JPH11124317A - 頭部用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 優れた脱毛防止効果、発毛促進効果等の養毛
作用及びフケ、痒み抑制作用を有するとともに、毛乳頭
細胞あるいは毛包上皮系細胞を活性化することによっ
て、毛髪伸長の促進をする頭部用組成物を提供する。 【解決手段】 クロトンバーマニカス（学名：Croton b
irmanicus Muell. Arg.）のようなトウダイグサ科（Eup
horbiaceae）ハズ属（Croton）植物の抽出物を配合す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、植物、特に特定の
生薬として用いられている植物からの抽出物のヒトの頭
部用組成物への使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】高齢化社会、ストレス社会といわれる現
代社会では、頭部毛髪が様々な原因により脱毛の危機に
さらされる機会がますます多くなってきている。

【０００３】これに対応して、より優れた「養毛料」を
提供すべく様々な試みがなされている。

【０００４】養毛料が毛髪に与える効果の主なものとし
ては、発毛誘導効果（発毛促進効果、成長期誘導効
果）、毛髪を太くする効果、毛髪成長期延長効果、５ａ
−レダクターゼ阻害効果、血行促進効果、殺菌効果、フ
ケ防止効果、保温効果、抗酸化効果等の効果を挙げるこ
とができる。このような効果を有する物質のスクリーニ
ング方法としては、一般的に、脱毛防止、発毛促進効果
あるいはふけもしくは痒み抑制作用が指標とされてき
た。

【０００５】しかしながら、前記のように種々の試みが
なされているにもかかわらず、従来の養毛料では、その
脱毛防止、発毛効果等の養毛作用は必ずしも十分なもの
ではなかった。これはおそらく脱毛の原因がさまざまで
あり、また発毛の機構も非常に複雑であるためと考えら
れている。従って、毛髪のより具体的な構造それ自体に
着目して養毛料を創出することはより有望な手段であ
り、こうして開発される有効成分の提供が望まれるであ
ろう。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の目的
は、総合的な脱毛防止、発毛促進効果、ならびにふけ、
痒みの抑制作用を有することはもとより、さらに毛髪の
より具体的な構造（または構成）、特に毛乳頭細胞や毛
包上皮系細胞、に直接作用しうる頭部用組成物を提供す
ることにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、まず、上
記目的を達成しうる有効成分のスクリーニング系または
評価試験系を樹立するべく検討してきた。その結果、詳
細については後述する、ヒト由来の培養毛乳頭細胞を用
いた細胞増殖試験またはヒト由来の培養毛包上皮系細胞
の活性化試験に被検物質を供したとき、良好な結果をも
たらすものは、それぞれ毛乳頭（または毛乳頭細胞）を
活性化しうるかまたは毛周期における毛髪成長期を延長
しうる効果を有するだけでなく、有意に優れた発毛促進
効果および育毛効果等を有しうることを見い出した。

【０００８】そして、上記両試験に各種植物抽出物をか
けてきたところ、トウダイグサ科（Euphorbiaceae）ハ
ズ属（Croton）に属する植物からの抽出物が、優れた効
果を有し、かつ優れた脱毛防止効果、発毛促進効果等の
養毛作用及びフケ、痒み抑制作用を示すことを見い出し
た。

【０００９】したがって、本発明によれば、トウダイグ
サ科（Euphorbiaceae）ハズ属（Croton）に属する植物
からの抽出物を有効成分として含有する頭部用組成物が
提供される。より具体的な態様としては、ヒトの毛髪の
養毛に有効量のトウダイグサ科（Euphorbiaceae）ハズ
属（Croton）に属する植物からの抽出物及び化粧用また
は皮膚科学的に許容できる他の添加剤を含んでなる養毛
用組成物が提供される。

【００１０】また、別の態様の本発明として、養毛用組
成物の有効成分として使用するための前記抽出物、ある
いは前記抽出物を用いる養毛方法も提供される。

【００１１】また、さらなる別の態様の本発明として、
前記抽出物を有効成分として含んでなる毛乳頭細胞を活
性化し、そして／または毛周期における毛髪成長期を延
長するための組成物も提供される。

【００１２】

【発明の具体的な態様】本発明にいう頭部用組成物と
は、ヒトの頭部、より具体的には毛髪および頭皮に使用
できる如何なる形態の組成物をも包含する。かような組
成物は、広く、養毛の目的に使用でき、本明細書におい
て、「養毛」とは、発毛促進、脱毛防止、さらにふけ、
痒み抑制作用等ならびに、乳頭細胞あるいは毛包上皮系
細胞の活性化作用を包含する概念で使用する。

【００１３】理論により拘束されるものでないが、本発
明で使用される有効成分であるトウダイグサ科（Euphor
biaceae）ハズ属（Croton）に属する植物からの抽出物
は、後述するように、ヒト由来の培養毛乳頭細胞を有意
に増殖することから毛乳頭活性化作用を有し、しかもヒ
ト由来の培養毛包上皮系細胞の増殖を維持または促進す
ることから毛周期における毛髪の成長期を延長する作用
をも有する。

【００１４】したがって、毛髪の構造（または構成要
素）それ自体に直接作用をすることにより発毛促進およ
び脱毛防止効果を有し、さらには上記の細胞の増殖に悪
影響を及ぼすことなく効能を示すことから、ふけ、痒み
抑制作用をも有する。

【００１５】特にこれらの効果および作用は、トウダイ
グサ科ハズ属に属する植物であるハズ（Croton tiglium
L.）の種子（Tiglii Semen または croton seed）の胚
乳から圧搾して得られるクロトン油（Croton oil）が、
本発明の抽出物に比べて有意に低い発毛および育毛作用
を有するにすぎず、一方、皮膚刺激作用を有することを
考慮すると驚くべきことである。

