KR20030031137A

KR20030031137A - 세포부활제

Info

Publication number: KR20030031137A
Application number: KR10-2003-7001276A
Authority: KR
Inventors: 하마다지카; 다지마마사히로; 나카마야스나리; 다카하시다다히토
Original assignee: 가부시키가이샤 시세이도
Priority date: 2000-09-19
Filing date: 2001-09-12
Publication date: 2003-04-18
Also published as: CN1458842A; WO2002024189A1; JP2002097116A

Abstract

본 발명은, 타우린을 유효성분으로 하는 세포부활제, 모발세포 콘트롤제, 모발성장기 연장제, 모발세포증식 활성제, 모낭상피계 세포증식 활성제, 외모근초세포증식 활성제에 관한 것이다. 본 발명은, 육모재료의 배합성분으로서 이용되고, 모발세포 활성화에 관한 효과를 발휘한다.

Description

세포부활제{CELL ACTIVATOR}

고령화사회, 스트레스 사회라고 일컬어지는 현대사회는, 여러가지 원인에 의해 탈모의 위기에 노출될 기회가 많다. 그 때문에, 우수한 육모재료의 개발이 정력적으로 행해지고 있다.

육모재료가 모발에 주는 효과로서는, 발모 유도효과(발모 촉진효과, 성장기 유도효과), 모발을 굵게하는 효과, 모발성장기 연장효과, 5α-리덕타제 저해효과, 혈행 촉진효과, 살균효과, 비듬 방지효과, 보습효과, 항산화효과 등을 들 수 있다.

그렇지만, 정력적인 육모재료의 개발에도 불구하고, 종래의 육모재료에 있어서는, 그 탈모방지, 발모효과 등의 육모작용은 반드시 충분한 것은 아니었다. 이것은, 탈모 등의 원인이 다방면에 걸쳐있고, 또, 발모의 기구도 대단히 복잡하기 때문이다.

종래의 육모재료는, 탈모를 비교적 대략적인 개념, 바꾸어 말하면, 만연하게「탈모」라는 현상만을 파악해서 개발되고 있어, 그 메커니즘에까지 착안하여, 탐구해서 개발된 것은 많지 않다.

이 큰 이유의 하나로서는, 메커니즘에 착안한 육모효과를 간편하게 검정할 수 있는 육모약제 검정방법이 충분히 확립되어 있지 않았던 것에 유래된다. 특히 모발성장기 연장효과 등을 검정하는 육모약제 검정방법의 확립은 어렵고, 결과로서, 지금까지 제공되어 온 육모재료는, 모주기(毛周期)의 성장기에 모발을 유도해서 육모하는 발모유도효과에 착안한 것이 많았다.

본 발명자 등은, 인 비트로(in vitro)에서 행하는 간편한 육모약제 검정방법을 확립하고, 이 육모약제 검정방법을 사용해서, 많은 화합물을 검토하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은, 양모료 등의 배합성분이 되는 육모관련 효과제를 제공하는 것에 있다.

본 발명은, 세포부활제, 모발세포 콘트롤제, 모발성장기 연장제, 모발세포 증식 활성제, 모낭상피계 세포증식 활성제, 외모근초세포(external trichilemmal cell)증식 활성제에 관한 것이다. 본 발명은, 육모재료의 배합성분으로서 이용되어, 모발세포 활성화에 관한 효과를 발휘한다.

도 1은, 외모근초세포의 증식도를 도시하는 도면이다.

도 2는, 모발의 비틀림토크의 증가를 도시하는 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

이하, 본 발명의 구성에 대해서 상세히 기술한다.

본 발명에 사용되는 타우린은, H₂NCH₂CH₂SO₃H의 분자식으로 표시되는 화합물이며, 지금까지, 세포부활제, 모발세포 콘트롤제, 모발성장기 연장제, 모발세포증식 활성제, 모낭상피계 세포증식 활성제, 외모근초세포증식 활성제, 모발 생기·탄성 개선제로서의 효과가 정확하게 확인된 것은 없다.

본 발명은, 후술하는 육모약제 검정방법에 의해, 적어도 모낭상피계 세포의 분열 증식활성을 유지 또는 촉진함으로써 모발의 성장기를 유지 또는 연장하는 효과를 확인할 수 있는 타우린을 유효 필수성분으로 하는 모발관련 약제이며, 육모재료, 양모료에 배합하기 위한 「개별효능약제」로서의 특징을 갖는다.

본 발명은, 예를 들면 모근 근방에서의 모낭상피계 세포의 증식이 느린 것 등에 의해 성장기가 짧아져서, 상대적으로 성장기모 보다도 휴지기모의 비율이 많아져버리는 것에 기인하는 탈모증에 특히 유효한 약제이다. 또, 다른 개별효능을 갖는 육모약제와 조합하여 사용함으로써, 폭 넓은 탈모증에 있어서, 종합적이고 또한 상승적인 효과를 높일 수 있다. 즉, 본 발명의 약제는, 종합적인 육모효과의 개념을 갖는 일반적 육모재료와는 분명히 구별되는 용도를 갖는 것이다.

