KR20050085539A - 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤의 멀티 정량법 - Google Patents

저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤의 멀티 정량법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혈중의 피검 성분인 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤과 총 콜레스테롤의 동시 측정 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 생체 시료 중의 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 1회의 측정으로 정량하는, 생체 시료의 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 동시에 측정하는 방법이다.

Description

저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤의 멀티 정량법{Method of Multiple Quantification of Cholesterol in Low-Density Lipoproteins}
본 발명은 혈중의 피검 성분인 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤과 총 콜레스테롤의 동시 측정 방법에 관한 것이다.
저밀도 리포단백질(이하,「LDL」이라고 함)은 혈액 중의 콜레스테롤 운반의 주역이며, 특히 죽상 동맥경화에 있어서 혈관벽에 침착된 콜레스테롤은 주로 LDL에 유래하고 있다. LDL 콜레스테롤의 증가는 동맥경화성 질환의 주요 위험 인자 중 하나이며, 분별 정량하는 것은 임상상 유용하다. 또한, 총 콜레스테롤 측정이란 카이로미크론(CM), 초저밀도 리포단백질(VLDL), LDL, 고밀도 리포단백질(HDL) 등의 모든 리포단백질 중의 콜레스테롤을 측정하는 것이며, 현재에도 지질 검사의 중심이 되고 있다.
종래로부터의 LDL 콜레스테롤의 정량 방법은, 분획과 콜레스테롤 정량의 두가지 조작으로부터 구하는 방법과, 총 콜레스테롤, HDL 콜레스테롤, 트리글리세라이드 값으로부터 구하는 프리데발트(Friedewald)식에 의한 연산 방법이 있다.
분획 조작으로서는 초원심법, 침전법, 면역법 등이 있지만, 시료의 원심 처리 또는 필터 처리에 의한 조작이 필요하여, 임상 검사에 있어서 간편성이나 경제성면에서 보급되기 어려운 상황이었다. 또한, 프리델발트식에 의한 연산 방법도 그 사용에 제한이 있고, 개체의 차이를 가미하고 있지 않기 때문에 정확성에 문제가 있었다.
그러나, 최근 들어 분획 조작을 필요로 하지 않는 LDL 콜레스테롤 정량 방법(일본 특허 공개 (평)11-318496호 공보)이 보고되어, 현재 임상 검사용 시약으로서 검사시 적용되고 있다. 이 방법은 제1 공정에서 시료 중의 LDL 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤을 선택적으로 소거하고(소거란 에스테르형 콜레스테롤과 유리형 콜레스테롤을 분해하여, 그 분해물이 제2 공정에서 검출되지 않도록 하는 것을 의미함), 제2 공정에서 LDL 콜레스테롤을 정량하는 것이다.
그러나, 상기 LDL 콜레스테롤 측정용 시약은 임상상 유용한 시약임에도 불구하고, 종래부터 총 콜레스테롤 측정이 널리 행해지고 있으며, 프리델발트식으로부터 LDL 콜레스테롤치를 구할 수 있다는 등의 사정에 의해 보급되기 어려운 상황에 있었다. 그러나, 상술한 바와 같이 프리델발트식으로 구하는 LDL 콜레스테롤치에는 문제점이 있어, 정확한 LDL 콜레스테롤치의 측정은 임상적으로 의의가 있다. 따라서, 시약의 지속적인 개량에 추가하여, 임상적인 의의가 높은 LDL 콜레스테롤 측정용 시약을 보급시키는 것이 요구되고 있었다.
한편, HDL 중의 콜레스테롤의 측정에 대하여 1회의 측정으로 HDL 중의 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 연속적으로 측정하는 방법이 보고되어 있다(M L Sampson et al., Ann Clin Biochem, 37, 479-487, 2000). 이 방법은 시료를 단일 시험용 튜브에 넣어 시료 중의 HDL 콜레스테롤을 항 아포B 항체를 이용하여 측정하고, 이어서 항 아포B 항체와 아포B 항체의 복합체, 즉 항 아포B 항체와 HDL 콜레스테롤이 결합된 것을 데옥시콜산을 이용하여 파괴하고, 남은 비-HDL 콜레스테롤을 효소적으로 측정하는 것이며, 2회의 측정치를 합계함으로써 총 콜레스테롤치를 알 수 있는 것이다. 총 콜레스테롤 및 HDL 콜레스테롤은 종래부터 건강 진단 등에서 널리 측정되고 있으며, 두 값을 한번에 측정할 수 있다는 것은 의의가 있다.
도 1은 본 발명의 멀티 정량 방법의 원리를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 멀티 정량 방법에 의해 측정한 LDL 중의 콜레스테롤치와, 단독으로 측정한 LDL 중의 콜레스테롤치의 상관 관계를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 멀티 정량 방법에 의해 측정한 총 콜레스테롤치와, 단독으로 측정한 총 콜레스테롤치의 상관 관계를 나타내는 도면이다.
