KR20060033001A

KR20060033001A - 키나제 억제제로서 활성인 피롤로[3,4-ｃ]피라졸 유도체

Info

Publication number: KR20060033001A
Application number: KR1020067000310A
Authority: KR
Inventors: 다니엘레 판첼리; 바바라 포르테; 유르겐 몰; 마리오 바라시; 파올라 비아넬로
Original assignee: 파마시아 이탈리아 에스.피.에이.
Priority date: 2003-07-09
Filing date: 2004-07-08
Publication date: 2006-04-18
Also published as: NZ544514A; ECSP056246A; NO20060113L; PE20050325A1; TWI343382B; AU2004255347B2; IL172923A0; CN1820009A; BRPI0411868B8; DOP2004000949A; IL172923A; NO332361B1; CA2531759C; EP1644376B1; PA8606201A1; HK1089769A1; AR050045A1; ZA200600095B; GT200400133A; BRPI0411868B1

Abstract

본 명세서에 정의된 바와 같은 화학식 I의 피롤로[3,4-c]피라졸 유도체 및 그의 제약상 허용되는 염, 그의 제조 방법 및 그를 포함하는 제약 조성물이 개시되며, 치료에 있어서 본 발명의 화합물은 암과 같이 조절 이상의 단백질 키나제 활성과 관련된 질환의 치료에 유용할 수 있다.

피롤로[3,4-c]피라졸 유도체, 단백질 키나제, 오로라 2 키나제

Description

키나제 억제제로서 활성인 피롤로[3,4-ｃ]피라졸 유도체 {PYRROLO[3,4-c]-PYRAZOLE DERIVATIVES ACTIVE AS KINASE INHIBITORS}

본 발명은 피롤로-피라졸 유도체, 그의 제조 방법, 그를 포함하는 제약 조성물, 및 특히 암 및 세포 증식 장애의 치료에서 치료제로서의 그의 용도에 관한 것이다.

단백질 키나제 (PK)의 기능 이상은 많은 질환의 특징이다. 인간 암에 관여하는 대부분의 종양유전자 및 원-종양유전자는 PK를 코딩한다. PK의 증대된 활성은 비-악성 질환, 예를 들어 양성 전립선 비대증, 가족샘종폴립증, 신경섬유종증, 건선, 죽상경화증과 관련된 맥관성 평활근세포 증식, 폐섬유증, 관절염, 사구체신염, 및 수술후 협착증 및 재협착증과도 관련된다.

PK는 염증성 증상, 및 바이러스 및 기생충의 증식과도 관련된다. PK는 신경퇴행성 장애의 발병 및 진행에서도 주요한 역할을 할 수 있다.

PK 기능 이상 또는 조절 이상에 관한 개괄적인 참고를 위해서는 예를 들어 문헌 [Current Opinion in Chemical Biology 1999, 3, 459-465]를 참조한다.

암 세포의 성장과 관련된 것으로 당업계에 공지된 여러 단백질 키나제 중에는 오로라 (Aurora) 키나제, 특히 오로라-2가 있다.

오로라-2는 각종 종양에서 과발현되는 것으로 밝혀졌다. 그의 유전자자리는 많은 암, 예를 들어 유방암 [Cancer Res. 1999, 59(9), 2041-4] 및 결장암에서 종종 증폭되는 염색체 부위인 20q13에 위치한다.

20q13 증폭은 결절-음성 유방암 환자에서의 불량한 예후와 상호 연관되며, 증가된 오로라-2 발현은 방광암 환자에서의 불량한 예후 및 생존 시간 단축을 나타낸다 [J. Natl. Cancer Inst., 2002, 94(17), 1320-9]. 또한, 비정상적인 중심체 기능에서 오로라-2의 역할에 관한 개괄적인 참고를 위해서는 문헌 [Molecular Cancer Therapeutics, 2003, 2, 589-595]를 참조한다.

<발명의 요약>

본 발명의 목적은 단백질 키나제 활성, 보다 구체적으로는 오로라 키나제 활성의 조절 이상에 의해 유발되고(거나) 그와 관련된 많은 질병의 작용제로서 치료에 유용한 화합물을 제공하는 것이다.

또다른 목적은 단백질 키나제 억제 활성, 보다 구체적으로는 오로라 키나제 억제 활성을 갖는 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 특정 피롤로-피라졸 및 그의 유도체가 단백질 키나제 억제 활성, 예를 들어 오로라 키나제 억제 활성을 갖는다는 것을 본 발명에 와서야 발견하였다.

보다 구체적으로, 본 발명의 화합물은 다양한 암, 예를 들어 암종, 예를 들어 방광암, 유방암, 결장암, 신장암, 간암, 폐암, 예를 들어 소세포 폐암, 식도암, 담낭암, 난소암, 췌장암, 위암, 자궁경부암, 갑상선암, 전립선암 및 피부암, 예를 들어 편평 세포 암종; 림프계의 조혈성 종양, 예를 들어 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프모세포성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 모발상 세포 림프종 및 버켓 림프종; 골수계의 조혈성 종양, 예를 들어 급성 및 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군 및 전골수구성 백혈병; 중간엽 기원의 종양, 예를 들어 섬유육종 및 횡문근육종; 중추 및 말초 신경계의 종양, 예를 들어 성상세포종, 신경모세포종, 신경교종 및 신경초종; 다른 종양, 예를 들어 흑색종, 정상피종, 기형암종, 골육종, 색소성 건피증, 각질가시세포종, 갑상선소포암 및 카포시 육종 (이에 제한되는 것은 아님)의 치료에 유용하다.

또한, PK 및 오로라 키나제가 세포 증식의 조절에서 중요한 역할을 하기 때문에, 상기 피롤로-피라졸은 다양한 세포 증식성 장애, 예를 들어 양성 전립선 비대증, 가족샘종폴립증, 신경섬유종증, 건선, 죽상경화증과 관련된 맥관성 평활근세포 증식, 폐섬유증, 관절염, 사구체신염, 및 수술후 협착증 및 재협착증의 치료에 유용하다.

따라서, 제1 실시양태에서 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 유효량을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 변화된 단백질 키나제 활성에 의해 유발되고(거나) 그와 관련된 세포 증식성 장애의 치료 방법을 제공한다.

식 중,

R은 수소 또는 메틸이고,

R₁은 히드록시 또는 직쇄형 또는 분지형 C₁-C₃ 알킬 또는 알콕시기이고,

R₂는 수소 또는 할로겐 원자이고,

X는 메틸렌 (-CH₂-) 또는 플루오로메틸렌 (-CHF-)으로부터 선택되는 2가 기이거나, 또는 X는 산소 (-O-) 또는 질소 (-NR'-) (여기서, R'는 수소 원자, 직쇄형 또는 분지형 C₁-C₄ 알킬기 또는 C₃-C₆ 시클로알킬기임)로부터 선택되는 헤테로원자 또는 헤테로원자-함유 기이다.

상기 방법은 변화된 오로라 키나제 활성에 의해 유발되고(거나) 그와 관련된 세포 증식성 장애의 치료를 가능하게 한다.

상기 기재된 방법의 바람직한 실시양태에서, 세포 증식성 장애는 암이다.

치료될 수 있는 암의 구체적인 유형으로는 암종, 편평 세포 암종, 골수 또는 림프계의 조혈성 종양, 중간엽 기원의 종양, 중추 및 말초 신경계의 종양, 흑색종, 정상피종, 기형암종, 골육종, 색소성 건피증, 각질가시세포종, 갑상선소포암 및 카포시 육종이 포함된다.

본 발명은 또한 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

<화학식 I>

식 중,

R은 수소 또는 메틸이고,

R₂는 수소 또는 할로겐 원자이고,

본 발명은 또한 상기 화학식 I의 피롤로-피라졸 및 제약상 허용되는 염, 및 또한 이들을 포함하는 제약 조성물의 합성 방법을 포함한다.