【００１６】クロトン油は、発がんの二段階説成立の基
礎となった発がんプロモーターとして知られる１２−０
−テトラデカノイル−ホルボール１３−アセテート（以
下、ＴＰＡという）を含むことは周知である。このＴＰ
ＡはＣ３Ｈマウスにおける強い発毛効果を有することが
知られている（“Normal and Abnormal Epidermal Diff
erentiation”、M. Seiji および I. A. Bernstein 編
集、第１５９〜１７０ページ、１９８２年東大出版）も
のの、マウスの耳への局所塗布により強い炎症を誘発し
（P. L. Stanley et al., Skin Pharmacol １９９１；
４：２６２−２７１）、また、Ｂａｌｂ／ｃマウスの皮
膚への塗布により重篤な表皮細胞の変化（例えば表皮肥
厚、角質増殖症等）をもたらす。

【００１７】かような背景を考慮すれば、本発明に従う
抽出物が有意に優れた発毛促進効果および育毛作用を示
す上に、皮膚刺激性を殆ど示さないことは予想外であ
り、本発明者らが樹立した培養毛乳頭細胞および培養毛
包上皮系細胞を使用するスクリーニングまたは評価試験
方法の有用性を意味する。

【００１８】かような本発明で使用する抽出物は、トウ
ダイグサ科（Euphorbiaceae）ハズ属（Croton）の種子
の胚乳からの圧搾油でなく、抽出処理により得られる点
に特徴がある。

【００１９】本発明の抽出物を得ることのできる植物
は、前記ハズ属に属する植物であって、本発明の目的に
沿う抽出物を得ることのできる植物であれば如何なる種
に属するものであってもよい。しかし、好ましいものと
しては、クロトン バーマニカス（Croton birmanicus M
uell. Arg.）を挙げることができる。かような植物は、
東南アジアを中心に分布する植物であり、タイ国ではハ
ッサクーン（HADSAKHYYN）と称されている。

【００２０】本発明に用いられる抽出物は、上記植物の
葉、地下茎を含む茎、根、果実、樹皮等、植物全草を抽
出溶媒に浸漬または抽出溶媒と共に加熱還流した後、濾
過し、濃縮して得られる。かような抽出溶液としては、
通常抽出に用いられる溶媒であれば如何なるものでもよ
く、特に水混和性の有機溶媒、例えばメタノール、エタ
ノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール等の低級ア
ルコールあるいはプロピレングリコール、１,３−ブチ
レングリコール等の多価アルコール、アセトン、および
酢酸エチルエステル等からなる群より選ばれる１種また
は２種以上の混和物を挙げることができる。低級アルコ
ールを使用する場合、得られる抽出液をそのまま用いる
こともできるが、抽出溶媒を留去し、必要により乾燥し
た後、本発明の頭部用組成物に含ませてもよい。

【００２１】また、本発明に従う抽出物は、目的に応じ
て、上記抽出溶媒を使用して得られたものを、さらに疎
水性溶媒（例えば、ｎ−ヘキサン）と水との系で液−液
分配にかけ、水性層から、例えば酢酸エチル等により抽
出し、あるいは抽出せずして、適当な分離用カラムクロ
マトグラフィー処理等により得られる、各段階での処理
物であってもよい。

【００２２】本発明に従う抽出物の頭部用組成物への配
合量は、組成物の形態または使用方法に応じて変動しう
るので特定されるものでない。しかし、後述の実施例に
記載の方法に従って得られる抽出物を使用する場合、組
成物全重量中、一般に抽出物（乾燥物基準）が０.００
０５〜２０.０重量％、好ましくは０.００１〜１０.０
重量％である。０.０００５重量％未満であると、本発
明でいう効果が十分に発揮されず、２０.０重量％を超
えると製剤化が困難であるので好ましくない。また、１
０.０重量％以上配合してもさほど大きな効果の向上は
得られない。

【００２３】本発明の頭部用組成物には、上記必須成分
以外に、化粧用または皮膚科学的に許容される他の添加
剤、あるいは通常化粧品、医薬部外品や医薬品等の頭部
用組成物に用いられる成分、例えば、油性成分、保湿
剤、増粘剤、金属封鎖剤、その他の活性成分、酸化防止
剤、紫外線吸収剤、界面活性剤、アルコール類、粉末成
分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応
じて適宜配合することができる。

【００２４】具体的には、油分として、例えば高級脂肪
酸、固形パラフィン、流動パラフィン、シリコーン油、
スクワラン等；保湿剤として、例えばヒアルロン酸、プ
ロピレングリコール、マルチトール、アテロコラーゲ
ン、乳酸ナトリウム等；増粘剤、マルメロ粘質物、カル
ボキシビニ−ルポリマー、キサンタンガム等；金属封鎖
剤として、例えばエデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナ
トリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウ
ム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸；その他の活性
成分として、例えばカフェイン、タンニン、ベラパミ
ル、トラネキサム酸およびその誘導体、甘草抽出物、グ
ラブリジン、火棘の果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸
トコフェロール、グリチルリチン酸およびその誘導体ま
たはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン
酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチ
ン、コウジ酸等の他の美白剤、グルコース、フルクトー
ス、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類などが
挙げられる。