본 발명의 목적은 1회의 측정으로 LDL 콜레스테롤과 총 콜레스테롤의 동시 정량을 가능하게 하는 방법을 제공하는 것이며, 1회의 측정으로 복수 항목의 정량치를 얻을 수 있는 멀티 정량 방법으로서 유효한 것이다.
본 발명자들은 최근 주목받고 있는 LDL 콜레스테롤의 정확한 측정의 중요성, 및 종래부터 잘 알려져 있는 총 콜레스테롤 측정의 중요성을 감안하여, LDL 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 동시에 측정하는 계의 확립에 대하여 예의 검토를 거듭하였다.
본원 발명자들은 상기 LDL 콜레스테롤 정량 방법의 일부를 변경하고, 임상 화학 검사에서 사용되고 있는 자동 분석 장치의 다항목 동시 분석 기능, 즉 1회의 측정으로 다른 조건에서 측정치를 분석할 수 있는 기능을 이용함으로써, 1회의 측정으로 LDL 콜레스테롤과 총 콜레스테롤의 동시 정량을 가능하게 하였다.
구체적인 정량 방법으로서는, 종래 방법에 있어서 제1 공정에서 시료 중의 LDL 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤을 선택적으로 소거한 것을 검출할 수 있도록 하고, 제2 공정에서의 LDL 콜레스테롤 반응을 검출할 수 있도록 한 것이다.
도 1에 본 발명 방법의 원리를 나타낸다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법은 2 공정을 포함한다. 제1 공정에 있어서는 시료 중의 LDL 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤에 기초하는 반응이 일어나, 이 반응에 의한 반응액의 흡광도 변화가 측정되고, 제2 공정에 있어서는 시료 중의 LDL 중 콜레스테롤에 기초하는 반응이 일어나, 이 반응에 의한 반응액의 흡광도 변화가 측정된다. 제2 공정의 흡광도 변화는 LDL 콜레스테롤의 양에 대응하며, 제1 공정과 제2 공정 양쪽의 흡광도 변화를 합친 흡광도 변화는 총 콜레스테롤량의 변화에 대응한다. 이 흡광도 변화를 자동 분석 장치에 의해 측정할 때의 분석 조건을 변화시킴으로써, 1회의 측정으로 동시에 다항목의 측정을 행할 수 있다. 도 1은 측정 방법의 일례의 원리를 나타낸 것이며, 제1 공정에 있어서 LDL 중의 콜레스테롤에만 기초하는 반응이 일어나고, 제2 공정에 있어서 LDL 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤에 기초하는 반응이 일어날 수도 있다.
자동 분석 장치의 다항목 동시 분석에 있어서의 하나의 측정 조건은, 도 1에 나타낸 제1 공정과 제2 공정의 반응에서의 흡광도 차이(제2 공정에서의 흡광도를 측정하고, 측정 2의 흡광도로부터 제1 공정에서의 흡광도를 측정하여, 측정 1의 흡광도를 뺀 것)를 구함으로써 LDL 콜레스테롤의 정량을 행하는 것이다.
또 하나의 측정 조건은, 제1 공정에서의 흡광도 변화량과 제2 공정에서의 흡광도 변화량의 합계인 총 흡광도량(측정 2의 흡광도)을 구함으로써, 총 콜레스테롤의 정량을 행하는 것이다.
이와 같이, 본 발명은 자동 분석 장치의 다항목 동시 분석 기능을 이용하여, 생체 시료 중의 피검 성분인 LDL 콜레스테롤과 총 콜레스테롤치를 1회의 측정으로 동시에 정량하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
(1) 생체 시료 중의 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 1회의 측정으로 정량하는, 생체 시료의 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 동시 측정하는 방법,
(2) 상기 (1)에 있어서, 생체 시료 중의 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤을 반응시키는 제1 공정, 및 이어서 잔존하는 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤을 반응시키는 제2 공정을 포함하는 방법,
(3) 상기 (1)에 있어서, 생체 시료 중의 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤의 존재량을 반영한 측정치, 및 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤의 존재량을 반영한 측정치를 1회의 측정으로 얻고, 상기 두가지 값에 기초하여 생체 시료 중의 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤과 총 콜레스테롤의 존재량을 동시에 측정하는 방법,
(4) 상기 (3)에 있어서, 생체 시료 중의 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤의 존재량을 반영한 측정치를 얻는 제1 공정, 및 잔존하는 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤의 존재량을 반영한 측정치를 얻는 제2 공정을 포함하는 방법,
