KR20080018828A

KR20080018828A - 콜라겐의 산생을 촉진하는 제, 화장료 및 콜라겐의제조방법

Info

Publication number: KR20080018828A
Application number: KR1020070085020A
Authority: KR
Inventors: 시바 토시카즈; 카토 시니츠; 카와조에 유미
Original assignee: 리젠티스 가부시키가이샤
Priority date: 2006-08-24
Filing date: 2007-08-23
Publication date: 2008-02-28
Also published as: CN101152129B; CN101152129A; JP5036252B2; KR101421499B1; JP2008050290A

Abstract

본 발명은 입수가 용이하고, 생체 친화성이 뛰어난 원료를 이용한 콜라겐의 산생을 촉진할 수 있는 제나 화장료, 그러한 제를 이용한 콜라겐의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

폴리인산, 그 염 또는 그 용매화물을 유효 성분으로서 포함하는 콜라겐의 산생을 촉진하는 제, 그러한 제를 포함하는 화장료, 및 폴리인산, 그 염 또는 그 용매화물을 사람 또는 사람 이외의 포유동물에 투여하는 공정을 포함하는 콜라겐의 제조 방법에 의해 해결된다.

Description

콜라겐의 산생을 촉진하는 제, 화장료 및 콜라겐의 제조방법{AN AGENT WHICH PROMOTES PRODUCTION OF COLLAGEN, A COSMETIC AGENT, A METHOD FOR PRODUCING COLLAGEN}

본 발명은 폴리인산 등을 유효 성분으로 포함하는 콜라겐의 산생을 촉진하는 제, 콜라겐의 제조 방법, 및 그 응용 제품 등에 관한 것이다.

노화 피부에서는 섬유아세포의 활성 저하에 따라 진피 세포 간질 성분인 콜라겐 섬유, 엘라스틴 섬유, 산성 무코다당의 질적, 양적인 변화가 일어난다. 콜라겐 섬유는 본래 탄력성이 풍부하다. 그러나, 인간의 노화가 촉진됨에 따라 콜라겐 섬유에 가교가 형성되므로, 콜라겐 섬유로부터 탄성이 사라진다. 그 결과, 인간의 피부는 유연성을 잃어, 주름이나 늘어짐 현상이 생기게 된다. 이러한 피부의 노화를 예방하는 목적으로 콜라겐 산생 촉진제가 개발되어 있다. 그러나, 모두 효과적으로 콜라겐의 산생을 촉진할 수 없으며, 또한, 원료가 되는 제(劑)도 손쉽게 입수할 수 없는 등의 문제가 있다.

본 발명은 입수하기 쉽고, 생체 친화성이 뛰어난 원료를 이용한 콜라겐의 산생을 촉진하는 제 및 화장료, 그러한 제를 이용한 콜라겐의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

기본적으로, 본 발명은 폴리인산을 유효량 포함하는 제에 의하면, 콜라겐의 산생을 유효하게 촉진할 수 있다는 것에 근거하는 것이다. 그리고, 폴리인산이 생체 친화성이 뛰어난 것은 식품 등의 분야에서도 실증되고 있다. 따라서, 이 제를 이용하면 생체 친화성이 뛰어난 제를 이용해 콜라겐의 산생을 촉진할 수 있고, 노화 현상 등을 방지할 수 있으므로, 본 발명의 제는 효과적으로 화장료 등에 이용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 형태는 울트라 인산을 함유하는 화장료에 관한 것이다. 그물코 모양 폴리인산나트륨인 울트라 인산은 산성도가 강하다. 이 때문에, 울트라 인산을 굳이 화장품에 배합하는 일은 없었다. 그렇지만, 울트라 인산은 산성도가 강하기 때문에 피부의 낡은 각질을 떨어뜨리는 필링 효과를 발휘한다. 게다가 후술하는 실시예에 의해 실증되듯이, 울트라 인산은 콜라겐을 산생한다. 즉, 본 발명의 바람직한 형태는 유효량의 울트라 인산을 함유으로써, 필링 효과를 줌과 동시에, 콜라겐의 산생도 촉진할 수 있는 화장료의 제공을 목적으로 한다.

본 발명의 바람직한 형태는 폴리인산, 그 염 또는 그 용매화물을 인간 또는 인간 이외의 포유동물에 투여하는 공정을 포함하는 콜라겐의 제조 방법에 관한 것이다. 이 방법에서, 폴리인산으로는 울트라 인산이 바람직하다. 또한, 인간 또는 인간 이외의 포유동물 중에서 인간 이외의 포유동물이 바람직하며, 구체적으로는 돼지, 원숭이, 생쥐, 또는 쥐 등을 들 수 있다. 즉, 폴리인산 등을 대상에 투여하여 콜라겐을 산생시킨 후, 산생된 콜라겐을 적절히 회수하면 된다.

본 발명에 의하면, 유효하게 콜라겐의 산생을 촉진하는 제를 제공할 수 있다. 또한, 울트라 인산을 유효 성분으로 함유시킴으로써, 필링 효과를 줌과 동시에, 콜라겐의 산생도 촉진할 수 있는 화장료를 제공할 수 있다.

콜라겐은 미백, 노화 방지 등에 효과적이므로, 본 발명의 제를 함유하는 화장료나 화장용 팩은 미백이나 노화 방지 등에 효과적이다.

본 발명은 폴리인산, 그 염, 또는 그 용매화물을 유효 성분으로서 포함하는 콜라겐의 산생을 촉진하는 제에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 폴리인산, 그 염, 또는 그 용매화물을 유효량 포함하는 콜라겐의 산생을 촉진하는 제이다.

[폴리인산]

상기와 같이, 본 발명의 제는 폴리 인산, 그 염, 또는 그 용매화물을 유효 성분으로 포함한다. 그리고, 본 발명의 폴리 인산으로는 오르토인산의 탈수축합에 의해 2개 이상의 PO₄사면체가 정점의 산소 원자를 공유하여 사슬모양으로 이어진 구 조를 갖는 사슬모양 폴리인산, 곁사슬에 유기기가 도입된 곁사슬모양 폴리인산, 고리모양 폴리인산, 분기상의 인산 집합체인 폴리인산(울트라 인산)이어도 되고, 이들 혼합물이나 이들의 유도체여도 된다.

본 발명의 제는 폴리 인산으로서 H₂O 및 P₂O₅를 구성분자로 하며, H₂O대 P₂O₅의 몰비(R)가 2＞R≥1이며, 아래의 일반식(I) 또는(II)에서 보여지는 사슬모양 또는 고리모양의 폴리인산을 1종 또는 2종 이상 포함하는 것이다.

H_n ₊₂(PnO_3n ₊₁) (I)

(HPO₃)_n (II)

(식(I) 및 (II) 중, n은 각각 독립되어 3이상 300 이하의 정수를 나타낸다.) 또한, 상기 폴리인산의 상기와는 다른 형태는 울트라 인산이다. 울트라 인산은 일반적으로 폴리인산의 구성분자인 H₂O대 P₂O₅의 몰비(R)가 1＞R＞0인 그물코 모양의 고차 구조를 가지는 폴리인산이다. 울트라 인산중의 인 원자의 개수는 특별히 한정되지 않지만, 3~300일 수 있다.

식(I) 중의 n은 바람직하게는 3~130의 정수이고, 보다 바람직하게는 10~89이다.

