KR20050123180A - 재조합 코마모나스 테스토스테로니 5-ｍｇａｍ-4ｄ 아미드및 카르복실산 생산 - Google Patents

Abstract

본 발명은 코마모나스 테스토스테로니(Comamonas testosteroni) 5-MGAM-4D로부터의 니트릴 하이드라타제(NHase) 또는 아미다제(Am)를 코딩하는 유전자의 분리, 서열결정 및 재조합 발현에 관한 것으로서, NHase는 특정 니트릴의 상응하는 아미드로의 수화를 촉매하는데 유용하고 아미다제는 특정 아미드의 상응하는 카르복실산으로의 가수분해에 유용하다. 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 니트릴 하이드라타제 또는 아미다제 효소를 발현하기 위한 폴리뉴클레오티드를 함유하는 형질전환된 숙주세포가 또한 제공된다

Description

재조합 코마모나스 테스토스테로니 5-ＭＧＡＭ-4Ｄ 아미드 및 카르복실산 생산{Recombinant Comamonas Testosteroni 5-MGAM-4D Amides and Carboxylic acid Production}

본 발명은 분자생물학 분야 및 재조합 미생물에서 외래 유전자의 분리 및 발현방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 코마모나스 테스토스테로니(Comamonas testosteroni) 5-MGAM-4D로부터의 니트릴 하이드라타제(NHase) 또는 아미다제(Am)를 코딩하는 핵산 단편(유전자)의 분리, 서열결정 및 재조합 발현에 관한 것으로서, NHase는 특정 니트릴의 상응하는 아미드로의 수화를 촉매하는데 유용하고, 아미다제는 특정 아미드를 상응하는 카르복실산으로 가수분해하는데 유사하게 유용하다.

니트릴 하이드라타제는 니트릴에 대한 물 한 분자의 첨가를 촉매하여, 반응식 1에 따라 상응하는 아미드의 형성을 일으킨다:

반응식 1 R-CN + H₂O → RCONH₂

유사하게, 카르복실산의 제조방법이 알려져 있고 아미다제(Am) 활성을 갖는 효소를 생산하는 미생물을 이용한다. 일반적으로, 아미다제는 반응식 2에 따라 반응식 1의 아미드 산물을 상응하는 카르복실산 + 암모니아로 전환한다:

반응식 2 RCONH₂ → RCOOH + NH₃

로도코커스(Rhodococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 알칼리제네스(Alcaligenes), 아쓰로박터(Arthrobacter), 바실러스(Bacillus), 박테리디움(Bacteridium), 브레비박테리움(Brevibacterium), 코리네박테리움(Corynebacterium) 및 마이크로코커스(Micrococcus)를 포함하는, 광범위하게 다양한 세균 속이 다양한 스펙트럼의 니트릴 하이드라타제와 아미다제 활성을 갖는 것으로 알려져 있다(Martinkova 및 Kren, Biocatalysis and Biotransformation, 20: 73-93(2002); Cowan 등, Extremophiles, 2: 207-216(1998)). 예를 들어, 니트릴 하이드라타제 효소는 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis) B23(Nishiyama 등, J. Bacteriol., 173: 2465-2472(1991)), 로도코커스 로도크러스(Rhodococcus rhodochrous) J1(Kobayashi 등, Biochem. Biophys. Acta, 1129: 23-33(1991)), 브레비박테리움 sp. 312(Mayaux 등, J. Bacteriol., 172: 6764-6773(1990)), 로도코커스 sp. N-774(Ikehata 등, Eur. J. Biochem., 181: 563-570(1989)) 및 슈도모나스 퓨티다(Pseudomonas putida) 5B NRRL-18668(Payne 등, Biochemistry, 36: 5447-5454(1997))로부터 분리되어 있다.

니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 것으로 알려져 있는 야생형 미생물이 니트릴을 상응하는 아미드로 전환하는데 사용되어 왔다. Nagasawa 등(Appl. Microbiol. Biotechnol., 40: 189-195(1993))은 아크릴로니트릴로부터 아크릴아미드의 상업적 생산을 위해 사용된 세 미생물 니트릴 하이드라타제 촉매를 비교하였다; 로도코커스 로도크러스 J1의 니트릴 하이드라타제 활성에 비해, 브레비박테리움 R312와 슈도모나스 클로로라피스 B23의 니트릴 하이드라타제 활성은 10 ℃ 초과에서는 안정하지 않았다. Cowan 등(상기)은 많은 중온 니트릴 하이드라타제가 20-35 ℃의 성장 온도 범위에서 매우 짧은 효소 활성 반감기를 가져, 현저하게 불안정하다고 보고하였다. 온도 불안정성에 더하여, 니트릴 하이드라타제를 함유하는 미생물 촉매는 아크릴로니트릴과 같은 특정 기질의 높은 농도에 의한 불활성화에 감수성일 수 있다. 상업적 사용에서, 아크릴로니트릴의 농도는, 7wt% 이하의 농도가 R. 로도크러스 J1과 함께 사용되었음에 비해, 브레비박테리움 R312 및 P. 클로로라피스 B23 촉매를 사용할 때 1.5-2wt%로 유지되었다(상기 Nagasawa 등). 유사하게, Padmakumar 및 Oriel(Appl. Biochem. Biotechnol., 77-79: 671-679(1999))은 바실러스 sp. BR449가 열안정성 니트릴 하이드라타제를 발현하지만, 아크릴로니트릴의 아크릴아미드로의 수화에 사용될 때, 효소의 불활성화가 단지 2wt%의 아크릴로니트릴 농도에서 일어나, 이 촉매를 상업적 적용에 부적절하게 만든다고 보고하였다. Webster 등(Biotechnology Letters, 23: 95-101(2001))은 암모늄 아크릴레이트 생산을 위한 촉매로서 두 로도코커스 분리물을 비교하고(단지 니트릴라제 활성만을 갖는 것과 단지 니트릴 하이드라타제와 아미다제 활성의 결합만을 갖는 것), 니트릴 하이드라타제와 아미다제 활성의 결합을 갖는 촉매가 (a) 두 효소를 요구되는 비율로 유도함에 있어서의 어려움, (b) 두 효소(니트릴 하이드라타제와 아미다제)의 아크릴로니트릴에 의한 불활성화에 대한 감수성, 및 (c) 각각의 산물에 의한 두 효소의 저해로 인해 덜 바람직하다고 결론내렸다.

야생형 유기체의 사용에 더하여, 니트릴 하이드라타제의 발현을 위한 이종 유전자를 함유하는 재조합 유기체가 또한 니트릴의 전환을 위해 알려져 있다. 예를 들어, Cerebelaud 등(WO 9504828)은 C. 테스토스테로니(C. testosteroni)로부터 분리된 니트릴 하이드라타제 유전자의 E. 콜라이(E. coli)에서의 분리와 발현을 교시하고 있다. 형질전환된 숙주는 하나의 니트릴과 하나의 카르복실레이트 군으로 구성된 기질을 포함하여, 니트릴을 아미드로 효과적으로 전환한다. Endo 등은 로도코커스 N-771의 니트릴 하이드라타제를 발현하는 E. 콜라이 형질전환체의 생산을 개시하고 있다(US 6,316,242B1). 유사하게, Beppu 등(EP 5024576)은 형질전환된 숙주가 나중에 효소 기질로서 이소부티로니트릴과 이소부티르아미드를 사용할 수 있는 E. 콜라이를 형질전환할 수 있는 로도코커스로부터의 니트릴 하이드라타제와 아미다제 둘다를 운반하는 플라스미드를 개시하고 있다. 슈도모나스 퓨티다 5B로부터의 입체선택적 니트릴 하이드라타제가 E. 콜라이에서 과잉생산되었다(Wu 등, Appl. Microbiol. Biotechnol., 48: 704-708(1997); US 5,811,286).

아미다제 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자가 또한 재조합 유기체에서 클로닝, 서열결정 및 발현되었다. 예를 들어, Azza 등(FEMS Microbiol. Lett., 122: 129(1994))은 천연 프로모터의 제어 하에 브레비박테리움 sp. R312로부터의 아미다제의 E. 콜라이에서의 클로닝 및 과잉-발현을 개시하고 있다. 유사하게, Kobayashi 등(Eur. J. Biochem., 217: 327(1993))은 R. 로도코커스 J1으로부터의 니트릴 하이드라타제와 아미다제 둘다의 클로닝과 E. 콜라이에서의 그들의 공동-발현을 개시하고 있다. Wu 등(DNA Cell Biol., 17: 915-920(1998); US 6,251,650)은 E. 콜라이에서의 슈도모나스 퓨티다 5B로부터의 아미다제 유전자의 클로닝과 과잉발현을 보고하고 있다.

출원인은 이전에 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D(ATCC 55744; US 5,858,736 및 US 5,922,589)를 분리한 바 있다. 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D는 다양한 니트릴의 그들의 상응하는 아미드 및 카르복실산으로의 전환에 유용한 열적으로 안정하고, 위치특이적인 니트릴 하이드라타제(EC 4.2.1.84)와 아미다제(EC 3.5.1.4) 활성을 갖는 것으로 나타나 있다. 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D 니트릴 하이드라타제와 아미다제 활성의 유용성을 입증하는 방법이 출원인에 의해 이전에 기재된 바 있다. 이들 용도는 이로써 참조에 의해 도입되는, 지방족 α,ω-디니트릴로부터 락탐의 위치특이적 제조(US 5,858,736), 3-하이드록시니트릴의 3-하이드록시산으로의 생물학적 전환(US 2002/0039770A1), 및 메타크릴니트릴과 아크릴로니트릴의 그들의 상응하는 카르복실산으로의 생물학적 전환(USSN 10/067,652)을 포함한다. 그러나, 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 니트릴 하이드라타제와 아미다제를 코딩하는 핵산 단편의 분리 및 재조합 발현은 이해하기 어려웠다.

해결하고자 하는 문제점은 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 열-안정성, 위치선택적 니트릴 하이드라타제 및 아미다제 효소를 코딩하는 유전자를 제공하고 이들 촉매를 발현하는 형질전환체를 제공하는 것이다.

부가적으로, 아미드 또는 카르복실산을 효율적으로 제조하기 위해 니트릴 하이드라타제/아미다제 활성을 갖는 미생물 촉매를 사용하는 산업적 방법의 개발은 어려운 것으로 입증되었다. 상응하는 니트릴로부터 이들 산물을 제조하기 위하여 효소 촉매를 사용하는 많은 방법들은 상업적 필요를 충족시키기에 충분히 높은 농도로 산물을 생산 및 축적하지 못하거나, 반응 과정 동안 효소 불활성화(반응 과정에 걸쳐 니트릴의 낮은 농도를 요구하는)나 산물 저해를 받기 쉽다.

해결하고자 하는 부가적인 문제점은 고 수율, 고 농도, 및 고 선택성을 특징으로 하고 니트릴 가수분해의 공지의 화학적 방법과 비교할 때 낮은 온도와 에너지 요구 및 낮은 폐기물 생산의 부가적 장점을 갖는 방법에서 니트릴을 상응하는 아미드나 산으로 전환하는 용이한 미생물 촉매의 결여가 계속되는 것이다. 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D는 열-안정성, 위치선택적 니트릴 하이드라타제 및 열-안정성 아미다제를 발현한다. 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D의 니트릴 하이드라타제 활성만을 갖는 효소 촉매는 니트릴 수화로부터 아미드 산물만을 목적으로 하는 용도에 매우 유용할 것이다.

발명의 요약

출원인은 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터 열-안정성, 위치선택적 니트릴 하이드라타제 및 아미다제를 발현하는데 필요한 유전자를 분리하고 서열결정하였다. 각 효소의 상응하는 아미노산 서열 또한 개시되어 있다. 본 발명은 또한 1) 서열번호 4에 의해 나타내어지는 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 니트릴 하이드라타제 효소의 폴리뉴클레오티드 알파-서브유닛에 90 내지 98% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드; 2) 서열번호 6에 의해 나타내어지는 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 니트릴 하이드라타제 효소의 폴리뉴클레오티드 베타-서브유닛에 80 내지 90% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드; 및 3) 아미다제 활성을 갖고 서열번호 17에 의해 나타내어지는 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 폴리펩티드에 90-95% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명은 추가로 니트릴 하이드라타제 효소의 최적 활성에 필요한 폴리펩티드("P7K"로 명명되고; 서열번호 14에 의해 나타내어지는)를 코딩하는 0.9 kb 단편(서열번호 9) 내에 포함되는 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D 게놈의 부위를 제공한다.

니트릴 하이드라타제나 아미다제 효소를 별도로 발현하거나 두 효소를 공동-발현하는 형질전환체가 제공된다. 또한 재조합 숙주에서 니트릴 하이드라타제와 아미다제 촉매를 제조하는 방법이 제공된다. 본 발명은 추가로 P7K 부속(accessory) 단백질과 함께 아미다제 및/또는 니트릴 하이드라타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된, 재조합 숙주를 제공한다.

본 발명의 특정 태양은 서열번호 11에 의해 나타내어지는 핵산 서열로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)이다.

출원인은 또한 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 니트릴 하이드라타제를 발현하는 형질전환된 숙주세포를 이용하여 다양한 지방족 또는 방향족 니트릴, 불포화 니트릴, 지방족 디니트릴 및 2-, 3-, 또는 4-하이드록시니트릴을 상응하는 아미드로 전환하는 방법을 제공한다. 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D는 열-안정성, 위치선택적 니트릴 하이드라타제 및 열-안정성 아미다제를 발현한다. 본 출원은 니트릴 수화로부터 아미드 산물만의 생산이 바람직한 적용에 사용하기 위한 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D의 니트릴 하이드라타제 활성만을 갖는 미생물 형질전환체의 제조를 기재하고 있다.

도면의 간단한 설명, 서열 설명 및 생물학적 기탁

본 발명은 함께 본 출원을 형성하는 도면, 서열목록, 생물학적 기탁 및 상세한 설명으로부터 더욱 완전히 이해될 수 있다.

도 1은 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D(ATCC 55744)로부터 클로닝된 유전자의 재조합 발현을 위해 창제된 몇몇 플라스미드에 삽입된 핵산 단편을 보여준다.

아래 서열은 37 C.F.R. 1.821-1.825("뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열 개시를 포함하는 특허출원에 대한 요건 - 서열 규칙")에 부합하고 세계지적재산권기구(WIPO) 표준 ST.25(1998) 및 EPO와 PCT의 서열목록 요건(규칙 5.2 및 49.5(a-bis) 및 행정적 지침의 208조 및 부록 C)에 일치한다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 데이터에 사용된 기호와 양식은 37 C.F.R. §1.822에 기재된 규칙에 부합한다.

서열번호 1은 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D(ATCC 55744)로부터의 게놈 DNA 단편을 프로브하는데 사용된 슈도모나스 퓨티다 5B(NRRL-18668)로부터의 니트릴 하이드라타제의 α-서브유닛을 코딩하는 핵산 서열이다.

서열번호 2는 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D(ATCC 55744)로부터의 게놈 DNA 단편을 프로브하는데 사용된 슈도모나스 퓨티다 5B(NRRL-18668)로부터의 니트릴 하이드라타제의 β-서브유닛을 코딩하는 핵산 서열이다.

서열번호 3은 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 니트릴 하이드라타제의 α-서브유닛을 코딩하는 핵산 서열이다.

서열번호 4는 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 니트릴 하이드라타제의 α-서브유닛에 대한 추론된 아미노산 서열이다.

서열번호 5는 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 니트릴 하이드라타제의 β-서브유닛을 코딩하는 핵산 서열이다.

서열번호 6은 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 니트릴 하이드라타제의 β-서브유닛에 대한 추론된 아미노산 서열이다.

서열번호 7은 pSW131의 창제에 사용된 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 니트릴 하이드라타제의 α- 및 β-서브유닛을 코딩하는 핵산 서열이다.

서열번호 8은 플라스미드 pSW131을 창제하기 위한 핵산 단편(서열번호 7)을 증폭하고 pSW137을 창제하기 위한 핵산 단편(서열번호 11)을 증폭하기 위해 유용한 두 프라이머 중 첫번째("프라이머 1")이다.

서열번호 9는 플라스미드 pSW131을 창제하기 위한 핵산 단편(서열번호 7)을 증폭하기 위해 유용한 두 프라이머 중 두번째("프라이머 2")이다.

서열번호 10은 활성 니트릴 하이드라타제의 발현에 유용한 부속 단백질("P7K"로 명명된)을 코딩하는 작은 오픈 리딩 프레임(ORF)을 함유하는 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 0.9 kb 핵산 단편의 핵산 서열이다.

서열번호 11은 pSW132 및 pSW137의 창제에 사용된 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 니트릴 하이드라타제의 α- 및 β-서브유닛 + 부속 단백질 P7K를 코딩하는 0.9 kb의 하류 DNA(서열번호 10)를 코딩하는 핵산 서열이다.

서열번호 12는 pSW137을 창제하기 위한 핵산 단편(서열번호 11)을 증폭하고 pSW136을 창제하기 위한 핵산 단편(서열번호 23)을 증폭하기 위해 유용한 두 프라이머 중 두번째("프라이머 3")이다.

서열번호 13은 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 부속 단백질 P7K를 코딩하고, 0.9 kb 하류 DNA 서열(서열번호 10) 내에서 발견되는 핵산 서열이다.

서열번호 14는 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D 니트릴 하이드라타제의 재조합 발현에 유용한 부속 단백질 P7K의 추론된 아미노산 서열이다.

서열번호 15는 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 아미다제를 동정하기 위한 프로브로서 유용한 pKP57 삽입체의 제1 0.6 kb를 포함하는 핵산 단편의 핵산 서열이다.

서열번호 16은 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 아미다제를 코딩하는 핵산 서열이다.

서열번호 17은 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 아미다제의 추론된 아미노산 서열이다.

서열번호 18은 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 아미다제, 니트릴 하이드라타제와 P7K 부속 단백질의 완전한 코딩 서열을 포함하는 7.4 kb 핵산 단편의 핵산 서열이다.

서열번호 19는 플라스미드 pKP60을 창제하기 위한 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 아미다제를 코딩하는 핵산 단편을 증폭하기 위해 유용한 두 프라이머 중 첫번째("프라이머 4")이다.

서열번호 20은 플라스미드 pKP60을 창제하기 위한 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 아미다제를 코딩하는 핵산 단편을 증폭하기 위해 유용한 두 프라이머 중 두번째("프라이머 5")이다.

서열번호 21은 플라스미드 pSW133을 창제하기 위한 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 아미다제를 코딩하는 핵산 단편을 증폭하고 pSW136을 창제하기 위한 핵산 단편(서열번호 23)을 증폭하기 위해 유용한 두 프라이머 중 첫번째("프라이머 6")이다.

서열번호 22는 플라스미드 pSW133을 창제하기 위한 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 아미다제를 코딩하는 핵산 단편을 증폭하기 위해 유용한 두 프라이머 중 두번째("프라이머 7")이다.

서열번호 23은 플라스미드 pSW136의 창제에 사용된 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 아미다제, 니트릴 하이드라타제(α- 및 β-서브유닛) 및 부속 단백질 P7K를 코딩하는 핵산 단편이다.

