KR20020082206A - 폴리펩티드 및 항원 안정화 희석제 - Google Patents
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Abstract
폴리펩티드 또는 항원을 안정화시키기 위한 조성물이 제공된다. 이 조성물은 수성 제제 중에 저장된 폴리펩티드 또는 항원을 안정화시키는 데 유용하다. 이러한 제제는 다양한 분석 방법 또는 다른 방법에 사용될 수 있다.
Description
다음은 본원 명세서에 기재된 발명과 관련 가능성이 있는 문헌에 대한 설명이다. 그러나, 본원 명세서에 기재된 문헌 중 어느 것도 선행기술인 것으로 인정하지 않는다.
수용액 중의 폴리펩티드 및 항원을 안정화시키는 데는 종종 어려움이 있다. 예를 들면, 이러한 용액을 실온에서 장기간 저장하면 수용액 중에 함유된 폴리펩티드 또는 항원이 열화된다. 특히, 세균, 바이러스 및 다른 미생물 항원들은 수성 매질에서 저장될 때 불안정한 것으로 증명되었다. 한가지 예는 엔벨럽된 바이러스, 예를 들면 넓은 범위의 저장 온도에서 시간이 경과함에 따라 용액 중에서 분해되는 항원을 함유하는 오르토믹소바이러스(Orthomyxovirus) 패밀리의 인플루엔자 바이러스이다. 당업계 통상의 기술을 가진 자들은 다양한 세균 항원, 예를 들면일부 톡신의 용액 내 안정화에도 어려움이 있다는 것을 이해한다. 수용액 중에서의 열화를 피하기 위해, 당업계 숙련자들은 폴리펩티드 또는 항원을 보존하기 위한 방법으로서 동결건조 및 냉동을 이용하였다. 사실상, 동결건조 및 냉동의 폭넓은 이용은 수용액 중에 이러한 성분을 보존함에 있어서 단점 및 어려움이 있다는 것을 입증하는 것이다.
당업계의 많은 간행물에는 동결건조된 시약의 안정성을 증가시키는 수단 및 이 최신 기술에서조차 해결되지 않은 난점들이 기재되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,955,448호, 동 제4,496,537호, 및 PCT 국제출원 공개 WO97/04801은 모두 동결건조 기술을 개선시키는 것을 기재한다. 그러나, 단백질 함유 용액의 동결건조는 제조자 및 최종 사용자에게 큰 경제적 부담 및 불편함을 줄 뿐만 아니라, 재구성 상의 착오 및 오염을 일으킬 위험을 증가시킨다. 게다가, 용액의 냉동은 특수 설비를 요구하고, 궁극적으로 사이클이 반복되는 동안 단백질 분해를 초래할 수 있다. 상업적으로 이용하는 경우, 수용액 중의 폴리펩티드 및 항원의 열화는 극히 짧은 저장 기간 후에도 이러한 용액의 교체를 요하기 때문에 비용이 많이 든다.
본 발명은 용액 중의 폴리펩티드 및 다른 비단백질 화합물의 안정성을 증진시키는 수성 안정화 시약 또는 희석제에 관한 것이다. 항원, 예를 들면 탄수화물, 단백질, 지단백질, 지다당류, 다당류, 핵산, 핵단백질, 및 단백질, 지질 및 다른 화합물과 복합체를 이룬 탄수화물이 본 발명을 이용하여 안정화될 수 있는 항원 종류의 예시적인 예이다. 신규 시약 성분을 이용하여, 본 발명은 현재 상업적으로 입수가능한 희석제 또는 기술 문헌에 기재된 희석제 중의 폴리펩티드 및 항원의 안정성을 개선시킨다. 본 발명은 이러한 성분의 안정한 수용액을 필요로 하는 진단 분석 또는 다른 용도에서 대조시약으로서 사용되는 항원 및 폴리펩티드를 안정화시키는 데 특히 유용하다. 본 발명의 안정화 희석제는 약 2 - 8 ℃, 실온 및 약 45 ℃에서 장기간 저장을 위해 폴리펩티드 및 항원을 안정화시키는 데 유용하다.
PCT 국제특허출원공개 WO99/15901은 항원, 특히 C형 간염 바이러스(HCV) 항원을 안정화시키기 위한 희석제를 기재한다. HCV 희석제는 HCV 항원을 환원형으로 유지시키는 환원제를 포함한다. 이 공개는 희석제에 환원제를 포함시킴으로써 최장 7일 동안 HCV 항원의 면역반응성이 유지되었다고 보고한다. 보고된 희석제는 인산나트륨,pH6.5(또는 다른 완충제), EDTA(또는 다른 킬레이트화제), DTT(또는 다른 환원제), 젤라틴(또는 다른 단백질 블록킹 물질), 티오시안산암모늄(또는 다른 카오트로프(chaotrope)), 아지드화나트륨(또는 다른 방부제) 및 SDS(또는 다른 세정제)를 더 포함한다. 그러나, 희석제에 환원제를 포함시키는 것은 다른 미생물로부터 유래하는 많은 항원의 안정성에는 효과적이지 못하거나 또는 해로울 수 있다.
미국 특허 제4,956,274호는 상보성 분석에 사용하기 위한 β-갈락토시다제 유래 펩티드 단편을 안정화시키는 기술에 관한 것이다. 미국 특허 제4,956,274호에 기재된 용액은 β-갈락토시다제 펩티드 단편의 분해를 늦추기 위해 이온성 계면활성제 또는 당 잔기로부터 유래된 계면활성제를 포함하였다. 그러나, 계면활성제는 효소 단편도 변성시키기 때문에, 효소 단편이 그의 올바른 형태로 되돌아가도록 하고 효소 활성을 되찾도록 하기 위해서는 계면활성제가 제거되거나 또는 중화되어야 하는데, 이것은 용액이 단백질의 천연형을 안정화시키지 못했다는 것을 가리킨다. 계면활성제는 분석 직전에 시클로덱스트린을 사용하여 중화된다. 별법으로, 고농도의 혈청을 이용하여 계면활성제의 작용을 방해한다. 기재된 시약의 추가 성분은 킬레이트화제, 완충제, 살균제, 마그네슘 또는 다른 이온, 환원제, 가용화제, 예를 들면 에틸렌 글리콜과 같은 용매, 및 비이온성 세정제를 포함하였다. 당업계 숙련자들이 인식하는 바와 같이, 단백질 또는 효소 단편의 변성 및 재생은 일부 항원 에피토프를 손상시켜서 그들을 불활성으로 만들 수 있다.
미국 특허 제5,459,033호는 바이러스 응집을 방지하는 데 유용한 용액을 기재한다. 이 용액은 N-라우릴 사르코신 또는 다른 음이온성 계면활성제를 포함하는 것으로 보고되었다. 이 용액은 비리온 입자, 특히 간염 및 헤르페스 바이러스가 소수성 인력 때문에 응집하고 그 결과 감도가 감소된다는 가정을 토대로 하여 안정성을 증진시키는 것으로 기재되었다. 이 희석제는 항원의 촉매 활성 또는 면역원성을 개선 또는 보존하는 것으로 보고된 것이 아니라, 응집을 방지하는 것으로 보고되었다. 또, 용액이 사용될 수 있기 전에, 일정한 안정성을 보장하기 위해 15시간 내지 10일 동안 2 - 35 ℃에서 배양되어야 한다고 보고되어 있으며, 이것은 최종 제품의 제조 용이성에 큰 제한을 가하는 것이다.
