BRPI0411868B1

BRPI0411868B1 - derivados de pirrol[3,4-c]pirazol ativos como inibidores de cinase

Info

Publication number: BRPI0411868B1
Application number: BRPI0411868-5A
Authority: BR
Inventors: Forte Barbara; Fancelli Daniele; Moll Jurgen; Varasi Mario; Vianello Paola
Original assignee: Nerviano Medical Science S R L; Pfizer Italia Srl; Pharmacia Italia Spa
Priority date: 2003-07-09
Filing date: 2004-07-08
Publication date: 2019-11-12
Also published as: MY139072A; KR101075711B1; DE602004029045D1; KR20060033001A; ATE480540T1; CA2531759C; RS20060004A; US7582628B2; JP4728232B2; IL172923A0; MEP51908A; GT200400133AA; ECSP056246A; CR8171A; ZA200600095B; AP2214A; AP2006003480A0; US7141568B2; PA8606201A1; PE20050325A1

Abstract

"derivados de pirrol[3,4-c]pirazol ativos como inibidores de cinase". a presente invenção refere-se a derivados de pirrol[3,4-c]pirazol de fórmula i e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, como definido no relatório descritivo, processo para sua preparação e composições farmacêuticas compreendendo-os; os compostos da invenção podem ser úteis em terapia no tratamento de doenças associadas com uma atividade de proteína cinase desregulada, como câncer.

Description

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a um derivado de pirrol-pirazol, a um processo para a sua preparação, às composições farmacêuticas compreendendo-o, e ao seu uso como agente terapêutico, particularmente no tratamento de câncer e distúrbios de proliferação celular.

Discussão dos Antecedentes

O mau funcionamento das proteinocinases (PKs) é a indicação de numerosas doenças. A grande parte dos oncogenes proto-oncogenes envolvida em cânceres humanos codifica para PKs. As atividades aumentadas de PKs estão da mesma forma envolvidas em muitas doenças nãomalignas, tal como hiperplasia prostática benigna, adenomatose familiar, polipose, neuro-fibromatose, psoríase, proliferação de célula lisa vascular associada com aterosclerose, fibrose pulmonar, artrite glomerulonefrite e reestenose e estenose pós-cirúrgica.

As PKs estão da mesma forma envolvidas em condições inflamatórias e na multiplicação de vírus e parasitas. As PKs podem da mesma 20 forma desempenhar um papel principal na patogênese e desenvolvimento de distúrbios de neurodegenerativos.

Para uma referência geral ao mau funcionamento ou desregulagem de PKs veja, por exemplo, Current Opinion in Chemical Biological 1999, 3, 459-465.

Entre as várias proteinocinases conhecidas na técnica como estando envolvidas no crescimento de células de câncer estão as cinases Aurora, em particular Aurora-2.

A Aurora-2 foi constatada ser superexpressa em vários tipos de tumor diferentes. Seus mapas de locus de gene em 20q13, uma região cro30 mossômica freqüentemente amplificada em muitos cânceres, incluindo de mama [Cancer Res. 1999, 59 (9), 2041-4] e de cólon.

A amplificação de 20q13 correciona com o mau prognóstico em pacientes com câncer de mama nodo-negativo e expressão de Aurora-2 aumentada é indicativa de mau prognóstico e tempo de sobrevivência diminuído em pacientes com câncer de bexiga [J. Natl. Cancer Inst., 2002, 94 (17), 1320-9]. Para uma referência geral ao papel da Aurora-2 na função de centrossoma anormal em câncer, veja da mesma forma Molecular Cancer Terapeutics, 2003, 2, 589-595.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

É um objetivo da invenção fornecer compostos, que sejam úteis na terapia como agentes contra um hospedeiro de doenças causadas por e /ou associadas a uma atividade de proteína cinase desregulada e, mais particularmente, atividade de cinases Aurora.

É outro objetivo fornecer compostos, que são dotados com atividade de inibição de proteína cinase e, mais particularmente, atividade de inibição de cinases Aurora.

Os presentes inventores já descobriram que alguns pirrolpirazóis, e derivados destes, são dotados com atividade de inibição de proteína cinase, por exemplo, atividade de inibição de cinases Aurora.

Mais especificamente, os compostos desta invenção são úteis no tratamento de uma variedade de cânceres incluindo, porém não limitados a: carcinoma, tais como bexiga, mama, cólon, rim, fígado, pulmão, incluindo câncer do pulmão de célula pequena, esôfago, vesícula biliar, ovário, pâncreas, estômago, cerviz, tiróide, próstata e pele, incluindo carcinoma de célula escamosa; tumores hematopoiético de linhagem linfóide, incluindo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia de linfoblástica aguda, linfoma de célula B, linfoma de célula T, linfoma de Hodgkin, linfoma de não Hodgkin, linfoma de célula pilosa e linfoma de Burkett; tumores hematopoiéticos de linhagem mielóide, incluindo leucemias mielogenosas agudas e crônicas, síndrome mielodisplástica e leucemia promielocítica; tumores de origem mesenquimatosa, incluindo fibrossarcoma e rabdomiossarcoma; tumores do sistema nervoso central e periférico, incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma e schwanomas; outros tumores, incluindo melanoma, seminoma, teratocarcinoma, osteossarcoma, xeroderma pigmentosa, cerato3 xantoma, câncer folicular da tireóide e o sarcoma de Kaposi.

Devido ao papel fundamental das PKs e cinases Aurora no regulação da proliferação celular, estes pirrol-pirazóis são da mesma forma úteis no tratamento de uma variedade de distúrbios proliferativos celulares tais como, por exemplo, hiperplasia prostática benigna, adenomatose familiar, polipose, neuro-fibromatose, psoríase, proliferação de célula lisa vascular associada com aterosclerose, fibrose pulmonar, artrite glomerulonefrite e reestenose e estenose pós-cirúrgica. Conseqüentemente, em uma primeira modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar distúrbios proliferativos celulares causados por e /ou associado com uma atividade de proteína cinase alterada que compreende administrar a um mamífero em necessidade deste, uma quantidade eficaz de um composto de formula (I).

em que R é hidrogênio ou metila;

Ri é hidróxi ou um grupo de alcóxi ou C1-C3 alquila reta ou ramificada;

R₂ é um hidrogênio ou átomo de halogênio;

X é um grupo divalente selecionado de metileno (-CH₂-) ou fluorometileno (CHF-), ou é um heteroátomo ou grupo heteroatômico selecionado de oxigênio (-O-) ou nitrogênio (-NR¹-) em que R' é um átomo de hidrogênio, um grupo de C1-C4 alquila reta ou ramificada ou um grupo de C₃-C₆ cicloalquila; ou um sal farmaceuticamente aceitável destes.

O método anterior permite o tratamento de distúrbios proliferativos de célula causados por e /ou associados com atividades de cinases Au4 rora alteradas.

Em uma modalidade preferida do método anteriormente descrito, distúrbio proliferativo de célula é câncer.

Tipos específicos de câncer que podem ser tratados incluem carcinoma, carcinoma de célula escamosa; tumores hematopoético de linhagem linfóide ou mielóide, tumores de origem mesenquimatosa, tumores do sistema nervoso central e periférico, melanoma, seminoma, teratocarcinoma, osteossarcoma, xeroderma pigmentosa, ceratoxantoma, câncer folicular da tireóide e sarcoma de Kaposi.

A presente invenção da mesma forma fornece um composto de fórmula (I)

em que R é hidrogênio ou metila;

Ri é hidróxi ou um grupo de alcóxi ou C1-C3 alquila reta ou ramificada;

R₂ é um hidrogênio ou átomo de halogênio;

A presente invenção da mesma forma inclui métodos de sintetizar os pirrol-pirazóis da formula (I) e os sais farmaceuticamente aceitáveis, bem como as composições farmacêuticas compreendendo-os.

Uma avaliação mais completa da invenção e muitas dentre as vantagens concomitantes desta será obtida facilmente quando a mesma vem a ser melhor entendida por referência à seguinte descrição detalhada. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Vários compostos heterocíclicos são conhecidos na técnica como inibidores de proteína cinase. Entre eles, derivados de 3-carboxamidopirazóis e 3-ureído-pirazóis e derivados destes, foram descritos como inibidores de proteína cinase nos pedidos de patente internacionais WO01/12189, WO01/12188, WO02/48114 e WO 02/70515, todos no nome do próprio requerente.