출원인은 특허 절차의 목적을 위한 미생물 기탁의 국제적 인정에 대한 부다페스트 조약의 규정 하에 아래 생물학적 기탁을 행하였다:

기탁자 식별 참조번호	국제 기탁번호	기탁일
코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D	ATCC 55744	1996년 3월 8일
슈도모나스 퓨티다 5B	NRRL 18668	1990년 7월 6일
에스케리키아 콜라이 SW132	ATCC PTA-5073	2003년 3월 21일
에스케리키아 콜라이 SW137	ATCC PTA-5074	2003년 3월 21일

여기에 사용된 바, "ATCC"는 USA, VA 20110-2209, 매나싸스, 유니버시티 Blvd., 10801, ATCC에 위치한 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 국제기탁기관을 말한다. "국제 기탁번호"는 ATCC에 기탁된 배양물에 대한 등록번호이다.

여기에 사용된 바, "NRRL"은 U.S.A., IL 61604, 페오리아, N. 유니버시티 스트리트 11815에 위치한, 애그리컬처럴 리서치 서비스 컬쳐 컬렉션 국제기탁기관, 노던 리저널 리서치 래보라토리를 말한다. "NRRL 번호"는 NRRL에 기탁된 배양물에 대한 등록번호이다.

수록된 기탁물은 적어도 삼십(30) 년간 표시된 국제기탁기관에 유지되고 그것을 개시한 특허의 허여 시 공중에게 이용가능하게 될 것이다. 기탁물의 입수가능성은 정부 조치에 의해 허여된 특허권을 손상시키는 대상 발명을 실시하는 실시권을 구성하지 않는다.

본 발명은 촉매로 작용하는 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D(ATCC 55744)로부터의 세 폴리펩티드(니트릴 하이드라타제의 α- 및 β-서브유닛 및 아미다제)를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 및 핵산 서열을 제공한다. 공동발현될 때, 니트릴 하이드라타제의 α- 및 β-서브유닛은 선별적으로 니트릴을 상응하는 아미드로 수화하고, 아미다제는 아미드를 상응하는 카르복실산으로 가수분해한다. 본 발명은 또한 폴리펩티드를 발현하는 형질전환된 미생물 숙주세포를 제공한다. 본 발명은 추가로 형질전환된 미생물을 이용하여 폴리펩티드 촉매를 제조하는 방법과 니트릴을 상응하는 아미드 및/또는 카르복실산으로 전환하거나, 아미드를 상응하는 카르복실산으로 전환하기 위하여 촉매를 사용하는 방법을 제공한다.

정의:

본 개시내용에서, 많은 용어와 약어가 사용된다. 구체적으로 다르게 진술되지 않으면 아래 정의가 적용된다.

용어 "촉매", "효소 촉매" 또는 "미생물 세포 촉매"는 니트릴 하이드라타제 활성, 아미다제 활성을 갖거나, 니트릴 하이드라타제와 아미다제 활성의 결합을 갖는 폴리펩티드(또는 단백질)를 말한다. 촉매는 완전한 미생물 세포, 투과화된 미생물 세포(들), 미생물 세포 추출물의 하나 이상의 세포 성분, 부분적으로 정제된 효소(들), 또는 정제된 효소(들)의 형태일 수 있다.

용어 "열-안정성"은 주어진 온도에 대한 노출에도 불구하고 활성을 보유하는 효소를 특징으로 한다.

용어 "코마모나스 테스토스테로니" 및 "C. 테스토스테로니"는 상호교환적으로 사용되며 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D(ATCC 55744)를 말한다.

용어 "슈도모나스 퓨티다 5B" 및 "P. 퓨티다 5B"는 상호교환적으로 사용되며 슈도모나스 퓨티다 NRRL-18668을 말한다.

용어 "에스케리키아 콜라이 SW132" 및 "E. 콜라이 SW132"는 상호교환적으로 사용되며 ATCC 등록번호 PTA-5073을 갖는 플라스미드 pSW132로 형질전환된 E. 콜라이 균주를 말한다.

용어 "pSW132"는 T7 프로모터의 제어 하에 C. 테스토스테로니 5-MGAM-4D 니트릴 하이드라타제 α- 및 β-서브유닛을 코딩하는 DNA 단편 + 0.9 kb의 하류 DNA를 함유하는 플라스미드를 말한다. 0.9 kb의 하류 DNA는 니트릴 하이드라타제의 재조합 발현에 유용한 부속 단백질("P7K")을 코딩한다. E. 콜라이 균주 SW132는 플라스미드 pSW132를 갖고 ATCC 등록번호 PTA-5073을 갖는다.

용어 "에스케리키아 콜라이 SW137" 및 "E. 콜라이 SW137"은 상호교환적으로 사용되며 ATCC 수탁번호 PTA-5074를 갖는 플라스미드 pSW137로 형질전환된 E. 콜라이 균주를 말한다.

용어 "pSW137"은 trc 프로모터의 제어 하에 C. 테스토스테로니 5-MGAM-4D 니트릴 하이드라타제 α- 및 β-서브유닛을 코딩하는 DNA 단편 + 0.9 kb의 하류 DNA를 함유하는 플라스미드를 말한다. 0.9 kb의 하류 DNA는 니트릴 하이드라타제의 재조합 발현에 유용한 부속 단백질("P7K")을 코딩한다. E. 콜라이 균주 SW137은 플라스미드 pSW137을 갖고 ATCC 등록번호 PTA-5074를 갖는다.

"오픈 리딩 프레임"은 ORF로 약칭된다.

"중합효소 연쇄 반응"은 PCR로 약칭된다.

여기에 사용된 바, "단리된 핵산 단편" 또는 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 임의로 합성, 비-자연 또는 변형된 뉴클레오티드 염기를 함유하는, 일- 또는 이본쇄인 RNA나 DNA의 폴리머이다. DNA의 폴리머 형태의 단리된 핵산은 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA의 하나 이상의 조각으로 이루어질 수 있다.

용어 "부속 핵산"은 니트릴 하이드라타제의 증가된 재조합 발현에 유용한 폴리펩티드(서열번호 14)를 코딩하는 오픈 리딩 프레임(서열번호 13)을 함유하는, 니트릴 하이드라타제 α(알파) 및 β(베타) 서브유닛 유전자의 하류에 위치하는, 0.9 kb 서열(서열번호 10)을 말한다.

용어 "상보적"은 서로 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 설명하는데 사용된다. 예를 들어, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이고 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서 본 발명은 또한 첨부된 서열목록에 보고된 완전한 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함한다.

당업계에 알려진 바와 같이, 용어 "백분율 상동성"은 서열들을 비교함으로써 결정되는 바와 같은, 두 개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 두 개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계이다. 당업계에서, "동일성"은 그러한 서열의 스트링 간의 매치에 의해 결정되는, 경우에 따라, 폴리펩티드나 폴리뉴클레오티드 서열 간의 서열 관련성의 정도를 의미한다. "동일성"과 "유사성"은 Computational Molecular Biology(Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY(1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects(Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY(1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part Ⅰ(Griffin, A. M., 및 Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ(1994); Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje, G., ed.) Academic Press(1987); 및 Sequence Analysis Primer(Gribskov, M. 및 Devereux, J., eds., Stockton Press, NY(1991))에 기재된 것들을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 공지의 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있다. 동일성을 결정하는 바람직한 방법은 시험 서열 간에 최상의 매치를 제공하도록 설계된다. 동일성과 유사성을 결정하는 방법은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램에서 암호화된다. 서열 정렬과 백분율 동일성은 LASERGENE 바이오인포매틱스 컴퓨팅 스위트(WI, 매디슨, DNASTAR Inc.)의 Megalign 프로그램을 이용하여 수행될 수 있다. 서열의 다중 정렬이 디폴트 지수(갭 패널티=10, 갭 길이 페널티=10)를 갖는 CLUSTAL 정렬방법(Higgins 및 Sharp CABIOS. 5: 151-153(1989))을 이용하여 수행될 수 있다. CLUSTAL 방법을 이용하는 쌍 정렬을 위해 전형적으로 사용되는 디폴트 지수는 KTUPLE 1, 갭 패널티=3, 윈도우=5 및 다이아고날즈 세이브드=5이다.

"코돈 축퇴"는 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않으면서 뉴클레오티드 서열의 변화를 허용하는 유전자 코드의 성질을 말한다. 따라서, 본 발명은 서열번호 4, 6, 14 및 17에 기재된 본 미생물 폴리펩티드를 코딩하는 아미노산 서열의 모두 또는 실질적인 부분을 코딩하는 어느 핵산 단편에 관한 것이다. 당업자는 주어진 아미노산을 특정하는 뉴클레오티드 코돈의 사용에 있어서 특정 숙주세포에 의해 나타내어지는 "코돈-편향"을 잘 알고 있다. 따라서, 숙주세포에서 개선된 발현을 위해 유전자를 합성할 때, 그의 코돈 사용 빈도가 숙주세포의 선호되는 코돈 사용 빈도에 접근하도록 유전자를 설계하는 것이 바람직하다.

"합성 유전자"는 당업자에게 알려진 방법을 이용하여 화학적으로 합성되는 올리고뉴클레오티드 조립 블락으로부터 조립될 수 있다. 이들 조립 블락은 결찰되고 어닐링되어 나중에 전체 유전자를 제작하기 위해 효소적으로 조립되는 유전자 조각을 형성한다. DNA의 서열에 관련된 바, "화학적으로 합성된"은 성분 뉴클레오티드가 시험관 내에서 조립되었음을 의미한다. DNA의 수동 화학 합성이 잘 확립되어 있는 과정을 이용하여 달성되거나, 자동화된 화학 합성이 많은 상업적으로 이용가능한 기계 중 하나를 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 유전자는 숙주세포의 코돈 편향을 반영하기 위한 뉴클레오티드 서열의 최적화에 기초하여 최적 유전자 발현을 위해 맞추어질 수 있다. 당업자는 코돈 이용이 숙주에 의해 선호되는 그들 코돈 쪽으로 편향되는 경우 성공적인 유전자 발현의 가능성을 이해한다. 선호되는 코돈의 결정은 서열 정보가 이용가능한 숙주세포로부터 유래된 유전자의 조사에 기초할 수 있다.

"유전자"는 코딩 서열에 앞서고(5' 비-코딩 서열) 뒤따르는(3' 비코딩 서열) 조절 서열을 포함하는, 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 말한다. "천연 유전자"는 그 자신의 조절 서열을 갖는 자연에서 발견되는 것과 같은 유전자를 말한다. "키메라 유전자"는 자연에서 함께 발견되지 않는, 조절 및 코딩 서열을 포함하는, 천연 유전자가 아닌 어느 유전자를 말한다. 따라서, 키메라 유전자는 상이한 출처로부터 유래된 조절 서열과 코딩 서열, 또는 동일한 출처로부터 유래되었지만, 자연에서 발견되는 것과 상이한 방식으로 배열된 조절 서열과 코딩 서열을 포함할 수 있다. "내생성 유전자"는 유기체의 게놈에서 그의 본래 위치에 있는 천연 유전자를 말한다. "외래" 유전자는 숙주 유기체에서 정상적으로 발견되지 않지만, 유전자 도입에 의해 숙주 유기체로 도입된 유전자를 말한다. 외래 유전자는 비-천연 유기체로 삽입된 천연 유전자나, 키메라 유전자를 포함할 수 있다. "형질전환유전자"는 형질전환 과정에 의해 게놈으로 도입된 유전자이다.

"코딩 서열"은 특정 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 말한다. "적당한 조절 서열"은 관련 코딩 서열의 전사, RNA 가공 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 미치는 코딩 서열의 상류(5' 비코딩 서열), 내부 또는 하류(3' 비코딩 서열)에 위치한 뉴클레오티드 서열을 말한다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 가공 위치, 효과기 결합 위치 및 스템-루프 구조를 포함할 수 있다.

"프로모터"는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 말한다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열의 3'에 위치하고 있다. 프로모터는 천연 유전자로부터 그들 전체로 유래되거나, 자연에서 발견되는 상이한 프로모터로부터 유래된 상이한 요소로 구성되거나, 심지어 합성 DNA 조각을 포함할 수 있다. 상이한 프로모터가 상이한 조직이나 세포 타입이나, 발생의 상이한 단계에서, 또는 상이한 환경적 또는 생리적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있음이 당업자에 의해 이해된다. 유전자가 대부분의 시간에 대부분의 세포 타입에서 발현되도록 하는 프로모터는 보편적으로 "구성적 프로모터"로 언급된다. 대부분의 경우 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 정의되지 않았기 때문에, 상이한 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있음이 추가로 인식된다.

용어 "작동가능하게 연결된"은 하나의 기능이 나머지에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상의 핵산 서열의 결합을 말한다. 예를 들어, 프로모터는 그것이 그 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있을 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다(즉, 코딩 서열이 프로모터의 전사 제어 하에 있음). 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.

여기에 사용된 바, 용어 "발현"은 본 발명의 핵산 단편으로부터 유래된 센스(mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사와 안정한 축적을 가리킨다. 발현은 또한 mRNA의 폴리펩티드로의 번역을 가리킬 수 있다.

"형질전환"은 유전적으로 안정한 유전성을 초래하는, 숙주 유기체의 게놈으로의 핵산 단편의 도입을 말한다. 형질전환된 핵산 단편을 포함하는 숙주 유기체를 "형질전환" 또는 "재조합" 또는 "형질전환된" 유기체로 언급된다.

용어 "탄소 기질"은 본 발명의 숙주 유기체에 의해 대사될 수 있는 탄소 원을 말하고, 특히 지방족 카르복실산 또는 디카르복실산, 단당류, 올리고당류, 다당류, 및 1-탄소 기질로 이루어진 군으로부터 선택되지만, 그들로 제한되지 않는 탄소원이나 그의 혼합물을 말한다.

출원인의 발명에 특히 관련있는 니트릴은 화학식 1 R-C≡N 또는 화학식 2 N≡C-R-C≡N(여기에서 N은 질소이고, C는 탄소이며, R은 a) 선형, 분지형 또는 사이클릭의, 임의로 치환된 C₁-C₉ 알킬; b) 선형, 분지형 또는 사이클릭의, 임의로 치환된 C₁-C₉ 알케닐; 및 c) 임의로 치환된, C₁-C₉ 아릴로 이루어진 군으로부터 선택된다)의 니트릴이다. 화학식 1의 R은 C₁, C₂ 또는 C₃ 위치 상에서 하이드록실 군으로 임의로 치환된다. 본 발명에서 특히 유용한 니트릴은 아크릴로니트릴, 메타크릴로니트릴, 3-하이드록시프로피오니트릴, 3-하이드록시부티로니트릴, 3-하이드록시발레로니트릴, 부티로니트릴, 아디포니트릴, 벤조니트릴 및 글리콜로니트릴을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

용어 "플라스미드", "벡터" 및 "카세트"는 세포의 중심 대사의 일부가 아닌 유전자를 자주 운반하고, 보통 환상의 이본쇄 DNA 단편 형태로 있는 염색체 외 요소를 말한다. 그러한 요소는 많은 뉴클레오티드 서열이 적절한 3' 비번역 서열과 함께 프로모터 서열과 선택된 유전자 산물의 DNA 서열을 세포로 도입할 수 있는 독특한 제작물로 결합 또는 재조합되는, 어느 출처로부터 유래된 일- 또는 이본쇄 DNA 또는 RNA의, 선형 또는 환상의, 자가 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. "형질전환 카세트"는 외래 유전자를 함유하고 특정 숙주세포의 형질전환을 용이하게 하는 외래 유전자에 부가적인 요소를 갖는 특정 벡터를 말한다. "발현 카세트"는 외래 유전자를 함유하고 외래 숙주에서 그 유전자의 증진된 발현을 허용하는 외래 유전자에 부가적인 요소를 갖는 특정 벡터를 말한다.

용어 "변형된 생물학적 활성"은 활성이 천연 미생물 서열과 관련된 활성 보다 크거나 작은, 어세이 방법에 의해 측정될 수 있는 미생물 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드(단백질)와 관련된, 활성을 말한다. "증진된 생물학적 활성"은 천연 서열과 관련된 것 보다 더 큰 변형된 활성을 말한다. "감소된 생물학적 활성"은 천연 서열과 관련된 것 보다 더 작은 변형된 활성을 말한다.

용어 "적당한 수성 반응 혼합물" 또는 "적당한 반응 혼합물"은 니트릴 및/또는 아미드 기질과 효소 촉매가 접촉하는 물질과 물을 말한다. 적당한 수성 반응 혼합물의 성분이 여기에서 언급되고 당업자는 이 방법에 적당한 성분 변화 범위를 이해한다.

용어 "서열 분석 소프트웨어"는 뉴클레오티드나 아미노산 서열의 분석에 유용한 어느 컴퓨터 알고리즘이나 소프트웨어 프로그램을 말한다. "서열 분석 소프트웨어"는 상업적으로 이용가능하거나 독립적으로 개발될 수 있다. 전형적인 서열 분석 소프트웨어는 GCG 스위트 프로그램(WI, 매디슨, 제네틱스 컴퓨터 그룹(GCG), 위스콘신 팩키지 버전 9.0), BLASTP, BLASTN, BLASTX(Altschul 등, J. Mol. Biol. 215: 403-410(1990), 및 DNASTAR(USA, WI 53715, 매디슨, S. 파크 St. 1228, DNASTAR, Inc.), 및 Smith-Waterman 알고리즘(W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.](1994), 미팅일 1992, 111-20. 편집인(들): Suhai, Sandor. 발행인: NY, 뉴욕, Plenum)을 도입한 FASTA 프로그램을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 용어 "MEME"는 숨겨진 마르코프(Markov) 모델에 기초하여 보존된 진단 모티프를 동정하는데 사용되는 소프트웨어 프로그램을 말한다(Timothy L. Bailey 및 Charles Elkan, Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in biopolymers, Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, 28-36면, AAAI Press, Menlo Park, CA(1994)). "MAST"(Timothy L. Bailey 및 Michael Gribskov, "Combining evidence using p-values: application to sequence homology searches" Bioinformatics, 14권, 48-54면(1998))는 MEME 프로그램으로부터의 출력을 취하고 EMBL 또는 스위스프롯과 같은 단백질 데이터베이스에 대해 동정된 모티프를 검색하는 프로그램이다. 본 출원의 문맥 내에서 서열 분석 소프트웨어가 분석을 위해 사용되는 경우, 분석의 결과는 다르게 특정되지 않으면, 참조된 프로그램의 "디폴트 값"에 기초함이 이해될 것이다. 여기에 사용된 바 "디폴트 값"은 처음 초기화될 때 소프트웨어로 원래 로딩하는 값 또는 지수의 어느 세트를 의미할 것이다.

여기에 사용되는 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 잘 알려져 있고 Sambrook, J., Fritsch, E. F. 및 Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(1989)(이하 "Maniatis"); 및 Silhavy, T. J., Bennan, M. L. 및 Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Press Spring Harbor, NY(1984)(이하 "Silhavy"); 및 Ausubel, F. M. 등, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. 및 Wiley-Interscience에 의해 발행됨(1987)(이하 "Ausubel")에 의해 설명된다.

