TWI257953B

TWI257953B - Stabilizing diluent for polypeptides and antigens

Info

Publication number: TWI257953B
Application number: TW089126738A
Authority: TW
Inventors: Jeffrey W Steaffens; Laura Panzarella
Original assignee: Thermo Biostar Inc; Asahi Kasei Corp
Priority date: 1999-12-14
Filing date: 2001-03-07
Publication date: 2006-07-11
Also published as: CN1409758A; CA2396503A1; JP2003517153A; DE60019458T2; EP1242576B1; EP1242576A1; DE60019458D1; KR100771294B1; ATE293159T1; AU783246C; US20020160359A1; US20020076813A1; CN1286969C; AU2075001A; KR20020082206A; JP3884652B2; WO2001044441A1; AU783246B2; US6579688B2

Description

1257953 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ~_B7________ 五、發明說明（1 ) " 愛技術範圍_ 〜本發明係關於有效穩定多肽和抗原之水溶液組合物。穩夂^肽和抗原有效於分析方法如抗原—專一性偵測，以^ 其Έ：須要穩定水溶液中此成分之醫藥用途。背景下列爲潛在關於本發明之文獻討論。然而，本文討論之參考文獻並非爲先前技藝。、穩定水溶液中多肽和抗原通常很困難。例如，該溶液在室溫下，放，期後會導致水溶液中多肽或抗原‘品質惡化。特別ϋ實了細菌、病毒和其它微生物之抗原保存在水溶液基質中會不穩定。一實例是被膜病毒，如正黏液病毒科（〇i：th〇myXovirus famil y)流行性感冒病毒，其抗原在廣之^溫度範圍下超過時間後便在溶液中解降。相關技藝 ^叙技術也難以穩定溶液中不同細菌抗原，例如，某些毒素。爲避免水溶液品質惡化，熟諳此藝者使用冷凍乾燥法和冷凍方法來保存多肽或抗原。果然，燥法和冷康法註實了在水溶液保存此等成分之難。 ^許多相關技藝文獻揭露重要成果關於增加冷凍乾燥劑穩疋性及此部分相關技術之固有困難。例如，美國專利案 4’496,537 ’ 及全球專利 pcT 申請案 97/G48〇i = 揭路々凍乾燥法技術之改良。然而，含蛋白質溶液之冷凍乾燦法對製造商和最終使用者而言必須花費較多和不方便並且會引導增加重建誤差和污染之危險。而且，冷凍