미국 특허 제5,660,978호에는 단백질분해 또는 산화를 방지하기 위해 항원 농축액(예: 혈청)에 항원 특이적 항체 또는 그의 부분(특히, Fab)를 포함시킴으로써 항원, 특히 불안정한 단백질 항원, 특히 효소를 안정화시키는 방법이 기재되어 있다. 혈청 또는 비특이적 IgG의 도입이 이러한 희석제에 요망되는 보호 또는 특이적 보호를 제공할 것이라고는 예상하지 못할 것이다. 게다가, 안정화는 희석제에 항원을 넣기 전에 완료되었다. 대조적으로, 본 발명은 희석제 자체에 의해 안정화가 이루어진다. 게다가, 이전의 특허 발명이 제안한 것처럼 단계적으로가 아니라, 본 발명은 처음부터 비교적 묽은 용액을 안정화시킨다. 항원을 구조적으로 안정화시키기 위해 항체를 사용하는 것은 특히 하나 이상의 항원 부위가 면역학 분석의 목표인 경우에 문제가 될 것이다. 또한, 당업계 숙련자는 항원을 형태적으로 보존하지만 특이적 효소활성을 억제하지 못하는 상기 미국 특허 제5,660,978호에 기재된 것과 같은 희석제를 시종일관되게 제조하는 데 있어서 어려움이 있을 것이다. 이 발명은 화학적 고정액 대신에 항체 부분들을 고정 시약으로서 주로 사용하고 있으며, 따라서, 사실은, 안정화 희석제를 기재하고 있지 않다.
랜디, 에스(Landi, S) 및 헬드, 에이취알(Held, HR) (Tubercle 59(1978) 121-133)은 희석된 용액에 트윈-80(Tween-80) 세정제를 첨가하는 것을 보고하였으며, 세정제의 항흡착 성질 때문에 이것의 첨가로 튜베르쿨린 PPD 안정성이 증진되었다는 것을 제시하였다. 튜베르쿨린 제제(Connaught Laboratories, LTD에서 제조)는 튜베르쿨린 PPD, 0.3% 페놀(방부제로 작용하는 것으로 보고됨), 및 0.0005% 트윈-80을 PBS 중에 함유한다. 페놀은 본 발명에서는 허용될 수 없는 위험 물질이고, 일부 단백질을 변성시킬 것이다.
희석제 제제 및 동결건조 저장 기술의 진보에도 불구하고, 용액 중에 저장된 다양한 폴리펩티드 및 항원, 특히 미생물로부터 유래한 항원의 장기간 안정성을 충분히 개선시키는 희석제에 대한 요구가 여전히 남아있다.
본 발명은 폴리펩티드 및 항원을 안정화시키는 데 유용한 수성 조성물에 관한 것이다. 안정화된 폴리펩티드 및 항원은 항원 특이적 검출과 같은 분석 방법, 뿐만 아니라 수용액 중의 이러한 성분의 안정화가 요망되는 다른 제약 용도에 유용하다.
<발명의 요약>
본 발명은 폴리펩티드 및 항원을 안정화시키는 시약을 다룬다. 이 시약은 특히 분석 절차에 사용되는 대조 또는 비교 항원의 안정화에 특히 유용하다. 항원, 예를 들면, 탄수화물, 단백질, 폴리펩티드, 폴리펩티드 단편, 지단백질, 지다당류, 다당류, 핵산, 핵단백질, 및 다당류, 지질 및 다른 화합물과 복합체를 이룬 탄수화물은 본 발명을 이용하여 안정화될 수 있는 항원 종류의 예시적인 예이다.
본 발명의 시약은 저온 및 고온 모두에서 폴리펩티드 및 항원 안정성에 있어서 종래의 제제를 능가한다. 폴리펩티드 및 항원은 이 시약 중에 용해된 형태로 장기간 동안 약 0.5 ℃ 내지 약 50 ℃ 초과, 바람직하게는 약 2 내지 8 ℃, 약 실온(대표적으로는, 약 23 ℃ 내지 약 28 ℃, 특히 바람직하게는 25 ℃) 및 약 42 ℃ 내지 약 43 ℃, 특히 약 45 ℃의 다양한 온도에서 저장될 수 있다. 45 ℃에서의 안정성은 시약이 장기간 항원 안정성을 제공할 수 있는 능력이 있음을 예측하게 하는 것이다. 게다가, 본 발명의 시약은 폴리펩티드 및 항원을 안정화시키는 것을 목적으로 하는 단일한 수용액이라는 이점을 갖는다.
제1 면으로서, 본 발명은 폴리펩티드 또는 항원 안정성을 증진시키는 수성 시약 조성물을 다룬다. 몇몇 바람직한 실시태양에서, 이 시약은 완충제(들), 블록킹제(들), 용매(들), 염(들), 킬레이트화제(들), 세정제(들) 및 방부제(들) 중 하나 이상을 포함한다. 바람직하게는, 이 시약은 N-도데카노일-N-메틸글리신 또는 데카노일-N-메틸글루콘아미드를 포함하지 않는다. 이 시약은 또한 조직 배양 배지 또는 상업적으로 입수가능한 희석제와 같은 성분들을 포함할 수도 있다.
본원 명세서에서 사용된 "완충제"라는 용어는 용액의 pH 변화를 최소화시키는 작용을 하는, 당업계 숙련자들에게 잘 알려져 있는 조성물을 의미한다. 바람직한 완충제는 pH 7과 9 사이의 유효 완충 작용을 제공하는 pKa를 가진다. 바람직한 완충제는 ACES, ADA, BES, 비신, 비스-트리스, CAPS, CHES, 디에틸말로네이트, 글리실글리신, 글리신아미드 HCl, HEPES, HEPPS, 이미다졸, MES, MOPS, PIPES, POPSO, TAPSO, TES, 트리신, 트리스, 바이카르보네이트 및 보레이트이다. 특히 바람직한 것은 인산염 완충제이다. 바람직한 완충제 농도는 2M 미만이고, 가장 바람직한 농도는 pH 7, 7.25, 7.5, 7.75, 8, 8.25, 8.5, 8.75 및 9를 갖는 0.2M, 0.1M, 0.05M, 0.05M, 0.02M, 0.01M, 0.005M, 0.001M 및 0.0001M이다.
본원 명세서에서 사용되는 "블록킹제"라는 용어는 단백질 및(또는) 폴리펩티드의 혼합물을 함유하는 단백질 풍부 공급원을 의미하는 것으로서, 지질, 탄수화물, 염, 및 헴과 같은 조인자와 같은 하나 이상의 추가 성분을 포함할 수 있다. "단백질 풍부"라는 용어는 본원 명세서에서 정의된다. 이러한 블록킹제는 본원 명세서에 기재된 조성물 및 방법에서 하나 이상의 단백질, 폴리펩티드 및(또는) 항원을 안정화시키는 데 사용될 수 있다. 바람직한 블록킹제는 약 6.5 내지 약 8.0의 pH 및(또는) 약 250 내지 약 350 mOsm/㎏ H2O의 오스몰 농도를 갖는다. 특히 바람직한 블록킹제는 혈청, 예를 들면 말 혈청, 신생 송아지 혈청, 송아지 혈청, 소 혈청, 사람 혈청, 토끼 혈청, 양 혈청 등 및 당업계 숙련자에게 공지된 혈청 대체물이다. 블록킹제로서 가장 바람직한 것은 태아 상태 송아지 혈청이다.
본원 명세서에서 사용된 "단백질 풍부"라는 용어는 약 1 g% 내지 약 50 g%, 가장 바람직하게는 약 3 g% 내지 약 10 g%의 총 단백질 농도를 갖는 단백질 및(또는) 폴리펩티드의 혼합물을 함유하는 용액을 의미한다. 예를 들면, 태아 상태 송아지 혈청은 약 3 g% 내지 약 4.5 g%의 총 단백질 함량을 가지고, 한편 소 혈청은 약 4.5 g% 내지 약 8.5 g%의 총 단백질 함량을 가진다.
본원 명세서에서 사용된 "용매" 또는 "가용화제"라는 용어는 조성물의 다른 성분들을 분산시킬 수 있는 액체 물질을 의미한다. 바람직한 용매는 물, 글리세롤, DMSO, 알콜, 예를 들면 에탄올, 메탄올 등, 아세톤, 디메틸 술폭시드, 아세토니트릴 및 디메틸 포름아미드이다.
본원 명세서에서 사용된 "염"이라는 용어는 산의 산성 수소 일부 또는 전부가 금속 또는 금속처럼 작용하는 원소로 대체됨으로써 생성된 하나 이상의 화합물을 의미한다. 바람직한 염은 KCl, NaCl, MgCl2, MgSO4, 및 CaCl2이다. 바람직한 염 농도는 4M 내지 0.1mM, 가장 바람직하게는 2M 내지 50 mM이다.