또한, 사용하는 폴리인산의 평균 분자량은 240이상 25,000 이하이고, 바람직하게는 810 이상 7,300 이하이다. 한편, 폴리인산의 총량 중, 식(I) 중 n이 10~89(바람직하게는 20~80)의 범위의 것을 90 중량% 이상 포함하는 것은 콜라겐의 산생 능력이 높아지므로 바람직하다.

더욱이, 사슬 길이가 1000이상의 폴리인산은 수용액의 형태로 존재하는 것이 확인 되어 있지 않으며, 물에 난용성이라고 여겨지므로 결코 바람직하지 않다. 또한, 생체내에서 폴리인산의 사슬길이는 약 800이므로, 사슬길이가 800 이하의 폴리인산이, 생체내에서 여러 가지의 생리기능에 관한 높은 유효성을 갖는다고 여겨진다(K.D.Kumble and A.Kornberg, Inorganic polyphosphate in mammalian cells and tissues, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 270, pp. 5818-5822, 1995).

본 발명의 폴리인산은 콜라겐의 산생을 촉진하는 효과를 가지므로, 특히 사슬길이가 3~300의 폴리인산을 바람직하게 이용할 수 있다. 또한, 후술의 실시예에서 실증 되듯이, 콜라겐의 산생을 촉진하기 위해서는 사슬길이가 20이상의 폴리인산을 이용하는 것이 바람직하다고 할 수 있다.

"그 염"이란, 폴리인산의 염, 특히 약학적으로 허용되는 폴리인산의 염을 의미한다. 본 명세서에서“약학적으로 허용된다”라는 것은 수용자에게 유해하지 않은 것을 의미한다. 본 발명의 폴리인산은 통상의 방법에 따라 염으로 할 수 있다. 그 염으로서는 예를 들면, 나트륨염, 칼륨염, 리튬염 등의 알칼리 금속염； 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 토류 금속염； 알루미늄염, 철염, 아연염, 구리염, 니켈염, 코발트염 등의 금속염； 암모늄염등의 무기염； t-옥틸아민염, 디벤질아민염, 몰포린염, 글루코사민염, 페닐글리신알킬에스테르염, 에틸렌디아민염, N-메틸글루카민염, 구아니딘염, 디에틸 아민염, 트리에틸아민염, 디시클로헥실아민염, N, N＇-디벤질에틸렌디아민염, 클로로 프로카인염, 프로카인염, 디에탄올아민염, N-벤질-N-페네틸아민염, 피페라진염, 테트라메틸암모늄염, 트리스(히드록시메 틸) 아미노메탄염 등의 유기염 등의 아민염을 들 수 있다. 이들 중, 폴리인산의 염으로서, 알칼리 금속염이 바람직하며, 나트륨염이 보다 바람직하다.

본 명세서에서, “그 염”에는 무수염뿐만 아니라 함수염이 포함되어도 된다. 이러한 염은 예를 들면, 생체 내 등에서 전기 해리되어 폴리인산과 같은 기능을 한다.

"그 용매화물"이란 폴리인산의 용매화물을 의미한다. 용매화물로서 수화물을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 제는 대기중에 방치하거나 재결정함으로써, 수분을 흡수하여, 흡착수가 붙거나 수화물이 되는 경우가 있다. 그러한 용매화물을 형성하는 경우도 "그 용매화물"에 포함한다. 이러한 용매화물은 생체내 등에서 전기해리되어 폴리인산과 같은 기능을 한다.

본 발명에 사용하는 폴리인산, 그 염 또는 그 용매화물은 1종류여도 괜찮지만, 복수종의 혼합물이어도 된다. 복수종의 폴리인산, 그 염 또는 그 용매화물에는 중합도가 다른 폴리인산, 그 염 또는 그 용매화물, 분자 구조가 다른 폴리인산, 그 염 또는 그 용매화물 및 금속 이온이 다른 폴리인산염을 포함한다.

폴리인산, 폴리 인산의 염, 폴리인산의 용매화물은 인산을 가열하는 방법, 인산에 오산화인을 첨가 용해하는 방법 등 통상 이용되는 제법에 의해 제조할 수 있다.

또한, 특히 사슬길이가 20이상의 중장사슬 폴리인산은 바람직하게는 아래의 방법에 의해 제조할 수 있다. 우선, 헥사메타인산염을 0. 1~20 중량%, 바람직하게는 9~11 중량%가 되도록 물에 용해한다. 이 헥사메타인산 수용액에, 87~100% 에탄 올, 바람직하게는 96% 에탄올을, 헥사메타인산 용액과 에탄올의 혼합 후의 전체액량의 1/10~1/3의 용량으로, 즉 헥사메타인산 수용액：에탄올이 2：1 ~ 9：1의 부피비가 되는 양으로 첨가한다. 이 혼합 용액을 충분히 교반하고, 그 결과 석출되는 침전물을 원심분리 또는 필터 여과 등의 분리 방법을 이용해 수용액 성분과 분리한다. 이와 같이 하여 분리한 침전물이 중장사슬 폴리인산이다. 이 폴리인산을 계속해서 70% 에탄올로 세정하고, 그 후 건조시킨다. 이러한 분리 조작에서 얻어지는 폴리인산의 평균사슬길이는 60 ~ 70이며, 10 이하의 단사슬 폴리인산은 전혀 포함되어있지 않는다. 따라서, 그 분자량 분포는 인산 잔기수로 10 ~ 150 정도이다.

폴리인산은 일본특표2004-537490에 기재되듯이, 인산으로부터 폴리인산을 제조하는 방법이며, (a) 충전한 컬럼을 제공하는 것, 이 충전한 컬럼은 하단에서 상단으로 연장하고, 이 컬럼의 상단 혹은 상단 부근에 1이상의 제1 입구 개구부 및 이 제1 입구 개구부 아래에 배치된 1 이상의 제 2 입구 개구부를 가지고, (b) 인산을 포함하는 제1 산공급 유체를, 1이상의 제1 입구 개구부의 컬럼에 도입하는 것, (c) 인산을 포함하는 제2 산공급 유체를, 열공기유체에 도입하여 열공기와 산의 유체를 형성하는 것, (d) 열공기와 산의 유체를, 1이상의 제2 입구 개구부의 컬럼에 도입하는 것 및 (e) 제1 산공급 유체와 제2 산공급 유체의 인산을 중합시켜 폴리 인산을 형성하는 것을 포함한 방법으로 제조하여도 된다. 헥사폴리인산이나 옥타폴리인산은 예를 들면 일본특개2004-035348호 공보에 개시되는 방법으로 제조해도 된다.

본 발명의 제에 있어서의 폴리인산의 함유량은 특별히 한정되지 않지만, 예 를 들면 배양 세포에 대해서는 0.001 ~ 0.5 중량%가 적절하고, 바람직하게는 0.002~0.1 중량%이다. 또, 조직내 혹은 경피적으로 투여하는 경우에는 배양 세포를 처리하는 농도에 비해 꽤 진한 농도가 바람직하다. 따라서, 조직내 혹은 경피적으로 투여하는 경우의 폴리인산의 함유량은 0.1 ~ 10 중량%, 보다 바람직하게는 1 ~ 5 중량%, 가장 바람직하게는 1 ~ 2 중량%를 들 수 있다. 폴리인산을 금속 봉쇄제나 항산화제로서 화장료 등에 이용하는 경우는 일반적으로 1 중량% 미만의 농도로 이용하지만, 콜라겐 산생 증대의 목적으로는 1 중량% 이상으로 함으로써 효과적으로 콜라겐의 산생을 촉진할 수 있다.