本紙張尺度巾ίϋ?票準(CNS)A4£格(210X H ϋ in n ϋ n 一。ν I n —1 1 I I I Hi I . (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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-4- 1257953 A7 一 --------—~--- 五、發明說明（2 ) 溶液須要特殊儀器和重複循環發生時最後導致蛋白質解降。對商業用途而T，水溶液中多肽和抗原品質惡化要付出極大代價，因爲該溶液僅在短暫保存期後就須要置換。本發明關於水溶液穩定劑或稀釋液以增加多肽和其它溶液中非蛋白質化合物之穩定性。抗原如碳水化合物、蛋白質、脂蛋白、脂多醣、多醣、核酸、核蛋白，和碳水化合物複合蛋白質、脂質、和其它化合物爲使用本發明穩定抗原之種類實例。因爲使用新穎試劑化合物，本發明改良了一般市售稀釋液或相關技藝敘述之稀釋液中多肽和抗原穩足性。本發明特別有效穩定抗原和多肽，以當作診斷性測試之控制組試劑或其它須穩定水溶液中此等成分之用途。本發明％定稀釋液有效穩定多肽和抗原以長期保存在約2 °C-8°C，室溫和溫度約45°C。全球專利PCT申請案99/ 1 5901揭露用於穩定抗原之稀釋液，特別針對C型肝炎病毒（HCV)抗原。HCV稀釋液包含還原劑以維持HCV抗原在還原狀態。該文獻報告稀釋液包含還原劑可維持HCV抗原免疫活性最多達七天。該報告之稀釋液進一步包含磷酸鈉、ρΗ 6·5(或其它緩衝劑），edta (或其它螯合劑）、DTT(或其它還原劑）、明膠（或其它蛋白經濟部智慧財產局員工消費合作社印製阻辦來源）、硫氰酸銨（或其它促溶劑），三氮化納（或其它防腐劑）、和SDS(或其它清潔劑）。然而，在稀釋液中包含還原劑可能無益於甚至會惡化許多來自其它微生物之抗原穩定性。美國專利案4,956,274關於技術在互補測試以穩定來自貝 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐） 1 ~- --· 1257953 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明說明（3 ) :-半安乳糖菩⑽.gal aetGsidase)之多"斷。揭露於美國專利末=956,274(落夜包括離子性界面活性劑或衍生自糖類殘餘基之界面活性劑可诘蟮目仙φ 』4、是貝他+乳糖荅酶多肽片斷降。然而，界面活性劑也會使酵素片斷變性，因此必須移除或中和使得酵素片斷回復其正確結構並恢復酵素活性，所以指出該溶液不能穩定蛋白質之自然型態。於測試前使用餐糊精中和界面活性劑。或者，以高濃度血清遮蔽界面活性劑作用。該揭露試劑額外成分包括整合劑、緩衝劑、殺菌劑、鎂或其它離子、還原劑、穩定劑如溶劑如乙二醇、和非—離子性清潔劑。然而熟暗此技藝者讚賞變性和復性蛋白質或酵素片斷時，有可能損害抗原性決定基而呈現減能。吴國專利案5,459，G33敛述溶液有效抑制病毒聚集。據報導泫/今液含正代十一醯甲胺基乙酸或其它陰離子性界面活性劑。並聲稱該溶液可增加穩定性是基於假設病毒原顆粒，特別是肝炎和皰疹病毒因斥水性吸引產生聚集導致降低活性。此稀釋液並非改善或保存抗原催化活性或免疫性，而疋預防聚集產生。據報導使用溶液前必須培養在2_ 35 C 15小時至1〇天以確保一致穩定性，所以給其最終產品之製造可能性增添很大的限制。美國專利案5,660,978揭露穩定抗原之方法，針對不安定蛋白抗原，特別是酵素，藉合併濃縮抗原（如血清）溶液，抗原-專一性抗體或其蛋白質（特別是Fab)以預防蛋白分解或氧化。對此稀釋液採用血清或非_專一性IgG無法預期提 -6- ^紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(21〔^_7公爱一 ^ - - - - ----^--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1257953 A7 '一 ---:—— 五、發明說明（4 ) 供所需之保護或保護專一性。此外，穩定化是將抗原置於稀釋液來完成。相較之下，本發明藉由稀釋液本身來穩疋。因此，本發明從一開始便穩定相關稀釋溶液，而非如上述專利建議之階段性。使用抗體在結構上穩定抗原可能產生問題，特別以一或多個抗原決定位爲免疫測試之標的。因此，熟知此項技藝者會遇上困難如果堅持生產如專利案’978所揭露之稀釋液，雖然其在結構上保存抗原，但不會抑制特殊酵素活性。該發明基本上利用抗體部分當作固定試劑，以取代化學固定劑，所以不是眞的描述成^定化稀釋液。蘭地（Landi)，S和海得（Hel d) , HR(結核結節（Tubercl e) % (1978) 121-133)報告添加吐溫（Twea)- 8〇清潔劑至稀釋溶液，並經建議此添加導入清潔劑抗—吸附特質使得結核菌素PPD穩定性增加。結核菌素製備品由柯南特實驗室股份有限公司（Connaught Laboratories，LTD)製作，含結核菌素 PPD，0.3%苯酚（報告指出當作防腐劑），和〇〇〇〇5%吐溫_ 80於PBS中。苯酚是具危險性物質在本發明中不被接受而且可能會使一些蛋白質變性。除了稀釋液配方和冷凍乾燥法保存技術進步外，仍須針對稀釋液適當改善存放在溶液中多種多肽和抗原之長期穩定性，特別是取自微生物之抗原。 1明簡述本發明特指試劑用來穩定多肽和抗原。該試劑特別有效穩定分析程序中控制組或參考組之抗原。