서열 동정

코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 니트릴 하이드라타제 α 및 β-서브유닛과 아미다제의 본 아미노산 서열의 공중 데이터베이스에 대한 비교는 대부분의 유사한-공지 서열이 모두 슈도모나스 퓨티다 5B(NRRL-18688: US 5,811,286 및 Wu 등, Appl. Microbiol. Biotechnol. 48: 704-708(1997)을 참조하라)로부터 유래되었음을 밝혔다. 니트릴 하이드라타제 α-서브유닛은 P. 퓨티다 5B로부터의 상응하는 니트릴 하이드라타제 α-서브유닛에 약 97.1% 동일하였다(표 1). 니트릴 하이드라타제 β-서브유닛은 P. 퓨티다 5B로부터의 상응하는 니트릴 하이드라타제 β-서브유닛에 약 82.0% 동일하였다. 마지막으로, 아미다제는 P. 퓨티다 5B로부터의 상응하는 아미다제에 약 92.3% 동일하였다.

서열 분석 결과

유전자 명칭	동정된 유사성	%동일성a	%유사성b	E-값c	인용
아미다제	Gi｜6225048｜sp｜O69768｜AMID_PSEPU	92.3	92.5	0	Wu 등, DNA Cell Biol. 17(10), 915-920(1998)
니트릴하이드라타제α-서브유닛	Gi｜2499193｜sp｜P97051｜NHAA_PSEPU	97.1	97.1	10e-108	Payne 등,Biochemistry 36(18),5447-5454(1997)
니트릴하이드라타제β-서브유닛	Gi｜2499195｜sp｜P97052｜NHAB_PSEPU	82.0	82.5	6e-92	Payne 등,Biochemistry 36(18)5447-5454(1997)

^a 동일성은 두 단백질 간에 동일한 아미노산의 백분율로 정의된다.

^b 유사성은 두 단백질 간에 동일하거나 보존된 아미노산의 백분율로 정의된다.

^c 기대값. 기대값은 절대적으로 우연히 이 크기의 데이터베이스의 검색에서 기대되는, 주어진 점수를 갖는 매치의 수를 특정하는, 매치의 통계적 유의성을 평가한다.

코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D의 니트릴 하이드라타제와 아미다제 효소의 슈도모나스 퓨티다 5B(NRRL-18688)의 것들에 대한 서열 유사성에도 불구하고, 첨부된 실시예는 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D 니트릴 하이드라타제 효소(E. 콜라이 형질전환체 SW132에서 발현된)의 열적 안정성과 반응 조건 하에서의 안정성이 슈도모나스 퓨티다 5B 니트릴 하이드라타제(E. 콜라이 형질전환체 SW30에서 발현된, 상기 Wu 등)에 상이하고 현저히 우수함을 입증한다.

동족체의 동정

본 서열은 동족체의 동정을 위한 혼성화 시약으로 사용될 수 있다. 핵산 혼성화 시험의 기본적 성분은 프로브, 관심있는 유전자 또는 유전자 단편을 함유하는 것으로 추측되는 샘플, 및 특정 혼성화 방법을 포함한다. 본 발명의 프로브는 전형적으로 검출하고자 하는 핵산 서열에 상보적인 일본쇄 핵산 서열이다. 프로브는 검출하고자 하는 핵산 서열에 "혼성화 가능"하다. 프로브 길이는 5 염기에서 수만 염기까지 변화할 수 있으며, 행하고자 하는 특정 시험에 의존할 것이다. 전형적으로 약 15 염기 내지 약 30 염기의 프로브 길이가 적당하다. 단지 일부만의 프로브 분자가 검출하고자 하는 핵산 서열에 상보적일 필요가 있다. 또한, 프로브와 표적 서열 간의 상보성은 완전할 필요가 없다. 혼성화는 불완전하게 상보적인 분자 사이에 일어나 혼성화된 부위에 있는 염기의 특정 분획이 적당한 상보적인 염기와 쌍을 형성하지 않는 결과를 낳는다.

혼성화 방법은 잘 규명되어 있다. 전형적으로 프로브와 샘플은 핵산 혼성화를 허용하는 조건 하에서 혼합되어야 한다. 이것은 적당한 농도와 온도 조건 하에서 무기 또는 유기 염의 존재 하에 프로브와 샘플을 접촉시키는 것을 포함한다. 프로브와 샘플 핵산은 프로브와 샘플 핵산 간에 어느 가능한 혼성화가 일어날 수 있는 충분히 긴 시간 동안 접촉되어야 한다. 혼합물에 있는 프로브나 표적의 농도는 혼성화가 일어나는데 필요한 시간을 결정할 것이다. 프로브나 표적 농도가 높을수록 필요한 혼성화 인큐베이션 시간이 짧아진다. 임의로 무질서유발제가 첨가될 수 있다. 무질서유발제는 뉴클레아제 활성을 저해함으로써 핵산을 안정화한다. 더욱이, 무질서유발제는 실온에서 짧은 올리고뉴클레오티드 프로브의 민감하고 엄격한 혼성화를 허용한다(Van Ness 및 Chen, Nucl. Acids Res., 19: 5143-5151(1991)). 적당한 무질서유발제는 특히 구아니디움 클로라이드, 구아니디움 티오시아네이트, 나트륨 티오시아네이트, 리튬 테트라클로로아세테이트, 나트륨 퍼클로레이트, 루비듐 테트라클로로아세테이트, 칼륨 요오다이드, 및 세슘 트리플루오로아세테이트를 포함한다. 전형적으로, 무질서유발제는 약 3 M의 최종 농도로 존재할 것이다. 필요한 경우, 혼성화 혼합물에 전형적으로 30-50%(v/v)로 포름아미드를 첨가할 수 있다.

다양한 혼성화 용액이 사용될 수 있다. 전형적으로, 이들은 약 20 내지 60% 부피, 바람직하게는 30%의, 극성 유기용매를 포함한다. 보편적 혼성화 용액은 약 30-50% v/v 포름아미드, 약 0.15 내지 1 M 염화나트륨, 나트륨 시트레이트, Tris-HCl, PIPES 또는 HEPES(pH 범위 약 6-9)와 같은, 약 0.05 내지 약 0.1 M의 완충액, 나트륨 도데실설페이트와 같은, 약 0.05 내지 0.2%의 계면활성제 또는 0.5-20 mM EDTA, FICOLL(약 300-500 킬로달톤), 폴리비닐피롤리돈(약 250-500 kdal) 및 혈청 알부민을 사용한다. 전형적인 혼성화 용액 중에 약 0.1 내지 5 ㎎/㎖의 비표지 담체 핵산, 단편화된 핵 DNA, 예를 들어 송아지 흉선 또는 연어 정자 DNA, 또는 효모 RNA, 및 임의로 약 0.5 내지 2% 중량/부피 글리신이 또한 포함될 것이다. 폴리에틸렌글리콜과 같은 다양한 극성 수용성 또는 수팽윤성 물질, 폴리아크릴레이트 또는 폴리메타크릴레이트와 같은 음이온성 폴리머, 및 황산덱스트란과 같은 음이온성 당 폴리머를 포함하는 부피 배제 물질과 같은, 다른 첨가제가 또한 포함될 수 있다.

핵산 혼성화는 다양한 어세이 포맷에 적합화될 수 있다. 가장 적당한 것 중 하나는 샌드위치 어세이 포맷이다. 샌드위치 어세이는 특히 비변성 조건 하에서의 혼성화에 적합화될 수 있다. 샌드위치-타입 어세이의 일차 성분은 고상 지지체이다. 고상 지지체는 그것에 흡착되거나 그것에 공유적으로 커플링된 비표지되고 서열의 일 부분에 상보적인 고정화된 핵산 프로브를 갖는다.

미생물 재조합 발현

본 서열의 유전자와 유전자 산물은 이종 숙주세포, 특히 미생물 숙주 세포에서 생산될 수 있다. 재조합 미생물 숙주에서의 발현은 다양한 경로 중간체의 발현; 숙주에 이미 존재하는 경로의 변조, 또는 숙주를 이용하여 지금까지 가능하지 않았던 새로운 산물의 합성을 위해 유용할 수 있다.

본 유전자와 핵산 단편의 발현을 위해 바람직한 이종 숙주세포는 진균 또는 세균 훼밀리 내에 광범위하게 발견될 수 있고 광범위한 온도, pH 값, 및 용매 내성에 걸쳐 성장하는 미생물 숙주이다. 예를 들어, 세균, 효모 및 필라멘트상 진균 중 어느 것이 본 핵산 단편의 발현을 위해 적당한 숙주일 것이다. 전사, 번역 및 단백질 생합성 장치가 세포 공급원료에 무관하게 동일하기 때문에, 기능적 유전자는 세포 생체량을 생성하는데 사용되는 탄소 공급원료에 무관하게 발현된다. 대규모 미생물 성장 및 기능적 유전자 발현은 광범위한 간단하거나 복잡한 탄수화물, 유기산 및 알콜, 광합성 또는 화학자가영양 숙주의 경우 메탄이나 이산화탄소와 같은 포화 탄화수소를 이용할 수 있다. 그러나, 기능적 유전자는 질소, 인, 황, 산소, 탄소 또는 작은 무기 이온을 포함하는 어느 미량 미세영양분의 형태와 양을 포함할 수 있는, 특정 성장 조건에 의해 조절, 억제 또는 저하될 수 있다. 또한, 기능적 유전자의 조절은 배양물에 첨가되고 전형적으로 영양분이나 에너지원으로 간주되지 않는 특정 조절 분자의 존재나 부재에 의해 달성될 수 있다.

숙주 균주의 예는 아스퍼질러스(Aspergillus), 트로코더마(Trichoderma), 사카로마이세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia), 캔디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 살모넬라(Salmonella), 바실러스(Bacillus), 아시네토박터(Acinetobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 아그로박테리움(Agrobacterium), 에리쓰로박터 클로로비움(Erythrobacter Chlorobium), 크로마티움(Chromatium), 플라보박테리움(Flavobacterium), 사이토파가(Cytophaga), 로도박터(Rhodobacter), 로도코커스(Rhodococcus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 브레비박테리움(Brevibacterium), 코리네박테리아(Corynebacteria), 마이코박테리움(Mycobacterium), 데이노코커스(Deinococcus), 에스케리키아(Escherichia), 어위니아(Erwinia), 판토에아(Pantoea), 슈도모나스(Pseudomonas), 스핑고모나스(Sphingomonas), 메틸로모나스(Methylomonas), 메틸로박터(Methylobacter), 메틸로코커스(Methylococcus), 메틸로시누스(Methylosinus), 메틸로마이크로비움(Methylomicrobium), 메틸로시스티스(Methylocystis), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 알칼리제네스(Alcaligenes), 시네코시스티스(Synechocystis), 시네코코커스(Synechococcus), 아나바에나(Anabaena), 티오바실러스(Thiobacillus), 메타노박테리움(Methanobacterium), 크렙시엘라(Klebsiella), 믹소코커스(Myxococcus) 및 스타피로코커스(Staphylococcus)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

높은 수준의 외래 단백질의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 미생물 발현 시스템 및 발현 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있다. 이들 중 어느 것도 본 니트릴 하이드라타제, 아미다제 및 P7K의 발현을 위한 키메라 유전자를 제작하는데 사용될 수 있다. 이들 키메라 유전자는 그런 다음 형질전환을 통해 적절한 미생물로 도입되어 효소의 고-수준 발현을 제공할 수 있다.

따라서 예를 들어, 적절한 프로모터의 제어 하에 본 세균 효소를 코딩하는 키메라 유전자의 도입은 증가된 니트릴의 아미드 및/또는 카르복실산 전환을 입증할 것으로 기대된다. 천연 숙주 세포 및 이종 숙주 둘다에서 본 유전자를 발현하는 것이 유용할 것으로 생각된다. 천연 숙주로의 본 유전자의 도입은 변화된 수준의 현존 니트릴 하이드라타제 및 아미다제 활성을 초래할 것이다. 부가적으로, 본 유전자는 또한 현존하는 니트릴-아미드-카르복실산 경로가 조작될 수 있는 비-천연 숙주 세균으로 도입될 수 있다.

적당한 숙주세포의 형질전환을 위해 유용한 벡터나 카세트는 당업계에 잘 알려져 있다. 전형적으로 벡터나 카세트는 관련 유전자의 전사와 번역을 지시하는 서열, 선별마커, 및 자가 복제 또는 염색체 통합을 허용하는 서열을 포함한다. 적당한 벡터는 전사 개시 제어를 갖는 유전자의 5' 부위와 전사 종결을 제어하는 DNA 단편의 3' 부위를 포함한다. 그러한 제어 부위가 생산 숙주로서 선택된 특정 종에 천연적인 유전자로부터 유래될 필요는 없을지라도, 양 제어 부위가 형질전환된 숙주세포에 동종인 유전자로부터 유래될 때 가장 바람직하다.

목적으로 하는 숙주세포에서 본 ORF의 발현을 유도하는데 유용한 개시 제어 부위 또는 프로모터는 수많으며 당업자에게 익숙하다. CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI(사카로마이세스에서의 발현을 위해 유용한); AOX1(피치아에서의 발현을 위해 유용한); 및 lac, ara, tet, trp, IP_L, IP_R, T7, tac 및 trc(에스케리키아 콜라이에서의 발현을 위해 유용한) 및 바실러스에서의 발현을 위해 유용한 amy, apr, npr 프로모터 및 다양한 파지 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 이들 유전자를 유도할 수 있는 거의 어떠한 프로모터도 본 발명을 위해 적당하다.

종결 제어 부위 또한 바람직한 숙주에 천연인 다양한 유전자로부터 유래될 수 있다. 임의로, 종결 위치는 불필요할 수 있다; 그러나, 포함되면 가장 바람직하다.

유전적 경로를 조작하는 방법은 관용적이고 당업계에 잘 알려져 있다. 특정 경로에서 선택된 유전자는 다양한 방법에 의해 상향-조절되거나 하향-조절될 수 있다. 부가적으로, 경쟁 경로가 유전자 파괴 및 유사한 기술에 의해 제거되거나 순화될 수 있다.

일단 핵심 유전적 경로가 확인되거나 서열결정되면, 특정 유전자가 경로의 산출량을 증가시키기 위하여 상향-조절될 수 있다. 예를 들어, 표적 유전자의 부가적인 카피가 pBR322와 같은 다중카피 플라스미드 상에서 숙주세포로 도입될 수 있다. 대안으로, 표적 유전자는 비-천연 프로모터의 제어 하에 있도록 변형될 수 있다. 경로가 세포 주기의 특정 점에 또는 발효 실행 동안 작동하는 것이 바람직한 경우, 조절 또는 유도성 프로모터가 표적 유전자의 천연 프로모터를 대체하기 위해 사용될 수 있다. 유사하게, 일부 경우 천연 또는 내생 프로모터가 유전자 발현을 증가시키기 위하여 변형될 수 있다. 예를 들어, 내생 프로모터가 돌연변이, 결실 및/또는 치환에 의해 생체 내에서 변형될 수 있다(Kmiec, US 5,565,350; Zarling 등, PCT/US93/03868을 참조하라).

대안으로는, 경로 또는 에너지 또는 탄소에 대해 경쟁하는 싱크(sinks)로 역할할 수 있는 경쟁 경로에서 어느 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하는 것이 필요할 수 있다. 이 목적을 위해 유전자를 하향-조절하는 방법이 탐구되었다. 파괴하고자 하는 유전자의 서열이 알려져 있을 때, 유전자 하향 조절의 가장 효과적인 방법 중 하나는 전사를 파괴하도록 외래 DNA가 구조 유전자로 삽입되는 표적화된 유전자 파괴이다. 이것은 파괴하고자 하는 유전자 부분에 높은 정도의 상동성을 갖는 서열에 의해 연결되는 삽입하고자 하는 DNA(자주 유전적 마커)를 포함하는 유전자 카세트의 창제에 의해 수행될 수 있다. 숙주세포로의 카세트의 도입은 세포의 천연 DNA 복제 기작을 통해 구조 유전자로의 외래 DNA의 삽입을 초래한다(Hamilton 등, J. Bacteriol. 171: 4617-4622(1989); Balbas 등, Gene 136: 211-213(1993); Gueldener 등, Nucleic Acids Res. 24: 2519-2524(1996); 및 Smith 등, Methods Mol. Cell. Biol. 5: 270-277(1996)).

안티센스 기술은 표적 유전자의 서열이 알려져 있는 경우 유전자를 하향조절하는 또다른 방법이다. 이것을 달성하기 위하여, 목적하는 유전자로부터의 핵산 조각이 클로닝되고 RNA의 안티센스 쇄가 전사되도록 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 그런 다음 이 제작물은 숙주세포로 도입되고 RNA의 안티센스 쇄가 생산된다. 안티센스 RNA는 관심있는 단백질을 코딩하는 mRNA의 축적을 방지함으로써 유전자 발현을 저해한다. 당업자는 특정 유전자의 발현을 감소시키기 위하여 특별한 고려가 안티센스 기술의 사용과 관련됨을 알 것이다. 예를 들어, 적당한 수준의 안티센스 유전자 발현은 당업자에게 알려져 있는 상이한 조절 요소를 이용하는 상이한 키메라 유전자의 사용을 요구할 수 있다.

표적화된 유전자 파괴 및 안티센스 기술이 서열이 알려진 경우 유전자를 하향조절하는 효과적인 수단을 제공하지만, 서열 기초하지 않은 다른 덜 특이적인 방법론이 개발되어 있다. 예를 들어, 세포는 UV 조사에 노출된 후 목적하는 표현형에 대해 스크리닝될 수 있다. 화학물질로의 돌연변이유발 또한 돌연변이를 생성하는데 효과적이며 보편적으로 사용되는 물질은 HNO₂ 및 NH₂OH와 같은 비-복제 DNA에 영향을 미치는 화학물질, 및 프레임쉬프트 돌연변이를 유발하는 것으로 주목할만한 아크리딘 염료와 같은 복제 DNA에 영향을 미치는 물질을 포함한다. 조사나 화학물질을 이용하여 돌연변이를 창제하는 구체적인 방법은 당업계에 잘 문헌화되어 있다(예를 들어, Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology. 2판(1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA.(이하 "Brock"), 또는 Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36: 227(1992)(이하 "Deshpande")를 참조하라).

유전자 파괴의 다른 비-특이적 방법은 전좌 요소(transposable elements)나 트랜스포존의 사용이다. 트랜스포존은 DNA에 무작위로 삽입하지만 나중에 서열에 기초하여 회수되어 어디서 삽입이 일어났는지 결정할 수 있는 유전자 요소이다. 생체 내 및 시험관 내 전좌 방법이 알려져 있다. 양 방법은 트랜스포자제 효소와 함께 전좌 요소의 사용을 포함한다. 전좌 요소 또는 트랜스포존이 트랜스포자제 존재 하에 핵산 단편과 접촉될 때, 전좌 요소는 무작위로 핵산 단편으로 삽입할 것이다. 파괴된 유전자가 전좌 요소의 서열에 기초하여 확인될 수 있으므로, 이 기술은 무작위 돌연변이유발과 유전자 분리에 유용하다. 시험관 내 전좌를 위한 키트가 상업적으로 입수가능하다(예를 들어 효모 Ty1 요소에 기초한, NJ, 브랜치버그, 퍼킨 엘머 어플라이드 바이오시스템즈로부터 입수가능한, 더 프라이머 아일랜드 전좌 키트; MA, 베버리, 세균 트랜스포존 Tn7에 기초한 뉴 잉글랜드 바이오랩스로부터 입수가능한, 더 게놈 프라이밍 시스템; 및 Tn5 세균 전좌 요소에 기초한, WI, 매디슨, 에피센터 테크놀로지즈로부터 입수가능한 EZ::TN 트랜스포존 삽입 시스템즈를 참조하라).