본원 명세서에서 사용된 "킬레이트화제"라는 용어는 보통 그 분자 내의 2개 이상의 착화기를 통해서 금속 이온과 결합하는 분자를 의미하는 것이다. 킬레이트화제는 당업계에 잘 알려져 있으며, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA) 뿐만 아니라 몇몇 단백질 및 폴리펩티드도 포함한다. 바람직한 킬레이트화제 농도는 100mM 내지 0.01mM이고, 가장 바람직하게는 20 mM 내지 1mM이다.
본원 명세서에서 사용된 "세정제"라는 용어는 오일을 유화시키고 습윤제로 작용할 수 있는 당업계에 잘 알려진 화합물을 의미한다. 바람직한 세정제는 CHAPS, 콜산, 데옥시콜산, 디지토닌, n-도데실-β-D-말토시드, 글리코데옥시콜산, n-라우로일사르코신, 라우릴 술페이트, 사포닌, 트윈20 및 트리톤X-100을 포함한다. 바람직한 세정제 농도는 약 0.001% 내지 약 5%이다. 가장 바람직하게는 조성물은 약 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 1.0% 및 2%를 포함한다.
본원 명세서에서 사용된 "방부제"라는 용어는 미생물 성장을 방지하는 당업계 숙련자에게 잘 알려진 화합물을 의미한다. 바람직한 방부제는 티메로살, 소르브산, BHA, BHT, 마이크로사이드(Microcide) II (트리메틸테트라데실암모늄 브로마이드) 및 항생제, 예를 들면 겐타마이신, 페니실린, 스트렙토마이신 등을 포함한다. 바람직한 방부제 농도는 10% 내지 0.001mM이고, 가장 바람직하게는 1% 내지 0.1%이다.
본원 명세서에서 사용된 "폴리펩티드"라는 용어는 아미노산의 폴리머를 의미하고, 특정 길이의 물질을 의미하지 않으며, 따라서, 이 정의에는 펩티드, 올리고펩티드, 단백질 및 그의 단편이 포함된다. "폴리펩티드"라는 용어는 폴리펩티드의 번역후 변형, 예를 들면 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등을 배제하지 않는다.
본원 명세서에서 사용된 "항원"이라는 용어는 탄수화물, 단백질, 폴리펩티드, 지단백질, 지다당류, 다당류, 핵산, 및 폴리펩티드, 지질 및 다른 화합물과 복합체를 이룬 탄수화물을 포함한다. 항원은 유효한 면역계를 가진 동물에서 면역반응을 유도할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 안정화되는 항원은 폴리펩티드 항원이다. 이들 폴리펩티드 항원은 단독으로 또는 다른 분자들과 결합된 상태로 관찰될 수 있다. 특히 바람직한 실시태양에서, 안정화되는 폴리펩티드는 핵단백질 항원이다. 핵단백질 항원은 많은 공급원으로부터 유래할 수 있고, 단독으로 또는 다른 분자들과 결합된 상태로 관찰될 수 있다.
"핵단백질 항원"이라는 용어는 핵복합체와 결합되거나 부착된 채로 발견되는 폴리펩티드를 의미한다.
특히 바람직한 핵단백질은 인플루엔자 바이러스, 특히 인플루엔자 B형으로부터 유래하는 핵단백질이다.
"항원 안정성"이라는 용어는 정해진 온도에서 주어진 기간 동안 시약을 저장한 후 검벙 또는 분석 방법, 특히 진단 분석 또는 면역 분석에서 한 시약에 의해 발생되는 일관된 신호를 유지할 수 있는 능력을 의미한다. 전형적인 저장 온도는 약 2 ℃ 내지 30 ℃이다. 항원 안정성은 더 짧은 기간 동안 고온에서 항원 열화를 측정함으로써 평가될 수 있다. 가속 안정성 시험의 대표적인 온도는 약 30 ℃ 내지 60 ℃이다.
"미생물"이라는 용어는 원핵생물, 효모와 같은 진핵생물, 바이러스, 프리온(prion), 또는 다른 전염성 입자를 의미한다.
"분석 방법"이라는 용어는 하나 이상의 항원을 특이적으로 검출할 수 있는 기술을 의미한다. 분석 방법은 임의의 검출 방식을 채택한 면역 분석 및 핵산 혼성화를 포함하고, 이들의 많은 예가 당업계에 알려져 있다. 특히 바람직한 광학적면역분석 방법은 미국 특허 제5,550,063호, 제5,955,377호 및 제5,541,057호에 기재되어 있다.
제2 면으로서, 본 발명은 미생물로부터 유래한 항원 또는 폴리펩티드 안정성을 증진시키는 수성 시약 조성물을 다룬다. 바람직한 실시태양에서, 미생물은 바이러스 및(또는) 세균을 포함한다. 본 발명은 바이러스 분석물에 이용하는 경우에 특히 바람직하다. 특히 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 인플루엔자로부터 유래한 항원 및 폴리펩티드, 특히 인플루엔자 B로부터 유래한 폴리펩티드 및 항원을 안정화시키는 시약 조성물을 다룬다.
제3 면으로서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 핵단백질, 특히 인플루엔자 B로부터 유래한 핵단백질을 안정화시키는 시약 조성물을 다룬다.
제4 면으로서, 본 발명은 분석 방법과 연관된 대조 또는 비교 시약으로 사용될 수 있는 항원 제제를 안정화시키는 수성 시약 조성물을 다룬다.
특히 바람직한 실시태양에서, 이 시약은 완충제, 블록킹제, 염, 킬레이트화제, 가용화제, 비이온성 세정제 및 방부제를 포함한다. 가장 바람직하게는, 이 시약은 N-도데카노일-N-메틸글리신 또는 데카노일-N-메틸글루콘아미드를 포함하지 않는다.
추가의 바람직한 실시태양에서, 이 시약은 또한 조직 배양 배지, 스타빌코트(Stabilcoat,등록상표) 완충제(BSI, Inc), 및 포르말린으로 불활성화된 바이러스 함유 세포 배양 배지도 함유할 수 있다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 이 시약은 인산나트륨 완충제, 태아 상태 송아지 혈청, 글리세롤, 염화나트륨, EDTA, 트윈-20(등록상표) 세정제 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트), 마이크로사이드 II(등록상표) 방부제(사급 암모늄 화합물; Amresco, E423), 겐타마이신 술페이트를 포함하고, 수크로스, 조직 배양 배지 및 스타빌코트(등록상표) 완충제(BSI, Inc.)를 포함할 수 있다. 이 용액의 pH는 약 7 내지 약 9, 가장 바람직하게는 7.5 내지 8.5이다. 당업계 숙련자들은 유사한 시약들로 상기한 것들을 대체할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, EDTA는 EGTA로 대체될 수 있고, 마이크로사이드 II(등록상표) 또는 겐타마이신은 다른 항균제로 대체될 수 있다. 상기 시약들의 바람직한 농도는 다음과 같다: 인산나트륨 농도는 0.1mM 내지 1000 mM, 더 바람직하게는 1mM 내지 200 mM, 가장 바람직하게는 50 mM 내지 100 mM이고, 태아 상태 송아지 혈청 농도는 0.1 % 내지 40%v/v, 가장 바람직하게는 2% 내지 20%v/v이며, 글리세롤 농도는 0.1% 내지 30%v/v, 가장 바람직하게는 2.5% 내지 10%v/v이고, 염화나트륨 농도는 0.1mM 내지 4M, 가장 바람직하게는 50mM 내지 2 M이며, EDTA 농도는 0.01mM 내지 100 mM, 더 바람직하게는 1 mM 내지 20mM, 가장 바람직하게는 10 mM 내지 15 mM이고, 트윈-20 농도는 0.001% 내지 1%, 더 바람직하게는 0.01% 내지 0.1%, 가장 바람직하게는 0.5%이며, 마이크로사이드 II 농도는 0.001% 내지 1% w/v, 가장 바람직하게는 0.002 % 내지 0.1% w/v이고, 겐타마이신 술페이트 농도는 0.01% 내지 10% w/v, 더 바람직하게는 0.1 % 내지 2.5%, 가장 바람직하게는 0.25% 내지 1%이며, 수크로스 농도는 0.01% 내지 5 %w/v, 가장 바람직하게는 0.1% 내지 0.5%이다.