抗原如碳水化合 I l· ‘ -------^--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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五、發明說明（5 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製物虫白貝夕肽、多肽片斷、脂蛋白、脂多醣、多醣、核鲅、核蛋白，和碳水化合物複合多肽、脂質、和其它化合物爲使用本發明來穩定抗原之種類實例。 /、本揭L 4浏針對多狀和抗原穩定性在低溫和高溫上優於先前配方。能將多肽和抗原以溶解狀態存放在試劑中保持長期在不同溫度從約0·5Χ：至超過約5(rc，較佳從約2-8 c，約室溫（一般從約23Ό至約28Ό，25。〇爲特別佳）和约、，力3 C，特别約4 5 C。試劑在4 5 °C穩定性能預測試釗％疋性以提供長期抗原穩定性。因此針對穩定多肽和抗原目的，本揭露試劑具有單一水溶液之優點。首先，本發明特指水溶液試劑組合物以增加多肽或抗原穩足性。在特定較佳實施例中，試劑包含一或多種下列成分：緩衝劑、阻斷劑、溶劑、鹽類、螯合劑、清潔劑、和防腐劑。試劑較佳不含N_十二醯基—N_甲基甘胺酸或癸醯基N甲基％)糖酸安（N-methylgluconamide)。試劑也可包含成分如組織培養基或市售稀釋液。本文中專有名詞”緩衝劑”指相關技藝已知之組合物，其作用將溶液PH値變化最小化。較佳緩衝劑pKa提供有效緩衝力在pH値7和9之間。較佳緩衝劑爲ACES，ADA，BES，二甘氨酸’雙—三羥甲基氨基甲烷緩衝劑，CApS， CHES ’丙一酸二乙基g旨，甘胺酿甘胺酸、甘胺酿胺、鹽 fe、HEPES、HEPPS、咪口坐、MES、MOPS、PIPES、 POPSO、TAPSO、TES、N-三（羥甲基）甲基甘氨、三羥甲基氨基甲烷緩衝劑、雙碳酸鹽、和硼酸。特別佳是憐酸緩 -8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ILTIILIIIII - 1 I I I I I I · I n —— — — — — (請先閱讀背面之注意事頊存填寫本 1257953 A7 B7 五、發明說明（6 衝劑。較佳緩衝劑濃度少 ττ、也— 乂於2吴耳濃度；最佳濃度异〇 9苗耳濃度、0.1莫耳濃度、〇卜又疋0.2旲。.〇1莫耳濃度、〇.。。5、。广、。.°2旲耳濃度、 -7,5.,5.,75.8；； ·〇〇〇1^^-^ΡΗ^ 6 8.25、8·5、8.75、和 9。本文中專有名詞”阻斷南丨"4匕 ^人 7 .. 斷d才曰一畐含蛋白來源含蛋白皙 /或多肽混合物，其也可戈句貝和石反水化合物、鹽類、釦丑 j曰貝 ^ ^ 和共因子如血基質。專有名詞”舍八 :4;„本文中。此阻斷劑可用來穩定本文敘：: 组，物和万法中_或多種蛋白f、多肽、和/或佳，劑具”_约65至約8。之間… 250 土約350 ¾洛質濃度/公斤水。特別佳阻、如馬血清、新生小丰^、主 ,^ ^ 生 s ^生】牛血清、小牛血清、成牛血清、人血 >,、兔子血清、羊血清等，和相關技藝已知之血品。最佳阻斷劑是胎牛血清。本又中專有名詞，，富含蛋白質，，指溶液中含蛋白皙和/戈多肽，混合物，具有總蛋白質濃度約1 g%至約50 g%之間，最佳是在約3 g%和約10 g%之間。例如，胎牛血清具總蛋白質含量約3 g%和約4.5 g%之間，而成牛血清具總蛋白含量在4· 5 g%和約8 · 5 g%之間。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本文中專有名詞”溶劑"和”溶解化劑”指液態物質能夠分散其L組合物之成分。較佳溶劑是水、甘油、Dms〇、酒精如乙醇、甲醇等、丙酮、曱亞颯、乙腈、和二甲基甲醯胺。本文中專有名詞"鹽類”指一或多種化合物得自酸類部分 -9 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1257953 A7 --- ----—___B7 五、發明說明（7 ) 或全部酸性氫被金屬或作用像金屬之元素取代。較佳鹽類疋氯化鉀、氯化鈉、氯化鎂、硫酸鎂、和氯化鈣。較佳鹽類濃度在4莫耳濃度和^丨毫莫耳濃度之間，最佳在2莫耳濃度和50毫莫耳濃度之間。本文中專有名詞”螯合劑”指一分子和金屬離子結合，通系藉由分子中二或多個複雜基團結合。螯合劑於相關技藝中熟知，並且包括特定蛋白質和多肽，以及小分子如乙二胺四乙酸（EDTA)和乙二醇基—二胺乙醚>N，N,N，，N，_w 乙酸（EGTA)。較佳螯合劑濃度在1〇〇毫莫耳濃度和〇〇1毫莫耳濃度之間，最佳在20毫莫耳濃度和1毫莫耳濃度之間。本文中專有名詞’，清潔劑”指相關技藝已知之化合物，其能夠乳化油類並作用如溼潤劑。較佳清潔劑包括CHAPS、膽汁酸、去氧膽汁酸、地芰皀寧、n-十二基-々-D_麥芽糖甞、去氧甘膽汁酸、n-十二醯基肉胺酸酯、十二基硫酸酉旨、皂甞、吐溫20、和川酮（triton) X- 1 00。較佳清潔劑濃度在約0.001%至約5%之間。最佳組合物含約0.01%、 0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、 0.09%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、1.0%、和 2%。本文中專有名詞”防腐劑，，指熟知此項技藝者已知之化合物，其預防微生物生長。較佳防腐劑包括乙基硫汞水楊酸鈉、花楸酸、丁基羥基苯甲醚（BHA)、2,6-二-第三丁基-對-甲盼（BHT)、殺微生物劑Π (Microcide 11)(溴化三甲基四癸基铵）和抗生素如正大黴素、青黴素、鏈黴素等。較佳 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 1 裝訂---------