생물촉매의 산업적 생산

여기에 개시된 니트릴 하이드라타제 촉매(α- 및 β-서브유닛 및 임의로, 부속 단백질 P7K의 유전자에 의해 코딩되는)를 갖는 형질전환체를 이용하여 아미드를 제조하기 위한 생물촉매의 상업적 생산은 다양한 배양 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 특정 유전자 산물의 대규모 생산은 회분 및 연속 배양 방법론에 의해 생산될 수 있다.

고전적인 회분 배양방법은 배지의 조성이 배양 시작 시 설정되고 배양 과정 동안 인공적인 변화를 받지 않는 폐쇄 시스템이다. 따라서, 배양 과정의 시작 시 배지는 목적으로 하는 유기체 또는 유기체들로 접종되고 시스템으로 아무 것도 첨가하지 않으면서 성장 또는 대사 활성이 일어나도록 허용된다. 그러나, 전형적으로, "회분" 배양은 탄소원의 첨가에 관하여 회분식이고 pH와 산소 농도와 같은 인자를 제어하는 시도가 자주 행해진다. 회분 시스템에서 시스템의 대사물 및 생체량 조성은 배양이 종결되는 시간까지 계속 변화한다. 회분 배양물 내에서 세포는 정지된 지체기를 통해 고성장 대수기로 마지막으로 성장속도가 감소되거나 정지되는 정지기로 조정된다. 무처리되면, 정지기에 있는 세포는 결국 죽는다. 대수기에 있는 세포는 자주 일부 시스템에서 최종 산물이나 중간체의 생산의 대부분을 담당한다. 정지 또는 대수기 후 생산은 다른 시스템에서 얻어질 수 있다.

표준 회분식 시스템에 대한 변형이 유가(Fed-batch) 시스템이다. 유가 배양방법이 또한 본 발명에 적당하고 배양이 진행함에 따라 기질이 증가하여 첨가되는 것을 제외하고는 전형적인 회분 시스템을 포함한다. 유가 시스템은 이화물 억제가 세포의 대사를 저해하기 쉬울 때와 배지에서 제한된 양의 기질을 갖는 것이 바람직한 경우 유용하다. 유가 시스템에서 실제 기질 농도의 측정은 어렵고 따라서 pH, 용존산소 및 CO₂와 같은 폐 기체의 분압과 같은 측정가능한 인자에 기초하여 평가된다. 회분 및 유가 배양방법은 보편적이고 당업계에 잘 알려져 있으며 예들이 Brock(상기)과 Deshpande(상기)에서 발견될 수 있다.

생물촉매의 상업적 생산은 또한 연속 배양으로 달성될 수 있다. 연속 배양은 정해진 배양 배지가 연속적으로 생물반응기로 첨가되고 동량의 조정된 배지가 가공을 위해 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 연속 배양은 일반적으로 세포가 일차적으로 대수기 성장에 있는 일정한 고-액체-상 밀도로 세포를 유지시킨다.

연속 또는 반-연속 배양은 세포 성장 또는 최종산물 농도에 영향을 미치는 하나의 인자 또는 어느 수의 인자의 변조를 허용한다. 예를 들어, 하나의 방법은 고정된 비율로 탄소원이나 질소 수준과 같은 제한 영양분을 유지시키고 모든 다른 지수가 조정되도록 하는 것일 것이다. 다른 시스템에서는 배지 탁도에 의해 측정되는, 세포 농도가 일정하게 유지되는 반면, 성장에 영향을 미치는 많은 인자가 연속적으로 변화될 수 있다. 연속 시스템은 정상상태 성장 조건을 유지하려고 노력하고 따라서 유출되는 배지로 인한 세포 유실은 배양물에서 세포 성장속도에 대해 균형잡혀져야만 한다. 연속 배양방법을 위한 영영분 및 성장 인자를 변조하는 방법과 산물 형성의 속도를 최대화하는 방법은 산업 미생물학의 기술분야에 잘 알려져 있고 다양한 방법이 상기 Brock에 의해 상술되어 있다.

본 발명에서의 발효 배지는 적당한 탄소 기질을 함유하여야 한다. 적당한 기질은 지방족 카르복실산 및 디카르복실산(락트산이나 석신산과 같은), 글리세롤, 단당류(글루코스와 프럭토스와 같은), 이당류(락토스나 슈크로스와 같은), 올리고당류(가용성 전분과 같은), 다당류(전분 또는 셀룰로스 또는 그들의 혼합물과 같은), 및 재생가능한 공급원료로부터의 비정제 혼합물(유청 치즈 투과물, 옥수수 침지수, 사탕무 당밀 및 보리 맥아와 같은)을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다. 부가적으로 탄소 기질은 또한 핵심 생화학적 중간체로의 대사 전환이 입증된 이산화탄소, 메탄 또는 메탄올과 같은 일탄소 기질일 수도 있다. 일 및 이탄소 기질에 더하여, 메탄올자화 유기체는 또한 메틸아민, 글루코사민, 및 대사 활성을 위한 다양한 아미노산과 같은 많은 다른 탄소-함유 화합물을 이용하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 메탄올자화 효모는 메틸아민으로부터 탄소를 이용하여 트레할로스나 글리세롤을 형성하는 것으로 알려져 있다(Bellion 등, Microb. Growth C1 Compd., [Int. Symp.], 7th(1993), 415-32. 편집인(들): Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. 발행인: Intercept, Andover, UK). 유사하게, 다양한 종의 캔디다가 알라닌이나 올레산을 대사할 것이다(Sulter 등, Arch. Microbiol. 153: 485-489(1990)). 따라서, 본 발명에서 사용되는 탄소원은 광범위하게 다양한 탄소-함유 기질을 포함할 수 있으며 단지 사용되는 미생물에 의해서 제한될 것으로 생각된다.

니트릴의 아미드 또는 카르복실산으로의 생물촉매 전환

지방족 또는 방향족 니트릴을 함유하는 수성 반응 혼합물이 니트릴을 적절한 효소 촉매의 수성 현탁액과 혼합하여 제조된다. 완전한 미생물 세포가 투과화나 가열과 같은, 어떠한 전처리도 없이 촉매로 사용될 수 있다. 대안으로, 촉매의 회수와 재사용을 용이하게 하기 위하여 세포가 폴리머 매트릭스(예를 들어, 알기네이트, 카라기난, 폴리비닐알콜, 또는 폴리아크릴아미드 젤(PAG)) 또는 가용성 또는 불용성 지지체(예를 들어, 셀라이트, 실리카)에 고정화될 수 있다. 폴리머 매트릭스나 가용성 또는 불용성 지지체 상에 세포를 고정화하는 방법은 널리 보고되어 있고 당업자에게 잘 알려져 있다. 효소는 또한 미생물 세포로부터 분리되어 직접 촉매로서 사용되거나, 효소는 폴리머 매트릭스나 가용성 또는 불용성 지지체 상에 고정화될 수 있다. 이들 방법은 또한 널리 보고되어 있으며 당업자에게 잘 알려져 있다(Methods in Biotechnology, 1권: Immobilization of Enzymes and Cells; Gordon F. Bickerstaff, 편집인; Humana Press,Totowa,NJ, USA; 1997).

니트릴 하이드라타제 활성이나 아미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 함유하거나, 니트릴 하이드라타제와 아미다제 활성을 별도로 갖는 폴리펩티드의 배합물을 코딩하는 유전자를 함유하는, 고정화 또는 비고정화된, 완전한 미생물 세포가 투과화, 동결 해동 또는 가열과 같은, 어떠한 전처리도 없이 촉매로 사용될 수 있다. 대안으로, 미생물 세포는 세포 내부 및 외부로의 물질의 확산속도를 향상시키기 위하여 당업자에게 익숙한 방법(예를 들어, 톨루엔, 계면활성제, 또는 동결-해동으로의 처리)에 의해 투과화될 수 있다(Felix, H., Anal. Biochem., 120: 211-234(1982)).

본 발명에서 출발물질로 사용되는 지방족 또는 방향족 니트릴의 일부는 단지 적당히 수용성일 뿐이다. 그들의 용해도는 또한 용액의 온도와 수성 상에서의 염 농도에 의존한다; 완충제의 선택적 포함, 또는 상응하는 아미드의 가수분해에 의한 카르복실산의 암모늄 염의 생산이 반응 혼합물에서 두 가능한 염의 출처이다. 본 경우에서, 출발 지방족 또는 방향족 니트릴의 용해도 한계 보다 높은 농도로 수화 또는 가수분해된 반응산물을 생산하는 것이 처음에 두 상으로 이루어진 반응 혼합물을 이용하여 달성된다: 수성 상(효소 촉매와 용해된 지방족 또는 방향족 니트릴을 함유하는) 및 유기상(수성 상과 혼합되지 않는 유기용매에 임의로 용해된, 비용해된 지방족 또는 방향족 니트릴). 반응이 진행함에 따라, 지방족 또는 방향족 니트릴은 수성 상으로 용해하여, 최종적으로 산물의 수 용해도, 및 물과 혼합되지 않는 임의의 유기용매의 존재나 부재에 따라, 단일 상일 수 있는 산물 혼합물을 생성시킨다.

2-상 반응 혼합물의 수성 상은 최소한 단지 a) 지방족 또는 방향족 니트릴의 상응하는 아미드 또는 카르복실산으로의 완전한 전환(활성 니트릴 하이드라타제만이나 활성 하이드라타제와 아미다제 효소의 결합물이 존재하느냐에 따라), 및 b) 효소 촉매의 가수분해 활성의 유지를 초래하기에 충분한 양만의 물을 함유할 수 있다. 반응은 또한 지방족 또는 방향족 니트릴을 반응 혼합물에 효소 수화 또는 가수분해 반응속도와 대략 동일한 속도로 첨가함으로써, 단일-상 수성 반응 혼합물을 유지하고, 높은 출발물질 농도로 효소의 기질 저해의 잠재적인 문제점을 방지함으로써 실행될 수 있다.

상응하는 지방족 또는 방향족 니트릴의 완전한 전환 시 산물 혼합물에 있는 용액 중 지방족 또는 방향족 아미드 또는 카르복실산의 최종 농도는 산물 혼합물 중 0.001 M 내지 지방족 또는 방향족 니트릴의 용해도 한계 범위일 수 있다. 반응 과정 동안 산물은 반응 혼합물로부터 침전하여, 반응 혼합물 중 상기 산물의 용해도 초과로 아미드나 카르복실산의 생산을 허용할 수 있다. 전형적으로, 산물 혼합물의 용액 중 지방족 또는 방향족 아미드 또는 카르복실산 산물의 농도는 0.001 M 내지 7.0 M 범위이다. 지방족 또는 방향족 아미드 또는 카르복실산은 또한 반응의 산물이 카르복실산일 때 농축된 HCl로 반응 혼합물의 pH를 2.0 내지 2.5로 임의로 조정하고, 생성된 용액을 염화나트륨으로 포화시키고, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 메틸이소부틸케톤 또는 디클로로메탄과 같은 적당한 유기용매로 지방족 또는 방향족 아미드 또는 카르복실산을 추출함으로써 산물 혼합물로부터 분리될 수 있다(촉매의 제거 후). 그런 다음 유기 추출물을 합하고, 적당한 건조제(예를 들어, 황산마그네슘)로 교반하고, 여과하고, 용매를 제거(예를 들어, 회전 증발에 의해)하여 목적 산물을 고 수율 고 순도(전형적으로 98-99% 순수한)로 생산한다. 원하는 경우, 산물은 재결정화나 증류에 의해 추가로 정제될 수 있다.

반응 혼합물 중 효소 촉매의 농도는 효소 촉매의 비 촉매활성에 의존하고 목적하는 반응속도를 얻도록 선택된다. 가수분해 반응에서 촉매로 사용되는 미생물 세포의 습윤 세포 중량은 전형적으로 총 반응 부피 ㎖ 당 습윤 세포 0.001 그램 내지 0.300 그램, 바람직하게는 ㎖ 당 습윤 세포 0.002 그램 내지 0.050 그램 범위이다; 세포는 상기한 바와 같이 임의로 고정화될 수 있다. 미생물 세포의 비 활성(IU/그램 건조 세포 중량)은 기지 중량의 미생물 세포 촉매를 이용하여, 25 ℃에서 목적하는 아미드 또는 카르복실산 산물로의 니트릴 기질의 0.10-0.50 M 용액의 전환속도를 측정함으로써 결정된다. 효소 활성의 IU는 분 당 1 마이크로몰의 기질을 산물로 전환하는데 요구되는 효소 활성의 양으로 정의된다.

가수분해 반응의 온도는 반응속도와 효소 촉매의 안정성 둘다를 최적화하도록 선택된다. 반응 온도는 반응 혼합물의 어는점 바로 위(약 0 ℃)에서 65 ℃ 범위에 있을 수 있고, 바람직한 범위의 반응 온도는 5 ℃ 내지 45 ℃이다. 효소 촉매 용액 또는 현탁액은 비고정화 또는 고정화된 세포를 증류수나, 반응의 최초 pH를 5.0 내지 10.0, 바람직하게는 6.0 내지 8.0으로 유지하는 완충액의 수성 반응 혼합물에 현탁하거나, 고정화된 효소 촉매를 유사한 혼합물에 현탁하거나, 세포 추출물 용액, 부분적으로 정제되거나 정제된 효소(들), 또는 고정화된 효소의 가용성 형태를 유사한 혼합물에서 제조함으로써 제조될 수 있다. 니트릴을 첨가한 후 반응이 진행함에 따라, 반응 혼합물의 pH는 지방족 또는 방향족 니트릴의 상응하는 니트릴 기능기로부터 카르복실산의 암모늄염의 형성으로 인해 변화할 수 있다(니트릴 하이드라타제와 아미다제 효소의 결합물을 사용할 때). 반응은 pH 제어 없이 니트릴을 완전히 전환하도록 실행될 수 있거나, 목적하는 pH를 유지하기 위하여 적당한 산이나 염기가 반응 과정에 걸쳐 첨가될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 바람직한 태양을 나타내는 아래 실시예에서 추가로 정의된다. 위 논의와 이들 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 필수적 특성을 확실하게 알 수 있으며, 그것을 다양한 용도와 조건에 적용하기 위하여, 그의 요지와 범위를 벗어나지 않으면서, 본 발명의 다양한 변화와 변형을 가할 수 있다.

아래 실시예에서, 니트릴의 백분율 회수와, 상응하는 아미드와 카르복실산 산물의 백분율 수율은 반응 혼합물에 존재하는 니트릴의 최초 농도에 기초한 것이고, 굴절 지수 검출기를 이용하여 HPLC에 의해 결정되었다. 3-하이드록시발레로니트릴, 아디포니트릴, 부티로니트릴, 벤조니트릴 및 메타크릴로니트릴, 및 그들의 상응하는 반응산물의 분석을 25 ℃에서 프리칼럼을 갖는 Supelco LC-18-DB 칼럼(15 ㎝×4.6 ㎜ 직경) 및 1.5 ㎖/분에서 용출제로서 물 중 7.5% 메탄올 중 10 mM 아세트산, 10 mM 아세트산나트륨을 사용하여 수행하였다. 글리콜로니트릴, 아크릴로니트릴, 3-HPN, 3-HBN 및 그들의 상응하는 반응 산물의 분석을 50 ℃에서 프리칼럼을 갖는 바이오-래드 HPX-87H 유기산 분석 칼럼(30 ㎝×7.8 ㎜ 직경) 및 1.5 ㎖/분에서 용출제로서 0.010 N NH₂SO₄를 사용하여 HPLC에 의해 수행하였다.

일반적 방법

실시예에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 잘 알려져 있고 Maniatis(상기) 및 Ausubel(상기)에 의해 설명되어 있다.

세균 배양물의 유지와 성장에 적당한 재료와 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 아래 실시예에서 사용하기에 적당한 기술은 Manual of Methods for General Bacteriology(Phillip Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg 및 G. Briggs Philips, eds., American Society for Microbiology, Washington, DC(1994)) 또는 상기 Brock에 기재된 바와 같이 발견될 수 있다.

본 명세서에서 아래 약어는 아래와 같이 측정 단위, 기술, 성질 또는 화합물에 해당한다: "sec"은 초(들)를 의미하고, "min"은 분(들)을 의미하며, "h"는 시간(들)을 의미하고, "d"는 일(들)을 의미하며, "㎖"은 밀리리터를 의미하고, "ℓ"은 리터를 의미하며, "mM"은 밀리몰라를 의미하고, "M"은 몰라를 의미하며, "mmol"은 밀리몰(들)을 의미하고, "rpm"은 분당 회전수를 의미하며, "slpm"은 분당 표준 리터를 의미하고, "psig"는 평방 인치당 파운드를 의미하며, "wt"는 중량을 의미한다. "HPLC"는 고성능 액체 크로마토그래피를 의미한다. "ca"는 대략을 의미하고, "O.D."는 지정된 파장에서의 광학 밀도를 의미하며, "dcw"는 건조 세포 중량을 의미하고, "IU"는 국제단위를 의미한다.

실시예 1

C. 테스토스테로니 5-MGAM-4D 니트릴 하이드라타제를 코딩하는

게놈 DNA 단편의 동정

코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D(ATCC 55744)를 LB 배지에서 37 ℃에서 진탕하면서 성장시켰다. 게놈 DNA를 제조자(MN, 미니아폴리스, 젠트라 시스템즈)에 따라 퓨어진 DNA 분리 키트를 이용하여 제조하였다. 서던 분석(Southern 등, J. Mol. Biol., 98: 503(1975))을 프로브로서 니트릴 하이드라타제 알파 및 베타 서브유닛(US 5,811,286)을 코딩하는 슈도모나스 퓨티다 NRRL-18668 유전자(서열번호 1 및 2)를 이용하여 EcoRⅠ 제한된 게놈 DNA 상에서 수행하였다. 프로브 표지화, 혼성화 및 검출을 제조자(UK, 버킹엄샤이어, 아머샴 인터내셔널)에 따라 ECL 랜덤 프라임 라벨링 및 검출 시스템 버전 Ⅱ를 이용하여 행하였다. 알파(서열번호 1) 및 베타(서열번호 2) 프로브는 각각 동일한 5.7 kb EcoRⅠ DNA 단편에 대해 양성 혼성화를 나타내었다.