하기 발명의 상세한 설명을 참조하여 본 발명을 보다 잘 이해함에 따라, 본 발명의 보다 완전한 이해 및 그에 따른 많은 이점이 용이하게 파악될 것이다.

여러가지 헤테로시클릭 화합물이 단백질 키나제 억제제로서 당업계에 알려져 있다. 이들 중에서 3-카르복사미도-피라졸 및 3-우레이도-피라졸 및 이들의 유도체는 국제 특허 출원 WO 01/12189, WO 01/12188, WO 02/48114 및 WO 02/70515 (모두 본 출원인 명의임)에 단백질 키나제 억제제로서 개시되었다.

피라졸 잔기를 포함하며 키나제 억제 활성을 갖는 융합 비시클릭 화합물은 WO 00/69846, WO 02/12242, 및 또한 WO 03/028720 및 아직 공개되지 않은 출원 PCT/EP03/04862 (2002년 5월 17일자로 출원된 미국 특허 출원 60/381092를 우선권으로 주장함) (모두 본 출원인 명의임)에 개시되었다.

또한, 프레닐 트랜스퍼라제 단백질에 대한 억제 활성을 갖는 아미노페닐-피페라진 또는 아미노페닐-피페리딘 유도체가 WO 02/30927 (피에르 파브레 메디카먼트 (Pierre Fabre Medicament) 명의임)에 개시되어 있다.

본 발명의 화합물은 상기 언급된 WO 02/12242 (본원에 참고로 포함됨)의 화학식의 범주 내에 있으나, 상기 문헌에서 구체적으로 예시되지는 않는다.

본 발명의 화학식 I의 화합물은 비대칭 탄소 원자를 가지므로 개별 광학 이성질체로서, 라세미 혼합물로서, 또는 두 광학 이성질체 중 하나를 주성분으로 포함하는 임의의 다른 혼합물로서 존재할 수 있으며, 이들은 모두 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 이해되어야 한다.

마찬가지로, 화학식 I의 화합물의 모든 가능한 이성질체 및 이들의 혼합물의 항종양제로서의 용도, 및 대사물질과 제약상 허용되는 생체전구체 (달리 전구약물로 지칭됨) 둘 다의 항종양제로서의 용도도 본 발명의 범주 내에 있다.

전구약물은 생체내에서 화학식 I에 따른 활성 모 약물을 방출하는 임의의 공유 결합 화합물이다.

화합물이 호변이성질체 형태로 존재할 수 있는 경우, 각 형태는 평형 상태로 존재하든지 또는 한 형태가 우세하게 존재하든지에 관계없이 본 발명 내에 포함되는 것으로 간주된다.

이로써, 달리 제공되어 있지 않다면, 하기 화학식 Ia 또는 Ib의 호변이성질체 형태들 중 하나만 명시되는 경우에 나머지 하나도 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서, 달리 명시되어 있지 않다면, 본 발명자들은 직쇄형 또는 분지형 C₁-C₃ 또는 C₁-C₄ 알킬이란 용어로 예를 들어 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸 및 sec-부틸과 같은 기들 중 임의의 것을 나타낸다.

본 발명자들은 직쇄형 또는 분지형 C₁-C₃ 알콕시란 용어로 예를 들어 메톡시, 에톡시, n-프로폭시 및 이소프로폭시와 같은 기들 중 임의의 것을 나타낸다.

본 발명자들은 할로겐 원자란 용어로 불소, 염소, 브롬 또는 요오드 원자를 나타낸다.

본 발명자들은 C₃-C₆ 시클로알킬이란 용어로 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸 또는 시클로헥실과 같은 임의의 기를 나타낸다.

명백히, 화학식 I의 화합물의 페닐렌 잔기에 연결된 상기 헤테로사이클은 X기의 성질에 따라 피페리디노, 4-플루오로피페리디노, 피페라지노, 4-알킬-피페라지노, 4-시클로알킬-피페라지노 또는 모르폴리노 고리를 나타낼 수 있다.

화학식 I의 화합물의 제약상 허용되는 염으로는 무기산 또는 유기산, 예를 들어 질산, 염산, 브롬화수소산, 황산, 과염소산, 인산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 락트산, 옥살산, 말론산, 말산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 이세티온산 및 살리실산과의 산부가염이 포함된다.

본 발명의 바람직한 화합물 군은 화학식 I의 유도체 (여기서, R은 수소 또는 메틸이고, R₁은 히드록시, 메틸 또는 메톡시로부터 선택되고, R₂는 수소 또는 불소 원자이고, X는 메틸렌, 플루오로메틸렌, -O- 또는 -NR' (여기서, R'는 상기 기재된 바와 같음)로부터 선택됨)로 나타낸다.

임의로 제약상 허용되는 염 형태로 본 발명의 화학식 I의 임의의 특정 화합물에 관한 참고를 위해서는 하기 실험 부분 및 청구의 범위를 참조한다.

상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 추가 목적은

a) 하기 화학식 II의 화합물을 하기 화학식 III의 화합물과 반응시켜 하기 화학식 IV의 화합물을 얻는 단계,

b) 화학식 IV의 화합물을 산성 조건 하에 반응시켜 하기 화학식 V의 화합물을 얻는 단계,

c) 화학식 V의 화합물을 하기 화학식 VI의 화합물과 반응시켜 하기 화학식 VII의 화합물을 얻는 단계, 및

d) 화학식 VII의 화합물을 염기성 조건 하에 반응시켜 상응하는 화학식 I의 화합물을 수득하고, 원하는 경우에 이것을 그의 제약상 허용되는 염으로 변환시 키는 단계

를 포함하는 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염의 제조 방법을 제공하는 것이다.

식 중,

R 및 X는 상기 정의된 바와 같고, Q는 저급 알킬기이고, t-Bu는 tert-부틸을 나타내고, Z는 히드록시 또는 적합한 이탈기이고,

R₁ 및 R₂는 상기 정의된 바와 같고, Z'는 히드록시 또는 적합한 이탈기를 나타낸다.

상기 방법은 매우 잘 알려진 공정 조건에 따라 수행될 수 있는 유사 방법이다.

상기 방법의 단계 a)에 따르면, 화학식 II의 화합물과 화학식 III의 화합물의 반응은 아미노 유도체를 아실화시키기 위한 통상적인 방법에 따라 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 예로서, 화학식 II의 화합물을 Z가 적합한 이탈기로서 염소 원자를 나타내는 화학식 III의 아실 클로라이드와 반응시킬 수 있다.

상기 반응은 실온 내지 약 60 ℃ 범위의 온도에서 적합한 용매, 예를 들어 테트라히드로푸란 또는 디클로로메탄 중에서 양성자 포착제, 예를 들어 트리에틸아민 또는 디이소프로필에틸아민의 존재 하에 수행되는 것이 바람직하다. 화학식 II의 화합물의 Q는 저급 알킬기, 예를 들어 C₁-C₄ 알킬기, 보다 바람직하게는 메틸 또는 에틸을 나타낸다.

상기 방법의 단계 b)에 따르면, 화학식 IV의 화합물은 산 처리에 의해 피롤리딘 질소 원자가 쉽게 탈보호된다.

상기 반응은 약 1 내지 약 48 시간 범위의 시간 동안 실온 내지 약 40 ℃ 범위의 온도에서 적합한 용매, 예를 들어 디클로로메탄, 1,4-디옥산, 저급 알콜 (예를 들어, 메탄올 또는 에탄올) 중에서 무기산 또는 유기산, 예를 들어 염산, 트리플루오로아세트산 또는 메탄술폰산의 존재 하에 편리하게 수행될 수 있다.

생성된 화학식 V의 화합물은 상기 방법의 단계 c)에 따라 화학식 VI의 화합물과 더 반응한다. 상기로부터, 상기 아실화 반응이 또한 카르복사미드 제조 분야에 널리 알려진 다양한 방식 및 공정 조건 하에 수행될 수 있음은 당업자에게 명백하다.

