KR20170002560A - Ｃｍｖ를 치료하기 위한 수단 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 재조합 단백질 생산 및 백신 제조 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 CMV의 오량체 gH/gL/UL128/UL130/UL131A 복합체를 제조하기 수단 및 방법을 제공한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 CMV에 대한 백신으로서 사용될 수 있는, 바큘로바이러스 시스템에서 생산된, CMV의 오량체 gH/gL/UL128/UL130/UL131A 복합체를 제공한다.

Description

ＣＭＶ를 치료하기 위한 수단 및 방법 {MEANS AND METHODS FOR TREATING CMV}
시토메갈로바이러스는 헤르페스비리다에(Herpesviridae) 또는 헤르페스바이러스로 공지된 바이러스 과의 바이러스 속이다. 이는 전형적으로는 CMV로 약칭된다. 인간을 감염시키는 종은 보편적으로 인간 CMV (HCMV) 또는 인간 헤르페스바이러스-5 (HHV-5)로 공지되어 있으며, 모든 시토메갈로바이러스들 중 가장 많은 연구가 이루어진 것이다. 성인 집단 중 약 60% 및 일부 국가에서는 이미 100% 유행성 감염에 도달하였다. 감염은 일반적으로 면역적격 대상체에서는 무증상이지만, 종종 단핵증 유사 질병이 발생할 수도 있다. 감염은 일생 동안의 잠복 상태 확립으로 이어지며, 이는 때때로 재활성화에 의해 중단될 수 있다. 그러나, 면역결핍 대상체, 예컨대, 암 또는 이식 환자, 신생아 또는 HIV 환자인 경우, CMV 감염은 심지어는 사망에 이르게 할 수도 있는, 심각한 위협이 될 수 있다. 바이러스 게놈이, 바이러스 항원의 MHC 클래스 I 제시를 방해하는 다수의 단백질을 코딩하기 때문에, CMV는 숙주에서 지속될 수 있다. 한 바이러스 단백질은 펩티드의 소포체 내강으로의 이동을 차단하는 반면, 나머지 다른 두 바이러스 단백질은 MHC 클래스 I 단백질이 세포 표면에 도달하기 이전에 그의 분해를 유발한다.
현 치료법은 항바이러스제, 예컨대, 간시클로비르, 포스카르네트, 아시클로비르, 시도포비르 또는 레플루노미드를 적용한다. 상기 작용제가 이식 환자 및 면역손상된 환자를 위한 것으로 적합화될 수는 있지만, 이는 임산부용으로는 사용될 수 없다. 이를 위해서는 고면역글로불린 요법이 바람직하다. 비록 선행 기술에서는 백신, 예컨대, 약독화된 생 백신, 서브유니트 단백질 백신, 서브유니트 바이러스 벡터 코딩 백신을 찾아내기 위한 각종 시도가 이루어졌지만, 현재까지는 아직도 이용가능한 백신은 없다.
시토메갈로바이러스 (CMV)는 인간 질환을 유발하는 공지된 바이러스들 중 가장 크고, 가장 복잡한 바이러스 중 하나이다. 235 kb 게놈이 165개 이상의 단백질을 코딩하지만, CMV 백신 연구는 자연 감염 동안 세포성 또는 체액성 면역 반응을 지배하는 제한된 개수의 바이러스 단백질에 초점을 맞추어 왔다. pp65 단백질은 세포독성 T 세포 반응의 주요 표적이다. 캡시드와 바이러스 외피 사이의 피막 내에 위치하는 pp65는 CMV 비리온에서 가장 풍부한 단백질이다. IE1 단백질 또한 중요한 세포독성 T 세포 표적으로서, 이는 비리온에는 존재하지 않지만, 감염 후 세포에서 풍부하게 발현되는 것이다. 숙주 세포 침입을 매개하는 수개의 당단백질 복합체가 비리온 표면상에 있고, 외피에 포매되어 있다. 당단백질 M 및 당단백질 N으로 구성된 이종이량체가 헤파린에의 결합에 의해 숙주 세포 상호작용을 개시하는 것으로 여겨진다. 당단백질 H 및 당단백질 L로 구성된 두번째 이종이량체 (gH/gL)는 표적 세포막과 바이러스 외피의 융합을 구동시키는 당단백질 B (gB)의 입체구조적 변화가 일어나도록 하는 수용체 상호작용을 매개할 수 있다. gH, gL, UL128, UL130, UL131A로 구성된 CMV의 오량체 복합체는 상피 및 내피 세포 내로의 침입을 매개한다. 상기 복합체들 모두, 이들은 중화 항체로도 공지된 선택된 부류의 항체에 결합하는 에피토프를 함유하는 바, 이에 체액성 면역에 중요한 표적이다. 백신 개발에 있어 전반적인 목표는 CMV에 의한 상피/내피 세포 감염 및 섬유모세포 감염, 둘 모두에 대한 중화 활성을 유도하는 것이다.
단순 펩티드 또는 서브유니트; 재조합 다중서브유니트 복합체, 예컨대, gH/gL 또는 완전한 오량체 복합체; 천연 오량체 복합체, gB, pp65, 및 다른 바이러스 항원을 함유하는 불활성화된 CMV 비리온; 잠재적으로는 생 백신의 면역원성을 사 백신의 안전성과 조합할 수 있는, 천연 오량체 복합체를 발현하는 유전적 장애가 있는 CMV; 서브유니트 또는 다중서브유니트 복합체를 발현하는 복제 결함 바이러스 벡터 (예컨대, 폭스, 아데노바이러스, 알파바이러스 및 다른 것); 및 상기의 프라임/부스트 조합을 비롯한, 다양한 백신 접근법이 연구 중에 있다.
관심의 대상이 되는 백신 후보물질은 상피 및 내피 세포 내로의 침입을 매개하는 CMV의 오량체 복합체이다. 그러나, 입체구조적 및/또는 다중서브유니트-의존성 에피토프가 오량체 복합체의 "중화 에피톰"을 어느 정도로 지배하는지에 대해서는 여전히 불명확한 상태 그대로 남아있다. 완전한 오량체 복합체를 그의 입체구조상 천연 상태로 나타내어야 하는 가능한 필요성이 자연적으로 감염된 대상체로부터 단리된 모노클로날 항체: 1개를 제외한 모두가 다중서브유니트-의존성 에피토프를 인식한, 17개의 오량체 복합체-특이 중화 항체의 연구에 의해 제안된다.
선행 기술에서 CMV, 특히, HCMV의 오량체 복합체를 제공하는 많은 시도가 이루어졌지만, 본 발명자들이 알고 있는 바로는 현재까지는 오량체 복합체가 역시 이상적으로는 고순도를 가지면서, 안정한 형태로 및 충분한 양으로 제공될 수 없다. 그러나, 백신을 제공하기 위해서는 면역 반응을 유도하기 위해 면역원성을 띠는 고순도의 충분한 양의 안정적인 오량체 복합체가 요구된다. 따라서, 본 발명의 기초가 되는 기술상의 문제는 이러한 요구를 충족시켜 주는 것이다.
본 발명은 CMV의 오량체 복합체를 제조하기 위한 신규한 수단 및 방법을 제공함으로써 상기 문제를 해소한다. 특히, 오량체 복합체는 곤충 세포를 비롯한 적합한 숙주 세포에서 바큘로바이러스 벡터를 이용함으로써 고수율로 안정하게 발현될 수 있다는 놀라운 관찰 결과에 기초한다. 또한, 본 발명자들은 예상 밖으로 본 발명의 방법에 의해 수득된 오량체 복합체가 특히 제약 및/또는 백신 조성물로서 유용하다는 것을 발견하게 되었다. 곤충 세포에서 생산된 재조합 단백질은 면역 반응을 조절하는 중요한 파라미터의 그의 글리코실화 패턴과 관련하여 그의 "천연" 대응물과 상이하기 때문에, 이는 분명 예측하지 못했던 것이었다. 또한, 본 발명자들은 발현 시스템에서, 특히, 바큘로바이러스 시스템에서 제조된 CMV의 안정적인 오량체 복합체를 제공하는 데 있어 최초로 성공을 거두었으며, 이로써, 고순도의 면역원성 오량체 복합체를 대규모로 제조할 수 있다.
본 발명자들은 CMV의 오량체 복합체를 안정적인 형태로 및 고수율 및 고순도로 제조할 수 있는 새로운 수단 및 방법의 확립을 개척해 왔다. 본 발명자들은 최초로 바큘로바이러스 벡터를 이용하여 CMV의 오량체 복합체의 단백질 성분을 다량으로 발현하였고, 기능적 오량체 복합체의 어셈블리를 관찰하였다.
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은
(i) 바큘로바이러스를 이용하여 숙주 세포에서 UL128, UL130, UL131A, gH (UL75) 및 gL (UL115)을 공동 발현시키는 단계;
(ii) 상기 공동 발현으로부터 수득된 오량체 복합체를 숙주 세포 및/또는 상청액으로부터 정제하는 단계; 및
(iii) 임의적으로 정제된 오량체 복합체를 킬레이트화제 및/또는 안정화제를 포함하는 완충제 용액 중에서 보관하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는, CMV 단백질 UL128, UL130, UL131A, gH (UL75) 및 gL (UL115)로 구성된 오량체 복합체에 관한 것이다.
숙주 세포는 곤충 세포 또는 포유동물 세포일 수 있다.
본 발명의 바람직한 생산 세포주는 곤충 세포주, 예컨대, Sf9, Sf21, 슈퍼(Super) Sf9-1 (VE-1), 슈퍼 Sf9-2 (VE-2), 슈퍼 Sf9-3 (VE-3), 하이-5(Hi-5), 미믹(Mimic) Sf9, 반키린(Vankyrin), 익스프레스(Express) Sf+, 및 S2 슈나이더 (Schneider) 세포이고, 슈퍼 Sf9-2가 바람직하다 (옥스포드 익스프레션 에크놀러지즈(Oxford Expression Technologies), 카탈로그 번호 600103 및 문헌 [Fath-Goodin et al. (2006), Adv. Virus Res. 68, 75-90]; [Kroemer et al. (2006), J. Virol. 80(24), 12291-12228] 및 US20060134743). 슈퍼 Sf-9 세포는 캄포레티스 소노렌시스(Campoletis sonorensis) 이크노바이러스 P-vank-1 단백질을 안정적으로 발현하도록 조작된 것이다. 포유동물 세포, 특히, 인간 세포에서의 발현을 위해, 예컨대, HEK293, HEK293F, CHO, HeLa, HUVEC, HUAEC, Huh7, HepG2, BHK, MT-2, Cos-7, Cos-1, C127, 3T3, 인간 포피 섬유모세포 (HFF), 골수 섬유모세포, 바우스 흑색종(Bowes melanoma), 1차 신경 세포, 또는 상피 세포가 사용된다.