Os composto bicíclicos fundidos compreendendo porções de pirazol e possuindo atividade inibidora de cinase foram da mesma forma descritos em WO 00/69846, WO02/12242, bem como W003/028720 e ainda pedido PCT/EP03/04862 não publicado (reivindicando prioridade do pedido de patente US 60/381092, depositado em 17 de maio, 2002), todos no nome do próprio requerente.

Além do acima mencionado, os derivados de aminofenilpiperidina e aminofenil-piperazina, quando possuindo atividade inibidora com respeito às proteínas de fenil transferase são descritos em WO 02/30927 no nome de Pierre Fabre Medicament.

Os compostos da presente invenção incluem-se dentro do escopo da fórmula geral do WO 02/12242 anteriormente mencionado, com isto incorporado por referência, porém não são especificamente nele exemplificados.

Os compostos da fórmula (I) da invenção têm átomos de carbono assimétricos e podem portanto existir como isômeros ópticos individuais, como misturas racêmicas ou como qualquer outra mistura que compreende a maior parte de um dos dois isômeros ópticos que devem ser todos pretendidos como incluídos no escopo da presente invenção.

Igualmente, o uso como agente antitumor de todos os possíveis isômeros e suas misturas e tanto os metabólitos quanto os bioprecursores farmaceuticamente aceitáveis (de outro modo referidos como pró-drogas) dos compostos de fórmula (I) incluem-se também no escopo da presente invenção.

As pró-drogas são quaisquer compostos covalentemente ligados, que liberam a droga origem, de acordo com a fórmula (I), in vivo.

Em casos quando os compostos podem existir em formas tautoméricas, cada forma é contemplada como sendo incluída nesta invenção se estiver em equilíbrio ou predominantemente em uma forma.

Como tal, a menos que de outro modo fornecido, quando apenas uma das seguintes formas tautoméricas de fórmula (Ia) ou (Ib) é indicada, aquela restante deve também ser pretendida como incluída no escopo da

Na presente descrição, a menos que de outro modo especificado, com o termo CrC₃ ou C1-C4 alquila reta ou ramificada pretendemos qualquer dos grupos tais como, por exemplo, metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, terc-butila e sec-butila.

Com o termo C1-C3 alcóxi reto ou ramificado, pretendemos qualquer dos grupos tais como, por exemplo, metóxi, etóxi, n-propóxi e isopropóxi.

Com o termo átomo de halogênio pretendemos um átomo de flúor, cloro, bromo ou iodo. Com 0 termo C₃-Ce cicloalquila nós pretendemos qualquer grupo, tal como ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila ou ciclohexila.

Claramente, dependendo da natureza do grupo X, este mesmo heterociclo sendo ligado à porção de fenileno dos compostos da fórmula (I) pode representar um anel de piperidina, 4-fluoropiperidina, piperazina, 4alquil-piperazina, 4-cicloalquil-piperazina ou morfolina.

Sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da fórmula (I) incluem sais de adição de ácido com ácidos inorgânicos ou orgânicos tais como, por exemplo, ácido nítrico, hidroclórico, hidrobrômico, sulfurico, perclórico, fosfórico, acético, trifluoroacético, propiônico, glicólico, lático, oxálico, malônico, málico, maléico, tartárico, cítrico, benzóico, cinâmico, mandélico, metanossulfônico, isotiônico e salicílico.

Uma classe preferida de compostos da invenção é representada pelos derivados da fórmula (I) em que R é hidrogênio ou metila; Ri é selecionado de hidróxi, metila ou metóxi; R₂ é um átomo de flúor ou hidrogênio; X é selecionado de metileno, fluorometileno, -O- ou -NR', em que R‘ é como relatado acima.

Para uma referência a qualquer composto específico da fórmula (I) da invenção, opcionalmente na forma de um sal farmaceuticamente aceitável, veja a seção experimental e reivindicações

Como anteriormente indicado, um outro objetivo da presente invenção é representado pelo processo para preparar os compostos da fórmula (I) e os sais farmaceuticamente aceitáveis destes, cujo processo compreende:

a) reagir um composto da fórmula (II) com um composto da fórmula (III) o

COO-tBu em que R e X são como definidos acima, Q é um grupo de alquila inferior, tBu representa terc-butila e Z é hidróxi ou um grupo de partida adequado, a fim de obter um composto da fórmula (IV)

b) reagir o composto da fórmula (IV) sob condições acídicas a fim de obter um composto da fórmula (V)

c) reagir o composto da fórmula (V) com um composto da fórmula (VI)

em que Ri e R₂ são como definidos acima e Z¹ representa hidróxi ou um 5 grupo de partida adequado, a fim de obter um composto da fórmula (VII) Copiar a fórmula da página 9.

d) reagir o composto da fórmula (VII) sob condições básicas a fim de obter o composto correspondente da fórmula (I) e, se desejado, converter em um sal farmaceuticamente aceitável deste.

O processo acima é um processo análogo, que pode ser realizado funcionando-se de acordo com condições operativas muito bem conhecidas.

De acordo com a etapa (a) do processo, a reação entre os compostos da fórmula (II) e (III) pode ser realizada em uma variedade de manei15 ras, de acordo com métodos convencionais para acilação de derivados de amina. Como um exemplo, o composto da fórmula (II) pode ser reagido com um cloreto de acila da fórmula (III) em que Z representa, como um grupo de partida adequado, um átomo de cloro.

Preferivelmente, esta reação é realizada em uma temperatura variando de temperatura ambiente a cerca de 60°C, em um solvente adequado tal como, por exemplo, tetraidrofurano ou diclorometano, e na presença de um descontaminante de próton tal como trietilamina ou diisopropiletilamina. Dentro dos compostos da fórmula (II) Q representa um grupo de alquila inferior, por exemplo, um grupo de CrC₄ alquila, mais preferivelmente metila ou etila.

De acordo com etapa (b) do processo, o composto da fórmula (IV) é facilmente desprotegido no átomo de nitrogênio de pirrolidina, por tratamento acídico.

Esta reação pode ser convenientemente realizada na presença de um ácido mineral ou orgânico tal como, por exemplo, ácido hidroclórico, trifluoroacético ou metanossulfônico, em um solvente adequado, tal como diclorometano, 1,4-dioxano, um álcool inferior (por exemplo, metanol ou etanol), em uma temperatura variando da temperatura ambiente a cerca de 40°C e durante um tempo variando de cerca de 1 hora a cerca de 48 horas.

O composto da fórmula (V) desse modo obtido é também reagido, de acordo com a etapa (c) do processo, com um composto da fórmula (VI). A partir do anterior está claro para a pessoa versada que da mesma forma esta reação de acilação pode ser realizada em uma variedade de maneiras e condições operativas, que são amplamente conhecidas na técnica para a preparação de carboxamidas.

A reação entre um composto da fórmula (V) e um ácido carboxílico da fórmula (VI) em que Z' é hidróxi pode ser realizada na presença de um agente de acoplamento tal como, por exemplo, carbodiimida, isto é 1,3diciclohexilcarbodiimida, 1,3-diisopropilcarbodiimida, 1 -(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, poliestireno de N-ciclohexilcarbodiimida-N¹propiloximetila ou poliestireno de N-ciclohexilcarbodiimida-N'-metila, em um solvente adequado tal como, por exemplo, diclorometano, clorofórmio, tetrahidrofurano, éter de dietila, 1,4-dioxano, acetonitrila, tolueno, ou N,Ndimetilformamida em uma temperatura variando de cerca de -10°C até o refluxo durante um tempo adequado, isto é de cerca de 30 minutos a cerca de 96 horas. A referida reação é opcionalmente realizada na presença de um catalisador adequado, por exemplo 4-dimetilaminopiridina, ou na presença de um outro reagente de acoplamento, tal como N-hidroxibenzotriazol.