실시예 2

C. 테스토스테로니 5-MGAM-4D 니트릴 하이드라타제를 코딩하는

게놈 DNA 단편의 클로닝

C. 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 게놈 DNA를 제조하고(실시예 1), EcoRⅠ으로 제한하고, 표준 아가로스 젤 전기영동에 가하였다. 대략 5-7 kb 크기 범위의 DNA 단편을 분리하고 EcoRⅠ 제한된 pUC19(MA, 베버리, 뉴 잉글랜드 바이오랩스)에 결찰시켰다. 이 플라스미드 라이브러리를 플레이팅하고 P. 퓨티다 NRRL-18668 니트릴 하이드라타제 α-서브유닛 유전자 프로브(서열번호 1)로 스크리닝하였다. 프로브 표지화, 혼성화 및 검출을 제조자(아머샴 인터내셔널)에 따라 ECL 랜덤 프라임 라벨링 및 검출 시스템 버전 Ⅱ를 이용하여 행하였다. 양성으로 혼성화하는 콜로니를 분리하고 5.7 kb(pKP57)의 삽입물을 함유하는지 결정하였다.

실시예 3

C. 테스토스테로니 5-MGAM-4D 니트릴 하이드라타제를 코딩하는

유전자의 뉴클레오티드 서열 결정

pKP57(실시예 2) 삽입물의 뉴클레오티드 서열을 ABI 377-XL DNA 서열분석기와 빅다이 터미네이터 사이클 시퀀싱 화학을 이용하여 결정하였다. GenBank® 데이터베이스에 대한 수득된 서열의 BlastN 분석(Altschul 등, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402(1997))은 니트릴 하이드라타제 α 및 β-서브유닛을 코딩하는 완전한 유전자와 아미다제를 코딩하는 일부 유전자의 존재를 확인하였다. 니트릴 하이드라타제 α 및 β-서브유닛을 코딩하는 pKP57 삽입물의 뉴클레오티드 서열이 각각 서열번호 3과 서열번호 5에 주어져 있다. α 및 β-서브유닛의 pKP57 삽입물의 추론된 아미노산 서열은 각각 서열번호 4와 서열번호 6에 주어져 있다.

니트릴 하이드라타제 α 및 β-서브유닛의 추론된 아미노산 서열을 이용하여 BlastP 분석을 수행하였다. 결과를 표 1에 나타내었다. 본 니트릴 하이드라타제 α-서브유닛 아미노산 서열에 가장 근접한 매치는 슈도모나스 퓨티다 NRRL-18668로부터의 니트릴 하이드라타제 α-서브유닛이었다(97.1% 동일성, 97.1% 유사성, E 값=10e^-108). 본 니트릴 하이드라타제 β-서브유닛 아미노산 서열에 가장 근접한 매치는 슈도모나스 퓨티다 NRRL-18668로부터의 니트릴 하이드라타제 β-서브유닛이었다(82.0% 동일성, 82.5% 유사성, E 값=6e^-92).

실시예 4

E. 콜라이에서 C. 테스토스테로니 5-MGAM-4D 니트릴 하이드라타제의 생산

C. 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 니트릴 하이드라타제 알파 및 베타 서브유닛을 코딩하는 DNA 단편(서열번호 7)을 프라이머 1(서열번호 8)과 프라이머 2(서열번호 9)를 이용하여 제조자(NJ, 브랜치버그, 로슈)에 따라 GeneAmp 키트를 통해 표준 PCR에 의해 pKP57로부터 얻고 T7 프로모터의 제어 하에 pGEM-T(WI, 매디슨, 프로메가)로 서브클로닝하여 pSW131을 생성시켰다. E. 콜라이 BL21(DE3)(WI, 매디슨, 노바젠)을 표준 과정을 이용하여 pSW131로 형질전환하였다. pSW131을 갖는 E. 콜라이 BL21(DE3)의 성장과 유도를 노바젠에 의해 권장되는 바와 같이 필수적으로 수행하였다. 변형은 유도 시 각각 최종 농도 0.01 ㎎/㎖ 및 0.1 ㎎/㎖로의 염화코발트와 시트르산나트륨의 첨가를 포함하였다. 유도를 30 ℃에서 16 시간 동안 수행하였다. 알파(23 kDa) 및 베타(24 kDa) 단백질의 생산을 표준 SDS-PAGE 분석에 의해 확인하였다.

실시예 5

형질전환된 E. 콜라이에 의한 3-하이드록시발레로니트릴(3-HVN)의 전환

pSW131을 갖는 E. 콜라이 BL21(DE3)의 성장과 유도를 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. 그런 다음 세포를 원심분리에 의해 수획하고, 완충액(0.1 M 인산칼륨 pH 7.0)에서 2회 세척하고 완충액 중에 100 ㎎ 습윤 세포/㎖로 현탁하였다. 니트릴라제 활성 어세이 혼합물은 주변 온도에서 교반된 세포(50 ㎎/㎖), 3-하이드록시발레로니트릴(0.3 M) 및 완충액(0.1 M 인산칼륨, pH 7.0)을 포함하였다. HPLC 분석은 15 분에 3-HVN의 상응하는 아미드(3-하이드록시발레르아미드)로의 17% 전환을 입증하였다.

실시예 6

E. 콜라이에서 고-수준의 C. 테스토스테로니 5-MGAM-4D 니트릴 하이드라타제

활성의 생산은 하류 서열을 요구한다

T7 프로모터의 제어 하에 C. 테스토스테로니 5-MGAM-4D 니트릴 하이드라타제 알파 및 베타 서브유닛을 코딩하는 DNA 단편 + 부속 단백질 P7K를 코딩하는 0.9 kb의 하류 DNA(서열번호 11)를 함유하는, 플라스미드(pSW132; ATCC PTA-5073)를 pSW131의 더 작은 BamHⅠ/PstⅠ 단편을 pKP57로부터의 상응하는 BamHⅠ/PstⅠ 단편으로 대체함으로써 제작하였다. E. 콜라이 BL21(DE3)(노바젠)을 표준 과정을 이용하여 pSW132로 형질전환하였다. pSW132를 갖는 E. 콜라이 BL21(DE3)("E. 콜라이 균주 SW132")의 성장과 유도를 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하고, 알파 및 베타 단백질의 생산을 표준 SDS-PAGE 분석에 의해 확인하였다.

C. 테스토스테로니 5-MGAM-4D 니트릴 하이드라타제 알파 및 베타 서브유닛을 코딩하는 DNA 단편 + 부속 단백질 P7K를 코딩하는 0.9 kb의 하류 DNA(서열번호 11)를 또한 프라이머 1(서열번호 8) 및 프라이머 3(서열번호 12)을 이용하여 제조자(로슈)에 따라 GeneAmp 키트를 통해 표준 PCR에 의해 pKP57로부터 수득하고 trc 프로모터의 제어 하에 pTrcHis2-TOPO로 서브클로닝하여 제조자(인비트로젠)에 따라 E. 콜라이 TOP10에서 pSW137을 생성하였다. pSW137을 갖는 E. 콜라이 TOP10의 성장과 유도를 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하고, 알파 및 베타 단백질의 생산을 표준 SDS-PAGE 분석에 의해 확인하였다. pSW132를 갖는 E. 콜라이 BL21(DE3) 및 pSW137을 갖는 E. 콜라이 TOP10에서 알파 및 베타 단백질의 생산은 pSW131을 갖는 E. 콜라이 BL21(DE3)(실시예 4)로부터 얻어진 것과 정성적으로 구별할 수 없었다.

pSW132를 갖는 E. 콜라이 BL21(DE3)의 성장과 유도를 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. 그런 다음 세포를 원심분리에 의해 수획하고, 완충액(0.1 M 인산칼륨 pH 7.0)에서 2회 세척하고 완충액 중에 100 ㎎ 습윤 세포/㎖로 현탁하였다. 니트릴 하이드라타제 활성 어세이 혼합물은 주변 온도에서 교반된 세포(2 ㎎/㎖), 3-하이드록시발레로니트릴(0.3 M) 및 완충액(0.1 M 인산칼륨, pH 7.0)을 포함하였다. HPLC 분석은 5 분에 3-하이드록시발레로니트릴의 3-하이드록시발레르아미드로의 100% 전환을 입증하였다. 유사하게, pSW137을 갖는 E. 콜라이 TOP10의 니트릴 하이드라타제 활성 어세이는 5 분에 3-하이드록시발레로니트릴의 3-하이드록시발레르아미드로의 100% 전환을 입증하였다. 이들 결과의 pSW131로부터 얻어진 것들(실시예 5)과의 비교는 최대 니트릴 하이드라타제 활성을 얻는데, 니트릴 하이드라타제 베타 유전자의 하류 DNA의 중요성을 입증하였다(표 2). 하류 뉴클레오티드 서열(서열번호 10)은 그 서열이 서열번호 13에 주어져 있는 작은 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 추론된 아미노산 서열(P7K라 불리는)이 서열번호 14에 주어져 있다.

발현 벡터 pSW131과 pSW132의 비교

발현벡터	C. 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터발현된 유전적 성분	실온에서 0.35 M 3-HVN의3-HVAm으로의 % 전환
PSW131	니트릴 하이드라타제 α 및 β-서브유닛	15 분에 17%
PSW132	니트릴 하이드라타제 α 및 β-서브유닛 +부속 단백질 "P7K"	5 분에 100%

실시예 7

C. 테스토스테로니 5-MGAM-4D 아미다제를 코딩하는 유전자의

뉴클레오티드 서열 결정

C. 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 게놈 DNA를 제조하고(실시예 1), PstⅠ으로 제한하고, 프로브(서열번호 15)로서 pKP57(실시예 2)의 제1 0.6 kb를 포함하는 표준 PCR 산물을 이용하여 서던 분석에 가하였다. 프로브 표지화, 혼성화 및 검출을 제조자(아머샴 인터내셔널)에 따라 ECL 랜덤 프라임 라벨링 및 검출 시스템 버전 Ⅱ를 이용하여 행하였다. 이 프로브는 2.4 kb PstⅠ 단편에 혼성화하였다. PstⅠ으로 분해된 게놈 DNA를 표준 아가로스 젤 전기영동에 가하였다. 대략 2-4 kb 크기 범위의 DNA 단편을 분리하고 PstⅠ 제한된 pUC19에 결찰시켰다. 이 플라스미드 라이브러리를 플레이팅하고 동일한 0.6 kb 프로브(서열번호 15)로 스크리닝하였다. 프로브 표지화, 혼성화 및 검출을 제조자(아머샴 인터내셔널)에 따라 ECL 랜덤 프라임 라벨링 및 검출 시스템 버전 Ⅱ를 이용하여 행하였다. 양성으로 혼성화하는 콜로니를 분리하고 2.4 kb(pKP59)의 삽입물을 함유하는지 결정하였다.

뉴클레오티드 서열결정은 삽입물이 이전에 클로닝된 EcoRⅠ DNA 단편(pKP57)과 중복하는 DNA 단편임을 확인하였다. 따라서, pKP57과 pKP59로부터의 뉴클레오티드 서열을 결합하여, 아미다제 유전자의 완전한 뉴클레오티드 서열을 결정하였다(서열번호 16). 추론된 아미노산 서열은 서열번호 17에 주어져 있다. 아미다제와 니트릴 하이드라타제의 완전한 코딩 서열을 포함하는 C. 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 7.4 kb DNA 단편의 뉴클레오티드 서열이 서열번호 18에 주어져 있다.

BlastP 분석을 추론된 아미다제 아미노산 서열(서열번호 17; 표 1)을 이용하여 수행하였다. 가장 근접한 공개적으로 알려진 매치는 슈도모나스 퓨티다 NRRL-18668로부터의 아미다제의 것이었다(92.3% 동일성, 92.5% 유사성, E 값=0).

실시예 8

E. 콜라이에서 C. 테스토스테로니 5-MGAM-4D 아미다제의 생산

C. 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 아미다제를 코딩하는 DNA 단편을 프라이머 4(서열번호 19)와 프라이머 5(서열번호 20)를 이용하여 제조자(NJ, 브랜치버그, 로슈)에 따라 GeneAmp 키트를 통해 표준 PCR에 의해 pKP57로부터 얻고 T7 프로모터의 제어 하에 pGEM-T(프로메가)로 서브클로닝하여 pKP60을 생성시켰다. E. 콜라이 BL21(DE3)(노바젠)을 표준 과정을 이용하여 pKP60으로 형질전환하였다. pKP60을 갖는 E. 콜라이 BL21(DE3)의 성장과 유도를 노바젠에 따라 수행하고 아미다제 단백질의 생산을 표준 SDS-PAGE 분석에 의해 확인하였다.

C. 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 아미다제를 코딩하는 DNA 단편을 또한 프라이머 6(서열번호 21)과 프라이머 7(서열번호 22)를 이용하여 표준 PCR에 의해 얻고 trc 프로모터의 제어 하에 pTrcHis2 TOPO로 서브클로닝하여 제조자(인비트로젠)에 따라 E. 콜라이 TOP10에서 pSW133을 생성시켰다. pSW133을 갖는 E. 콜라이 TOP10의 성장과 유도를 인비트로젠에 따라 수행하고 아미다제 단백질의 생산을 표준 SDS-PAGE 분석에 의해 확인하였다.

실시예 9

E. 콜라이에서 C. 테스토스테로니 5-MGAM-4D 니트릴 하이드라타제

및 아미다제의 공동-생산

C. 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 아미다제, NHase 알파 및 베타, 및 부속 단백질 P7K를 코딩하는 DNA 단편(서열번호 23)을 프라이머 6(서열번호 21)과 프라이머 3(서열번호 12)을 이용하여 제조자(로슈)에 따라 GeneAmp 키트를 이용하여 표준 PCR을 통해 게놈 DNA로부터 얻고 Trc 프로모터의 제어 하에 pTrcHis2-TOPO(인비트로젠)로 서브클로닝하여 pSW136을 생성시켰다.

실시예 10

에스케리키아 콜라이 SW132 세포의 발효

14 ℓ 브라운 바이오스타트 C 발효조(독일, 멜슝겐, B. 브라운 바이오텍 인터내셔널 게엠베하)에서 니트릴 하이드라타제의 생산을 글루코스, 암모니아 및 효모 추출물을 함유하는 무기질 배지에서 행하였다. E. 콜라이 균주 SW132(실시예 6에 기재된 바와 같이 플라스미드 pSW132를 갖는 E. 콜라이 BL21(DE3))를 발효조로 접종하기 전에 종자 배양에서 10 h 성장시켰다. IPTG(1 mM)를 30-35 OD_λ=550에서 발효조로 가하고 세포를 IPTG 첨가 후 5 h에 수획하였다.

발효 프로토콜: 용기 배지를 32 g KH₂PO₄, 8.0 g MgSO₄*7H₂0, 8.0 g (NH₄)₂SO₄, 50 g 효모 추출물 및 10 ㎖ Mazu DF204 소포제(NJ, 마운트 올리브, BASF 코포레이션)를 함유하는 7.5 ℓ의 최초 뱃치에서 제조하였다. 멸균 후, 369 g 글루코스 용액(60% w/w), 160 ㎖ 미량원소 용액(표 3), 및 100 ㎎/ℓ 앰피실린을 가하였다. NH₄0H(40% w/v) 및 20% w/v H₂SO₄를 pH 제어를 위해 사용하였다. 교반, 통기, pH, 압력, 용존산소 농도(DO), 및 온도에 대한 설정 점은 아래 표 4에 기재되어 있다. 용존 산소 농도는 교반이 먼저 증가된 산소 요구로 일어나고 통기가 뒤따르는 25%의 공기 포화에서 제어하였다. 500 ㎖ 종자 배양물을 2 ℓ 플라스크에서 36 ℃, 300 rpm에서 10 h 동안 OD_λ=550 > 2.0으로 성장시켰다. 20-30 OD의 배양 밀도에 있는 발효조에 부가적인 AMP를 100 ㎎/ℓ로 가하였다. IPTG를 30-35 OD의 배양 밀도에서 1 mM로 가하였다. 글루코스 공급을 < 5 g/ℓ에서 시작하였고 계획된 속도는 표 5에 기재되어 있다. 글루코스가 2 g/ℓ 넘게 축적하면 글루코스 공급속도를 감소시켰다. IPTG 첨가 후 5 시간에 세포를 5-10 ℃로 차게 하고 원심분리에 의해 수획하였다; 490 g(습윤 세포)을 수획하였다. 성장과 니트릴 하이드라타제 생산의 역학을 표 6에 제시하였다.

미량 원소 용액:

화학물질	농도 g/ℓ
시트르산	10.0
CaCl2*2H2O	1.50
FeSO4*7H2O	5.00
ZnSO4*7H2O	0.39
CuSO4*5H2O	0.38
CoCl2*6H2O	0.20
MnCl2*4H2O	0.30

발효 운전 조건

	초기 설정점	최소	최대
교반기(rpm)	400	400	850
기류(slpm)	2	2	16
pH	6.8	6.8	6.8
압력(psig)	0.5	0.5	0.5
DO	25%	25%	25%
온도 ℃	36	36	36

글루코스 공급 프로토콜

시간 h	속도(g/분)
0-2	0.39
2-8	0.78
8-끝	0.60

성장 및 니트릴 하이드라타제 생산의 역학

시간 h	ODλ=550	글루코스(g/ℓ)	니트릴 하이드라타제 생산(U/g 건조 세포 wt.)
2.9	5.8	26.2
4.9	15.7	20.2
6.3	28	8.5	9157
8.1	44	6	10220
11.2	57.6	0.04	10888

실시예 11

비고정화 E. 콜라이 SW132 세포에 의한 니트릴의 상응하는 아미드로의 수화

자기 교반기가 장착된 20-㎖ 반응 용기에 0.04, 0.4, 2.0 또는 5.0 mmol의 아크릴로니트릴, 메타크릴로니트릴, 3-하이드록시프로피오니트릴, 3-하이드록시부티로니트릴, 3-하이드록시발레로니트릴, 부티로니트릴, 아디포니트릴, 벤조니트릴, 또는 글리콜로니트릴을 가하고 증류된, 탈이온수를 가하여 혼합물의 최종 부피를 3.0 ㎖로 조정하였다. 다음에 반응 용기에 0.10 M 인산칼륨 완충액(pH 7.0, pH 6.0에서 운전되었던 글리콜로니트릴을 제외) 중 0.44-8.8 ㎎ 건조 세포 중량(dcw)/㎖의 E. 콜라이 SW132 세포(실시예 10에 기재된 바와 같이 제조된)의 수성 현탁액 1.0 ㎖를 가하고 혼합물을 25 ℃에서 교반하였다. 반응 혼합물의 샘플(0.100 ㎖)을 0.400 ㎖의 물과 혼합한 후, 0.200 ㎖의 희석 샘플을 (a) 물 중 0.200 ㎖의 0.200 M 부티르산나트륨(아크릴로니트릴 및 3-하이드록시발레로니트릴 HPLC 표준), 0.200 M N-에틸아세트아미드(메타크릴로니트릴 HPLC 표준), 0.200 M 이소부티르산(부티로니트릴 및 3-하이드록시프로피오니트릴 HPLC 표준), 또는 0.200 M 말론산(3-하이드록시부티로니트릴 HPLC 표준)과 혼합하거나, (b) 100% 니트릴 전환(5-시아노발레르아미드, 아디프아미드, 벤즈아미드, 글리코아미드)에서 산물의 검정 곡선에 대해 측정하였다. 생성된 혼합물을 원심분리하고, 상등액을 HPLC로 분석하였다.

모든 반응은 니트릴의 상응하는 카르복실산으로의 가수분해 없이, 니트릴의 100% 전환에서 수화 산물로서 아미드만을 생산하였다.