(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 공정이 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질에 작용하는 계면활성제의 존재하에서, 생체 시료 중의 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질에 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제 효소를 작용시켜 생성된 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시켜 측정하거나, 또는 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 데히드로게나제 효소를 작용시켜 생성된 NADH(β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 환원형)를 측정하는 것을 포함하는 방법,
(6) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 공정이 제1 공정 의 반응 후 산물에 적어도 저밀도 리포단백질에 작용하는 계면활성제를 첨가하고, 잔존하는 저밀도 리포단백질에 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제 효소를 작용시켜 생성된 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시켜 측정하거나, 또는 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 데히드로게나제 효소를 작용시켜 생성된 NADH(β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 환원형)를 측정하는 것을 포함하는 방법,
(7) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 한 항에 있어서, 임상 화학 검사용 자동 분석 장치를 이용하여 1회의 측정으로 다른 측정 조건에서 분석을 행하는 방법,
(8) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 한 항에 있어서, 제1 공정과 제2 공정에서 측정치로서 얻어지는 흡광도의 차이를 구함으로써 혈중 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤의 정량을 행하는 방법,
(9) 상기 (1) 내지 (8) 중 어느 한 항에 있어서, 제1 공정에서 측정치로서 얻어지는 흡광도 변화량과 제2 공정에서 측정치로서 얻어지는 흡광도 변화량으로부터 총 흡광도량을 구함으로써 총 콜레스테롤의 정량을 행하는 방법,
(10) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 생체 시료 중의 저밀도 리포단백질 중 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 동시 측정하기 위한 시약 조성물,
(11) 상기 (10)에 있어서, 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질에 작용하는 계면활성제, 적어도 저밀도 리포단백질에 작용하는 계면활성제, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제를 포함하는 시약 조성물,
(12) 상기 (10)에 있어서, 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질에 작용하는 계면활성제, 적어도 저밀도 리포단백질에 작용하는 계면활성제, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 데히드로게나제를 포함하는 시약 조성물.
본 발명은 생체 시료 중의 LDL 중 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 1회의 측정으로 정량하는, 생체 시료의 LDL 중 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 동시 측정하는 방법이다. 구체적으로는, 본 발명의 방법은 생체 시료 중의 LDL 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤을 반응시키는 제1 공정과, 이어서 잔존하는 LDL 중의 콜레스테롤을 반응시키는 제2 공정을 포함한다. 예를 들면, 생체 시료 중의 LDL 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤의 존재량을 반영한 측정치, 및 LDL 중의 콜레스테롤의 존재량을 반영한 측정치를 1회의 측정으로 얻고, 상기 두가지 값에 기초하여 생체 시료 중의 LDL 중 콜레스테롤과 총 콜레스테롤의 존재량을 동시에 측정함으로써 본 발명의 방법을 행할 수 있다.
리포단백질 중에 포함되는 콜레스테롤로서는 에스테르형 콜레스테롤(콜레스테롤 에스테르) 및 유리형 콜레스테롤이 있다. 본 명세서에 있어서, 단순히「콜레스테롤」이라고 하는 경우에는 이들 두가지를 포함한다.
본 발명의 방법에 사용되는 생체 시료로서는 HDL, LDL, VLDL 및 CM 등의 리포단백질을 포함할 수도 있는 시료이며, 예를 들면 혈액, 혈청, 혈장 등의 체액이나 그의 희석물을 들 수 있지만, 이것들로 한정되는 것은 아니다. 「LDL 이외의 리포단백질」이란 HDL, VLDL, CM 등을 말한다.