공동 발현 단계는 숙주 세포를, 상기 단백질을 발현하며, 감염시 약 2*106개의 세포/mL의 세포 계수를 가지는 상기 숙주 세포를 감염시켰을 때 약 107 pfu/mL 이상의 역가를 가지는 바큘로바이러스로 감염시키고; 상기 숙주 세포를 적합한 조건하에서 배양하고, 감염 후 56-65 h에 상기 숙주 세포 및/또는 상청액을 수거하는 것을 포함할 수 있다.
숙주 세포, 특히, 곤충 세포를 해동 및 배양 후 15일째 내지 50일째, 바람직하게, 15일째 내지 30일째, 바람직하게 18일째 감염시킬 수 있다.
정제는 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및/또는 친화성 크로마토그래피를 포함할 수 있다.
킬레이트화제는 EDTA 또는 EGTA일 수 있다. 바람직하게, EDTA는 상기 완충제 용액 중에 20 mM 이하, 예컨대, 3 mM 이하인 농도로 존재한다.
안정화제는 폴리에틸렌 글리콜, 아르기닌, 글리신, 소르비톨, 트레할로스, 글리세롤, 수크로스, 글루코스, DMSO, TMAO 및/또는 NP-40일 수 있다.
추가로, 완충제 용액은 트리스(Tris) 완충제, NaCl, MgCl2, 및/또는 KCl를 포함할 수 있다.
CMV 단백질 UL128, UL130, UL131A, gH 및 gL을 코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)은 하나 이상의 벡터 상에, 바람직하게, 단일 벡터 상에 존재할 수 있다.
벡터는 박테리아 (E. 콜라이(E. coli)), 효모 (S. 세레비지아에(S. cerevisiae)), 곤충 세포 및/또는 포유동물 세포에서의 증식을 위한 요소를 함유할 수 있다.
ORF는 상기 벡터에서 5' → 3' 방향으로 하기 순서로 위치할 수 있다:
(i) gH, gL, UL128, UL130, UL131; 또는
(ii) gL, UL128, UL130, UL131, gH.
바람직하게는,
(a) (i)에서 gH ORF는 3' 방향으로 전사되고, gL ORF는 5' 방향으로 전사되고, UL128 ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL130 ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL131A ORF는 3' 방향으로 전사됨;
(b) (i)에서 gH ORF는 3' 방향으로 전사되고, gL ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL128 ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL130 ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL131A ORF는 3' 방향으로 전사됨;
(c) (ii)에서 gL ORF는 5' 방향으로 전사되고, UL128 ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL130 ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL131A ORF는 3' 방향으로 전사되고, gH ORF는 3' 방향으로 전사됨.
각각의 상기 ORF는 p10 프로모터, polh 프로모터, IE-1 프로모터, mCMV 프로모터, vp39 프로모터, lef2 프로모터, CAG 프로모터, HepB SV40 프로모터 또는 본원에 기술된 임의의 다른 프로모터에 의해 구동되고, 다음으로 종결 인자 서열, 예컨대, HSVtk 종결 인자 또는 SV40 종결 인자 또는 본원에 기술된 임의의 다른 종결 인자가 이어질 수 있다.
상기 단백질 중 1개 이상은 태그를 포함할 수 있고, 이 태그는 His-태그, Strep-태그, His-Strep-태그, StrepII-태그, Softag 1, TC-태그, myc-태그, FLAG-태그, HA-태그, V5-태그, Avi-태그, 칼모듈린-태그, 폴리글루타메이트-태그, 아밀로이드 베타-태그, GST-태그, MBP-태그 또는 S-태그일 수 있다. 바람직하게, gH 단백질에 바람직하게는 8개의 His-잔기를 포함하는 His-태그가 부착된다.
상기 단백질 중 하나 이상의 것은 프리시전(PreScission) 프로테아제 또는 프리시전 및 TEV 프로테아제를 포함할 수 있고, 바람직하게, gH 및/또는 gL 단백질은 프리시전 프로테아제 또는 프리시전 및 TEV 프로테아제를 포함한다.
바큘로바이러스 유전자 v-cath 및/또는 ChiA 활성은 기능적으로 파괴될 수 있다.
본 발명의 오량체 복합체는 또한 조성물 형태일 수 있다.
본 발명의 오량체 복합체는 또한 상피/내피 (Epi/EC) 및 섬유모세포 감염, 둘 모두를 억제시키는 중화 활성을 유도할 수 있다.
제2 측면에서, 본 발명은 또한 (i) 숙주 세포에서 바큘로바이러스 CMV 단백질 UL128, UL130, UL131A, gH (UL75) 및 gL (UL115)을 공동 발현시키는 단계; (ii) 상기 공동 발현으로부터 수득된 오량체 복합체를 숙주 세포 및/또는 상청액으로부터 정제하는 단계; 및 (iii) 임의적으로 정제된 오량체 복합체를 킬레이트화제 및/또는 안정화제를 포함하는 완충제 용액 중에서 보관하는 단계를 포함하는, CMV 단백질 UL128, UL130, UL131A, gH (UL75) 및 gL (UL115)로 구성된 오량체 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.
제3 측면에서, 본 발명의 오량체 복합체, 또는 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있는 오량체 복합체, 및 임의적으로 제약상 허용되는 담체 또는 애주번트를 포함하는 제약 조성물 또는 백신 조성물을 제공한다.
제4 측면에서, 본 발명의 오량체 복합체에서 상기 단백질 중 1, 2, 3, 또는 4개 이상은 나머지 단백질의 유래 기점이 되는 CMV 균주 이외의 다른 CMV 균주로부터 유래될 수 있다.
CMV 단백질은 CMV 균주 타운(Towne), 수탁 번호 FJ616285.1 하에 NCBI 진뱅크(NCBI GenBank)에 기탁된 게놈을 가지는 타운, 톨레도(Toledo) (GU937742.1), AD169 (FJ527563), 메를린(Merlin) (AY446894.2), TB20/E (KF297339.1), VR1814 (GU179289)로부터 유래된 것일 수 있다. 문헌 [Patrone et al., J. Virol., 2005, 79, 8361-8373]에 따라 204번 위치의 aa Y는 aa F로 치환될 수 있고, UL130의 발현에 있어 주된 문제는 동일 위치의 프레임시프트이며, 이는 다음 ORF까지 아미노산 확장을 일으킨다. 제5 측면에서, 본 발명은 수탁 번호 FJ616285.1 하에 NCBI 진뱅크에 기탁된 게놈을 가지고, UL130 ORF의 아미노산 서열의 204번 위치에 아미노산 F를 가질 뿐만 아니라, (인간 포피 섬유모세포에서 성장시킨) 랩균주 타운의 동일 위치에 프레임시프트의 수복을 가짐으로써 기능적 아미노산 Y를 생성하는 변형된 CMV 타운 균주를 제공한다.
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본원에서 사용되는 바, 단수 형태인 "하나(a, an)" 및 "그"라는 것은 문맥상 달리 명백하게 명시되지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 따라서, 예를 들어, "한 시약"이라고 언급하는 것은 하나 이상의 상기 다른 시약을 포함하고, "그 방법"이라고 언급하는 것은 변형될 수 있거나, 또는 본원에 기술된 방법에 대체될 수 있는 통상의 기술자에게 알려져 있는 등가의 단계 및 방법을 지칭하는 것을 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 연속된 요소들 앞의 "적어도"라는 용어는 연속된 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해하여야 한다. 통상의 기술자는 단지 통상의 실험만을 사용하여서도 본원에 기술된 본 발명의 구체적인 실시양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 상기 등가물은 본 발명에 포함시키고자 한다.
본원에서 사용되는 경우에는 언제나, "및/또는"이라는 용어는 "및," "또는" 및 "상기 용어로 연결된 요소의 모든 또는 임의의 다른 조합"의 의미를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "약" 또는 "대략"이라는 용어는 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 바람직하게, 10% 이내, 더욱 바람직하게, 5% 이내인 것을 의미한다. 그러나, 명수 또한 포함하며, 예컨대, 약 20은 20을 포함한다.
"미만" 또는 "초과"라는 용어는 명수를 포함한다. 예를 들어, 20 미만이란, 20보다 작거나, 또는 그와 동일하다는 것을 의미한다. 유사하게, 초과 또는 그보다 큰이라는 것은 각각 초과 또는 동일, 또는 그보다 크거나, 또는 그와 동일하다는 것을 의미한다.
문맥상 달리 요구되지 않는 한, 하기의 본 명세서 및 특허청구범위 전역에 걸쳐, "포함하다(comprise)"라는 단어, 및 예컨대, "포함하다(comprises)" 및 "포함하는"이라는 파생어는 언급된 정수 또는 단계, 또는 정수들 또는 단계들의 군을 포함하되, 임의의 다른 정수 또는 단계, 또는 정수들 또는 단계들의 군을 배제하는 것은 아님을 암시한다는 것을 이해할 것이다. 본원에서 사용될 때, "포함하는(comprising)"이라는 "함유하는" 또는 "비롯한"이라는 용어로, 또는 때때로 본원에서 사용될 때, "가지는"이라는 용어로 치환될 수 있다.
본원에서 사용될 때, "~으로 이루어진"이란, 특허청구범위 요소에서 명시되지 않은 임의의 요소, 단계, 또는 성분은 배제시킨다. 본원에서 사용될 때, "본질적으로 ~으로 이루어진"은 특허청구범위의 기본적인 및 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 재료 또는 단계는 배제시키지 않는다.
본원 각 경우에서, "포함하는," "본질적으로 ~으로 이루어진," 및 "~으로 이루어진"이라는 용어 중 임의의 것을 나머지 둘 용어 중 어느 하나로 대체될 수 있다.
본 발명이 본원에 기술된 특정 방법론, 프로토콜, 재료, 시약, 및 물질 등으로 제한되지 않으며, 따라서, 이는 달라질 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시양태를 기술하기 위한 목적의 것이며, 본 발명의 범주는 제한하고자 하는 것이 아니고, 본 발명의 범주는 오직 특허청구범위에 의해서만 정의된다.
상기에서든 또는 하기에서든, (모든 특허, 특허 출원, 과학 공개 문헌, 제조사 설명서, 지침서 등을 비롯한) 본 명세서 텍스트 전역에 걸쳐 인용된 모든 공개 문헌 및 특허는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 본원에서는 본 발명이 선행 발명에 의해서 상기 개시내용을 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 참고 문헌이 포함하는 자료가 본 명세서를 부정하거나, 또는 그와 일치하지 않는 한, 본 명세서가 임의의 상기 자료를 대신할 것이다.