A reação entre um composto da fórmula (V) e um composto da fórmula (VI) pode ser da mesma forma realizada, por exemplo, através de 5 um método de anidrido misturado, empregando-se um cloroformato de alquila, tal como cloroformato de etila, isobutila, ou iso-propila, na presença de uma base terciária, tal como trietilamina, Ν,Ν-diisopropiletilamina ou piridina, em um solvente adequado tal como, por exemplo, tolueno, diclorometano, clorofórmio, tetrahidrofurano, acetonitrila, éter de dietila, 1,4-dioxano, ou 10 Ν,Ν-dimetilformamida, em uma temperatura variando de cerca de -30°C a temperatura ambiente.

A reação entre um composto da fórmula (V) e um derivado carboxílico da fórmula (VI) em que Z' é um grupo de partida adequado pode ser realizada na presença de uma base terciária, tal como trietilamina, N,N15 diisopropiletilamina ou piridina, em um solvente adequado, tal como tolueno, diclorometano, clorofórmio, éter de dietila, tetrahidrofurano, acetonitrila, ou Ν,Ν-dimetilformamida, em uma temperatura variando de cerca de -10°C até o refluxo.

Os compostos da fórmula (VI) são caracterizados pela presença 20 de um átomo de carbono assimétrico sendo ligado ao Ri e presentemente notado com um asterisco

Portanto, os compostos da fórmula (VI) pode ser na forma de enantiômeros simples ou como misturas destes, da mesma forma compre11 ensíveis de misturas racêmicas.

Claramente, dependendo da natureza do composto da fórmula (VI) a ser empregado no processo da invenção, compostos correspondentes da fórmula (VII) tendo uma estereoquímica apropriadamente definida neste mesmo átomo de carbono podem ser desse modo obtidos.

De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a etapa (c) é realizada reagindo-se um composto adequado da fórmula (VI) que está em uma dada forma enantiomérica.

Da mesma maneira, se misturas racêmicas do composto da fórmula (VI) são empregadas e quando compostos finais da fórmula (I) em forma pura forma óptica são desejados, a resolução óptica do composto intermediário da fórmula (VII) ou, alternativamente, do composto final da fórmula (I) será requerida, funcionando-se de acordo com meios convencionais. Justamente como um exemplo, técnicas convencionais para resolução de racemato incluem, por exemplo, cristalização dividida de derivados de sal diastereoisoméricos ou HPLC quiral preparativa.

Finalmente, de acordo com a etapa (d) do processo, o composto da fórmula (VII) é desprotegido no átomo de nitrogênio de pirazol funcionando-se de acordo com métodos convencional permitindo, por exemplo, a hidrólise seletiva do grupo de carbamato.

Como um exemplo, esta reação pode realizada sob condições básicas, por exemplo na presença de hidróxido de sódio, potássio ou lítio, ou uma amina terciária, tal como trietilamina, e em um solvente adequado, tal como Ν,Ν-dimetilformamida, metanol, etanol, tetrahidrofurano, água e misturas destes. Tipicamente, a reação é realizada em temperaturas variando de temperatura ambiente a cerca de 60°C e durante um tempo variando de cerca de 30 minutos a cerca de 96 horas.

Finalmente, sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da fórmula (I) ou, alternativamente, os compostos livres de seus sais destes podem ser todos obtidos de acordo com métodos convencionais.

O material de partida do processo da invenção é conhecido ou facilmente preparado de acordo com métodos conhecidos.

Como um exemplo, a preparação do composto da fórmula (II) em que Q representa etila é descrita no pedido de patente internacional anteriormente mencionado WO 02/12242 (veja, em particular, exemplo 26 na página 249; este mesmo composto é dessa maneira nomeado como éster de éster de 1-etila de 5-terc-butila de ácido 3-amino-4,6-dihidro-pirrolo[3,4-

c]pirazol-1,5-dicarboxílico).

Funcionando-se de uma maneira análoga, os compostos adicionais da fórmula (II) em que Q representa um grupo de alquila inferior exceto etila podem ser desse modo preparado também.

Os compostos da fórmula (III) e (VI), por exemplo aqueles em que Z e Z¹ representam um átomo de halogênio, por exemplo, um átomo de cloro, são conhecidos ou podem ser facilmente obtidos dos ácidos carboxílicos conhecidos correspondentes, funcionando-se de acordo com métodos convencionais.

Igualmente, está da mesma forma claro para a pessoa versada na técnica que se um composto da fórmula (I), preparado de acordo com o processo anterior compreensivo de qualquer variante deste, é obtido como uma mistura de isômeros, sua separação nos isômeros simples da fórmula (I), realizado de acordo com técnicas convencionais, está ainda dentro do escopo da presente invenção.

FARMACOLOGIA

Os compostos da fórmula (I) são ativos como inibidores de proteína cinase, mais particularmente como inibidores de Aurora cinases e são portanto úteis, por exemplo, para restringir a proliferação desregulada de células de tumor.

Em terapia, eles podem ser empregados no tratamento de vários tumores, tal como aqueles anteriormente relatado, bem como no tratamento de outros distúrbios proliferativos de células, tais como psoríase, proliferação de célula lisa vascular associada com ateroesclerose e reestenose e estenose pós cirúrgica.

A atividade de inibição e a potência de compostos selecionados são determinadas através de um método de ensaio com base no uso da tec13 nologia de SPA (Amersham Pharmacia Biotech). O ensaio consiste da transferência em porção de fosfato rotulada de radioatividade pela cinase para um substrato biotinilado. O produto biotinilado 33P-rotulado resultante é permitido ligar as contas de SPA revestidas por estreptavidina (capacidade de biotina 130 pmol/mg), e luz emitida foi medida em uma contador de cintilação.

Ensaio de Inibição de Atividade de Aurora-2

Reação de Cinase: 8μΜ peptídeo biotinilado (4 repetições de LRRWSLG), 10μΜ de ATP (0,5 uCiP³³y-ATP), 7,5 ng de Aurora 2, inibidor em um volume final de 30μΙ de tampão (50 mM de HEPES pH 7,0, 10 mM de MgCI₂, 1 mM de DTT, 0,2 mg/ml de BSA, 3μΜ de ortovanadato) foram adicionados a cada cavidade de uma placa de 96 cavidades com base em U. Depois de 60 minutos de incubação em temperatura ambiente, a reação foi interrompida e o peptídeo biotinilado capturado adicionando-se 100μΙ de suspensão de conta.

Estratificação: 100μΙ de 5 M de CsCI₂ foram adicionados a cada cavidade e permitido manter 4 horas antes da radioatividade ser contada no instrumento Top-Count.

Determinação de IC50: inibidores foram testados em concentrações diferentes variando de 0,0015 a 10μΜ. Dados experimentais foram analisados pelo programa de computador GraphPad Prizm empregando a equação logística de quatro parâmetros:

y = base + (topo-base)/(1+10 ^Λ ((loglC50-x) * declive)) onde x é o logaritmo da concentração inibidora, y é a resposta; y começa na base e vai para o topo com uma forma de sigmóide.

Cálculo de Ki:

lí

Método Experimental: Reação foi realizada em tampão (10 mM de Tris, pH

7,5, 10 mM de MgCI₂, 0,2 mg/ml de BSA, 7,5 mM de DTT) contendo 3,7 nM de enzima, histona e ATP (relação constante de ATP frio/rotulado 1/3000). A reação foi interrompida com EDTA e o substrato capturado em placas de 96 cavidades Multiscreen de fosfomembrana de Millipore). Depois da lavagem extensa, as placas multiscreen foram lidas em uma contadora de topo. Con trole (tempo zero) para cada ATP e as concentrações de histona foi avaliada.

Projeto Experimental: Velocidades de reação são medidas em quatro concentrações de ATP, substrato (histona) e inibidor. Uma matriz de concentração de 80-pontos foi projetada ao redor dos valores em Km de substrato e ATP respectivos, e os valores de IC50 do inibidor (0,3, 1,3, 9 vezes o Km ou valores de IC50). Uma experiência de curso de tempo preliminar na ausência do inibidor e no ATP diferente e concentrações de substrate permite a seleção de um único tempo de ponto final (10 minutos) na faixa linear da reação para a experiência de determinação de Ki.