「LDL 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤의 존재량을 반영한 측정치」또는 「LDL 중의 콜레스테롤의 존재량을 반영한 측정치」란, 생체 시료 중의 리포단백질 중 콜레스테롤의 농도 또는 절대량을 정량했을 경우 얻어지는 값을 말한다. 측정 방법은 한정되지 않으며, 복수의 방법을 조합하여 최종적으로 생체 시료 중의 리포단백질 중 콜레스테롤의 농도 또는 절대량에 따른 값, 예를 들면 비례 또는 반비례한 값이 얻어지는 경우, 그 값을 말한다. 예를 들면, 리포단백질의 콜레스테롤을 특정한 약제로 처리함으로써 생성되는 화합물에 기인하는 흡광도를 측정치의 일례로서 들 수 있다. 또한, 이 경우의 측정치에는 절대치 및 변화치도 포함된다. 예를 들면, 도 1에 나타낸 제1 공정 및 제2 공정에서의 흡광도 변화는, 제1 공정에서 상승한 흡광도에 제2 공정에서 상승한 흡광도가 부가되어 있다. 이것은 제1 공정의 반응에서 생성되는 화합물과 제2 공정의 반응에서 생성되는 화합물의 흡수 파장이 동일하기 때문이다. 제1 공정의 반응에서 생성되는 화합물과 제2 공정의 반응에서 생성되는 화합물의 흡수 파장은 상이할 수 있으며, 이 경우에는 제2 공정에서 상승한 흡광도가 제1 공정에서 상승한 흡광도에 부가되지 않고, 별도의 파장에서 측정한 흡광도가 제2 공정이 개시되면 0에서부터 상승한다. 도 1에서 제1 공정의 측정 1에 의해 LDL 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤의 존재량을 반영한 흡광도를 얻을 수 있는데, 이 흡광도는「LDL 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤의 존재량을 반영한 측정치」이다. 또한, 제2 공정에 있어서, 제1 공정에서 얻어진 LDL 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤의 존재량을 반영한 흡광도에 LDL 중의 콜레스테롤의 존재량에 대응한 흡광도가 부가된 형태로 측정 2에 의해 흡광도가 얻어지며, 이 흡광도는 총 콜레스테롤의 존재량을 나타내지만, 제1 공정에서 얻어진 흡광도에 LDL 중의 콜레스테롤의 존재량에 대응한 흡광도가 부가되어 있기 때문에, 「LDL 중의 콜레스테롤의 존재량을 반영한 측정치」이다. 또한, 이와 같이 흡광도가 부가되어 있는 것을 고려하면, 이 「LDL 중의 콜레스테롤의 존재량을 반영한 측정치」는 「LDL 중의 콜레스테롤의 존재량을 반영한 값을 포함하는 측정치」라고 할 수도 있다. 또한, 이러한 경우, 부가된 LDL 중의 콜레스테롤의 존재량에 대응한 흡광도의 변화치도 「LDL 중의 콜레스테롤의 존재량을 반영한 측정치」이다. 즉, 제2 공정에 있어서 흡광도의 변화분만을 측정할 수도 있다.
한편, 제1 공정에서 생성되는 화합물과 제2 공정에서 생성되는 화합물의 흡수 파장이 상이한 경우에는, 제1 공정에서의 측정에 의해 얻어지는 흡광도가 「LDL 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤의 존재량을 반영한 측정치」이고, 제2 공정에 있어서 제1 공정과는 다른 파장에서 측정하여 얻어지는 흡광도가 「LDL 중의 콜레스테롤의 존재량을 반영한 측정치」이다.
2종류의 측정치를 1회의 측정으로 얻는 경우의 「1회의 측정」이란, 생체 시료를 측정에 사용하고 나서 필요한 복수의 측정치를 얻기까지의 일련의 처리를 포함하며, 1회의 측정 동안에는 복수회의 시약 첨가나 측정치의 획득이 포함된다. 바람직하게는 단일 측정용 튜브 또는 웰 중에서 1회의 측정이 완료된다.
「두가지 측정치에 기초하여 생체 시료 중의 LDL 중 콜레스테롤과 총 콜레스테롤의 존재량을 동시에 얻는다」라는 것은, 두가지 측정치로부터 연산에 의해 LDL 중의 콜레스테롤 및 총 콜레스테롤의 농도 또는 절대량을 얻는 것을 말한다. 예를 들면, 도 1에 있어서 측정 2에서 얻어진 측정치에 의해 총 콜레스테롤의 존재량을 알 수 있고, 측정 2에서 얻어진 측정치로부터 측정 1에서 얻어진 측정치를 차감함으로써 LDL 중의 콜레스테롤의 존재량을 알 수 있다. 상술한 바와 같이 제1 공정의 반응에서 생성되는 화합물과 제2 공정의 반응에서 생성되는 화합물의 흡수 파장이 상이한 경우에는, 제2 공정의 측정에서 얻어진 측정치로부터 LDL 중의 콜레스테롤의 존재량을 알 수 있고, 제1 공정의 측정치와 제2 공정의 측정치를 더한 것으로부터 총 콜레스테롤의 존재량을 알 수 있다.
본 발명의 방법은 제1 공정 및 제2 공정을 포함하며, 제1 공정에서는 시료 중의 LDL 이외의 리포단백질인 HDL, VLDL 및 CM 중의 콜레스테롤을 처리하여 존재량을 반영한 측정치를 유도하고, 이어지는 제2 공정에서는 잔존하는 LDL 콜레스테롤을 처리하여 존재량을 반영한 측정치를 유도한다. 여기서, 처리란 화학적, 물리적 및(또는) 생화학적으로 반응을 행하게 하는 것을 말한다.
제1 공정에서의 처리는 LDL 이외의 리포단백질에 작용하는 계면활성제의 존재하에서, 효소 반응에 의해 콜레스테롤을 분해하는 것을 말한다. 반응에 의해 생성된 분해 산물 또는 생성물을 화학적, 물리적 및(또는) 생화학적으로 측정할 수 있다. 계면활성제가 작용한다는 것은 리포단백질을 분해하여 리포단백질 중의 콜레스테롤을 유리시키는 것을 말한다.
LDL 이외의 리포단백질, 즉 HDL, VLDL, CM 등에 포함되는 콜레스테롤을 선택적으로 측정하는 구체적인 방법으로서는 이하의 것을 들 수 있다.