특히 바람직한 실시태양에서, 희석제는 다음 성분들을 다음에 지정된 양 이상으로 포함한다: 50 mM 인산나트륨, 2% v/v 태아 상태 송아지 혈청, 10% v/v 글리세롤, 50mM 염화나트륨, 10mM EDTA, 0.05%v/v 트윈-20 세정제, 0.01 %w/v 마이크로사이드 II 방부제 및 0.5% w/v 겐타마이신 술페이트. 이 시약은 또한 0.5 % 이하의 수크로스, 15% 이하의 스타빌코트(등록상표) 완충제 및 20% 이하의 조직 배양 배지(항원 제제로부터 또는 별도 첨가에 의해)를 포함할 수도 있다. 용액의 바람직한 pH는 약 7.5 내지 약 8.5이다. 완충제 및(또는) 염을 일정 농도의 미리 제제화된 조직 배양 배지(예를 들면, Bio Whittaker로부터의 이글 최소 필수배지 또는 둘베코 변형 이글 배지)로 대체하는 것도 가능한다.
제5 면으로서, 본 발명은 미생물로부터 유래된 폴리펩티드 및 항원을 안정화시키는 방법을 다룬다. 바람직한 실시태양에서, 상기 방법은 분석 방법과 연관된 대조 또는 비교 시약으로서 사용하기 위한 또는 제약 제제에 사용하기 위한 미생물로부터 유래된 항원 제제를 안정화시키는 데 사용된다.
<도면의 간단한 설명>
도1은 불활성화된 인플루엔자 B의 안정성에 대한 본 발명의 희석제의 이점을 보여주는 그래프.
도2는 세포 배양 배지가 본 발명의 희석제의 안정화 성질을 더 증진시킬 수 있음을 보여주는 그래프.
<바람직한 실시태양에 대한 상세한 설명>
A. 도입
본 발명의 이해를 쉽게 하기 위해, 시약 조성물의 개발을 특정 응용례에 대하여, 즉 인플루엔자에서 유래된 항원을 안정화시키는 것에 대해 설명한다. 그러나, 유사한 실험을 수행함으로써 다른 항원 또는 폴리펩티드에 대한 안정화 시약 조성물의 일반적 용도가 입증될 수 있다.
진단 분석 성분 또는 다른 용도를 위한 시약을 개발하는 동안, 시약의 장기간 안정성에 대한 측정이 요구된다. 먼저, 실시간 안정성 측정에 앞서 시약의 저장 수명에 대한 평가를 위해 가속 안정성을 확인한다. 가속 안정성 연구는 신속하게 수행될 수 있고, 당업계 숙련자들이 안정성을 예측하는 데 종종 사용된다. 이것을 수행하는 한가지 수단은 시약을 고온에서 항온처리하고, 비교적 짧은 시간 간격으로 분석하는 것이다. 예를 들면, 어떤 시약이 약 2 - 8 ℃에서 장기간 동안 안정하게 유지될 수 있는지를 예측하기 위해 37 ℃, 45 ℃ 및 다른 고온에서 3 일 내지 7 일 동안 배양한 것을 아레니우스 방정식을 사용하여 분석한다. 이 방법이 현재로서는 시약의 열화(failure)를 예측함에 있어서 가장 정확한 것으로 믿어진다. 시약이 고온 공격을 견딜 수 없다면, 정상 저장 조건 하에서 장기간 동안 안정하지 않을 것이다. 고온 안정성은 열화 속도를 정확하게 예측하는 것이 아니라 예상되는 시약의 열화점(failure point)을 확인함으로써 안정성의 지표를 제공하는 것이기 때문에, 장기간 안정성을 예측하는 데는 모자람이 있다. 고온에서의 안정성 손실이 감소하면, 실시간 열화 가능성도 마찬가지로 감소한다.
가속 검증(accelerated validation) 이외에, 실시간 장기간 연구도 시약이 폴리펩티드 또는 항원을 안정화시킬 수 있는 가능성을 평가하는 데 필요하다. 실시간 연구를 위한 조건은 당업계 숙련자들에게 알려져 있다. 예를 들면, 실시간평가 조건은 시약을 약 2 - 8 ℃의 정상 저장 온도 또는 실온(18 - 30 ℃)에서 시약의 열화점에 도달할 때까지 저장하는 것을 포함할 수 있다.
인플루엔자 바이러스의 면역분석을 위한 양성 대조 시약을 개발함에 있어서, 포르말린으로 불활성화된 인플루엔자 A 및 B 형 바이러스들을 단백질 기재 희석제 중에서의 안정성에 대해 평가한다. 이 분석에서 검출된 에피토프가 바이러스 핵단백질로부터 유래하는 것인 경우, 불활성화된 인플루엔자 A가 불활성화된 인플루엔자 B보다 단순 희석제 및 상업적으로 입수가능한 안정화 희석제 중에서 훨씬 더 안정하다. 인플루엔자 A 및 B 검출을 위한 새로운 생성물의 상업적 생존력을 보장하기 위해서는, 불활성화된 인플루엔자 B를 안정화시키는 수단이 요구된다. 두가지 유형의 불활성화된 인플루엔자 바이러스 현탁액에 안정성을 부여하는 희석제가 제제화되었다. 이 희석제는 종래 희석제 조성물보다 더 오랜 기간 동안 용액 중의 불활성화된 인플루엔자 B의 안정성을 개선할 수 있다는 것이 입증되었다.
인플루엔자 A는 단순 단백질 기재 희석제에서 안정한 것으로 나타났다. 이러한 희석제 중 한가지는 인산염 완충 염수(PBS) 중에 소 혈청 알부민(BSA) 및 트윈-20(등록상표) 세정제를 함유한다(PBT라고도 부름). 제2의 제제는 시판품인 스타빌코트(등록상표) 완충제(BSI, Inc.)이고, 이것도 또한 인플루엔자 A를 안정화시키는 것으로 입증되었다. 그러나, 이들 용액 중 어느 것도 인플루엔자 B를 안정화시키지 못한다. 수행된 분석에서 이들 상이한 바이러스 종들을 검출하는 모노클로날 항체가 두 핵단백질의 상이한 에피토프를 인식하는 것이라고 생각된다. 이들 에피토프는 불활성화 및 저장 조건에 의해 다르게 영향받을 수 있다. 게다가, 분석에 사용된 모노클로날 항체를 위한 초기 제제에 사용되는 면역원이 상이하게 제조될 수 있고, 따라서 상이한 형태를 가진 에피토프를 인식하는 모노클로날의 제조를 촉진할 수 있다. 본원 발명자들은 본원 명세서에 기재된 희석제 조성물이 불활성화된 인플루엔자 B 핵단백질에 나타내는 안정화 효과와 유사한 안정화 효과를 불활성화된 인플루엔자 A 핵단백질에 나타낸다고 믿는다. 게다가, 다른 바이러스 및 세균 단백질도 마찬가지로 안정화된다고 생각된다.
바이러스 불활성화 및 각 희석 포맷으로의 희석 과정에는 불활성화된 바이러스 스톡 현탁액의 성분들을 포함시키는 것이 내재한다는 것을 주목하여야 한다. 불활성화된 바이러스 스톡 현탁액은 50%의 포르말린으로 불활성화된 바이러스를 함유하는 세포 배양 배지(ICC) 및 50%의 스타빌코트(등록상표) 완충제로 이루어진다. 시험된 양성 대조 조성물들은 각각 이 스톡 현탁액을 조금씩 포함한다.