【００２５】また、養毛料の補助成分として、これらの
製剤を調製する上で上記油性成分、保湿剤、増粘剤に加
えて、その他の活性成分として、例えばモノオレイン酸
グリセリル等の油分、ニコチン酸アミド、ニコチン酸ベ
ンジル、ビタミンＥアセテート、センブリ抽出物、塩化
カルプロニウム、センブリエキス、アセチルコリン誘導
体等の血管拡張剤、セリン、メチオニン等のアミノ酸
類、ビタミンＢ６、ビタミンE 及びその誘導体、ビオチ
ン等のビタミン類、パントテン酸及びその誘導体グリチ
ルレチン酸及びその誘導体、ニコチン酸、ニコチン酸メ
チル、ニコチン酸トコフェロールなどのニコチン酸エス
テル類、セファランチン等の皮膚機能亢進剤、エストラ
ジオ−ル等の女性ホルモン剤等を同時に配合してもよ
い。

【００２６】さらに、通常、養毛料に用いられる添加
剤、例えばヒノキチオ−ル、ヘキサクロロフェン、ベン
ザルコニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリド、
ウンデシレン酸、トリクロロカルバニリドおよびビチオ
ノール等の抗菌剤、メントール等の清涼剤、サリチル
酸、亜鉛およびその誘導体、乳酸およびそのアルキルエ
ステルなどの薬剤、クエン酸等の有機酸類、アルギニン
等のアミノ酸類等が本発明の効果を損なわない範囲で適
宜配合することができる。

【００２７】本発明の頭部用組成物の性状は、例えばト
ニック、ヘアークリーム、ムース、シャンプー、リンス
等の剤型をとることもできる。

【００２８】

【実施例】次に実施例をあげて本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明はこれらにより限定されるものでな
い。なお、配合量は特記しない限り重量％である。

【００２９】まず、発毛効果、育毛効果、培養毛
乳頭細胞を用いた細胞増殖、ヒト培養毛包上皮系細胞
活性化に関する試験方法とその結果について順に説明す
る。 発毛試験 １．抽出物の調製（調製例１） クロトンバーマニカス（乾燥物）５００ｇを、５.０リ
ットルのメタノールに室温で５日間浸漬した。抽出液か
ら溶媒を留去し、次いで乾燥してクロトンバーマニカス
のメタノールエキス乾燥物１５.２ｇを得た。

【００３０】２．試料の調製 上記で得られたメタノールエキス乾燥物０.５％、１
％、２％を、それぞれ７５％エタノール溶液に溶解して
試料１〜３を得た。

【００３１】３．発毛試験方法及びその結果 対照試料として０.１％クロトン油の７５％エタール溶
液を用い、本発明の液状の試料１〜３について下記の発
毛試験を行った。

【００３２】実験動物として毛周期の休止期にあるＣ３
Ｈ／ＨｅＮＣｒＪマウスを使用し、小川らの方法“Norm
al and Abnormal Epidermal Differentiation”、M ．S
eijiおよび I ．A ．Bernstein 編集、第１５９〜１７
０ページ、１９８２年、東大出版）により行なった。

【００３３】すなわち、マウスを１群１０匹とし、それ
ぞれ被検試料１〜３と対照試料用の４群に分け、バリカ
ンおよびシェ−バーでマウスの背部を剃毛し、それぞれ
の試料を１日１回、０.１ｍｌずつ塗布した。１８日、
２４日後に毛の再生面積を測定した。結果は再生面積の
平均値で表した。その結果を表１に示す。

【００３４】 表１ ─────────────────────────────────── 試 料 毛再生面積（％） １８日後 ２４日後 ─────────────────────────────────── 試料１（クロトンバーマニカス抽出物 0.5％） ７６ ９６ 試料２（クロトンバーマニカス抽出物 １％） ８７ １００ 試料３（クロトンバーマニカス抽出物 ２％） ９２ １００ 対照試料 ３７ ６６ ─────────────────────────────────── 表１より、本発明のクロトンバーマニカス抽出物は、マ
ウスの発毛試験において優れた発毛効果を示した。

【００３５】２．その他の調製例 調製例１と同様にして得られたメタノール抽出物２９
９.２ｇ（乾燥重量）をｎ−ヘキサン（６ ｌ）と水（３
ｌ）との間で液−液分配を行い、ｎ−ヘキサン層から
乾固物５１.８３ｇと水層を得た。この水層を酢酸エチ
ル（１０ ｌ）との間で液−液分配を行い酢酸エチル層
から乾固物５２.７ｇを得た（以下、酢酸エチル画分と
いう）。

【００３６】この酢酸エチル画分をシリカゲルカラム
（充填剤：ワコーゲルＣ−２００：１ｋｇ、溶離液：ク
ロロホルム：メタノール＝５０：１→３０：１→２０：
１→９：１→２：１）で分画し、Ｃ３Ｈマウス発毛効果
が認められた画分をさらにＯＤＳゲルカラムクロマトグ
ラフィー（ＯＤＳゲル：３００ｇ、溶離液：７０％メタ
ノール→９０％メタノール→１００％メタノール）によ
り分画し、Ｃ３Ｈマウス発毛効果が認められた中期流出
画分から乾固物１.１０ｇを得た。これをシリカゲルカ
ラム（充填剤：ワコーゲルＣ−２００：１７０ｇ、溶離
液：クロロホルム：メタノール＝２０：１→１０：１→
５：１→２：１→１：１→０：１）に分画した。初期流
出画分から約２／５溶出画分より乾固物５２０ｍｇ（以
下、フラクションＡ）と３／５溶出画分より乾固物５３
０ｍｇ（以下、フラクションＢ）を得た。

