도포하였다.

E. coli DH5a 균주(Invitrogen, Paisley, UK)(유전자형: F^-φ80lacZΔM Δ(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(r_k ^-, m_k ^-)phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1λ^-)는 α-갈락토시다제 양성 균주이며, 그외 모든 유전자 조작에 사용하였다.

비피도박테리움 비피덤으로부터 게놈 DNA 추출

게놈 DNA는 100 ml의 WC 혐기성 브로스로부터 수거한 세포 펠렛으로부터 염색체 DNA를 준비하는, 하기 방법을 이용하여 비피도박테리움 비피덤 균주(NCIMB 41171)로부터 분리하였다. 세포를 10 ml의 TES 완충액(10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 10 mM NACl, pH8)에 재현탁한 다음, 200 ㎕의 라이소자임/무타노라이신(lysozyme/mutanolysin) 혼합물(4:1, 라이소자임 10 mg/ml; 무타노라이신 1 mg/ml)을 30분간 37 ℃에서 처리하였다. 이후, 세포에 200 ㎕의 프로테나제 K(20 mg/ml) 및 200 ㎕의 RNase(10 mg/ml)을 처리하고, 혼합한 다음, 1시간 동안 65 ℃에서 배양하였다. 최종적으로, 세포에 2 ml의 10% SDS를 첨가하여 65 ℃에서 15분간 배양하였다. 여기에 페놀/클로로포름 12 ml을 첨가하고, 인터페이스(interphase)로부터 수상을 쉽게 분리할 수 있을 때까지 추출을 반복 실시하였다. 게놈 DNA를 이소프로판올로 침전시키고, 10 mM Tris-HCl - 1 mM EDTA(pH8)에 재현탁하였다. 이후, 게놈 DNA를 제한 효소로 절단하여, 동일한 효소로 자른 pSP72에 연결한 다음, 알카리 포스파타제를 처리하였다. 비피도박테리움 비피덤 게놈 DNA의 절단은 EcoRI, PstI, BamHI, SmaI 또는 KpnI을 이용하여 수행하였다. 연결 혼합물을 이용하여 E. coli DH5a를 형질전환하였고, β-갈락토시다제 양성 콜로니를 X-Gal-함유 플레이트에서 블루 콜로니로 동정하였다.

벡터 DNA 제조

본 실험에서 클로닝 및 발현에 사용한 벡터는 pSP72(Promega, UK)(Krieg, P.A. and Melton, D.A.(1987). In vitro RNA synthesis with SP6 RNA polymerase. Methds on Enzymology. 155: 397-415)였다.

이 벡터는 pSP72에 코팅되어 있지 않은 β-갈락토시다제의 알파-단편의 상보적인 활성이 결핍되어 있어, 선택하였다. 이 벡터는, β-갈락토시다제의 처음 146개의 아미노산에 대한 코딩 정보와 조절 서열을 포함하는 E. coli DNA의 짧은 단편을 가지고 있지 않아, 이 β-갈락토시다제의 카르복시 말단 부분을 발현하는 E. coli 균주(즉, DH5a)와 조합하여 활성의 β-갈락토시다제(알파-상보)를 제공한다.

이 벡터는 제조사의 설명서에 따라 DNA 대비 10배에 해당하는 효소(효소 단위: ㎍r DNA는 플라스미드 DNA ㎍r 당 효소 10 단위이거나, 또는 플라스미드 DNA 0.5 pmol 당 효소 10 단위임)를 이용하여 PstI, BamHI, HindIII, SmaI, KpnI 및 EcoRI으로 절단하였다. 효소는 열에 의해 불활성화(65 ℃에서 20분)한 다음, 제한효소 절단 패턴을 수평적인 젤 전기영동 분석에 의해 분석하였다. 젤에 하나의 단편이 존재하는 것은 벡터의 완전한 절단과 벡터가 제한효소로 한번 절단되었음을 시사한다.

벡터의 충분한 절단은 또한 컴피턴트 E. coli DH5a에 미연결 분자의 형질전환에 의해 테스트하였다. 암피실린(lOO㎍r/ml)이 첨가된 LB 아가 플레이트상에 형성된 콜로니의 수는 절단되지 않은 분자의 표시이며, 이후의 실험에서의 예상되는 백그라운드를 나타낸다.

제조사의 설명서에 따라 소의 장내 알칼라인 포스파타제 CIAP(Promega, Southampton, UK)를 이용하여 벡터를 추가적으로 탈인산화하였다. 처리 효율은 (박테리오파지 T4 DNA 라이게이즈를 제조사의 설명서에 따라 사용한) 벡터의 자가-연결(self-ligation) 및 후속적인 DH5a 세포로의 형질전환에 의해 테스트하였다. 형성된 콜로니 수는 재고리화된 분자(클로닝되지 않은 벡터)의 갯수를 나타내며, 여기에서 CIAP 벡터 처리하지 않은 경우에 형성된 콜로니를 제하면, 탈인산화되지 않은 벡터의 갯수가 된다.

게놈 DNA 라이브러리 구축

게놈 DNA는 원핵생물 DNA내에서 빈번하게 이루어지는 6개의 뉴클레오타이드 서열을 인지하는 6종의 제한 효소로 부분 절단하였다. EcoRI, BamHI, PstI, KpnI, SmaI 및 HindIII는 각각 5'G/AATTC'3, 5'G/GATCC'3, 5'CTGCA/G'3, 5'GGTAC/C3', 5'CCC/GGG3', 및 5'A/AGCTT3'을 특이적으로 인지하는 타입 II 제한 엔도뉴클레아제며, 이들 서열내에 4개의 뉴클레오타이드로 이루어진, EcoRI, BamHI 및 HindIII의 경우에는 각각 AATT, GATC 및 AGCT의 5' 돌출부(overhang)가, 그리고 PstI 및 kpnI의 경우에는 각각 ACGT 및 GTAC의 3' 돌출부가, 그리고 SmaI은 블런트 엔드(blunt end) 형성되는 이중가닥 절단을 수행한다.