폴리인산, 그 염, 또는 그 용매화물은 각각 단체로, 혹은 약리학적으로 허용되는 담체 또는 희석제 등과 혼합하여, 폴리인산의 산생을 촉진하기 위한 조성물로 할 수 있다. 또한, 폴리인산, 그 염, 또는 그 용매화물은 약학적으로 허용되는 첨가제와 혼합하여, 환부에 적용하는데 적합한 형태의 각종 제재로 제재화할 수 있다. 본 발명의 제에 적합한 제재 형태로는 예를 들면, 주사제, 외용액제(주입제, 도포제), 고형 제재(과립제, 세립제, 가루약, 연고제, 정제), 연고제 등의 형태로, 공지 방법에 의해 적절히 조제할 수 있다.

약리학적으로 허용되는 첨가물로는 예를 들면, 부형제, 붕괴제 또는 붕괴 보조제, 결합제, 활택제, 코팅제, 색소, 희석제, 기제, 용해제 또는 용해 보조제, 등장화제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 보존제, 분산제, 유화제, 겔화제, 증점제, 점착제, 교미제 등을 들 수 있다.

더욱이, 본 발명의 제와 약학적으로 허용되는 담체 등을 포함하는 조성물은 피부의 노화 방지나 미백 등에 유효한 조성물이다. 이 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다.

약리학적으로 허용되는 담체로는 부형제, 희석제, 활택제, 결합제, 붕괴제, 안정제, 및 교미교취제로부터 적절히 선택되는 것을 들 수 있다.

부형제로는 예를 들면, 유당, 백당, 포도당, 만니톨, 솔비톨과 같은 당유도체 ；옥수수 전분, 감자 전분, α전분, 덱스트린과 같은 전분 유도체 ；결정 셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체 ；아라비아 고무； 덱스트란； 플루란과 같은 유기계부형제： 및 경질무수규산, 합성규산알루미늄, 규산칼슘, 메타규산 알루민산마그네슘과 같은 규산염 유도체； 인산수소칼슘과 같은 인산염； 탄산칼슘과 같은 탄산염； 황산칼슘과 같은 황산염 등의 무기계부형제를 들 수 있다.

활택제로는 예를 들면, 스테아린산, 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘과 같은 스테아린산금속염； 탈크； 콜로이드실리카； 비검, 경납과 같은 왁스류； 붕산； 아디핀산； 황산나트륨과 같은 황산염； 글리콜； 후말산； 안식향산나트륨； DL로이신； 지방산나트륨염； 라우릴황산나트륨, 라우릴황산마그네슘과 같은 라우릴황산염； 무수규산, 규산수화물과 같은 규산류 및 상기 전분 유도체를 들 수 있다.

결합제로는 예를 들면, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 매크로골 및 상기부형제와 같은 화합물을 들 수 있다.

붕괴제로는 예를 들면, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스칼슘, 내부가교 카르복시메틸셀룰로오스나트륨 과 같은 셀룰로오스 유도체； 카르복시메틸녹말, 카복시메틸녹말나트륨, 가교 폴리비닐 피롤리돈과 같은 화학수식된 전분·셀룰로오스류를 들 수 있다.

안정제로는 예를 들면, 메칠파라벤, 프로필파라벤과 같은 파라옥신 안식향산에스테르류； 클로로부탄올, 벤질알코올, 페닐에틸알코올과 같은 알코올류； 염화벤잘코늄； 페놀, 크레졸과 같은 페놀류； 치메로살； 데히드로초산；및 솔빈산을 들 수 있다. 교미교취제로는 예를 들면, 감미료, 산미료, 및 향료 등을 들 수 있다. 희석제로는 멸균수, 멸균유기용매, 수성 전분 등을 들 수 있다.

본 발명의 제의 사용량은 증상, 연령, 성별, 투여 방법 등에 따라 적절히 조정하면 된다. 예를 들면, 실시예에서 실증되었듯이 콜라겐 산생은 피부의 표피 혹은 진피 세포에 가까운 부분에서 폴리인산이 직접 작용하는 것이 바람직하기 때문에, 제형으로서 도포제 또는 화장료로 하는 것이 바람직하고, 피부 표면 1 ㎠에 대해 1회당, 폴리인산을 하한으로서 1 ㎎/㎠ (바람직하게는 5 ㎎/㎠), 상한으로서 500 ㎎/㎠(바람직하게는 50 ㎎/㎠)를 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 형태는 상기의 제를 포함한 화장료에 관한 것이다. 화장료로는 화장수, 유액, 크림, 젤, 미용액(엣센스), 팩 화장료를 들 수 있다. 본 발명의 제를 유효량 포함하는 화장료는 화장료를 도포한 부위의 콜라겐의 산생이 촉진되므로, 젊고 건강한 피부를 유지할 수 있다고 여겨진다.

"화장수"는 일반적으로 피부를 청결하고 건강하게 유지하기 위해서 피부 표면에 도포하는 투명 액상의 화장료이다. 화장수의 기본 기능은 피부의 각질층에 수분이나 보습 성분을 보급하는 것이며, 화장수는 피부를 유연하게 하는 기능 등도 있다. 화장수에는 물에 녹기 어려운 물질을 용해시키고 안정시켜 외관을 투명상태로 한 것, 마이크로에멀젼이나 리피드나노스피어를 이용한 투명 또는 반투명의 것, 수%의 유분을 O/W형(오일인워터형)으로 유화한 불투명 화장수, 및 수용성 고분자를 배합한 것 등을 들 수 있다. 본 발명의 트리트먼트 방법으로는 공지의“화장수”를 그 용도 등에 따라 적절히 이용할 수 있다.

화장수에는 본 발명의 제 이외, 예를 들어 이하의 성분이 포함되어 있다. 즉, 화장수에는 이온 교환수 등, 수용성 성분을 용해하여, 각질층에 수분을 공급하기 위한 정제수； 에탄올, 프로파놀 등, 유용성 성분을 용해하고, 살균하여, 청량감을 주기 위한 알코올； 글리세린, PEG, 히알론산 등, 각질층의 보습을 위한 보습제； 에스테르유, 식물유 등, 보습성이나 사용감의 향상을 위한 에모리엔트제(수분이 증발하는 것을 막는 기름 성분)； 폴리옥시에틸렌오레일알코올 에테르 등, 원료 성분을 가용화하기 위한 가용화제； 구연산, 유산, 아미노산류 등, 제품의 pH를 조정하기 위한 완충제； 바니린, 오렌지플래이버, 레몬플래이버, 밀크후레이버게라니올, 리나롤 등 향을 부가하기 위한 향료； 메틸파라벤, 페녹시 에탄올 등의 미생물을 억제하여, 부패를 방지하기 위한 방부제； 착색하기 위한 착색제； 금속 이온 봉쇄제, 자외선 흡수제 등, 퇴색이나 변색을 방지하기 위한 퇴색 방지제； 및 수렴제, 살균제, 활력제, 소염제, 또는 미백제 등의 약제가, 2종 이상 혼합되어 포함되어 있다.

화장수의 전체량을 100 중량%로 했을 경우에, 폴리인산, 그 염 또는 그 수화물을 0.00 ~ 20 중량%, 바람직하게는 0.01 ~ 10 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 ~ 5 중량%, 가장 바람직하게는 0.2 ~ 2 중량% 정도 포함하면 된다. 화장수를 구성하는 폴리인산 이외의 각 성분의 양은 공지의 성분량을 채용할 수 있다. 예를 들어, 정제수 10 ~ 90 중량%; 알코올 1 ~ 40 중량%; 보습제 1 ~ 20 중량%; 에모리엔트제 1 ~ 5 중량%; 가용화제 0 ~ 1 중량%; 완충제 0 ~ 1 중량%; 기타 약제 0 ~ 10 중량% 정도로 할 수 있다.

