JP2002097116A - 細胞賦活剤 - Google Patents

細胞賦活剤

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JP2002097116A
JP2002097116A JP2000283069A JP2000283069A JP2002097116A JP 2002097116 A JP2002097116 A JP 2002097116A JP 2000283069 A JP2000283069 A JP 2000283069A JP 2000283069 A JP2000283069 A JP 2000283069A JP 2002097116 A JP2002097116 A JP 2002097116A
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cell
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taurine
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Chika Hamada
千加 浜田
Masahiro Tajima
正裕 田島
Yasunari Nakama
康成 中間
Tadahito Takahashi
唯仁 高橋
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Original Assignee
Shiseido Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 育毛剤に配合する毛髪関連薬剤を提供するこ
と。 【解決手段】 タウリンを有効成分とする細胞賦活剤、
毛髪細胞コントロール剤、毛髪成長期延長剤、毛髪細胞
増殖活性剤、毛包上皮系細胞増殖活性剤、外毛根鞘細胞
増殖活性剤、毛髪はり・こし改善剤。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞賦活剤、毛髪
細胞コントロール剤、毛髪成長期延長剤、毛髪細胞増殖
活性剤、毛包上皮系細胞増殖活性剤、外毛根鞘細胞増殖
活性剤に関する。本発明は、育毛料の配合成分として利
用され、毛髪細胞活性化に関する効果を発揮する。
【０００２】
【従来の技術】高齢化社会、ストレス社会と称される現
代社会は、様々な原因により脱毛の危機にさらされる機
会が多い。そのため、優れた育毛料の開発が精力的に行
なわれている。
【０００３】育毛料が毛髪に与える効果としては、発毛
誘導効果（発毛促進効果、成長期誘導効果）、毛髪を太
くする効果、毛髪成長期延長効果、５α−レダクターゼ
阻害効果、血行促進効果、殺菌効果、フケ防止効果、保
湿効果、抗酸化効果等が挙げられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、精力的
な育毛料の開発にもかかわらず、従来の育毛料において
は、その脱毛防止、発毛効果等の育毛作用は必ずしも十
分なものではなかった。これは、脱毛などの原因が多岐
にわたり、また、発毛の機構も非常に複雑であるためで
ある。
【０００５】従来の育毛料は、脱毛を比較的大雑把な概
念、言い換えれば、漫然と「脱毛」という現象のみを捉
えて開発されており、そのメカニズムにまで着目し、探
求して開発されたものは多くはない。
【０００６】この大きな理由の一つとしては、メカニズ
ムに着目した育毛効果を簡便に検定できる育毛薬剤検定
方法が十分に確立されていなかったことに由来する。特
に毛髪成長期延長効果などを検定する育毛薬剤検定方法
の確立は難しく、結果として、これまで提供されてきた
育毛料は、毛周期の成長期に毛髪を誘導して育毛する発
毛誘導効果に着目したものが多かった。
【０００７】本発明者等は、インビトロ（in vitro）で
行う簡便な育毛薬剤検定方法を確立し、この育毛薬剤検
定方法を用いて、多くの化合物を検討し、本発明を完成
するに至った。
【０００８】本発明の目的は、養毛料などの配合成分と
なる育毛関連効果剤を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、タ
ウリンを有効成分とする細胞賦活剤を提供するものであ
る。
【００１０】また、本発明は、タウリンを有効成分とす
る毛髪細胞コントロール剤を提供するものである。
【００１１】さらに、本発明は、タウリンを有効成分と
する毛髪成長期延長剤を提供するものである。
【００１２】また、本発明は、タウリンを有効成分とす
る毛髪細胞増殖活性剤を提供するものである。
【００１３】さらに、本発明は、タウリンを有効成分と
する毛包上皮系細胞増殖活性剤を提供するものである。
【００１４】また、本発明は、タウリンを有効成分とす
る外毛根鞘細胞増殖活性剤を提供するものである。
【００１５】さらに、本発明は、タウリンを有効成分と
する毛髪はり・こし改善剤を提供するものである。
【００１６】
【発明の実施の形態】以下、本発明の構成について詳述
する。
【００１７】本発明に用いるタウリンは、Ｈ2ＮＣＨ2Ｃ
Ｈ2ＳＯ3Ｈの分子式で表される化合物であり、これま
で、細胞賦活剤、毛髪細胞コントロール剤、毛髪成長期
延長剤、毛髪細胞増殖活性剤、毛包上皮系細胞増殖活性
剤、外毛根鞘細胞増殖活性剤、毛髪はり・こし改善剤と
しての効果を正確に確認されたことはない。
【００１８】本発明は、後述する育毛薬剤検定方法によ