E. 콜라이 SW132 세포에 의한 니트릴의 상응하는 아미드로의 수화

니트릴	농도(M)	㎎ dcw/㎖	시간(h)	아미드	아미드 수율(%)
아크릴로니트릴	0.50	2.2	3	아크릴아미드	100
아크릴로니트릴	1.25	8.8	5	아크릴아미드	98
메타크릴로니트릴	0.50	2.2	20	메타크릴아미드	100
3-하이드록시프로피오니트릴	0.50	2.2	3	3-하이드록시프로피온아미드	100
3-하이드록시부티로니트릴	0.50	4.4	4	3-하이드록시부티르아미드	99
3-하이드록시발레로니트릴	0.51	2.2	1	3-하이드록시발레르아미드	99
부티로니트릴	0.50	2.2	16	부티르아미드	100
아디포니트릴	0.50	0.44	1.5	5-시아노발레르아미드	93
				아디프아미드	8
아디포니트릴	0.50	4.4	1	아디프아미드	100
벤조니트릴	0.010	2.2	2	벤즈아미드	99
글리콜로니트릴	0.10	2.2	2	글리콜아미드	63

실시예 12

E. 콜라이 SW132 세포의 부분-정제된 단백질 추출물을 이용한

3-하이드록시발레로니트릴의 수화

E. 콜라이 SW132 세포(0.4874 g)를 0.1 M 인산칼륨 완충액(pH 7) 중의 1 mM DTT와 0.1 mM PMSF로 이루어진 2.0 ㎖의 차가운 파괴 완충액에 현탁시켰다. 현탁액(200 ㎎ 습윤 세포 중량/㎖)을 프렌치 프레셔 미니 셀에 로딩하고, 세포를 16000-17000 psi에서 파괴하였다. 세포 찌꺼기를 생성된 혼합물로부터 38000 RCF에서 15 min 원심분리하여 제거하였다. 199 ㎎ 습윤 세포 중량/㎖ 세포 현탁액과 동등한 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는, 대략 1.68 ㎖의 추출 상등액을 회수하였다.

자기 교반기가 장착된 20-㎖ 반응 용기에 0.4 ㎖의 E. 콜라이 SW132 추출 상등액, 0.6 ㎖의 탈이온수 및 3 ㎖의 물 중 0.667 M 3-하이드록시발레로니트릴을 가하였다. 혼합물을 25 ℃에서 교반하였다. 반응 혼합물의 샘플(0.100 ㎖)을 0.100 ㎖의 물과 혼합한 후, 0.200 ㎖의 희석된 샘플을 0.200 ㎖의 0.200 M 부티르산나트륨(외부 표준)과 혼합하고 HPLC에 의해 분석하였다. 120 min 후, 3-하이드록시발레르아미드의 수율은 3-하이드록시발레로니트릴의 100% 전환에서 99%였다.

실시예 13

코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D와 슈도모나스 퓨티다 5B 세포로부터의

니트릴 하이드라타제의 열 안정성 비교

0.50 M 인산염 완충액 중 E. 콜라이 SW30 습윤 세포(슈도모나스 퓨티다 5B로부터의 활성 니트릴 하이드라타제를 갖는) 또는 E. 콜라이 SW132 습윤 세포(코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 활성 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는)의 44 ㎎ 건조 세포 중량/㎖ 현탁액을 수욕에서 50 ℃로 가열하였다. 예정된 시간에, 50 ℃ 세포 현탁액의 수적을 수욕에서 25 ℃로 신속하게 냉각시키고, 25 ℃에서 3.0 ㎖의 0.667 M 3-하이드록시발레로니트릴에 1.0 ㎖ 수적의 가열/냉각된 세포 현탁액을 교반하면서 첨가하여 이들 현탁액을 잔존 니트릴 하이드라타제 활성에 대해 어세이하였다. 반응 혼합물의 샘플(0.100 ㎖)을 예정된 시간에 빼내고 0.100 ㎖의 물과 혼합한 후, 0.200 ㎖의 희석된 샘플을 0.200 ㎖의 0.200 M 부티르산나트륨(외부 표준)과 혼합하고, 원심분리하고, 상등액을 HPLC에 의해 분석하였다. 50 ℃에서 시간의 함수로서, 각각 E. 콜라이 SW30 및 E. 콜라이 SW132에 대해 회수된 니트릴 하이드라타제 비활성과 회수된 효소의 %가 아래 표 8에 수록되어 있다.

E. 콜라이 SW30 및 E. 콜라이 SW132 니트릴 하이드라타제 열안정성의 비교

50 ℃에서의시간(min)	SW30 니트릴하이드라타제(IU/d dcw)	니트릴 하이드라타제회수(%)	SW132 니트릴하이드라타제(IU/g dcw)	니트릴 하이드라타제 회수(%)
0	103	100	7752	100
30	1.6	1.6	6940	90
60	0	0	6437	83

실시예 14

아크릴로니트릴의 아크릴아미드로의 수화를 위한 코마모나스 테스토스테로니

5-MGAM-4D와 슈도모나스 퓨티다 5B 니트릴 하이드라타제의 비교

20-㎖ 반응 용기(자기 교반기가 장착된)에 0.270 g(5.1 mmol)의 아크릴로니트릴과 총부피 9.664 ㎖의 0.10 M 인산칼륨 완충액(pH 7.0) 중 107.6 ㎎ 건조 세포 중량 E. 콜라이 SW30 습윤 세포(슈도모나스 퓨티다 5B로부터의 활성 니트릴 하이드라타제를 발현하는) 또는 4.41 ㎎ 건조 세포 중량 E. 콜라이 SW132 습윤 세포(코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 활성 니트릴 하이드라타제를 발현하는)의 현탁액을 가하였다; 각 반응물에 존재하는 건조 세포 중량의 양은 반응 혼합물에서 거의 동일한 니트릴 하이드라타제 활성(IU/㎖)을 제공하도록 선택되었다. 아크릴로니트릴의 최농 농도는 0.51 M이었다. 혼합물을 25 ℃에서 교반하였다. 반응 혼합물의 샘플(0.200 ㎖)을 0.200 ㎖의 물 중 0.200 M 부티르산나트륨(HPLC 표준) 및 0.020 ㎖의 6 N 아세트산과 혼합하였다. 생성된 샘플을 원심분리하고, 상등액을 HPLC로 분석하였다. 반응 시간, % 아크릴로니트릴 전환, 및 아크릴아미드의 % 수율을 표 9에 수록하였다. 생물촉매로서 E. 콜라이 SW30을 사용하는 반응의 경우, 니트릴 하이드라타제 활성의 유실이 반응 과정에 걸쳐 관찰되었고, 니트릴의 불완전한 전환이 연장된 반응 시간에서 얻어졌다.

아크릴로니트릴 수화반응에서 E. 콜라이 SW30과 E. 콜라이 SW132의 비교

E. 콜라이 제작물	㎎ dcw/㎖	시간(h)	아크릴로니트릴 전환(%)	아크릴아미드 수율(%)
SW30	10.8	1.5	42	38
SW30	10.8	20	80	82
SW30	10.8	45	96	97
SW132	0.44	1.5	100	98

실시예 15

3-하이드록시발레로니트릴의 3-하이드록시발레르아미드로의 수화를 위한 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D와 슈도모나스 퓨티다 5B 니트릴 하이드라타제의 비교

20-㎖ 반응 용기(자기 교반기가 장착된)에 증류된 탈이온수 중의 0.204 g(2.0 mmol)의 3-하이드록시발레로니트릴의 용액 3.0 ㎖와 0.10 M 인산칼륨 완충액(pH 7.0) 중 44 ㎎ 건조 세포 중량의 E. 콜라이 SW30 습윤 세포(슈도모나스 퓨티다 5B로부터의 활성 니트릴 하이드라타제를 발현하는) 또는 E. 콜라이 SW132 습윤 세포(코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 활성 니트릴 하이드라타제를 발현하는)의 현탁액 1.0 ㎖를 가하였다. 3-하이드록시발레로니트릴의 최농 농도는 0.50 M이었다. 혼합물을 25 ℃에서 교반하였다. 반응 혼합물의 샘플(0.100 ㎖)을 0.100 ㎖의 물, 0.200 ㎖의 물 중 0.200 M 부티르산나트륨(HPLC 표준) 및 0.020 ㎖의 6 N HCl과 혼합하였다. 생성된 혼합물을 원심분리하고, 상등액을 HPLC로 분석하였다. 반응 시간, % 3-하이드록시발레로니트릴 전환, 및 3-하이드록시발레르아미드의 % 수율을 표 10에 수록하였다. 생물촉매로서 SW30을 사용하는 반응의 경우, 니트릴 하이드라타제 활성의 유실이 반응 과정에 걸쳐 관찰되었고, 니트릴의 불완전한 전환이 연장된 반응 시간에서 얻어졌다.

3-하이드록시발레로니트릴 반응에서 E. 콜라이 SW30과 E. 콜라이 SW132의 비교

E. 콜라이 제작물	㎎ dcw/㎖	시간(h)	3-하이드록시발레로니트릴 전환(%)	3-하이드록시발레르아미드 수율(%)
SW30	11	1	12	12
SW30	11	7	42	40
SW30	11	24	61	61
SW132	11	0.25	100	100

실시예 16

E. 콜라이 SW137에 의한 3-하이드록시발레로니트릴의

3-하이드록시발레르아미드로의 수화

4-㎖ 반응 용기(자기 교반기가 장착된)에 0.404 M의 3-하이드록시발레로니트릴을 함유하는 수용액 0.75 ㎖와 0.10 M 인산칼륨 완충액(pH 7.0) 중 18 ㎎ 건조 세포 중량 E. 콜라이 SW137 습윤 세포(실시예 6에 기재된 바와 같이 제조된)의 현탁액 0.25 ㎖를 가하였다. E. 콜라이 SW137 세포는 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현한다. 3-하이드록시발레로니트릴의 최농 농도는 0.303 M이었다. 혼합물을 25 ℃에서 교반하였다. 반응 혼합물의 샘플(0.100 ㎖)을 0.100 ㎖의 물, 0.200 ㎖의 물 중 0.200 M 부티르산나트륨(HPLC 표준) 및 0.020 ㎖의 6 N HCl과 혼합하였다. 생성된 혼합물을 원심분리하고, 상등액을 HPLC로 분석하였다. 10 min 후, 3-하이드록시발레로니트릴의 전환은 100%였고, 3-하이드록시발레르아미드의 수율은 100%였다.

실시예 17

칼슘 가교-결합된 알기네이트에서 에스케리키아 콜라이 SW132 세포의 고정화

250-㎖ 배지 병(자기 교반 막대가 장착되고 50 ℃에서 59.7 g의 증류된 탈이온수를 함유하는)으로 3.30 g의 FMC 바이오폴리머 Protanal® LF10/60 알게네이트를 신속히 교반하면서 천천히 가하였다. 알기네이트가 완전히 녹을 때까지 혼합물을 신속하게 교반하면서 75-80 ℃로 가열하고, 생성된 용액을 수욕에서 25 ℃로 냉각하였다. 알기네이트 현탁액에 40.8 g의 에스케리키아 콜라이 SW132 습윤 세포 페이스트(22% 건조 세포 중량)와 16.2 ㎖의 증류수를 교반하면서 가하였다. 세포/알기네이트 혼합물을 교반하면서 25 ℃에서 640 ㎖의 0.20 M 아세트산칼슘 완충액(pH 7.0)에 주사기로 적가하였다. 2 h 동안 교반한 후, 완충액을 생성된 비드(82 g)로부터 따라내고, 200 ㎖의 0.20 M 아세트산칼슘(pH 7.0)에 재현탁하였다. 교반하면서, 4.10 g의 물 중 25wt% 글루다르알데히드(GA)를 가하고 비드를 25 ℃에서 1 h 혼합하였다. 그런 다음 현탁액에 16.4 g의 물 중 12.5wt% 폴리에틸렌이민(PEI)(바스프 Lupasol® PR971L, 평균분자량 ca. 750,000)을 가하고, 비드를 25 ℃에서 1 h 더 혼합하였다. 그런 다음 GA/PEI-가교결합된 비드를 25 ℃에서 250 ㎖의 0.05 M 아세트산칼슘 완충액(pH 7.0)으로 2회 세척하고, 5 ℃에서 이 동일한 완충액에 저장하였다.

실시예 18

생물촉매 재생을 갖는 연속적 뱃치 반응에서 알기네이트-고정화된 에스케리키아

콜라이 SW132 세포에 의한 니트릴(0.50 M 내지 3.0 M)의 상응하는 아미드로의 수화

50-㎖ 자켓 반응 용기(재순환 온도 욕조를 갖는 오버헤드 교반기(25 ℃ 또는 35 ℃에서 온도-제어되는)가 장착된)에 실시예 17에 기재된 바와 같이 제조된 4.0 g의 GA/PEI-가교결합된 에스케리키아 콜라이 SW132 세포/알기네이트 비드를 위치시켰다. 반응 용기에 0.2 ㎖의 0.20 M 아세트산칼슘 완충액(pH 7.0, 반응 혼합물 중 2.0 mM 최종 칼슘 이온 농도), 10, 20, 40 또는 60 mmol의 아크릴로니트릴, 메타크릴로니트릴 또는 3-하이드록시발레로니트릴을 가하고 증류된, 탈이온수를 가하여 반응 혼합물의 최종 부피를 20 ㎖로 조정하였다. 혼합물을 25 ℃ 또는 35 ℃에서 교반하였다. 반응 혼합물의 샘플(0.100 ㎖)을 0.400 ㎖의 물과 혼합한 후, 0.200 ㎖의 희석 샘플을 0.200 ㎖의 물 중 0.200 M 부티르산나트륨(아크릴로니트릴 및 3-하이드록시발레로니트릴 HPLC 외부 표준) 또는 0.200 M N-에틸아세트아미드(메타크릴로니트릴 HPLC 외부 표준)와 혼합하였다. 생성된 혼합물을 원심분리하고, 상등액을 HPLC로 분석하였다.

반응 완료 시(니트릴의 100% 전환), 산물 혼합물을 생물촉매 비드로부터 따라내고, 25 ℃ 또는 35 ℃에서 부가적인 증류된, 탈이온수, 0.2 ㎖의 0.20 M 아세트산칼슘 완충액(pH 7.0, 반응 혼합물 중 2.0 mM 최종 칼슘 이온 농도) 및 10, 20, 40 또는 60 mmol의 아크릴로니트릴, 메타크릴로니트릴 또는 3-하이드록시-발레로니트릴을 반응 힐(고정화된-세포 촉매와 제1 반응으로부터의 잔존 산물 혼합물)과 혼합하였다. 제2 반응 완료 시, 산물 혼합물을 따라내고 제3 반응을 이전과 같이 수행하였다. 각 재생 반응에 대한 반응시간, 아크릴아미드, 메타크릴아미드 또는 3-하이드록시발레르아미드의 산물 수율 및 백분율 회수 생물촉매 활성을 아래 표 11에 수록하였다.

생물촉매 재생을 갖는 연속적 뱃치 반응에서 고정화된 E. 콜라이 SW132 세포에 의한 니트릴(0.50 M 내지 3.0 M)의 상응하는 아미드로의 수화

니트릴	농도(M)	온도(℃)	Rxn#	시간(h)	아미드수율(%)	회수 생물촉매활성(%)
아크릴로니트릴	0.53	25	123	0.180.180.12	100100100	10094112
아크릴로니트릴	1.02	25	123	0.250.250.25	100100100	100118124
아크릴로니트릴	2.05	25	123	0.50.50.5	100100100	10095100
아크릴로니트릴	3.04	25	123	0.750.830.5	100100100	10098106
아크릴로니트릴	1.06	35	123	0.150.250.15	100100100	100107110
메타크릴로니트릴	1.00	25	123	1.01.01.5	10010099	100106103
3-하이드록시발레로니트릴	1.05	25	123	0.750.750.75	100100100	1009384
3-하이드록시발레로니트릴	2.05	25	123	1.52.02.0	100100100	10010293

실시예 19

카라기난에서 E. 콜라이 SW132 세포의 고정화

자기 교반 막대가 장착되고 50 ℃에서 54.6 g의 물을 함유하는 250-㎖ 배지 병으로 2.88 g의 카파-카라기난(FMC RG300)을 신속히 교반하면서 천천히 가한다. 카라기난이 완전히 녹을 때까지 혼합물을 신속하게 교반하면서 75-80 ℃로 가열하고, 생성된 용액을 정온 수욕에서 55-56 ℃(ca. 52 ℃ 젤화 온도)로 냉각한다. 19.7 g의 0.35 M 인산나트륨 완충액(pH 7.3) 중의 18.6 g의 E. 콜라이 SW132 습윤 세포 페이스트(22% 건조 세포 중량)의 현탁액을 50 ℃로 15 min 가열한 후, 55-56 ℃의 카라기난 용액에 교반하면서 가한다. 세포/카라기난 혼합물을 오버헤드 교반기를 이용하여 교반하면서 50 ℃에서 383 ㎖의 대두유에 즉각적으로 천천히 적가한다. 원하는 크기의 세포/카라기난 방울이 교반속도를 제어함으로써 오일에서 생성된 후, 오일의 온도를 40-42 ℃로 감소시켜 방울을 젤화하고, 오일을 생성된 비드로부터 따라낸다. 비드를 150 ㎖의 0.1 M 중탄산칼륨 완충액(pH 7.0)으로 세척한 후, 182 ㎖의 동일한 완충액에 현탁하고, 1.9 g의 물 중 25wt% 글루타르알데히드를 가하고 비드를 25 ℃에서 1 h 혼합한다. 그런 다음 혼합물에 7.6 g의 물 중 12.5wt% 폴리에틸렌이민(PEI)(바스프 Lupasol PR971L)을 가하고, 비드를 25 ℃에서 1 h 혼합한다. 그런 다음 비드를 0.30 M 중탄산암모늄(pH 7.0)으로 2회 세척하고, 5 ℃에서 이 동일한 것에 저장한다.

실시예 20

카라기난-고정화된 E. 콜라이 SW132 세포에 의한 아크릴로니트릴의 수화

오버헤드 교반기(재순환 온도 욕조를 갖는 35 ℃에서 온도-제어되는)가 장착된 50-㎖ 자켓 반응 용기에 실시예 19에서와 같이 제조된 4.0 g의 GA/PEI-가교결합된 E. 콜라이 SW132 세포/카라기난 비드를 위치시킨다. 반응 용기에 1.06 g의 아크릴로니트릴(1.0 M 최종 농도)을 가하고 증류된, 탈이온수를 가하여 반응 혼합물의 최종 부피를 20 ㎖로 조정하고, 혼합물을 35 ℃에서 교반한다. 반응 혼합물의 샘플(0.100 ㎖)을 0.400 ㎖의 물과 혼합한 후, 0.200 ㎖의 희석 샘플을 0.200 ㎖의 물 중 0.200 M 부티르산나트륨(HPLC 외부 표준)과 혼합한다. 생성된 혼합물을 원심분리하고, 상등액을 HPLC로 분석하였다. 아크릴로니트릴의 완전한 전환 시, 아크릴아미드의 정량적 수율이 있다.