도 1 : CMV - 오량체 복합체 및 가용성 CMV 단백질의 발현을 위한 재조합 벡터를 나타낸 개략도.
바큘로바이러스 발현 시스템 (BEVS)을 사용하는 재조합 단백질 발현을 목표로 하고, 2개의 프로모터 P1 및 P2 (◁_p10, ▷_polh), 및 SV40 및 HSVtk인, 2개의 종결 인자 서열 T1 및 T2 (T)를 함유하는 벡터 백본 pRBT136 내로 상이한 변이체를 삽입한다. 효소에서의 증식을 위해, 벡터는 복제 기점 (O), 예컨대, 2미크론, 및 마커 유전자 (m), 예컨대, URA3을 함유한다. 추가로, 벡터는 전달 벡터로부터 바크미드(bacmid)로의 트랜스진의 전위를 위한 트랜스포손 부위 좌측 (TL) 및 우측 (TR), 부위 특이적 상동성 재조합 (플라스미드 융합)을 위한 loxP 부위 (L), 복제 기점 (O), 암피실린 (A), 클로람페니콜 (C) 및 겐타마이신 (G) 저항성 유전자, 및 정해진 제한 부위를 함유한다. 바큘로바이러스를 사용한 형질도입 또는 일과성 발현 중 어느 하나에 의한 포유동물 세포에서의 발현의 경우, 벡터 백본 pRBT 393은 pCMV, ie1 및 lef2로부터 선택되는 프로모터, 및 SV40pA, BHG pA 및 HSVtk로부터 선택되는 종결 인자를 추가로 함유한다.
약어: c: 컨센서스 서열; H: His-태그(tag); SH: 스트렙트아비딘-His-태그; V: 균주 VR1814, pcI: 프레시션 프로테아제, pcII: 프레시션 및 TEV 프로테아제, DT: 이량체화 도구, T: 종결 인자, O: 복제 기점, G: 겐타마이신 저항성, C: 클로람페니콜 저항성, L: loxP 부위, TL: 좌측 트랜스포손 측, TR: 우측 트랜스포손 측.
도 2 : His- 태그부착된 가용성 CMV - 오량체 복합체의 친화성 크로마토그래피 단계, 이어서, 크기 배제 크로마토그래피로 이루어진 정제 프로세스 분석.
표면 단백질 UL75 (His-태그부착된, gH)-UL115 (gL)-UL128-UL130-UL131A (서열식별번호(SEQ ID NO): 18)를 포함하는 오량체 복합체를 His-Trap 칼럼을 이용하는 친화성 기반 크로마토그래피 (IMAC), 이어서, 크기 배제 크로마토그래피 (XK16/60 슈퍼덱스200pg(Superdex200pg))에 의해 정제하였다.
(A) SDS-PAGE (4-12% 비스-트리스 겔), 이어서, 쿠마시 염색에 의해 2차 IMAC 정제를 분석하였다. 단백질 표준 (레인 1)의 크기 (kDa)는 좌측에 마킹되어 있다. 레인 2: 1차 IMAC의 풀 (2차 IMAC 프로세스의 로드), 레인 3: 통과액, 레인 4: 세액, 레인 5-14는 최대 500 mM까지로 이미다졸 농도 증가에 따른 용리 분획을 나타낸다.
(B) SDS-PAGE (4-12% 비스-트리스 겔), 이어서, 쿠마시 염색에 의한 크기 배제 크로마토그래피 정제의 분석. 단백질 표준 (레인 1)의 크기 (kDa)는 좌측에 마킹되어 있다. 레인 1: 용리 풀 IV-2 (침전형); 레인 2: 용리 풀 IV-2 (비침전형); 레인 3: 용리 풀 IV-3; 레인 4: 용리 풀 V; 레인 5: 용리 풀 VI; 레인 6: 크기 마커. 오량체 복합체 (gH, gL, UL128, UL130, UL131A)의 단백질은 화살표로 표시되어 있다.
(C) gH의 His-태그에 대한 항체를 이용한 면역블롯. 레인 1은 용리 풀 IV-2 (침전형)을 나타냄; 레인 2: 용리 풀 IV-2 (비침전형); 레인 3: 용리 풀 IV-3; 레인 4: 용리 풀 V; 레인 5: 용리 풀 VI; 레인 6: 양성 대조군. His-태그부착된 gH 단백질은 우측에 마킹되어 있다.
(D) 정제된 가용성 인간 CMV (HCMV) 오량체 복합체 (서열식별번호: 18) (레인 6)의 쿠마시 염색된 SDS-PAGE (4-12% 비스-트리스 겔). 농도 계측 분석에 의한 단백질 농도 측정을 위해, 상이한 양의 BSA를 로딩하였다 (레인 2: 0.1 mg/ml; 레인 3: 0.2 mg/mL; 레인 4: 0.3 mg/mL; 레인 5: 0.5 mg/mL). 단백질 표준 (레인 1)의 크기 (kDa)는 좌측에 마킹되어 있다.
(E) 표면 단백질 UL75 (His-태그부착된, gH)-UL115 (gL)-UL128-UL130-UL131A (서열식별번호: 18)를 포함하는 오량체 복합체를 Ni2+ 하전된 칼럼 (벌크 크기에 의존하는 스케일)을 이용하여 1 단계 친화성 기반 크로마토그래피 (IMAC), 이어서, PALL 마크로셉(PALL macrosep) 원심분리 장치에서 농축시키고, (25 mM 트리스, 150 mM NaCl, 3mM KCL (pH 6.5), 0.2% Brij-35)를 함유하는 보관 완충제에 대하여 투석하여 정제하였다. 정제된, 가용성 복합체를 SDS-PAGE (4-12% 비스-트리스 겔)에 의해 분석한 후, 이어서, 쿠마시 염색 및 상이한 양의 BSA (레인 2: 0.1 mg/ml; 레인 3: 0.2 mg/mL; 레인 4: 0.3 mg/mL; 레인 5: 0.5 mg/mL; 레인 6: 정제된 오량체 복합체)에 따른 농도 계측 분석을 수행하였다. 단백질 표준 (레인 1)의 크기 (kDa)는 좌측에 마킹되어 있다.
도 3 : 서열식별번호: 18에 기반한 체액성 면역 반응을 입증하는 중화 검정법
인간 CMV 혈액 기증자 및 마우스 혈청의 중화 항체 역가 비교. 2배 연속 희석된 (1:20 내지 1:2,560), 5명의 양성 (G2 군, D6-D10) 및 5명의 음성 (G1 군, D1-D5) HCMV 혈액 기증자로부터의 혈청에 대해 세포 기반 형광 중화 검정법을 수행하였다. 앞서 오량체 복합체 (서열식별번호: 18)로 면역화된 8마리의 마우스로부터 수득된, 풀링된 혈청의 1:320 희석액과 동일한 억제 효과를 제공한 혈청 희석액 (s.d.)을 제시한다. 마우스의 면역화에 사용된 항원 믹스 중의 한 성분으로서 가용성 오량체 복합체를 별도로 분석하였을 때, 인간 혈액 기증자와 비교하여 중화 항체가 유도된 것으로 나타났다.
PR: 면역전 오량체, PO: 면역후 오량체, G1: 음성 혈액 기증자, G2: 양성 혈액 기증자.
도 4 : 백신 후보로서의 가용성 복합체, 서열식별번호: 18의 정질 조절(quality control).
IMAC 기반 정제 수행 후, 상이한 양의 이미다졸을 사용하여 용리된 분획을 나타낸다. 이를 UL75 (gH) 및 gH 상 His 태그의 존재에 대하여 시험하였다. 신호 강도의 유사성은 gH, 및 그에 따른 UL75-UL115-UL128-UL30-UL131A로 구성되는 전체 복합체의 무손상성을 나타낸다.
1: 로드, 2: 통과액, 3: 세액, 4: 250　mM 이미다졸, 5-8: 300 mM 이미다졸, 9-13: 350　mM 이미다졸, 14: 양성 대조군, 15: 음성 대조군.
도 5 : 입체구조 의존성 항체를 이용한 백신 후보로서의 가용성 복합체, 서열식별번호: 18의 정질 조절.
샌드위치 ELISA 검정법을 사용하여 상이한 복합체 제조 배치를 지정된 단백질의 공동-존재에 대해 시험하였다. 항-gH1 (UL75) 항체로 샘플을 포획하고, 항-gH2 및 항-His 뿐만 아니라, 항-UL130/131A 및 항-UL130 입체구조-의존성 (UL130/UL131A) 항체를 사용하여 검출하였다. 신호를 통해 복합체 내의 단백질의 공동-존재, 복합체의 무손상성 뿐만 아니라, 그의 제조의 재현가능성을 확인할 수 있다.
1: 배치 451-풀 1, 2: 배치 459-풀 2, 3: 배치 459-풀 1 (15 mM EDTA), 4: 배치 459-풀 1 (20 mM EDTA), 5: 배치 458 (15 mM EDTA), 6: 양성 대조군, 7: 음성 대조군, 8: 내부 표준.
도 6: CMV gH , gL , UL128, UL130 및 UL131A 단백질에 대한 참조 아미노산 서열.
gH (서열식별번호: 1), gL (서열식별번호: 2), UL128 (서열식별번호: 3), UL130 (서열식별번호: 4), UL131A (서열식별번호: 5).
도 7: 서열식별번호: 18 및 서열식별번호: 67에 기반한 세포성 면역 반응에 관한 정질적 개요.
(A) 마우스 면역화를 위해 사용되는 항원에 의존하는 Th-1 및 Th-2 반응을 보여주는 시토카인 분비 비교. (B, C, D) 비장세포는 AD169 바이러스 용해물로 재자극시킨 반면, 시토카인 분비는 제조사의 프로토콜에 따라 다중 검정법에 의해 확인하였다. 애주번트는 IL-4의 분비 증가를 유도한 반면, IFN-감마 또는 IL-5의 분비에 대해서는 어떤 자극 효과도 보이지 않았다. 시토카인 분비는 오량체 복합체에 대하여 용량 의존성이고; 보다 낮은 용량이 유익하였다.
P1: 오량체 복합체 (타운 균주); P2: 오량체 복합체 (타운 및 VR1814 균주); adj: 애주번트; VLP: 바이러스 유사 입자; gB: 가용성 당단백질 gB (UL55); BV: 바큘로바이러스.