본 발명의 약제는 타우린으로 이루어진다. 타우린을 적당한 기제에 배합하여 제제화해서 유효성분으로서 사용하는 경우는, 본 발명의 효과가 발휘되도록 구체적인 형태 등에 따라서 그 배합량이 적당하게 결정된다. 통상의 배합량은 기제전체에 대해 0.00001∼20 질량%, 바람직하게는, 0.01∼10.0 질량%이다. 본 발명의 약제를 모발관련 제품에 배합하는 경우에도, 타우린의 함유량이 상기 함유량으로 되는 것이 바람직하다. 0.00001 질량% 미만의 배합량에서는, 모발세포 부활효과가 충분히 발휘되지 않고, 또한 20 질량%를 초과하여 배합해도, 함유량의 증가에 적당한 효과의 증대를 기대할 수 없을 뿐만 아니라, 제제상 지장을 초래하는 경향이 현저하게 되어 바람직하지 않다.

본 발명의 약제는, 특별하게는 우수한 모낭계 세포증식 활성작용 또는 외모근초세포증식 활성작용에 근거하는 모발성장기 연장효과를 갖는다. 예를 들면, 모근 근방에서의 모낭상피계 세포의 증식이 느린 것 등에 의해 성장기가 짧아져서, 상대적으로 성장기모 보다도 휴지기모의 비율이 많아져버리는 것에 기인하는 탈모증에 특히 유효하다. 또, 다른 개별효능을 갖는 육모재료와 조합하여 사용함으로써, 특정한 탈모증에서는 상승적인 효과를 높일 수 있다.

본 발명의 약제의 모주기에서의 성장기의 유지 또는 연장작용을 특정하여 확인하는 수단은, 그 특정방법 자체가 그 작용을 특정하기 위해서 타당한 것인 한 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면 인 비트로(in vitro)에서의 특정방법도, 인 비보(in vivo)에서의 특정방법도 사용할 수 있지만, 그 간편성과 유효성을 고려하면, 인 비트로에서의 특정방법을 사용하는 것이 바람직하다.

이하에, 인 비트로에서의 특정방법의 하나인, 모낭계 상피배양세포의 증식효과를 검토하는 것을 특징으로 하는 특정방법에 대해서 간단히 설명한다. 이 방법은, 「모낭상피계 배양세포에 무혈청배지중에서 대상물질을 접촉시킴으로써 그 세포의 증식활성의 유무 및 강약을 특정하고, 그 대상물질의 모주기에서의 성장기를 연장하는 효과를 검정하는 육모약제 검정방법」이다. 모발의 신장에 직접적으로 관계되는 모낭상피계 세포에 착안하여, 이 배양세포를 사용함으로써, 원하는 모주기에서의 성장기를 연장하는 효과를 특정하는 인 비트로의 육모약제 검정방법이다.

이 육모약제 검정방법에 있어서는, 동물(사람을 포함함)의 모낭상피계 세포를 단리해서 얻은 배양세포인 「모낭상피계 배양세포」에 대상물질을 접촉시켜서, 그 증식의 유무 및 강약을 특정한다. 모낭상피계 세포는, 특히 모근 근방의 외모근초세포와 매트릭스 세포 등의 세포인 것을 가리키고, 내측의 모유두세포는 제외된다. 모주기에서의 성장기는, 정말로 이 모발이 신장하고 있는 시기, 즉 모낭상피계 세포가 분열하여 증식하고 있는 시기이며, 동 퇴행기 및 휴지기는 이것이 둔화되어 휴지하는 시기이다. 즉, 모주기에서의 성장기를 연장시키는 물질은, 그 투여에 의해 모낭상피계 세포의 분열 및 증식활성을 유지함으로써, 모발이 모주기에서의 퇴행기 및 휴지기로의 이행을 방지하는 물질, 즉, 모낭상피계 세포의 증식을 촉진 또는 계속하여 유지하는 물질인 것을 결론지을 수 있다. 또한, 다른 인 비트로의 육모약제 검정방법으로서, 예를 들면, 대상물질을 동물의 모유두세포에 작용시켜서, 그 증식효과를 판정하는 방법을 들 수도 있다.

인 비보에서의 특정방법으로서는, 예를 들면 누드마우스에 대상물질을 투여하고, 이 누드마우스의 체표의 발모부위의 상태를 특정하여, 대상물질의 모주기에서의 성장기를 연장하는 효과를 검정하는 육모약제 검정방법 등을 들 수 있다. 원칙적으로는 무모이지만, 그 체표에 경시적으로 그 발모부위가 이동하는 특징적인 발모를 하는 누드마우스에서의 발모부위의 넓이와 발모부위의 이동속도를 특정함으로써, 모주기에서의 성장기의 길이를 검정하는 방법 등이다.

본 발명의 약제가 취할 수 있는 제형은, 육모재료에 배합할 수 있고, 외피에 적용할 수 있는 제형이면 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 약제는, 예를 들면, 헤어토닉, 헤어크림, 헤어 무스(등록상표), 샴푸, 린스 등의 제품에 배합할 수 있다.

본 발명의 약제는, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 한에 있어서, 화장품, 의약부외품, 의약품 등에서 일반적으로 사용되는 각종 유성 혹은 수성성분, 보습제, 증점제, 방부제, 산화방지제, 향료, 색제, 각종 약제 등을 배합하여, 상법에 의해 제제화 할 수가 있다.

즉, 본 발명은 타우린을 유효성분으로 하는 세포부활제를 제공하는 것이다.