【００３７】上記で得られたフラクションＡ、フラクシ
ョンＢおよび４α−ＴＰＡ（比較）について、以下の条
件でＨＰＬＣを実施したときの、各成分の溶出パターン
を、図１に対比して示す。

【００３８】ＨＰＬＣ条件：移動相 ０〜５０分：８０％アセトニトリル ５０〜６０分：８０→１００％アセトニトリル ６０〜８０分：１００％アセトニトリルカラム Capcell Pak Ｃ１８ ＵＧ１２０Å検出 ＵＶ ２３８ｎｍ これらの試料を上記の発毛試験及びＣ３Ｈ／ＨｅＮＣｒ
Ｊマウスの背部を剃毛した試料塗布部位の皮膚について
刺激を観察した。この刺激とは落屑および表皮の肥厚を
意味し、著しくこれらが観察される場合を＋＋、ある程
度観察される場合を＋、そして全く観察されない場合を
−と表示する。

【００３９】また、発毛効果は、毛再生面積が試験開始
から１８日後に８０％以上かつ１００％以下を＋＋＋、
６０％以上かつ８０％未満を＋＋、４０％以上かつ６０
％未満を＋として表示する。

【００４０】以上の試験の結果を下記表２に示す（試料
濃度は７５％エタノールで調整）。

【００４１】 表２ ──────────────────────────── 試 料 発毛効果 刺 激 ──────────────────────────── 調製例１の抽出物 ０.５％ ＋＋ − 酢酸エチル画分 ０.５％ ＋＋＋ − フラクションＡ ０.１％ ＋＋＋ − フラクションＢ ０.１％ ＋＋＋ − ＴＰＡ ６ｐｐｍ ＋＋＋ ＋＋ ＴＰＡ ０.６ｐｐｍ ＋＋＋ ＋＋ クロトン油 ０.１％ ＋ ＋ ──────────────────────────── 上記文献に記載されているように、ＴＰＡは顕著な皮膚
刺激性を示すことがわかる。

【００４２】育毛試験（トリコグラム試験） １．抽出物の調製 上記発毛試験例で調製した調製例１の方法で抽出物を調
製した。

【００４３】２．試料の調製 上記方法で得られたメタノールエキス乾燥物 ０.５、１
および２％を、７０％エタノール溶液（９０％）、オレ
イン酸ナトリウム（０.０１％）、ドデシルベンゼンス
ルホン酸（０.４９％）、硬化ヒマシ油エチレンオキシ
ド（４０モル）付加物（０.５％）及びイオン交換水
（８％）と混合撹拌して溶解させた。さらにイオン交換
水（残余）を添加混合して、液状の試料４、５および６
を得た。

【００４４】３．育毛試験方法及びその結果 本発明の頭部用組成物の脱毛防止、発毛効果等の養毛作
用を調べるために、ヒトに対して、以下の方法でトリコ
グラム試験を実施した。

【００４５】試料の使用前と使用後の抜去毛髪の毛根を
顕徴鏡下で観察し、毛根の形態から休止期毛根数を計数
し、その割合の増減によって養毛作用を比較した。尚、
休止期毛根とは成長の止まった毛の毛根であり、脱毛を
訴える人は正常な人よりもこの休止期毛根の割合が多い
ことが認められている。

【００４６】被験試料及び対照試料の各試料をそれぞれ
男性被験者１０名の頭皮に１日２回、１回２ｍｌずつ６
ケ月間連続して塗布し、塗布直前および６ケ月間塗布終
了直後に被験者１名につき１００本ずつ毛髪を抜去し、
それぞれの毛根を調ベ、実使用テストを行った。結果を
表２に示す。

【００４７】 表３ ─────────────────────────────────── 試 料 休止期毛根の割合 養毛効果 ─────────────────── の評価 20％以上減少 ±20％ 20％以上増加 ─────────────────────────────────── 試料４(0.5％） ５９ ３３ １０ 有効 試料５( １％） ７２ ３２ １ 著効 試料６( ２％） ８０ ２０ ０ 著効 対照試料 ９ ３１ ５９ 無効 ─────────────────────────────────── 表３より明らかなように、本発明のクロトンバーマニカ
ス抽出物は、ヒトのトリコグラム試験において有意な育
毛効果を示した。

【００４８】培養毛乳頭細胞を用いた細胞増殖試験 １．抽出物の調製 上記抽出物の調製は、上記発毛試験例で調製した調製例
１の方法で抽出物を調製した。さらに、メタノールエキ
ス乾燥物をＤＭＳＯで０.２重量％の溶液に調製して、
これを無血清培地（ＭＥＭ）に希釈してクロトンバーマ
ニカス抽出物をそれぞれ１.０×１０^-9〜１.０×１０^-6
％を含む溶液を調製した（調製例２〜５）。

【００４９】２．毛乳頭細胞の採取 整形外科手術によって摘出された３２歳男性の後頭部皮
膚（５ｍｍ×１.５ｃｍ）から、脂肪組織を分離して、
そこから毛包を摘出し、毛球部より毛乳頭細胞を単離し
た。単離した毛乳頭細胞を２０％ＦＢＳを含むＭＥＭで
２週間培養した〔３７℃，５％ＣＯ₂〕。毛乳頭細胞か
ら細胞のアウトグロースが確認された時点で、培地を１
０％ＦＢＳを含むＭＥＭ（ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）に交
換して同様の条件で培養した。以降、１週間に２回の割
合で培養液（ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）を交換して細胞を
維持した。