Z'가 히드록시인 화학식 VI의 카르복실산과 화학식 V의 화합물의 반응은 적합한 시간, 즉 약 30 분 내지 96 시간 동안 약 -10 ℃ 내지 환류 온도 범위의 온도에서 적합한 용매, 예를 들어 디클로로메탄, 클로로포름, 테트라히드로푸란, 디에틸 에테르, 1,4-디옥산, 아세토니트릴, 톨루엔 또는 N,N-디메틸포름아미드 중에서 커플링제, 예를 들어 카르보디이미드, 즉 1,3-디시클로헥실카르보디이미드, 1,3-디이소프로필카르보디이미드, 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드, N-시클로헥실카르보디이미드-N'-프로필옥시메틸 폴리스티렌 또는 N-시클로헥실카르보디이미드-N'-메틸 폴리스티렌의 존재 하에 수행될 수 있다. 상기 반응은 임의로 적합한 촉매, 예를 들어 4-디메틸아미노피리딘의 존재 하에 또는 추가의 커플링 시약, 예를 들어 N-히드록시벤조트리아졸의 존재 하에 수행된다.

화학식 V의 화합물과 화학식 VI의 화합물의 반응은 예를 들어 약 -30 ℃ 내지 실온 범위의 온도에서 적합한 용매, 예를 들어 톨루엔, 디클로로메탄, 클로로포름, 테트라히드로푸란, 아세토니트릴, 디에틸 에테르, 1,4-디옥산 또는 N,N-디메틸포름아미드 중에서 3급 염기, 예를 들어 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민 또는 피리딘의 존재 하에 알킬 클로로포르메이트, 예를 들어 에틸, 이소-부틸 또는 이소-프로필 클로로포르메이트를 사용하여 혼합 무수물 방법을 통해 수행될 수도 있다.

Z'가 적합한 이탈기인 화학식 VI의 카르복실산 유도체와 화학식 V의 화합물의 반응은 -10 ℃ 내지 환류 온도 범위의 온도에서 적합한 용매, 예를 들어 톨루엔, 디클로로메탄, 클로로포름, 디에틸 에테르, 테트라히드로푸란, 아세토니트릴 또는 N,N-디메틸포름아미드 중에서 3급 염기, 예를 들어 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민 또는 피리딘의 존재 하에 수행될 수 있다.

하기 화학식 VI의 화합물은 별표로 표시된, R₁에 연결된 비대칭 탄소 원자의 존재를 특징으로 한다.

<화학식 VI>

따라서, 화학식 VI의 화합물은 단일 거울상이성질체의 형태로 또는 이들의 혼합물 (라세미 혼합물도 포함함)로 존재할 수 있다.

명백히, 본 발명의 방법에서 사용되는 화학식 VI의 화합물의 성질에 따라, 상기 탄소원자에서 적합하게 정의된 입체화학을 갖는 상응하는 화학식 VII의 화합물이 얻어질 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 단계 (c)는 소정의 거울상이성질체 형태인 적합한 화학식 VI의 화합물을 반응시킴으로써 수행된다.

또한, 화학식 VI의 화합물의 라세미 혼합물이 사용되고 광학적으로 순수한 형태로 화학식 I의 최종 화합물이 요구되는 경우에는 통상적인 수단에 따라 화학식 VII의 중간체 화합물 또는 별법으로 최종 화학식 I의 화합물을 광학적으로 분리할 필요가 있을 것이다. 예를 들어, 라세미체 분리를 위한 통상적인 기술로는 예를 들어, 부분입체이성질체 염 유도체의 분별 결정화 또는 정제용 키랄 HPLC가 포함된다.

최종적으로, 본 발명의 방법의 단계 d)에 따르면, 화학식 VII의 화합물은 예를 들어 카르바메이트기의 선택적 가수분해를 가능하게 하는 통상적인 방법에 따라 피라졸 질소 원자가 탈보호된다.

예로서, 상기 반응은 적합한 용매, 예를 들어 N,N-디메틸포름아미드, 메탄올, 에탄올, 테트라히드로푸란, 물 및 이들의 혼합물 중에서 염기성 조건 하에, 예를 들어 나트륨, 칼륨 또는 리튬 히드록시드, 또는 3급 아민, 예를 들어 트리에틸아민의 존재 하에 수행될 수 있다. 상기 반응은 통상적으로 약 30 분 내지 약 96 시간 범위의 시간 동안 실온 내지 60 ℃ 범위의 온도에서 수행된다.

최종적으로, 화학식 I의 화합물의 제약상 허용되는 염, 또는 별법으로 그의 염으로부터 유리된 화합물이 통상적인 방법에 따라 얻어질 수 있다.

본 발명의 방법의 출발 물질은 공지되어 있거나 또는 공지된 방법에 따라 쉽게 제조될 수 있다.

예로서, Q가 에틸을 나타내는 화학식 II의 화합물의 제법이 상기 언급된 국제 특허 출원 WO 02/12242 (특히 제249면의 실시예 26 참조 (여기서 상기 화합물은 3-아미노-4,6-디히드로-피롤로[3,4-c]피라졸-1,5-디카르복실산 5-tert-부틸 에스테르 1-에틸 에스테르로 명명됨))에 개시되어 있다.

유사 방식으로, Q가 에틸이 아닌 저급 알킬기인 화학식 II의 화합물도 추가로 제조될 수 있다.

화학식 III 및 VI의 화합물, 예를 들어 Z 및 Z'가 할로겐 원자, 예를 들어 염소 원자를 나타내는 것들은 공지되어 있거나 또는 상응하는 공지된 카르복실산으로부터 통상적인 방법에 따라 쉽게 얻어질 수 있다.

또한, 상기 방법 (이의 임의의 변형법 포함)에 따라 제조된 화학식 I의 화합물이 이성질체 혼합물로 얻어지는 경우에 이를 화학식 I의 단일 이성질체로 통상적인 기술에 따라 분리하는 것도 본 발명의 범주 내에 있음은 당업자에게는 명백할 것이다.

약리학

화학식 I의 화합물은 단백질 키나제 억제제, 보다 구체적으로는 오로라 키나제 억제제로서 활성이므로 예를 들어 종양 세포의 비조절 증식을 제한하는 데 유용하다.

치료에 있어서 이들은 다양한 종양, 예를 들어 상기 기재된 것들의 치료 뿐만 아니라, 다른 세포 증식성 장애, 예를 들어 건선, 죽상경화증과 관련된 맥관성 평활근세포 증식, 및 수술후 협착 및 재협착의 치료에 사용될 수 있다.

선택된 화합물의 억제 활성 및 효능은 SPA 기술 (아머샴 파마시아 바이오테크사 (Amersham Pharmacia Biotech))의 이용을 기초로 하는 분석 방법을 통해 측정 한다. 상기 분석은 키나제에 의해 방사능 표지된 포스페이트 잔기를 바이오티닐화 기질로 이동시키는 것으로 구성된다. 생성된 33P-표지 바이오티닐화 생성물을 스트렙타비딘-코팅 SPA 비드 (바이오틴 용량 130 pmol/mg)에 결합시키고, 섬광 계수기로 방출광을 측정하였다.

오로라-2 활성의 억제 분석

키나제 반응: 최종 부피 30 ㎕의 완충액 (50 mM HEPES (pH 7.0), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0.2 mg/ml BSA, 3 μM 오르토바나데이트) 중 8 μM 바이오티닐화 펩티드 (LRRWSLG 4회 반복), 10 μM ATP (0.5 μCi P³³γ-ATP), 7.5 ng 오로라 2, 억제제를 96웰 U자형 바닥 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 실온에서 60 분간 인큐베이션한 후에 반응을 중지시키고, 비드 현탁액 100 ㎕를 첨가하여 바이오티닐화 펩티드를 포획하였다.