Estimativas de Parâmetro Cinético: Parâmetros cinéticos foram calculados para regressão de quadrado menor não linear simultânea empregando [Eq.

1] (relação de inibidor competitivo para ATP, mecanismo aleatório) empregando o grupo de dados completo (80 pontos):

• Vm «> A eB

V ----—---------- [Eq.1] a oKapKb + cr ® Kao B + a®Kb© A + A*B + a? ® J® (Kb + —1

Ki β’ em que A= [ATP], B = [Substrato], I = [inibidor], Vm = velocidade máxima, Ka, Kb, Ki as constantes de dissociação de ATP, substrato e inibidor respectivamente. α e β o fator de cooperatividade entre substrato e ligação de ATP e substrato e ligação de inibidor respectivamente.

Os compostos da invenção foram também testados in vitro para avaliar o efeito antiproliferative sobre culturas de célula e o efeito inibidor sobre o ciclo celular.

Ensaio de Proliferação Celular in vitro

A linhagem celular de câncer de cólon humano HCT-116 foi semeada em 5000 células/cm² em placas de 24 cavidades (Gostar) empregando meio F12 (Gibco) suplementado com 10% de FCS (EuroClone, Itália) 2 mM de L-glutamina e 1% de penicilina/estreptomicina e mantida a 37°C, 5% de CO2 e 96% de umidade relativa. O dia seguinte, as placas foram tratadas em duplicata com 5 ul de uma diluição apropriada de compostos começando de uma matéria prima de 10 mM em DMSO. As cavidades de controle não tratadas foram incluídas em cada placa. Depois de 72 horas de tratamento, o meio foi retirado e as células separadas de cada cavidade empregando 0,5 ml de 0,05% (p/v) de Tripsina, 0,02% (p/v) de EDTA (Gibco).

As amostras foram diluídas com 9,5 ml de Isoton (Coulter) e contadas empregando uma contadora de célula Multisizer 3 (Beckman Coulter). Os dados foram avaliados como o percentual das cavidades de controle:% de CTR = (Blank tratado)/ (Blankde controle).

Os valores de IC₅o foram calculados por LSW/Análise de Dados empregando ajustamento de curva sigmoidal da Microsoft Excel.

Análise de Ciclo Celular in vitro

A linhagem celular de câncer de cólon humana HCT-116 foi semeada em 5000 células/cm² em placas de 24 cavidades (Gostar) e cultivada como anteriormente mencionado. As células em sua fase exponencial de crescimento foram tratadas durante 24 horas com concentrações diferentes de composto. Da mesma forma, o sobrenadante de meio de cultura foi coletado para evitar a perda de células mitóticas ou apoptóticas separadas. Em seguida, as células foram lavadas empregando PBS e separadas por 0,05% (p/v) de tripsina, 0,02 % (p/v) de EDTA (Gibco). A atividade de tripsina foi interrompida empregando o meio de cultura. As frações de célula não aderente e aderente foram agrupadas e centrifugadas em 2000 rpm durante 10 minutos. As células foram ressuspensas em PBS e contadas empregando uma contadora de célula Multisizer 3 (Beckman Coulter). Para fixação, etanol foi adicionado (70 %, v/v) e as células foram mantidas em -20°C durante a noite.

Um milhão de células fixas foram centrifugadas em 2000 rpm durante 5 minutos e lavadas com PBS e subsequentemente manchadas durante 1 hora em temperatura ambiente no escuro adicionando-se 200 ul : 25 ug/ml de iodeto de propídio (Sigma) e 15 ug/ml de RNAse A (Sigma), 0,001 % (v/v) de Nonidet P40 (Sigma) em citrato de sódio (0,1% p/v, pH 7,5). As amostras foram analisadas por citometria de fluxo em 488 nm de excitação (FACSCalibur, Beckton Dickinson) empregando o software Cell Quest 3.0 (Beckton Dickinson). Tipicamente, 10000 eventos (ativando módulos discri16 minados duplos DDM e fechando apenas as células isoladas) foram coletados e os perfis de ciclo celular foram registrados empregando CellQuest (Verity Software). A distribuição do ciclo celular da população foi calculada empregando um modelo modificado no software Modfit 3.1 (Verity Software) e 5 expressa em % de G0/G1, S, G2/M e poliplóide.

Dados os ensaios acima, os compostos da fórmula (I) da invenção resultaram para possuir uma atividade de proteína cinase notável, por exemplo, atividade inibidora de Aurora-2. Veja, como um exemplo, a tabela I seguinte relatando os dados experimentais de quatro compostos representa10 tivos da invenção a ser testados como inibidores de Aurora-2 cinase (IC₅o nM), quanto ao seu efeito antiproliferative de célula (ICsonM), e quanto a sua capacidade de exercer o bloqueio do ciclo celular e induzir poliplóide (% de G2/M + poliplóide em 200 nM).

Interessantemente, estes mesmos compostos foram testados 15 em comparação a um composto da técnica anterior estruturalmente muito restrito, deste modo definido como composto de Referência, que é especificamente descrito na WO 02/12242 anteriormente mencionada - veja página 160, linhas 5-7 da mesma; o composto de Referência foi dessa maneira nomeado como N-{5-fenilacetil-4,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4-(4-metilpi20 perazino)benzamida.

Composto de Referência (R = Rt = R₂ = Η; X = NMe)

N-{5-fenilacetil-4,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4-(4metilpiperazino)benzamida;

Composto (1) (R = R₂ = H; Ri = OMe; X = NMe)

N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il]-4(4-metilpiperazin-1 -il) benzamida;

Composto (11) (R = R₂ = H; Ri= Me; X = NMe) N-{5-[(2R)-2-metil-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-yl}-4(4-metilpiperazin-1 -il)benzamida ;

Composto (6) (R = R₂ = H; Ri = OMe; X = CH₂) N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4piperidin-1 -ilbenzamida;

Composto (5) (R = Me; Ri = OMe; R₂= Η; X = NMe)

4-(3,4-dimetilpiperazin-1 -il)-N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5, 6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}benzamida.

Tabela I

Composto	IC₅o Inibição de Aurora-2	IC50 de Antiproliferação de Célula	Bloco de Ciclo Celular (% de G2/M + poliplóide em 200 nM)
Composto de Referência	140	220	33
Nenhum	-	-	19
(1)	16	31	90
(11)	63	17	90
(6)	37	30	90
(5)	18	50	90

Surpreendentemente, a atividade inibidora de Aurora-2 dos compostos da invenção resultou ser constante e acentuadamente superior àquela do composto de Referência.

Além disso, aqueles mesmos compostos resultou em possuir um efeito antiproliferative de célula junto com a capacidade de bloquear o ciclo celular e induzir poliplóide, significativamente superior aquela do composto de Referência a ser testado nas mesmas condições.

A partir do anterior, os novos compostos da fórmula (I) da invenção mostram ser dotados com um perfil biológico, considerado como um todo, que é inesperadamente superior aquele da técnica anterior mais restrita de WO 02/12242 e, portanto, são particularmente vantajosos, em terapia, contra distúrbios proliferativos associados com uma atividade de Aurora2 cinase alterada.

Os compostos da presente invenção podem ser administrados como agentes únicos ou, alternativamente, em combinação com tratamentos anticâncer conhecidos tal como terapia de radiação ou regime de quimioterapia em combinação com agentes citostáticos ou citotóxicos, agentes tipo antibióticos, agentes de alquilação, agentes antimetabólitos, agentes hormonais, agentes imunológicos, agentes tipo interferon, inibidores de ciclooxigenase (por exemplo, inibidores de COX-2), inibidores de metaloprotease matriz, inibidores de telomerase, inibidores de tirosina cinase, agentes de receptor fator de anticrescimento, agentes anti-HER, agentes anti-EGFR, agentes antiangiogênese (por exemplo, inibidores de angiogênese), inibidores de farnesil transferase, inibidores de trilha de transdução de sinal ras-raf, inibidores de ciclo celular, outros inibidores de cdks, agentes de ligação de tubulina, inibidores de topoisomerase I, inibidores de topoisomerase II, e similares.