이들 효소 모두 활성이었으며, 이가 마그네슘 이온이 존재하는 경우에만 DNA를 절단할 수 있었다. 이들 이온은 단지 필수 보조인자였다.

DNA 의 제한효소 절단

게놈 DNA 샘플의 모든 제한효소 절단은 2시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션하 여 실시하였고, 최종적으로 65 ℃에서 20분 동안 열에 의해 불활성화하였다. 이후, 반응물을 실온으로 냉각시키고, 적량의 로딩 완충액을 첨가하고, 밀폐된 유리 모세관을 이용하여 부드럽게 혼합하였다. 이 용액은 0.8% 아가로즈 젤의 웰에 주입하고(14-16시간 동안 4-5 volt의 전력 공급), 1 kbp DNA 표준물질(Promega, UK)(Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002))을 이용하여 절단된 DNA 크기를 추정하였다.

제한효소로 절단한 후 생성된 단편의 정제

반응 혼합물 및 아가로즈 젤에서의 단편 정제는 Qiagen 사의 QIAEX 젤 추출 키트(West Sussex, UK)를 이용하여 수행하였다. 프로토콜은 제조사의 매뉴얼에 상세히 기술되어 있다.

DNA 연결 및 형질전환

QIAEX 젤 추출 키트를 이용하여 DNA 단편을 분리한 다음, 이를 CIAP-처리한 pSP72 벡터에 연결하였다. 연결을 위해, 표 1에 나타낸 바와 같이 적량의 DNA를 멸균한 0.5 ml 미세원심분리관에 넣었다.

시험관 DNA

A 벡터(15 fmoles [~ 29.7 ng])

B 벡터(15 fmoles ~29.7ng DNA)

+ 삽입체(외래물 15 fmoles ~ 69.3ng )

C pUC 대조군(0.056 fmoles [-100 pg])

연결 반응에서 플라스미드 DNA 벡터 : 삽입 DNA 단편의 몰비는 ~ 1: 1이어야 한다. 최종 DNA 농도는 ~ 10 ng/ ㎕이어야 한다.

표 1: 연결 혼합물. A 관은 형질전환 후 형질전환체 총 수에서 제해야 될 자가-연결된 벡터 DNA 수이다. B 관은 벡터와 DNA 단편의 연결을 나타낸 것이고, C 관은 형질전환 효율을 계산하기 위한 대조군이다.

각각의 연결 전에, DNA 단편들은 45 ℃에서 5분간 가온하여, 단편을 제조하는 동안에 다시 어닐링되는 코헤시브(cohesive) 말단을 용융하였다. 모든 연결 반응에서 벡터: 삽입 DNA의 몰 비를 1:1로 정하고, 반응 어셈블리를 Promega의 지침에 따라 수행하였다.

A 관과 B 관에, 1.0 ㎕의 1Ox 연결 완충액과 0.5 Weiss 단위의 T4 DNA 라이게이즈(Promega, UK)를 넣고, 분자생물학에 적합한 등급의 물을 사용하여 연결 반응 부피를 10 ㎕로 조정하였다. C 관에, 10x 연결 완충액 1.0 ㎕을 넣고, 분자생물학에 적합한 등급의 물을 사용하여 연결 반응 부피를 10 ㎕로 조정하였다.

DNA 단편은 물과 함께 시험관에 넣은 다음 5분간 45 ℃로 가온하여, 제조하는 동안에 다시 어닐링되는 코헤시브(cohesive) 말단을 용융하였다. DNA는 0 ℃로 냉각한 다음 나머지 연결 반응시약을 첨가하고, 반응 혼합물을 16 ℃에서 철야 인큐베이션하였다(Sambrook and Russell, 2001).

(형질전환 효율을 감소시키는 연결 혼합물을 제거하기 위한) 에탄올 침전 및 연결된 단편의 정제를 수행한 다음, 형질전환을 Hanahan 지시에 따라 수행하였다. 연결된 DNA ~50 ng의 5 ㎕ 용액을 컴피턴트 E. coli DH5a 세포 100 ㎕에 첨가하였다. 열 처리 및 암피실린 내성 유전자의 발현을 수행한 후, 세포를 암피실린(1OO ㎍r/ml), X-α-Gal(40 ㎕의 2% X-α-Gal) 및 IPTG(7 ㎕의 20% IPTG)가 함유된 LB 플레이트 표면에 도말하였다.

각 연결 반응물에서의 형질전환체의 수를 측정하였다. C 관에서 일반적으로 수득되는 형질전환체 갯수는 2 x 1O⁵ - 1 x 10⁶ cfu/㎍이었지만, A 관의 경우에는 500 - 600 cfu/㎍이었다. A 관에서의 형질전환체 갯수는 벡터 DNA의 처리 효율을 나타낸다. B 관의 형질전환체 수는 2 - 4 x 10⁴ cfu/㎍이었다.

형질전환체의 수

PstI 염색체 DNA와의 연결 혼합물에서, 약 2500개의 스크리닝된 형질전환체 중에서 13개의 β-갈락토시다제 양성 클론이 나타났으며, BamΗI 처리 염색체 DNA에서는 약 7개의 양성 클론(~1500 scr. 형질전환체)이, EcoRI 처리 염색체 DNA에서는 약 3개의 양성 클론이(~1300 scr. 형질전환체), KpnI의 경우 7개의 양성 클론이(~2000 scr. 형질전환체), SmaI의 경우 3개의 양성 클론이(~16000 scr. 형질전환체), 그리고 HindIII의 경우 2개의 양성 클론이(~1200 scr. 형질전환체) 나타났다.

양성 클론의 절단

여러가지 β-갈락토시다제 유전자를 동정하기 위해, 양성 클론으로부터 분리한 플라스미드를 하기 표와 같이 절단하였다.