또, 본 발명은 타우린을 유효성분으로 하는 모발세포 콘트롤제를 제공하는 것이다.

더욱이, 본 발명은 타우린을 유효성분으로 하는 모발성장기 연장제를 제공하는 것이다.

또, 본 발명은 타우린을 유효성분으로 하는 모발세포증식 활성제를 제공하는 것이다.

더욱이, 본 발명은 타우린을 유효성분으로 하는 모낭상피계 세포증식 활성제를 제공하는 것이다.

또, 본 발명은 타우린을 유효성분으로 하는 외모근초세포증식 활성제를 제공하는 것이다.

더욱이, 본 발명은 타우린을 유효성분으로 하는 모발 생기·탄성 개선제를 제공하는 것이다.

다음에 본 발명을 실시예 등에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 본 발명은이하의 실시예만에 한정되지 않는다. 이하의 실시예 등에서 「%」로 표시되고, 또한 내용량을 나타내는 것은 특별한 예고가 없는 한 질량%를 의미한다.

「실시예 1」

타우린의 모발성장기 연장작용을 평가했다. 처음에 인 비트로의 세포증식 시험에 대하여 설명한다.

<모낭상피계 배양세포를 사용한 세포증식 시험>

A. 사람 모낭상피계 세포

1. 사람 모낭상피계 세포의 채취

외과수술의 부산물로서 얻어진 사람 남성두피로부터 모주기에 있어서의 성장기인 모낭를 실체현미경하에서 기계적으로 채취했다. 이 성장기의 모낭을 1000U/ml 디스파제(dispase)·0.2% 콜라게나제를 포함하는 둘베코의 개변 MEM(DMEM)으로 30분간, 37℃에서 처리하고, 주사바늘의 끝을 사용하여 진피 집(dermal sheath)이나 진피유두(dermal papilla), 모구부 상피조직을 제거하고, 0.05% 트립신·0.02% EDTA를 포함하는 인산완충액[PBS(-):(-)란 칼슘이온이나 마그네슘 이온을 포함하지 않는 의미임]에서 5분간, 37℃에서 처리했다.

다음에 콜라겐(Type I)코팅한 배양접시에 모낭를 정치하고, 외식편 배양을 행했다. 또한, 이 때의 배지는, 무혈청배지[Keratinocyte Growth Medium(KGM)]를 사용했다. 이 배양의 4∼5일 후에, 모낭의 배양접시에의 접착 및 세포의 증식을 확인할 수 있는 시점에서 배지를 교환하고, 이후 2일 걸러서 배지교환을 행했다.

이렇게 하여 증식시킨 세포를, 0.05wt% 트립신-0.02% EDTA로 37℃에서 5분간 처리한후, 등량의 0.1% 트립신 인히비터로 반응을 정지시키고, 원심처리(800×g, 5분간)를 시행하여 세포를 회수했다. 다음에 세포를 상기의 무혈청배지에 부유시켜서, 5000cells/cm²의 밀도로 콜라겐 코팅(Type I) 한 배양접시에 파종하고, 세포가 서브컨플루언트(subconfluent)가 될 때까지 2일 걸러 배지교환을 행하고, 다시 0.05wt% 트립신-0.02% EDTA로 37℃에서 5분간 처리한 후, 등량의 0.1% 트립신 인히비터로 반응을 정지시키고, 원심처리(800×g, 5분간)를 시행하여, 이것에 의해 얻어진 사람 모낭상피계 세포에 세포동결액(셀 방카:다이아트론제)을 첨가하고, 1.0×10⁶cell/ml의 농도로 조정하고, 각 동결튜브에 1.0×10⁶cell 씩 넣고, 이것을 동결 보존했다. 또한, 이들의 세포수는, 혈구산정판으로 산출했다.

2. 대상물질의 분석

상기 공정에 의해 얻은 모낭상피계 세포의 섬유아세포 혼입율(FB혼입율)을 측정(3000배, 5시야)하고, 그 결과 FB혼입율이 3% 이상인 것은, 분석의 대상에서 제외했다. 그리고 이 모낭상피계 세포를 배양 플라스크중에 파종후, 이것을 0.05% 트립신과 0.02% EDTA로 처리한 후, 0.1% 트립신 인히비터로 반응을 정지후, 계를 1500rpm으로 5분간 원심처리를 시행하고, 상청을 제거하고, 잔사에 KGM배지 20ml를 첨가하여, 세포현탁액을 조제했다.

0.02ml/well의 비율로, 96 웰 플레이트(well-plate)(I형 콜라겐코팅 플레이트:팔콘사제)에 파종하고(1.0×10⁴cell/well), 세포가 웰의 바닥에 가라앉기 까지약 20분간 실온하에 방치했다. 그 후, 37℃, 5% CO₂에서 1일간 배양을 행하여, 원하는 사람모낭상피계 배양세포를 얻었다.

B. 래트 모낭상피계 세포

1, 래트 모낭상피계 세포의 채취;

(1) 모낭의 채취

신생아(3∼4일 령)래트의 등부분 피부를 채취하고, 이 채취한 등부분 피부를 1% PSF함유 PBS(-)에 2장씩 침지했다. 그 후, 피부지방층에서 아래의 피하지방이나 피막 등을 해부용 가위로 제거했다. 이어서, 다시 이 등부분 피부를 1% PSF함유 PBS(-)에 침지하고, 이것을 0.25% 트립신함유 PBS(-)(0.02%EDTA 포함. 이하 동일)중에 4℃에서 하루밤 더 침지했다.