실시예 21

E. 콜라이 SW132 세포의 부분-정제된 단백질 추출물로부터의 고정화된

니트릴 하이드라타제를 이용한 아크릴로니트릴의 수화

25-㎖ 엘렌마이어 플라스크로 1.0 g의 옥시란 아크릴릭 비드(시그마)를 칭량한다. 그런 다음 플라스크에 인산칼륨 완충액(50 mM, pH 8.0)을 함유하는 ca. 7.5 ㎖의 용액을 가하고, 플라스크의 내용물을 잠시 혼합함으로써 옥시란 아크릴릭 비드를 완충액 중에 현탁시킨다. 혼합을 중단한 후, 비드는 플라스크 바닥에 가라앉고, 혼합물의 상부로 떠오르는 미세 입자를 가라앉은 비드를 교란하지 않으면서 제거할 수 있는 양의 상등액과 함께, 피펫으로 제거한다. 이 세척 과정을 두번째 반복한다. 그런 다음 플라스크에 실시예 12에 기재된 1.0 ㎖의 E. 콜라이 SW132 세포 추출물 상등액을 가하고 혼합물의 최종 부피를 부가적인 인산칼륨 완충액으로 10 ㎖로 조정한다. 생성된 혼합물을 25 ℃에서 16 h 동안 회전 플랫폼 상에서 혼합한다. 그런 다음 혼합물을 융해된 베드 지지체가 장착된 크로마토그래피 칼럼으로 옮기고, 고정화된 니트릴 하이드라타제를 10 ㎖의 인산칼륨 완충액으로 3회 세척하고 이 동일한 완충액에 5 ℃에서 저장한다.

오버헤드 교반기(재순환 온도 욕조를 갖는 35 ℃에서 온도-제어되는)가 장착된 50-㎖ 자켓 반응 용기에 상기한 바와 같이 제조된 1.0 g의 고정화된 E. 콜라이 SW132 니트릴 하이드라타제를 위치시킨다. 그런 다음 반응 용기에 1.06 g의 아크릴로니트릴(1.0 M 최종 농도)을 가하고 증류된, 탈이온수를 가하여 반응 혼합물의 최종 부피를 20 ㎖로 조정하고, 혼합물을 35 ℃에서 교반한다. 반응 혼합물의 샘플(0.100 ㎖)을 0.400 ㎖의 물과 혼합한 후, 0.200 ㎖의 희석 샘플을 0.200 ㎖의 물 중 0.200 M 부티르산나트륨(HPLC 외부 표준)과 혼합한다. 생성된 혼합물을 원심분리하고, 상등액을 HPLC로 분석한다. 아크릴로니트릴의 완전한 전환 시, 아크릴아미드의 정량적 수율이 있다.

SEQUENCE LISTING <110> E.I. duPont de Nemours and Company, Inc. <120> Nucleic Acid Fragments Encoding Nitrile Hydratase and Amidase Enzymes from Comamonas Testosteroni 5-MGAM-4D and Recombinant Organisms Expressing Those Enzymes Useful for the Production of Amides and Acids <130> CL2200 PCT <150> 10/413,966 <151> 2003/05/08 <160> 23 <170> Microsoft Office 97 <210> 1 <211> 633 <212> DNA <213> Pseudomonas putida 5B <400> 1 atggggcaat cacacacgca tgaccaccat cacgacgggt accaggcacc gcccgaagac 60 atcgcgctgc gggtcaaggc cttggagtct ctgctgatcg agaaaggtct tgtcgaccca 120 gcggccatgg acttggtcgt ccaaacgtat gaacacaagg taggcccccg aaacggcgcc 180 aaagtcgtgg ccaaggcctg ggtggaccct gcctacaagg cccgtctgct ggcagacgca 240 actgcggcaa ttgccgagct gggcttctcc ggggtacagg gcgaggacat ggtcattctg 300 gaaaacaccc ccgccgtcca caacgtcttc gtttgcacct tgtgctcttg ctacccatgg 360 ccgacgctgg gcttgccccc tgcctggtac aaggccgccg cctaccggtc ccgcatggtg 420 agcgacccgc gtggggttct cgcggagttc ggcctggtga tccccgccaa caaggaaatc 480 cgcgtctggg acaccacggc cgaattgcgc tacatggtgc tgccggaacg gcccggaact 540 gaagcctaca gcgaagaaca actggccgaa ctcgttaccc gcgattcgat gatcggcacc 600 ggcctgccaa cccaacccac cccatctcat taa 633 <210> 2 <211> 654 <212> DNA <213> Pseudomonas putida 5B <400> 2 atgaatggca ttcacgatac tggcggagca catggttatg ggccggttta cagagaaccg 60 aacgaacccg tctttcgcta cgactgggaa aaaacggtca tgtccctgct cccggccctg 120 ctcgccaacg cgaacttcaa cctcgatgaa tttcggcatt cgatcgagcg aatgggcccg 180 gcccactatc tggagggaac ctactacgaa cactggcttc atgtctttga gaacctgctg 240 gtcgagaagg gtgtgctcac ggccacggaa gtcgcgaccg gcaaggctgc gtctggcaag 300 acggcgacgc gcgtgctgac gccggccatc gtggacgact cgtcagcacc ggggcttctg 360 cgcccgggag gagggttctc tttttttcct gtgggggaca aggttcgcgt cctcaacaag 420 aacccggtgg gccatacccg catgccgcgc tacacgcggg caaagtgggg acagtggtca 480 tcgaccatgg tgtgtttcgt gacgccggac accgcggcac acggaaaggg cgagcagccc 540 cagcacgttt acaccgtgag tttcacgtcg gtcgaactgt gggggcaaga cgcttcctcg 600 ccgaaggaca cgattcgcgt cgacttgtgg gatgactacc tggagccagc gtga 654 <210> 3 <211> 633 <212> DNA <213> Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D <220> <221> CDS <222> (1)..(633) <400> 3 atg ggg caa tca cac acg cat gac cac cat cac gac ggg tac cag gca 48 Met Gly Gln Ser His Thr His Asp His His His Asp Gly Tyr Gln Ala 1 5 10 15 ccg ccc gaa gac atc gcg ctg cgg gtc aag gcc ttg gag tct ctg ctg 96 Pro Pro Glu Asp Ile Ala Leu Arg Val Lys Ala Leu Glu Ser Leu Leu 20 25 30 atc gag aaa ggt ctt gtc gac cca gcg gcc atg gac ttg gtc gtc caa 144 Ile Glu Lys Gly Leu Val Asp Pro Ala Ala Met Asp Leu Val Val Gln 35 40 45 acg tat gaa cac aag gta ggc ccc cga aac ggc gcc aaa gtc gtg gcc 192 Thr Tyr Glu His Lys Val Gly Pro Arg Asn Gly Ala Lys Val Val Ala 50 55 60 aag gcc tgg gtg gac cct gcc tac aag gcc cgt ctg ctg gca gac ggc 240 Lys Ala Trp Val Asp Pro Ala Tyr Lys Ala Arg Leu Leu Ala Asp Gly 65 70 75 80 act gcc ggc att gcc gag ctg ggc ttc tcc ggg gta cag ggc gag gac 288 Thr Ala Gly Ile Ala Glu Leu Gly Phe Ser Gly Val Gln Gly Glu Asp 85 90 95 atg gtc att ctg gaa aac acc ccc gcc gtc cac aac gtc gtc gtt tgc 336 Met Val Ile Leu Glu Asn Thr Pro Ala Val His Asn Val Val Val Cys 100 105 110 acc ttg tgc tct tgc tac cca tgg ccg acg ctg ggc ttg ccc cct gcc 384 Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Thr Leu Gly Leu Pro Pro Ala 115 120 125 tgg tac aag gcc ccg ccc tac cgg tcc cgc atg gtg agc gac ccg cgt 432 Trp Tyr Lys Ala Pro Pro Tyr Arg Ser Arg Met Val Ser Asp Pro Arg 130 135 140 ggg gtt ctc gcg gag ttc ggc ctg gtg atc ccc gcg aag gaa atc cgc 480 Gly Val Leu Ala Glu Phe Gly Leu Val Ile Pro Ala Lys Glu Ile Arg 145 150 155 160 gtc tgg gac acc acg gcc gaa ttg cgc tac atg gtg ctg ccg gaa cgg 528 Val Trp Asp Thr Thr Ala Glu Leu Arg Tyr Met Val Leu Pro Glu Arg 165 170 175 ccc gcg gga act gaa gcc tac agc gaa gaa caa ctg gcc gaa ctc gtt 576 Pro Ala Gly Thr Glu Ala Tyr Ser Glu Glu Gln Leu Ala Glu Leu Val 180 185 190 acc cgc gat tcg atg atc ggc acc ggc ctg ccc atc caa ccc acc cca 624 Thr Arg Asp Ser Met Ile Gly Thr Gly Leu Pro Ile Gln Pro Thr Pro 195 200 205 tct cat taa 633 Ser His 210 <210> 4 <211> 210 <212> PRT <213> Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D <400> 4 Met Gly Gln Ser His Thr His Asp His His His Asp Gly Tyr Gln Ala 1 5 10 15 Pro Pro Glu Asp Ile Ala Leu Arg Val Lys Ala Leu Glu Ser Leu Leu 20 25 30 Ile Glu Lys Gly Leu Val Asp Pro Ala Ala Met Asp Leu Val Val Gln 35 40 45 Thr Tyr Glu His Lys Val Gly Pro Arg Asn Gly Ala Lys Val Val Ala 50 55 60 Lys Ala Trp Val Asp Pro Ala Tyr Lys Ala Arg Leu Leu Ala Asp Gly 65 70 75 80 Thr Ala Gly Ile Ala Glu Leu Gly Phe Ser Gly Val Gln Gly Glu Asp 85 90 95 Met Val Ile Leu Glu Asn Thr Pro Ala Val His Asn Val Val Val Cys 100 105 110 Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Thr Leu Gly Leu Pro Pro Ala 115 120 125 Trp Tyr Lys Ala Pro Pro Tyr Arg Ser Arg Met Val Ser Asp Pro Arg 130 135 140 Gly Val Leu Ala Glu Phe Gly Leu Val Ile Pro Ala Lys Glu Ile Arg 145 150 155 160 Val Trp Asp Thr Thr Ala Glu Leu Arg Tyr Met Val Leu Pro Glu Arg 165 170 175 Pro Ala Gly Thr Glu Ala Tyr Ser Glu Glu Gln Leu Ala Glu Leu Val 180 185 190 Thr Arg Asp Ser Met Ile Gly Thr Gly Leu Pro Ile Gln Pro Thr Pro 195 200 205 Ser His 210 <210> 5 <211> 657 <212> DNA <213> Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D <220> <221> CDS <222> (1)..(657) <400> 5 atg aat ggc att cac gat act ggg gga gca cat ggt tat ggg ccg gtt 48 Met Asn Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Ala His Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 tac aga gaa ccg aac gaa ccc gtc ttt cgc tac gac tgg gaa aaa acg 96 Tyr Arg Glu Pro Asn Glu Pro Val Phe Arg Tyr Asp Trp Glu Lys Thr 20 25 30 gtc atg tcc ctg ttc ccg gcg ctg ttc gcc aac ggc aac ttc aac ctc 144 Val Met Ser Leu Phe Pro Ala Leu Phe Ala Asn Gly Asn Phe Asn Leu 35 40 45 gat gag ttt cga cac ggc atc gag cgc atg aac ccc atc gac tac ctg 192 Asp Glu Phe Arg His Gly Ile Glu Arg Met Asn Pro Ile Asp Tyr Leu 50 55 60 aag gga acc tac tac gaa cac tgg atc cat tcc atc gaa acc ttg ctg 240 Lys Gly Thr Tyr Tyr Glu His Trp Ile His Ser Ile Glu Thr Leu Leu 65 70 75 80 gtc gaa aag ggt gtg ctc acg gca acg gaa ctc gcg acc ggc aag gca 288 Val Glu Lys Gly Val Leu Thr Ala Thr Glu Leu Ala Thr Gly Lys Ala 85 90 95 tct ggc aag aca gcg aca ccg gtg ctg acg ccg gcc atc gtg gac gga 336 Ser Gly Lys Thr Ala Thr Pro Val Leu Thr Pro Ala Ile Val Asp Gly 100 105 110 ctg ctc agc acc ggg gct tct gcc gcc cgg gag gag ggt gcg cgg gcg 384 Leu Leu Ser Thr Gly Ala Ser Ala Ala Arg Glu Glu Gly Ala Arg Ala 115 120 125 cgg ttc gct gtg ggg gac aag gtt cgc gtc ctc aac aag aac ccg gtg 432 Arg Phe Ala Val Gly Asp Lys Val Arg Val Leu Asn Lys Asn Pro Val 130 135 140 ggc cat acc cgc atg ccg cgc tac acg cgg ggc aaa gtg ggg aca gtg 480 Gly His Thr Arg Met Pro Arg Tyr Thr Arg Gly Lys Val Gly Thr Val 145 150 155 160 gtc atc gac cat ggt gtg ttc gtg acg ccg gac acc gcg gca cac gga 528 Val Ile Asp His Gly Val Phe Val Thr Pro Asp Thr Ala Ala His Gly 165 170 175 aag ggc gag cac ccc cag cac gtt tac acc gtg agt ttc acg tcg gtc 576 Lys Gly Glu His Pro Gln His Val Tyr Thr Val Ser Phe Thr Ser Val 180 185 190 gaa ctg tgg ggg caa gac gcc tcc tcg ccg aag gac acg att cgc gtc 624 Glu Leu Trp Gly Gln Asp Ala Ser Ser Pro Lys Asp Thr Ile Arg Val 195 200 205 gac ttg tgg gat gac tac ctg gag cca gcg tga 657 Asp Leu Trp Asp Asp Tyr Leu Glu Pro Ala 210 215 <210> 6 <211> 218 <212> PRT <213> Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D <400> 6 Met Asn Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Ala His Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 Tyr Arg Glu Pro Asn Glu Pro Val Phe Arg Tyr Asp Trp Glu Lys Thr 20 25 30 Val Met Ser Leu Phe Pro Ala Leu Phe Ala Asn Gly Asn Phe Asn Leu 35 40 45 Asp Glu Phe Arg His Gly Ile Glu Arg Met Asn Pro Ile Asp Tyr Leu 50 55 60 Lys Gly Thr Tyr Tyr Glu His Trp Ile His Ser Ile Glu Thr Leu Leu 65 70 75 80 Val Glu Lys Gly Val Leu Thr Ala Thr Glu Leu Ala Thr Gly Lys Ala 85 90 95 Ser Gly Lys Thr Ala Thr Pro Val Leu Thr Pro Ala Ile Val Asp Gly 100 105 110 Leu Leu Ser Thr Gly Ala Ser Ala Ala Arg Glu Glu Gly Ala Arg Ala 115 120 125 Arg Phe Ala Val Gly Asp Lys Val Arg Val Leu Asn Lys Asn Pro Val 130 135 140 Gly His Thr Arg Met Pro Arg Tyr Thr Arg Gly Lys Val Gly Thr Val 145 150 155 160 Val Ile Asp His Gly Val Phe Val Thr Pro Asp Thr Ala Ala His Gly 165 170 175 Lys Gly Glu His Pro Gln His Val Tyr Thr Val Ser Phe Thr Ser Val 180 185 190 Glu Leu Trp Gly Gln Asp Ala Ser Ser Pro Lys Asp Thr Ile Arg Val 195 200 205 Asp Leu Trp Asp Asp Tyr Leu Glu Pro Ala 210 215 <210> 7 <211> 1386 <212> DNA <213> Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D <400> 7 tcgatgccga gttgaagtcg ctgtacccct tttttcaacc acaccaggag aaccgcacca 60 tggggcaatc acacacgcat gaccaccatc acgacgggta ccaggcaccg cccgaagaca 120 tcgcgctgcg ggtcaaggcc ttggagtctc tgctgatcga gaaaggtctt gtcgacccag 180 cggccatgga cttggtcgtc caaacgtatg aacacaaggt aggcccccga aacggcgcca 240 aagtcgtggc caaggcctgg gtggaccctg cctacaaggc ccgtctgctg gcagacggca 300 ctgccggcat tgccgagctg ggcttctccg gggtacaggg cgaggacatg gtcattctgg 360 aaaacacccc cgccgtccac aacgtcgtcg tttgcacctt gtgctcttgc tacccatggc 420 cgacgctggg cttgccccct gcctggtaca aggccccgcc ctaccggtcc cgcatggtga 480 gcgacccgcg tggggttctc gcggagttcg gcctggtgat ccccgcgaag gaaatccgcg 540 tctgggacac cacggccgaa ttgcgctaca tggtgctgcc ggaacggccc gcgggaactg 600 aagcctacag cgaagaacaa ctggccgaac tcgttacccg cgattcgatg atcggcaccg 660 gcctgcccat ccaacccacc ccatctcatt aaggagttcg tcatgaatgg cattcacgat 720 actgggggag cacatggtta tgggccggtt tacagagaac cgaacgaacc cgtctttcgc 780 tacgactggg aaaaaacggt catgtccctg ttcccggcgc tgttcgccaa cggcaacttc 840 aacctcgatg agtttcgaca cggcatcgag cgcatgaacc ccatcgacta cctgaaggga 900 acctactacg aacactggat ccattccatc gaaaccttgc tggtcgaaaa gggtgtgctc 960 acggcaacgg aactcgcgac cggcaaggca tctggcaaga cagcgacacc ggtgctgacg 1020 ccggccatcg tggacggact gctcagcacc ggggcttctg ccgcccggga ggagggtgcg 1080 cgggcgcggt tcgctgtggg ggacaaggtt cgcgtcctca acaagaaccc ggtgggccat 1140 acccgcatgc cgcgctacac gcggggcaaa gtggggacag tggtcatcga ccatggtgtg 1200 ttcgtgacgc cggacaccgc ggcacacgga aagggcgagc acccccagca cgtttacacc 1260 gtgagtttca cgtcggtcga actgtggggg caagacgcct cctcgccgaa ggacacgatt 1320 cgcgtcgact tgtgggatga ctacctggag ccagcgtgat catgaaagac gaacggtttc 1380 cattgc 1386 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 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660 tgtcactaac tgtggcccac ccccgccgcg ctgcgcgcga ccccctccag ggggcaaacc 720 gagtggcccg gcggagccgg ttccaccgcg ttcccggtgg ggtgcactgc tggcgttgcg 780 ggtcttgttt cggctggatg gtttcttgac ggagccacac cgtcgctcat ctgtatatgg 840 agagggtcat gatttttcga cgcttgatct gggcggcgct ggccgtggcc ttgctggtgg 900 gcagtttgca gtcgggtctg cag 923 <210> 11 <211> 2223 <212> DNA <213> Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D <400> 11 atggggcaat cacacacgca tgaccaccat cacgacgggt accaggcacc gcccgaagac 60 atcgcgctgc gggtcaaggc cttggagtct ctgctgatcg agaaaggtct tgtcgaccca 120 gcggccatgg acttggtcgt ccaaacgtat gaacacaagg taggcccccg aaacggcgcc 180 aaagtcgtgg ccaaggcctg ggtggaccct gcctacaagg cccgtctgct ggcagacggc 240 actgccggca ttgccgagct gggcttctcc ggggtacagg gcgaggacat ggtcattctg 300 gaaaacaccc ccgccgtcca caacgtcgtc gtttgcacct tgtgctcttg ctacccatgg 360 ccgacgctgg gcttgccccc tgcctggtac aaggccccgc cctaccggtc ccgcatggtg 420 agcgacccgc gtggggttct cgcggagttc ggcctggtga tccccgcgaa ggaaatccgc 480 gtctgggaca ccacggccga attgcgctac atggtgctgc cggaacggcc cgcgggaact 540 gaagcctaca gcgaagaaca actggccgaa ctcgttaccc gcgattcgat gatcggcacc 600 ggcctgccca tccaacccac cccatctcat taaggagttc gtcatgaatg gcattcacga 660 tactggggga gcacatggtt atgggccggt ttacagagaa ccgaacgaac ccgtctttcg 720 ctacgactgg gaaaaaacgg tcatgtccct gttcccggcg ctgttcgcca acggcaactt 780 caacctcgat gagtttcgac acggcatcga gcgcatgaac cccatcgact acctgaaggg 840 aacctactac gaacactgga tccattccat cgaaaccttg ctggtcgaaa agggtgtgct 900 cacggcaacg gaactcgcga ccggcaaggc atctggcaag acagcgacac cggtgctgac 960 gccggccatc gtggacggac tgctcagcac cggggcttct gccgcccggg aggagggtgc 1020 gcgggcgcgg ttcgctgtgg gggacaaggt tcgcgtcctc aacaagaacc cggtgggcca 1080 tacccgcatg ccgcgctaca cgcggggcaa agtggggaca gtggtcatcg accatggtgt 1140 gttcgtgacg ccggacaccg cggcacacgg aaagggcgag cacccccagc acgtttacac 1200 cgtgagtttc acgtcggtcg aactgtgggg gcaagacgcc tcctcgccga aggacacgat 1260 tcgcgtcgac ttgtgggatg actacctgga gccagcgtga tcatgaaaga cgaacggttt 1320 ccattgccag agggttcgct gaaggacctc gatggccctg tgtttgacga gccttggcag 1380 tcccaggcgt ttgccttggt ggtcagcatg cacaaggccg gtctctttca gtggaaagac 1440 tgggccgaga ccttcaccgc cgaaatcgac gcttccccgg ctctgcccgg cgaaagcgtc 1500 aacgacacct actaccggca atgggtgtcg gcgctggaaa agttggtggc gtcgctgggg 1560 cttgtgacgg gtggagacgt caactcgcgc gcacaggagt ggaaacaggc ccacctcaac 1620 accccacatg ggcacccgat cctgctggcc catgcgcttt gcccgccagc gatcgacccc 1680 aagcacaagc acgagccaaa acgctcaccg atcaaggtcg ttgccgcaat ggcttgagat 1740 ccactgtcct gtttccctac cttgaatgga gtaaaccatg agttcatttt ctaccactgc 1800 cgtccccgcc gcccagcgcc tgagcgccac gcgcagctta ctgttgcaac tgtccgctgg 1860 cgccgcgctg ggcctggtcg tcctgtacgg cgtggctttt gccgaaagcc cgcttgcgca 1920 caacgccgcg cacgatgttc gccacgtgac ggtcaagcct tgtcactaac tgtggcccac 1980 ccccgccgcg ctgcgcgcga ccccctccag ggggcaaacc gagtggcccg gcggagccgg 2040 ttccaccgcg ttcccggtgg ggtgcactgc tggcgttgcg ggtcttgttt cggctggatg 2100 gtttcttgac ggagccacac cgtcgctcat ctgtatatgg agagggtcat gatttttcga 2160 cgcttgatct gggcggcgct ggccgtggcc ttgctggtgg gcagtttgca gtcgggtctg 2220 cag 2223 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Primer 3 <400> 12 ctgaagcttc aaggtaggga aacaggacag 30 <210> 13 <211> 216 <212> DNA <213> Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D <220> <221> CDS <222> (1)..(216) <400> 13 atg gcc ctg tgt ttg acg agc ctt ggc agt ccc agg cgt ttg cct tgg 48 Met Ala Leu Cys Leu Thr Ser Leu Gly Ser Pro Arg Arg Leu Pro Trp 1 5 10 15 tgg tca gca tgc aca agg ccg gtc tct ttc agt gga aag act ggg ccg 96 Trp Ser Ala Cys Thr Arg Pro Val Ser Phe Ser Gly Lys Thr Gly Pro 20 25 30 aga cct tca ccg ccg aaa tcg acg ctt ccc cgg ctc tgc ccg gcg aaa 144 Arg Pro Ser Pro Pro Lys Ser Thr Leu Pro Arg Leu Cys Pro Ala Lys 35 40 45 gcg tca acg aca cct act acc ggc aat ggg tgt cgg cgc tgg aaa agt 192 Ala Ser Thr Thr Pro Thr Thr Gly Asn Gly Cys Arg Arg Trp Lys Ser 50 55 60 tgg tgg cgt cgc tgg ggc ttg tga 216 Trp Trp Arg Arg Trp Gly Leu 65 70 <210> 14 <211> 71 <212> PRT <213> Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D <400> 14 Met Ala Leu Cys Leu Thr Ser Leu Gly 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gggatcgtgc tacccgaagc cagcgcctac caccgcacga tgctgcgcga gtcacccgag 600 ctctacaccg ccgatgtccg catactgctg gaactcggaa atctagtcac cgccaccgac 660 tacctgcag 669 <210> 16 <211> 1407 <212> DNA <213> Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D <220> <221> CDS <222> (1)..(1407) <400> 16 atg agt tcg cta acc cgc ctc acc ctc gcg caa gtt gcg cag aaa ctt 48 Met Ser Ser Leu Thr Arg Leu Thr Leu Ala Gln Val Ala Gln Lys Leu 1 5 10 15 aag gca cgg gaa gtc tcc gcc gtt gaa gtt ctg gac gcc tgt ctg acg 96 Lys Ala Arg Glu Val Ser Ala Val Glu Val Leu Asp Ala Cys Leu Thr 20 25 30 cag gtg cgc tcc acc gaa aaa cag atc agt gcg tac gtg tgc gtg ctg 144 Gln Val Arg Ser Thr Glu Lys Gln Ile Ser Ala Tyr Val Cys Val Leu 35 40 45 gag gat cag gcc cgt gca gca gcc cag caa gct gac gcc gac atc agc 192 Glu Asp Gln Ala Arg Ala Ala Ala Gln Gln Ala Asp Ala Asp Ile Ser 50 55 60 gcc ggg cgc tgg aaa ggc ccg ctg cat ggc gtg cct gta gcg gtc aag 240 Ala Gly Arg Trp Lys Gly Pro Leu His Gly Val Pro Val Ala Val Lys 65 70 75 80 gac tta tac gac atc gct ggc gta ccc acc acg gca tcg tcg cgc cag 288 Asp Leu Tyr Asp Ile Ala Gly Val Pro Thr Thr Ala Ser Ser Arg Gln 85 90 95 cgc acg aat tgg acg ccg cag caa gac tgc gcc gta gtc cgg cgc ttg 336 Arg Thr Asn Trp Thr Pro Gln Gln Asp Cys Ala Val Val Arg Arg Leu 100 105 110 aaa gac gca ggt gcc gtt atc ctt ggc aag acc cat acg cac gaa ttc 384 Lys Asp Ala Gly Ala Val Ile Leu Gly Lys Thr His Thr His Glu Phe 115 120 125 gcc tat ggc gtc atc act ccg aag tcg cgc aac ccc tgg gac ccg gga 432 Ala Tyr Gly Val Ile Thr Pro Lys Ser Arg Asn Pro Trp Asp Pro Gly 130 135 140 aga aca ccg ggt ggc tcc agc ggc ggc tcg gcg gcc acg gtc gca gcc 480 Arg Thr Pro Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ala Ala Thr Val Ala Ala 145 150 155 160 tgc ggc gtc tac ttg gcg acc ggc acc gac acc ggt gga tcc gtt cgc 528 Cys Gly Val Tyr Leu Ala Thr Gly Thr Asp Thr Gly Gly Ser Val Arg 165 170 175 atc cct tcg tcg atg tgc aac acc gta ggc ctg aag cca acc tac ggg 576 Ile Pro Ser Ser Met Cys Asn Thr Val Gly Leu Lys Pro Thr Tyr Gly 180 185 190 cgc gtg agc cgt gcc 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ggg atc gtg cta ccc gaa gcc agc gcc tac cac cgc acg atg 960 Glu Phe Gly Ile Val Leu Pro Glu Ala Ser Ala Tyr His Arg Thr Met 305 310 315 320 ctg cgc gag tca ccc gag ctc tac acc gcc gat gtc cgc ata ctg ctg 1008 Leu Arg Glu Ser Pro Glu Leu Tyr Thr Ala Asp Val Arg Ile Leu Leu 325 330 335 gaa ctc gga aat cta gtc acc gcc acc gac tac ctg cag gcg cag cgc 1056 Glu Leu Gly Asn Leu Val Thr Ala Thr Asp Tyr Leu Gln Ala Gln Arg 340 345 350 gtc cgt acg ctg atg cag cgc gcg gtg gcc gag atg ttc cag cgc atc 1104 Val Arg Thr Leu Met Gln Arg Ala Val Ala Glu Met Phe Gln Arg Ile 355 360 365 gat gtg ctg atc gca ccc aca ctg ccc atc ccg gct gct cgc agc ggg 1152 Asp Val Leu Ile Ala Pro Thr Leu Pro Ile Pro Ala Ala Arg Ser Gly 370 375 380 gag gag gtc cac aca tgg ccg gac ggc acg gta gag gcg ttg ttc atg 1200 Glu Glu Val His Thr Trp Pro Asp Gly Thr Val Glu Ala Leu Phe Met 385 390 395 400 gcc tat acg cgc ttc acc tcg ttc ggc aac gtg aca gga tta ccc acg 1248 Ala Tyr Thr Arg Phe Thr Ser Phe Gly Asn Val Thr Gly Leu Pro 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gagttcgtca tgaatggcat tcacgatact 2340 gggggagcac atggttatgg gccggtttac agagaaccga acgaacccgt ctttcgctac 2400 gactgggaaa aaacggtcat gtccctgttc ccggcgctgt tcgccaacgg caacttcaac 2460 ctcgatgagt ttcgacacgg catcgagcgc atgaacccca tcgactacct gaagggaacc 2520 tactacgaac actggatcca ttccatcgaa accttgctgg tcgaaaaggg tgtgctcacg 2580 gcaacggaac tcgcgaccgg caaggcatct ggcaagacag cgacaccggt gctgacgccg 2640 gccatcgtgg acggactgct cagcaccggg gcttctgccg cccgggagga gggtgcgcgg 2700 gcgcggttcg ctgtggggga caaggttcgc gtcctcaaca agaacccggt gggccatacc 2760 cgcatgccgc gctacacgcg gggcaaagtg gggacagtgg tcatcgacca tggtgtgttc 2820 gtgacgccgg acaccgcggc acacggaaag ggcgagcacc cccagcacgt ttacaccgtg 2880 agtttcacgt cggtcgaact gtgggggcaa gacgcctcct cgccgaagga cacgattcgc 2940 gtcgacttgt gggatgacta cctggagcca gcgtgatcat gaaagacgaa cggtttccat 3000 tgccagaggg ttcgctgaag gacctcgatg gccctgtgtt tgacgagcct tggcagtccc 3060 aggcgtttgc cttggtggtc agcatgcaca aggccggtct ctttcagtgg aaagactggg 3120 ccgagacctt caccgccgaa atcgacgctt ccccggctct gcccggcgaa agcgtcaacg 3180 acacctacta ccggcaatgg gtgtcggcgc tggaaaagtt ggtggcgtcg ctggggcttg 3240 tgacgggtgg agacgtcaac tcgcgcgcac aggagtggaa acaggcccac ctcaacaccc 3300 cacatgggca cccgatcctg ctggcccatg cgctttgccc gccagcgatc gaccccaagc 3360 acaagcacga gccaaaacgc tcaccgatca aggtcgttgc cgcaatggct tgagatccac 3420 tgtcctgttt ccctaccttg aagcttcag 3449