B. 새로운 희석제의 제제화
새로운 희석제의 제제화는 BSA, 트윈-20 및 PBS 용액을 포함하는 단순 단백질 희석제 PBT로 시작한다. 각 성분에 대해 그들이 불활성화된 인플루엔자 A 바이러스의 안정성을 유지 또는 증진시키면서 불활성화된 인플루엔자 B 바이러스를 안정화시킬 수 있는지를 평가한다. 항원 제제의 안정성 증가는 다음 방법으로 평가한다. 불활성화된 바이러스 물질을 대조 시약이 마켓팅될 분석적 시험 방법을 위해 요망되는 세기의 신호 강도를 나타내도록 희석한다. 일반적으로, 대응하는 분석 방법으로 대조 시약에 대해서는 낮은 세기 내지 중간 세기의 신호가 선택된다. 선택된 항원 희석비의 여러 시약 조성물을 즉시 적당한 분석 방법으로 시험한다.여러 시약 조성물(항원 함유)은 다양한 저장 조건에 둔 후, 주기적으로 분석 방법으로 재시험한다. 저장 조건에 대해 원래 신호를 보유하거나 또는 원래 신호 세기가 극미하게 감쇠된 시약 조성물은 증진된 안정성을 제공하는 것으로 결정한다. 신호 세기는 정성적으로, 정량적으로, 시각적으로 또는 기기에 의해 평가될 수 있다. 성분 선택 과정 중에 PBT 희석제에 몇가지 변형을 가한다. 첫째, BSA 대신 다른 블록킹제, 예를 들면 태아 상태 송아지 혈청으로 대체한다. 그 다음, 안정성을 증진시키기 위해 글리세롤과 같은 가용화제 및 EDTA 또는 EGTA와 같은 킬레이트화제를 첨가한다. 또한, 트윈-20(등록상표)과 같은 비이온성 세정제를 포함시키는 것이 안정성에 필수적이라는 것이 결정되었다. 마이크로사이드 II 및 겐타마이신 술페이트의 혼합물과 같은 방부제가 항미생물제로서 포함된다.
특히 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 희석제 조성물은 다음 성분을 다음에 지정된 양 이상으로 포함한다: 50 mM 인산나트륨, 2% v/v 태아 상태 송아지 혈청, 1%v/v 글리세롤, 50mM 염화나트륨, 5mM EDTA, 0.05%v/v 트윈-20 세정제, 0.01 %w/v 4급 암모늄 화합물 및 0.5% w/v 겐타마이신 술페이트. 이 시약은 또한 15% 이하의 스타빌코트(등록상표) 완충제 및 20% 이하의 조직 배양 배지(항원 제제로부터 또는 별도 첨가에 의해)를 포함할 수도 있다. 용액의 바람직한 pH는 약 7.5 내지 약 8.5이다. 완충제 및(또는) 염을 일정 농도의 미리 제제화된 조직 배양 배지(예를 들면, Bio Whittaker로부터의 이글 최소 필수 배지 또는 둘베코 변형 이글 배지)로 대체하는 것도 가능하다.
어떠한 특정 이론에도 얽매이는 것을 바라지 않으면서, 원래 희석제에 대한변형은 다음 메카니즘에 의해 폴리펩티드 또는 항원 안정성을 증진시킬 수 있다. 태아 상태 송아지 혈청은 정제된 단백질이 아니라 전체 혈청 생성물이기 때문에 BSA보다 더 풍부한 단백질 공급원을 제공할 수 있다. 그것은 다른 안정화 물질을 포함할 수 있다. 글리세롤은 수소결합을 통해 항원의 수화를 증가시킬 수 있다. 킬레이트화제는 폴리펩티드 또는 항원 자체에 부정적인 영향을 줄 수 있거나 또는 항원 또는 폴리펩티드에 손상을 줄 수 있는 몇몇 분해 효소의 활성에 필요할 수 있거나 또는 항원의 촉매 부위를 억제할 수 있는 양이온을 제거함으로써 안정성을 증가시킬 수 있다. 세정제는 항원 또는 폴리펩티드의 중요한 이차 구조 및 지지가 되는 결합은 유지시키는 반면, 중요하지 않거나 또는 분해성 구조/상호작용은 파괴할 수 있다.
본 발명은 먼저, 상기한 단순 BSA 단백질 희석제(PBT) 중에서의 항원 안정성을 기준으로서 시험하여 평가한다. 대표적으로, 시약 개발에서, 저온에서의 장기간 안정성을 평가하는 데는 45 ℃에서 약 3일까지 양성 반응(positivity)을 보유하면 충분하다. 당업계 숙련자들은 고온에서 약 14일까지 안정성을 보이면 잘 안정화된 항원을 가리킨다고 믿는다. 또한, 시약이 45 ℃에서 활성을 보유하는 시간이 길수록, 저온, 예를 들면 약 2 - 8 ℃ 및 실온에서 더 오랜 기간 동안 안정할 것으로 생각된다. 먼저, 포르말린으로 불활성화된 인플루엔자 현탁액 스톡을 당업계에 흔히 알려져 있는 하기 실시예 1에 기재된 방법으로 제조한다. 이어서, 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B가 불활성화된 스톡 둘 모두를 단순 단백질 희석제에 각각 1:2 및 1:4 희석비로 가한다. 이 희석비에서, 시험 희석액은 각각 전체적으로50% 희석제, 25% ICC 및 25% 스타빌코트 완충제, 또는 75% 희석제, 12.5% ICC 및 12.5% 스타빌코트(등록상표) 완충제를 함유한다. 이들 항원 희석비는 반응된 시험 장치의 시각적 검사에서 적당한 양성 신호를 제공하도록 선택된 것이다. 이렇게 하여 얻은 두 용액을 양성반응(positivity)을 위한 플루 오이아(FLU OIA, 등록상표) 시험 키트(Biostar Inc.)로 제0일, 제3일(4 ℃) 및 제3일(45 ℃)에서 시험한다. 시험은 포장된 설명서에 따라 수행한다. 불활성화된 인플루엔자 B는 제3일 45 ℃에서 양성반응을 전부 잃고, 불활성화된 인플루엔자 A는 양성반응을 일부 잃는다. 시약의 열화 때문에 그 후 시점에서는 시험하지 않는다. PBT 단백질 희석제는 요망되는 정도의 항원 안정성을 유지하지 못한다.
또한, 항체 코팅 표면을 보호 및 안정화시키도록 제제화된 상업적으로 입수가능한 희석제인 스타빌코트(등록상표) 완충제(BSI, Inc.)를 상기 항원 희석비를 이용하여 시험한다. 스타빌코트(등록상표)로부터 유래한 대조 시약의 안정성은 시험 시점이 제0일 및 제4일(4 ℃ 및 45 ℃ 저장 조건)이라는 것을 제외하고는 상기한 바와 같이 평가한다. 이러한 조건 하에서, 희석제의 완전 조성은 75% 스타빌코트(등록상표) 완충제 및 25% ICC이다. 심지어 조직 배양 배지가 존재하는 경우에도, 스타빌코트(등록상표)는 불활성화된 인플루엔자 B 항원의 안정성을 제4일을 넘어서까지 유지할 수 없으며, 이것은 장기간 저장 가능성이 결여됨을 가리킨다.
그 다음, 본 발명의 시약 조성물을 그의 성능을 평가하기 위해 상기한 바와 같이 시험한다. 이 경우, 희석제의 완전 조성물은 불활성화된 인플루엔자 A 용액에 대해서는 50% 희석제, 25% ICC 및 25% 스타빌코트(등록상표) 완충제를 함유하고, 불활성화된 인플루엔자 B 용액에 대해서는 75% 희석제, 12.5% ICC 및 12.5% 스타빌코트(등록상표) 완충제를 함유한다. 제3일 45℃에서, 불활성화된 인플루엔자 A 및 B 모두 양성반응을 약간 잃지만, 여전히 명백하게 양성이다. 불활성화된 인플루엔자 B 시약을 제7일, 제14일 및 제21일에 평가한다. 결국, 21일 후 45℃에서, 불활성화된 인플루엔자 B는 양성반응을 모두 잃는다. 이전의 연구는 불활성화된 인플루엔자 A도 또한 제21일에 그의 양성반응을 상당 부분 잃는다고 밝혔다. 불활성화된 인플루엔자 A가 열화점까지 시험되지는 않았기 때문에 그 데이타에서는 이 특별한 분석 조건 하에서 불활성화된 인플루엔자 A가 향상된 것이 나타나 있지 않다. 그러나, 이 조건 하에서 불활성화된 인플루엔자 A의 안정성은 매우 높을 수 있고, 시험된 시점을 넘어서까지 연장될 수 있다. 이러한 또는 다른 분석 조건 하에서 열화점까지 시험된다면, 본 발명의 희석제는 또한 인플루엔자 A 항원의 안정성을 증진시킬 것이다. 따라서, 단순 PBT 단백질 희석제 및 스타빌코트(등록상표)에 비해, 본 발명의 조성물은 저장 동안 용액 중의 항원을 더 잘 안정화시킬 수 있다.