이 트립신 용액중에서의 침지후, 등부분 피부의 진피층과 표피층을 핀셋으로 박리한 후, 진피층을 0.35%의 콜라게나제를 함유시킨 Ham'sF12배지[조성(mg/L): 1-알라닌(8.9), 1-알기닌(HCl=211), 1-아스파라긴(13.2), 1-아스파르트산(13.3), 1-시스테인(HCl:31.5), 1-글루탐산(14.7), 1-글루타민(146), 글리신(7.5), 1-히스티딘(HCl:19), 1-이소류신(3.9), 1-류신(13.1), 1-리신(HCl:36.5), 1-메티오닌(4.5), 1-페닐알라닌(5.0), 프롤린(34.5), 1-세린(10.5), 1-트레오닌(11.9), 1-트립토판(2.0), 1-티로신(5.4), 1-발린(11.7), 비오틴(0.0073), 콜린(Cl:14.0), 비타민B12 (1.36), 엽산(1.32), 이노시톨(18.0), 니코틴아미드(0.037), 판토텐산 (Ca:0.477), 비타민B6 (HCl:0.062), 비타민B2 (0.038), 비타민B1 (HCl:0.337),CaCl₂(2H₂0:44.0), CuSO₄·5H₂0(0.0025), FeSO₄·7H₂0(0.834), KCl(224.0), MgCl₂(6H₂0:122), "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 53, 288(1965)" 이하 동일함]이 들어 있는 100mm 디시(dish)에 옮기고, 가위로 재단했다. 이 재단물을 포함하는 배지를 37℃에서 35분간 침투를 행했다(60rpm). 침투후, 이 콜라게나제 반응물중에 덩어리상태의 것이 보이지 않게 될 때까지 피펫팅을 행하고, 이것을 50ml 원침관에 옮기고, DNase(10000unit)를 함유시킨 Ham's F12배지를 첨가하고, 5분간 방치했다.

방치후, 얻어진 현탁액을 더욱 피펫팅한 후, 나일론 메시(Nytex 157mesh)로 여과하고, 이것을 50ml 원침관에 옮겼다. 현탁액을 반량씩 나누고, 각각에 대해서 PBS(-)를 용량이 30ml로 될 때까지 현탁액을 희석하고, 이어서 이 희석한 현탁액에 원심처리를 실시했다(4℃, 400rpm, 5분간). 원심후, 상청을 없애고 지방분을 계로부터 제거했다. 이어서, 잔사에 PBS(-)를 25ml 첨가하여 현탁후, 이것에 원심처리를 더 시행했다[(4℃, 400rpm, 5분간)×3회]. 이 원심조작에 의해 얻어진 잔사가, 래트의 등부분 피부에서의 모낭이다.

(2) 모낭상피계 세포의 채취

상기 조작에 의해 얻어진 모낭에, 0.25% 트립신함유 PBS(-)를 5ml 첨가하고, 세포현탁액을 37℃에서 5분간 인큐베이트 했다. 인큐베이트 종료후 5ml의 등량의 우태아혈청(FBS)과 Ham's F12배지를 첨가하고, 세포현탁액을 셀스트레이너(100㎛ Nalgene사제)로 여과후, 50ml 원침관에 넣고, 이 세포현탁액에 원심처리를 시행했다(4℃, 1500rpm, 5분간). 이 계로부터 상청을 제거하고, 잔사로서 원하는 모낭상피계 세포를 얻었다.

이 모낭상피계 세포에 세포동결액(셀 방카:다이아트론제)을 첨가하고, 1.5 ×10⁷cell/ml의 농도로 조정하고, 각 동결튜브에 1.5 ×10⁷cell 씩 넣고, 이것을 동결 보존했다. 또한, 이들 세포수는, 혈구산정판에서 산출했다.

2. 모낭상피계 세포의 전배양

계에 혼입되어 있는 섬유아세포를 가능한 한 계로부터 제거하기 위해서, 상기공정에 의해 얻어진 모낭상피계 세포의 전배양을 행했다. 이하, 그 순서에 대하여 설명한다. 37 ℃의 항온조에서, 상기 공정에 의해 동결세포를 융해했다. 이어서 FAD배지 [Ham's F12배지(후술)와 MEN배지를 용량비로 3 대 1로 혼합한 것에, 인슐린(5.0μg/ml), 하이드로코르티손(0.45μg/ml), 에피써멀 그로우스 팩터(EGF)(10.0ng/ml), 콜레라 톡신(10^-9M) 및 우태아혈청(10%)을 함유시킨 배지, 이하 동일함]을 10ml첨가하고, 세포용액을 희석하고 계에 원심처리를 시행했다(10℃이하, 1500rpm, 5분간). 원심후, 상청을 제거하고, 계에 FAD배지를 10ml 첨가하고, 세포덩어리를 확인할 수 없게 될 때까지 피펫팅을 반복했다.

얻어진 세포수를 혈구산정판에서 산출하고, FAD배지에서 2.5×10⁵cell/ml의 농도가 되도록 조정했다. I형 콜라겐으로 코팅한 75cm³의 플라스크에 세포를 파종하고, 이것을 37℃, 5% CO₂에서 하루밤 배양했다.