【００５０】培養開始より４週間後に継代培養を行い、
以後細胞が十分増殖した時点で再度継代して、この継代
を繰り返した。

【００５１】３．試験方法 継代数３代目の毛乳頭細胞を用い、ＭＥＭ＋１０％ＦＢ
Ｓ培地で，１００００細胞／ｍｌの細胞密度の細胞懸濁
液を調製した。この細胞懸濁液を２００μｌずつ、９６
ウエルのマイクロプレートに分注し（つまり，２０００
細胞／ウエル）、３７℃，５％ＣＯ₂で３日間インキュ
ベートを行い細胞を付着させた。培養開始７２時間後、
対照は培養液を無血清のＭＥＭに交換した。被検体系は
対象物質であるクロトンバーマニカス抽出物を含む無血
清培地（ＭＥＭ）（調製例２〜５）に交換した（各試料
７〜１０）。

【００５２】対照および被検体系をいずれもさらに４日
間培養した。

【００５３】培養終了後、それぞれの系にアラマーブル
ー（alamar blue)(BIOSOURSE社製)を２０μl 添加後、
さらに８時間培養し、マイクロプレートリーダー（Micr
o plate reader：Bio RAD社製) で５７０ｎｍと５９５
ｎｍの吸光度を測定した。添付の使用説明書に従って、
吸光度の測定結果によりアラマーブルーの還元率を算出
した。この還元率は細胞数と相関することから対照およ
び被検体系での細胞増殖率を比較した。

【００５４】４．結果：測定したクロトンバーマニカス
抽出物（試料７〜１０）における、上記細胞増殖促進指
標を下記第４表に示す。

【００５５】 表４ ────────────────────────────────── 試 料 増殖促進率（％） 効果 ────────────────────────────────── 試料７ （１.０×１０^-9％） ４.６±３.７* あり 試料８ （１.０×１０^-8％） １８.７±６.０** あり 試料９ （１.０×１０^-7％） １３.５±５.４** あり 試料１０（１.０×１０^-6％） ６.３±３.２ なし 対照試料 ２.１±３.１ なし ────────────────────────────────── ＊；有意差ｐ＜０.０５ ＊＊；有意差ｐ＜０.０１ 表４より明らかなように、本発明のクロトンバーマニカ
ス抽出物は、培養毛乳頭細胞活性化試験において有意な
毛乳頭細胞増殖促進効果を示した。

【００５６】ヒト培養毛包上皮系細胞活性化試験 １．ヒト培養毛包上皮系細胞の採取 外科手術の副産物として得られたヒト男性頭皮から毛周
期における成長期の毛包を実体顕微鏡下で機械的に採取
した。この成長期の毛包を１０００Ｕ／ｍｌ dispase・
０.２％コラゲナーゼを含むダルベッコの改変ＭＥＭ
（ＤＭＥＭ）で３０分間、３７℃で処理し、注射針の先
を用いて dermal sheath や dermal papilla、毛球部上
皮組織を除去して、０.０５％トリプシン・０.０２％Ｅ
ＤＴＡを含むリン酸緩衝液〔ＰＢＳ（−）：（−）とは
カルシウムイオンやマグネシウムイオンを含まない意味
である〕で５分間，３７℃で処理した。

【００５７】次にコラーゲン（Type I）コーティングし
た培養皿に毛包を静置し、外殖片培養を行った。なおこ
の際の培地は、無血清培地〔Keratinocyte Growth Medi
um（ＫＧＭ）〕を用いた（Keratinocyte Serum Free Me
dium を用いることもできる）。

【００５８】この培養の４〜５日後に、毛包の培養皿へ
の接着及び細胞の増殖が確認できた時点で培地を交換
し、これ以降２日おきに培地交換を行った。

【００５９】このようにして増殖させた細胞を、０.０
５ｗｔ％トリプシン−０.０２％ＥＤＴＡで３７℃で５
分間処理した後、等量の０.１％トリプシンインヒビタ
ーで反応を停止させ、遠心処理（８００×ｇ，５分間)
を施して細胞を回収した。

【００６０】次に、細胞を上記の無血清培地に浮遊させ
て、５０００ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の密度でコラーゲンコ
ーティング（Type I）した培養皿に播種し、細胞が sub
confluentになるまで２日おきに培地交換を行い、再び
０.０５ｗｔ％トリプシン−０.０２％ＥＤＴＡで３７℃
で５分間処理した後、等量の０.１％トリプシンインヒ
ビターで反応を停止させ、遠心処理（８００×ｇ，５分
間）を施して、これにより得られたヒト毛包上皮系細胞
に細胞凍結液（セルバンカー：ダイヤトロン製）を添加
し、１.０×１０⁶ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度に調整して、各
凍結チューブに１.０×１０⁶ｃｅｌｌずつ入れ、これを
凍結保存した。なお、これらの細胞数は、血球算定板で
算出した。

【００６１】上記工程により得た毛包上皮系細胞の線維
芽細胞混入率（ＦＢ混入率）を測定（３０００倍，５視
野）し、その結果ＦＢ混入率が３％以上のものは、アッ
セイの対象から除外した。

【００６２】そして、この毛包上皮系細胞を培養フラス
コ中に播種後、これを０.０５％トリプシンと０.０２％
ＥＤＴＡで処理した後、０.１％トリプシンインヒビタ
ーで反応を停止後、系を１５００ｒｐｍで５分間遠心処
理を施し、上清を除去し、残渣にＫＧＭ培地２０ｍｌを
添加して、細胞懸濁液を調製した。

【００６３】０.２ｍｌ／ｗｅｌｌの割合で、９６ｗｅ
ｌｌ−ｐｌａｔｅ（Ｉ型コラーゲンコーティングプレー
ト：ファルコン社製）に播種し（１.０×１０⁴ｃｅｌｌ
／ｗｅｌｌ）、細胞がウエルの底に沈むまで約２０分間
室温下で放置した。