본 발명의 다른 평가에서, 본 발명의 안정화 희석제는 보다 더 민감한 광학 분석 방법에 사용된다. 이 방법의 양성 대조구는 이러한 대조구 용액에 필요한 적당한 신호를 달성하기 위해 포르말린으로 불활성화된 인플루엔자 A 및 포르말린으로 불활성화된 인플루엔자 B의 1:10 희석비로 희석된 항원을 사용한다. 이 평가에 사용된 항체는 사용된 표면 유형에 대한 최적 분석 성능을 기초로 하여 선택한다. 분석 표면에서 반응성 영역은 바람직한 방법으로 모노클로날 항-인플루엔자 A 항체 또는 모노클로날 항-인플루엔자 B 항체를 표면에 각 분석 표면이 1개의 인플루엔자 A 반응성 영역 및 1개의 인플루엔자 B 반응성 영역을 함유하도록 스트라이핑(striping)함으로써 만든다. 표면을 건조시키고, 실온에서 방부제 용액으로 그 위에 코팅한다. 항체 표면은 히트-스택킹(heat-staking) 설비를 사용하여 용액이 다공성 표면을 통해 또는 그 주위를 흐르도록 하는 폴리스티렌 고리에 열밀봉한다. 플라스틱 고리는 취급을 용이하게 하는 지지물을 제공하고, 다공성 표면으로부터 유체를 제거하여 다공성 표면의 건조를 돕도록 진공원 위에 다공성 표면을 올려놓는 수단을 제공한다. 이 실험의 목적상, 분석은 플로우-쓰루(flow-through) 방식으로 수행한다. 플로우-쓰루는 샘플이 분석 표면과 접촉하고, 분석 절차 동안 그를 통해 또는 그 위로 또는 그 주위를 흐르는 것을 가리킨다.
이 실험은 세포 배양 배지(EMEM, Bio Whittaker Cat.#12 136Q)가 본 발명의 안정화 희석제의 한 성분으로서 항원의 안정성을 증진시킬 수 있는지를 시험한다. 4 개의 시험 용액을 제조한다: (A) 75% 본 발명의 희석제, 12.5% EMEM 및 12.5% 스타빌코트 완충제, (B) 용액 A (이 경우에는, EMEM이 추가로 2% FCS, 1% L-글루타민 및 0.5% 펜스트렙/펀지존(PenStrep/Fungizone)(항미생물 용액, Bio Whittaker Cat. #17-745H)을 함유함), (C) 75% 본 발명의 희석제 및 25% 스타빌코트 희석제, 및 (D) 본 발명의 희석제만. 각 시험 희석제로 먼저 1:4 희석액을 만들고, 이어서 1:2.5 희석액을 만듬으로써 4 개의 희석제 각각에 불활성화된 인플루엔자 B 스톡 현탁액의 1:10 희석액을 제조한다. 각 용액을 제3일 4℃에서 및 제3일 45℃에서 시험한다. 용액 A가 3일 45 ℃에서 가장 좋은 안정성을 나타내고, 그 다음으로 용액 B, D 및 C 순이다. 이 결과는 점증적으로 희석되는 항원 조건 하에서 희석제에 세포 배양 배지/스타빌코트(등록상표)를 포함시키는 것이 항원 안정성을 증진시킨다는 것을 가리킨다(용액 A에서의 안정성과 용액 D에서의 안정성 비교). 높은 농도의 스타빌코트(등록상표) 완충제를 유일한 다른 성분으로서 이용하는 경우(용액 C)는 항원 안정성에 해로운 것으로 입증된다(용액 A와 비교).
따라서, 이 결과들은 본 발명이 수성 매질 중의 단백질 항원, 특히 인플루엔자 항원을 안정시킬 수 있는 능력에 있어서 다른 희석제를 훨씬 능가한다는 것을 명백하게 가리킨다.
다음 실시예는 예시를 위해 제공된 것이지 제한하기 위해 제공된 것이 아니고, 본 발명의 여러 면 및 실시태양을 더 예시하기 위한 것이다. 실시예는 범위를 제한하는 의도가 전혀 없다.
<실시예 1>
1X 둘베코 PBS, 0.05% 트윈-20 세정제, 2% BSA, 0.01% 마이크로사이드 II 방부제 및 0.5% 겐타마이신 술페이트를 포함하는 단순 단백질 희석제(PBT)에서 항원 안정성을 평가하였다. 먼저, 불활성화된 인플루엔자 바이러스 현탁액 스톡을 다음과 같이 제조하였다. 유착 MDCK p83 세포를 인플루엔자 A(플라스크 당 1:10000 희석비의 A/홍콩 68) 또는 인플루엔자 B(플라스크 당 1:1000 희석비의 B/파나마 45/90)로 감염시키고, 이글 MEM 유지 배지(maintenance medium)(2% 열불활성화된 FCS, 1% L-글루타민 및 0.5% 펜/스트렙/펀지존) 중에서 90-100% CPE(세포병변 효과)가 관찰될 때까지 성장시켰다. 보어텍싱(vortexing)에 의해 바이러스를 수거하고, 이어서 세포 현탁액을 원심분리시켰다. 이와 같이 하여 얻은 상징액에 37% 포름알데히드 용액(Sigma Chemical, F-1268)을 총부피의 0.2%(2 ㎕/㎖)가 될 때까지 첨가함으로써 상징액을 불활성화시키고, 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 이어서, 바이러스 함유 용액을 동량의 스타빌코트(등록상표) 완충제(BSI, Inc.)와 혼합하고, 분취해서, 즉시 사용하거나 또는 냉동시켰다.
불활성화된 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 바이러스 현탁액 스톡을 1 ㎖의 불활성화된 인플루엔자 A 스톡을 1 ㎖의 단순 희석제에 첨가하고, 별도의 용기에서 0.5 ㎖의 불활성화된 인플루엔자 B 스톡을 1.5 ㎖의 단순 희석제에 첨가함으로써 단순 BSA 희석제에 각각 1:2 및 1:4로 가하였다. 이 희석비에서, 시험 희석액은 각각 전체적으로 50% 희석제, 25% ICC 및 25% 스타빌코트(등록상표) 완충제, 또는 75% 희석제, 12.5% ICC 및 12.5% 스타빌코트(등록상표) 완충제를 함유하였다. 그 다음, 이렇게 하여 얻은 용액을 양성반응을 위한 플루 오이아(FLU OIA, 등록상표) 시험 키트(Biostar Inc.)로 제0일에 시험하였다. 시험은 포장된 설명서에 따라 수행하였고, 반응된 플루 오이아 시험장치를 시각적으로 해석함으로써 다음과 같이 신호 질 또는 양성반응 정도를 평가하였다:(0) 음성; (1) 모호함; (2) 매우 약한 양성; (3) 매우 약한 양성 내지 약한 양성; (4) 약한 양성; (5) 약한 양성 내지 중간 양성; (6) 중간 양성; (7) 중간 양성 내지 강한 양성; (8) 강한 양성. 신호가 2 - 8로 분류되면 양성인 것으로 보았다.