화장수는 기본적으로는 아래와 같이 제조하면 된다. 즉, 수용성 성분을 실온에서 용해한다. 유용성 성분을 가열 용해하여 정제수를 더해 혼합한다. 이 혼합물과 수용성 성분을 혼합한다. 그 후, 색제를 더해도 된다. 그 후, 여과함으로써 정제한다. 한편, 화장수의 성분은 용도 등에 따라 공지의 방법으로 조정하면 된다.

"유액"은 화장수와 크림의 중간적인 성질을 가지는 것이며, 일반적으로는 유동성이 있는 에멀젼이다. 유액은 주로 피부의 모이스처 밸런스, 보습성 및 유연성을 유지하기 위해서, 피부에 수분, 보습제 및 유분 등을 공급하기 위해 이용되는 화장료이다. 유액에 포함되는 성분은 후술의 크림에 포함되는 성분과 유사하지만, 유액은 유동성이 있으므로, 크림에 비해 고형 유분이나 납류의 양이 적다. 본 발명의 트리트먼트 방법에서는 공지의“유액”을, 그 용도 등에 따라 적절히 이용할 수 있다.

유액은 폴리인산, 그 염 또는 그 수화물을 예를 들어, 0.001 ~ 20 중량%, 바람직하게는 0.01 ~ 10 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 ~ 5 중량%, 가장 바람직하게는 0.2 ~ 2 중량% 정도 포함하면 된다.

"크림"은 물과 기름처럼 서로 서로 섞이지 않는 액체의 한쪽을 분산상으로서, 다른쪽 분산매에 안정적인 상태로 분산시킨 에멀젼의 일종이다. 본 발명의 트리트먼트 방법에서는 공지의“크림”을, 그 용도 등에 따라 적절히 이용할 수 있다. 이러한 크림으로는 피부의 보습이나 유연을 위한 에모리엔트 크림, 혈행을 촉진하기 위한 맛사지 크림, 피부의 세정을 위한 클렌징 크림, 탈모를 위한 헤어 리무버, 냄새제거를 위한 데오도란트 크림, 및 각질연화를 위한 각질연화 크림 등을 들 수 있다.

크림에는 예를 들면 아래의 성분이 포함되어 있다. 즉, 크림에 포함되는 수상성분으로는 이온 교환수 등의 정제수； 에탄올, 프로파놀 등, 유용성 성분을 용해하고 살균하여, 청량감을 주기 위한 알코올； 글리세린, PEG, 히알론산 등, 각질층의 보습을 위한 보습제； 및 퀸스시드, 펙틴, 셀룰로오스 유도체 등의 점액질을 들 수 있다.

크림에 포함되는 유상성분으로는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 바셀린, 고형 파라핀 등의 탄화수소； 올리브유, 아몬드유, 카카오지방, 피마자유 등의 유지； 밀납, 라놀린, 호호바유 등의 납； 스테아린산, 올레인산, 팔미틴산 등의 지방산, 세타놀, 스테아릴알코올 등의 고급 알코올； IPM, 글리세린트리에스텔, 펜타에리스리톨테트라 에스테르 등의 에스테르； 및 폴리실록산류 등의 실리콘유 등을 들 수 있다.

크림에 포함되는 계면활성제(유화제)로는 모노스테아린산글리세린, 폴리옥시 에틸렌(POE)솔비탄지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE알킬에테르, POE·폴리옥시프로필렌(POP)블록 폴리머 등의 비이온성 유화제； 및 지방산 비누 또는 알 킬황산나트륨 등의 음이온성 유화제를 들 수 있다.

그 외, 크림에는 구연산, 유산, 아미노산류 등, 제품의 pH를 조정하기 위한 완충제；게라니올, 리날로올 등 향기를 부가하기 위한 향료； 메틸파라벤, 페녹시 에탄올 등의 미생물을 억제하고, 부패를 방지하기 위한 방부제； 착색하기 위한 착색제； 금속 이온 봉쇄제, 자외선 흡수제 등, 퇴색이나 변색을 방지하기 위한 퇴색 방지제； EDTA등의 킬레이트제； 수산화 칼륨, 수산화 나트륨 등의 알칼리 성분, 비타민 E, 비타민 C, 디부틸히드록시톨루엔 등의 산화 방지제； 및 수렴제, 살균제, 활력제, 소염제 또는 미백제등의 약제가, 포함되어 있어도 된다.

크림에 포함되는 각 성분의 양은 그 종류나 용도에 따라 크게 다르지만, 본 발명의 트리트먼트 방법에서는 공지의 것을 적절히 이용하면 된다.

크림은 기본적으로는 아래와 같이 제조하면 된다. 즉, 수상성분을 70℃전후로 과열한다. 유상성분을 가열 용해하고, 향료 등을 첨가해 교반한다. 그리고, 수상성분과 유상성분을 교반하여, 70℃ 전후에서 호모믹서 등을 이용해 유화한다. 그 후, 탈기, 여과 및 냉각을 실시한다.

젤은 겔 또는 졸 등 외관 상태가 균일하고 투명에서부터 반투명의 화장료이다. 본 발명의 트리트먼트 방법으로는 공지의“젤”을, 그 용도 등에 따라 적절히 이용할 수 있다. 피부에 수분을 보급하고, 보습하기 위한 수성 젤, 피부의 보습을 유지하고, 유분을 보급하기 위한 유성 젤, 혈행을 촉진하기 위한 맛사지 용수성 젤, 및 세정용의 젤 등을 들 수 있다. 젤로는 카르복시비닐폴리머, 메틸셀룰로오스 등의 수용성 고분자를 포함한 겔화제를 이용해 제조하는 것을 들 수 있다. 또한, 겔상의 맛사지 오일을 이용해도 된다.

크림은 폴리인산, 그 염 또는 그 수화물을 0.001 ~ 20 중량%, 바람직하게는 0.01 ~ 10 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 ~ 5 중량%, 가장 바람직하게는 0.2 ~ 2 중량% 정도 포함하면 된다.

"미용액(엣센스)"은 기본적으로는 상기의 화장수, 유액 및 크림과 같은 성분이며, 유제, 가용화제, 보습제, 물, 및 그 외의 약제를 포함하는 것을 들 수 있다. 본 발명의 트리트먼트 방법에서의 공지의 미용액을 이용할 수 있다. 미용액에 포함되는 유제로는 올리브유, 동백유, 참기름, 해바라기유, 스위트아몬드유, 호호바유 등의 천연 식물유；카프린산, 미리스틴산, 올레인산, 이소스테아린산 등의 지방산의 디글리세린 에스테르 또는 트리글리세린에스테르 등을 들 수 있다. 이러한 유제는 주로 에모리엔트제로서 기능한다.

미용액에 포함되는 가용화제로는 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, 및 모노스테아린산프로필렌 글리콜 등의 프로필렌글리콜지방산에스테르류, 글리세린, 디글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1, 3－부틸렌글리콜 등의 다가(多價)알코올 등을 들 수 있다. 한편, 가용화제는 글리세린 또는 디글리세린을 사용하는 것과, 맛사지에 있어서 온열 효과를 높이므로 바람직하다. 미용액에 포함되는 물로는 증류수, 및 탈이온수를 들 수 있다. 기타 약제로는 살균제, 방부제, 비타민류, 식물로부터의 천연 엑기스, 색소, 향료 등을 들 수 있다.