【００６４】その後、３７℃，５％ＣＯ₂で１日間培養
を行い、所望するヒト毛包上皮系培養細胞を得た。

【００６５】上記操作により得られた毛包に、０.２５
％トリプシン含有ＰＢＳ（−）を５ｍｌ添加して、細胞
懸濁液を３７℃で５分間インキュベートした。

【００６６】インキュベート終了後、５ｍｌの等量の牛
胎児血清（ＦＢＳ）とＨａｍ'ｓＦ１２培地を添加し
て、細胞懸濁液をセルストレーナー（１００μｍ Nalge
ne社製）で濾過後、５０ｍｌ遠沈管に入れて、この細胞
懸濁液に遠心処理を施した（４℃，１５００ｒｐｍ，５
分間）。この系から上清を除去して、残渣として所望す
る毛包上皮系細胞を得た。

【００６７】２．毛包上皮系細胞の前培養 系に混入している線維芽細胞を可能な限り系から除去す
るために、上記工程により得られた毛包上皮系細胞の前
培養を行った。以下、その手順について説明する。

【００６８】３７℃の恒温槽で、上記工程により得た凍
結細胞を融解した。次いでＦＡＤ培地〔Ｈａｍ'ｓ Ｆ
１２培地（後述）とＭＥＮ培地を容量比で３対１で混合
したものに、インシュリン（５.０μｇ／ｍｌ），ハイ
ドロコルチゾン（０.４５μｇ／ｍｌ），エピダーマル
グロウスファクター（ＥＧＦ）（１０.０ｎｇ／ｍｌ)，
コレラトキシン（１０^-9Ｍ）及びウシ胎児血清（１０
％) を含有させた培地、以下同様である〕を１０ｍｌ添
加し、細胞溶液を希釈して系に遠心処理を施した（１０
℃以下，１５００ｒｐｍ，５分間）。遠心後、上清を除
去し、系にＦＡＤ培地を１０ｍｌ添加して、細胞塊が認
められなくなるまでピペッティングを繰り返した。

【００６９】得られた細胞数を血球算定板で算出し、Ｆ
ＡＤ培地で２．５×１０⁵ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度になる
ように調製した。

【００７０】Ｉ型コラーゲンでコーティングした７５ｃ
ｍ³のフラスコに細胞を播種して、これを３７℃，５％
ＣＯ₂で一晩培養した。

【００７１】培養後、系をＰＢＳ（−）１０ｍｌで２回
洗浄し、０.２５％トリプシン含有ＰＢＳ（−）を２ｍ
ｌ添加して、これを３７℃，５％ＣＯ₂で４分間インキ
ュベートした。次に、系に牛胎児血清（ＦＢＳ）を２ｍ
ｌ添加して、１回軽くゆすった後で上清を除去して、系
に混入している線維芽細胞を除去した。

【００７２】さらに、系にＫＧＭ培地〔表皮角化細胞基
礎培地（Keratinocyto growth medium）：Keratinocyto
basal medium （ＫＢＭ培地（改変ＭＣＤＢ１５３培地
（クローネティックス社製）））に，ウシ脳下垂体エキ
ス（ＢＰＥ）（０.４ｖｏｌ％），インシュリン（０.５
μｍ／ｍｌ），ハイドロコルチゾン（０.５μｍ／ｍ
ｌ），ｈ−ＥＧＦ（０.１ｎｇ／ｍｌ)を添加した培地、
以下同様である〕を１５ｍｌ添加し、３７℃，５％ＣＯ
₂ で３日間培養した。

【００７３】上記工程により得た毛包上皮系細胞を播種
した培養フラスコの線維芽細胞混入率（ＦＢ混入率）を
測定（３０００倍，５視野）し、その結果ＦＢ混入率が
３％以上のものは、アッセイの対象から除外した。

【００７４】系をＰＢＳ（−）１０ｍｌで２回洗浄し、
０．２５％トリプシン含有ＰＢＳ（−）を２ｍｌ添加し
て、これを３７℃で３分間インキュベートした。次いで
上皮系細胞と線維芽細胞とのトリプシンに対する反応性
の違いを利用して，系から線維芽細胞を除去するため
に、トリプシンを除去し、再び０.２５％トリプシン含
有ＰＢＳ（−）を２ｍｌ添加して、３７℃，２０ｒｐｍ
で５分間振盪した。

【００７５】次いで、細胞のはがれを顕微鏡下で確認し
た後、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を１０ｍｌ添加し
て、５０ｍｌ遠心チューブ中でピペッティングを行い、
系を１５００ｒｐｍで５分間遠心処理を施した。

【００７６】上清を除去し、ＫＧＭ培地２０ｍｌを添加
して、細胞塊がなくなるまでピペッティングを行った。

【００７７】懸濁液をセルストレーナー（１００μｍ N
algene 社製）で濾過後、５０ｍｌ遠沈管に入れて、懸
濁液中の生細胞数を血球算定板で算出し、系にＫＧＭ培
地を添加して、系の中の細胞濃度が５.０×１０⁴ｃｅｌ
ｌ／ｍｌになるように調整した。

【００７８】次いで、０.２ｍｌ／ｗｅｌｌの割合で、
９６ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅ（Ｉ型コラーゲンコーティン
グプレート：ファルコン社製）に播種し（１.０×１０⁴
ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）、細胞がウエルの底に沈むまで約
２０分間室温下で放置した。その後、３７℃，５％ＣＯ
₂で１日間培養を行い、所望するヒト毛包上皮系培養細
胞を得た。