1257953 A7 五、發明說明（8 ) 防腐劑濃度在10%和0.001毫莫耳濃度之間，最佳介於1%和 0.1%之間。本文中多肽’’指氨基酸聚合物並非指產物特殊片斷，因此胜肽、寡肽、蛋白質、和其片斷都涵蓋在定義中。專有名Θ夕肽不排除多肽後-轉譯修飾，例如酷化、乙酿化、磷酸化，及其類似反應。本文中’’抗原’’包括碳水化合物、蛋白質、多肽、脂蛋白、脂多醣、多醣、核酸和碳水化合物複合多肽、脂質、和其它化合物。抗原能夠對具有功能性免疫系統之動物引出免疫反應。在較佳實施例中，穩定化抗原是多肽抗原。這些多肽抗原可單獨存在或和其它分子聯結。在特別佳實施例中，穩足化多肽是核蛋白抗原。核蛋白抗原可來自數個來源且可單獨存在或和其它分子聯結。 π核蛋白抗原’，意指任何多肽聯結或附在核複合物上。特別佳核蛋白是來自流行性感冒病毒，特別是流行性感冒病毒Β型之核蛋白。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ’’抗原穩定性"意指在設定溫度特定期間試劑在保存後維持一致訊號之能力以用於測試或分析方法中，特別是診斷測试或免疫測試。一般保存溫度是從約_ 3〇〇c。藉高⑻ 車父短期間測量抗原品質惡化也可評估抗原穩定性。針對择進穩定性測試一般溫度是從約30。〇至6〇°c。曰 π微生物’’意指原核生物、眞核生物如酵母菌、病毒、朊病毒或其它感染性粒子。 "分析方法”指任何技術允許一或多種抗原之特殊測試。 -11 本紙張尺度適用中國國豕標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 1257953 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（9 分析方法包括任何測試型式之免疫測試和核酸雜交、以及相關技藝已知之數種實例。特別佳光學免疫測試方法已敘述在美國專利案 5,550,〇63 ; 5,955,377 ;和 5,541,〇57。第二方面，本發明特指水溶液試劑組合物以增加抗原或 :肽穩定性，纟中抗原來自微生物。在—較佳實施例中，微生物包含病毒和/或細菌。本發明特別佳用於病毒分析。最特別佳實施例，本發明特指一試劑組合物用於移定抗原和多肽取自流行性感冒病毒，特別是取自流行性感冒病毒B之多肽和抗原。第三方面，…月特指-試劑組合物顧I定流行性感冒病毒之核蛋白，特別是流行性感冒病毒B之核蛋白。第四方面，本發明特指水溶液試劑組合物以穩定抗原製劑於分析方法中當作控制組或參考試劑。一特別佳實施例中，試劑包含緩衝劑、阻斷劑、鹽類、螯合劑、溶解化劑、非—離子性清潔劑、和防腐劑。試劑最佳不含N—十二醯基—N—甲基甘胺酸或癸醯基—N—甲基葡糖醯胺。一更佳實施例中，試劑也包含組織培養基，史塔必寇特@ (Stabil Coat，緩衝劑（BSI股份有限公司），和含福馬林—滅能病毒細胞培養基。其^更佳貫施例中，試劑包含嶙酸鈉緩衝劑、胎牛血清、甘油、氯化鈉、EDTA、吐溫-20®清潔劑（聚氧乙烯花楸糖單月桂酸酯）、殺微生劑Π®防腐劑（四級胺化合物；亞雷斯可（Amresco)，E423)、正大黴素硫酸鹽，以及可 12- 本紙張尺度顧+目國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公髮）裝--------訂--------#丨 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1257953 A7 -- ---—— B7_____ 五、發明說明（10 ) 糖、組織培養基和史塔必寇特®緩衝劑（Bsi股份有限公司）。溶液pH値在約7和約9之間，最佳在7.5和8 5之間。熟知此項技藝者知曉類似試劑能取代上述所列者。例如， EDTA可以用EGTA取代，和殺微生物劑η®或正大黴素可用其它抗菌劑替代。上述試劑之較佳濃度如下：對磷酸鈉而言，0.1毫莫耳濃度至1000毫莫耳濃度，更佳是}毫莫耳濃度至200¾莫耳濃度，最佳是50毫莫耳濃度至1〇〇毫莫耳濃度；對胎牛血清而言，〇.1%至40%體積/體積，最佳是2〇/〇至20%體積/體積；對甘油而言，〇1%至3〇%體積/體積，最佳疋2.5%至10%體積/體積；對氯化鈉而言，毫莫耳濃度至4莫耳濃度，最佳是50毫莫耳濃度至2莫耳濃度；對 EDTA而言，〇·〇ΐ毫莫耳濃度至1〇〇毫莫耳濃度，更佳是1毫莫耳;辰度_±>20毫莫耳濃度，最佳是亳莫耳濃度至I〗毫莫耳；辰度；對吐溫-2 0而言，〇 · 〇〇 1 %至1 %，更佳是〇〇 1 %至 0.1%，最佳是0.5% ;殺微生物劑η而言，〇⑻1%至1%重量 /體積’最佳是0.002%至0.1%重量/體積；對正大黴素硫酸鹽而言，0.01%至1〇%重量/體積，更佳是〇1%至2.5%，最佳疋0.2 5 %至1 % ;和對蔗糖而言，〇 · 〇 1 %至5 %重量/體積，最佳是0.1%至0.5%。特別佳貫施例中，稀釋液包含劑量大於或等於約；5 〇毫莫耳濃度鱗酸鈉；2%體積/體積胎牛血清；1 〇%體積/體積甘油；50毫莫耳濃度氯化鈉；10毫莫耳濃度edta ; 0.05% 體積/體積吐溫-2 0清潔劑；〇. 〇 1 %重量/體積殺微生物劑η 防腐劑；和0.5%重量/體積正大黴素硫酸鹽。來自抗原製 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） C請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1257953 A7 五、發明說明（12 ) 行並且熟暗此藝者可經常用來預測穩定性。執行意義是在高溫培養試劑並在相當短時間間隔進行測試。例如，培養 3至7天在37 C，45°C，或其它高溫，分析時使用阿列紐司氏方程式（Arrhenius equation)去預測試劑是否長期在約2。〇 C中爿十保持％足。一般相信這方法最能正確預測試劑是否失效。如果試劑無法經得起高溫挑戰，其不可能在長時間正¥ 存狀;兄下保持穩定。當不能正確預測衰退率時，南溫穩疋性較無法預測長期穩定性，但可以由確認試劑失效可能時間點而給予穩定性指標。當穩定性喪失在高溫中減少時，就呈現眞實失效之希望。除了加速確效外，也須要實際時間、長期研究去評估試劑穩定多肽和抗原之潛力。熟暗此藝者已知針對實際時_ 研究狀況。例如，實際時間研究狀況包括將試劑保存在正常保存溫度約2°C-8°C或室溫（18X：_3(rc)中，直至試劑失效爲止。主針對流行性感冒病毒，包括福馬林_滅能流行性感冒病毒A和B型態病毒之免疫測試，正性控制組試劑之^展以汗估其在蛋白質基稀釋液中穩定性。在測試中偵測抗原決 ^基時，以病毒核蛋白、減能流行性感冒病毒Α比滅能流行性感冒B病毒在單純稀釋液和市售穩定化稀釋液中明顯更％疋。爲確保偵測流行性感冒病毒八和B之市售新產。商機，意指須要穩定滅能之流行性感冒病毒β。將^ 調配讀與穩定性給予二種滅能流行性感冒病毒懸浮^ 已m實此稀釋液比先前稀釋液配方更具有能力以改善在液本紙張尺度翻中國國家鮮（6Ss)A4規格（21〇1 -I · n ϋ I an —ϋ ϋ t v I ·ϋ ail ϋ ϋ _1 I ^ -^UD (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) -15- 131257953 A7 五、發明說明（經濟部智慧財產局員工消費合作社印製體中滅能流行性感冒病毒B穩定性達較長時期。流行性感冒病毒A顯示能穩定於單純蛋白基稀釋液中。一此種稀釋液含牛血清蛋白（BSA)和吐溫- 20®清潔劑在磷酸鹽緩衝生理食鹽水（PBS)別名PBT。第二種調製品是市售產品，史塔必冠特®緩衝劑（BSI股份有限公司），並已証實说穩足流行性感S病毒A。然而，這些溶液無法穩定流行性感冒病毒B。極像偵測不同株之單株抗體，在測試中執行辨視位在二種核蛋白上不同抗原決定基。這些抗原決定基經滅说和财存狀況受到不同影響。因此，爲測試使用之單株抗體在初始製備時所用免疫原可以不同方式製備，所以傾向產生單株抗體能辨視不同合適之抗原決定基。我們相信本文所述之稀釋液組合物具有類似穩定效果在滅能流行性感冒病毒A核蛋白以及在滅能流行性感冒病毒B核蛋白上。此外，忍爲對其它病毒或細菌蛋白也穩定良好。在病毒滅能和稀釋成每個稀釋型式過程中，値得注意是滅能病毒基本懸浮液成分特質會併入其中。滅能病毒基本懸浮液包含50%福馬林-滅能病毒_包細胞培養基（ICC)和 50%史塔必寇特⑧緩衝劑。每個測試之正性控制組合物包含一些此基本懸浮液體積。 B .新稀釋液之形成新稀釋液配方始於單純蛋白稀釋液、PBT，包含BSA、吐溫-20、和PBS落液。當其能維持或增加減能流行性感冒病毒A之穩定性，對每個單一成分評估其穩定滅能流行性感冒病毒B之能力。抗原製劑穩定性之增加以下列方法來