Se formulados como dose fixada, tais produtos de combinação empregam os compostos desta invenção dentro da faixa de dosagem descrita abaixo e o outro agente farmaceuticamente ativo dentro da faixa de dosagem aprovada.

Compostos da fórmula (I) podem ser seqüencialmente empregados com agentes anticâncer conhecidos quando uma formulação de combinação é inapropriada.

Os compostos da fórmula (I) da presente invenção, adequados para administração em um mamífero, por exemplo, para seres humanos, podem ser administrados pelas vias usuais e o nível de dosagem depende da idade, peso, condições do paciente e via de administração.

Por exemplo, uma dosagem adequada adotada para administração oral de um composto da fórmula (I) pode variar de cerca de 10 a cerca de 500 mg por dose, de 1 a 5 vezes diariamente. Os compostos da invenção podem ser administrados em uma variedade de formas de dosagem, por exemplo, oralmente, na forma de comprimidos, cápsulas, comprimidos revestidos com açúcar ou película, soluções líquidas ou suspensões; retalmente na forma de supositórios; parenteralmente, por exemplo, intramuscularmente, ou através de infusão ou injeção intravenosa e/ou intratecal e/ou intra-espinhal.

A presente invenção da mesma forma inclui composições farmacêuticas compreendendo um composto da fórmula (I) ou sal farmaceuticamente aceitável destas em associação com um excipiente farmaceuticamente aceitável, que pode ser um veículo ou um diluente.

As composições farmacêuticas contendo os compostos da invenção são usualmente preparadas seguindo métodos convencionais e são administrados em uma forma farmacêutica aceitável.

Por exemplo, as formas orais sólidas podem conter, junto com o composto ativo, diluentes, por exemplo, lactose, dextrose, sacarose, sucrose, celulose, amido de milho ou amido de batata; lubrificantes, por exemplo, sílica, talco, ácido esteárico, estearato de cálcio ou magnésio e/ou polietileno glicóis; agentes de ligação, por exemplo, amidos, goma arábica, gelatina metilcelulose, carboximetilcelulose ou polivinil pirrolidona; agentes desintegrantes, por exemplo, amido de sódio, ácido algínico, alginatos ou glicolato de amido, misturas efervescentes; matérias corantes, adoçantes; agentes de umectação tal como lecitina, polissorbatos, laurilsulfatos; e, em geral, substâncias farmacologicamente inativas e não tóxicas empregadas nas formulações farmacêuticas. Estas preparações farmacêuticas podem ser fabricadas de maneira conhecida, por exemplo, por meios de processo de mistura, granulação, formação de comprimidos, super-revestimento ou revestimento de película.

As dispersões líquidas para administração oral podem ser, por exemplo, xaropes, emulsões e suspensões.

Como um exemplo, os xaropes podem conter, como veículo, sacarose ou sacarose com glicerina e/ou manitol ou sorbitol.

As suspensões e as emulsões podem conter, como exemplos de veículos, goma natural, ágar, alginato de sódio, pectina, metilcelulose, carboximetilcelulose ou álcool polivinílico. A suspensão ou soluções para injeções intramusculares podem conter, junto com o composto ativo, um veículo farmaceuticamente aceitável, por exemplo, água estéril, azeite de oliva, oleato de etila, glicóis, por exemplo, propileno glicol e, se desejado, uma quantidade adequada de cloridrato de lidocaína. As soluções para injeções intravenosas ou infusões podem conter, como um veículo, água estéril ou preferivelmente elas podem ser na forma de soluções salinas isotônicas, aquosas, estéreis ou elas podem conter propileno glicol como o veículo.

Os supositórios podem conter, juntamente com o composto ativo, um veículo farmaceuticamente aceitável, por exemplo, manteiga de cacau, polietileno glicol, um tensoativo de éster de ácido graxo de sorbitano de polioxietileno ou lecitina.

Com o objetivo de melhor ilustrar a presente invenção, sem propor qualquer limitação a ela, os seguintes exemplos são agora dados. EXEMPLOS

Métodos Gerais

Cromatografia Instantânea foi realizada em sílica-gel(Merck grade 9385, 60A). HPLC/MS foi realizada em uma coluna Waters X Terra RP 18 (4,6 x 50 mm, 3,5 gm) empregando um sistema de HPLC Waters 2790 equipado com um detector 996 Waters PDA e um espectrômetro de massa único Micromass mod. ZQ, equipado com uma fonte de íon de eletrovaporização (ESI). A fase móvel A foi acetato de amônio 5 mM de tampão (pH 5,5 com ácido acético/acetonitrila 95: 5), e a fase Móvel B foi H₂O/acetonitrila (5: 95). Gradiente de 10 a 90% de B em 8 minutos, retenção de 90% B em 2 minutos. Detecção de UV em 220 nm e 254 nm. Taxa de fluxo 1 ml/minuto. Volume de injeção 10 μΙ. Exame completo, faixa de massa de 100 a 800 amu. Voltagem capilar foi de 2,5KV; Temperatura da fonte foi 120°C; Cone foi 10 V. Tempos de retenção (HPLC temperatura ambiente) são dados em minutos em 220 nm ou 254 nm. Massa é determinada como relação de m/z. Espectroscopia de 1H-RMN foi realizada em um Mercury VX 400 operando em 400,45 MHz equipado com uma sonda de ressonância dupla de 5mm (1H {15N-31P} ID-PFG Varian).

Exemplo 1

Preparação 3-amino-4,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1,5-dicarboxilato de 1-etila de 5-terc-butila

Uma solução de clorocarbonato de etila (8,9 ml, 93 mmoles) em tetrahidrofurano (THF, 250 ml) foi adicionada lentamente a uma mistura de

3-amino-4,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-5-(1H)-carboxilato de terc-butila (20 g, 89 mmoles) e diisopropiletilamina (DIEA, 92 ml, 528mmoles) em THF (500ml) a 0-5°C. A reação foi mantida na mesma temperatura durante duas horas em seguida permitida alcançar a temperatura ambiente e agitada durante a noite. A mistura obtida foi evaporada até a secura sob vácuo, e o resíduo resultante extraído com acetato de etila (AcOEt) e água. A camada orgânica foi separada, secou em sulfato de sódio e evaporada até a secura. A mistura foi purificada por cromatografia Instantânea (eluente: acetato de etila/ciclohexano 4/6 a 7/3) para produzir 19 g do composto do título como um sólido branco. [M+H]⁺297.

Exemplo 2

Preparação de 3-{[4-(4-metilpiperazin-1-il)benzoil]amino}-4,6dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1,5-dicarboxilato de 1-etila de 5-terc-butila

Cloreto de oxalila (23,2 ml, 265mmoles) foi adicionado a uma suspensão de ácido 4-(4-metil-1-piperazinil)-benzóico (11,7 g, 53 mmoles) em diclorometano (DCM, 320 ml) e dimetilformamida (DMF, 0,52 ml). Depois de refluxar a mistura durante 6,5 horas, os voláteis foram cuidadosamente removidos sob pressão reduzida (absorvendo o resíduo três vezes com tolueno).

O dicloridrato de cloreto de 4-metilpiperazino-benzoíla resultante foi adicionado em porções a uma solução de 3-amino-4,6-dihidropirrol[3,4-

c]pirazol-1,5-dicarboxilato de 1-etila de 5-terc-butila (13,1 g, 44,3mmoles) em THF seco (620 ml) e DIEA (54,4 ml, 0,32 mol) sob agitação em temperatura ambiente. A suspensão resultante foi agitada 16 horas em temperatura ambiente e 1 hora a 40°C.

Depois da remoção do solvente sob pressão reduzida, o resíduo foi apreendido com AcOEt (600 ml) e a camada orgânica lavada com carbonato de sódio aquoso (200 ml), salmoura, (200 ml) e secado em sulfato de sódio.

O solvente foi evaporado, e o resíduo foi triturado com uma mistura de éter de dietila (Et₂0, 135 ml) e AcOEt (15ml), filtrado, secado sob vácuo a 40°C para produzir 20 g do composto do título como um pó branco [M+H]⁺ 499.