	샘플	효소
1차 절단	pB1, pB2, pB3, pB4, pB5, pB6, pB7	BamHI
2차 절단	pP1, pP2, pP3, pP4, pP5, pP6, pP7, pP8, pP9, pP10, pP11	PstI
3차 절단	pP12, pP13, pP14	PstI
4차 절단	pE1, pE2, pE3	EcoRI
5차 절단	pP1, pP12, pB1, pP2, pE1, pE2, pE3......	PstI 및 EcoRI
6차 절단	pS1, pS2, pS3	SmaI
7차 절단	pP1, pP12, pB1, pP2, pS1, pS2, pS3	PstI 및 SmaI
8차 절단	pK1, pK2, pK3, pK4, pK5, pK6, pK7	KpnI
9차 절단	pP1, pP12, pB1, pP2, pK1, pK2, pK3, pK4, pK5, pK6, pK7	PstI 및 KpnI
첫번째 글자(p)는 플라스미드와 삽입 유전자를 나타내고, 두번째 글자(P,B,E,S,K)는 게놈 DNA로부터 각 클론을 분리하는데 사용된 제한효소를 나타낸다.

절단 후 수득되는 단편의 겔 전기영동 분석은, 플라스미드 pB1, pP1, pP2 및 pP11 각각이 상이한 β-갈락토시다제를 코딩하는 삽입체를 가지고 있는 것으로 확인되었다. pB1을 포함하는 클론을 이후의 분석에 사용하였다.

DNA 서열분석

DNA 서열 분석은 생거의 다이데옥시 체인 종결 방법으로, BigDye Terminator V.3.0 사이클 시퀀싱 키트(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였고, 모세관 전기영동이 통합된 형광을 이용한 DNA 분석 시스템인 ABI Prism 3100으로 분석하였다.

삽입된 DNA 단편의 5'- 및 3'- 말단은 벡터에 특이적인 프라이머를 이용하여 서열분석하였다. 삽입체는 또한 Genome Priming System(GPS-1)(New England Biolabs, Uk)를 이용하여 더욱 서열분석하였다. GPS-1은 DNA 타겟에 무작위로 트랜스포존을 삽입하기 위해 TnsABC 트랜스포사제를 이용하는 TN7 트랜스포존 기반의 시험관내 시스템이다. 제조사의 설명서에 따라 공여체 : 타겟 DNA의 중량비를 1:4로 이용하였다. 타겟 플라스미드에 트랜스프라이머를 삽입한 후 서열분석하기 위 한 분리된 플라스미드의 수는 25개였다. 이 수치는 제조사의 설명서에 따라 계산하였고, 유효 범위(fold depth of coverage)는 5로 추측되었다.

플라스미드 pB1에서, 사용된 벡터의 다중 클로닝 부위의 하류 973bp 위치에 ~1699bp 트랜스포존-삽입체의 삽입은 β-갈락토시다제 활성을 완전히 제거하였으며, 이는 개시 코돈이 벡터 MCS(다중 클로닝 부위)와 트랜스포존 부위 사이에 위치되어 있음을 의미한다. 그러나, MCS의 하류 841bp 위치에 삽입은 활성의 β-갈락토시다제의 생성으로 이어졌는데. 이는 개시 코돈이 MCS의 하류 841bp 내지 973bp 사이에 존재함을 의미한다. 효소 활성은 MCS의 하류 3565bp 위치에 삽입체가 삽입되었을 때 완전히 없어졌으며, 이는 개시 코돈이 이 위치의 하류에 있음을 의미한다. 또한, 1239bp, 1549bp, 1683bp, 1832bp, 2108bp, 2189bp, 2270bp, 2340bp, 2414bp, 2574bp, 2648bp, 2734bp, 2807bp 및 3410bp 위치에 삽입도 효소적 활성을 완전히 제거하였다.

서열분석 반응 혼합물에는 약 400-600ng의 플라스미드 DNA, 3.2pmol의 프라이머 용액 및 4㎕의 BigDye 종결 용액이 포함되어 있었다.

오픈 리딩 프래임 식별

B1의 오픈 리딩 프레임(ORF)은 NCBI의 ORF 파인더를 이용하여 위치를 확인하였다. 박테리아의 유전자 코드를 이용하였고, 프레임 길이는 100 bp인 것으로 확인하였다. 뉴클레오타이드 서열은 모두 6개의 가능성 있는 리딩 프레임으로 번역되며, 추정의 β-갈락토시다제를 코딩하는 1052개의 아미노산으로 이루어진 하나의 오픈 리딩 프레임이 동정되었다(도 2에 번역 결과를 나타냄).

실시예 2

비피도박테리움 비피덤 NCIMB 41171로부터 분리된 β- 갈락토시다제 클론 효소를 이용한, E. coli 숙주( DH5a )에서의 합성

별도로 언급하지 않는 한, 하기 기술된 합성은, 세포 투과성을 증가시키고 세포질 막을 파괴함으로써 세포를 비-생존성이 되게 하기 위해 (10,000 g로 원심분리하여 회수한), E. coli 바이오메스를 2000 ppm의 톨루엔으로 처리한 후, E. coli DH5a 숙주 세포 전체를 이용하여 수행하였다. E. coli 바이오메스는 실시예 1의 "E. coli 균주"에 기재된 바와 같이 준비하였다.

클로닝한 효소를 이용한 합성

β-갈락토시다제를 이용한 합성은 기질 농도가 40% (w/w) 초기 멜리바이오스 농도인 조건에서 수행하였다. 합성 용액은 pH 6.0의 0.1 M 인산 완충액(또는 pH 6.2의 0.1M 사이트레이트 완충액 또는 pH 6.8의 포타슘 포스페이트 완충액)으로 준비하였다. 합성은 150 rpm의 교반 수조에서 40 ℃로 수행하였다. 특이적인 효소에 대한 최적 pH는 다양한 pH에서 (o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노사이드를 기질로 이용하여) 특이적 효소 준비물의 활성 측정치를 기초로 선정하였다.