희석 후, 각 용액을 두 부분으로 나누었다. 하나는 4℃에서, 다른 하나는45℃에서 3일 동안 저장하였다. 4개의 용액 모두를 제0일에서와 동일한 방식으로 제3일에 재시험하였다. 제0일 4℃ 대조구는 예상되는 적당한 양성 신호를 나타내었다. 불활성화된 인플루엔자 B는 제3일 45℃에서 양성반응을 모두 잃었고, 불활성화된 인플루엔자 A는 그의 양성반응의 일부를 잃었다. 시약의 열화 때문에 그 후 시점에서는 시험하지 않았다. 대표적으로, 시약 개발에 있어서, 45℃에서 3일간 양성반응을 보유하는 것은 저온에서의 장기간 안정성을 평가하는 데 적합하다. 시약이 45℃에서 활성을 더 오랫동안 유지하는 것은 저온, 예를 들면 2 - 8 ℃ 및 실온에서의 안정성과 상관있다. 따라서, 이 단순 PBT 제제는 항원 안정성을 목적하는 정도까지 유지시키지 못하였다.
<실시예 2>
항체 코팅된 표면을 보호 및 안정화시키도록 제제화된 상업적으로 입수가능한 희석제인 스타빌코트(등록상표) 완충제(BSI, Inc.)를 실시예 1에 기재된 바와 같이 시험하되, 단, 여기서는 시약을 제0일 및 제4일(4℃ 및 45℃ 저장조건)에 시험하였다. 희석제의 완전 조성은 75% 스타빌코트 완충제 및 25% ICC이라는 점을 유의한다. 스타빌코트는 제4일을 지나서는 불활성화된 인플루엔자 B 항원의 안정성을 유지할 수 없었고, 이는 그것이 장기간 저장 가능성이 결여되었음을 가리킨다.
<실시예 3>
그 다음, 본 발명의 시약 조성물을 실시예 1에 기재된 것과 유사한 실험으로 시험하였다. 희석제는 다음과 같이 20 ㎖ 부피로 만들었다. 원추형 관에 1M 인산나트륨 완충제 2 ㎖ 및 dH2O 8 ㎖를 첨가하고(100mM), 혼합하고, pH를 7.5로 조정하였다. 다음, 0.175 g NaCl(150mM)을 첨가하고 혼합하였다. 이어서, 0.1 ㎖의 10% 트윈-20 용액(0.05%)를 첨가하고 혼합하였다. 이어서, 0.2 ㎖의 1% 마이크로사이드 II 방부제 스톡(0.01%) 및 0.1 ㎖의 겐타마이신 술페이트(0.5%)를 관에 첨가하고 잘 혼합하였다. 이어서, 2 ㎖의 글리세롤(10%) 및 1 ㎖의 태아 상태 송아지 혈청(5%)를 첨가하고 혼합하였다. 이어서, 0.4 ㎖의 500 mM EDTA/dH2O (10 mm) 혼합물 스톡을 첨가하고 혼합하고 pH를 7.5로 조정하였다. dH2O로 총 부피가 20 ㎖가 되도록 하였다.
5 ㎖의 희석제를 5 ㎖의 불활성화된 인플루엔자 A 바이러스 스톡에 첨가하거나(1:2 희석비), 또는 7.5 ㎖의 희석제를 2.5 ㎖의 불활성화된 인플루엔자 B 바이러스 스톡에 첨가함으로써(1:4 희석비) 바이러스 시험 시약을 만들고, 잘 혼합하였다. 이 경우, 희석제의 완전 조성물은 불활성화된 인플루엔자 A에 대해서는 50% 희석제, 25% ICC 및 25% 스타빌코트(등록상표) 완충제를 함유하였고, 불활성화된 인플루엔자 B에 대해서는 75% 희석제, 12.5% ICC 및 12.5% 스타빌코트(등록상표) 완충제를 함유하였다. 연구하는 동안 각 시험 시약에 대해 포장된 설명서에 따라 플루 오이아 시험을 수행하였다. 이 실험은 항원 안정성의 증진 때문에 21일까지 수행하였다. 제3일 45℃에서, 불활성화된 인플루엔자 A 및 B 모두 양성반응을 약간 잃었지만, 여전히 명백하게 양성이었다. 불활성화된 인플루엔자 B 시약을 제7일, 제14일 및 제21일에 평가하였다. 결국, 제21일 45℃에서, 불활성화된 인플루엔자 B는 양성반응을 모두 잃었다. 불활성화된 인플루엔자 A는 다른 연구에서도 이 정도의 기간 후에 그의 활성의 상당 부분을 잃는 것으로 나타났다. 분석 결과를 다음과 같이 0 - 8의 주관적인 등급으로 시각적으로 해석하였다: (0) 음성; (1) 모호함; (2) 매우 약한 양성; (3) 매우 약한 양성 내지 약한 양성; (4) 약한 양성; (5) 약한 양성 내지 중간 양성; (6) 중간 양성; (7) 중간 양성 내지 강한 양성; (8) 강한 양성. 신호가 2 - 8로 분류되면 양성인 것으로 보았다. 본 발명의 희석제에서의 인플루엔자 B의 증진된 안정성이 도1에 나타나 있다.
<실시예 4>
본 발명의 또다른 평가에서는, 양성 대조구가 이러한 대조 용액에 필요한 적당한 신호를 얻기 위해 포르말린으로 불활성화된 인플루엔자 A 및 포르말린으로 불활성화된 인플루엔자 B의 1:10 희석비로 희석된 항원을 사용한 다른 분석에 안정화 희석제를 이용하였다. 불활성화된 바이러스 현탁액 스톡은 실시예 1에서와 같이 제조하고, 안정화 희석제는 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조하였다. 표면이 WO98/18962에 따라 반사성을 제공하는 실리콘 광학층, Si3N4의 반사방지층, 및 다이아몬드류 카본 부착층으로 코팅된 트랙-에칭된(track-etched) 폴리카르보네이트 멤브레인인 광학적으로 제조된 다공성 표면을 코팅하기 위한 항체를 선택하였다. 이 평가에 사용된 항체는 사용된 표면 유형에 대한 최적 분석 성능을 기초로 하여 선택하였다. 분석 표면 상의 반응성 영역은 바람직한 방법으로 모노클로날 항-인플루엔자 A 항체(0.1M HEPES 중의 40 ㎍/㎖, pH 8.0, 1% 수크로스) 또는 모노클로날항-인플루엔자 B 항체 (0.1M HEPES 중의 40 ㎍/㎖, pH 8.0, 1% 수크로스, 150 mM NaCl)를 표면에 각 분석 표면이 1 개의 인플루엔자 A 반응성 영역 및 1 개의 인플루엔자 B 반응성 영역을 포함하도록 스트라이핑하였다. 표면에 바이오제트 (BioJet,등록상표) 기기(BioDot, Inc.)로 스트라이핑하고, 건조시키고, 실온에서 방부제 용액으로 그 위를 코팅하였다. 항체 표면을 히트-스택킹 설비를 사용하여 용액이 다공성 표면을 통해 또는 그 주위를 흐르게 하는 폴리카르보네이트 고리에 열밀봉하였다. 플라스틱 고리는 취급을 용이하게 하는 지지물을 제공하고, 유체를 다공성 표면으로부터 제거하여 다공성 표면의 건조를 돕기 위해 진공원 위에 다공성 표면을 올려놓는 수단을 공급한다. 코팅된 표면을 사용전 2 - 8 ℃에서 저장하였다. 이 실험의 목적상, 플로우-쓰루 방식으로 분석을 수행하였다. 플로우-쓰루는 샘플이 분석 표면과 접촉해서, 분석 과정 동안 그를 통해, 그 위를 또는 그 주위를 흐르는 것을 가리킨다.