즉, LDL 이외의 리포단백질에 작용하는 계면활성제의 존재하에서, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제 효소를 작용시켜 생성된 과산화수소를, 퍼옥시다제 효소에 의해 4-아미노안티피린과 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물과의 산화 축합 반응에 의해 유색 퀴논으로 전화시켜 파장 400 내지 700 nm에서 측정하는 방법을 들 수 있다. 이 경우의 유색 퀴논의 흡광도의 측정치는 생체 시료 중의 LDL 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤의 존재량을 반영한다. 또한, 수소 공여체 화합물 중 아닐린계 수소 공여체 화합물로서 N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린(HDAOS), N-에틸-N-술포프로필-3-메톡시아닐린(ADPS), N-에틸-N-술포프로필아닐린(ALPS), N-에틸-N-술포프로필-3,5-디메톡시아닐린(DAPS), N-술포프로필-3,5-디메톡시아닐린(HDAPS), N-에틸-N-술포프로필-3,5-디메틸아닐린(MAPS), N-에틸-N-술포프로필-3-메틸아닐린(TOPS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메톡시아닐린(ADOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)아닐린(ALOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린(DAOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린(MAOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메톡시아닐린(TOOS) 및 N-술포프로필아닐린(HALPS) 등이 있다.
다른 방법으로서는 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 데히드로게나제 효소를 작용시켜 생성된 NADH(β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 환원형)를 파장 340 nm에서 측정하는 것도 들 수 있지만, 이것들로 한정되는 것은 아니다. 이 경우의 NADH의 흡광도 측정치는 생체 시료 중의 LDL 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤의 존재량을 반영한다.
제1 공정의 반응액 중 콜레스테롤 에스테라제 농도는 0.2 내지 2.0 IU/mL 정도가 바람직하며, 유래로서는 슈도모나스속 세균으로부터 생성되는 것이 효과적이다. 또한, 콜레스테롤 옥시다제의 농도는 0.1 내지 0.7 IU/mL 정도가 바람직하며, 세균이나 효모 유래의 것을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 과산화수소를 유색 퀴논으로 전화시키는 경우의 퍼옥시다제의 농도는 0.4 내지 3.0 IU/mL가 바람직하고, 4-아미노안티피린의 농도는 0.4 내지 4.0 mmol/L가 바람직하며, 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물의 농도는 0.4 내지 2.0 mmol/L가 바람직하다.
또한, 퀴논 색소 이외에 NADH를 측정하는 경우에도 콜레스테롤 에스테라제에 대해서는 상기와 동일하며, 콜레스테롤 데히드로게나제 농도는 0.2 내지 1.0 IU/mL가 바람직하고, NADH의 농도는 2.0 내지 5.0 mmol/L가 바람직하다.
제1 공정에서 사용되는 LDL 이외의 리포단백질에 작용하는 계면활성제의 바람직한 예로서 HLB치가 13 이상 15 이하, 바람직하게는 13 이상 14 이하인 폴리알킬렌옥시드 유도체를 들 수 있다. 유도체의 예로서는 고급 알코올 축합물, 고급 지방산 축합물, 고급 지방산 아미드 축합물, 고급 알킬아민 축합물, 고급 알킬머캅탄 축합물, 알킬페놀 축합물을 들 수 있다. 또한, 계면활성제의 HLB 산출 방법은 공지되어 있으며, 예를 들면 「신계면활성제(新界面活性劑)」, 호리우찌 히로시 저서, 쇼와 61년, 산꾜 출판에 기재되어 있다.
HLB치가 13 이상 15 이하인 폴리알킬렌옥시드 유도체의 바람직한 구체예로서는 폴리옥시에틸렌라우릴에테르, 폴리옥시에틸렌 세틸 에테르, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르, 폴리옥시에틸렌 고급 알코올 에테르, 폴리옥시에틸렌 옥틸 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 벤질 페닐 에테르 등으로 HLB치가 13 이상 15 이하인 화합물을 들 수 있지만, 이것들로 한정되는 것은 아니다.
제1 공정에서 사용되는 상기 계면활성제의 농도는 0.1 내지 10 g/L 정도가 바람직하고, 0.5 내지 5.0 g/L 정도가 더욱 바람직하다.
제1 공정은 pH 5 내지 9의 완충액 중에서 행하는 것이 바람직하며, 완충액으로서는 트리스, 트리에탄올아민, 굿 완충액 등의 아민을 포함하는 완충액이 바람직하다. 특히 굿 완충액인 Bis-Tris, PIPES, MOPSO, BES, HEPES 및 POPSO가 바람직하며, 완충액의 농도는 10 내지 500 mM 정도가 바람직하다.
제1 공정에서 LDL과의 반응을 억제하고, 다른 리포단백질과의 반응을 더 높이기 위해 반응액 중에 2가 금속 이온을 포함시킬 수도 있다. 2가 금속 이온으로서는 구리 이온, 철 이온 및 마그네슘 이온을 사용할 수 있지만, 특히 마그네슘 이온이 바람직하다. 2가 금속 이온의 농도는 5 내지 200 mM 정도가 바람직하다.