って、少なくとも毛包上皮系細胞の分裂増殖活性を維持
又は促進することにより毛髪の成長期を維持又は延長す
る効果を確認できるタウリンを有効必須成分とする毛髪
関連薬剤であり、育毛料、養毛料に配合するための「個
別効能薬剤」としての特徴を有する。
【００１９】本発明は、例えば、毛根近傍における毛包
上皮系細胞の増殖が緩徐であること等により成長期が短
くなって、相対的に成長期毛よりも休止期毛の割合が多
くなってしまうことに起因する脱毛症に特に有効な薬剤
である。また、他の個別効能を有する育毛薬剤と組み合
わせて用いることにより、幅広くの脱毛症において、総
合的かつ相乗的な効果を上げることが可能である。すな
わち、本発明の薬剤は、総合的な育毛効果の概念を有す
る一般的育毛料とは一線を画する用途を有するものであ
る。
【００２０】本発明の薬剤はタウリンからなる。タウリ
ンを適当な基剤に配合し製剤化して有効成分として用い
る場合は、本発明の効果が発揮されるように具体的な形
態等に応じてその配合量が適宜決定される。通常の配合
量は基剤全体に対して０．００００１〜２０質量％、好
ましくは、０．０１〜１０．０質量％である。本発明の
薬剤を毛髪関連製品に配合する場合においても、タウリ
ンの含有量が前記含有量になることが好ましい。０．０
０００１質量％未満の配合量では、毛髪細胞賦活効果が
十分に発揮されず、また、２０質量％を超えて配合して
も、含有量の増加に見合った効果の増大を見込めないば
かりではなく、製剤上支障をきたす傾向が顕著となり好
ましくない。
【００２１】本発明の薬剤は、特には優れた毛包系細胞
増殖活性作用又は外毛根鞘細胞増殖活性作用に基づく毛
髪成長期延長効果を有する。例えば、毛根近傍における
毛包上皮系細胞の増殖が緩徐であること等により成長期
が短くなって、相対的に成長期毛よりも休止期毛の割合
が多くなってしまうことに起因する脱毛症に特に有効で
ある。また、他の個別効能を有する育毛料と組み合わせ
て用いることにより、特定の脱毛症においては相乗的な
効果を上げることが可能である。
【００２２】本発明の薬剤の毛周期における成長期の維
持又は延長作用を特定して確認する手段は、その特定方
法自体がその作用を特定するために妥当なものである限
り特に限定されない。例えば、インビトロ（in vitro）
における特定方法も、インビボ（in vivo）における特
定方法も用いることができるが、その簡便性と有効性を
考慮すると、インビトロにおける特定方法を用いること
が好ましい。
【００２３】以下に、インビトロにおける特定方法の一
つである、毛包系上皮培養細胞の増殖効果を検討するこ
とを特徴とする特定方法について簡単に説明する。この
方法は、「毛包上皮系培養細胞に無血清培地中で対象物
質を接触させることによって、その細胞の増殖活性の有
無及び強弱を特定し、その対象物質の毛周期における成
長期を延長する効果を検定する育毛薬剤検定方法」であ
る。毛髪の伸長に直接的に関係する毛包上皮系細胞に着
目し、この培養細胞を用いることによって、所望する毛
周期における成長期を延長する効果を特定するインビト
ロの育毛薬剤検定方法である。
【００２４】この育毛薬剤検定方法においては、動物
（ヒトを含む）の毛包上皮系細胞を単離して得た培養細
胞である「毛包上皮系培養細胞」に対象物質を接触させ
て、その増殖の有無及び強弱を特定する。毛包上皮系細
胞は、特に毛根近傍の外毛根鞘細胞とマトリクス細胞等
の細胞のことを指し、内側の毛乳頭細胞は除外される。
毛周期における成長期は、まさにこの毛髪が伸長してい
る時期、すなわち毛包上皮系細胞が分裂して増殖してい
る時期であり、同退行期及び休止期はこれが鈍化して休
止する時期である。つまり、毛周期における成長期を延
長させる物質は、その投与により毛包上皮系細胞の分裂
及び増殖活性を維持することによって、毛髪が毛周期に
おける退行期及び休止期への移行を防ぐ物質、すなわ
ち、毛包上皮系細胞の増殖を促進又は維持し続ける物質
であることが結論付けられる。なお、他のインビトロの
育毛薬剤検定方法として、例えば、対象物質を動物の毛
乳頭細胞に作用させて、その増殖効果を判定する方法を
挙げることもできる。
【００２５】インビボにおける特定方法としては、例え
ば、ヌードマウスに対象物質を投与し、このヌードマウ
スの体表の発毛部位の状態を特定して、対象物質の毛周
期における成長期を延長する効果を検定する育毛薬剤検
定方法などを挙げられる。原則的には無毛であるが、そ
の体表に経時的にその発毛部位が移動する特徴的な発毛
をするヌードマウスにおける発毛部位の広さと発毛部位
の移動速度を特定することによって、毛周期における成
長期の長さを検定する方法等である。
【００２６】本発明の薬剤がとり得る剤型は、育毛料に
配合できて、外皮に適用可能な剤型であれば特に限定さ
れない。本発明の薬剤は、例えば、ヘアトニック、ヘア
ークリーム、ヘアムース（登録商標）、シャンプー、リ
ンス等の製品に配合できる。
【００２７】本発明の薬剤は、本発明の効果を損なわな
い限りにおいて、化粧品、医薬部外品、医薬品等におい
て一般的に用いられる各種油性若しくは水性成分、保湿
剤、増粘剤、防腐剤、酸化防止剤、香料、色剤、各種薬
剤等を配合して、常法により製剤化することができる。
【００２８】
【実施例】次に本発明を実施例等によりさらに具体的に
説明する。本発明は以下の実施例のみに限定されない。
以下の実施例等において「％」と表示され、かつ内容量
を示すものは特に断りのない限り質量％を意味する。