도 8: 서열식별번호: 18 및 서열식별번호: 67에 기반한 체액성 면역 반응을 입증하는 중화 검정법
인간 CMV 혈액 기증자 및 마우스 혈청의 중화 항체 역가 비교. 2배 연속 희석된 (1:20 내지 1:2,560), 5명의 양성 (혈청 반응 양성) 및 5명의 음성 (혈청 반응 음성) HCMV 혈액 기증자로부터의 혈청에 대해 세포 기반 형광 중화 검정법을 수행하였다. 앞서 VLP, gB 및 애주번트와의 조합으로 오량체 복합체 (서열식별번호: 18, 서열식별번호: 67)로 면역화된 8마리의 마우스 중 4마리로부터 수득된, 풀링된 혈청의 1:100 희석액과 동일한 억제 효과를 제공한 혈청 희석액 (s.d.)을 제시한다. 마우스의 면역화에 사용된 항원 믹스 중의 한 성분으로서 가용성 오량체 복합체를 별도로 분석하였을 때, 혈청 반응 양성 및 혈청 반응 음성 인간 혈액 기증자와 비교하여 중화 항체가 유도된 것으로 나타났다. 섬유모세포 (MRC-5) 및 상피 세포 (ARPE-19)의 중화를 다른 두 바이러스 균주, VR1814 및 TB40E 균주를 이용하여 조사하였다.
P1: 오량체 복합체 (타운 균주); P2: 오량체 복합체 (타운 및 VR1814 균주); adj: 애주번트; VLP: 바이러스 유사 입자; gB: 가용성 당단백질 gB (UL55); BV: 바큘로바이러스; 면역전: 면역화 이전; 면역: 면역화 이후.
도 9: His- 태그부착된 가용성 CMV - 오량체 복합체의 친화성 크로마토그래피 단계, 및 이온 교환 크로마토그래피로 이루어진 정제 프로세스 분석
순도 및 농도의 농도 계측 분석 (이미지J(ImageJ) 소프트웨어)을 위해 가용성 인간 CMV (HCMV) 오량체 복합체 (배치 E0713, 레인 6 및 배치 E0714, 레인 7)의 쿠마시 블루 (심플리블루(SimplyBlue), 인비트로겐(Invitrogen)) 염색된 SDS-PAGE (NuPAGE 인비트로겐)를 사용하였다. 도 1에서 관찰된 3개의 밴드는 gH-His 뿐만 아니라, 함께 공동으로 이동하는 gL/UL130 및 UL128/UL131A 단백질을 나타낸다 (이들 모두는 이전 배치에서 질량 분석법으로 확인). 3개 밴드의 총합을 BSA 표준과 비교하였다 (농도 계측 분석; 이미지J 소프트웨어). 농도 계측 분석에 의한 단백질 농도 측정을 위해, 상이한 양의 BSA를 로딩하였다 (레인 2: 0.2 mg/mL; 레인 3: 0.4 mg/mL; 레인 4: 0.6 mg/mL). 각각 E0713 및 E0714에 대한 최종 샘플 (레인 6 및 7) 상의 HCMV 오량체 복합체 농도를 측정하였다. *MM: 프리시젼 플러스 프로테인(Precision Plus Protein)™ 모두 청색 표준 (바이오-래드(Bio-Rad), #161-0373, 레인 1).
도 10: 서열식별번호: 18에 기반한 정제된 오량체 복합체의 특징화
DSP 프로세스 (IMAC-AEX-IMAC) 종료시 생성물의 정체를 직접 ELISA를 통해 확인하였다. α-gH-항체 (산타 크루즈(Santa Cruz), sc-58113) 및 α-His-항체 (AbD 세로텍, MCA1396)로 복합체를 확인하고, α-마우스-HRP 항체 (셀 시그널링(Cell Signaling), 7076S)로 검출하였다. 신호를 gH 및 태그의 공동-존재를 확인할 수 있고, 그러므로, 신호는 가용성 HCMV 오량체 복합체의 무손상성을 나타낸다. 음성 대조군 (neg.ctrl.)은 관심 유전자가 없는 바큘로바이러스 샘플을 반영한다.
도 11: 서열식별번호: 18에 기반한 오량체 복합체의 수율에 관한 안정화제의 영향
완충제, pH 및 안정화 시약, 예컨대, EDTA에 관한 오량체 복합체 안정성 입증. 정제 후, 이전 써모플루오르-쉬프트 검정법에 기반한 각종 완충제를 이용하는 투석을 수행함으로써 상이한 완충제 및 pH와 조합하여 안정화제의 영향을 입증하였다. 농도 계측 분석에 의해 단백질 농도를 측정하기 위해, 상이한 양의 BSA를 로딩하였다 (레인 1: 0.2 mg/mL; 레인 2: 0.4 mg/mL; 레인 3: 0.6 mg/mL). 상이한 완충제를 이용하여 투석을 수행한 후, 상청액 및 펠릿 중 HCMV 오량체 복합체가 나타났다. 레인 5: PBS, 20 mM EDTA (pH 6.0) (상청액); 레인 6: PBS, 20 mM EDTA (pH 6.0) (펠릿); 레인 7: 트리스, 20 mM EDTA (pH 7.4) (상청액); 레인 8: 트리스, 20 mM EDTA (pH 7.4) (펠릿); 레인 9: 트리스, 20 mM EDTA (pH 6.0) (상청액); 레인 10: 트리스, 20 mM EDTA (pH 6.0) (펠릿); *MM: 프리시젼 플러스 프로테인™ 모두 청색 표준 (바이오-래드, #161-0373, 레인 4).
(B, C) 투석 동안 다양한 양의 EDTA의 입증. 10 mM EDTA를 사용한 결과, 생성물 중 대략 절반이 침전에 의해 손실된 것으로 나타났고 (펠릿), EDTA의 양을 증가시키면, 복합체는 안정화되는 것으로 나타났다. (B) 저용량의 EDTA를 이용한 오량체 복합체, 레인 2: 트리스, 10 mM EDTA (pH 7.4) (상청액); 레인 3: 트리스, 10 mM EDTA (pH 7.4) (펠릿); (C) 농도 계측 분석에 의해 단백질 농도를 측정하기 위해, 상이한 양의 BSA를 로딩하였다 (레인 1: 0.2 mg/mL; 레인 2: 0.4 mg/mL; 레인 3: 0.6 mg/mL). 상이한 완충제를 이용하여 투석을 수행한 후, 상청액 및 펠릿 중 HCMV 오량체 복합체가 나타났다. 레인 5: 트리스, 20 mM EDTA (pH 7.4) (상청액); 레인 6: 트리스, 20 mM EDTA (pH 7.4) (펠릿); 레인 7: 트리스, 15 mM EDTA (pH 7.4) (상청액); 레인 8: 트리스, 15 mM EDTA (pH 7.4) (펠릿); 레인 9: 트리스, 25 mM EDTA (pH 6.0) (펠릿); 레인 10: 트리스, 25 mM EDTA (pH 6.0) (상청액); *MM: 프리시젼 플러스 프로테인™ 모두 청색 표준 (바이오-래드, #161-0373, 레인 4). 제1 투석 단계 동안 침전이 최소로 일어나는 완충제는 트리스, 20 mM EDTA (pH 7.4)인 것으로 보인다.
도 12: 생체내 연구를 위한 스케줄
용량 효과, 오량체 복합체 변이체 및 애주번트를 포함하는 또는 포함하지 않는 상태에서 각종 CMV 단백질과의 조합을 입증하기 위해 추가의 생체내 연구를 수행하였다.
CMV에 대한 보호, 중화 면역 반응을 유도하는 강력한 CMV 항원 확인, 및 높은 보호 수준을 달성하는 CMV 백신 개발이 계속해서 요구되고 있다. CMV의 오량체 gH/gL/UL128/UL130/UL131A 복합체는 신규한 CMV 백신 개발을 위한 유망한 도구이다. 그러나, 오량체 복합체의 대량 생산은 비효율적인 단백질 발현 시스템으로 인해 방해받아 왔다. 본 발명자들은 단백질 성분을 공동 발현하기 위해 바큘로바이러스 시스템을 최초로 사용하였고, 생체내에서 면역원성 반응을 유도할 수 있는 기능적 오량체 복합체를 어셈블리하였다고 보고하였다.
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은
(i) 바큘로바이러스를 이용하여 숙주 세포에서 CMV 단백질 UL128, UL130, UL131a, gH (UL75) 및 gL (UL115)을 공동 발현시키는 단계;
(ii) 상기 공동 발현으로부터 수득된 오량체 복합체를 숙주 세포 및/또는 상청액으로부터 정제하는 단계; 및
(iii) 임의적으로 정제된 오량체 복합체를 킬레이트화제 및/또는 안정화제를 포함하는 완충제 용액 중에서 보관하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있는, CMV 단백질 UL128, UL130, UL131A, gH (UL75) 및 gL (UL115)로 구성된 오량체 복합체를 제공한다.
"CMV"라는 용어는 시토메갈로바이러스, 헤르페스비리다에의 바이러스 속, 또는 헤르페스바이러스를 지칭한다. 일반적으로, 상기 용어는 그 중에서도 인간 헤르페스바이러스 5 (HHV-5)로도 알려져 있는 인간 시토메갈로바이러스 (HCMV), 침팬지 시토메갈로바이러스 (CCMV), 심미안 시토메갈로바이러스 (SCCMV) 및 레서스(Rhesus) 시토메갈로바이러스 (RhCMV)를 비롯한, CMV의 모든 종을 포함한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 CMV는 HCMV이다. TR, 타운, AD 169, 톨레도, 메를린, TB40, 다비스(Davis) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다수의 HCMV 균주가 공지되어 있다.
전형적으로, CMV는 5종 이상의 캡시드 단백질 (UL46, UL48A, UL85, UL86, UL104의 유전자 생성물), 19종의 조절 단백질, 17종의 피막 단백질 (UL25, UL45, UL47, UL48, UL69, UL71, UL72, UL76, UL77, UL83 [pp65], UL88, UL93, UL94, UL95, UL97, UL99, UL103의 유전자 생성물), 5종의 표면 또는 외피 단백질 (UL55 [gB], UL73 [gN], U74 [gO], UL75 [gH], UL100 [gM], UL115 [gL]의 유전자 생성물), 오픈 리딩 프레임 UL128, UL130, UL131A로부터의 비-범주화 유전자 생성물; 15종의 베타-헤르페스바이러스 특이 유전자 유래 단백질 (UL23, UL24, UL32, UL33, UL35, UL36, UL38, UL43, UL74 [gO], UL78, UL82, UL96, IRS1, US22, TRS1) 및 오픈 리딩 프레임 (ORF) UL50, UL80.5 유래의 소위 기능적 단백질을 포함한다.