또한, 제1 공정의 반응액 중에는 리포단백질 리파제 효소를 첨가할 수도 있다. 이 효소를 첨가함으로써 특히 VLDL 중의 콜레스테롤이 반응하기 쉬워지므로 바람직하다. 이 효소의 반응액 중 농도는 5.0 내지 10.0 U/mL 정도가 바람직하다.
제1 공정의 반응 온도는 30 내지 40 ℃ 정도가 적당하고, 37 ℃가 가장 바람직하다. 또한, 반응 시간은 2 내지 10 분 정도가 바람직하다.
본 발명의 방법에서는 제1 공정을 알부민의 존재하에서 행한다. 알부민은 알부민이라면 전혀 한정되지 않으며, 혈청 알부민 등의 시판 알부민을 바람직하게 사용할 수 있다. 알부민의 기원은 전혀 한정되지 않고 인간, 소, 돼지, 말 등 중 어느 동물일 수도 있으며, 특히 널리 이용되고 있는 소 혈청 알부민을 바람직하게 사용할 수 있다. 제1 공정의 반응 용액 중의 상기 알부민의 농도는 0.1 내지 5.0 g/dL이 바람직하고, 0.3 내지 3.0 g/dL이 더욱 바람직하다.
이어지는 제2 공정에서는, 피검 시료 중의 잔존 콜레스테롤을 정량한다. 이것은, 예를 들면 적어도 LDL에 작용하는 계면활성제를 첨가하고, 제1 공정에서 첨가한 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제의 작용에 의해 생성된 과산화수소를 정량함으로써 행할 수 있다. 과산화수소의 정량은 과산화수소를 퍼옥시다제 효소에 의해 4-아미노안티피린과 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물과의 산화 축합 반응에 의해 유색 퀴논으로 전화시켜, 파장 400 내지 700 nm에서 측정하는 방법에 의해 행할 수 있다. 제2 공정에서의 유색 퀴논의 흡광도의 측정치는, 제1 공정의 반응에 있어서도 유색 퀴논이 생성되는 경우에는 제1 공정에서 생성된 유색 퀴논의 흡광도에 제2 공정의 반응에서 생성된 유색 퀴논의 흡광도가 부가된 것이며, 생체 시료 중의 LDL 중 콜레스테롤의 존재량을 반영함과 동시에 생체 시료 중의 모든 리포단백질 중 콜레스테롤의 존재량을 나타낸다. 한편, 제1 공정의 반응에서 NADH가 생성되는 경우에는 유색 퀴논의 흡광도는 NADH의 흡광도와는 별도의 파장에서 측정하기 때문에, 제2 공정의 반응에서 생성된 유색 퀴논의 흡광도는 생체 시료 중의 LDL 중 콜레스테롤의 존재량을 나타내며, 제2 공정의 반응에서 생성된 유색 퀴논의 흡광도와 제1 공정의 반응에서 생성된 NADH의 흡광도를 더한 것이 생체 시료 중의 총 콜레스테롤의 존재량을 나타낸다. 또한, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 데히드로게나제 효소를 작용시켜 생성된 NADH(β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 환원형)를 파장 340 nm에서 측정할 수도 있다. 제2 공정에서의 NADH의 흡광도의 측정치는, 제1 공정의 반응에 있어서도 NADH가 생성되는 경우에는 제1 공정의 반응에서 생성된 NADH의 흡광도에 제2 공정의 반응에서 생성된 NADH의 흡광도가 부가된 것이며, 생체 시료 중의 LDL 중 콜레스테롤의 존재량을 반영함과 동시에 생체 시료 중의 모든 리포단백질 중 콜레스테롤의 존재량을 나타낸다. 한편, 제1 공정의 반응에서 유색 퀴논이 생성되는 경우에는 NADH의 흡광도는 유색 퀴논의 흡광도와는 별도의 파장에서 측정하기 때문에, 제2 공정의 반응에서 생성된 NADH의 흡광도는 생체 시료 중의 LDL 중 콜레스테롤의 존재량을 나타내고, 제2 공정의 반응에서 생성된 NADH의 흡광도와 제1 공정의 반응에서 생성된 유색 퀴논의 흡광도를 더한 것이 생체 시료 중의 총 콜레스테롤의 존재량을 나타낸다.
여기서, 적어도 LDL에 작용하는 계면활성제는 LDL에만 선택적으로 작용하는 계면활성제일 수도 있고, 모든 리포단백질에 작용하는 계면활성제일 수도 있다.