請先閱讀背之注意事項I 寫裝本 · 頁I 一 I I I I I I訂

-16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱 1257953 A7 ---------— B7___ 五、發明說明（14 ) 評估。馬具有即將上市之控制組試劑的分析測試方法，將滅能病毒物質稀釋成預期之訊號強度。一般來説，根據相關分析方法對控制組試劑選擇低於中央訊號強度。在所選抗原稀釋液中不同試劑組合物立刻以適當分析方法來測 4。不同试劑組合物（包含抗原）被置於不同保存條件下然後以分析方法進行周期性再測試。超過貯存條件範圍後試劑組合物保有初始訊號或僅有初始訊號強度之最少量解降以決定是否增加了穩定性。訊號強度可在定性、定量、光學上評估或藉由使用儀器。成分篩選期間，對pBT稀釋液可行數種修飾。首先，不同阻斷劑、如胎牛血清以取代 BSA。其/人，可添加落解化劑如甘油和螯合物，如edta 或EGTA，以增加穩定性。因此，結論認爲非—離子性清潔劑，如吐溫-20®清潔劑對穩定性是必要的。防腐劑如殺微生物劑II和正大黴素硫酸鹽合併涵蓋在抗微生物劑中。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製一特殊較佳實施例中，所發明稀釋液包含大於或等於5〇毫莫耳濃度磷酸鈉、2%體積/體積胎牛血清、ι%體積/體牙貝甘油、50耄莫耳濃度氣化鈉、5毫莫耳濃度EDTA、 0.05%體積/體積吐溫—2〇清潔劑、〇〇1%重量/體積四級銨化合物、和0.5%重量/體積正大黴素硫酸鹽。來自抗原製劑或由分別添加，試劑也可包含至多丨5 %史塔必寇特®緩衝劑和20%組織培養基。溶液較佳pH値約7.5至約8.5之間。也可以取代緩衝劑和/或鹽類而用預配方組織培養基濃縮液（例如，依果最低基本培養基或來自拜歐懷塔克之杜必寇修飾依果培養基）。 -17- 本紙張尺度而中國國家標準（CNS；)A4規格⑽X 297公髮y 1257953 A7 五、發明說明（15 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製並不期望和特殊理論結釋液可增加多1或抗原制修飾初始稀豐富蛋白質來源，即以她▲、主牛血〉“匕BSA更可提供含其它穩定化物質。甘;：=產物替代純化蛋白。亦可包合劑可經移除陽離子增加^原經由氯鍵增加水合。螯多肚或抗原本身，或；性，因爲陽離子會負面碰撞素活性所須，或可能抑制= 之特定解降酵解降結構或交互影響時，、、主瓦肖f不重要或持抗原或多肽之㈣。^射维持重要二級結構並支 J = 2述單純BSA蛋白稀釋液（ΡΒΤ)中進行首度水準 H平估。一般試劑發展過程，45Χ：正性保持力 f約3天足以評估較低溫長時期穩定性。熟暗此藝者相信同中至多約14天之穩定性表示爲很穩定之抗原。此外， WC時試劑長時間保持活性；即可能在較低溫，如約& 8:c主或Λ溫時能穩定更久。首先，福馬林-滅能流行性感冒病母磕净基本溶液以相關技藝已知之一般方法製作並在下列實例1加以敘述。接著，將流行性感冒病毒Α和流行性感 i病母B減活基本溶液二者分別以丨·· 2和1: 4稀釋比例調製成單純蛋白稀釋液。在這些稀釋溶液中，測試稀釋液分別匕口元王’谷液、5 0 %稀釋液、2 5 % IC C、和2 5 %史塔必寇特、、爰衝劑或7 5 %稀釋液、12 % IC C和12 %史塔必寇特⑧緩劑。這些抗原稀釋溶液選來供給反應測試器之光學檢驗適當正性訊號。二種反應溶液在4°C測試第0天、第3天在45 °C第3天以弗魯歐阿®(FLU 〇ΙΑΘ)測試組（生技之 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

訂

衝中和星 1257953 A7 五、發明說明（16 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ^圳股份有限公司 ^組來執行。減能流行性感冒病毒有正性活性，而仗J U弟3天失去所、而減此“仃性感冒病毒A僅失去邱八甘活性。由於試匈生、、 #刀其正性 ""失效所以不進行接續時間點測Ή。ρτ^ 白稀釋劑在預計、、w声卜n w „ 〒H、J 4。ΡΒ丁蛋、寸魏度上典法維持抗原穩定性。 :外’史’合必寇特®緩衝劑(BSI股份售觀可調配以保護和穩定抗體包裏外表，測)：：原稀釋液如上述。史狀必守祛® ： ^式使用柷 ..,..... 史σ地特-何生又控制組試劑穩定性以万法#估，但排除第G天和第叫代和价保存狀況）測。試點。在這些狀況下稀釋液完全組合物是萬史拔必冠：t衝劑和25%ICC。甚至在組織培養基存在下，史塔必池特..爰衝劍仍無法維#滅能流行性感冒病毒B抗原之穩足性超過第4天，指出其缺乏長期保存潛能。 ^ 本發明試劑組合物以上述方法測試以評估其能。在這案例中，稀釋液完全組合物針對滅能流行性感病毒A含50%稀釋液、25% ICC、和25%史塔必寇特⑧緩劑’且針對滅能流行性感冒病毒B溶液含75%稀釋液 12.5% ICC、和12.5%史塔必寇特®緩衝劑。在45°c第3天滅能流行性感冒病毒A和B二者都失去些微正性反應但，/y 是明顯正性。滅能流行性感冒病毒B試劑在第7天、第14天和第2 1天進行評估。經2 1天在45°C，滅能流行性感冒病 B終於失去所有正性反應。先前研究顯示滅能流行性感病毒A也在第2 1天失去大部分正性反應。在這些特殊測狀況下並沒有示出滅能流行性感冒病毒A之增進數據，