【００２９】「実施例１」タウリンの毛髪成長期延長作
用を評価した。始めにインビトロの細胞増殖試験につい
て説明する。
【００３０】＜毛包上皮系培養細胞を用いた細胞増殖試
験＞ Ａ．ヒト毛包上皮系細胞 １．ヒト毛包上皮系細胞の採取 外科手術の副産物として得られたヒト男性頭皮から毛周
期における成長期の毛包を実体顕微鏡下で機械的に採取
した。この成長期の毛包を1000U/ml dispase・0.2％コ
ラゲナーゼを含むダルベッコの改変ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）
で３０分間、３７℃で処理し、注射針の先を用いてderm
al sheath やdermal papilla、毛球部上皮組織を除去し
て、0.05％トリプシン・0.02％ＥＤＴＡを含むリン酸緩
衝液〔ＰＢＳ（−）：（−）とはカルシウムイオンやマ
グネシウムイオンを含まない意味である〕で５分間、３
７℃で処理した。
【００３１】次に、コラーゲン（Type I）コーティング
した培養皿に毛包を静置し、外殖片培養を行った。な
お、この際の培地は、無血清培地〔Keratinocyte Growt
h Medium（ＫＧＭ）〕を用いた。この培養の４〜５日後
に、毛包の培養皿への接着及び細胞の増殖が確認できた
時点で培地を交換し、これ以降２日おきに培地交換を行
った。
【００３２】このようにして増殖させた細胞を、0.05wt
％トリプシン-0.02％ＥＤＴＡで３７℃で５分間処理し
た後、等量の0.1％トリプシンインヒビターで反応を停
止させ、遠心処理(800×g、5分間)を施して細胞を回収
した。次に、細胞を上記の無血清培地に浮遊させて、50
00cells/cm2の密度でコラーゲンコーティング（TypeI）
した培養皿に播種し、細胞がsubconfluentになるまで２
日おきに培地交換を行い、再び0.05wt％トリプシン-0.0
2％ＥＤＴＡで３７℃で５分間処理した後、等量の0.1％
トリプシンインヒビターで反応を停止させ、遠心処理(8
00×g、5分間)を施して、これにより得られたヒト毛包
上皮系細胞に細胞凍結液（セルバンカー：ダイヤトロン
製）を添加し、１．０×１０６cell/mlの濃度に調整し
て、各凍結チューブに１．０×１０６cellずつ入れ、こ
れを凍結保存した。なお、これらの細胞数は、血球算定
板で算出した。
【００３３】２．対象物質のアッセイ 上記工程により得た毛包上皮系細胞の線維芽細胞混入率
（ＦＢ混入率）を測定（３０００倍、５視野）し、その
結果ＦＢ混入率が３％以上のものは、アッセイの対象か
ら除外した。そして、この毛包上皮系細胞を培養フラス
コ中に播種後、これを０．０５％トリプシンと０．０２
％ＥＤＴＡで処理した後、０．１％トリプシンインヒビ
ターで反応を停止後、系を１５００rpmで５分間遠心処
理を施し、上清を除去し、残渣にＫＧＭ培地２０mlを添
加して、細胞懸濁液を調製した。
【００３４】０．２ml/wellの割合で、９６well-plate
（Ｉ型コラーゲンコーティングプレート：ファルコン社
製）に播種し（１．０×１０4cell/well）、細胞がウエ
ルの底に沈むまで約２０分間室温下で放置した。その
後、３７℃、５％ＣＯ2で１日間培養を行い、所望する
ヒト毛包上皮系培養細胞を得た。
【００３５】Ｂ．ラット毛包上皮系細胞 １．ラット毛包上皮系細胞の採取： （１）毛包の採取 新生児（３〜４日令）ラットの背部皮膚を採取し、この
採取した背部皮膚を１％ＰＳＦ含有ＰＢＳ（−）に２枚
ずつ浸した。その後、皮膚脂肪層から下の皮下脂肪や皮
膜等を解剖用ハサミで除去した。次いで、再びこの背部
皮膚を１％ＰＳＦ含有ＰＢＳ（−）に浸し、さらにこれ
を０．２５％トリプシン含有ＰＢＳ（−）（０．０２％
ＥＤＴＡ含む。以下、同様である。）中に４℃で一晩浸
した。
【００３６】このトリプシン溶液中における浸漬後、背
部皮膚の真皮層と表皮層をピンセットで剥がした後、真
皮層を０．３５％のコラゲナーゼを含有させたＨａｍ'
ｓＦ１２培地〔組成(mg/L)：l-Alanin(8.9)、l-Arginin
e（HCl:211）、l-Asparagine(13.2)、l-Asparatic acid
(13.3)、l-Cysteine（HCl:31.5）、l-Glutamic acid(1
4.7)、l-Glutamine(146)、Glycine(7.5)、l-Histidine
（HCl:19）、l-Isoleucine(3.9)、l-leucine(13.1)、l-
Lysine(HCl:36.5)、l-Methionine(4.5)、l-Phenylalani
n(5.0)、Proline(34.5)、l-Serine(10.5)、l-Threonine
(11.9)、l-Tryptophane(2.0)、l-Tyrosine(5.4)、l-Val
ine(11.7)、Biotine(0.0073)、Choline(Cl:14.0)、Vita
minB12(1.36)、葉酸(1.32)、Inositol(18.0)、Nicotina
mide(0.037)、パントテン酸(Ca:0.477)、VitaminB6(HC
l:0.062)、VitaminB2(0.038)、VitaminB1(HCl:0.337)、
CaCl2(2H2O:44.0)、CuSO4・5H2O(0.0025)、FeSO4・7H2O
(0.834)、KCl(224.0)、MgCl2(6H2O:122)、”Proc.Natl.