층화: 5 M CsCl₂ 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 4시간 동안 방치한 후에 탑-카운트 (Top-Count) 기기로 방사능을 계수하였다.

IC50 측정: 0.0015 내지 10 μM 범위의 여러 농도에서 억제제를 시험하였다. 하기 4 파라미터 로지스틱 방정식을 이용하여 그래프패드 프리즘 (GraphPad Prizm) 컴퓨터 프로그램으로 실험 데이터를 분석하였다.

y = 최소값 + (최대값 - 최소값) / (1 + 10^((logIC50-x) * 기울기))

식 중, x는 억제제 농도의 로그값이고, y는 반응값이다. y는 최소값에서 출발하여 S자 형태로 최대값으로 향한다.

Ki 계산:

실험 방법: 3.7 nM 효소, 히스톤 및 ATP (콜드 ATP/표지된 ATP의 일정 비율 1/3000)를 함유하는 완충액 (10 mM 트리스 (pH 7.5), 10 mM MgCl₂, BSA 0.2 mg/ml, 7.5 mM DTT) 중에서 반응을 수행하였다. EDTA로 반응을 중지시키고, 포스포멤브레인 (phosphomembrane) (밀리포어사 (Millipore)의 멀티스크린 (Multiscreen) 96웰 플레이트) 상에 기질을 포획시켰다. 철저하게 세척한 후, 상기 멀티스크린 플레이트를 탑 카운터 상에서 판독하였다. 각 ATP 및 히스톤 농도에 대한 대조군 (0 시간)을 측정하였다.

실험 설계: 4가지의 ATP, 기질 (히스톤) 및 억제제 농도에서 반응 속도를 측정하였다. 80-지점 농도 매트릭스를 각 ATP 및 기질 Km값 및 억제제 IC50값 (0.3, 1, 3, 9배의 Km 또는 IC50값)에 따라 설계하였다. 억제제의 부재 하에 여러 ATP 및 기질의 농도에서 수행되는 예비 시간 경과 실험은 Ki 결정 실험을 위한 반응의 선형 범위에서 단일 종점 시간 (10 분)의 선택을 가능하게 한다.

동력학적 파라미터 추정: 완전한 데이터 세트 (80 지점)를 사용하여 하기 수학식 1을 이용한 동시 비선형 최소제곱 회귀법 (억제제는 ATP에 대해 경쟁적임, 랜덤 메카니즘)으로 동력학적 파라미터를 추정하였다.

식 중, A = [ATP], B = [기질], I = [억제제], Vm = 최대 속도이고, Ka, Kb, Ki는 ATP, 기질 및 억제제 각각의 해리 상수이다. α 및 β는 각각 기질과 ATP 결합간의 협력 인자 및 기질과 억제제 결합간의 협력 인자이다.

본 발명의 화합물을 시험관 내에서 더 시험하여 세포 배양액에서의 항증식성 효과 및 세포 주기에서의 억제 효과를 평가하였다.

시험관내 세포 증식 분석

10％ FCS (이탈리아에 소재한 유로클론사 (EuroClone)), 2 mM L-글루타민 및 1％ 페니실린/스트렙토마이신이 보강된 F12 배지 (기브코사 (Gibco))를 사용하여 인간 결장암 세포주 HCT-116을 24웰 플레이트 (코스타사 (Costar)))에 5000 세포/cm²로 시딩하고, 37 ℃, 5％ CO₂ 및 96％ 상대 습도에서 유지하였다. 다음날, 플레이트 2개를 DMSO 중 화합물 (10 mM 스톡으로부터 출발함)의 적절한 희석액 5 ㎕로 처리하였다. 각 플레이트에는 2개의 미처리 대조 웰이 포함되었다. 처리 72 시간 후, 배지를 회수하고, 0.5 ml의 0.05％ (w/v) 트립신, 0.02％ (w/v) EDTA (기브코사)를 사용하여 각 웰로부터 세포를 분리시켰다. 샘플을 이소톤 (Isoton) (콜터사 (Coulter)) 9.5 ml로 희석시키고, 멀티사이저 (Multisizer) 3 셀 카운터 (벡맨 콜터사 (Beckman Coulter))를 사용하여 계수하였다. 대조 웰의 ％로 데이터를 평가하였다: CTR의 ％ = (처리된 웰 - 블랭크) / (대조 웰 - 블랭크).

마이크로소프트 엑셀 (Microsoft Excel)의 S자형 곡선 피팅을 이용한 LSW/데이터 분석에 의해 IC₅₀값을 계산하였다.

시험관내 세포 주기 분석

인간 결장암 세포주 HCT-116을 24웰 플레이트 (코스타사)에 5000 세포/cm²로 시딩하고, 상기 언급된 바와 같이 배양하였다. 기하급수적 성장 단계의 세포를 24 시간 동안 여러 농도의 화합물로 처리하였다. 또한, 분리된 아폽토시스 세포 또는 분열 세포의 손실을 방지하기 위해 배지 상청액을 수집하였다. 이후, 세포를 PBS를 사용하여 세척하고, 0.05％ (w/v) 트립신, 0.02％ (w/v) EDTA (기브코사)로 분리시켰다. 배지를 사용하여 트립신 활성을 중지시켰다. 접착성 및 비접착성 세포 분획물을 풀링하고, 10 분간 2000 rpm에서 원심분리하였다. 세포를 PBS에 재현탁시키고, 멀티사이저 3 세포 카운터 (벡맨 콜터사)를 사용하여 계수하였다. 고정을 위해, 에탄올 (70％, v/v)을 첨가하고, 세포를 밤새 -20 ℃에서 유지시켰다.

백만개의 고정 세포를 5 분간 2000 rpm에서 원심분리하고, PBS로 세척한 후에 암실에서 1 시간 동안 실온에서 200 ml: 프로피듐 요오다이드 (시그마사) 25 mg/ml 및 RNAse A (시그마사) 15 ㎍/ml, 나트륨 시트레이트 (0.1％ w/v, pH 7.5) 중 0.001％ (v/v) 노니데트 (Nonidet) P40 (시그마사)을 첨가하여 염색하였다. 셀 퀘스트 (Cell Quest) 3.0 소프트웨어 (벡톤 디킨슨사 (Beckton Dickinson))를 이용하여 488 nm 여기에서 유동 세포분석 (벡톤 디킨슨사의 팩스칼리버 (FACSCalibur))에 의해 샘플을 분석하였다. 통상적으로 10000가지 사건 (event) (이중 식별 모듈 (doubles discriminate module, DDM)을 활성화시키고, 단일 세포만을 게이팅함)을 수집하고, 셀퀘스트 (CellQuest) (베리티 소프트웨어사 (Verity Software))를 이용하여 세포 주기 프로파일을 기록하였다. 모디핏 (Modfit) 3.1 소프트웨어 (베리티 소프트웨어사)의 변형 모델을 이용하여 집단의 세포 주기 분포를 계산하고, ％ G0/G1, S, G2/M 및 다배수 상태 (polyploidy)로 나타냈다.

상기 분석으로부터, 본 발명의 화학식 I의 화합물은 현저한 단백질 키나제 억제 활성, 예를 들어 오로라-2 억제 활성을 갖는 것으로 나타났다. 예로서, 4종의 본 발명의 대표적인 화합물 (오로라-2 키나제 억제제 (IC₅₀ nM)로서 시험하고, 세포 항증식성 효과 (IC₅₀ nM)에 대해 시험하고, 세포 주기를 차단하고 다배수 상태를 유도하는 능력 (200 nM에서 G2/M + 다배수 상태의 ％)에 대해 시험하였음)의 실험 데이터를 보고하는 하기 표 I을 참조한다.

흥미롭게도, 상기 화합물을 본원에서 기준 화합물로 정의된, 구조적으로 매우 유사한 종래 기술의 화합물 (상기 언급된 WO 02/12242에 구체적으로 개시되어 있음 (상기 문헌 제160면 제5행 내지 제7행 참조))과 비교하여 시험하였다 (기준 화합물은 상기 문헌에서 N-{5-페닐아세틸-4,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-(4-메틸피페라지노)벤즈아미드로 명명되어 있음).