效冒衝仍毒冒因

19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1257953

五、發明說明（17 ) 爲沒有測得其失效。然而，性在這些狀況下可以很合日此机仃性感冒病毒A之穩定在這些或其它測試狀：；：：：：超過物間點。如果能增加滅能流行性感冒：i:二、本發明稀釋液應該也於單_蛋白稀釋液和史於穩定抗原在溶液中保存。 &明組合物更優在本發明其它評估φ 學測試方法。本方法之正性^丨㈣稀釋液用在更敏感光滅能流行性感冒病毒原爲福馬林— 者稀釋成1:1〇之稀釋溶液行性感冒病毒8二 ^ ^ 帝釋/合履，以達到此控制組溶液所須之適 °在此評估中選擇使用之抗體是針對使用之表面種類而，於最佳分析執行。製作測試表面反應區域以較佳方法將单株抗-流行性感冒病毒A抗體或單株抗—流行性感冒病毒^佈至表面成斑紋狀，使得每個測試表面含一個流行性感冒病毒A反應區域和一個流行性感冒病毒B反應區域。在1：溫下將表面乾燥並以防腐溶液塗佈。使用熱—打椿儀器使抗體表面熱固定至聚本乙烯環以容許溶液流經或圍繞多孔表面。爲了本實驗目的，將測試處理以流經方式。"瓦經意指測試過程中樣品接觸並流過、覆蓋、或圍繞測試面。本實驗檢測細胞培養基（EMEM，拜歐懷塔克目錄編號 # 12 136Q)之效能作爲本發明穩定稀釋液成分以增加抗原穩定性。四個檢測溶液製做如下：（A) 75%本發明稀釋液、12.5%£“£“和12.5%史塔必寇特緩衝劑，（3)溶液八， -2 0 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I---.-----"^^裝 (請先間讀背面之注意事項再填寫本頁) tr---------00. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 181257953 A7 五、發明說明（其EMEM額外含2%胎牛血清、1%L-麩胺酸、和〇·5%盤史崔晋/夫巨答（PenStrep/Fungizone)(抗微生物溶液，拜歐懷塔克目綠編號# 17-745H)，（C) 75%本發明稀釋液和25%史塔必寇特稀釋液，和（D)僅具本發明稀釋液。滅能流行性感冒病毒B基本懸浮液之1: 1〇稀釋溶液以四種稀釋液製作，用各別檢測稀釋液先製成丨：4稀釋溶液，再製作1 ·· 2.5 稀釋溶液。每種溶液在4。(；第3天和在45r第3天進行檢測。溶液A在45°C第3天顯示最佳穩定性，接著是溶液B、 D和C。結果指出合併細胞培養基/史塔必寇特⑧至稀釋液在增加稀釋抗原狀況下會增加抗原穩定性（比較在溶液A和在溶液D之穩定性）。以較高濃度史塔必寇特®緩衝劑爲當作唯一其ΈΓ組成分（溶液〇則不利於抗原穩定性（相較於溶液 A)。、所以，結果明顯指出在水溶液中穩定蛋白質抗原之能力上本發明大大地優於本身其它類型稀釋液，特別是流行性感冒病毒。

下例實例提供闡述方式，但不是限制，而是更進一步闡述本發明之不同方面和實施例。實例不在任何方面限定範圍。實例實例1 : 測試抗原穩定性在單純蛋白稀釋液（pBT)，其含丨χ杜必寇PBS、0.05%吐溫_2〇清潔劑、2% BSA、0.01%殺微生物劑II防腐劑、和0.5%正大黴素硫酸鹽。首先，如下製備滅 *21 本紙張尺度適用中國國家鮮（CNS)A4規格do χ 297公髮 1257953 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明說明（19 ) 能流行性感冒病毒懸浮基本溶液。融合MDCK p83細胞以流行性感冒病毒八（1:10,000稀釋八/香港68每錐形瓶）或流行性感冒病毒B(1: 1000稀釋B/巴拿馬45/90每錐形瓶）感染且培養在依果MEM維持培養基（具有2 %熱-滅能胎牛血清、 1% L-麩胺酸、和0.5%盤/史崔普/夫巨容）直至觀察到9〇_ 100% CPE(細胞病變效應）。以劇烈振盪收集病毒接著將細胞懸浮液離心。以添加37%甲醛溶液（西格瑪化學（sigma

Chemical)，F-1268)將所得懸浮物滅能並達〇·2%總體積（2 微升/毫升）且在室溫下培養1小時。然後，含病毒溶液和等量史塔必寇特⑧緩衝劑（BSI股份有限公司）混合、分裝、並使用或立即冷凍。將滅能流行性感冒病毒A和流行性感冒病毒b病毒懸浮基本落液以1: 2和1: 4分別加至單純BSA稀釋液，經添加1毫升滅能泥行性感冒病毒A基本溶液至1毫升單純稀釋液，並在不同容器將〇·5毫升滅能流行性感冒病毒β基本溶液添加至 1.5耄升單純稀釋液中。在這些稀釋溶液中，檢測稀釋液刀别包括其旯整溶液、50%稀釋液、25% ICC、和25%史塔必池特R緩衝劑或75%稀釋液、12.5% ICC、和12.5%史塔必寇特⑧緩衝劑。其次，每個所得溶液在第〇天以弗魯歐阿⑧ 測4組（生技之星股份有限公司）測試正性反應。將測試當作每包裝插入組來執行，而且訊號品質或正性反應以反應弗㈢k阿；^測咨之光學説明評估如下：（〇)負性；⑴少泎’（2)非常微弱正性；（3)正性界在非常微弱和微弱之間（4)彳政正性；（5)正性界在弱和中度之間；（6)中度正 · H ϋ I ϋ ϋ I ϋ ϋ ϋ H ϋ H ϋ ϋ I ί請先閱讀背面之注音？事項#ι填寫本頁)

X 297公釐） 1257953 A7 B7 五、發明說明（性；（7)正性界在中度和強 ^ 9 Qai ^度又間，（8)強度正性結果。訊唬右位在2- 8則被視爲正性。稀釋之後每個溶液分成二部分。 45 °C達3天。四種溶液都万 W。β ^ P在罘3天以第〇天相同方式再檢 /’、J。弟天和4 C控制組得到預期 -^ ^ ^ ^ X, ^ 于j ?一、月艾中度正性訊號。滅能流仃性感S病毒B在45°C第3夭生土以士 "# η、& 罘3天失去所有正性反應，而滅能流灯性感自病母A失去部分正性 , 刀止〖生反應。測試沒有在接婧時間點進行是由於試劑失效。一 t I忒剡喬展上，正性反應保留、#天足以斤估在較低溫長期穩定性。試劑在45 保μ性達較長時間；相關於穩定性在較低溫，如2 τ — 8 C和室溫。因此，此置出、此早純ΡΒΤ配万無法維持抗原穩定性至預期程度。實例2 ：史塔必寇特⑧緩衝劑（BSI股份有限公司），—種市售稀釋液調配以保護和穩定抗體塗佈面，測試如實例W述但排除試劑在第0天和第4天（代和机貯存狀糊試。注意稀釋液70正、、且5物疋75%史塔必寇特⑧缓衝劑和ICC。史 :必寇特不能維持滅能流行性感冒病毒B抗原穩定性超過第4天，即指出其缺乏長期貯存潛能。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製實例3 : 、著"本叙月13式劑組合物以實例1所述之類似實驗來測。式稀釋液如下製備20耄升。2毫升1莫耳濃度磷酸鈉緩衝 ^和8笔升去離子水（丨〇〇毫莫耳濃度）加至一圓錐管中，混合，並碉整pH値至7.5。然後將〇175氯化鈉（15〇毫莫耳）加 .23- M氏張尺度適用中關家標準⑽χ 297公髮經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1257953