Acad.Sci.USA、53、288(1965)”以下同様である〕が入
った100mm dishに移し、ハサミで裁断した。この裁断物
を含む培地を３７℃で３５分間浸透を行った（６０rp
m）。浸透後、このコラゲナーゼ反応物中に塊状のもの
が見えなくなるまでピペッティングを行い、これを５０
ml遠沈管に移し、ＤＮase（10000unit)を含有させたＨ
ａｍ'ｓ Ｆ１２培地を添加し、５分間放置した。
【００３７】放置後、得られた懸濁液をさらにピペッテ
ィングした後、ナイロンメッシュ（Nytex 157 mesh)で
濾過し、これを５０ml遠沈管に移した。懸濁液を半量ず
つに分け、それぞれについてＰＢＳ（−）を容量が３０
mlになるまで懸濁液を希釈し、次いでこの希釈した懸濁
液に遠心処理を施した（４℃、４００rpm、５分間）。
遠心後、上清を除いて脂肪分を系から除去した。次い
で、残渣にＰＢＳ（−）を２５ml添加して懸濁後、これ
にさらに遠心処理を施した〔（４℃、４００rpm、５分
間）×３回〕。この遠心操作により得られた残渣が、ラ
ットの背部皮膚における毛包である。
【００３８】（２）毛包上皮系細胞の採取 上記操作により得られた毛包に、０．２５％トリプシン
含有ＰＢＳ（−）を５ml添加して、細胞懸濁液を３７℃
で５分間インキュベートした。インキュベート終了後、
５mlの等量の牛胎児血清（ＦＢＳ）とＨａｍ'ｓ Ｆ１２
培地を添加して、細胞懸濁液をセルストレーナー（100
μm Nalgene 社製）で濾過後、５０ml遠沈管に入れて、
この細胞懸濁液に遠心処理を施した（４℃、１５００rp
m、５分間）。この系から上清を除去して、残渣として
所望する毛包上皮系細胞を得た。
【００３９】この毛包上皮系細胞に細胞凍結液（セルバ
ンカー：ダイヤトロン製）を添加し、１．５×１０7cel
l/mlの濃度に調整して、各凍結チューブに１．５×１０
7cellずつ入れ、これを凍結保存した。なお、これらの
細胞数は、血球算定板で算出した。
【００４０】２．毛包上皮系細胞の前培養 系に混入している線維芽細胞を可能な限り系から除去す
るために、上記工程により得られた毛包上皮系細胞の前
培養を行った。以下、その手順について説明する。３７
℃の恒温槽で、上記工程により得た凍結細胞を融解し
た。次いでＦＡＤ培地〔Ｈａｍ'ｓ Ｆ１２培地（後述）
とＭＥＮ培地を容量比で３対１で混合したものに、イン
シュリン(5.0μg/ml）、ハイドロコルチゾン（0.45μg/
ml）、エピダーマルグロウスファクター(EGF)(10.0ng/m
l)、コレラトキシン(10-9Ｍ）及びウシ胎児血清(10％)
を含有させた培地、以下同様である〕を１０ml添加し、
細胞溶液を希釈して系に遠心処理を施した（１０℃以
下、１５００rpm、５分間）。遠心後、上清を除去し、
系にＦＡＤ培地を１０ml添加して、細胞塊が認められな
くなるまでピペッティングを繰り返した。
【００４１】得られた細胞数を血球算定板で算出し、Ｆ
ＡＤ培地で２．５×１０5cell/mlの濃度になるように調
整した。Ｉ型コラーゲンでコーティングした７５cm3の
フラスコに細胞を播種して、これを３７℃、５％ＣＯ2
で一晩培養した。
【００４２】培養後、系をＰＢＳ（−）１０mlで２回洗
浄し、０．２５％トリプシン含有ＰＢＳ（−）を２ml添
加して、これを３７℃、５％ＣＯ2で４分間インキュベ
ートした。次に、系に牛胎児血清（ＦＢＳ）を２ml添加
して、１回軽くゆすった後で上清を除去して、系に混入
している線維芽細胞を除去した。
【００４３】さらに、系にＫＧＭ培地〔表皮角化細胞基
礎培地(Keratinocyto growth medium)：Keratinocyto b
asal medium ｛ＫＢＭ培地（改変ＭＣＤＢ１５３培地：
クローネティックス社製）｝に、ウシ脳下垂体エキス(B
PE)(0.4vol％)、インシュリン(0.5μm/ml)、ハイドロコ
ルチゾン(0.5μm/ml)、h-EGF(0.1ng/ml)を添加した培
地。以下同様である〕を１５ml添加し、３７℃、５％Ｃ
Ｏ2で３日間培養した。
【００４４】３．対象物質のアッセイ 上記工程により得た毛包上皮系細胞を播種した培養フラ
スコの線維芽細胞混入率（ＦＢ混入率）を測定（３００
０倍、５視野）し、その結果ＦＢ混入率が３％以上のも
のは、アッセイの対象から除外した。
【００４５】系をＰＢＳ（−）１０mlで２回洗浄し、
０．２５％トリプシン含有ＰＢＳ（−）を２ml添加し
て、これを３７℃で３分間インキュベートした。次いで
上皮系細胞と線維芽細胞とのトリプシンに対する反応性
の違いを利用して、系から線維芽細胞を除去するため