β-갈락토시다제 합성을 위해, 5 ml의 E. coli DH5a 세포 현탁물(활성 2.2 U/ml)을 원심분리(10,000 g)하여, 세포 바이오메스를 모으고, 상층액은 버렸다. 합성을 수행하기 위해, 상기 바이오메스는 10 g의 40%(w/w) 멜리바이오스 기질 용액로 재현탁하였다.

합성 중에 혼합물에 존재하는 다양한 당의 농도를 도 3에 나타낸다. 비피도박테리움 비피덤 NCIMB 41171로부터 클로닝한 β-갈락토시다제에 의해 합성한 갈락토올리고당 혼합물의 펄스형 전류계 검출이 연계된 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC-PAD) 크로마토그램은 도 4에 나타낸다. 최적 합성 시간대의 갈락토올리고당 혼합물의 당 농도를 표 1에 나타낸다.

표 1. 최대 올리고당 농도가 관찰되는 시간대에 40 %(w/w) 초기 멜리바이오스 농도에서의 β-갈락토올리고당 합성의 탄수화물 조성.

합성 초기 기질	GOS DP≥3	GOS DP=2	Lac	Glc	Gal
%(w/w)	농도(총 당에 대한 %)
40	20.45	27.64	12.73	25.90	13.28

Lac: 락토스, Glc: 글루코스, Gal: 갈락토스, DP: 중합도

SEQUENCE LISTING <110> LINDSAY, Clare L <120> Product and Process <130> 13906WO:GH <150> GB 0601901.2 <151> 2006-01-31 <160> 2 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 7281 <212> DNA <213> Bifidobacterium bifidum <220> <221> gene <222> (1)..(7281) <400> 1 ggatccggtg aacgcgccga gcgcggtgta cgtgctgcgc tcgtgcgagt cggaggagat 60 cgcggggatc atgccccagt aggagatgtc gcgcagcgag tagatcacgt cgagcaggat 120 gaacacgatg acgaacagga ccatgaacac gccggtgttc acatccacga ggccgaacag 180 gccggtgaac accatgatca gcaggatgcc aggcacgatg ccgccaatga actgccacgg 240 gcggaaccgg ccccagcggg tgttcgtgtt gtccacgagg ttgccgagca gcgggtcgag 300 aaagatctcc gcgatgcgga tgaccaccac gagtccggtg atcaccgcga tgaggcgttt 360 ggcaagcgtc ttgtccacgt cgatgaacag cgcggtggtc acgaacgtga tgaagaacgt 420 gctcattgtg ttgtagaacg cggcctggcc caggttaccg aatgcgtatg cgatcttctg 480 acccgtgttc cgcgtgggct gcggccttcc ggtcgtttcc gtgtgttgtg tggtggatcc 540 gctcatggtg tggtggcctc cttgcgacct gtaaagaatc cgtgcgcgtg aaccgctccg 600 atcccgcaaa gcgtgagtat agaactttct tgaaaaagta gaaaactata ccgcgtgtcg 660 caaatcatgc caacgttctg caaccggcac tccgtgtgga tgagtaaggt ttgaagcctg 720 cttgatgtgc ttgaatctta agaaatccac gtattctgca tgttgcaggc cttgtgccgc 780 gaaatgctgg aaagaatttg cgcaatcaag taacaatatt tatccttgtt gtacaaggaa 840 cccgattcaa cgaggttccc tcactgcggc ggcaacgacg cgacgcaatc cgatgcgaaa 900 gcgaggacat catgaacaca accgacgatc agcggaagaa cggcgatccg atcgtctccc 960 cgtccatacc gacgacggca tggctcgccg acccgcgcgt gtacgcggtt caccggctcg 1020 acgcccattc cgatcatgcg tgctggtctc gctccccagt cgacggcgag agcacgaatc 1080 tcaggcagag ccttgacggc gaatggcggg tccgcgtcga gacggcgccg acgggccgtt 1140 tccccgatgg gacgagcgac gggccggact ggatcagcga cgtgtcgcct ctgttcgccg 1200 cgcccggatt cgacgattcg tcgttctcac gcgtgcaggt gccctcgcat ctggagactg 1260 cggggctgct tgccccgcag tacgtgaacg tgcagtaccc atgggacgga catgaggacc 1320 cgaaggcccc ggccatcccc gagcatggcc atgtggcggt ctaccggcgc gagttcgacg 1380 cggatggcga agtcgcccag gccgtgcgcg aagggcgccc ggtgacgctt accttccagg 1440 gcgcggccac agccatctac gtgtggctca acggctcgtt cgttggctac gccgaggact 1500 ccttcacgcc cagcgagttc gacgtgacgg acgcgatcaa ggtggacggc aacgtgctgg 1560 cggtcgtctg ctacgagtat tcgagcgcga gctggttgga ggatcaggac ttctggcgtc 1620 tgcacggcct gttccgctcc gtcgaactca acgcgaggcc cgccgcccac atcgccgacc 1680 tccatgccga cgccgactgg gatctcgcca catcaagggg ttcgctctcg ctggatgtgc 1740 tgatcgacgg tgccgcgaac gccgcgacgg tcgacttcgc actgtgggac aagaacggca 1800 ccatcgtctg gcacaccgcc acgaaagcgg acggaacgct gcacgccgag gccgagatcg 1860 atgacgcggc gccatggagc gccgaacgcc ccgacctgta cgagctatcc gtcaccctgc 1920 tcgacgcgga cggcaaggtc ctggagaccg ctcgcactcg catcggcttc cggcatgtgg 1980 ccatcgagga cggcatcctc aagctcaacg gcaagcgcct cgtgttccgt ggcgtcaacc 2040 gccacgagtt cgactgccgg cgcggccggg ccatcaccga agaggacatg ctgtgggaca 2100 tccgcttcat gaagcgccac aacatcaacg cggtgcgcac ctcgcactat ccgaaccagt 2160 cgcgctggta cgagctgtgc gacgaatacg gcatctacct gatcgacgag accaatctgg 2220 agacccatgg cagctggaac agccccggcg acatccccgt gggaacctcc gtccccggtg 2280 acgacgaggc ctggctgggc gcgtgcatcg accggctgga cagcatgatc ctgcgcgacc 2340 gcaaccatcc cagcgtgctc gtctggtcgc