<화학식 I>

기준 화합물 (R = R ₁ = R ₂ = H; X = NMe)

N-{5-페닐아세틸-4,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-(4-메틸피페라지노)벤즈아미드;

화합물 1 (R = R ₂ = H; R ₁ = OMe; X = NMe)

N-{5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-(4-메틸피페라진-1-일)벤즈아미드;

화합물 11 (R = R ₂ = H; R ₁ = Me; X = NMe)

N-{5-[(2R)-2-메틸-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-(4-메틸피페라진-1-일)벤즈아미드;

화합물 6 (R = R ₂ = H; R ₁ = OMe; X = CH ₂ )

N-{5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-피페리딘-1-일벤즈아미드;

화합물 5 (R = Me; R ₁ = OMe; R ₂ = H; X = NMe)

4-(3,4-디메틸피페라진-1-일)-N-{5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}벤즈아미드.

놀랍게도, 본 발명의 화합물의 오로라-2 억제 활성은 기준 화합물보다 일정하고 현저하게 월등한 것으로 나타났다.

또한, 상기 화합물은 세포 주기를 차단하고 다배수 상태를 유도하는 능력과 함께 세포 항증식성 효과를 갖는 것으로 나타났는데, 이 능력은 동일 조건 하에 시험한 기준 화합물보다 상당히 월등하였다.

상기로부터, 본 발명의 신규한 화학식 I의 화합물은 전체적으로, 가장 유사한 종래 기술의 화합물 (WO 02/12242)보다 예상외로 월등한 생물학적 프로파일을 갖는 것으로 나타나며, 따라서 변화된 오로라-2 키나제 활성과 관련된 증식성 장애에 대한 치료에 특히 유리하다.

본 발명의 화합물은 단일 작용제로, 또는 별법으로 세포증식억제제 또는 세포독성제, 항생제형 작용제, 알킬화제, 항대사제, 호르몬 작용제, 면역제, 인터페론형 작용제, 시클로옥시게나제 억제제 (예를 들어, COX-2 억제제), 매트릭스메탈로프로테아제 억제제, 텔로머라제 억제제, 티로신 키나제 억제제, 항-성장 인자 수용체 작용제, 항HER 작용제, 항EGFR 작용제, 항혈관형성제 (예를 들어, 혈관형성 억제제), 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, ras-raf 신호 전달 경로 억제제, 세포 주기 억제제, 다른 cdk 억제제, 튜불린 결합제, 토포이소머라제 I 억제제, 토포이소머라제 II 억제제 등을 병용하는 공지된 항암 치료법, 예를 들어 방사선 요법 또는 화학치료 요법과 조합하여 투여될 수 있다.

고정 투여량으로서 제제화되는 경우, 이러한 조합 생성물에는 하기 기재된 투여량 범위 내의 본 발명의 화합물 및 승인된 투여량 범위 내의 다른 제약상 활성인 작용제가 사용된다.

배합 제제가 부적절한 경우, 화학식 I의 화합물은 공지된 항암제와 순차적으로 사용될 수 있다.

포유동물, 예를 들어 인간에게 투여하기에 적합한 본 발명의 화학식 I의 화합물은 통상적인 경로로 투여될 수 있으며, 투여량 수준은 환자의 연령, 체중, 증상 및 투여 경로에 따른다.

예를 들어, 화학식 I의 화합물의 경구 투여에 적합한 투여량은 1 일당 1 내지 5회, 1회 투여당 약 10 내지 약 500 mg의 범위일 수 있다. 본 발명의 화합물은 다양한 투여 형태, 예를 들어 정제, 캡슐제, 당의정, 필름코팅정, 액상 액제 또는 현탁제 형태로 경구로; 좌약제 형태로 직장내로; 비경구로, 예를 들어 근육내로, 또는 정맥내 및(또는) 경막내 및(또는) 수강내 주사 또는 주입을 통해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 담체 또는 희석제일 수 있는 제약상 허용되는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물을 포함한다.

본 발명의 화합물을 함유하는 제약 조성물은 일반적으로 하기 통상적인 방법에 따라 제조되며, 적합한 제약 형태로 투여된다.

예를 들어, 고상 경구 형태는 활성 화합물과 함께 희석제, 예를 들어 락토스, 덱스트로스 사카로스, 수크로스, 셀룰로스, 옥수수 전분 또는 감자 전분; 윤활제, 예를 들어, 실리카, 탈크, 스레아르산, 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트 및(또는) 폴리에틸렌 글리콜; 결합제, 예를 들어, 전분, 아라비아검, 젤라틴 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스 또는 폴리비닐 피롤리돈; 붕해제, 예를 들어, 전분, 알긴산, 알기네이트 또는 나트륨 전분 글리콜레이트; 비등성 혼합물; 염료; 감미제; 습윤제, 예를 들어 레시틴, 폴리소르베이트, 라우릴술페이트; 및 일반적으로 제약 제제에 사용되는 비독성이면서 약학적으로 불활성인 물질을 함유할 수 있다. 이들 제약 제제는 공지된 방법, 예를 들어 혼합, 과립화, 정제화, 당의화 또는 필름 코팅 방법으로 제조될 수 있다.

경구 투여용 액상 분산액은 예를 들어 시럽제, 에멀션제 및 현탁제일 수 있다.

예로서, 시럽제는 담체로서 사카로스, 또는 사카로스와 글리세린 및(또는) 만니톨 및 소르비톨을 함유할 수 있다.

현탁제 및 에멀션제는 담체의 예로서 천연 고무, 한천, 나트륨 알기네이트, 펙틴, 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스 또는 폴리비닐 알콜을 함유할 수 있다. 근육내 주사용 현탁제 또는 액제는 활성 화합물과 함께 제약상 허용되는 담체, 예를 들어 멸균수, 올리브 오일, 에틸 올레에이트, 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜 및 필요한 경우 적합한 양의 리도카인 히드로클로라이드를 함유할 수 있다. 정맥내 주사 또는 주입용 액제는 담체로서 멸균수를 함유할 수 있거나, 또는 바람직하게는 이들은 멸균, 수성, 등장성, 염수 용액의 형태로 존재할 수 있거나, 또는 이들은 담체로서 프로필렌 글리콜을 함유할 수 있다.

좌약제는 활성 화합물과 함께 제약상 허용되는 담체, 예를 들어 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 계면활성제 또는 레시틴을 함유할 수 있다.

보다 잘 예시할 목적으로 하기 실시예를 지금부터 제시하나, 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.

일반적인 방법

실리카 겔 (머크 (Merck) 등급 9385, 60 Å) 상에서 플래시 크로마토그래피를 수행하였다. 워터스 (Waters) X 테라 (Terra) RP 18 (4.6 x 50 mm, 3.5 ㎛) 컬럼 상에서 996 워터스 PDA 검출기 및 마이크로매스 (Micromass) 변형 ZQ 단일 사극자 질량분석기 (전기분무 (ESI) 이온 공급원 장착)가 장착된 워터스 2790 HPLC 시스템을 사용하여 HPLC/MS를 수행하였다. 이동상 A는 암모늄 아세테이트 5 mM 완충액 (아세트산/아세토니트릴 95:5 (pH 5.5))이고, 이동상 B는 H₂O/아세토니트릴 (5:95)이었다. 8 분간 10 내지 90％ B의 구배 (2 분간 90％ B 유지). 220 nm 및 254 nm에서 UV 검출. 유속 1 ml/분. 주입 용량 10 ㎕. 전체 스캔 (질량 범위 100 내지 800 amu). 모세관 전압은 2.5 KV이고, 공급원 온도는 120 ℃이고, 콘은 10 V였다. 체류 시간 (HPLC r.t.)은 220 nm 또는 254 nm에서 분 단위로 주어진다. 질량은 m/z 비율로 주어진다. 5 mm 이중 공명 프로브가 장착된, 400.45 MHz에서 작동하는 머큐리 (Mercury) VX 400 (1H {15N-31P} ID_PFG 배리안 (Varian)) 상에서 1H-NMR 분광법을 수행하였다.