Claims (38)

1. 니트릴 하이드라타제 효소의 알파-서브유닛을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하고, 상기 폴리펩티드가 서열번호 4에 나타내어진 바와 같은 아미노산 서열을 갖는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
2. 서열번호 4에 나타내어진 바와 같은 코마모나스 테스토스테로니(Comamonas testosteroni) 5-MGAM-4D로부터 니트릴 하이드라타제 효소의 폴리펩티드 알파-서브유닛에 90% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
3. 니트릴 하이드라타제 효소의 알파-서브유닛을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하고, 서열번호 3에 나타내어진 핵산 서열을 갖는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
4. 서열번호 4에 나타내어진 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
5. 니트릴 하이드라타제 효소의 베타-서브유닛을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하고, 상기 폴리펩티드가 서열번호 6에 나타내어진 바와 같은 아미노산 서열을 갖는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
6. 니트릴 하이드라타제 효소의 베타-서브유닛을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하고, 서열번호 5에 나타내어진 핵산 서열을 갖는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
7. 서열번호 6에 나타내어진 바와 같은 폴리펩티드에 80% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고, 폴리펩티드가 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터 니트릴 하이드라타제 효소의 베타-서브유닛인, 단리된 폴리뉴클레오티드.
8. 서열번호 6에 나타내어진 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
9. 니트릴 하이드라타제 효소의 알파- 및 베타-서브유닛을 코딩하고, 서열번호 7에 나타내어진 바와 같은 핵산 서열을 갖는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
10. 니트릴 하이드라타제 효소의 알파- 및 베타-서브유닛 및 부속 단백질을 코딩하고, 서열번호 11에 나타내어진 바와 같은 핵산 서열을 갖는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
11. 아미다제를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하고, 상기 폴리펩티드가 서열번호 17에 나타내어진 바와 같은 아미노산 서열을 갖는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
12. 아미다제 활성을 갖고 서열번호 17에 나타내어진 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 폴리펩티드에 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
13. 아미다제 효소를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하고, 서열번호 16에 나타내어진 핵산 서열을 갖는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
14. 서열번호 17에 나타내어진 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
15. 부속 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하고, 상기 폴리펩티드가 서열번호 14에 나타내어진 아미노산 서열을 갖는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
16. 부속 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하고, 서열번호 13에 나타내어진 핵산 서열을 갖는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
17. 서열번호 14에 나타내어진 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
18. 니트릴 하이드라타제 효소의 알파- 및 베타-서브유닛, 부속 단백질 및 아미다제를 코딩하고, 상기 니트릴 하이드라타제 효소의 알파- 및 베타-서브유닛, 부속 단백질 및 아미다제가 서열번호 23에 나타내어진 바와 같은 핵산 서열에 의해 코딩되는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
19. 제1 내지 3항, 5 내지 7항, 9 내지 13항, 15 내지 16항 및 18항 중 어느 한 항의 핵산 서열 중 어느 하나를 포함하는 발현벡터.
20. ATCC PTA-5073으로 지정된 E. 콜라이(E. coli) SW132에 함유된 것과 같은 발현벡터.
21. ATCC PTA-5074으로 지정된 E. 콜라이 SW137에 함유된 것과 같은 발현벡터.
22. 제19항의 발현벡터를 포함하는 형질전환된 미생물 숙주세포.
23. 제20항 또는 제21항의 발현벡터를 포함하는 형질전환된 미생물 숙주세포.
24. 제24항에 있어서, 미생물 숙주세포가

    a) 에스케리키아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 로도코커스(Rhodococcus), 아시네토박터(Acinectobacter), 바실러스(Bacillus) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세균;

    b) 피치아(Pichia), 한세눌라(Hansenula) 및 사카로마이세스(Saccharomyces) 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 효모; 또는

    c) 아스퍼질러스(Aspergillus), 뉴로스포라(Neurospora) 및 페니실리움(Penicillium) 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 필라멘트상 진균인 형질전환된 미생물 숙주세포.
25. 제20항에 있어서, 미생물 숙주세포가 에스케리키아. 콜라이(Escherichia coli)인 형질전환된 미생물 숙주세포.
26. ATCC PTA-5073으로 지정된 에스케리키아. 콜라이 SW132 및 ATCC PTA-5074로 지정된 에스케리키아. 콜라이 SW137로 이루어진 군으로부터 선택되는 정제된 형질전환된 미생물 숙주세포.
27. a) 제19항의 발현벡터를 함유하는 형질전환된 미생물 숙주세포를 적당한 조건 하에서 배양하는 단계; 및

    b) 단계 a)에서 생산된 폴리펩티드를 회수하는 단계

    를 포함하는, 폴리펩티드의 생산방법.
28. a) 서열번호 11의 핵산 서열에 의해 코딩되는 니트릴 하이드라타제 폴리펩티드를 발현하는 형질전환된 미생물 숙주세포를 적당한 반응 조건 하에서 하나 이상의 니트릴 기능기를 함유하는 기질과 접촉시키는 단계; 및

    b) 단계 a)에서 생산된 아미드를 회수하는 단계

    를 포함하는, 하나 이상의 니트릴 기능기를 함유하는 기질을 아미드로 전환하는 방법.
29. 제29항에 있어서, 적어도 하나의 니트릴 기능기를 함유하는 기질이 화학식 화학식 1 R-C≡N 또는 화학식 2 N≡C-R-C≡N(여기에서 N은 질소이고, C는 탄소이며, R은

    a) 선형, 분지형 또는 사이클릭의, 임의로 치환된 C₁-C₉ 알킬;

    b) 선형, 분지형 또는 사이클릭의, 임의로 치환된 C₁-C₉ 알케닐; 또는

    c) 임의로 치환된, C₁-C₉ 아릴:이다)

    의 니트릴인 방법.
30. 제30항에 있어서, 니트릴이 2-하이드록시니트릴, 3-하이드록시니트릴 또는 4-하이드록시니트릴인 방법.
31. 제30항에 있어서, 화학식 2의 R이 선형 또는 분지형 C₁-C₄ 알킬인 방법.
32. 제32항에 있어서, 니트릴이 말로노니트릴, 아디포니트릴, 글루타로니트릴 및 2-메틸글루타로니트릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
33. 제30항에 있어서, 화학식 1의 R이 선형 또는 분지형 C₁-C₄ 알킬인 방법.
34. 제34항에 있어서, 니트릴이 아크릴로니트릴 또는 메타크릴로니트릴인 방법.
35. a) 메타크릴로니트릴을, 적당한 반응 조건 하에서, 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 촉매와 접촉시키는 단계

    를 포함하는 메타크릴로니트릴을 메타크릴아미드로 수화하는 방법.
36. 제36항에 있어서,

    b) 단계 a)에서 생산된 메타크릴아미드를 회수하는 단계

    를 추가로 포함하는 방법.
37. a) 아크릴로니트릴을, 적당한 반응 조건 하에서 코마모나스 테스토스테로니 5-MGAM-4D로부터의 니트릴 하이드라타제 활성을 갖는 촉매와 접촉시키는 단계

    를 포함하는 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 수화하는 방법.
38. 제38항에 있어서,

    b) 단계 a)에서 형성된 아크릴아미드를 회수하는 단계

    를 추가로 포함하는 방법.