이 실험은 세포 배양 배지(EMEM)가 본 발명의 안정화 희석제의 성분으로서 항원의 안정성을 증진시킬 수 있는지를 시험하였다. 4개의 시험 용액을 제조하였다: (A) 75% 본 발명의 희석제, 12.5% EMEM, 및 12.5% 스타빌코트 완충제, (B) 용액 A(이 경우에는, EMEM가 2% FCS, 1% L-글루타민, 및 0.5% 펜스트렙/펀지존을 추가로 포함함), (C) 75% 본 발명의 희석제 및 25% 스타빌코트 희석제, 및 (D) 본 발명의 희석제만. 불활성화된 인플루엔자 B 스톡 현탁액의 1:10 희석액은 4개의 희석제 각각에 먼저 1:4 희석액을 만든 후, 1:2.5 희석액을 만듬으로써 제조하였다. 4개의 용액 각각(30 ㎕)을 추출 시약 165 ㎕를 함유하는 각 시험관에 첨가하고 1분동안 배양하였다. 각 샘플 전체를 상기 표면 위에 옮기고, 3분 동안 배양하였다. 이어서, 접합체(HRP와 접합된 항-인플루엔자 A 항체와 HRP와 접합된 항-인플루엔자 B 항체가 혼합된 것) 100 ㎕를 추가로 3분 동안 그 표면 위에 두었다. 그 다음, 표면 밑에 진공을 가하여 표면을 통해 및 표면으로부터 샘플/접합체 믹스를 빼내었다. 표면 위에 수성 세척액을 놓고 그것이 표면을 통해 흐르게 함으로써 3회 세척하고, 진공 압력 하에서 건조시켰다. 진공을 끄고, 침전하는 TMB 기질 75 ㎕를 분석 표면 위에 놓고, 6분 동안 배양하였다. 기질을 표면을 통해 끌어당기고, 표면을 한번 세척하고, 상기한 바와 같이 건조시켰다. 이어서, 실시예 3에서처럼 분석 신호를 해석하였다.
각 용액을 제3일 4℃에서 및 제3일 45℃에서 시험하였다. 3일 45℃에서는 용액 A가 가장 좋은 안정성을 나타냈고, 그 다음으로 용액 B, D 및 C 순이었다. 이 결과는 점증적으로 희석되는 항원 조건 하에서 희석제에 세포 배양 배지/스타빌코트(등록상표)를 혼입시키는 것이 항원 안정성을 증가시킨다는 것을 가리킨다(용액 A에서의 안정성과 용액 D에서의 안정성 비교). 유일한 다른 성분으로서 더 높은 농도의 스타빌코트(등록상표) 완충제를 이용하는 것(용액 C)은 항원 안정성에 해롭다는 것을 입증하였다. 도2는 상기 실험에서 얻은 결과를 보여준다.
이 결과는 본 발명이 수용액 중의 단백질 항원, 특히 인플루엔자의 항원을 안정화시키는 능력에 있어서 다른 희석제를 크게 능가한다는 것을 명백히 알려준다. 위에서 언급된 각 참고문헌, 특허 또는 특허출원은 그 전체 내용을 참고로 본원에 포함시킨다.
본 발명의 바람직한 실시태양을 설명하였지만, 당업계 숙련자는 본 발명의 정신 및 첨부된 특허청구 범위에서 벗어남이 없이 다양한 변화, 적용 및 변경을 가할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
Claims (42)
- 완충제, 블록킹제, 가용화제, 염, 킬레이트화제, 세정제 및 방부제를 포함하는 최종 pH가 7.5 내지 8.5인 수성 시약 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 블록킹제가 혈청인 수성 시약.
- 제2항에 있어서, 상기 블록킹제가 태아 상태 송아지 혈청인 수성 시약.
- 제1항에 있어서, 상기 가용화제가 글리세롤인 수성 시약.
- 제1항에 있어서, 상기 염이 염화나트륨인 수성 시약.
- 제1항에 있어서, 상기 킬레이트화제가 EDTA인 수성 시약.
- 제1항에 있어서, 상기 세정제가 트윈 20(Tween 20)인 수성 시약.
- 제1항에 있어서, 상기 방부제가 트리메틸테트라데실암모늄 브로마이드 및 겐타마이신인 수성 시약.
- 제1항에 있어서, 상기 완충제가 인산나트륨인 수성 시약.
- 제1항에 있어서, 상기 완충제가 인산나트륨이고, 상기 블록킹제가 태아 상태 송아지 혈청이고, 상기 가용화제가 글리세롤이고, 상기 염이 염화나트륨이고, 상기 킬레이트화제가 EDTA이고, 상기 세정제가 트윈 20이고, 상기 방부제가 트리메틸테트라데실암모늄 브로마이드 및 겐타마이신인 수성 시약.
- 제1항에 있어서, 조직 배양 배지 또는 조직 배양 배지들 및 스타빌코트(Stabilcoat,등록상표) 완충제를 더 포함하는 수성 시약.
- 제10항에 있어서, 상기 조직 배양 배지가 이글 최소 필수 배지인 수성 시약.
- 제1항에 있어서, 50 mM - 100 mM 인산나트륨, 2% - 20% v/v 태아 상태 송아지 혈청, 2.5% - 10% v/v 글리세롤, 50 mM - 2M 염화나트륨, 10 mM - 15 mM EDTA, 0.05% - 0.1% v/v 트윈-20 세정제, 0.01% w/v 트리메틸테트라데실암모늄 브로마이드 및 0.5% w/v 겐타마이신 술페이트를 포함하는 최종 pH가 7.5 내지 8.5인 수성 시약.
- 완충제, 블록킹제, 가용화제, 염, 킬레이트화제, 세정제 및 방부제를 포함하는 최종 pH가 7.5 내지 8.5인 수성 시약에 항원 또는 폴리펩티드를 넣는 것을 포함하는 용액 중의 항원 또는 폴리펩티드를 안정화시키는 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 블록킹제가 혈청인 수성 시약.
- 제15항에 있어서, 상기 블록킹제가 태아 상태 송아지 혈청인 수성 시약.
- 제14항에 있어서, 상기 항원 또는 폴리펩티드가 미생물로부터 유래한 것인 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 미생물이 바이러스인 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 미생물이 세균인 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 바이러스가 인플루엔자인 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 인플루엔자가 인플루엔자 B인 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 항원이 폴리펩티드인 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 핵단백질인 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 수성 시약이 조직 배양 배지 또는 배지들을 더 포함하는 것인 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 조직 배양 배지가 최소 필수 배지인 방법.
- a) 완충제, 블록킹제, 가용화제, 염, 킬레이트화제, 세정제 및 방부제를 포함하는 최종 pH가 7.5 내지 8.5인 수성 시약에 항원 또는 폴리펩티드를 넣고,b) 분석 방법을 이용하여 상기 항원 또는 폴리펩티드를 검출하는것을 포함하는, 수용액 중의 안정화된 항원 또는 폴리펩티드를 검출하는 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 블록킹제가 혈청인 수성 시약.
- 제27항에 있어서, 상기 블록킹제가 태아 상태 송아지 혈청인 수성 시약.
- 제26항에 있어서, 상기 분석 방법이 면역분석인 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 면역분석이 효소 면역분석인 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 면역분석이 광학 면역분석인 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 분석 방법이 핵산 혼성화 방법인 방법.
- 분석 방법에 의해 검출되는 항원 또는 폴리펩티드를 함유하여 안정화시키기 위한, 완충제, 블록킹제, 가용화제, 염, 킬레이트화제, 세정제 및 방부제를 포함하는 최종 pH가 7.5 내지 8.5인 수성 시약 조성물.
- 제33항에 있어서, 상기 블록킹제가 혈청인 수성 시약.
- 제34항에 있어서, 상기 블록킹제가 태아 상태 송아지 혈청인 수성 시약.
- 제33항에 있어서, 상기 항원 또는 폴리펩티드를 더 포함하는 수성 시약.
- 제36항에 있어서, 상기 항원 또는 폴리펩티드가 미생물로부터 유래한 것인 수성 시약.
- 제37항에 있어서, 상기 미생물이 바이러스인 수성 시약.
- 제37항에 있어서, 상기 미생물이 세균인 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 바이러스가 인플루엔자인 수성 시약.
- 제40항에 있어서, 상기 인플루엔자가 인플루엔자 B인 수성 시약.
- 제36항에 있어서, 상기 항원이 핵단백질인 수성 시약.
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