に、トリプシンを除去し、再び０．２５％トリプシン含
有ＰＢＳ（−）を２ml添加して、３７℃、２０rpmで５
分間振盪した。
【００４６】次いで、細胞のはがれを顕微鏡下で確認し
た後、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を１０ml添加し
て、５０ml遠心チューブ中でピペッティングを行い、系
を１５００rpmで５分間遠心処理を施した。上清を除去
し、ＫＧＭ培地２０mlを添加して、細胞塊がなくなるま
でピペッティングを行った。
【００４７】懸濁液をセルストレーナー（100μm Nalge
ne社製）で濾過後、５０ml遠沈管に入れて、懸濁液中の
生細胞数を血球算定板で算出し、系にＫＧＭ培地を添加
して、系の中の細胞濃度が５．０×１０4cell/mlになる
ように調整した。次いで、０．２ml/wellの割合で、９
６well-plate（Ｉ型コラーゲンコーティングプレート：
ファルコン社製）に播種し（１．０×１０4cell/wel
l）、細胞がウエルの底に沈むまで約２０分間室温下で
放置した。その後、３７℃、５％ＣＯ2で１日間培養を
行い、所望するラット毛包上皮系培養細胞を得た。
【００４８】Ｃ．試験培地の調製 （１）対象物質添加培地の調製 タウリンを約１．５mg秤量し、ＫＢＭ培地で１％溶液に
なるように調製し、０．４５μｍフィルターで濾過滅菌
した。次いで、ＫＢＭ培地に、上記の溶液を１００００
倍量添加した〔対象物質濃度：１．０×１０-5％〕。
【００４９】（２）コントロール培地の調製 ＫＢＭ培地をネガティブコントロールとして用いた。ポ
ジティブコントロールとして、ネガティブコントロール
のＫＢＭ培地に、細胞増殖因子のインシュリン（５mg/m
l）を２μl、ハイドロコーチゾン（０．５mg/ml）を２
μl添加した培地を用いた。
【００５０】Ｄ．対象物質培地交換 上記Ａ、Ｂにおいてヒト毛包上皮系培養細胞及びラット
毛包上皮系培養細胞を調製した９６well-plate中のＫＧ
Ｍ培地を、対象物質添加培地及びコントロール培地（２
００μl/well）と交換して、交換後３７℃、５％ＣＯ2
で２日間培養した。なおこの培地の交換は、ウエル内の
ＫＧＭ培地を、底面に付着している細胞を傷つけないよ
うに留意しつつアスピレーターで抜いて、その後速やか
に対象物質添加培地等をウエルの両端から添加すること
により行った。
【００５１】Ｅ．細胞増殖の測定 アラマーブルー(alamar blue：アラマーバイオサイエン
ス社製)を培地量（容量）に対して１／１０量を添加し
て、３７℃（５％ＣＯ2）で６時間インキュベートし
た。インキュベート後、系の５９５nm及び５７０nmでの
吸光度をマイクロプレートリーダー（Micro plate read
er:Bio RAD社製)を用いて測定し、下記計算式に従っ
て、細胞増殖度を算出した。
【００５２】
【数１】（対象試料の細胞増殖度）＝（対象試料のアラ
マブルー還元率）／（ネガティブコントロールのアラマ
ブルー還元率）×１００（％）
【００５３】さらに、下記計算式に従って、タウリンの
毛包上皮系細胞増殖促進作用を判定した。
【００５４】
【数２】（対象試料の細胞増殖促進指標）＝（（対象試
料の細胞増殖度）―（ネガティブコントロールのアラマ
ブルー還元率））／（（ポジティブコントロールのアラ
マブルー還元率）−（ネガティブコントロールのアラマ
ブルー還元率））
【００５５】「結果」細胞増殖促進作用は、ネガティブ
コントロールが０、ポジティブコントロールが１に対し
て、タウリンはヒト由来毛包上皮系培養細胞に対して
０．８及びラット由来毛包上皮系培養細胞に対しても
０．８であった。この結果より、毛包上皮系培養細胞の
増殖活性が明らかに認められることが判明した。すなわ
ち、タウリンには、毛髪成長期延長活性が認められるこ
とが明らかになった。
【００５６】「実施例２」タウリンの不死化外毛根鞘細
胞増殖作用を評価した。始めに、不死化外毛根鞘細胞増
殖試験について説明する。
【００５７】＜不死化外毛根鞘細胞増殖試験＞ 「不死化外毛根鞘細胞の培養」ヒト頭皮より実体顕微鏡
下において毛包をハサミで単離する。皮脂腺下部で毛包
を切り離しコラゲナーゼ及びディスパーゼで酵素処理を
行う。毛球部をハサミで切り離し除き、毛幹をピンセッ
トで分離する。毛幹をトリプシンで酵素処理し、トリプ
シンインヒビターで反応を停止する。遠心して、上清を
すて、外毛根鞘細胞を回収する。コラーゲンコートした
培養フラスコに回収した細胞をKeratinocyte growth me
dium（KGM）培地で播種し、CO2インキュベーター中で培
養する。