미용액을 구성하는 각 성분의 양은 공지 성분량을 채용할 수 있다. 예를 들 면, 미용액 전체량을 100 중량%로 했을 경우에, 폴리 인산, 그 염 또는 그 수화물을 0.001 ~ 20 중량%, 바람직하게는 0.01 ~ 10 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 ~ 5 중량%, 가장 바람직하게는 0.2 ~ 2 중량% 정도 포함하면 된다. 또한, 유제 65 ~ 90 중량%, 가용화제 1 ~ 10 중량%, 보습제 1 ~ 30 중량%, 기타 약제 0 ~ 10 중량% 정도, 및 나머지는 물을 들 수 있다. 미용액은 공지 제조 방법에 따라 제조하면 된다.

"팩 화장료"는 피부의 보습, 혈행 촉진, 청정을 목적으로, 대상 부위에 도포하는 것이다. 팩 화장료에는 일반적으로, 젤리상, 페이스트상, 분말상을 들 수 있으며, 안면에 도포하여 피막을 형성시킨 후 박리하는 것이나, 도포 후에 닦아내는 것, 도포 후 씻어내는 것 등이 있다. 분말상의 것은 사용시에 물 등에 균일하게 녹이던지 현탁해서 사용한다. 또한, 아이마스크 등의 형상의 부직포나 콜라겐 시트에 화장료를 함침시킨 팩 화장료나 상기 부직포 등을 사용시에 화장료에 침지해 이용하는 팩 화장료 등이어도 된다.

"팩 화장료"는 폴리인산, 그 염 또는 그 수화물을 0.001 ~ 20 중량%, 바람직하게는 0.01 ~ 10 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 ~ 5 중량%, 가장 바람직하게는 0.2 ~ 2 중량% 정도 포함하면 된다. 기타 조성은 팩 화장료에 이용되는 공지 조성으로 하면 되고, 공지 제조 방법에 따라 제조하면 된다.

상기의 화장료는 각각이 통상 이용되는 방법에 따라 사용되면 된다. 그렇게 하면, 상기 화장료는 폴리인산 등을 유효량 포함하므로, 콜라겐의 산생이 촉진되어 피부미용효과나 노화방지효과 등의 효과가 있다.

다음으로, 폴리인산, 그 염, 또는 그 용매화물을 투여하는 콜라겐의 제조 방법에 대해 설명한다. 콜라겐은 사람 이외의 피부 등에서 추출하는 방법이 일반적이지만, 본 발명의 제조 방법을 이용하면 보다 효과적으로 콜라겐을 제조할 수 있다.

구체적으로는 본 발명의 제, 조성물 등을, 가축 등의 피부에 도포하고, 통상의 방법에 따라, 콜라겐을 채취한다. 그러면, 본 발명의 제를 도포한 피부는 통상의 피부에 비해 콜라겐을 많이 포함하므로 효과적으로 콜라겐을 제조할 수 있게 된다.

사람 또는 사람 이외의 포유동물의 상처에 본 발명의 제 또는 본 발명의 조성물을 적절히 도포한다. 그러면, 그 상처부위에서는 콜라겐의 산생이 촉진되므로, 상처가 깨끗이 치유되는 효과가 있다. 그 제나 투여량은 상기에 설명했던 대로 하면 된다.

고리모양의 폴리인산의 평균사슬길이의 절대값을 계측하는 대표적인 방법으로는 적정법이 있다. 이 방법은 일종의 말단기 측정법이며, 주로 고리모양 인산염의 분자량 결정에 이용되고 있다. 고리모양 인산염에 있어서는 말단기에는 1개의 강산성 수소와 1개의 약산성 수소가 있고, 중간기에는 1개의 강산성 수소가 있다. 즉 강산성 수소의 양(SA)과 약산성 수소의 양(WA)을 구함으로써, 다음식(III)으로부터 체인모양 인산염의 평균사슬길이를 구할 수 있다.

즉, 평균사슬길이=(2 SA/WA)···식(III)이다.

또한, 평균 분자량의 상대값과 분자량 분포를 구하는 방법으로는 HPLC를 이용한 겔 여과 크로마토그래피가 일반적이다. 겔 여과 크로마토그래피법의 상세와 계측 결과에 관해서는 실시예 중에 후술한다.

[제조예1]

폴리인산나트륨의 조제

아래와 같이, 다양한 사슬길이를 가지는 폴리인산나트륨을 제조했다.

(i) 식품첨가물 규격의 헥사메타인산나트륨(타이헤이 화학산업 주식회사제) 200g를 정제수 1,000 ml에 용해하고, 이것에 96%의 에탄올 50ml를 서서히 첨가했다.

(ii) 얻어진 액을 잘 교반하여 실온에서 1시간 이상 방치한 후, 원심분리(10,000×g, 10분, 25℃)하여 액을 2층으로 분리시켰다.

(iii) 상층을 없애 다른 용기로 옮겼다.

(iv) 고분자량(장사슬)의 폴리인산나트륨을 포함하는 하층을 회수하고, 가장 분자량이 큰 장사슬 폴리인산나트륨을 포함하는 획분(획분1)으로서 보존했다.

(v) 상기 (iii)의 조작으로 분리 회수한 상층에, 50ml의 에탄올을 첨가했다. 이와 같이 하여 얻어진 액에 대해 상기의(ii)~(iv)에 기재한 조작을 실시했다. 단, 그 결과 얻어진 하층은 획분1보다 분자량이 작은 폴리인산나트륨이 포함되므로, 이것을 획분2로서 보존했다.

(vii) 앞의 조작으로 얻어진 상층에 대해서, 상기(v) 및 (vi)의 조작을 실시하여, 얻어진 하층을 획분3으로서 보존했다.

(viii) 상기의 (vii)의 조작을 6회 더 반복하고, 그 때에 얻어진 하층을 보존했다. 얻어진 획분을, 각각 획분 4, 5, 6, 7, 8, 9로 했다.

(실시예 1)

폴리인산나트륨의 평균 분자량 및 분자량 범위의 결정

상기 분리 조작의 결과, 각각의 획분을 3개의 그룹으로 나누어 혼합하고, 각각의 그룹을 장사슬 폴리인산나트륨, 중사슬 폴리인산나트륨, 단사슬 폴리인산나트륨으로 했다. 획분 1, 2를 혼합한 것은 장사슬 폴리인산나트륨이며, 획분 3 ~ 5를 혼합한 것은 중사슬 폴리인산나트륨, 또한, 나머지 획분 6 ~ 9를 혼합한 것은 단사슬 폴리인산 나트륨이다. 또한, 획분 1 ~ 9의 전부를 혼합한 것은 모든 분자량을 포함하며, 분자량 분포가 큰 분할 폴리인산나트륨으로 했다. 상기 각각의 획분의 혼합물을 각각 동결 건조하고, 에탄올을 완전히 제거하여, 각종 사슬길이의 폴리인산나트륨 분말을 얻었다. 또한 각각의 평균사슬길이와 분자량 분포를 아래와 같은 적정법과 겔 여과법에 의해 결정했다.