Operando-se de uma maneira análoga e reagindo-se 3-amino-

4,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1,5-dicarboxilato de 1-etila de 5-terc-butila com o derivado de cloreto de acila apropriado, os seguintes compostos foram preparados: 3-{[4-(4-etilpiperazin-1-il)benzoil]amino)-4,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1,5dicarboxilato de 1-etila de 5-terc-butila; [M+H]⁺ 513.

3-{[4-(4-isopropilpiperazin-1-il)benzoil]amino-4,6-dihidropirrol[3,4-(5)c]pirazol-

1,5-dicarboxilato de 1-etila de 5-terc-butila; [M+H]⁺ 527.

3-{[4-(4-ciclopropilpiperazin-1-il)benzoil]amino}-4,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-

1,5-dicarboxilato de 1-etila de 5-terc-butila; [M+H]⁺ 525. 3-{[4-(3,4-dimetilpiperazin-1-il)benzoil]amino}-4,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-

1,5-dicarboxilato de 1-etila de 5-terc-butila; [M+H]⁺ 513.

3-[(4-piperidin-1-ilbenzoil)amino]-4,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1,5-dicarboxilato de 1-etila de 5-terc-butila; [M+H]⁺ 484.

3-{[4-(4-fluoropiperidin-1-il)benzoil]amino}-4,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1,5dicarboxilato de 1-etila de 5-terc-butila; [M+H]⁺ 502.

3-[(4-morfolin-4-ilbenzoil)amino]-4,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1,5-dicarboxilato de 1 -etila de 5-terc-butila; [M+H]⁺ 486.

3-{[4-(4-terc-butilpiperazin-1-il)benzoil]amino}-4,6-dihidropirrol[3,4-(5)c]pirazol-1,5-dicarboxilato de 1-etila de 5-terc-butila; [M+H]⁺ 541.

Exemplo 3

Preparação de Tricloridrato de 3-([4-(4-metilpiperazin-1-il)benzoil1amino}-5,6dihidropirroir3.4-c]pirazol-1(4H)-carboxilato de etila.

Uma solução de 4N de ácido clorídrico em dioxano (122 ml, 488 mmoles) foi adicionada em gotas em uma solução agitada de 3-{[4-(4 metilpiperazin-1 -il)benzoil]amino}-4,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1,5dicarboxilato de 1-etila de 5-terc-butila (19,5 g, 39,2 mmoles), como preparado no Exemplo 2, em DCM seco (240 ml); a precipitação de um sólido branco ocorreu quase imediatamente. A mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente durante 24 horas; depois da diluição com Et₂O (100ml), o sólido foi filtrado, extensivamente lavado com Et₂O, e foi secado sob vácuo a 50°C para produzir 20,1 g do composto do título, empregado na próxima etapa sem outra purificação. [M+H]⁺ 399.

1H-RMN (DMSO-d6) δ ppm: 1,4 (t, 3H); 2,8 (d, 3H); 3,2 (m, 4H); 3,5 (m, 2H);

4,1 (m, 2H); 4,4 (q, 2H); 4,6 (m, 4H); 7,1 - 8,0 (m, 4H); 10,3 (bs, 2H); 10,7 (bs, 1H); 11,4 (s, 1H).

Operando-se como acima relatado e começando-se do intermediário adequado, os seguintes compostos foram analogamente preparados: tricloridrato de 3-{[4-(4-etilpiperazin-1 -il)benzoil]amino}-5,6-dihidropirrol[3,4-

c]pirazol-1(4H)-carboxilato de etila; [M+H]⁺ 413.

tricloridrato de 3-{[4-(4-isopropilpiperazin-1-il) benzoil]amino}-5,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1(4H)-carboxilato de etila; [M+H]⁺ 427.

tricloridrato de 3-{[4-(4-ciclopropilpiperazin-1 -il)benzoil]amino)-5,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1 (4H)-carboxilato de etila; [M+H]⁺ 425.

tricloridrato de 3-{[4-(3,4-dimetilpiperazin-1 -il)benzoil]amino)-5,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1 (4H)-carboxilato de etila; [M+H]⁺ 413.

3-[(4-piperidin-1-ilbenzoil)amino]-5,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1-(4H)-carboxilato de etila; [M+H]⁺ 384.

tricloridrato de 3-{[4-(4-fluoropiperidin-1 -il)benzoil]amino}-5,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1(4H)-carboxilato de etila; [M+H]⁺ 402.

tricloridrato de 3-{[4-(4-morfolin-4-il)benzoil]amino}-5,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1(4H)-carboxilato de etila; [M+H]⁺ 386.

tricloridrato de 3-{[4-(4-terc-butilpiperazin-1 -il)benzoil]amino}-5,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1 (4H)-carboxilato de etila; [M+H]⁺ 441.

Exemplo 4

Preparação de 5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-3-{[4-(4-metilpiperazin-1 -il)benzoil]amino}-5,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1 (4H)-carboxilato de etila.

Cloreto de oxalila (10. 1,2 ml, 115 mmoles) foi adicionado em uma solução de ácido R-(-)-a-metoxifenilacético (1,91 g, 11,5 mmoles) em DCM (90 ml) e DMF (0,50ml). Depois de agitar a mistura em temperatura ambiente durante 16 horas, os voláteis foram cuidadosamente removidos sob pressão reduzida.

Uma solução do cloreto de R-(-)-a-metoxifenilacetila resultante em DCM (20ml) foi adicionada em gotas a uma solução de tricloridrato de 3{[4-(4-metilpiperazin-1-il)benzoil]amino}-5,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1(4H)carboxilato de etila (4,5 g, 8,9 mmoles) em DCM (400 ml) e DIEA (11,8 ml, 69 mmoles) sob agitação em temperatura ambiente. A solução resultante foi agitada durante 20 horas em temperatura ambiente.

A mistura de reação foi em seguida lavada com carbonato de sódio aquoso (200 ml), salmoura, (200 ml) e secada em sulfato de sódio. O solvente foi evaporado, e o resíduo foi triturado com uma mistura de Et₂O (100 ml) e AcOEt (10ml), filtrada, e secada sob vácuo a 40°C para produzir 3,94 g do composto do título como um pó branco empregado na etapa seguinte sem outra purificação. [M+H]⁺ 547;

1H-RMN (DMSO-d6) δ ppm: 1,3 (t, 3H); 2,3 (d, 3H); 2,6 (m, 4H); 3,3 - 3,4 (m, 7H); 4,3 (q, 2H); 4,6 - 4,9 (m, 4H); 5,1 (d, 1H) 7,0 - 8,0 (m, 9H); 11,1 (d, 1H).

Operando-se como relatado acima e começando-se do derivado de cloreto de acila adequado, os seguintes compostos foram analogamente preparados:

5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-3-{[4-(4-etilpiperazin-1-il)benzoil]amino}-5,6dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1-(4H)-carboxilato de etila; [M+H]⁺ 561. 5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-3-{[4-(4-isopropilpiperazin-1-il)benzoil]amino}-

5,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1(4H)-carboxilato de etila; [M+H]⁺ 575. 5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-3-{[4-(4-ciclopropilpiperazin-1il)benzoil]amino}-5,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1 (4H)-carboxilato de etila; [M+H]⁺ 573. 3-{[4-(3,4-dimetilpiperazin-1-il)benzoil]amino}-5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-

5,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1(4H)-carboxilato de etila; [M+H]⁺ 561.

5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-3-[(4-piperidin-1-ilbenzoil)amino]-5,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1(4H)-carboxilato de etila; [M+H]⁺ 532.

3-{[4-(4-fluoropiperidin-1-il)benzoil]amino}-5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-

5,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1(4H)-carboxilato de etila; [M+H]⁺ 550. 5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-3-[(4-morfolin-4-ilbenzoil)amino]-5,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1(4H)-carboxilato de etila; [M+H]⁺ 534.

3-{[4-(4-terc-butilpiperazin-1-il)benzoil]amino)-5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-

5,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1(4H)-carboxilato de etila; [M+H]⁺ 589. 5-[(2R)-2-metil-2-feniletanoil]-3-{[4-(4-etilpiperazin-1-il)benzoil]amino}-5,6dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1(4H)-carboxilato de etila; [M+H]⁺ 545.