【００５８】ウイルス及び導入遺伝子 アデノウイルスベクターである≡Ｅｌ／ＸのＥｌＡ領域
を、複製開始点を欠失させたＳＶ４０のＬａｒｇｅ Ｔ
抗原遺伝子に置換したウイルス（Doren and Gluzman, 1
984; Mol. Cell. Biol. 4, 1653-1656）を用いた。
【００５９】Ｔ抗原遺伝子の導入 細胞のクローニングコンフレントの約５０％まで培養し
た継代１代目の培養外毛根鞘細胞をＫ−ＳＦＭで洗浄し
た後に、これに１，１０又は３０ＭＯＩ（multiplicity
of infection)の量で上記ウイルスを添加して感染させ
た。以後、通常の細胞と同様に継代培養を続け、通常の
細胞の増殖が止まってしまう継代数まで達した後にクロ
ーニングを行った。クローニングにおいては、細胞を直
径１０cmシャーレあたり１０3 〜１０4 個だけ播種し直
し、増殖がよく、細胞形態が通常細胞と変わらないもの
をピペットマンのチップを用いてピックアップし、これ
を２４ウェルプレートに移して培養し、この時点でも増
殖が良い細胞を選択した。なお、選択された細胞株も通
常の細胞と同様に継代培養を続けた。
【００６０】その結果、ウイルスを感染させなかった外
毛根鞘細胞は継代５代くらいで増殖を停止してしまっ
た。Ｔ抗原導入毛乳頭細胞は、クローニング後継代７代
ほどで見かけ上増殖が停止してしまったように見えた
が、さらに培養を継続すると、見かけ上再び増殖を開始
したように見えた。おそらく継代７代でクライシスを迎
え、ここで何らかの変異が起こり、不死化細胞となった
ものと予想された。クローニングの際、いくつかのクロ
ーンを選出したものの、クライシスの時期を越えて増殖
を続ける細胞株１クローンを得た。
【００６１】細胞増殖評価 外毛根鞘細胞はPBS(-)で2回洗浄する。トリプシンで酵
素処理を行い、細胞を剥がす。トリプシンインヒビター
で反応を停止し、遠心して上清をすて、外毛根鞘細胞を
回収する。KGM培地を加え細胞浮遊液を調製する。コラ
ーゲンコートした24穴培養プレートに細胞を播種し、CO
2インキュベーター中で培養する。翌日、被検物質を添
加した培地に交換する。4日培養後、細胞をPBS(-)で洗
浄し、trypsinで細胞を剥がす。この状態でプレートご
と細胞を冷凍する。
【００６２】被検物質の調製 被検物質のタウリンは、Keratinocyte basal medium
（KBM）培地で５０ｍMに調製し、濾過滅菌をおこなっ
た。これを原液としてKBM培地で希釈し、被検物質濃度
が１０ｎＭ、1μM、１００μM、１０ｍＭになるよう調
製した。ネガティブコントロールはKBM培地のみとし
た。
【００６３】細胞ＤＮＡ測定 細胞を解凍後、Hoechst33258を各穴に加え、ソニケーシ
ョンをかけ細胞を破砕する。これをキュベットに移し、
励起波長356nm、蛍光波長460nmで蛍光強度を測定する。
ネガティブコントロールの蛍光強度を１００として、Ｄ
ＮＡ量の相対値を計算し細胞増殖度算出した。
【００６４】図１に結果を示す。この結果より、タウリ
ンには、不死化外毛根鞘細胞活性作用があることが分か
った。
【００６５】次に、毛髪成長期延長作用に基づくその育
毛効果を検討する。
【００６６】〔実施例３〕 液状毛髪成長期延長剤 タウリン０．８％を、７０％エタノール９０％、オレイ
ン酸ナトリウム０．０５％、ドデシルベンゼンスルホン
酸０．４９％、硬化ヒマシ油エチレンオキシド（４０モ
ル）付加物０．５％及びイオン交換水（残余）と混合攪
拌して溶解させた。さらにイオン交換水（１０％）を添
加混合して、液状の毛髪成長期延長剤を得た。この液状
の育毛料の処方において、タウリンを除去して調整した
液状の剤を対照として調整した（比較例１）。
【００６７】〔実施例４〕 乳液状毛髪成長期延長剤 以下の処方の乳液状毛髪成長期延長剤を作成した。 配合成分 配合量（質量％） （Ａ相） タウリン ０．０５ ポリオキシエチレン（６０モル）付加硬化ヒマシ油 ２．０ グリセリン １０．０ ジプロピレングリコール １０．０ １，３−ブチレングリコール ５．０ ポリエチレングリコール１５００ ５．０ （Ｂ相） セチルイソオクタネート １０．０ スクワラン ５．０ ワセリン ２．０ プロピルパラベン ２．０ （Ｃ相） カルボキシビニルポリマー１％水溶液 ３０．０ ヘキサメタリン酸ソーダ ０．０３ イオン交換水 ９．３ （Ｄ相） イオン交換水 ４．５ （Ｅ相） ＫＯＨ ０．１２ イオン交換水 ５．０ ＜製造法＞Ａ相、Ｂ相をそれぞれ６０℃で加熱溶解し、
混合してホモミキサー処理しゲルを作る。これにＤ相を
徐々に添加しホモミキサーで分散した。次にこれに溶解