tgggcaacga atcctacgcg ggcgaagtcc 2400 tcaaggccat gagcgcgcac gcgcaccggc ttgatccggg tcgtcccgtc cactacgaag 2460 gtgtcaactg gaaccatgcc tacgacggga tcagcgactt cgaaagccgt atgtacgcca 2520 agccggccga gatccaagac tggctcgaac acggcgacga acggggcgag gcgagcaagc 2580 cgttcgtcag ctgtgagtac atgcatgcca tgggcaactc gtgcggcggt ctgagcgagt 2640 tcatcgacct cgaacggtac gagcgctact ccggcgggtt catctgggat tacatcgacc 2700 aggggctcgt ccagcgtctg cccgacggga gcgaacgcct cagcgtcggc ggagaatggg 2760 gcgaccgtcc aaccgactac gaattcgtgg gcaacggcat cgtgttcgcc gaccgcacgc 2820 ccagccccaa ggcgcaggag gtcaagcagc tgtattcgcc ggtcaagctc gcccccgacg 2880 ggcacggcgt gaccatcgag aaccgcaacc tgttcgccgg caccgacggc tacgtgttcg 2940 ccgcacggct cctcgaagac gggcatgaga tctggcatgc cgactaccgt ttcgacgtgg 3000 ccgcaggaga tacccaacac catgacatcg ccttcccgga catcgacgcg gacggggata 3060 cgcgcgaagt cacctacgag gtcgatctcc tgctcgccga agccaccgca tgggcgccgg 3120 ccggctacga gctcgcgttc ggccaactca ccggcacgct caaccccgaa caggacatca 3180 ccgagaccag ccatgacgac gacggccgcg caactcgcac gctcagccga tggaacgccg 3240 gcatccgccg cgacgacgag gaaattctcc tgtcacgcac tcagggaggc atcgtctcct 3300 ggaagcgcga cgaccgggaa atggtcatcc gtcgccccga actcgtcacg ttccgcccat 3360 tgaccgacaa cgatcgcggt aaccattccg gtttcgaccg tgccgcatgg ttcgcggccg 3420 gccgatacgc catcgtaacc gaaacgaaaa tccatgaaag cgatgacggt ctcgtagcgg 3480 aataccagta cgaacttgcc gatccgaacc acacgcccgt gtccgtcact taccatgtca 3540 actccgatat gcgtatgcaa ctgaccgtcg aataccccgg gaacgccact gacatggcca 3600 gtctgcccgc gttcggtatc gaatgggagc tgcccggcga atacgatcgt ctgcgctact 3660 acggccccgg ccccgaggag acctaccgcg accgtaagca gggcggcaag ctcggcatct 3720 gggacgccac cgcgaaggcg agcatggcgc cgtatctcat ggtgcaggaa accggcagcc 3780 acgaggacgt ccgctggctc gaagccaccg acatccaagg ccacggattg cgcgtcaccc 3840 aacgcggcga ccgtcacttc acggccagcc tgctgccctg gaacacctac acgatcgagg 3900 ccgcgcgccg ccacgaggac ctgcccaaac cgcgccacaa ctacctgcgc ctgctcgcgg 3960 cccagatggg cgtcggtgga gacgactcct ggggagcccc cgtccacacg gcctaccagc 4020 tgcccgccgg caggccgctc accctcgacg tgaacctcga actcatctga ccggcaacgg 4080 gcggcggcat gcaccaccat gccgccgccg gccccgccta cgacgcggcg atcgaggcca 4140 cgggcgctgc ggccgcggac ggcaccggcg aggaggcgtt cgagcgcgcc ggccacgcgg 4200 tccacggcac cacccgccag gtcctctcgc tcatcaccaa cccgatggac gtgatctgcc 4260 gcaacatccg caccgtgcgc gagaagatgg caacccgccc cgacatcctc ggctgccacc 4320 tcgaaggccc gttcctcgcc ctcaagtgca agggcgcgca cgattcgaac tgcctcaaag 4380 acccgatgcc cgaactcatg gaccgcatgc tcgacgcctc gggcgccgac ctcgccgccg 4440 gcaagctcgg gtgcatccgc cagatcacca tctcgacccc accgactgga ccgcccaaca 4500 cgtctggtgc gccggccgcc aggtggagta aactccttcc agcaaaatcg acgccggtgc 4560 cgcccgtctc gagacgacgt cttacgcctg aggaacgaag cttgcgcgcg gcaccagttc 4620 ggtcgtcagc aggatgtgac gacgcacccg ccgctcatgc ttcaacccat cgatcagggt 4680 ggagaacgcc atgcgggcca actccctttg atcgatcgca tacgaactca gcggcggcga 4740 cgtgtaccgg gcgatcgact ggttgttcac actcaccacg gccaactcgt cgggaacctc 4800 cacgcgcagt gcgttcaacg cctgcaacgc ccccaccgca agcacgtcgg cggccacgat 4860 caaaccatcg ggcatgctgc cggcctcacg atggtcagcc accaactgct ccgcgagacg 4920 atagccgttc tccacggtga acgtgccgga cgaatacacc aatccgtccg tttccaatcc 4980 cagatgcgcg gcccactgac ggaacgacag ctcgcgaatg tcctcgggat agtcatgcat 5040 gcccatgatg ctgcccacgc cgccgagaaa cgcgatatga ctgcggcccg ccgcgatcat 5100 cgcgtccaag gcgtccagca tcgtctgcga cagatcggga cacacggagt cgaacaggcg 5160 cggcgccgga ttcgtgtcga tgcacacgcc atgcgggagc accatatgca gggctcgcag 5220 gtccgcttcg ggaaacaccg tggctcccac ggtgatgaac ccatcaaact ccgttgcgcg 5280 ttccgtcaac tcgtgtatgg acaacgtgag ctggtccaat tccaacgact ccgcacgctc 5340 cgcaagaacc ttccgcagat cggcgaagta cgcgtcctgc aattcctccc cggacggagg 5400 cgcatccaac accgcgatcg cgggacggaa cacgttgcga taccccatct cctcgcacac 5460 gcgcaacaca