"오량체 복합체"라는 용어 또는 그의 단축형 형태로 본원에서는 또한 "복합체"로도 사용되는 상기 용어는, 표적 세포, 특히, 내피, 상피 및 섬유모세포 세포로의 바이러스 침입을 촉진시키는 것으로 간주되는 5개의 CMV 단백질인 UL128, UL130, UL131A, gH (UL75) 및 gL (UL115)을 포함하는 단백질 복합체를 의미한다. 오량체 복합체 모델, 및 그의 단백질-단백질 상호작용은 문헌 [Ryckmann BJ et al. J Virol. 2008; 82(1): 60-70]에서 제안된 바 있다. 본 발명의 오량체 복합체에서, gH, gL 및 pUL128은 전형적으로 이황화 결합을 통해 연결되어 있는 것으로 사료되며, UL130 및 UL131A는 전형적으로 비-공유 상호작용에 의해 오량체 복합체 내로 도입(및/또는 상호 연결)되어 있다. 오량체 복합체의 화학량론 비는 1:1:1:1:1인 것으로 추정된다 (Ryckmann BJ et al. J Virol. 2008; 82(1): 60-70). 본 발명의 오량체 복합체는 생체내에서 CMV 비리온과 면역학적으로 교차 반응하는 항체를 유도할 수 있는 것이 바람직하다. 오량체 복합체는 바람직하게는 가용성이다. 그러나, 비록 덜 바람직하기는 하지만, 막 결합 형태일 수도 있다. 가용성은 바람직하게는 gH의 막횡단 도메인을 결실시킴으로써 달성된다. 본 발명의 오량체 복합체와 관련하여 사용될 때, "~으로 구성된"이라는 용어는 오량체 복합체가 본원에 기술된 바와 같은 5개의 단백질 gH, gL, UL128, UL130 및 UL131A를 포함하고(encompasses/comprises), 추가의 CMV 단백질을 추가로 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 그러나, 바람직하게, 오량체 복합체는 오직 5개의 CMV 단백질 gH, gL, UL128, UL130 및 UL131A만을 함유한다. 본 발명의 오량체 복합체는 조성물 형태일 수 있다. 따라서, 하나 이상의 추가의 작용제가 오량체 복합체에 첨가되거나, 또는 그와 혼합됨으로써 조성물로 생성된다. 상기 추가의 작용제, 예컨대, 완충제, 킬레이트화제 및/또는 안정화제는 본원에 기술되어 있다. 적합한 조성물은 추가로 본원에 기술되어 있다.
본 발명의 오량체 복합체에서, 단백질 중 하나 이상의 것은 추가의 B 및/또는 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다. 상기 T 세포 에피토프는 CD4 T 세포 에피토프 또는 CD8 T 세포 에피토프일 수 있다. 바람직하게, 상기 에피토프는 서열식별번호: 22-66에 제시된 에피토프 중 어느 하나일 수 있다.
"에피토프"란 면역계, 예컨대, B 세포 또는 T 세포에 의해 인식되는 항원의 일부분이다. 상기 용어는 입체구조적 에피토프 및 선형 (또는 연속) 에피토프, 둘 모두를 포함한다. 입체구조적 에피토프는 항원의 아미노산 서열의 불연속 섹션을 포함하는 반면, 선형 에피토프는 항원의 아미노산 서열의 연속 섹션으로 구성되어 있다. 상기 용어는 크립토토프 및 네오토프를 추가로 포함한다. "크립토토프"는 천연적으로 발생된 항원, 예컨대, 바이러스에 숨겨져 있지만, 항원이 그의 천연 입체구조로 존재하지 않을 때에 접근이 가능할 수 있는 에피토프이다. "네오토프"는 단백질 단량체에서는 발견되지 않지만, 오직 단백질의 4차 구조에서만 발견이 되는 에피토프이다.
추가의 에피토프가 오량체 복합체의 하나 이상의 단백질 성분의 아미노산 서열에 융합될 수 있는 것으로 구상된다. 아미노산 서열의 본 발명의 복합체의 원하는 단백질 성분(들)에의 융합은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 표준 유전자 조작 방법에 의해 달성될 수 있다.
본 발명에 따라, 에피토프는 B 세포 및/또는 T 세포 에피토프일 수 있다.
B 세포 에피토프는 특정 막 결합 B 세포 수용체 (BCR) 또는 항체에 의해 인식된 항원 (예컨대, 천연 단백질)의 영역이다. x선 결정학법, 어레이 기반 올리고펩티드 스캐닝, 부위 지정 돌연변이유발법, 돌연변이유발 맵핑, 및 파지 디스플레이 뿐만 아니라, 문헌 [Sun et al. Comput Math Methods Med. 2013; 2013: 943636]에 리뷰된 컴퓨터를 이용한 방법을 비롯한, B 세포 에피토프를 확인 또는 선별하는 다수의 방법은 쉽게 이용가능하다. 예를 들어, 적합한 방법으로는 기하학적 속성 및 특이적인 물리화학적 특성을 비롯한 항원 및 에피토프 관련 성향 스케일의 3D 구조에 의존하는 구조 기반 예측 모델을 포함한다. 구조 기반 알고리즘 및 웹 서버 (프로그램)로는 예컨대, EPSVR & EP메타(EPSVR & EPMeta) (http://sysbio.unl.edu/services/), EPCES (http://sysbio.unl.edu/services/EPCES/), 및 에피토피아(Epitopia) (http://epitopia.tau.ac.il/)를 포함한다. 미모토프 기반 예측 방법은 입력값으로서 항체 친화도 선별 펩티드 및 항원의 3D 구조, 둘 모두를 필요로 하는 조합 방법이다. 미모토프 기반 예측 모델에 기반한 예시적인 알고리즘 및 프로그램으로는 예컨대, 미모프로(MimoPro) (http://informatics.nenu.edu.cn/MimoPro), 펩서프(PepSurf) (http://pepitope.tau.ac.il) 및 에피서치(EpiSearch) (http://curie.utmb.edu/episearch.html)를 포함한다. 추가로, 오직 항원의 1차 서열에만 의존하는 서열 기반 예측 모델, 예컨대, 문헌 [Sun et al. Comput Math Methods Med. 2013; 2013: 943636]에 리뷰되어 있는 것과 같은 BEST 및 장(Zhang)의 방법이 이용가능하다. 추가로, 단백질-단백질 상호작용의 결합 부위 예측에 초점을 맞추는 방법으로 항원과 항체의 상호작용을 추론하는 데 결합 부위 예측 모델, 예컨대, 프로메이트(ProMate), 콘서프(ConSurf), PINUP, 및 PIER이 사용될 수 있다.
특정 이론으로 한정하고자 하지 않으면서, 본 발명의 복합체에 하나 이상의 B 세포 에피토프가 존재함에 따라 바람직하게는 B 세포에 면역자극성 효과를 미치게 되고, 예컨대, B 세포를 활성화 및/또는 분화시키고, 면역원성 반응을 유도하고, 이는 예컨대, 중화 항체의 생성을 일으킬 수 있는 것으로 구상된다. B 세포는 에피토프의 면역자극성 잠재능을 측정하기 위해 관련 기술분야에 공지된 표준 프로토콜에 따른 상이한 방법으로 시험될 수 있다. 적합한 검정법으로는 림프증식성 검정법, 특이 T 세포 상에서 유도된 활성화 마커 검출, ELI스폿(ELIspot), 세포질내 시토카인 염색법 (ICS), 및 시토카인 시크리션(Cytokine Secretion)이 있다.
T 세포 에피토프는 프로세싱된 단백질 항원으로부터 유래된 것이다. 본 발명과 관련하여, T 세포 에피토프는 CD4-T 세포 에피토프 또는 CD8 T 세포 에피토프일 수 있다. 세포독성 (CD8) T 세포는 MHC 클래스 I 분자에 의해 제시되는 세포내 펩티드 (CD8 T 세포 에피토프)를 인식하는 반면, T 헬퍼 세포는 세포외 공간으로부터 흡수되고, MHC 클래스 II 분자에 의해 제시되는 펩티드 (CD4 T 세포 에피토프)를 인식한다. 펩티드:MHC 복합체 (pMHC)는 T 세포 수용체와 상호작용하여 그를 활성화시키고, 이어서, 세포성 면역 반응을 유도한다.
T 세포 에피토프 예측 및/또는 선별을 위한 다수의 인실리코 방법이 이용가능하다. CD8+ T 세포 에피토프를 예측하는 경우, 문헌 [Larsen et al. BMC Bioinformatics 2007, 8:424]에 리뷰되어 있는 바와 같이, NetCTL-1.2 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/), EpiJen (http://www.ddg-pharmfac.net/epijen/EpiJen/EpiJen.htm), 또는 MAPPP (http://www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/)가 사용될 수 있다. CD4+ T 세포의 경우, 에피토프 예측을 위한 컴퓨터를 이용한 모델은 문헌 [Oyarzuen P et al. BMC Bioinformatics 2013, 14:52]에 리뷰된 바 있으며, 이는 결합 모티프를 확인하기 위해 펩티드 서열 비교에 의존하는 데이터 주도형 방법, 예컨대, 랭크펩(Rankpep) (http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html), TEPITOPE, 및 NN-얼라인(NN-align) (http://www.cbs.dtu.dk/services/NNAlign/) 뿐만 아니라, 결합 에너지를 예측하기 위해 분자 모델링 계산법을 수행하고, 이로써, 실험적 결합 데이터로부터의 독립을 제공하는 구조 기반 방법, 예컨대, NetMHCIIPan-2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan-2.0/), TEPITOPEpan (http://www.biokdd.fudan.edu.cn/Service/TEPITOPEpan/), 및 프레디박(Predivac) (http://predivac.biosci.uq.edu.au/)을 포함한다.
특정 이론으로 한정하고자 하지 않으면서, 본 발명의 복합체에 하나 이상의 T 세포 에피토프가 존재함에 따라 바람직하게는 T 세포에 면역자극성 효과를 미치게 되고, 예컨대, T 세포를 활성화 및/또는 분화시키고, 바람직하게, 면역원성 반응을 유도하는 것으로 구상된다. T 세포에 대한 에피토프의 면역자극성 잠재능을 측정하는 데 적합한 방법으로는 MHC 펩티드 다량체 검정법, 솔리드 페이즈 MHC-펩티드 컴플렉스(Solid Phase MHC-Peptide Complex) 검정법, 림프증식성 검정법, 특이 T 세포 상에서 유도된 활성화 마커 검출, ELI스폿, 세포질내 시토카인 염색법 (ICS), 시토카인 시크리션 및 셀 서페이스 캡쳐(Cell Surface Capture: CSC), 및 문헌 [Li Pira G et al. J Biomed Biotechnol. 2010;2010:325720]에 리뷰되어 있는 바와 같은 시토카인 시크리션 및 웰 서페이스 캡쳐(Well Surface Capture) (셀-ELISA(Cell-ELISA))를 포함한다.