【００７９】３．試験培地の調製 上記調製例１で得たクロトンバーマニカスのメタノール
抽出物（乾燥物）の０.２％ＤＭＳＯ溶液を、１０００
倍量の改変ＭＣＤＢ１５３培地（クローネティックス社
製）に添加した〔抽出物濃度：２.０×１０^-4％（ＤＭ
ＳＯ ０.１％）〕。

【００８０】これらの対象物質添加培地を０.１％ＤＭ
ＳＯ含有ＫＢＭ培地に添加し、対象物質の濃度を１.０
×１０^-8〜１.０×１０^-5％（試料１１〜１４）になる
ように希釈した。同様に対象物質添加培地を含まない対
照試料を調製した。

【００８１】４．対象物質培地交換 上記Ａ，Ｂにおいてヒト毛包上皮系培養細胞及びラット
毛包上皮系培養細胞を調製した９６ｗｅｌｌ−ｐｌａｔ
ｅ中のＫＧＭ培地を上記Ｃにおいて調製した、対象物質
添加培地及びコントロール培地（２００μｌ／ｗｅｌ
ｌ）と交換して、交換後３７℃，５％ＣＯ₂で２日間培
養した。

【００８２】なお、この培地の交換はウエル内のＫＧＭ
培地を，底面に付着している細胞を傷つけないように留
意しつつアスピレーターで抜いて、その後速やかに対象
物質添加培地等をウエルの両端から添加することにより
行った。

【００８３】５．細胞増殖の測定：アラマーブルー（al
amar blue：アラマーバイオサイエンス社製) を培地量
（容量）に対して、１／１０量を添加して、３７℃（５
％ＣＯ₂）で６時間インキュベートした。

【００８４】インキュベート後、マイクロプレートリー
ダー（Micro plate reader:Bio RAD社製) で５７０ｎｍ
と５９５ｎｍの吸光度を測定した。添付の使用説明書に
従って、吸光度の測定結果によりアラマーブルーの還元
率を算出した。この還元率は細胞数と相関することから
対照および被検体系での細胞増殖率を比較した。

【００８５】６．結果：測定したクロトンバーマニカス
抽出物（試料１１〜１４）における、上記細胞増殖促進
指標を下記第５表に示す。

【００８６】 表５ ───────────────────────────────── 試 料 増殖促進率（％） 効果 ───────────────────────────────── 試料１１（１.０×１０^-8％） ５.３±６.３* あり 試料１２（１.０×１０^-7％） １３.５±５.２** あり 試料１３（１.０×１０^-6％） １５.５±３.１** あり 試料１４（１.０×１０^-5％） ２５.６±５.１** あり 対照試料 １.２±２.７ なし ───────────────────────────────── ＊；有意差ｐ＜０.０５ ＊＊；有意差ｐ＜０.０１ 表５より明らかなように、本発明のクロトンバーマニカ
ス抽出物は、ヒト培養毛包上皮系細胞活性化試験におい
て有意な毛包上皮系細胞増殖促進効果を示した。

【００８７】実使用試験 本発明試料例１５ ヘアートニック (1) クロトンバーマニカス抽出物（調製例１） 1.0 (2) プロピレングリコール 5.0 (3) ヒアルロン酸ナトリウム 0.01 (4) ７５％エタノール 残余 上記処方にて製造したヘアートニックについて実使用で
フケ、発毛、脱毛等の症状に対する効果を検討した。フ
ケ、発毛、脱毛等の症状を呈する１０名の男性（年齢２
５才〜５５才) に１日１〜２回、１〜３ｍｌずつ４ヵ月
にわたって投与し、以下に述べる評価基準で、フケ防止
効果、発毛促進効果および脱毛防止効果を試験した。そ
の結果を表６に示す。

【００８８】の結果を得た。表１から明らかなように、
このヘアートニックは発毛促進並びにフケ及び脱毛の防
止に対して優れた効果を奏する。

【００８９】評価基準 (1)フケ防止効果テスト 無効：治療にもかかわらず、何らの改善もみられないも
の。

【００９０】有効：フケの発生が減少したもの。

【００９１】著効：フケの発生が止まったもの。

【００９２】(2)発毛効果テスト 無効：治療にもかかわらず、何らの改善もみられないも
の。

【００９３】有効：脱毛部の２／３以上に毛の新生が認
められるもの。

【００９４】著効：脱毛部に毛が生えそろったもの。

【００９５】(3)脱毛効果テスト 無効：治療にもかかわらず、何らの改善もみられないも
の。

【００９６】有効：脱毛の進行が減少したもの。

【００９７】著効：脱毛が止まったもの。

【００９８】 表６ ──────────────────────────────── 被験者 年齢 フケ 発毛 脱毛 ──────────────────────────────── １ 43 著効 有効 有効 ２ 32 著効 有効 有効 ３ 45 著効 有効 有効 ４ 37 有効 有効 無効 ５ 41 無効 有効 有効 ６ 28 有効 著効 著効 ７ 25 無効 有効 有効 ８ 55 有効 無効 有効 ９ 33 有効 有効 有効 10 27 無効 有効 著効 ──────────────────────────────── 表６から明らかなように、このヘアートニックは、発毛
促進、フケ防止および脱毛防止に対して優れた効果を奏
する。