이하에 상술의 장사슬, 중사슬, 단사슬 폴리인산나트륨의 평균사슬길이를 적정법에 의해 측정한 방법의 상세와 결과를 기재한다. 장사슬, 중사슬, 단사슬 폴리인산나트륨 각각 25g을 500㎖의 물에 용해하고, 분해 전 용으로 5㎖, 분해 후 용으로 40㎖를 분취 했다. 분해 전 용 용액에 5N수산화 나트륨 용액을 0.04㎖ 더해 pH 약 12로 한 후, 0.5 mol/ℓ의 염산으로 pH 약 2.5까지 적정했다. 분해 후 용 용액에 5N염산 48㎖ 및 물 280㎖를 더해 30분 이상 자비하여 가수분해한 냉각 후, 정확히 400㎖로 메스업했다. 이 용액 10㎖에, 5N수산화나트륨 용액을 2.2㎖ 더해 pH 약 11로 한 후, 0.5 mol/ℓ염산으로 pH 약 2.5까지 적정했다. 적정에는 자동 적정 장치(히라누마 산업(주) COM-1500)을 이용했다.

상기 분해전 및 분해 후의 양 용액의 적정 곡선의 제일 변곡점으로부터 제2 변곡점까지의 0.5 mol/ℓ의 분해 전 염산 소요량(㎖)을 W, 분해 후 염산 소요량(㎖)을 S로 했을 때, 각각의 평균사슬길이는 아래와 같았다.

장사슬 폴리인산나트륨=(2×5×1. 56)/0.12 = 130

중사슬 폴리인산나트륨=(2×5×1. 32)/0.22 = 60.2

단사슬 폴리인산나트륨=(2×5×0. 50)/0.35 = 14.3

이하에 상술의 장사슬, 중사슬, 단사슬 폴리인산나트륨을 HPLC에 의한 겔 여과 크로마토그래피에 의한 해석 결과를 나타냈다. 한편, HPLC에서의 분석 조건은 아래와 같았다.

분석 기기(HPLC)： 시마즈 제작소제 LC2010C

컬럼： Shodex OHpak SB-803 HQ

컬럼 온도： 30℃

용매： 0.1M NaCl

유속： 1 ㎖/min

샘플 적용량：0.01 ㎖

샘플중 폴리인산나트륨 농도：1%

상기 조건에서의 겔 여과에 의한 해석의 결과, 장사슬 폴리인산나트륨의 용출시간은 7.95분, 중사슬 폴리인산나트륨의 용출시간은 8.50분, 단사슬 폴리인산나트륨의 용출시간은 9.17분이었다. 또한 이 값으로부터 평균 사슬길이의 대수(log)와 용질 시간과의 관계의 검량선을 작성했다(도1). 그 결과, 용출시간과 사슬길이 의 대수와의 관계는 다음의 식(VI)으로 나타나는 것을 알 수 있었다. 사슬길이(log)=-0.7987×용출시간 + 8.5001 식(VI)

이 검량선에 근거해 장사슬, 중사슬, 단사슬 폴리인산나트륨의 겔 여과 해석에서의 용출개시시간(고분자량측)과 용출종료시간(저분자량측)을 산출하고, 이들 분자량 범위를 산출했다. 그 결과를 표1에 나타낸다. 한편, 표 1중, 산출 불능은 검량선외이며 산출 불능을 의미한다.

사슬길이 용출개시시간 용출종료시간

(분) (분)

장사슬 7.52 8.35 사슬길이 산출불능 1.830955 (log) 사슬길이 산출불능 67.7571

중사슬 8.2 8.8 사슬길이 1.95076 1.47154 (log) 사슬길이 89.281196 29.616927

단사슬 8.78 9.55 사슬길이 1.487514 산출불능 (log) 사슬길이 30.726564 산출불능

[표 1] 식(IV)로부터 산출한 각사슬길이의 폴리인산의 분자량 범위

상술의 적정법과 겔 여과법에 의해 분자량 범위의 해석으로부터, 획분 1, 2를 혼합한 장사슬 폴리인산나트륨은 평균사슬길이 130, 사슬길이 범위가 67.8이상이며, 획분 3~5를 혼합한 중사슬 폴리인산나트륨은 평균사슬길이 60, 사슬길이 범위가 29.6~89.2였다. 또한, 나머지의 획분 6~9를 혼합한 단사슬 폴리인산나트륨은 평균사슬길이 14, 사슬길이 범위가 30.7 이하였다.

(실시예 2)

울트라 인산 나트륨의 성질 확인

또한 본 실시예에 사용한 울트라 인산 나트륨에 관해서, 그 분자의 특징으로서 수용액 상태로 했을 경우에 pH 1 ~ 2의 강산성을 나타내고, 수산화나트륨 등의 알칼리 용액으로 적정했을 경우에 상기 pH의 산성 영역에서 pH완충 영역을 가지는 것을 알 수 있다. 이것으로부터, 울트라인산나트륨수용액을 수산화나트륨수용액에서 적정하여, 그 pH변화를 계측하여 도 2에 나타냈다. 그 결과, pH 1 ~ 2 부근에서 완충 작용을 나타내고, 울트라인산나트륨의 성질을 가지는 것이 확인되었다.

(실시예 3)

폴리 인산에 의한 콜라겐 산생의 증대

상기 제조예에 따라 취득한 분할폴리인산나트륨을 이용해 쥐의 상처 부위의 콜라겐 산생 평가 시험을 실시했다.

도 3은 상처치유 모델을 나타내는 개념도이다.

생후 6주령의 Wistar계 수컷쥐를 이용해 에테르 마취 하에 등쪽을 체모하여, 몸의 장축을 따라 근막에 달하는 깊이로 20 ㎜절개를 실시했다. 그 후, 상처중앙의 양단을 5 ㎜의 폭이 되도록 근막과 1실씩 봉합해 방추형의 상처 치유 모델을 작성했다 (도 3을 참조). 실험군에는 상처부위에 1% 폴리인산나트륨수용액｛상술의 제조예로 조제한 단사슬, 중사슬, 장사슬 폴리인산나트륨 모두를 포함한 조정전의 폴리인산나트륨(평균사슬길이 60, 사슬길이 범위 3 ~ 300)｝을, 대조군에는 1% 인산 완충액을 각각 100㎎씩 주 5일간 국소에 도포했다. 3일째, 및 7일째에 안락사시켜, 상처의 중앙으로부터 5㎜의 거리의 조직을 도1에 나타냈듯이 근막상에서 피부 표본을 채취했다. 채취한 피부 표본을 통법에 따라 포르말린 고정 후, 파라핀 절편을 제작하고, 도포 후 7일째의 표본에 관해서 헤마톡실린·에오진 (HE) 염색 및 AZAN 염색을 실시했다. 또한 도포 후 3일째의 표본을 탈파라핀 후 인시튜 합성(in situ hybridization)에 의해 I형 콜라겐 mRNA 발현량의 평가를 실시했다.

인시튜 합성(in situ hybridization)에 의한 I형 콜라겐 mRNA 발현량의 평가

쥐 조직으로부터 추출한 RNA으로부터 cDNA를 합성하고, 그것을 주형으로 하여, FW: 5'-gagggggtttctgtgtcct-3'(배열번호1) 및 RV: 5'-cgaggtagtctttcagcaacac-3' (배열번호2)의 프라이머를 이용하여 PCR를 실시했다.

이와 같이 쥐 타입 I 콜라겐 유전자의 일부를 포함하는 DNA 단편을 얻었다.