五、發明說明（21 曰=匕口 a接著兩^0·1毫升10〇/〇吐溫—20溶液（〇·〇5%)加入並 ’此。、/、/人和〇.2笔升1%殺微生物劑⑧II防腐劑（0.01%)基本/令液和0.1毛升正大黴素硫酸鹽（0.5%)加到管中並混合均勻…、後，2¾升甘油（10%)和i毫升胎牛血清（5%)加入並化口最後知〇·4^升500毫莫耳濃度EDTA/去離子水（10毫米）w 口物之基本落液加入混合並調整値至7.5。加去離子水至總體積20毫升。 =作病毒檢驗試劑以5毫升稀釋劑加至5毫升滅能流行性感目病母八基本落液（1:2稀釋液）或7.5毫升稀釋液加至2.5 毫升滅能流行性感冒病毒B基本溶液（1:4稀釋液）並混合均勻°在此例中’稀釋液完全组合物針對滅能流行性感冒病母A;谷液包含50%稀釋液、25% ICC、和25%史塔必寇特⑧緩衝劑，且針對滅能泥行性感冒病毒B溶液包含75%稀釋液、12.5% ICC、和12.5%史塔必寇特⑧綾衝劑。在研究過程中針對每個檢測試劑每次進行弗魯歐阿®測試當作每包裝插入組來執行。此實驗進行2 1天因爲能增加抗原穩定性。在45°C第3天，滅能流行性感冒病毒a和b二者失去一些正性反應但仍是顯著正性。滅能流行性感冒病毒B試劑提高至第7天、第14天和第21天。事實上，在45 °C第21天滅能流> 行性感冒病毒B失去所有正性反應。滅能流行性感冒病毒A於其它研究顯示經此段時間量之後會失去大部分活性。光學上解析測試結果基於主觀上〇- 8等級如下：（〇) 負性；（1)少許；（2)非常微弱正性；（3)正性界在非常微弱和微弱之間；（4)微正性；（5)正性界在弱和中度之間；（6) -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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五、發明說明（22 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製中度正性’（7)正性界在中度和強度之間；（8)強度正性結果。讯唬右位在2- 8則被視爲正性。流行性感冒病毒B在本發明稀釋液中增加之穩定性以圖1表示。貫例4 : 在其它本發明評估中，穩定化稀釋液用在不同測試中， $正性控制組使用抗原稀釋至福馬林—滅能流行性感冒病毒A和福馬林—滅能流行性感冒病毒B之丨：丨〇稀釋溶液以達到此控制組溶液所須之適度訊號。滅能病毒懸浮基本溶液製備如貫例1且穩定稀釋液如實例3所述。選擇抗體以光學塗佈製作多孔性表面，該表面爲軌跡—蝕刻聚碳酸酯膜塗上一矽酮可見層以提供反射率，一抗反射四氮化三矽層二依全球專利案W0/98/ 18962近似鑽石之碳接觸層。在此評估中選擇使用之抗體針對使用之表面種類而基於最佳分析執行。在測試表面，反應區域以較佳方法製作將單株抗 -流行性感冒病毒A抗體（4〇微克/毫升在〇1莫耳濃度 HEPES、pH 8.0、1%蔗糖）或單株抗—流行性感冒病毒b抗體（40微克/毫升在〇·ι莫耳濃度HEPES、pH 8·〇、1%蔑糖、 150毫莫耳濃度氯化鈉）條紋分佈至表面，使得每個測^面含一個流行性感冒病毒A反應區和一個流行性感冒病毒8 反應區。反應面條紋化使用拜歐皆史塔®(Bi〇Jet@)儀器（拜歐達特（BioDot)股份有限公司），在室溫下乾燥且外層塗佈防腐劑溶液。使用熱-打椿儀器使抗體表面熱固定至^碳酸酯以容許溶液流經或圍繞多孔表面。塑膠環提供幫助操作和放置多孔面至眞空來源以協助移除液體並乾燥 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4現格（21G X 297公髮裝------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂.丨丨.¾. 1257953 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 --------B7 _ 五、發明說明（23 ) " 多孔面。塗佈面可在使用前貯放在2- 8。〇。爲了本實驗目的，測試採用流過方式。流過意指在測試期間樣品和測試面接觸並流過、覆蓋、或環繞之。、# 此實驗檢測細胞培養基（EMEM)能力以當作本發明移定稀釋成分增加抗原穩定性。四個檢測溶液製做如下：（八) 7—5%本發明稀釋液、12·5% ΕΜΕΜ*12·5%史塔必寇特緩衝劑，（Β)溶液A，其ΕΜΕΜ額外含2%胎牛血清、1%l_麩胺酸、和0.5%盤史崔普/夫巨容，（c) 75〇/〇本發明稀釋液和 25%史塔必寇特稀釋液，和（D)僅具本發明稀釋液。滅能流仃性感冒病毒B基本懸浮液之1: 1〇稀釋溶液以四種稀釋液製作，用各別檢測稀釋液先製成1:4稀釋溶液，再製作 1:2.5稀釋落液。四種溶液（3〇微升）分別加到含165微升萃取試劑之各別試管並培養丨分鐘。每個樣品全液移至上述反應面上並培養3分鐘。接著，丨00微升共軛物（抗—流行性感冒病毒A抗體共軛結合HRp混合抗_流行性感冒病毒3抗體共扼結合HRP)移至反應面培養額外3分鐘。其次，在反應底邛抽具全以吸引樣品/共輕物混合經過並離開表面。施以沖洗水溶液至表面將表面沖洗3次並在眞空壓力下允許其流經表面直至乾燥爲止。關掉眞空和將75微升沉澱 TMB基貝置於測试面並培養6分鐘。將基質拉引通過表面並如上述將表面沖洗一次和乾燥。然後測試訊號如實例3 解析。每種溶液在4°C第3天和在45°C第3天測試。溶液A在45°C 第3天顯示最佳穩定性，接著是溶液b、d、和c。結果指 -26- 本紙張尺度適用中國國豕標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注音？事項@寫本頁) 1 裝 ----^--------- % 1257953 A7 B7 五、發明說明（24 出合併細胞培養基/史塔必寇釋抗原狀況下可择 ’、更衝則至稀釋液在增加稀足性）。使用高濃度史塔必寇特叙m和溶液D之穩 (溶液C)會不利抗 ’、更衝刎當作唯一其它成分這些社果明1、思疋性。圖2頌示上述實驗所得結果。溶液；；白^ 發明極優於其它稀釋液在其穩定水 ::中邀原之能力上，特別是流行性參考之母篇參考文广、、母 u 併入文中。讀專利、或專财請書財考之方式頁中圭實施例後’熟知此項技藝者應該知道其 =二?、改造和修飾而不會偏離本發明之精神” 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