したＣ相を加え、最後に溶解したＥ相を添加し、ホモミ
キサーで乳化してＯ／Ｗ乳液型の毛髪成長期延長剤を調
製した。
【００６８】 〔実施例５〕 クリーム状毛髪成長期延長剤 配合成分 配合量（質量％） （Ａ相） 流動パラフィン ５．０ セトステアリルアルコール ５．５ グリセリルモノステアレート ３．０ ＥＯ（２０モル）−２−オクチルドデシルエーテル ８．０ プロピルパラベン ０．３ 香料 ０．１ （Ｂ相） タウリン ５．０ グリセリン ８．０ ジプロピレングリコール ２０．０ ポリエチレングリコール４０００ ５．０ ドデシル硫酸ナトリウム ０．１ ヘキサメタリン酸ソーダ ０．００５ イオン交換水 ３９．９９５ ＜製造法＞Ａ相、Ｂ相をそれぞれ加熱溶解し混合し、ホ
モミキサーで乳化して、クリーム状の毛髪成長期延長剤
を得た。
【００６９】「毛髪成長期延長剤の育毛作用の検討」上
記で得られた毛髪成長期延長剤の脱毛防止、発毛効果等
の育毛作用を調べるために、以下の方法でヒトに対して
トリコグラム試験及び実使用テストを実施した。被験試
料及び対照試料は、実施例３〜５の本発明の毛髪成長期
延長剤、７０％エタノール、比較例１である。
【００７０】試験方法 上記試料の使用前と使用後の抜去毛髪の毛根を顕微鏡下
で観察し、毛根の形態から、成長の止まった毛の毛根で
ある「休止期毛根」数を計数し、その割合の増減によっ
てこれらの試料の育毛作用を比較した。すなわち、被験
試料及び対照試料をそれぞれ男性被験者１０名の頭皮に
１日２回、１回２mlずつ６カ月間連続して塗布し、塗布
直前及び６カ月間塗布終了直後に、被験者１名につき１
００本ずつ毛髪を抜去し、それぞれの毛根を顕微鏡下で
観察した。試験の結果を、下記「表１」に示す。
【００７１】
【表１】
【００７２】この結果から、本発明の毛髪成長期延長剤
には毛髪成長期延長効果に基づく育毛効果が認められ
た。
【００７３】「はりとこしを毛髪に付与する効果」タウ
リンを必須成分とする本発明は、毛髪にはりとこしを付
与する効果を有し、毛髪はり・こし改善剤として利用で
きる。始めに試験方法について説明する。
【００７４】試験試料 毛髪は、パーマネントウェーブ、ヘアカラー、ブリーチ
等の化学的処理履歴のない１９才女性の毛髪を使用し
た。毛先部約２０ｃｍを、所定のシャンプー液に１時間
浸漬した後、流水中に１分間洗浄し、通常環境下で２４
時間以上乾燥したものを、健常毛試料とした。上記健常
毛を所定のブリーチ剤を用いて、室温にて３０分ブリー
チ処理を行い、その後流水中で１分間洗浄した。ブリー
チ処理を４回繰り返し、洗浄後通常環境下で乾燥したも
のをブリーチ処理毛（ＢＬ処理）とした。
【００７５】タウリン処理 １ｍｏｌ／ｌのタウリン水溶液２０ｍｌに毛髪１本を一
晩浸漬し、２５℃・５０％ＲＨ環境下にて試験試料の毛
髪を乾燥させた。
【００７６】ねじりトルクの測定 カトーテック社製ねじり試験機ＫＥＳ−ＹＮ−１を用い
て、２５℃・５０％ＲＨ環境下にて測定を行った。測定
は、タウリン水溶液による処理前に測定を行い、それを
コントロールとした。ねじり角度は±１０８０°、１８
°／ｓｅｃ．の速度にてねじりを与えた。ねじり角θ＝
３６０°〜７２０°における、ねじり角θに対するねじ
りトルクＴｆの増加分であるＢ＝ｔａｎ（Ｔｆ／θ）
を、ねじり剛性Ｂ値とし、タウリン水溶液による処理前
後でのＢ値の比で評価した。結果を図２に示した。
【００７７】この結果より、タウリン処理した毛髪は、
ねじりトルクが増加しており、毛髪にはりとこしを付与
していることが分かる。
【００７８】本発明の薬剤を配合した好ましい製品の処
方例を示す。タウリンを配合した以下のシャンプー、リ
ンスは、泡もち、泡質に優れた毛髪洗浄料であり、髪が
生える前の細胞レベルから毛髪を元気にし、生えた髪そ
のものにはりとこしを与え生まれたてのような元気な髪
にする効果を期待できる育毛毛髪洗浄料である。
【００７９】 〔処方例１〕シャンプーの処方 配合成分 配合量（質量％） タウリン ８．０ ポリオキシエチレンアルキルアンモニウム １５．０ アミドプロピルジメチル酢酸 ３．０ ヤシ油脂肪酸モノエタノールアミド １．６ ジステアリン酸エチレングリコール ０．６ ジメチルシリコン(5000ｃs)エマルジョン ４０％液 １．８ 安息香酸ナトリウム ０．２ カチオン化セルロース ０．３ イオン交換水 ６９．５
【００８０】 〔処方例２〕リンスの処方 配合成分 配合量（質量％） タウリン ０．６ エキセコールＤ−５ ３．４ ジメチルシリコン ０．５ ステアリルアルコール ７．５ ステアリン酸ジメチルアミノプロピルアミド ２．５ イオン交換水 ８５．５