배양후, 계를 PBS(-) 10ml로 2회 세정하고, 0.25% 트립신함유 PBS(-)를 2ml첨가하고, 이것을 37℃, 5% CO₂에서 4분간 인큐베이트 했다. 다음에 계에 우태아혈청(FBS)을 2ml 첨가하고, 1회 가볍게 흔든 후에 상청을 제거하고, 계에 혼입되어 있는 섬유아세포를 제거했다.

더욱이, 계에 KGM배지[표피 각화세포 기초배지(Keratinocyto growth medium): Keratinocyto basal medium{KBM배지(개변 MCDB153배지: 클로네틱스사제)}에, 소 뇌하수체 엑스(BPE)(0.4vol%), 인슐린(0.5㎛/ml), 하이드로 코르티손(0.5㎛/ml), h-EGF(0.1ng/ml)를 첨가한 배지. 이하 동일함]을 15ml첨가하고, 37℃, 5% CO₂에서 3일간 배양했다.

3. 대상물질의 분석

상기 공정에 의해 얻은 모낭상피계 세포를 파종한 배양 플라스크의 섬유아세포 혼입율(FB혼입율)을 측정(3000배, 5시야)하고, 그 결과 FB혼입율이 3% 이상인 것은, 분석의 대상에서 제외했다.

계를 PBS(-) 10ml로 2회 세정하고, 0.25% 트립신함유 PBS(-)를 2ml첨가하고, 이것을 37℃에서 3분간 인큐베이트 했다. 이어서 상피계 세포와 섬유아세포와의 트립신에 대한 반응성의 차이를 이용하여, 계로부터 섬유아세포를 제거하기 위해서, 트립신을 제거하고, 다시 0.25% 트립신함유 PBS(-)를 2ml첨가하고, 37℃, 20rpm으로 5분간 흔들었다.

이어서, 세포의 박리를 현미경하에서 확인한 후, 10% FBS함유 DMEM배지를 10ml 첨가하고, 50ml 원심튜브중에서 피펫팅을 행하고, 계를 1500rpm으로 5분간 원심처리를 시행했다. 상청을 제거하고, KGM배지 20ml를 첨가하고, 세포덩어리가 없어질 때까지 피펫팅을 행했다.

현탁액을 셀스트레이너(100㎛ Nalgene사제)로 여과후, 50ml 원침관에 넣고, 현탁액중의 생세포수를 혈구산정판에서 산출하고, 계에 KGM배지를 첨가하고, 계중의 세포농도가 5.0×10⁴cell/ml로 되도록 조정했다. 이어서, 0.2ml/well의 비율로, 96웰 플레이트 (I형 콜라겐코팅 플레이트: 팔콘사제)에 파종하고 (1.0×10⁴cell/well), 세포가 웰의 바닥에 가라앉기 까지 약 20분간 실온하에서 방치했다. 그 후에, 37℃, 5% CO₂에서 1일간 배양을 행하고, 원하는 래트 모낭상피계 배양세포를 얻었다.

C. 시험배지의 조제

(1) 대상물질첨가 배지의 조제

타우린을 약 1.5mg 칭량하고, KBM배지에서 1% 용액으로 되도록 조제하여, 0.45㎛ 필터로 여과 멸균했다. 이어서, KBM배지에, 상기의 용액을 10000배량 첨가했다[대상물질 농도: 1.0×10^-5%].

(2) 콘트롤배지의 조제

KBM배지를 네거티브 콘트롤로서 사용했다. 포지티브 콘트롤로서, 네거티브 콘트롤의 KBM배지에, 세포증식 인자의 인슐린(5mg/ml)을 2㎕, 하이드로 코르티손(0.5mg/ml)을 2㎕ 첨가한 배지를 사용했다.

D. 대상물질 배지교환

상기 A, B에서 사람 모낭상피계 배양세포 및 래트 모낭상피계 배양세포를 조제한 96웰 플레이트중의 KGM배지를, 대상물질첨가 배지 및 콘트롤배지(200㎕/well)와 교환하고, 교환후 37℃, 5% CO₂에서 2일간 배양했다. 또한 이 배지의 교환은, 웰내의 KGM배지를, 바닥면에 부착되어 있는 세포를 상처내지 않도록 유의하면서 흡입기로 뽑고, 그 후 신속하게 대상물질첨가 배지 등을 웰의 양끝으로부터 첨가함으로써 행했다.

E. 세포증식의 측정

알라마 블루(alamar blue: 알라마 바이오사이언스사제)를 배지량(용량)에 대해 1/10량을 첨가하고, 37℃(5% CO₂)에서 6시간 인큐베이트 했다. 인큐베이트후, 계의 595nm 및 570nm에서의 흡광도를 마이크로 플레이트 리더(Micro plate reader: Bio RAD사제)를 사용하여 측정하고, 하기 계산식에 따라서, 세포증식도를 산출했다.

(대상시료의 세포증식도)=(대상시료의 알라마 블루 환원율)/(네거티브 콘트롤의 알라마 블루 환원율)×100(%)

더욱이, 하기 계산식에 따라서, 타우린의 모낭상피계 세포증식 촉진작용을 판정했다.