5-[(2R)-2-metil-2-feniletanoil]-3-{[4-(4-isopropilpiperazin-1-il) benzoil]amino}-

5,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1(4H)-carboxilato de etila; [M+H]⁺ 559.

5-[(2R)-2-metil-2-feniletanoil]-3-{(4-(4-ciclopropilpiperazin-1-il) benzoil]amino}-5,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1(4H)-carboxilato de etila; [M+H]⁺ 557. 3-[(4-(3,4-dimetilpiperazin-1-il)benzoil]amino]-5-[(2R)-2-metil-2-feniletanoil]-

5.6- dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1(4H)-carboxilato de etila; [M+H]⁺ 545. 5-[(2R)-2-metil-2-feniletanoil]-3-[(4-piperidin-1-ilbenzoil)amino]-5,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1(4H)-carboxilato de etila [M+H]⁺ 516.

3-[(4-(4-fluoropiperidin-1-il)benzoil]amino)-5-[(2R)-2-metil-2-feniletanoil]-5,6dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1(4H)-carboxilato de etila; [M+H]⁺ 534.

5-[(2R)-2-metil-2-feniletanoil]-3-[(4-morfolin-4-ilbenzoil)amino]-5,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1(4H)-carboxilato de etila; [M+H]⁺ 518.

3-{[4-(4-terc-butilpiperazin-1-il)benzoil]amino)-5-[(2R)-2-metil-2-feniletanoil]-

5.6- dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1-(4H)-carboxilato de etila; [M+H]⁺ 573.

5-[(2R)-2-hidróxi-2-feniletanoil]-3-{[4-(4-metilpiperazin-1-il)benzoil]amino}-5,6dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1(4H)-carboxilato de etila; [M+H}⁺ 533.

Exemplo 5

Preparação de N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil)]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4-(4-metilpiperazin-1 -il)benzamida (1)

Uma solução de 5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-3-{[4-(4-metilpiperazin-1-il)benzoil]amino}-5,6-dihidropirrol[3,4-c]pirazol-1-(4H)-carboxilato de etila (3,94 g, 7,2 mmoles) em metanol (MeOH, 130 ml) e trietilamina (Et₃N, 13 ml) foi agitada em temperatura ambiente durante 16 horas (alguma precipitação ocorreu). O sólido foi separado e lavado com Et₂O, para produzir 1,6 g do composto do título. A solução foi evaporada até poucos mililitros, e uma segunda fração do produto sólido foi separada (1,62 g). As duas frações foram unidas e analisadas por LC-MS (pureza ao redor de 90% 254 e 220 nM). Depois da purificação cromatográfica (coluna de sílica-gel curta, DCM/MeOH 45:5) 2,83 g (83%) do composto do título foi obtido como um sólido branco. Ponto de fusão 289°C; [M+H]⁺ 475 ;

1H-RMN (DMSO-d6) δ ppm: 2,21 (s, 3H); 2,43 (m, 4H); 3,29 (m, 7H); 4,20 - 4,90 (m, 4H); 5,09 (s, 1H) 6,80 - 8,00 (m, 9H); 10,6 (br, 1H); 12,09 (br, 1H).

Operando-se de uma maneira análoga, através de hidrólise básica dos compostos do exemplo 4, os seguintes compostos foram preparados:

(2) N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-

c]pirazol-3-il}-4-(4-etilpiperazin-1-il)benzamida; [M+H]⁺ 489;

1H-RMN (DMSO-d6) δ ppm: 1,1 (t, 3H); 2,3 - 2,7 (m, 6H); 3,2 - 3,4 (m, 7H);

4,3-6,0 (m, 4H); 5,1 (d, 1H) 6,9-8,0 (m, 9H); 10,6 (bs, 1H); 12,1 (br, 1H).

(3) N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-

c]pirazol-3-il}-4-(4-isopropilpiperazin-1 -il)benzamida; [M+H]⁺ 503;

1H-RMN (DMSO-d6) δ ppm: 1,3-1,3 (dd, 6H); 3,3 - 3,4 (m, 9H); 4,6 - 4,9 (m, 4H); 5,1 (d, 1H); 7,0 - 8,0 (m, 9H); 10,7 (bs, 1H); 12,3 (bs, 1H).

(4) N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-

c]pirazol-3-il}-4-(4-ciclopropilpiperazin-1 -il)benzamida; [M+H]⁺ 501;

H-RMN (DMSO-d6) δ ppm: 0,3 - 0,5 (m, 4H); 3,2 - 3,4 (m, 7H); 3,2 - 5,0 (m, 4H); 5,1 (d, 1H); 6,8 - 8,2 (m, 9H); 10,5 -10,7 (br, 1H); 12,0 -12,4 (br,1H).

(5) 4-(3,4-dimetilpiperazin-1 -il)-N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6tetrahidropirrol[3, 4-c]pirazol-3-il}benzamida;

[M+H] + 489; 1 H-RMN (DMSO-d₆) δ ppm: 1,0-1,1 (m, 3H); 2,24 (s, 3H); 3,3-

3,5 (m, 7H); 4,3-5,0 (m, 4H); 5,1 (d, 1H); 6,9-8,0 (m, 9H); 10,6 (bs,1H); 11,9-

12,6 (br,1H).

(6) N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3- il}-4-pi peridin -1 -il-benzamida;

[M+H] + 460; 1H-RMN (DMSO-d₆) δ ppm: 1,5-1,7 (m, 6H); 3,2 - 3,4 (m, 7H);

4,3-4,9 (m, 4H); 5,1 (d, 1H); 6,9 - 8,0 (m, 9H); 10,4-10,7 (br,1H).

(7) 4-(4-fluoropiperidin-1-il)-N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-metóxi-2-feniletanoil]-

1,4,5,6- tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}benzamida;

[M+H] + 478; 1 H-RMN (DMSO-d₆) δ ppm: 1,65 - 2,1 (m, 4H); 3,5 - 3,6 (m, 7H); 4,35 -5,0 (m, 5H); 5,1 (d,1H); 6,9 - 8,0 (m, 9H); 10,4 -10,7 (br,1H).

(8) N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3il}-4-morfolin-4-ilbenzamida; [M+H] + 462 ;1 H-RMN (DMSO-d6) δ ppm: 3,15 3,5(m, 7H); 3,7 - 3,8 (m,4H) ; 4,3 - 4,9 (m, H); 5,1 (d, 1H); 6,9 - 8,0 (m, 9H); 10,4-10,7 (br, 1H).

(9) 4-(4-terc-butilpiperazin-1 -il)-N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il]benzamida ; [M+H]+ 517.

(10) N-{5-[(2R)-2-hidróxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol [3,4-c]pirazol3-il}-4-(4-metilpiperazin-1-il)benzamida ; [M+H] + 461; 1 H-RMN (DMSO-d₆) δ ppm: 2,3 (s, 3H); 2,45 - 2,65 (m, 4H); 3,2 -3,4 (m, 4H); 4,1 - 4,9 (m, 4H); 5,69 (d,1 H); 6,9-8,0 (m, 9H); 10,4-10,7 (br,1 H); 11,5-12,9 (br, 1H).

(11) N-{5-[(2R)-2-metil-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3il}-4- (4-metilpiperazin-1-il) benzamida; [M+H]+ 459; 1 H-RMN (DMSO-d₆) δ ppm: 1,33 (d, 3H); 2,21 (s, 3H); 3,85 - 5,0 (m, 5H); 4,2 - 4,9 (m, 4H); 5,1 (s,1H), 6,8 -8,0 (m, 9H); 10,3 -10,7 (br,1H); 11,8-12,5 (br, 1H).

(12) N-{5-[(2R)-2-metil-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3il}-4-(4-etilpiperazin-1-il) benzamida; [M+H] + 473 ; 1 H-RMN (DMSO-d₆) δ ppm: 1,06 (t, 3H); 1,36 (d, 3H); 2,41 (q, 2H); 2,47 - 2,6 (m, 4H); 3,2 - 3,4 (m, 4H); 3,9 - 5,0 (m, 5H); 6,9 - 8,0 (m, 9H); 10,5 (bs, 1H); 11,9 - 12,5 (br, 1 H).