모든 리포단백질에 작용하는 계면활성제의 바람직한 예로서, HLB치가 11 이상 13 미만, 바람직하게는 12 이상 13 미만인 폴리알킬렌옥시드 유도체를 들 수 있다. 유도체의 예로서는 고급 알코올 축합물, 고급 지방산 축합물, 고급 지방산 아미드 축합물, 고급 알킬아민 축합물, 고급 알킬머캅탄 축합물, 알킬페놀 축합물을 들 수 있다.
HLB치가 11 이상 13 미만인 폴리알킬렌옥시드 유도체의 바람직한 구체예로서 폴리옥시에틸렌 라우릴에테르, 폴리옥시에틸렌 세틸에테르, 폴리옥시에틸렌 올레일에테르, 폴리옥시에틸렌 고급 알코올에테르, 폴리옥시에틸렌 옥틸페닐에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐페닐에테르 등으로 HLB치가 11 이상 13 미만인 화합물을 들 수 있지만, 이것들로 한정되는 것은 아니다.
또한, LDL에만 선택적으로 작용하는 계면활성제로서 음이온 계면활성제를 들 수 있다. 여기서 사용되는 음이온 계면활성제로서는 특별히 한정되지 않지만, 방향환에 탄소수 4 내지 18의 직쇄상 또는 분지상 알킬기가 결합된 것을 갖는 것이 바람직하다. 여기서, 방향환은 벤젠, 나프탈렌, 디페닐 등과 같이 탄소와 수소만을 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 방향환에 술폰산염과 같은 친수기가 결합된 것이 바람직하다. 이러한 바람직한 음이온 계면활성제의 예를 하기 화학식 I 내지 V로 나타낸다.
상기 화학식 I 내지 V 중, R은 탄소수 4 내지 18의 직쇄상 또는 분지상의 알킬기를 나타낸다. 또한, 제2 공정에서 사용되는 바람직한 음이온 계면활성제로서 고급 알코올 황산나트륨 등을 들 수 있다.
제2 공정에서 사용되는 계면활성제의 농도는 0.1 내지 100 g/L 정도가 바람직하고, 1 내지 50 g/L 정도가 더욱 바람직하다.
제2 공정의 그 밖의 바람직한 반응 조건은, 제1 공정에서의 바람직한 반응 조건과 동일하다.
제1 공정 및 제2 공정은 바람직하게는 하나의 반응 용기 내에서 연속적으로 행해지며, 자동 분석 장치가 제1 공정 완료시의 흡광도 및 제2 공정 완료시의 흡광도를 자동적으로 측정한다.
본 발명의 방법에 이용하는 분석 장치는, 다항목을 동시에 분석할 수 있는 다항목 동시 분석법 기능을 갖는 자동 분석 장치이다.
분석 장치의 다항목 동시 분석법 기능으로서는, 반응 용기에 제1 시약 내지 제4 시약의 첨가가 가능하고, 반응 시간도 3 내지 20 분간의 설정이 가능하다. 또한, 반응 시간 동안 복수회 측광을 행하기 때문에 다른 측정 시간의 설정이 가능하고, 비색 분석이나 레이트 분석에서의 다른 시간 설정이나 비색법이나 레이트법의 조합도 가능해진다. 또 다른 파장에서의 동시 측정도 가능하다. 이들 분석 측정 조건을 적절하게 설정함으로써, 본 발명의 다항목 동시 측정을 달성할 수 있다.
다항목 동시 분석법 기능을 갖는 자동 분석 장치는 시판되는 것을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 생체 시료 중의 LDL 중 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 동시 측정하기 위한 시약 조성물, 즉 키트를 포함한다. 본 발명의 시약 조성물은 LDL 이외의 리포단백질에 작용하는 계면활성제, 적어도 LDL에 작용하는 계면활성제, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제를 포함한다. 상기 시약 조성물에 의해, 반응에 의해 생성된 유색 퀴논의 흡광도를 측정할 수 있다. 또한, 본 발명의 시약 조성물은 LDL 이외의 리포단백질에 작용하는 계면활성제, 적어도 LDL에 작용하는 계면활성제, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 데히드로게나제를 포함한다. 상기 시약 조성물에 의해, 반응에 의해 생성된 NADH의 흡광도를 측정할 수 있다. 또한, 본 발명의 시약 조성물은 농도가 공지된 표준 리포단백질 용액, 완충액 등을 포함한다.
본 명세서는 본원의 우선권 기초인 일본 특허 출원 제2002-362970호 명세서 및(또는) 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 구체적으로 설명한다. 본 발명은 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.
(시약)
하기 조성을 포함하는 LDL 콜레스테롤, 총 콜레스테롤 동시 측정 시약을 제조하였다.