(대상시료의 세포증식 촉진지표)=((대상시료의 세포증식도)-(네거티브 콘트롤의 알라마 블루 환원율))/((포지티브 콘트롤의 알라마 블루 환원율)-(네거티브콘트롤의 알라마 블루 환원율))

「결과」

세포증식 촉진작용은, 네거티브 콘트롤이 0, 포지티브 콘트롤이 1에 대해, 타우린은 사람유래 모낭상피계 배양세포에 대해 0.8 및 래트유래 모낭상피계 배양세포에 대해서도 0.8 이었다. 이 결과로부터, 모낭상피계 배양세포의 증식활성이 명확하게 확인할 수 있는 것이 판명되었다. 즉, 타우린에는, 모발성장기 연장활성을 확인할 수 있는 것이 명확해졌다.

「실시예 2」

타우린의 불사화(不死化) 외모근초세포 증식작용을 평가했다. 처음에, 불사화 외모근초세포 증식시험에 대하여 설명한다.

<불사화 외모근초세포 증식시험>

「불사화 외모근초세포의 배양」

사람 두피로부터 실체현미경하에서 모낭를 가위로 단리한다. 피지선 하부에서 모낭를 분리하여 콜라게나제 및 디스파제로 효소처리를 행한다. 모구부를 가위로 분리하여 제거하고, 모간을 핀셋으로 분리한다. 모간을 트립신으로 효소처리하고, 트립신 인히비터로 반응을 정지한다. 원심하고, 상청을 버리고, 외모근초세포를 회수한다. 콜라겐코팅한 배양플라스크에 회수한 세포를 KGM(Keratinocyte growth medium)배지에서 파종하고, CO₂인큐베이터중에서 배양한다.

바이러스 및 도입유전자

아데노바이러스 벡터인 △E1/X의 ElA영역을, 복제개시점을 결실시킨 SV40의 Large T항원유전자로 치환한 바이러스(Doren and Gluzman, 1984; Mol. Cell. Biol. 4, 1653-1656)를 사용했다.

T항원유전자의 도입

세포의 클로닝 컨플루언트의 약 50%까지 배양한 계대 1대째의 배양 외모근초세포를 K-SFM으로 세정한 후에, 이것에 1, 10 또는 30 MOI(multiplicity of infection)의 양으로 상기 바이러스를 첨가하여 감염시켰다. 이후, 통상의 세포와 동일하게 계대배양을 계속하고, 통상의 세포의 증식이 멈추어버리는 계대수까지 달한 후에 클로닝을 행했다. 클로닝에서는, 세포를 직경 10cm 샤알레당 10³∼10⁴개만 다시 파종하여, 증식이 좋고, 세포형태가 통상 세포로 변하지 않는 것을 피펫 맨의 팁을 사용하여 픽업하고, 이것을 24웰 플레이트에 옮겨서 배양하고, 이 시점에서도 증식이 좋은 세포를 선택했다. 또한, 선택된 세포주도 통상의 세포와 동일하게 계대배양을 계속했다.

그 결과, 바이러스를 감염시키지 않은 외모근초세포는 계대 5대 정도에서 증식을 정지하고 말았다. T항원도입 모유두세포는, 클로닝후 계대 7대 정도에서 외관상 증식이 정지해버린 것 같이 보였지만, 더욱 배양을 계속하면, 외관상 다시 증식을 개시한 것 같이 보였다. 아마 계대 7대에서 크라이시스를 맞아, 여기에서 어떠한 이변이 일어나고, 불사화 세포로 된 것으로 예상되었다. 클로닝 때, 몇개의 클론을 선출했지만, 크라이시스의 시기를 초과하여 증식을 계속하는 세포주 1클론을 얻었다.

세포증식 평가

외모근초세포는 PBS(-)로 2회 세정한다. 트립신으로 효소처리를 행하고, 세포를 박리한다. 트립신 인히비터로 반응을 정지하고, 원심하여 상청을 버리고, 외모근초세포를 회수한다. KGM배지를 가하여 세포부유액을 조제한다. 콜라겐코팅한 24구멍 배양플레이트에 세포를 파종하고, CO₂인큐베이터중에서 배양한다. 다음날, 피험물질을 첨가한 배지로 교환한다. 4일 배양후, 세포를 PBS(-)로 세정하고, 트립신으로 세포를 박리한다. 이 상태에서 플레이트마다 세포를 냉동한다.

피검물질의 조제

피검물질인 타우린은, KBM(Keratinocyte basal medium)배지에서 50mM에 조제하고, 여과 멸균을 행했다. 이것을 원액으로 하여 KBM배지에서 희석하고, 피검물질농도가 10nM, 1μM, 100μM, 10mM이 되도록 조제했다. 네거티브 콘트롤은 KBM배지만으로 했다.

세포DNA 측정

세포를 해동후, Hoechst33258을 각 구멍에 가하고, 초음파를 걸어 세포를 파쇄한다. 이것을 큐벳에 옮기고, 여기파장 356nm, 형광파장 460nm로 형광강도를 측정한다. 네거티브 콘트롤의 형광강도를 100으로 하고, DNA량의 상대값을 계산하여 세포증식도를 산출했다.

도 1에 결과를 나타낸다. 이 결과로부터, 타우린에는, 불사화 외모근초세포활성작용이 있는 것을 알았다.

다음에, 모발성장기 연장작용에 근거하는 그 육모효과를 검토한다.