cgccgacgcg tctcctcctt gatggagaac gacgggtcgt tcaacaagcg 5520 tgacaccgtg ctctgcgaca ccccggcccg tcccgcgact tccttgagcg tggccatgac 5580 atcctccccg caaactttag taaagggttt tactacagca taacccggga aggcggggtt 5640 agcggcattg gcggcgtgga agtttaccca tgactggtag actgcacatg tcccggcaat 5700 aggggcaatg catagggggg tggcgggcat gtgcagcaac attcccgtca ccttacgatt 5760 cttatagcgt gtcaggtaaa agaattatga ttctcaatcc accttccggc cgcgcctgca 5820 gactcaaatg gccatgatgc atagcgacaa tctctcgcac tatggataaa cccaatccgt 5880 gatgaggtga tgcagatccc acatgcgtat ttatcctatt atcctcccct ctgttaaaag 5940 gtgacaggaa atcatctatc ctcgtatcgg aaagatccat gccggtattg gatatgtcta 6000 tcgcaatgca ggactcgcct tcgtattgcc tgtcgttggc taagtttatc catacatgtg 6060 gttgagccgc acgattatgc tgaatggcat tcgtaataag gtttgcaatc atctgtctaa 6120 ttagcagacc atcggctagg atatatgcat tctccagatt ggtatgtact tgaactctat 6180 ctccgataag ttccatattt tcctgaagaa cattgcgaat gatctcagct acattaactc 6240 ggctaagatc agctcggttt aattgctgaa ctttcgacaa ttcgagcaga tgattgacga 6300 tttcaacccc agcatgattt gaagccaaag ccttttcgac gaaaggtctg caacgctcat 6360 cgaaaagctg gttgtgcagc ggaatctcca atgcggccga agtggccgca agtggatttt 6420 ttaactcatg tgacgcatcg gcgataaatt ccttttcccg actgattgcg ctgttgagat 6480 cctttaacat gaggttgtat gcggatgcaa tagtgtacgc ctcgtcgttt tcatatggaa 6540 taacgatagg ttgcctttcc aatccagcgt cggacgcgat aatctgagag gccacactat 6600 tgattcttcg ttgtgtccta gtggcgataa tccaagttat tcctccagat aatatgccga 6660 aaacaatgat gggggctatg cttaccgcca atatcagatc ccgggatttt atgtctcctt 6720 gttccatagt tagcgttaaa gcatccttac cggagtcata cccggcagaa acgtaatcct 6780 taccggagtc aggaggaatg gcttgcgaat tcaaactatg ttgttcatcg gcatcttctg 6840 cctgagtaaa agatttattt acggtcactg tttccagttg ccggttcacg acataatatg 6900 tcatggcggt caccactccg gtaagcatga agaacacgat gacgatcgtg gtgaccaatc 6960 ttcttcttgt agaccactga aacggtaaac gcagtttcgg atggctggaa tggctcccat 7020 tcgacgaagg atattcaggc tttttcatga tatgcgatat ccttgtccgg gaacggtttc 7080 aatgaaatca gtgattccga ttttcgtgcg aatcgcatag attgtggtct tgacgattcc 7140 tctcgtatga gcgtgatcat cctgccaaat ctcacgatat agacattccg cactaatcac 7200 cgcacctcgc gcctcaatca gcgtcctcaa tacggcaagt tctcgtttcc caaactttag 7260 ttctgcaccg cgaaccgtga t 7281 <210> 2 <211> 1052 <212> PRT <213> Bifidobacterium bifidum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1052) <400> 2 Met Asn Thr Thr Asp Asp Gln Arg Lys Asn Gly Asp Pro Ile Val Ser 1 5 10 15 Pro Ser Ile Pro Thr Thr Ala Trp Leu Ala Asp Pro Arg Val Tyr Ala 20 25 30 Val His Arg Leu Asp Ala His Ser Asp His Ala Cys Trp Ser Arg Ser 35 40 45 Pro Val Asp Gly Glu Ser Thr Asn Leu Arg Gln Ser Leu Asp Gly Glu 50 55 60 Trp Arg Val Arg Val Glu Thr Ala Pro Thr Gly Arg Phe Pro Asp Gly 65 70 75 80 Thr Ser Asp Gly Pro Asp Trp Ile Ser Asp Val Ser Pro Leu Phe Ala 85 90 95 Ala Pro Gly Phe Asp Asp Ser Ser Phe Ser Arg Val Gln Val Pro Ser 100 105 110 His Leu Glu Thr Ala Gly Leu Leu Ala Pro Gln Tyr Val Asn Val Gln 115 120 125 Tyr Pro Trp Asp Gly His Glu Asp Pro Lys Ala Pro Ala Ile Pro Glu 130 135 140 His Gly His Val Ala Val Tyr Arg Arg Glu Phe Asp Ala Asp Gly Glu 145 150 155 160 Val Ala Gln Ala Val Arg Glu Gly Arg Pro Val Thr Leu Thr Phe Gln 165 170 175 Gly Ala Ala Thr Ala Ile Tyr Val Trp Leu Asn Gly Ser Phe Val Gly 180 185 190 Tyr Ala Glu Asp Ser Phe Thr Pro Ser Glu Phe Asp Val Thr Asp Ala 195 200 205 Ile Lys Val Asp Gly Asn Val Leu Ala Val Val Cys Tyr Glu Tyr Ser 210 215 220 Ser Ala Ser Trp Leu Glu Asp Gln Asp Phe Trp Arg Leu His Gly Leu 225 230 235 240 Phe Arg Ser Val Glu Leu Asn Ala Arg Pro Ala Ala His Ile Ala Asp 245 250 255 Leu His Ala Asp Ala Asp Trp Asp Leu Ala Thr Ser Arg Gly Ser Leu 260 265 270 Ser Leu Asp Val Leu Ile Asp Gly Ala Ala Asn Ala Ala Thr Val Asp 275 280 285 Phe Ala Leu Trp Asp Lys Asn Gly Thr Ile