실시예 1

5-tert-부틸 1-에틸 3-아미노-4,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1,5-디카르복실레이트의 제조

0 내지 5 ℃에서 테트라히드로푸란 (THF, 250 ml) 중 에틸 클로로카르보네이트 (8.9 ml, 93 mmol)의 용액을 THF (500 ml) 중 tert-부틸 3-아미노-4,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-5(1H)-카르복실레이트 (20 g, 89 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (DIEA, 92 ml, 528 mmol)의 혼합물에 서서히 첨가하였다. 동일 온도에서 2 시간 동안 계속 반응시킨 후에 실온에 도달시키고 밤새 교반하였다. 얻어진 혼합물을 진공 하에 증발 건조시키고, 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트 (AcOEt) 및 물로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 증발 건조시켰다. 혼합물을 플래시 크로마토그래피 (용출액: 에틸 아세테이트/시클로헥산 4/6 내지 7/3)로 정제하여 표제 화합물 19 g을 백색 고체로서 수득하였다. [M+H]⁺ 297

실시예 2

5-tert-부틸 1-에틸 3-{[4-(4-메틸피페라진-1-일)벤조일]아미노}-4,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1,5-디카르복실레이트의 제조

옥살릴 클로라이드 (23.2 ml, 265 mmol)를 디클로로메탄 (DCM, 320 ml) 및 디메틸포름아미드 (DMF, 0.52 ml) 중 4-(4-메틸-1-피페라지닐)-벤조산 (11.7 g, 53 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 6.5 시간 동안 혼합물을 환류시킨 후, 휘발성 물질을 감압 하에 조심스럽게 제거하였다 (잔류물은 톨루엔으로 3회 추출함).

생성된 4-메틸피페라지노-벤조일 클로라이드 디-히드로클로라이드를 실온에서 교반 하에 무수 THF (620 ml) 및 DIEA (54.4 ml, 0.32 mol) 중 5-tert-부틸 1-에틸 3-아미노-4,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1,5-디카르복실레이트 (13.1 g, 44.3 mmol)의 용액에 나누어 첨가하였다. 생성된 현탁액을 16 시간 동안 실온에서 교반하고, 1 시간 동안 40 ℃에서 교반하였다.

감압 하에 용매를 제거한 후, 잔류물을 AcOEt (600 ml)으로 추출하고, 유기층을 탄산나트륨 수용액 (200 ml) 및 염수 (200 ml)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시켰다.

용매를 증발시키고, 잔류물을 디에틸 에테르 (Et₂O, 135 ml) 및 AcOEt (15 ml)의 혼합물로 연화 처리하고, 여과하고, 40 ℃에서 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 20 g을 백색 분말로서 수득하였다. [M+H]⁺ 499.

유사 방식으로 5-tert-부틸 1-에틸 3-아미노-4,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1,5-디카르복실레이트를 적절한 아실 클로라이드 유도체와 반응시켜 하기 화합 물들을 제조하였다:

5-tert-부틸 1-에틸 3-{[4-(4-에틸피페라진-1-일)벤조일]아미노)-4,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1,5-디카르복실레이트; [M+H]⁺ 513.

5-tert-부틸 1-에틸 3-{[4-(4-이소프로필피페라진-1-일)벤조일]아미노}-4,6-디히드로피롤로[3,4-(5)c]피라졸-1,5-디카르복실레이트; [M+H]⁺ 527.

5-tert-부틸 1-에틸 3-{[4-(4-시클로프로필피페라진-1-일)벤조일]아미노}-4,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1,5-디카르복실레이트; [M+H]⁺ 525.

5-tert-부틸 1-에틸 3-{[4-(3,4-디메틸피페라진-1-일)벤조일]아미노}-4,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1,5-디카르복실레이트; [M+H]⁺ 513.

5-tert-부틸 1-에틸 3-[(4-피페리딘-1-일벤조일)아미노]-4,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1,5-디카르복실레이트; [M+H]⁺ 484.

5-tert-부틸 1-에틸 3-{[4-(4-플루오로피페리딘-1-일)벤조일]아미노}-4,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1,5-디카르복실레이트; [M+H]⁺ 502.

5-tert-부틸 1-에틸 3-[(4-모르폴린-4-일벤조일)아미노]-4,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1,5-디카르복실레이트; [M+H]⁺ 486.

5-tert-부틸 1-에틸 3-{[4-(4-tert-부틸피페라진-1-일)벤조일]아미노}-4,6-디히드로피롤로[3,4-(5)c]피라졸-1,5-디카르복실레이트; [M+H]⁺ 541.

실시예 3

에틸 3-{[4-(4-메틸피페라진-1-일)벤조일]아미노}-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트 트리히드로클로라이드의 제조

디옥산 (122 ml, 488 mmol) 중 염산의 4 N 용액을 무수 DCM (240 ml) 중 5-tert-부틸 1-에틸 3-{[4-(4-메틸피페라진-1-일)벤조일]아미노}-4,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1,5-디카르복실레이트 (실시예 2에서 제조됨) (19.5 g, 39.2 mmol)의 교반된 용액에 적가하였고, 거의 동시에 백색 고체의 침전이 발생하였다. 생성된 혼합물을 24 시간 동안 실온에서 교반하고, Et₂O (100 ml)로 희석한 후에 고체를 여과하고, Et₂O로 철저하게 세척하고, 50 ℃에서 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 20.1 g을 수득하였고, 이것을 더 정제하지 않고서 다음 단계에서 사용하였다. [M+H]⁺ 399.

상기 기재된 바와 같이 적합한 중간체로부터 출발하여 하기 화합물들을 유사하게 제조하였다:

에틸 3-{[4-(4-에틸피페라진-1-일)벤조일]아미노}-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트 트리히드로클로라이드; [M+H]⁺ 413.

에틸 3-{[4-(4-이소프로필피페라진-1-일)벤조일]아미노}-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트 트리히드로클로라이드; [M+H]⁺ 427.

에틸 3-{[4-(4-시클로프로필피페라진-1-일)벤조일]아미노}-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트 트리히드로클로라이드; [M+H]⁺ 425.

에틸 3-{[4-(3,4-디메틸피페라진-1-일)벤조일]아미노}-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트 트리히드로클로라이드; [M+H]⁺ 413.

에틸 3-[(4-피페리딘-1-일벤조일)아미노]-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트; [M+H]⁺ 384.

에틸 3-{[4-(4-플루오로피페리딘-1-일)벤조일]아미노}-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트트리히드로클로라이드; [M+H]⁺ 402.

에틸 3-{[4-(4-모르폴린-4-일)벤조일]아미노}-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트 트리히드로클로라이드; [M+H]⁺ 386.

에틸 3-{[4-(4-tert-부틸피페라진-1-일)벤조일]아미노}-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트 트리히드로클로라이드; [M+H]⁺ 441.

실시예 4

에틸 5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-3-{[4-(4-메틸피페라진-1-일)벤조일]아미노}-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트의 제조

옥살릴 클로라이드 (10.12 ml, 115 mmol)를 DCM (90 ml) 및 DMF (0.50 ml) 중 R-(-)-α-메톡시페닐아세트산 (1.91 g, 11.5 mmol)의 용액에 첨가하였다. 16 시간 동안 실온에서 혼합물을 교반한 후, 휘발성 물질을 감압 하에 조심스럽게 제거하였다.