동단편을 pCRII-TOPO 벡터(인비트로젠사제)로 클로닝하고, pCRII-R type1-collagen 플라스미드를 제작했다. 동 플라스미드를 제한 효소 Xho1로 절단하여 사슬모양으로 하고, in vitro transcription에 의해 Dig 표식 타입 I 콜라겐 RNA probe를 제작했다. 탈 파라핀한 도포 후 3일째의 표본(프레파라트)을 protease K (2㎍/㎖)로 10분간 처리(실온)하고, 60℃에서 15시간 합성(hybridization)을 실시했다. 이 때의 프로브의 농도는 500ng/㎖이며, 50% 포름아미드(FA)를 포함하는 5×SSC(0.75 M NaCl, 60 mM Na₃citrate, pH 7. 0) 용액중에서 실시했다. 그 후, 아래 표 2의 순서로 세정을 실시하고, BM-purple(롯슈사 제품)로 처리함으로써, I형 콜라겐 mRNA가 발현하고 있는 조직 부분을 특이적으로 염색했다.

처리순서	세정용액	처리시간	처리온도
1	2XSSC	5분	실온
2	2XSSC	15분	실온
3	50%FA, 2XSSC	30분	60℃
4	1XSSC	15분	실온
5	0.5XSSC	15분	실온
6	0.5M Nacl, 30mM Tris-HCl(ph7.5)	5분	실온
7	0.5M Nacl, 30mM Tris-HCl(ph7.5)	5분	실온
8	1.5% Blocking reagent(코스모바이오사 제품)	30분	실온
9	Anti-DIG antibody	5시간	실온
10	0.5M Nacl, 30mM Tris-HCl(ph7.5)	5분	실온
11	0.5M Nacl, 30mM Tris-HCl(ph7.5)	5분	실온

[표 2] 세정공정

도 4는 헤마톡실린·에오진(HE) 염색도를 나타내는 도면을 대신하는 사진이다.

도 4(A)는 대조군의 HE염색 약확대 상이다. 도 4(a-1)에 도 4A의 사각으로 둘러싼 부분의 HE염색 강확대 상을 나타낸다.

도 4(a-2)는 도 4(A)의 사각으로 둘러싼 부분의 아잔 염색 강확대 상을 나타낸다.

대조군에서는 상처부위는 기질화의 경향을 나타냈지만, 임파구나 매크로파지 등의 염증성 세포의 침윤이 현저하고, 표피의 신장은 경도였다. 또한, 아잔염색의 결과, I형 콜라겐 산생도 그다지 많지 않았던 것을 알 수 있다. 도 4(B)는 폴리인산 도포군의 HE염색 약확대 상이다. 도 4(b-1)에 도 4(B)의 사각으로 둘러싼 부분의 HE염색 강확대 상을 나타낸다. 도 4(b-2)에 도 4(B)의 사각으로 둘러싼 부분의 아잔염색 강확대 상을 나타낸다. 상처부위는 섬유아세포의 증식·섬유의 증생과 성숙이 보여지며, 아잔염색의 결과로부터 대조군에 비해 분명하게 굵은 콜라겐 섬유의 산생이 확인되었다. 또한 상처의 표층에 있어도 염증성 세포는 거의 인정되지 않으며, 상처는 거의 표피에 덮여 있었다.

도 5는 인시튜 합성(in situ hybridization)의 결과를 나타내는 도면을 대신하는 사진이다. 도 5(A)는 대조군을 나타내고, 도5(B)는 폴리인산을 도포한 군을 나타내며, 도 5(b)는 도 5(B)의 부분 확대도이다.

대조군(도 5의 A)에서는 거의 염색되지 않으며, 현저한 타입 I콜라겐 mRNA의 발현이 인정되지 않았는데 비해, 폴리인산 도포군(도 5의 B)에서는 약확대 상에 있어서 피하 조직 전체의 염색이 확인되며, 도 5의 b(도 5의 B의 사각 부분의 확대 상)에서는 상처 단면 끝의 정상 피하 조직과 인접하는 부분의 섬유아세포의 세포질에 타입 I 콜라겐 mRNA의 현저한 발현을 인정했다.

상기의 HE 및 아잔염색상, 타입 I 콜라겐 mRNA에 대한 인시튜 합성(in situ hybridization)의 결과로부터, 폴리인산에 의해 콜라겐의 현저한 증산이 확인되며, 폴리인산이 콜라겐 산생 촉진 재료로서의 기능을 가지며, 그 효과에 의해 다친 조직의 회복이 높아지는 것을 알았다.

(실시예4)

폴리인산나트륨에 의한 사람 진피 섬유아세포의 콜라겐 산생 촉진 효과의 인산 중합도 의존성

사람 진피로부터의 섬유아세포(HDF)를 이용해 폴리인산나트륨에 의한 콜라겐 산생 촉진 효과를 조사했다. HDF를 1홀당 25,000개가 되도록 24홀 플레이트에 파종하고, D-MEM 배양지(시그마사제)를 이용해 37℃, 5% CO₂로 세포가 융합될 때까지 배양했다(3일간). 그 후 1% 소 혈청을 포함한 D-MEM 배양지로 치환하고, 6일간 혹은 9일간 배양을 실시했다. 다음으로, 상술의 제조예에 따라 조제한, 단사슬, 중사슬, 장사슬 폴리인산나트륨｛평균 인산 중합도 14(단사슬), 60(중사슬), 130(장사슬)｝을 피험물질로서, 각각 최종 농도가 1%가 되도록 D-MEM 배양지에 첨가하여 처리를 실시했다. 또한, 상술의 제조예로 조제한 단사슬, 중사슬, 장사슬 폴리인산나트륨 모두를 포함한 폴리인산나트륨(평균사슬길이 60, 사슬길이 범위 3~300)에 관해서도 다른 폴리인산나트륨과 동농도로 동일 처리를 실시했다. 한편, 대조로서 무처리군을 설치하여, 대조군으로 했다. 또한, 다양한 폴리인산으로 처리한 처리군은 아래와 같이 나타내는 것으로 했다.

처리군A：단사슬, 중사슬, 장사슬 폴리인산나트륨 모두를 포함하는 폴리인산나트륨(평균사슬길이 60, 사슬길이 범위 3 ~ 300)으로 처리한 세포.

처리군B：단사슬 폴리인산나트륨으로 처리한 세포.

처리군C：중사슬 폴리인산나트륨으로 처리한 세포.

처리군D：장사슬 폴리인산나트륨으로 처리한 세포.

처리군E：울트라인산나트륨으로 처리한 세포.

각 처리 배양지에 의해 6일간 혹은 9일간 배양한 세포에 관해서, 아래의 순서에 따라 I형 콜라겐의 면역 염색을 실시했다. 단, 처리 4일째와 7일째에 각종 처리군과 같은 피험물질이 포함된 신선한 D-MEM 배양지로 바꾸었다. 또 아래의 조작은 모두 24홀 플레이트의 1홀당에 대한 것이다.

(i) 배양액을 제거하고, 0.5㎖의 10%중성 완충 포르말린액(상품명：타나포름, 주식회사 다나카제)을 첨가해 세포를 고정했다.

(ii) TBS-Ca(20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.15 M NaCl, 1 mM CaCl₂)를 1㎖ 첨가해, 세포를 세정했다.

(iii) 1㎖의 메탄올을 첨가해 ―20℃에서 30분간 방치했다.

(iv) 1㎖의 TBS-Ca를 첨가해 세정했다.

(v) 5% 탈지유를 포함하는 TBS-Ca를 1㎖l 첨가해, 50분간 방치했다.

(vi) 1㎖의 TBS-Ca를 첨가해 세정했다.

(vii) 항(抗)사람 I형 콜라겐 항체(폴리크로널 항체, 케미콘사 제품)를 1/150희석한 5% 탈지유를 포함하는 TBS-Ca를 0.15㎖ 첨가해 50분간 방치했다. (viii) 1㎖의 TBS-Ca로 3회 세정했다.