본원에 기술된 바와 같은 오량체 복합체에 대한 대안으로, 다른 CMV 복합체가 본 발명의 수단 및 방법에 의해 제조되고, 이로써, 본 발명의 측면 및 실시양태에 적용된다는 것 또한 구상된다. 예를 들어, gH, gL, UL128, UL130 및 UL131A 중 2, 3, 또는 4개로 구성된 복합체가 제조된다는 것이 구상된다. 이량체 복합체의 바람직한 예는 gH 및 gL, 또는 UL130 및 UL131A 사이의 복합체이다. 오량체 복합체에 대한 대안인 또 다른 바람직한 예는 gH/gL/gO 사이의 삼량체 복합체이다. 그러므로, 오량체 복합체와 관련하여 본원에 기술된 모든 측면 및 실시양태는 이를 준용하여 앞서 기술된 이량체 또는 삼량체 복합체에 완전하게 적용될 수 있다. 본원에 기술된 다른 CMV 복합체는 추가의 B 및/또는 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다는 것 또한 구상된다. 상기 T 세포 에피토프는 본원에 기술된 바와 같은 CD4 T 세포 에피토프 또는 CD8 T 세포 에피토프일 수 있다.
본 발명의 복합체는 바람직하게는 단리된 형태로 제조되고, 사용된다. 본원에서 사용되는 바, "단리된"이라는 용어는 그의 천연 환경으로부터 제거되었다는 것을 의미한다. 그러므로, "단리된 오량체 복합체" 또는 "단리된 복합체"는 바람직하게는 CMV 감염된 세포의 표면 상의 또는 감염성 CMV 비리온 내의 CMV 막 단백질 복합체를 포함하지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "gH"라는 용어는 종종 "UL75" 또는 "pUL75"로서 지칭될 수 있다. 상기 용어들은 각각 나머지 다른 것으로 대체될 수 있고, 따라서, 이들 용어는 상호교환적으로 사용된다. "gH"라는 용어는 서열식별번호: 1에 제시된 참조 서열과 비교하여 돌연변이를 가지는 gH 폴리펩티드를 포함하고, 본원에 기술된 바와 같은 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열과 어느 정도의 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 또한 포함한다. 길이가 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650 또는 700개의 아미노산 길이인 gH 폴리펩티드의 단편으로서, 상기 단편은 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같은 다른 4가지 단백질과 함께 오량체 복합체를 형성할 수 있는 것인 단편 또한 상기 용어에 포함된다. 바람직한 gH 폴리펩티드에는 막횡단 도메인 (TM)이 없다. TM 도메인이 없다는 것은 상기 변형된 폴리펩티드가 지질 이중층 내에 존재할 수 없다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, gH 폴리펩티드에는 전장의 천연 TM 도메인이 없고; 다른 실시양태에서, 이는 천연 TM 도메인 중 일부를 보유할 수 있지만, 단백질이 지질 이중층에 존재할 수 있도록 하는 데 충분한 정도의 것은 아니다. 따라서, 폴리펩티드는 천연 gH TM 도메인 중 최대 10개의 아미노산 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산)을 함유할 수 있다. TM 도메인 중 일부 또는 그 모두가 존재하지 않는다는 것 이외에도, 폴리펩티드에는 또한 CMV gH의 천연 C 말단 도메인도 없을 수 있거나, 또는 C 말단 도메인 중 일부가 없을 수 있다.
gH의 엑토도메인은 소수성 막횡단 도메인 (TM)이 없는 gH의 일부에 상응한다. 엑토도메인, 신호 서열 및 TM 도메인의 위치 및 길이는 주어진 gH 단백질 서열의 길이를 따라 진행되는 컴퓨터를 이용한 소수성 분석에 기초하여 예측될 수 있다. 신호 서열 및 TM 도메인의 소수성 수준이 가장 높고, 이들 두 영역은 소수성이 더 작은 엑토도메인 측면에 위치한다.
본원에서 사용될 때, "gL"이라는 용어는 종종 "UL115" 또는 "pUL115"로서 지칭될 수 있다. 상기 용어들은 각각 나머지 다른 것으로 대체될 수 있고, 따라서, 이들 용어는 상호교환적으로 사용된다. "gL"이라는 용어는 서열식별번호: 2에 제시된 참조 서열과 비교하여 돌연변이를 가지는 gL 폴리펩티드를 포함하고, 본원에 기술된 바와 같은 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열과 어느 정도의 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 또한 포함한다. 길이가 50, 100, 150, 200, 또는 250개의 아미노산 길이인 gL 폴리펩티드의 단편으로서, 상기 단편은 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같은 다른 4가지 단백질과 함께 오량체 복합체를 형성할 수 있는 것인 단편 또한 상기 용어에 포함된다.
본원에서 사용될 때, "UL128"이라는 용어는 종종 "pUL128"로서 지칭될 수 있다. 상기 용어들은 각각 나머지 다른 것으로 대체될 수 있고, 따라서, 이들 용어는 상호교환적으로 사용된다. "UL128"이라는 용어는 서열식별번호: 3에 제시된 참조 서열과 비교하여 돌연변이를 가지는 UL128 폴리펩티드를 포함하고, 본원에 기술된 바와 같은 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열과 어느 정도의 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 또한 포함한다. 길이가 50, 100, 또는 150개의 아미노산 길이인 UL128 폴리펩티드의 단편으로서, 상기 단편은 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같은 다른 4가지 단백질과 함께 오량체 복합체를 형성할 수 있는 것인 단편 또한 상기 용어에 포함된다.
본원에서 사용될 때, "UL130"이라는 용어는 종종 "pUL130" 또는 "UL130A"로서 지칭될 수 있다. 상기 용어들은 각각 나머지 다른 것으로 대체될 수 있고, 따라서, 이들 용어는 상호교환적으로 사용된다. "UL130"이라는 용어는 서열식별번호: 4에 제시된 참조 서열과 비교하여 돌연변이를 가지는 UL130 폴리펩티드를 포함하고, 본원에 기술된 바와 같은 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열과 어느 정도의 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 또한 포함한다. 길이가 50, 100, 150, 또는 200개의 아미노산 길이인 UL130 폴리펩티드의 단편으로서, 상기 단편은 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같은 다른 4가지 단백질과 함께 오량체 복합체를 형성할 수 있는 것인 단편 또한 상기 용어에 포함된다.
본원에서 사용될 때, "UL131A"라는 용어는 종종 "pUL131A," "UL131" 또는 "pUL131"로서 지칭될 수 있다. 상기 용어들은 각각 나머지 다른 것으로 대체될 수 있고, 따라서, 이들 용어는 상호교환적으로 사용된다. "UL131a"라는 용어는 서열식별번호: 5에 제시된 참조 서열과 비교하여 돌연변이를 가지는 UL131A 폴리펩티드를 포함하고, 본원에 기술된 바와 같은 서열식별번호: 5에 제시된 아미노산 서열과 어느 정도의 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 또한 포함한다. 길이가 50, 또는 100개의 아미노산 길이인 UL131A 폴리펩티드의 단편으로서, 상기 단편은 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같은 다른 4가지 단백질과 함께 오량체 복합체를 형성할 수 있는 것인 단편 또한 상기 용어에 포함된다.
언급한 바와 같이, 본 발명의 각 단백질, 특히, 각각 gH, gL, UL128, UL130 및 UL131A, 또는 그의 단편은, 하기 돌연변이가 본 단백질을 항원으로 사용하는 데 이를 불리하게 하지 않는 한, 특히, 적어도 상기 오량체 복합체에 결합할 수 있는 항체 및/또는 상기 오량체 복합체의 생물학적 효과를 중화시킬 수 있는 항체 생산을 유도할 수 있는 하나 이상의 에피토프를 유지하는 한, 각각 서열식별번호: 1 (gH), 서열식별번호: 2 (gL), 서열식별번호: 3 (UL128), 서열식별번호: 4 (UL130), 및 서열식별번호: 5 (UL131A)에 제시된 참조 서열과 비교하였을 때, 돌연변이, 예컨대, 삽입, 결실 및 치환을 함유할 수 있다. 추가로, 상기 돌연변이는 본 발명의 오량체 복합체를 형성할 수 있는 단백질의 능력을 방해하지 않아야 한다. 본 발명의 오량체 복합체를 형성할 수 있는 능력은 단백질 정제를 수행하고, 예컨대, 비환원성 PAGE, 웨스턴 블롯 및/또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 단백질을 분석함으로써 시험될 수 있다. 특히, 각 단백질은 예컨대, 검출, 정제를 촉진시킬 수 있고/거나, 가용성을 증진시키는 태그를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 예시적인 태그로는 His-태그, Strep-태그, His-Strep-태그, StrepII-태그, Softag 1, TC-태그, myc-태그, FLAG-태그, HA-태그, V5-태그, Avi-태그, 칼모듈린-태그, 폴리글루타메이트-태그, 아밀로이드 베타-태그, GST-태그, MBP-태그 또는 S-태그를 포함하고, His-태그가 바람직하다. His-태그는 6 또는 8개의 His-잔기로 구성될 수 있고, 8개의 His-잔기가 바람직하다. 단백질은 또한 그의 성숙한 형태로 말단절단되고/거나 프로세싱될 수 있고, 예를 들어, 단백질에는 그의 천연 형태에 존재하는 신호 서열, 및/또는 막횡단 도메인이 없을 수 있다.
언급된 바와 같이, 본 발명의 gH 단백질 또는 그의 단편은 서열식별번호: 1과 다양한 정도의 동일성을 가질 수 있고, 예컨대, 서열식별번호: 1에 언급된 서열과 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일할 수 있다. 바람직한 gH 단백질은 (i) CMV gL과 이량체화될 수 있고/거나; (ii) 삼량체 gH/gL/gO 복합체의 일부를 형성하고/거나; (iii) 오량체 gH/gL/UL128/UL130/UL131A 복합체의 일부를 형성하고/거나; (iv) 그에는 막횡단 도메인이 없고/거나; (iv) 생체내에서 CMV 비리온과 면역학적으로 교차 반응하는 항체를 유도할 수 있다.