【００８１】 〔処方例３〕シャンプーの処方 配合成分 配合量（質量％） タウリン ３ Ｎ−ヤシ脂肪酸−Ｎ−メチルタウリンＮａ塩 １０ ヤシ脂肪酸ジエタノールアマイド ４ ヤシ脂肪酸アミドプロピルベタインＮａ １０ マーコート５５０（約８％水溶液） ５ クエン酸 ０．５ 安息香酸Ｎａ塩 適量 香料 適量 精製水 残部
【００８２】 〔処方例４〕シャンプーの処方 配合成分 配合量（質量％） Ｎ−ヤシ脂肪酸−Ｎ−メチルタウリン タウリン Ｎａ塩 １２ ヤシ脂肪酸アミドプロピルベタインＮａ塩 ５ ラウリン酸プロピレングリコール １．５ カチオン性セルロース ０．３ クエン酸 ０．５ 安息香酸Ｎａ塩 適量 香料 適量 精製水 残部
【００８３】 〔処方例５〕シャンプーの処方 配合成分 配合量（質量％） タウリン ０．３ ポリオキシエチレンラウリルエーテル Ｎａ塩 １０ ヤシ脂肪酸アミドプロピルベタインＮａ塩 ５ ヤシ脂肪酸モノエタノールアマイド ２ カチオン化セルロース ０．５ マーコート５５０（約８％水溶液） ３．０ クエン酸 ０．３ 安息香酸Ｎａ塩 適量 香料 適量 精製水 残部
【００８４】 〔処方例６〕シャンプーの処方 配合成分 配合量（質量％） タウリン ０．５ ポリオキシエチレンラウリルエーテル Ｎａ塩 ８ イミダゾリニウムベタインＮａ塩 ３ ヤシ脂肪酸ジエタノールアマイド ４ カチオン性セルロース ０．３ クエン酸 ０．５ ケーソンＣＧ 適量 香料 適量 精製水 残部
【００８５】 〔処方例７〕リンスの処方 配合成分 配合量（質量％） タウリン ０．１ ジメチルシリコーン ５ ステアリルアルコール ２ 塩化ステアリルトリメチルアンモニウム ０．７ グリセリン ２．０ パラベン 適量 香料 適量 精製水 残部
【００８６】 〔処方例８〕リンスの処方 配合成分 配合量（質量％） タウリン ０．３ ジメチルシリコーン １０ ベヘニルアルコール １．５ ステアリルアルコール １ 塩化ステアリルトリメチルアンモニウム １．０ グリセリン ５．０ パラベン 適量 香料 適量 精製水 残部
【００８７】 〔処方例９〕リンスの処方 配合成分 配合量（質量％） タウリン ０．１ ジメチルシリコーン ５ パラフィン ２ セチルアルコール １．５ ステアリルアルコール ０．３ 塩化ベヘニルトリメチルアンモニウム ０．５ イソプレングリコール ３．０ ケーソンＣＧ 適量 香料 適量 精製水 残部
【００８８】
【発明の効果】本発明によれば、細胞増殖の活発化させ
ることにより、毛髪細胞をコントロールし、毛周期にお
ける成長期を延長し、毛髪細胞の毛包上皮系細胞及び外
毛根鞘細胞の増殖を活性化し、さらに、毛髪にはりとこ
しを与える毛髪関連薬剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図1】外毛根鞘細胞の増殖度を表す図である。
【図２】毛髪のねじりトルクの増加を表す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中間 康成 神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地 株 式会社資生堂第一リサーチセンター内 (72)発明者 高橋 唯仁 神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地 株 式会社資生堂第一リサーチセンター内 Ｆターム(参考） 4C083 AC022 AC072 AC112 AC122 AC302 AC312 AC392 AC482 AC642 AC692 AC712 AC791 AC792 AD132 AD152 CC37 CC38 CC39 EE22 4C206 AA01 AA02 JA08 MA36 MA42 MA83 ZA92

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 タウリンを有効成分とする細胞賦活剤。
  2. 【請求項２】 タウリンを有効成分とする毛髪細胞コン
    トロール剤。
  3. 【請求項３】 タウリンを有効成分とする毛髪成長期延
    長剤。
  4. 【請求項４】 タウリンを有効成分とする毛髪細胞増殖
    活性剤。
  5. 【請求項５】 タウリンを有効成分とする毛包上皮系細
    胞増殖活性剤。
  6. 【請求項６】 タウリンを有効成分とする外毛根鞘細胞
    増殖活性剤。
  7. 【請求項７】 タウリンを有効成分とする毛髪はり・こ
    し改善剤。
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