Val Trp His Thr Ala Thr 290 295 300 Lys Ala Asp Gly Thr Leu His Ala Glu Ala Glu Ile Asp Asp Ala Ala 305 310 315 320 Pro Trp Ser Ala Glu Arg Pro Asp Leu Tyr Glu Leu Ser Val Thr Leu 325 330 335 Leu Asp Ala Asp Gly Lys Val Leu Glu Thr Ala Arg Thr Arg Ile Gly 340 345 350 Phe Arg His Val Ala Ile Glu Asp Gly Ile Leu Lys Leu Asn Gly Lys 355 360 365 Arg Leu Val Phe Arg Gly Val Asn Arg His Glu Phe Asp Cys Arg Arg 370 375 380 Gly Arg Ala Ile Thr Glu Glu Asp Met Leu Trp Asp Ile Arg Phe Met 385 390 395 400 Lys Arg His Asn Ile Asn Ala Val Arg Thr Ser His Tyr Pro Asn Gln 405 410 415 Ser Arg Trp Tyr Glu Leu Cys Asp Glu Tyr Gly Ile Tyr Leu Ile Asp 420 425 430 Glu Thr Asn Leu Glu Thr His Gly Ser Trp Asn Ser Pro Gly Asp Ile 435 440 445 Pro Val Gly Thr Ser Val Pro Gly Asp Asp Glu Ala Trp Leu Gly Ala 450 455 460 Cys Ile Asp Arg Leu Asp Ser Met Ile Leu Arg Asp Arg Asn His Pro 465 470 475 480 Ser Val Leu Val Trp Ser Leu Gly Asn Glu Ser Tyr Ala Gly Glu Val 485 490 495 Leu Lys Ala Met Ser Ala His Ala His Arg Leu Asp Pro Gly Arg Pro 500 505 510 Val His Tyr Glu Gly Val Asn Trp Asn His Ala Tyr Asp Gly Ile Ser 515 520 525 Asp Phe Glu Ser Arg Met Tyr Ala Lys Pro Ala Glu Ile Gln Asp Trp 530 535 540 Leu Glu His Gly Asp Glu Arg Gly Glu Ala Ser Lys Pro Phe Val Ser 545 550 555 560 Cys Glu Tyr Met His Ala Met Gly Asn Ser Cys Gly Gly Leu Ser Glu 565 570 575 Phe Ile Asp Leu Glu Arg Tyr Glu Arg Tyr Ser Gly Gly Phe Phe Trp 580 585 590 Asp Tyr Ile Gly Gln Gly Leu Val Gln Arg Leu Pro Asp Gly Ser Glu 595 600 605 Arg Leu Ser Val Gly Gly Glu Trp Gly Asp Arg Pro Thr Asp Tyr Glu 610 615 620 Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val Phe Ala Asp Arg Thr Pro Ser Pro Lys 625 630 635 640 Ala Gln Glu Val Lys Gln Leu Tyr Ser Pro Val Lys Leu Ala Pro Asp 645 650 655 Gly His Gly Val Thr Ile Glu Asn Arg Asn Leu Phe Ala Gly Thr Asp 660 665 670 Gly Tyr Val Phe Ala Ala Arg Leu Leu Glu Asp Gly His Glu Ile Trp 675 680 685 His Ala Asp Tyr Arg Phe Asp Val Ala Ala Gly Asp Thr Gln His His 690 695 700 Asp Ile Ala Phe Pro Asp Ile Asp Ala Asp Gly Asp Thr Arg Glu Val 705 710 715 720 Thr Tyr Glu Val Asp Leu Leu Leu Ala Glu Ala Thr Ala Trp Ala Pro 725 730 735 Ala Gly Tyr Glu Leu Ala Phe Gly Gln Leu Thr Gly Thr Leu Asn Pro 740 745 750 Glu Gln Asp Ile Thr Glu Thr Ser His Asp Asp Asp Gly Arg Ala Thr 755 760 765 Arg Thr Leu Ser Arg Trp Asn Ala Gly Ile Arg Arg Asp Asp Glu Glu 770 775 780 Ile Leu Leu Ser Arg Thr Gln Gly Gly Ile Val Ser Trp Lys Arg Asp 785 790 795 800 Asp Arg Glu Met Val Ile Arg Arg Pro Glu Leu Val Thr Phe Arg Pro 805 810 815 Leu Thr Asp Asn Asp Arg Gly Asn His Ser Gly Phe Asp Arg Ala Ala 820 825 830 Trp Phe Ala Ala Gly Arg Tyr Ala Ile Val Thr Glu Thr Lys Ile His 835 840 845 Glu Ser Asp Asp Gly Leu Val Ala Glu Tyr Gln Tyr Glu Leu Ala Asp 850 855 860 Pro Asn His Thr Pro Val Ser Val Thr Tyr His Val Asn Ser Asp Met 865 870 875 880 Arg Met Gln Leu Thr Val Glu Tyr Pro Gly Asn Ala Thr Asp Met Ala 885 890 895 Ser Leu Pro Ala Phe Gly Ile Glu Trp Glu Leu Pro Gly Glu Tyr Asp 900 905 910 Arg Leu Arg Tyr Tyr Gly Pro Gly Pro Glu Glu Thr Tyr Arg Asp Arg 915 920 925 Lys Gln Gly Gly Lys Leu Gly Ile Trp Asp Ala Thr Ala Lys Ala Ser 930 935 940 Met Ala Pro Tyr Leu Met Val Gln Glu Thr Gly Ser His Asx Asp Val 945 950 955 960 Arg Trp Leu Glu Ala Thr Asp Ile Gln Gly His Gly Leu Arg Val Thr 965 970 975 Gln Arg Gly Asp Arg His Phe Thr Ala Ser Leu Leu Pro Trp Asn Thr 980 985 990 Tyr Thr Ile Glu Ala Ala Arg Arg His Glu Asp Leu Pro Lys Pro Arg 995 1000 1005 His Asn Tyr Leu Arg Leu Leu Ala Ala Gln Met Gly Val Gly Gly 1010 1015 1020 Asp Asp Ser Trp Gly Ala Pro Val His Thr Ala Tyr Gln Leu Pro 1025 1030 1035 Ala Gly Arg Pro Leu Thr Leu Asp Val Asn Leu Glu Leu Ile 1040 1045 1050