언급된 바와 같이, 본 발명의 gL 단백질 또는 그의 단편은 서열식별번호: 2와 다양한 정도의 동일성을 가질 수 있고, 예컨대, 서열식별번호: 2에 언급된 서열과 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일할 수 있다. 바람직한 gL 단백질은 (i) CMV gH와 이량체화될 수 있고/거나; (ii) 삼량체 gH/gL/gO 복합체의 일부를 형성하고/거나; (iii) 오량체 gH/gL/UL128/UL130/UL131A 복합체의 일부를 형성하고/거나; (iv) 생체내에서 CMV 비리온과 면역학적으로 교차 반응하는 항체를 유도할 수 있다.
언급된 바와 같이, 본 발명의 UL128 단백질 또는 그의 단편은 서열식별번호: 3과 다양한 정도의 동일성을 가질 수 있고, 예컨대, 서열식별번호: 3에 언급된 서열과 60%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일할 수 있다. 바람직한 UL128 단백질은 (i) 오량체 gH/gL/UL128/UL130/UL131A 복합체의 일부를 형성하고/거나; (ii) 생체내에서 CMV 비리온과 면역학적으로 교차 반응하는 항체를 유도할 수 있다.
언급된 바와 같이, 본 발명의 UL130 단백질 또는 그의 단편은 서열식별번호: 4와 다양한 정도의 동일성을 가질 수 있고, 예컨대, 서열식별번호: 4에 언급된 서열과 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일할 수 있다. 바람직한 pUL130 단백질은 (i) 오량체 gH/gL/UL128/UL130/UL131 복합체의 일부를 형성하고/거나; (ii) 생체내에서 CMV 비리온과 면역학적으로 교차 반응하는 항체를 유도할 수 있다.
언급된 바와 같이, 본 발명의 UL131A 단백질 또는 그의 단편은 서열식별번호: 5와 다양한 정도의 동일성을 가질 수 있고, 예컨대, 서열식별번호: 5에 언급된 서열과 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일할 수 있다. 바람직한 UL131A 단백질은 (i) 오량체 gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A 복합체의 일부를 형성하고/거나; (ii) 생체내에서 CMV 비리온과 면역학적으로 교차 반응하는 항체를 유도할 수 있다.
"서열 동일성" 또는 "동일성(%)"이란, 표준화된 알고리즘을 사용하여 정렬된 2개 이상의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이에 매치되는 잔기의 비율(%)을 의미한다. 상기 알고리즘은 두 서열 사이의 정렬이 최적화될 수 있고, 이로써 두 서열의 더욱 중요한 비교를 달성할 수 있도록 비교되는 서열에 갭을 표준화되고, 재현가능한 방식으로 삽입할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 두 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 사이의 서열 동일성은 NCBI BLAST 프로그램 버전 2.2.29 (2014년 1월 6일)를 사용하여 측정된다 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389-3402). 두 아미노산 서열의 서열 동일성은 blastp 세트를 이용하여 하기 파라미터로 측정될 수 있다: 매트릭스: BLOSUM62, 워드 크기: 3; 기대값: 10; 갭 비용: 존재 = 11, 확장 = 1; 필터 = 활성화된 낮은 복잡도; 필터 스트링: L; 구성 조절: 조건부적 구성 스코어 매트릭스 조절. 본 발명의 목적을 위해, 두 뉴클레오티드 서열의 서열 동일성은 blastn 세트와 함께 NCBI BLAST 프로그램 버전 2.2.29 (2014년 1월 6일)를 사용하여 하기 예시적인 파라미터로 측정된다: 워드 크기: 11; 기대값: 10; 갭 비용: 존재 = 5, 확장 = 2; 필터 = 활성화된 낮은 복잡도; 매치/미스매치 스코어: 2,-3; 필터 스트링: L; m.
"폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 상호교환적으로 사용된다. "폴리펩티드"라는 용어는 2개 이상의 아미노산, 전형적으로, 3개 이상, 바람직하게, 20개 이상, 더욱 바람직하게는 30개 이상, 예컨대, 50개 이상의 아미노산을 함유하는 단백질 또는 펩티드를 의미한다. 따라서, 폴리펩티드는 아미노산 서열을 포함하며, 이에 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드은 본원에서 종종 "폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드"로 언급된다. 따라서, 본원에서 "폴리펩티드 서열"이라는 용어는 "아미노산 서열"이라는 용어와 상호교환적으로 사용된다.
"아미노산" 또는 "aa"라는 용어는 천연적으로 발생된 아미노산 및 합성 아미노산 뿐만 아니라, 천연적으로 발생된 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 의미한다. 천연적으로 발생된 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩된 것 뿐만 아니라, 이후에 변형된 아미노산, 예컨대, 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체란, 천연적으로 발생된 아미노산과 동일한 기본 화학적 구조를 가지는, 즉, 수소, 카르복실 기, 아미노 기, 및 R 기, 예컨대, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄에 결합된 탄소를 가지는 화합물을 지칭한다. 상기 유사체는 변형된 R 기 (예컨대, 노르류신), 또는 변형된 펩티드 백본을 가지지만, 천연적으로 발생된 아미노산과 동일한 기본 화학적 구조를 유지한다. 아미노산 모방체란, 아미노산의 일반 화학 구조와는 다른 구조를 가지지만, 천연적으로 발생된 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 화학적 화합물을 의미한다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 gH, gL, UL128, UL130 및/또는 UL131A 단백질을 코딩하는 핵산 분자 또는 단편을 제공한다. 상기 핵산 분자는 예컨대, 상기 단백질 중 하나 이상의 것을 발현할 때 사용되거나, 또는 그 자체로서 예컨대, 백신 접종을 위한 핵산 분자로서 사용된다. 상기 단백질 중 하나 이상의 것을 발현하기 위한 목적을 위해, 이는 보편적으로 공지되어 있고, 본원에 기술된 바와 같이 벡터로 클로닝된다.
공동 발현 단계
"공동 발현"이란, 바큘로바이러스, 예컨대, 바큘로바이러스 발현 시스템 또는 BacMam 발현 시스템을 사용하여 숙주 세포, 바람직하게, 곤충 세포 또는 포유동물 세포에서 발현되는 하나 이상의 CMV 단백질에 대해 사용되는 용어이다. 본원에서 "발현 벡터"란, 유전 물질이 발현될 수 있는 표적 숙주 세포로 유전 물질을 전달하는 데 사용되는 비히클로 정의된다. 특히, CMV 단백질이 바큘로바이러스 발현 시스템에서 발현되는 것이 구상된다. "발현 시스템"은 발현 벡터, 및 숙주 세포에서 외래 유전자가 발현될 수 있도록 허용하는 환경을 제공하는, 상기 벡터에 대한 숙주 세포의 조합이다.
본 발명의 복합체는 일과적으로 또는 안정적으로 발현될 수 있다.
바큘로바이러스는 주로 곤충에서 발견되는 간상의 이중 가닥 DNA 바이러스이다.
바큘로바이러스 발현 시스템은 전형적으로 예컨대, 표적 유전자를 함유하는 전달 벡터를 이용한 상동성 재조합을 통한 비필수 바이러스 게놈 영역 내로의 외래 유전자의 도입에 기반한다. 생성된 재조합 바큘로바이러스에는 비필수 유전자 (예컨대, polh, v-cath, chiA) 중 하나가 없을 수 있으며, 이는 적합한 숙주 세포에서 발현될 수 있는 이종성 단백질을 코딩하는 외래 유전자로 대체될 수 있다. 이러한 기술은 일반적으로 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 예컨대, 문헌 [Kosta et al. Nat Biotechnol. 2005; 23(5):567-75]에 리뷰되어 있다. 재조합 바큘로바이러스 벡터를 제조하는 구체적인 접근법은 백-투-백(Bac-to-Bac)® 바큘로바이러스 시스템 (인비트로겐)이다.
본 발명의 재조합 바큘로바이러스 발현 벡터는 우선적으로 숙주 세포, 및 임의적으로 원핵 세포 예컨대, E. 콜라이에서의 복제가 가능하다. 본 발명에 따라, 단백질의 재조합 발현을 위해 보편적으로 사용되는, 바큘로바이러스 유래의 임의의 바큘로바이러스 발현 벡터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 바큘로바이러스 벡터는 예컨대, AcMNPV, 봄빅스 모리(Bombyx mori) (Bm)NPV, 헬리코베르파 아르미게라(Helicoverpa armigera) (Hear) NPV) 또는 스포도프테라 엑시구아(Spodoptera exigua) (Se) MNPV로부터 유래된 것일 수 있다. 바큘로바이러스 벡터는 바크미드일 수 있다.
생산된 CMV 단백질이 진정한 포유동물 글리코실화 패턴을 가질 수 있고, 이로써, 감염성 CMV에 존재하는 에피토프를 가지는 것으로 알려져 있기 때문에, 선행 기술에서는 포유동물 세포에서의 CMV 단백질 발현이 바람직하였다는 것이 일반적인 편견이다. 따라서, 면역화를 위해 사용될 때, 이러한 단백질만이 감염 동안 천연적으로 발생된 CMV 입자에 결합할 수 있는 항체를 생성할 수 있을 것으로 기대되었다.
놀랍게도, 본 발명자들은 바큘로바이러스 벡터를 사용하여 면역원성 오량체 복합체를 포유동물 세포 뿐만 아니라, 곤충 세포로부터 수득할 수 있다는 것을 밝혀내었다. 동시에, 바큘로바이러스 시스템을 사용함으로써 본 발명의 오량체 복합체를 다량으로 및 고순도로 제조할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 수단 및 방법의 도움으로 제조된 오량체 복합체는 특이적인 글리코실화 패턴, 즉, 그를 독특한 것으로 만들고, 이로써, 포유동물 글리코실화와 다른 곤충 글리코실화 (문헌 [Harrison and Jarvis (2006), Adv. Virus Res. 68, 159-191] 참조)를 보인다.