(13) N-{5-[(2R)-2-metil-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3il}(4-isopropilpiperazin-1-il)benzamida; [M+H] + 487;

(14) N-{5-[(2R)-2-metil-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3, 4-c]pirazol-3il}(4-ciclopropilpiperazin-1-il)benzamida; [M+H]+ 485;

(15) 4-(3,4-dimetilpiperazin-1 -il)-N-{5-[(2R)-2-fenilpropanoil]-1,4,5,6tetrahidropirrol[3, 4-c]pirazol-3-il}benzamida; [M+H] + 473;

(16) N-{5-[(2R)-2-fenilpropanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}-4 piperidin-1-ilbenzamida; [M+H] + 444; 1H-RMN (DMSO-d₆) δ ppm: 1,37 (d, 3H); 1,6 (s, 6H); 3,2 - 3,4 (m, 4H); 3,90 - 4,05 (m, 1 H); 4,1 - 4,9 (m, 4H); 6,9 -8, 0(m, 9H); 10,4-10,7 (br, 1H);

(17) (4-fluoropiperidin-1-il)-N-{5-[(2R)-2-metil-2-feniletanoil]-1,4,5,6- tetrahi- dropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}benzamida; [M+H] + 462; 1H-RMN (DMSO-d₆) δ ppm: 1,37 (d, 3H); 1,65 - 2,05 (m, 4H); 3,15 - 3,6 (m, 7H); 3,2 - 3,4 (m, 4H);

3,85 - 4,07 (m, 1H); 4,1 - 5,05 (m, 5H); 5,1 (d, 1H) ; 6,9 - 8,0 (m, 9H); 10,4 -

10,7 (br, 1H).

(18) N-{5-[(2R)-2-metil-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3- il]-4-morfolin-4-ilbenzamida; [M+H]+ 446; 1H-RMN (DMSO-de) δ ppm: 1,37 (d, 3H); 3,2 - 3,4 (m, 4H); 3,7 - 3,85 (m, 4H); 3,9 - 4,1 (m,1 H); 4,1 - 4,95 (m, 4H); 6,9 - 8,0 (m, 9H); 10,4 - 10,7 (br,1 H).

(19) 4-(4-terc-butilpiperazin-1 -il)-N-[5-[(2R)-2-fenilpropanoil]-1,4,5,6tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il]benzamida; [M+H]+ 501.

Claims

REIVINDICAÇÕES

(1) N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol [3,4-c] pirazol-3il}-4-(4-metilpiperazin-1-il) benzamida;

«1 onde R é hidrogênio ou metila;

Ri é um grupo C1-C3 alcóxi linear ou ramificado;

R2 é um átomo de hidrogênio ou halogênio;

X é um grupo divalente selecionado de metileno (-CH2-) ou fluorometileno (CHF-), ou é um grupo de heteroátomo ou heteroatômico selecionado de oxigênio (-O-) ou nitrogênio (-NR'-) onde

R' é um átomo de hidrogênio, um grupo de C1-C4 alquila reto ou ramificado ou um grupo de C3 - C6 cicloalquila; ou um sal farmaceuticamente aceitável destes.

1. Uso de um composto de fórmula (I)

R

onde R é hidrogênio ou metila;

Ri é um grupo C1-C3 alcóxi linear ou ramificado;

R2 é um átomo de hidrogênio ou halogênio;

X é um grupo divalente selecionado de metileno (-CH2-) ou fluorometileno (CHF-), ou é um grupo de heteroátomo ou heteroatômico selecionado de oxigênio (-O-) ou nitrogênio (-NR'-) onde

R' é um átomo de hidrogênio, um grupo de C1-C4 alquila reto ou ramificado ou um grupo de C3 - C6 cicloalquila; ou um sal farmaceuticamente aceitável destes, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para tratar distúrbios proliferativos celulares selecionados do grupo consistindo em câncer, doença de Alzheimer, infecções virais, doenças autoimunes e distúrbios neurodegenerativos.
(2) N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c] pirazol-3il}-4-(4-etilpiperazin-1-il) benzamida;

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo consistindo em carcinoma, carcinoma de célula escamosa, tumores hematopoiéticos de linhagem mielóide ou linfóide, tumores de origem mesenquimatosa, tumores do sistema nervoso central e periférico, melanoma, seminoma, teratocarcinoma, osteossarcoma, xeroderma pigmentoso, ceratoxantoma, câncer folicular de tireóide, e sarcoma de Kaposi.
(3) N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol [3,4-c]pirazol-3il}-4-(4-isopropilpiperazin-1-il) benzamida;

3. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o distúrbio proliferativo celular é selecionado do grupo consistindo em

Petição 870190078582, de 14/08/2019, pág. 6/14 hiperplasia da próstata benigna, adenomatose polipose familiar, neurofibromatose, psoríase, proliferação de célula lisa vascular associada com aterosclerose, fibrose pulmonar, artrite, glomerulonefrite e restenose e estenose pós-cirúrgica.
(4) N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3il}-4-(4-ciclopropilpiperazin-1-il)benzamida;

4. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (I)

R
(5) 4-(3,4-dimetilpiperazin-1 -il)-N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}benzamida;

5. Composto de fórmula (I) de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que

R é hidrogênio ou metila;

Ri é metóxi;

R2 é um átomo de hidrogênio ou flúor;

X é selecionado de metileno, fluorometileno, -O- ou -NR', onde R' é como definido na reivindicação 4.

Petição 870190078582, de 14/08/2019, pág. 7/14
(6) N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6-tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3il}-4-piperidin-1-il-ibenzamida;

6. Composto de fórmula (I), como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, opcionalmente, é na forma de sal farmaceuticamente aceitável, selecionado do grupo consistindo em:
7. Processo para preparar os compostos de fórmula (I) e os sais farmaceuticamente aceitáveis destes, como definidos na reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende: a) reagir um composto de fórmula (II) com um composto de fórmula (III) o

COO-tBu onde

R e X são como definido na reivindicação 4,

Petição 870190078582, de 14/08/2019, pág. 8/14

Q é um grupo de alquila inferior, t-Bu representa terc-butila e Z é hidróxi ou um grupo de saída adequado, a fim de obter um composto de fórmula (IV)

b) reagir o composto de fórmula (IV) sob condições acídicas a fim de obter um composto de fórmula (V)

c) reagir o composto de fórmula (V) com

um composto de fórmula (VI) onde Ri e R2 são como definido na reivindicação 4 e Z' representa hidróxi ou um grupo de saída adequado, a fim de obter um composto de fórmula (VII)

Petição 870190078582, de 14/08/2019, pág. 9/14

R

Rt

d) reagir o composto de fórmula (VII) sob condições básicas a fim de obter o correspondente composto de fórmula (I) e, se desejado, convertê-lo em um sal farmaceuticamente aceitável deste.

(7) 4-(4-fluoropiperidin-1 -il)-N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}benzamida;
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que, nos compostos de fórmula (II), Q representa um grupo C1-C4 alquídico reto ou ramificado.

(8) N-{5-[(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5, 6-tetrahidropirrol[3, 4-c] pirazol-3il}-4-morfolin-4-ilbenzamida;
9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que Q é metila ou etila.

(9) 4- (4-terc-butilpiperazin-1-il)-N-{5- [(2R)-2-metóxi-2-feniletanoil]-1,4,5,6- tetrahidropirrol[3,4-c]pirazol-3-il}benzamida.
10. Processo acordo com a reivindicação 7 caracterizado pelo fato de que, nos compostos de fórmula (III) e (VI), Z e Z' são, cada qual independentemente, hidróxi ou um átomo de halogênio.
11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o átomo de halogênio é cloro.
12. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é realizada sob condições acídicas na presença de ácido clorídrico, trifluoroacético ou metanossulfônico.
13. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a etapa (d) é realizada sob condições básicas na presença de hidróxido de lítio, potássio ou sódio, ou de uma amina terciária tal como trietilamina.
14. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, como definido na

Petição 870190078582, de 14/08/2019, pág. 10/14 reivindicação 4, e um excipiente, veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável.
15. Composto de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de 5 que para uso como um medicamento.