Claims

a) 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열의 단백질을 코딩하거나,

b) 엄격한 조건하에서 상기 a) 서열에 혼성화하거나, 또는

c) 상기 a) 또는 b) 서열의 변성체인, DNA 서열.
제 1항에 있어서, 상기 서열이 서열번호 1로 기재된 서열이거나 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 서열이 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 그 단편에서 60% 미만이, 바람직하기로는 45% 미만이, 더 바람직하기로는 25% 미만이 변화된 뉴클레오타이드의 치환, 부가 또는 결손을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 서열이 보존적인 아미노산 치환을 초래하는 뉴클레오타이드 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한항의 DNA 서열에 의해 코딩되는 효소.
서열번호 2의 아미노산 서열 또는 그 단편을 포함하는 효소.
서열번호 2에 기재된 서열을 갖는 β-갈락토시다제.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한항의 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터.
제 8항에 있어서, 상기 벡터는 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한항의 DNA 서열을 포함하는 숙주 세포.
제 8항 또는 제 9항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제 10항 또는 제 11항에 있어서, 상기 세포는 박테리아 세포, 효모 세포 또는 진균 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
제 12항에 있어서, 상기 세포는 비피도박테리움(Bifidobacterium), 락토코커스(Lactococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 에스케리챠(Escherichia), 바실러스(Bacillus) 및 아스퍼질러스(Aspergillus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
제 13항에 있어서, 상기 세포는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 서쿨란스(Bacillus circulans) 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
올리고당 혼합물 제조에 있어서의, 제 5항 내지 제 7항 중 어느 한항에 따른 효소 또는 제 10항 내지 제 14항 중 어느 한항에 따른 세포의 용도.
제 15항에 있어서, 상기 혼합물은 2당류 Gal (β1-3) Glc, Gal (β1-3) Gal, Gal　(β1-6) Gal 및 Gal (α1-6) Gal을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 15항 또는 제 16항에 있어서, 상기 혼합물은 3당류인 Gal (β1-6) Gal (β1-4) Glc, Gal (β1-3) Gal (β1-4) Glc, 4당류인 Gal (β1-6) Gal (β1-6) Gal (β1-4) Glc 및 5당류인 Gal (β1-6) Gal (β1-6) Gal (β1-6) Gal (β1-4) Glc를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
액상유, 건조 분말 우유, 유아 우유, 유아 조제식(baby formula), 아이스크림, 요거트, 치즈, 발효 유제품과 같은 유제품, 과일 주스와 같은 음료, 유아 식품, 시리얼, 빵, 비스켓, 제과류, 케이크, 식품보조제, 식이보충제, 프로바이오틱 식료품, 프리바이오틱 식료품, 동물 사료, 가축 사료 및 약제로 이루어진 군으로부터 선택되는 제품의 구성성분이 되는 올리고당 혼합물의 제조에 있어서의, 제 5항 내지 제 7항 중 어느 한항에 따른 효소 또는 제 10항 내지 제 14항 중 어느 한항에 따른 세포의 용도.
제 18항에 있어서, 상기 혼합물은 2당류 Gal (β1-3) Glc, Gal (β1-3) Gal, Gal　(β1-6) Gal 및 Gal (α1-6) Gal, 3당류 Gal (β1-6) Gal (β1-4) Glc, Gal (β1-3) Gal (β1-4) Glc, 4당류 Gal (β1-6) Gal (β1-6) Gal (β1-4) Glc 및 5당류 Gal (β1-6) Gal (β1-6) Gal (β1-6) Gal (β1-4) Glc를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
액상유, 건조 분말 우유, 유아 우유, 유아 조제식(baby formula), 아이스크림, 요거트, 치즈, 발효 유제품과 같은 유제품, 과일 주스와 같은 음료, 유아 식품, 시리얼, 빵, 비스켓, 제과류, 케이크, 식품보조제, 식이보충제, 프로바이오틱 식료품, 프리바이오틱 식료품, 동물 사료, 가축 사료 및 약제로 이루어진 군으로부터 선택되는 제품의 제조에 있어서의, 제 10항 내지 제 14항 중 어느 한항에 따른 숙주 세포의 용도.
제 5항 내지 제 7항 중 어느 한항에 따른 효소의 발현을 허용하는 조건하에서 제 10항 내지 제 14항 중 어느 한항에 따른 숙주 세포를 적정 배양 배지에서 배양하는 단계 및 배양물로부터 제조되는 효소를 회수하는 단계를 포함하는, 상기 효소의 생산 방법.
올리고당 혼합물의 제조 방법으로서,

상기 올리고당 혼합물은 2당류 Gal (β1-3) Glc, Gal (β1-3) Gal, Gal　(β1-6) Gal 및 Gal (α1-6) Gal, 3당류 Gal (β1-6) Gal (β1-4) Glc, Gal (β1-3) Gal (β1-4) Glc, 4당류 Gal (β1-6) Gal (β1-6) Gal (β1-4) Glc 및 5당류 Gal (β1-6) Gal (β1-6) Gal (β1-6) Gal (β1-4) Glc를 포함하며,

상기 방법은 제 5항 내지 제 7항 중 어느 한항에 따른 효소, 또는 제 10항 내지 제 14항 중 어느 한항에 따른 숙주 세포를, 락토스 함유 물질과 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 올리고당 혼합물의 제조 방법.