DCM (20 ml) 중 생성된 R-(-)-α-메톡시페닐아세틸 클로라이드의 용액을 DCM (400 ml) 및 DIEA (11.8 ml, 69 mmol) 중 에틸 3-{[4-(4-메틸피페라진-1-일)벤조일]아미노}-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트 트리히드로클로라이드 (4.5 g, 8.9 mmol)의 용액에 실온에서 교반 하에 적가하였다. 생성된 용액을 실온에서 20 시간 동안 교반하였다.

이후, 반응 혼합물을 탄산나트륨 수용액 (200 ml) 및 염수 (200 ml)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 Et₂O (100 ml)와 AcOEt (10 ml)의 혼합물로 연화 처리하고, 여과하고, 40 ℃에서 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 3.94 g을 백색 분말로서 수득하였고, 이것을 더 정제하지 않고서 다음 단계에서 사용하였다. [M+H]⁺ 547;

상기 기재된 바와 같이 적합한 아실 클로라이드 유도체로부터 출발하여 하기 화합물들을 유사하게 제조하였다:

에틸 5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-3-{[4-(4-에틸피페라진-1-일)벤조일]아미노}-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트; [M+H]⁺ 561.

에틸 5-{(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-3-{[4-(4-이소프로필피페라진-1-일) 벤조일]아미노}-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트; [M+H]⁺ 575.

에틸 5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-3-{[4-(4-시클로프로필피페라진-1-일)벤조일]아미노}-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트; [M+H]⁺ 573.

에틸 3-{[4-(3,4-디메틸피페라진-1-일)벤조일]아미노}-5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트; [M+H]⁺ 561.

에틸 5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-3-[(4-피페리딘-1-일벤조일)아미노]-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트; [M+H]⁺ 532.

에틸 3-{[4-(4-플루오로피페리딘-1-일)벤조일]아미노}-5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트; [M+H]⁺ 550.

에틸 5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-3-[(4-모르폴린-4-일벤조일)아미노]-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트; [M+H]⁺ 534.

에틸 3-{[4-(4-tert-부틸피페라진-1-일)벤조일]아미노}-5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트; [M+H]⁺ 589.

에틸 5-[(2R)-2-메틸-2-페닐에타노일]-3-{[4-(4-에틸피페라진-1-일)벤조일]아미노}-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트; [M+H]⁺ 545.

에틸 5-[(2R)-2-메틸-2-페닐에타노일]-3-{[4-(4-이소프로필피페라진-1-일)벤조일]아미노}-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트; [M+H]⁺ 559.

에틸 5-[(2R)-2-메틸-2-페닐에타노일]-3-{[4-(4-시클로프로필피페라진-1-일)벤조일]아미노}-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트; [M+H]⁺ 557.

에틸 3-{[4-(3,4-디메틸피페라진-1-일)벤조일]아미노}-5-[(2R)-2-메틸-2-페닐에타노일]-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트; [M+H]⁺ 545.

에틸 5-[(2R)-2-메틸-2-페닐에타노일]-3-[(4-피페리딘-1-일벤조일)아미노]-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트; [M+H]⁺ 516.

에틸 3-{[4-(4-플루오로피페리딘-1-일)벤조일]아미노}-5-[(2R)-2-메틸-2-페닐에타노일]-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트; [M+H]⁺ 534.

에틸 5-[(2R)-2-메틸-2-페닐에타노일]-3-[(4-모르폴린-4-일벤조일)아미노]-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트; [M+H]⁺ 518.

에틸 3-{[4-(4-tert-부틸피페라진-1-일)벤조일]아미노}-5-[(2R)-2-메틸-2-페 닐에타노일]-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트; [M+H]⁺ 573.

에틸 5-[(2R)-2-히드록시-2-페닐에타노일]-3-{[4-(4-메틸피페라진-1-일)벤조일]아미노}-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트; [M+H]⁺ 533.

실시예 5

(1) N-{5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-(4-메틸피페라진-1-일)벤즈아미드의 제조

메탄올 (MeOH, 130 ml) 및 트리에틸아민 (Et₃N, 13 ml) 중 에틸 5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-3-{[4-(4-메틸피페라진-1-일)벤조일]아미노}-5,6-디히드로피롤로[3,4-c]피라졸-1(4H)-카르복실레이트 (3.94 g, 7.2 mmol)의 용액을 16 시간 동안 실온에서 교반하였다 (약간의 침전이 발생하였음). 고체를 분리하고 Et₂O로 세척하여 표제 화합물 1.6 g을 수득하였다. 용액을 수 밀리미터 이하로 증발시키고, 고체 생성물의 제2 분획물을 분리하였다 (1.62 g). 두 분획물을 합하고 LC-MS로 분석하였다 (순도 약 90％, 254 및 220 nM). 크로마토그래피 정제 (소형 실리카 겔 컬럼, DCM/MeOH 45:5) 후, 표제 화합물 2.83 g (83％)을 백색 고체로서 수득하였다. m.p 289 ℃; [M+H]⁺ 475;

유사한 방식으로 실시예 4의 화합물의 염기성 가수분해를 통해 하기 화합물들을 제조하였다:

(2) N-{5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-(4-에틸피페라진-1-일)벤즈아미드; [M+H]⁺ 489;

(3) N-{5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-(4-이소프로필피페라진-1-일)벤즈아미드; [M+H]⁺ 503;

(4) N-{5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-(4-시클로프로필피페라진-1-일)벤즈아미드; [M+H]⁺ 501;

(5) 4-(3,4-디메틸피페라진-1-일)-N-{5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}벤즈아미드; [M+H]⁺ 489;

(6) N-{5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-피페리딘-1-일벤즈아미드; [M+H]⁺ 460;

(7) 4-(4-플루오로피페리딘-1-일)-N-{5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]- 1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}벤즈아미드; [M+H]⁺ 478;

(8) N-{5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-모르폴린-4-일벤즈아미드; [M+H]⁺ 462;

(9) 4-(4-tert-부틸피페라진-1-일)-N-{5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}벤즈아미드; [M+H]⁺ 517.

(10) N-{5-[(2R)-2-히드록시-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-(4-메틸피페라진-1-일)벤즈아미드; [M+H]⁺ 461;

(11) N-{5-[(2R)-2-메틸-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-(4-메틸피페라진-1-일)벤즈아미드; [M+H]⁺ 459;

(12) N-{5-[(2R)-2-메틸-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-(4-에틸피페라진-1-일)벤즈아미드; [M+H]⁺ 473;

(13) N-{5-[(2R)-2-메틸-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-(4-이소프로필피페라진-1-일)벤즈아미드; [M+H]⁺ 487;

(14) N-{5-[(2R)-2-메틸-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-(4-시클로프로필피페라진-1-일)벤즈아미드; [M+H]⁺ 485;

(15) 4-(3,4-디메틸피페라진-1-일)-N-{5-[(2R)-2-페닐프로파노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}벤즈아미드; [M+H]⁺ 473;

(16) N-{5-[(2R)-2-페닐프로파노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-피페리딘-1-일벤즈아미드; [M+H]⁺ 444;

(17) 4-(4-플루오로피페리딘-1-일)-N-{5-[(2R)-2-메틸-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}벤즈아미드; [M+H]⁺ 462;

(18) N-{5-[(2R)-2-메틸-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-모르폴린-4-일벤즈아미드; [M+H]⁺ 446;

(19) 4-(4-tert-부틸피페라진-1-일)-N-[5-[(2R)-2-페닐프로파노일]- 1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일벤즈아미드; [M+H]⁺ 501.

Claims

하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 유효량을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 변화된 단백질 키나제 활성에 의해 유발되고(거나) 그와 관련된 세포 증식성 장애의 치료 방법.