<제1 시약>
PIPES 완충액 pH 7.0 50 mmol/L
HDAOS 0.7 mmol/L
4-아미노안티피린 1.5 mmol/L
콜레스테롤 에스테라제 0.8 IU/mL
콜레스테롤 옥시다제 0.5 IU/mL
퍼옥시다제 1.0 단위/mL
염화마그네슘 10 mmol/L
계면활성제 에멀젼(EMULGEN) B66(가오사 제조) 0.2 ％
<제2 시약>
PIPES 완충액 pH 7.0 50 mmol/L
트리톤 X100 3.0 ％
평가 대조 제품으로서 시판품인 자동 분석용 시약 LDL-EX N(덴까 세이껭사 제조)과 자동 분석용 시약 T-CHO(S)N(덴까 세이껭사 제조)을 사용.
(시료)
인간 혈청의 30가지 예를 준비하였다.
자동 분석 장치로서 TBA-30R(도시바사 제조)을 사용.
(LDL-C, T-CHO 동시 측정용 시약(멀티 시약))
측정 조건: 다항목 동시 분석
시료 각 4 μL에 미리 37 ℃로 가온한 제1 시약 300 μL를 혼화하여 37 ℃에서 5 분간 반응시킨 후, 제2 시약 100 μL를 첨가하여 5 분간 반응시켜 600 nm에서의 흡광도를 측정하였다. LDL 콜레스테롤(LDL-C)의 측정은 제2 시약 첨가 후의 흡광도로부터 제1 시약 첨가 후의 흡광도를 차감하고, 총 콜레스테롤(T-CHO)의 측정은 제2 시약 첨가 후의 흡광도로부터, 사전에 측정한 농도가 공지된 시료의 흡광도와 비교하여 LDL-C와 T-CHO의 농도를 산출하였다.
(비교 대조 시약)
측정 조건(LDL-C와 T-CHO는 동일 조건에서 각각 측정)
시료 각 4 μL에 미리 37 ℃로 가온한 제1 시약 300 μL를 혼화하여 37 ℃에서 5 분간 반응시킨 후, 제2 시약 100 μL를 첨가하여 5 분간 반응시켜 600 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 측정은 제2 시약 첨가 후의 흡광도로부터 제1 시약 첨가 후의 흡광도를 차감하고, 사전에 측정한 농도가 공지된 시료의 흡광도와 비교하여 농도를 산출하였다.
도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 방법의 동시 정량에 의해 각각 단독으로 LDL-C와 T-CHO의 측정을 행한 값과 동일한 측정 결과를 얻을 수 있다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 삽입하기로 한다.
본 발명의 방법에 의해, 1회의 측정으로 LDL 콜레스테롤과 총 콜레스테롤의 동시 정량이 가능해진다.

Claims (12)

  1. 생체 시료 중의 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 1회의 측정으로 정량하는, 생체 시료의 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 동시 측정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 생체 시료 중의 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤을 반응시키는 제1 공정, 및 이어서 잔존하는 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤을 반응시키는 제2 공정을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 생체 시료 중의 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤의 존재량을 반영한 측정치, 및 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤의 존재량을 반영한 측정치를 1회의 측정으로 얻고, 상기 두가지 값에 기초하여 생체 시료 중의 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤과 총 콜레스테롤의 존재량을 동시에 측정하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 생체 시료 중의 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤의 존재량을 반영한 측정치를 얻는 제1 공정, 및 잔존하는 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤의 존재량을 반영한 측정치를 얻는 제2 공정을 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 공정이, 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질에 작용하는 계면활성제의 존재하에서, 생체 시료 중의 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질에 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제 효소를 작용시켜 생성된 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시켜 측정하거나, 또는 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 데히드로게나제 효소를 작용시켜 생성된 NADH(β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 환원형)를 측정하는 것을 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 공정이, 제1 공정의 반응 후 산물에 적어도 저밀도 리포단백질에 작용하는 계면활성제를 첨가하고, 잔존하는 저밀도 리포단백질에 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제 효소를 작용시켜 생성된 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시켜 측정하거나, 또는 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 데히드로게나제 효소를 작용시켜 생성된 NADH(β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 환원형)를 측정하는 것을 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 임상 화학 검사용 자동 분석 장치를 이용하여 1회의 측정으로 다른 측정 조건에서 분석을 행하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 공정과 제2 공정에서 측정치로서 얻어지는 흡광도의 차이를 구함으로써 혈중 저밀도 리포단백질 중의 콜레스테롤의 정량을 행하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 공정에서 측정치로서 얻어지는 흡광도 변화량과 제2 공정에서 측정치로서 얻어지는 흡광도 변화량으로부터 총 흡광도량을 구함으로써 총 콜레스테롤의 정량을 행하는 방법.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 생체 시료 중의 저밀도 리포단백질 중 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 동시 측정하기 위한 시약 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질에 작용하는 계면활성제, 적어도 저밀도 리포단백질에 작용하는 계면활성제, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제를 포함하는 시약 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질에 작용하는 계면활성제, 적어도 저밀도 리포단백질에 작용하는 계면활성제, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 데히드로게나제를 포함하는 시약 조성물.
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