(ix) 이후의 조작에 관해서는 DAKO EnVision System HRP(DAB) 킷(DacoCytomation 주식회사)을 이용해 그 킷의 프로토콜에 따라 실시했다. 2차 항체를 결합시킨 DAKO 덱스트란폴리머 시약을 TBS-Ca로 5배 희석하고, 그것을 0.15㎖ 더해 30분간 방치했다.

(x) 1㎖의 TBS-Ca로 3회 세정했다.

(xi) DAKO 기질 반응액 0.15㎖에 DAKO 발색 기질을 3㎕혼합한 것을 첨가해 약 10분간 발색 반응을 실시했다.

(xii) 증류수로 3회 세정하여 반응을 정지시키고, 에탄올로 세정 후, 염색상을 스캐너로 거두어들였다. 각 처리군에 대해 화상 해석 소프트인 Image-J(프리 웨어)를 이용해 해석을 실시하고, 염색도를 정량화하여 평가의 지표로 했다.

도 6은 각 사슬의 폴리인산나트륨으로 처리한 HDF의 면역염상을 나타내는 도면을 대신하는 사진이다.

도 7은 도 6의 염색 화상을 화상 해석 소프트(Image-J)로 해석하여, 염색도를 정량화한 결과를 나타내는 도면을 대신하는 그래프이다.

정량화에 대해서, 각각의 처리 일수에 있어서의 대조군의 염색 강도를 1으로서, 그 외의 처리군의 염색 강도의 상대값을 콜라겐 산생율로 했다.

도 7로부터 6일째에는 단사슬 및 중사슬 폴리인산나트륨 처리군(처리군B 및 C), 모든 사슬길이를 포함한 폴리인산나트륨(평균사슬길이 60, 사슬길이 범위 3 ~ 300)(처리군A), 울트라인산나트륨으로 처리한 세포(처리군E)가, 장사슬 폴리인산나트륨 처리군(처리군D)이나 무처리의 대조군보다 콜라겐 산생 촉진능력이 높은 것을 알았다. 또한, 처리 9일째에서는 단사슬 폴리인산나트륨 처리군(처리군B)이 가장 촉진능력이 높고(대조군의 약6.3배), 다음으로, 중사슬 폴리인산나트륨(처리군C)이 높았다(대조군의 약4.9배). 또한, 다른 분자량을 포함하는 폴리인산나트륨이나 울트라인산나트륨(처리군E)은 무처리의 세포(대조군)에 비하면 2배 정도의 콜라겐 산생 촉진능력이 있었다. 이상로부터, 폴리인산은 사슬길이 3 ~ 300의 사이에서 콜라겐 산생 촉진능력을 가지지만, 특히 단사슬 및 중사슬 폴리인산나트륨에서 콜라겐 산생 촉진 효과가 보다 높은 것을 알았다. 또한 무처리 및 인산 처리군에서는 다른 처리군보다 현저하게 염색도가 낮고, 콜라겐 산생 촉진이 폴리인산나트륨 분자 자체에 의존하고 있는 것을 알 수 있었다.

도 1은 폴리인산나트륨의 분자량을 결정하기 위한 겔 여과 분석에서의 용출시간과 분자량의 관계를 나타낸 그래프이다.

도 2는 울트라인산나트륨의 적정 곡선이다.

도 3은 상처치유 모델을 나타내는 개념도이다.

도 4는 헤마톡실린·에오진(HE) 염색도를 나타내는 도면으로 바뀌는 사진이다. 4(A)는 대조군의 HE염색 약확대 상이고, 4(a-1)는 4A의 사각으로 둘러싼 부분의 HE염색 강확대 상을 나타내고, 4(a-2)는 4(A)의 사각으로 둘러싼 부분의 아잔 염색 강확대 상을 나타내고, 4(B)는 폴리인산도포군의 HE염색 약확대 상이고, 4(b-1)는 4(B)의 사각으로 둘러싼 부분의 HE염색 강확대 상을 나타내고, 4(b-2)는 4(B)의 사각으로 둘러싼 부분의 아잔염색 강확대 상을 나타낸다.

도 5는 인시튜 합성(in situ hybridization)의 결과를 나타내는 도면을 대신하는 사진이다. 5(A)는 대조군을 나타내며, 5(B)는 폴리인산을 도포한 군을 나타내고, 5(b)는 5(B)의 부분 확대도이다.

도 6은 각 사슬의 폴리인산나트륨으로 처리한 HDF의 면역염상을 나타내는 도면을 대신하는 사진이다. 무처리의 세포를 대조군으로 하고, 단사슬, 중사슬, 장사슬 폴리인산나트륨의 모두를 포함하는 폴리인산나트륨(평균사슬길이 60, 사슬길이 범위 3~300)으로 처리한 세포를 처리군A, 단사슬 폴리인산나트륨으로 처리한 세포를 처리군B, 중사슬 폴리인산나트륨으로 처리한 세포를 처리군C, 장사슬 폴리인산나트륨으로 처리한 세포를 처리군D, 울트라인산나트륨으로 처리한 세포를 처리군E 로 했다.

도7은 도6의 염색 화상을 화상 해석 소프트(Image-J)로 해석하여, 염색도를 정량화한 결과를 나타내는 도면을 대신하는 그래프이다. 무처리의 세포를 대조군으로 하고, 또한, 단사슬, 중사슬, 장사슬 폴리인산나트륨 모두를 포함하는 폴리인산나트륨(평균사슬길이 60, 사슬길이 범위 3~300)으로 처리한 세포를 처리군A, 단사슬 폴리인산나트륨으로 처리한 세포를 처리군B, 중사슬 폴리인산나트륨으로 처리한 세포를 처리군C, 장사슬 폴리인산나트륨으로 처리한 세포를 처리군D, 울트라인산나트륨으로 처리한 세포를 처리군E로 했다.

<110> Regenetiss Inc. <120> An agent which promotes production of collagen, a cosmetic agent, a method for producing collagen <130> IN2007-PKR032 <150> JP2006-227237 <151> 2006-08-24 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 gagggggttt ctgtgtcct 19 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 cgaggtagtc tttcagcaac ac 22

Claims

폴리인산, 그 염 또는 그 용매화물을 유효 성분으로 포함하는 콜라겐의 산생을 촉진하는 제.
청구항 1에 있어서,

상기 폴리인산이, H₂O 및 P₂O₅를 구성분자로 하고, H₂O대 P₂O₅의 몰비(R)가 2＞R≥1이며, 아래와 같이 일반식(I) 또는(II)으로 표시되는 사슬모양 또는 고리모양의 폴리인산을 1종 또는 2종 이상 포함하는 콜라겐의 산생을 촉진하는 제.

H_n ₊₂(P_nO_3n ₊₁) (I)

(HPO₃) _n (II)

(식(I) 및 (II)에서 n은 각각 독립하여 3 ~ 300의 정수를 나타낸다.)
청구항 2에 있어서,

식(I) 및 (II)에서 n은 각각 10 ~ 89의 정수인 콜라겐의 산생을 촉진하는 제.
청구항 1에 있어서,

상기 폴리인산은 울트라인산인 콜라겐의 산생을 촉진하는 제.
청구항 1 또는 청구항 4의 제를 포함하는 화장료.
폴리인산, 그 염 또는 그 용매화물을 사람 또는 사람 이외의 포유동물에 투여하는 공정을 포함하는 콜라겐의 제조 방법.