【００９９】以下に、種々の剤型の本発明による頭部用
組成物の処方例を実施例として説明する。

【０１００】 実施例１ シャンプー ココイルメチルタウリンナトリウム ２.０ ポリオキシエチレン(8モル）オレイルアルコール ２.０ ラウリン酸ジエタノールアミド ４.０ エチレングリコール脂肪酸エステル １.０ グリセリン ０.２ メントール ０.１ クロトンバーマニカス抽出物（調製例１） １.０ 香料 適量 プロピレングリコール ２.０ 精製水 残部 実施例２ ヘアトリートメント 流動パラフィン ２５.０ ステアリン酸 ５.０ セタノール ５.０ ソルビタンモノオレエート ２.０ ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート ３.０ クロトンバーマニカス抽出物（調製例１） ０.５ １,３−ブチレングリコール ５.０ 防腐剤 適量 精製水 残部 実施例３ ヘアートニック クロトンバーマニカス抽出物（調製例１） １.０ ステアリルジメチルアミンオキシド ０.５ 硬化ヒマシ油エチレンオキシド（40モル）付加物 １.０ ９５％エタノール ５４.０ イオン交換水 残部 （製造法）９５％エタノールにイオン交換水を加え、こ
れに硬化ヒマシ油エチレンオキシド（４０モル）付加物
およびステアリルジメチルアミンオキシドを加えた後エ
キス乾燥物を加え、撹拌溶解した。

【０１０１】 実施例４ ヘアートニック グリセリン ２.０ Ｌ−メントール ０.１ クロトンバーマニカス抽出物（調製例１） ２.０ ９５％エタノール ５４.０ 香料 ０.５ イオン交換水 残部 （製造法）９５％エタノールにグリセリン、Ｌ−メント
ール、香料及びエキス乾燥物を加え、撹拌溶解した後、
イオン交換水を加えた。

【０１０２】 実施例５ ヘアートニック Ｎ−ヤシラウリル−β−アミノプロピオン酸ソーダ ０.２ クロトンバーマニカス抽出物（調製例１） ０.００１ ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム ０.５ 硬化ヒマシ油エチレンオキシド（40モル）付加物 １.０ ９５％エタノール ５４.０ イオン交換水 残部 （製造法）９５％エタノールにイオン交換水を加え、こ
れに硬化ヒマシ油エチレンオキシド（４０モル）付加物
およびステアリルジメチルアミンオキシド及びＮ−ヤシ
ラウリル−β−アミノプロピオン酸ソーダを加えた後エ
キス乾燥物を加え、撹拌溶解した。

【０１０３】 実施例６ ヘアートニック グリセリン ２.０ Ｌ−メントール ０.１ クロトンバーマニカス抽出物から得られた活性フラクションＡ ０.１ ９５％エタノール ５４.０ 香料 ０.５ イオン交換水 残部 （製造法）９５％エタノールにグリセリン、Ｌ−メント
ール、香料及び活性フラクションＡを加え、撹拌溶解し
た後、イオン交換水を加えた。

【０１０４】 実施例７ ヘアートニック ヒノキチオール ０.１ センブリエキス １.０ ビタミンＢ６ ０.２ ビタミンＥ ０.０１ メントール ０.２ サリチル酸 ０.１ クロトンバーマニカス抽出物から得られた活性フラクションＡ ０.１ 界面活性剤 ０.１ プロピレングリコール ２.０ ７０％エタノール 残余 実施例８ ヘアートニック ヒノキチオール ０.１ センブリエキス １.０ ビタミンＢ６ ０.２ ビタミンＥ ０.０１ メントール ０.２ サリチル酸 ０.１ クロトンバーマニカス抽出物（調製例１） １.０ 界面活性剤 ０.１ プロピレングリコール ２.０ ７０％エタノール 残余

【０１０５】

【発明の効果】本発明の頭部用組成物は、優れた脱毛防
止効果、発毛促進効果等の養毛作用及びフケ、痒み抑制
作用を有するとともに、毛乳頭細胞あるいは毛包上皮系
細胞を活性化することによって、毛髪伸長の促進をする
等の優れた養毛効果を有するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に従う植物抽出物から有効成分濃度が高
められた画分と４α−ＴＰＡのＨＰＬＣの溶出パターン
を対比して示すグラフである。ａ）及びｂ）は、それぞ
れ「その他の調製例」で得られたフラクションＡおよび
Ｂからのものであり、ｃ）は比較の４α−ＴＰＡによる
ものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田島 正裕 神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地 株 式会社資生堂第一リサーチセンター内 (72)発明者 岩渕 徳郎 神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地 株 式会社資生堂第一リサーチセンター内 (72)発明者 石野 章博 神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地 株 式会社資生堂第一リサーチセンター内 (72)発明者 辻 善春 神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地 株 式会社資生堂第一リサーチセンター内 (72)発明者 真柄 綱夫 神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地 株 式会社資生堂第一リサーチセンター内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 トウダイグサ科（Euphorbiaceae）ハズ
   属（Croton）に属する植物からの抽出物を有効成分とし
   て含有する頭部用組成物。
2. 【請求項２】 トウダイグサ科（Euphorbiaceae）ハズ
   属（Croton）に属する植物がクロトンバーマニカス（学
   名：Croton birmanicus Muell. Arg.）である請求項１
   記載の頭部用組成物。
3. 【請求項３】 該組成物が養毛料として使用される請求
   項１または２のいずれかに記載の頭部用組成物。
4. 【請求項４】 トウダイグサ科（Euphorbiaceae）ハズ
   属（Croton）に属する植物からの抽出物を有効成分とし
   て含有する毛乳頭細胞を活性化するための組成物。
5. 【請求項５】 トウダイグサ科（Euphorbiaceae）ハズ
   属（Croton）に属する植物からの抽出物を有効成分とし
   て含有する毛周期における毛髪成長期を延長するための
   組成物。