—訂--------- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公爱) ----------—

Claims

A8 B8 C8 D8

12 5 TOS826738號專利申請案中文申請專利範圍替換本(95年4月）

六、申請專利範圍 1. 一種水溶液試劑組合物，其包含緩衝劑、血清、甘油、選自由氯化鉀、氯化鈉、氯化鎂、硫酸鎂及氯化鈣組成之群之鹽類、選自由EGTA及EDTA組成之群之螯合劑、選自由CHAPS、膽汁酸、去氧膽汁酸、地芰皂寧、 η-十一基-冷-D-麥芽糖嘗、去氧甘膽汁酸、[十二酸基肉胺酸醋、十二基硫酸酯、皂甞、聚環氧乙烷山梨糖醇纤單油酸酯及聚乙二醇Ρ- -四甲基丁基苯基醚組成之群之清潔劑、和防腐劑，且具最終pH值為7.5至 8.5’其中該組合物不包含N —十二醯基-N -甲基甘胺酸或癸醯基N-甲基葡糖醯胺。 2·根據申請專利範圍第1項之水溶液試劑組合物，其中該血清是胎牛血清。 3 ·根據申請專利範圍第1項之水溶液試劑組合物，其中該鹽類是氯化納。 4.根據申請專利範圍第1項之水溶液試劑組合物，其中該螯合劑是EDTA。 5 ·根據申請專利範圍第1項之水溶液試劑組合物，其中該潔劑疋I ί尽乳乙燒山梨糖辱奸單油酸酉旨。 6.根據申請專利範圍第1項之水溶液試劑組合物，其中該防腐劑是溴化三甲基四癸基按和正大黴素（gentamycin)。 7 ·根據申請專利範圍第1項之水溶液試劑組合物，其中該緩衝劑是磷酸鈉。 8·根據申請專利範圍第1項之水溶液試劑組合物，其中該緩衝劑是磷酸鈉，該血清是胎牛血清，該鹽類是氯化本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1257953 bS v>〇 D8 六、申請專利範園 " ^ ' 鈉，該螯合劑是EDTA，該清潔劑是聚環氧乙境山梨糖醇酐單油酸酯和該防腐劑是溴化三甲基四癸基銨和正大黴素。 9·根據申請專利範圍第1項之水溶液試劑組合物，其進一步包含一或多種組織培養基。 10.根據申請專利範圍第9項之水溶液試劑組合物，其中該組織培養基是依果最低基本培養基。 11 ·根據申請專利範圍第1項之水溶液試劑組合物，其中水溶液試劑包含在50毫莫耳濃度和100亳莫耳濃度間之石舞酸鈉，在2%和20%體積/體積間之胎牛血清，在2.5%和 10%體積/體積間之甘油，在50毫莫耳濃度和2莫耳濃度間之氯化鈉，在1 〇毫莫耳濃度和15毫莫耳濃度間之 EDTA，在0.05%和0·1°/〇體積/體積間之聚環氧乙燒山梨糖醇Sf單油酸酯清潔劑，0·01 %重量/體積溴化三甲基四癸基銨，和0.5%重量/體積正大黴素硫酸鹽且最終pH值是 7.5至 8.5 〇 12. —種用來穩定當中之抗原或多肽之水溶液試劑組合物，其包含緩衝劑、血清、甘油、選自由氯化4甲、氯化鋼、氯化鍰、硫酸鎂及氯化#5組成之群之鹽類、選自由 EGTA及EDTA組成之群之螯合劑、選自由CHAPS、膽汁酸、去氧膽汁酸、地芰皂寧、η-十二基-冷-D-麥芽糖甞、去氧甘膽汁酸、η-十二醯基肉胺酸酯、十二基硫酸酯、皂荅、聚環氧乙烷山梨糖醇酐單油酸酯及聚乙二醇 P-l，l，3,3 -四甲基丁基苯基醚組成之群之清潔劑、和防 -2 - 66985-950404.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X 297公釐) A8 B8 C8 1257953 六、申請專^園~^ ~ "~ - 腐刎，且最終pH值是7.5至8.5，其中該組合物不包含N-十一酸基-N -甲基甘胺酸或癸醯基N -甲基葡糖醯胺。 •根據申請專利範圍第12項之水溶液試劑組合物，其中該血清是胎牛血清。 14·根據申請專利範圍第12項之水溶液試劑組合物，其進一步包含該抗原或多欣。 15·根據申請專利範圍第14項之水溶液試劑組合物，其中抗原或多肽來自微生物。 16·根據申請專利範圍第丨5項之水溶液試劑組合物，微生物是病毒。 17·根據申請專利範圍第15項之水溶液試劑組合物，其中該微生物是細菌。 18. 根據申請專利範圍第16項之水溶液試劑組合物，其中該病毒是流行性感冒病毒。 19. 根據申請專利範圍第丨8項之水溶液試劑組合物，其中該流行性感冒病毒是流行性感冒病毒B。 20·根據申請專利範圍第14項之水溶液試劑組合物，其中該抗原是核蛋白。 3 - 66985-950404.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)