[실시예 3] 액상 모발성장기 연장제

타우린 0.8%를, 70%에탄올 90%, 올레산 나트륨 0.05%, 도데실벤젠술폰산 0.49%, 경화피마자유 에틸렌옥시드(40몰) 부가물 0.5% 및 이온교환수(잔여)와 혼합 교반하여 용해시켰다. 이온교환수(10%)를 더 첨가 혼합하여, 액상의 모발성장기 연장제를 얻었다. 이 액상의 육모재료의 처방에서, 타우린을 제거하여 조정한 액상의 제제를 대조로서 조정했다(비교예 1).

[실시예 4] 유액상 모발성장기 연장제

이하의 처방의 유액상 모발성장기 연장제를 작성했다.

배합성분배합량(질량%)

(A상)

타우린0.05

폴리옥시에틸렌(60몰)부가 경화피마자유2.0

글리세린10.0

디프로필렌글리콜10.0

1,3-부틸렌글리콜5.0

폴리에틸렌 글리콜15005.0

(B상)

세틸이소옥타네이트10.0

스쿠알란5.0

바셀린2.0

프로필파라벤2.0

(C상)

카르복시비닐 폴리머 1%수용액 30.0

헥사메타인산소다0.03

이온교환수9.3

(D상)

이온교환수4.5

(E상)

KOH0.12

이온교환수5.0

<제조법> A상, B상을 각각 60℃로 가열 용해하고, 혼합해서 호모믹서 처리하여 겔을 만든다. 이것에 D상을 서서히 첨가하여 호모믹서로 분산했다. 다음에 이것에 용해한 C상을 가하고, 최후에 용해한 E상을 첨가하고, 호모믹서로 유화해서 O/W유액형의 모발성장기 연장제를 조제했다.

[실시예 5] 크림상 모발성장기 연장제

배합성분배합량(질량%)

(A상)

유동파라핀5.0

세토스테아릴알콜5.5

글리세릴 모노스테아레이트3.0

EO(20몰)-2-옥틸도데실 에테르 8.0

프로필파라벤0.3

향료0.1

(B상)

타우린5.0

글리세린8.0

디프로필렌글리콜20.0

폴리에틸렌 글리콜40005.0

도데실 황산나트륨 0.1

헥사메타인산소다0.005

이온교환수39.995

<제조법> A상, B상을 각각 가열 용해하여 혼합하고, 호모믹서로 유화하여, 크림상의 모발성장기 연장제를 얻었다.

「모발성장기 연장제의 육모작용의 검토」

상기에서 얻어진 모발성장기 연장제의 탈모방지, 발모효과 등의 육모작용을 조사하기 위해서, 이하의 방법으로 사람에 대해 트리코그램 시험 및 실사용 테스트를 실시했다. 피험시료 및 대조시료는, 실시예 3∼5의 본 발명의 모발성장기 연장제, 70%에탄올, 비교예 1이다.

시험방법

상기 시료의 사용전과 사용후의 뽑아낸 모발의 모근을 현미경하에서 관찰하고, 모근의 형태로부터, 성장이 멈춘 모의 모근인 「휴지기모근」수를 계수하고, 그 비율의 증감에 의해 이들 시료의 육모작용을 비교했다. 즉, 피험시료 및 대조시료를 각각 남성피험자 10명의 두피에 1일 2회, 1회 2ml씩 6개월간 연속해서 도포하고, 도포직전 및 6개월간 도포종료 직후에, 피험자 1명에 대해서 100개씩 모발을 뽑아내어, 각각의 모근을 현미경하에서 관찰했다. 시험의 결과를, 하기 「표 1」에 나타낸다.

시료(대상 및 육모제 번호)	휴지기 모근의 비율	육모효과의 평가
시료(대상 및 육모제 번호)	20%이상 감소(%)	육모효과의 평가	±20%(%)	20%이상 증가(%)
대상(70% 에탄올)	10	40	50	무효
실시예3	50	40	10	유효
실시예4	60	30	10	유효
실시예5	50	30	20	유효
비교예1	20	40	40	무효

이 결과로부터, 본 발명의 모발성장기 연장제에는 모발성장기 연장효과에 근거하는 육모효과가 확인되었다.

「생기와 탄성을 모발에 부여하는 효과」

타우린을 필수성분으로 하는 본 발명은, 모발에 생기와 탄성을 부여하는 효과를 가지고, 모발 생기·탄성 개선제로서 이용할 수 있다. 처음에 시험방법에 대하여 설명한다.

시험시료

모발은, 퍼머넌트 웨이브, 헤어컬러, 블리칭 등의 화학적처리 이력이 없는 19세 여성의 모발을 사용했다. 모 끝부분 약 20cm를, 소정의 샴푸액에 1시간 침지한 후, 흐르는 물중에 1분간 세정하고, 통상환경하에서 24시간 이상 건조한 것을, 건강한 상태의 모시료로 했다. 상기 건강한 상태의 모를 소정의 블리칭제를 사용하여, 실온에서 30분 블리칭처리를 행하고, 그 후 흐르는 물중에서 1분간 세정했다. 블리칭처리를 4회 반복하고, 세정후 통상환경하에서 건조한 것을 블리칭처리 모(BL처리)로 했다.