<화학식 I>

식 중,

R은 수소 또는 메틸이고,

R₁은 히드록시 또는 직쇄형 또는 분지형 C₁-C₃ 알킬 또는 알콕시기이고,

R₂는 수소 또는 할로겐 원자이고,

X는 메틸렌 (-CH₂-) 또는 플루오로메틸렌 (-CHF-)으로부터 선택되는 2가 기이거나, 또는 X는 산소 (-O-) 또는 질소 (-NR'-) (여기서, R'는 수소 원자, 직쇄형 또는 분지형 C₁-C₄ 알킬기 또는 C₃-C₆ 시클로알킬기임)로부터 선택되는 헤테로원자 또는 헤테로원자-함유 기이다.
제1항에 있어서, 변화된 오로라 키나제 활성에 의해 유발되고(거나) 그와 관련된 세포 증식성 장애의 치료 방법.
제2항에 있어서, 오로라 키나제가 오로라 2인 방법.
제1항에 있어서, 세포 증식성 장애가 암, 알츠하이머병, 바이러스 감염, 자가-면역 질환 및 신경퇴행성 장애로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제4항에 있어서, 암이 암종, 편평 세포 암종, 골수 또는 림프계의 조혈성 종양, 중간엽 기원의 종양, 중추 및 말초 신경계의 종양, 흑색종, 정상피종, 기형암종, 골육종, 색소성 건피증, 각질가시세포종, 갑상선소포암 및 카포시 육종으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 세포 증식성 장애가 양성 전립선 비대증, 가족샘종폴립증, 신경섬유종증, 건선, 죽상경화증과 관련된 맥관성 평활근세포 증식, 폐섬유증, 관절염, 사구체신염, 및 수술후 협착증 및 재협착증으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 1종 이상의 세포증식억제제 또는 세포독성제를 병용하는 방사선 요법 또는 화학치료 요법을 이를 필요로 하는 포유동물에게 적용하는 것을 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 이를 필요로 하는 포유동물이 인간인 방법.
상기 키나제를 제1항에 정의된 화합물의 유효량과 접촉시키는 것을 포함하는, 오로라 2 키나제 활성의 억제 방법.
하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.

<화학식 I>

식 중,

R은 수소 또는 메틸이고,

R₁은 히드록시 또는 직쇄형 또는 분지형 C₁-C₃ 알킬 또는 알콕시기이고,

R₂는 수소 또는 할로겐 원자이고,

X는 메틸렌 (-CH₂-) 또는 플루오로메틸렌 (-CHF-)으로부터 선택되는 2가 기이거나, 또는 X는 산소 (-O-) 또는 질소 (-NR'-) (여기서, R'는 수소 원자, 직쇄형 또는 분지형 C₁-C₄ 알킬기 또는 C₃-C₆ 시클로알킬기임)로부터 선택되는 헤테로원자 또는 헤테로원자-함유 기이다.
제10항에 있어서, R이 수소 또는 메틸이고, R₁이 히드록시, 메틸 또는 메톡시로부터 선택되고, R₂가 수소 또는 불소 원자이고, X가 메틸렌, 플루오로메틸렌,-O- 또는 -NR' (여기서, R'는 제10항에 정의된 바와 같음)로부터 선택되는 화학식 I의 화합물.
(1) N-{5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-(4-메틸피페라진-1-일)벤즈아미드;

(2) N-{5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-(4-에틸피페라진-1-일)벤즈아미드;

(3) N-{5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-(4-이소프로필피페라진-1-일)벤즈아미드;

(4) N-{5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로 [3,4-c]피라졸-3-일}-4-(4-시클로프로필피페라진-1-일)벤즈아미드;

(5) 4-(3,4-디메틸피페라진-1-일)-N-{5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}벤즈아미드;

(6) N-{5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-피페리딘-1-일벤즈아미드;

(7) 4-(4-플루오로피페리딘-1-일)-N-{5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}벤즈아미드;

(8) N-{5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-모르폴린-4-일벤즈아미드;

(9) 4-(4-tert-부틸피페라진-1-일)-N-{5-[(2R)-2-메톡시-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}벤즈아미드;

(10) N-{5-[(2R)-2-히드록시-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-(4-메틸피페라진-1-일)벤즈아미드;

(11) N-{5-[(2R)-2-메틸-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-(4-메틸피페라진-1-일)벤즈아미드;

(12) N-{5-[(2R)-2-메틸-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-(4-에틸피페라진-1-일)벤즈아미드;

(13) N-{5-[(2R)-2-메틸-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-(4-이소프로필피페라진-1-일)벤즈아미드;

(14) N-{5-[(2R)-2-메틸-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4- c]피라졸-3-일}-4-(4-시클로프로필피페라진-1-일)벤즈아미드;

(15) 4-(3,4-디메틸피페라진-1-일)-N-{5-[(2R)-2-페닐프로파노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}벤즈아미드;

(16) N-{5-[(2R)-2-페닐프로파노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-피페리딘-1-일벤즈아미드;

(17) 4-(4-플루오로피페리딘-1-일)-N-{5-[(2R)-2-메틸-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}벤즈아미드;

(18) N-{5-[(2R)-2-메틸-2-페닐에타노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일}-4-모르폴린-4-일벤즈아미드;

(19) 4-(4-tert-부틸피페라진-1-일)-N-[5-[(2R)-2-페닐프로파노일]-1,4,5,6-테트라히드로피롤로[3,4-c]피라졸-3-일벤즈아미드

로 구성된 군으로부터 선택되는 제1항에 따른 화학식 I의 화합물, 및 임의로 그의 제약상 허용되는 염 형태.
a) 하기 화학식 II의 화합물을 하기 화학식 III의 화합물과 반응시켜 하기 화학식 IV의 화합물을 얻는 단계,

b) 화학식 IV의 화합물을 산성 조건 하에 반응시켜 하기 화학식 V의 화합물을 얻는 단계,

c) 화학식 V의 화합물을 하기 화학식 VI의 화합물과 반응시켜 하기 화학식 VII의 화합물을 얻는 단계, 및

d) 화학식 VII의 화합물을 염기성 조건 하에 반응시켜 상응하는 화학식 I의 화합물을 수득하고, 원하는 경우에 이것을 그의 제약상 허용되는 염으로 변환시키는 단계

를 포함하는, 제10항에 따른 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염의 제조 방법.

<화학식 II>

<화학식 III>

<화학식 IV>

<화학식 V>

<화학식 VI>

<화학식 VII>

식 중,

R 및 X는 제10항에 정의된 바와 같고, Q는 저급 알킬기이고, t-Bu는 tert-부틸을 나타내고, Z는 히드록시 또는 적합한 이탈기이고,

R₁ 및 R₂는 제10항에 정의된 바와 같고, Z'는 히드록시 또는 적합한 이탈기를 나타낸다.
제13항에 있어서, 화학식 II의 화합물의 Q가 직쇄형 또는 분지형 C₁-C₄ 알킬기를 나타내는 방법.
제14항에 있어서, Q가 메틸 또는 에틸인 방법.
제13항에 있어서, 화학식 III 및 VI의 화합물의 Z 및 Z'가 각각 독립적으로 히드록시 또는 할로겐 원자인 방법.
제16항에 있어서, 할로겐 원자가 염소인 방법.
제13항에 있어서, 단계 b)가 염산, 트리플루오로아세트산 또는 메탄술폰산의 존재 하의 산성 조건 하에 수행되는 방법.
제13항에 있어서, 단계 d)가 나트륨, 칼륨 또는 리튬 히드록시드, 또는 트리에틸아민과 같은 3급 아민의 존재 하의 염기성 조건 하에 수행되는 방법.
제10항에 정의된 화학식 I의 화합물 또는 제약상 허용되는 염의 치료 유효량, 및 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 담체 및(또는) 희석제를 포함하는 제약 조성물.
제20항에 있어서, 1종 이상의 화학치료제를 더 포함하는 제약 조성물.
항암 치료에서의 동시, 개별 또는 순차 사용을 위한 배합 제제로서, 제10항에 정의된 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 제20항에 정의된 그의 제약 조성물, 및 1종 이상의 화학치료제를 포함하는 제품 또는 키트.
의약으로 사용하기 위한 제10항에 정의된 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
항종양 활성을 갖는 의약의 제조에 있어서 제10항에 정의된 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도.