타우린처리

1mol/l의 타우린 수용액 20ml에 모발 1개를 하루밤 침지하고, 25℃·50% RH 환경하에서 시험시료의 모발을 건조시켰다.

비틀림토크의 측정

카토테크사제 비틀림 시험기 KES-YN-1을 사용하여, 25℃·50%RH 환경하에서 측정을 행했다. 측정은, 타우린 수용액에 의한 처리전에 측정을 행하고, 그것을 콘트롤로 했다. 비틀림 각도는 ±1080°, 18°/sec, 의 속도로 비틀었다. 비틀림각 θ=360°∼720°에서의, 비틀림각 θ에 대한 비틀림토크 Tf의 증가분인 B=tan(Tf/θ)를, 비틀림 강성 B값으로 하고, 타우린 수용액에 의한 처리전후에서의 B값의 비로 평가했다. 결과를 도 2에 도시했다.

이 결과로부터, 타우린처리한 모발은, 비틀림토크가 증가하고 있고, 모발에 생기와 탄성을 부여하고 있는 것을 알 수 있다.

본 발명의 약제를 배합한 바람직한 제품의 처방예를 나타낸다. 타우린을 배합한 이하의 샴푸, 린스는, 거품 함유, 거품질이 우수한 모발세정료이고, 머리털이 나기 전의 세포레벨로부터 모발을 건강하게 하고, 돋아 나온 머리털 자체에 생기와 탄성을 부여하여 생긴지 얼마 안 된 것 같은 건강한 머리털로 하는 효과를 기대할 수 있는 육모모발 세정료이다.

[처방예 1] 샴푸의 처방

배합성분배합량(질량%)

타우린8.0

폴리옥시에틸렌알킬암모늄15.0

아미도프로필메틸아세트산3.0

야자유지방산모노에탄올아미드 1.6

디스테아르산 에틸렌글리콜0.6

디메틸실리콘(5000cs)에멀션 40%액1.8

벤조산나트륨0.2

양이온화 셀룰로스 0.3

이온교환수69.5

[처방예 2] 린스의 처방

배합성분배합량(질량%)

타우린0.6

엑세콜D-53.4

디메틸실리콘0.5

스테아릴알콜7.5

스테아르산디메틸아미노프로필아미드 2.5

이온교환수85.5

[처방예 3] 샴푸의 처방

배합성분배합량(질량%)

타우린3

N-야자지방산-N-메틸타우린Na염 10

야자지방산디에탄올아미드4

야자지방산아미드프로필베타인Na 10

마코트550(약 8%수용액)5

시트르산0.5

벤조산Na염적량

향료적량

정제수잔부

[처방예 4] 샴푸의 처방

배합성분배합량(질량%)

N-야자지방산-N-메틸타우린 타우린Na염12

야자지방산아미도프로필베타인Na염5

라우르산프로필렌글리콜1.5

양이온성 셀룰로스 0.3

시트르산0.5

벤조산Na염적량

향료적량

정제수잔부

[처방예 5] 샴푸의 처방

배합성분배합량(질량%)

타우린0.3

폴리옥시에틸렌라우릴에테르Na염10

야자지방산아미드프로필베타인Na염5

야자지방산모노에탄올아마이드 2

양이온화셀룰로스0.5

마코트550(약 8%수용액)3.0

시트르산0.3

벤조산Na염적량

향료적량

정제수잔부

[처방예 6] 샴푸의 처방

배합성분배합량(질량%)

타우린0.5

폴리옥시에틸렌라우릴에테르Na염8

이미다졸리늄베타인Na염3

야자지방산디에탄올아미드4

양이온성셀룰로스0.3

시트르산0.5

케손CG적량

향료적량

정제수잔부

[처방예 7] 린스의 처방

배합성분배합량(질량%)

타우린0.1

디메틸실리콘5

스테아릴알콜2

염화스테아릴트리메틸암모늄0.7

글리세린2.0

파라벤적량

향료적량

정제수잔부

[처방예 8] 린스의 처방

배합성분배합량(질량%)

타우린0.3

디메틸실리콘10

베헤닐알콜1.5

스테아릴알콜1

염화스테아릴트리메틸암모늄1.0

글리세린5.0

파라벤적량

향료적량

정제수잔부

[처방예 9] 린스의 처방

배합성분배합량(질량%)

타우린0.1

디메틸 실리콘5

파라핀2

세틸알콜1.5

스테아릴 알콜0.3

염화베헤닐 트리메틸암모늄0.5

이소프렌글리콜3.0

케송CG적량

향료적량

정제수잔부

본 발명에 의하면, 세포증식을 활발화시킴으로써, 모발세포를 콘트롤 하고, 모주기에서의 성장기를 연장하고, 모발세포의 모낭상피계 세포 및 외모근초세포의 증식을 활성화하고, 더욱이, 모발에 생기와 탄성을 주는 모발관련 약제가 제공된다.

Claims

타우린을 유효성분으로 하는 세포부활제.
타우린을 유효성분으로 하는 모발세포 콘트롤제.
타우린을 유효성분으로 하는 모발성장기 연장제.
타우린을 유효성분으로 하는 모발세포증식 활성제.
타우린을 유효성분으로 하는 모낭상피계 세포증식 활성제.
타우린을 유효성분으로 하는 외모근초세포증식 활성제.
타우린을 유효성분으로 하는 모발 생기·탄성 개선제.