따라서, 숙주 세포는 일반적으로 곤충 세포 또는 포유동물 세포일 수 있다. 일반적으로, 바람직하게는 본 발명의 오량체 복합체를 제조하기 위해 핵산 분자를 발현하는 데 적합하는 임의의 숙주 세포가 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 숙주 세포는 특히 곤충 세포, 바람직하게, Sf9, Sf21, 슈퍼 Sf9-1 (VE-1), 슈퍼 Sf9-2 (VE-2), 슈퍼 Sf9-3 (VE-3), Hi-5, 익스프레스 Sf+(Express Sf+), 및 S2 슈나이더(Schneider) 세포일 수 있고, 슈퍼 Sf-9-2가 바람직하다 [옥스포드 익스프레션 테크놀러지즈(Oxford Expression Technologies), 카탈로그 번호 600103, 영국 옥스포드; Fath-Goodin et al. (2006), Adv. Virus Res. 68, 75-90; Kroemer et al. (2006), J. Virol. 80(24), 12291-12228 및 US20060134743]. 본 발명에 따라 사용하는 데 적합한 예시적인 포유동물 숙주 세포는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 이는 HEK293, HEK293F, CHO, HeLa, HUVEC, HUAEC, Huh7, HepG2, BHK, MT-2, Cos-7, Cos-1, C127, 3T3, 인간 포피 섬유모세포 (HFF), 골수 섬유모세포, 바우스 흑색종, 1차 신경 세포 세포, 또는 상피 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection: ATCC)으로부터 이용가능한 무한증식 세포주를 포함한다. 포유동물 세포에서의 발현을 통해 생산된 단백질은 진정한 포유동물 글리코실화 패턴을 가지게 될 것이며, 이로써, 감염성 CMV 입자에 존재하는 에피토프를 소지하게 될 수 있다. 따라서, 이론으로 한정하고자 하지 않으면서, 포유동물 세포에서 본 발명의 오량체 복합체를 제조하면, 이를 통해 감염 동안 천연적으로 발생된 CMV 입자에 결합할 수 있는 항체가 제조될 것이다. 그러나, 본 발명자들은 곤충 세포에서 생산된 오량체 복합체는 중화 활성을 유도한다는 것을 관찰하였는 바, 특히 중화 항체는 이상적으로 상피/내피 세포 및 섬유모세포로의 CMV의 침입을 차단하거나 또는 적어도 감소시킨다.
그러나, 본원에 기술된 바와 같이, 숙주 세포는 또한 포유동물 세포일 수 있다. 예컨대, BacMam 시스템에서 바큘로바이러스 발현 벡터는 유전자를 포유동물 세포로 전달하는 데 사용된다.
본 발명자들은 예상 밖으로 예컨대, 본 발명의 오량체 복합체를 고수율로 제조할 수 있는 구체적인 파라미터를 발현하게 되었다. 예를 들어, 본 발명의 오량체 복합체는 성장 배지 1 ℓ당 1.0 mg 초과인 수준 (예컨대, 성장 배지 1 ℓ당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 100, 200, 300, 400, 500, 600, 650, 680, 700, 800, 900, 1,000 mg 또는 그 초과)으로 축적될 수 있다.
상기 내용에 따라, 공동 발현 단계는 본 발명의 오량체 복합체의 단백질을 발현하는 바큘로바이러스로 숙주 세포를 감염시키는 것을 포함하는 것으로 구상된다. 상기 숙주 세포를 감염시킬 때, 바큘로바이러스 역가는 약 107 pfu/mL 이상이고, 이는 바람직하게는 감염시 세포 계수가 약 2*106개의 세포/mL인 것이 추가로 구상된다.
이어서, 숙주 세포를 적합한 조건하에서 배양한다. 바람직하게, 감염 후 56-65 h 경과하였을 때, 숙주 세포 및/또는 그의 상청액을 수거한다. 대안으로, 숙주 세포 중 (총 100% 대비) 80% 이상이 생존가능할 때, 숙주 세포 및/또는 그의 상청액을 수거한다. 숙주 세포의 생존가능성은 예를 들어, 트립판 블루로 세포를 염색함으로써 측정될 수 있다. 생존가능한 세포는 색상을 띠지 않는 반면, 생존 불가능한 세포는 색상을 띨 것이다. 트립판 블루 염색을 하기와 같이 수행될 수 있다: 1 ml 세포 현탁액을 약 5분 동안 0.4% 트립판 블루로 염색시킨 후, 계수된 모든 세포 (즉, 계수된 모든 세포는 100%인 것으로 설정) 대비 생존가능/비-생존가능 세포의 비율(%)을 측정하기 위해 바람직하게는 혈구계를 사용함으로써 현미경 관찰을 수행한다.
그의 모든 문법적 형태의 "수거하는"이란, 숙주 세포 및/또는 상청액을 수득하는 조치 또는 프로세스를 의미할 수 있고, 이는 예를 들어, 트립신 처리, 여과, 및/또는 원심분리를 포함할 수 있다. 본 발명의 오량체 복합체가 그의 무손상 또는 기능적 형태로 수득될 수 있는 한, 임의의 방법이 가능하다.
본 발명의 방법에서, 숙주 세포를 해동 및 배양 후 15일째부터 50일째 사이, 바람직하게, 15일째부터 30일째 사이, 바람직하게, 18일째에 감염시키는 것이 추가로 구상된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 오량체 복합체는 그가 발현되는 세포로부터 분비된다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명의 오량체 복합체는 분비되지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 오량체 복합체의 단백질 중 어느 것도 추가의 분비 신호를 함유하지 않는다. 이론으로 한정하고자 하지 않으면서, 일단 오량체 복합체가 숙주 세포에서, 특히, 곤충 세포에서 어셈블리되고 나면, gH 단백질이 전체 복합체의 분비를 매개하는 것으로 가정된다.
정제
그의 모든 문법적 형태의 "정제하는"이란, 바람직하지 못한 화합물, 예컨대, 세포, 세포 파편, 배양 배지, 바큘로바이러스, 무손상 또는 손상 바큘로바이러스 등을 제거하는 것을 의미한다. 발현 시스템, 수율 등에 의존하는 적합한 정제 방법은 선행 기술에서 쉽게 이용가능하다. 예컨대, 정제는 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및/또는 친화성 크로마토그래피를 포함할 수 있으며, 이들은 모두 앞서 광범위하게 기술되었다. 언급한 바와 같이, 정제 단계는 그 중에서도 바큘로바이러스를 제거하는 것을 포함한다. 상기 바큘로바이러스는 바큘로바이러스 벡터 또는 BacMam 벡터로 감염된 숙주 세포로부터 수득될 수 있는 상청액 및/또는 배양 배지 중에 함유되어 있을 수 있다. 본 발명의 오량체 복합체를 정제할 때 상기 바큘로바이러스를 제거하는 것이 바람직하다. 본 발명자들은 특히 이온 교환 크로마토그래피, 더욱 특히, 음이온 교환 크로마토그래피가 본원에 기술된 바와 같이 숙주 세포로부터 수득될 수 있는 상청액 및/또는 배양 배지로부터 바큘로바이러스를 제거하는 데 적용될 수 있다는 것을 발견하게 되었다.
본원에서 사용되는 바, 정제하는 것은 CMV 단백질 UL128, UL130, UL131A, gH (UL75) 및 gL (UL115)을 공동 발현하는 숙주 세포를 배양 배지로부터 제거할 수 있는 것을 포함한다. 상기 숙주 세포가 바람직하게는 본 발명의 오량체 복합체를 분비하기 때문에, 상기 배양 배지는 바람직하게는 상기 오량체 복합체를 포함한다. 숙주 세포를 배양 배지로부터 제거하는 것은 기계력에 의해, 예컨대, 원심분리에 의해 또는 여과에 의해 수행될 수 있다. 여과는 바람직하게 여과 매체, 예컨대, 미세여과 필터 또는 심층 여과 필터를 사용하여 수행된다. 미세여과 필터는 폴리에테르술폰 또는 재생 셀룰로스로 구성될 수 있다. 심층 여과 필터는 폴리프로필렌 또는 유리 섬유로 구성될 수 있다.
그러나, 상기 숙주 세포가 반드시 상기 오량체 복합체를 분비하여야 할 필요는 없다는 것 또한 구상된다. 만약 그렇다면, 이때 상기 숙주 세포는 수거될 수 있다. 수거 후, 오량체 복합체를 방출시키기 위해 상기 숙주 세포를 예컨대, 효소적으로 또는 기계적으로 파괴할 수 있고, 이어서, 이를 본원에 기술된 바와 같이 정제할 수 있다.
정제 후, 킬레이트화제, 예컨대, EDTA 또는 EGTA를 복합체에 첨가하는 것이 바람직하다. 바람직하게, EDTA는 최종 농도 20 mM로 존재한다. 이어서, 최종 농도 20 mM의 EDTA는 본원에 기술된 바와 같이 투석에 의해 최종 농도 3 mM 이하로 감소시키는 것이 바람직하다.
보관
그의 모든 문법적 형태의 "보관하는"이란, 바람직하게는 본 발명의 오량체 복합체를 그의 무손상 또는 기능적 형태로, 즉, 바람직하게는 그의 천연적으로 발생된 형태와 유사하고/거나, 중화 항체를 유도할 수 있는 오량체 복합체를 유지시키는 조건하에서 (추후 사용을 위해) 보존시키는 것을 의미한다. 따라서, 보관 조건은 본 발명의 오량체 복합체의 붕해를 촉진시키지 않는 것 (또는 심지어는 그러한 붕해를 막는 것)으로 구상된다. "붕해"라는 용어는 본원에서 그의 가장 광범위한 의미로 이해되어야 하고, "분해" 및/또는 "변성"을 의미할 수 있다. 본 발명의 오량체 복합체의 보관은 킬레이트화제 및/또는 안정화제를 포함하는 완충제 용액 중에서 보관하는 것으로 구상된다.
일반적으로, 본 발명의 오량체 복합체를 보관할 수 있고, 그의 붕해를 촉진시키지 않는 한, 임의의 킬레이트화제 및/또는 안정화제가 적합하다. 본 발명과 관련하여 유용한 예시적인 킬레이트화제는 EDTA이다. EDTA는 상기 완충제 용액 중에 20 mM 이하, 예컨대, 15 mM, 10 mM, 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 또는 1 mM인 농도로 존재할 수 있다. 특히, EDTA는 3 mM 이하인 농도로 존재할 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 예시적인 안정화제로는 글리콜, 아르기닌, 소르비톨, 글리세롤 및/또는 수크로스를 포함한다. 특히, 완충제 용액은 100-200 mM 아르기닌, 100 mM 소르비톨, 20% 글리세롤 (w/v), 20% 수크로스 (w/v), 0.5 % NP-40, 0.2% Brij-35 및 0.5% 찹스(Chaps)를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 완충제 용액은 트리스 완충제, NaCl, KCl을 포함할 수 있고, pH는 6.5일 수 있다. 특히, 완충제 용액은 25 mM 트리스 완충제, 150 mM NaCl, 3 mM KCl을 포함할 수 있다. 완충제 용액은 또한 인산나트륨/인산칼륨 완충제일 수 있다. 상기 완충제의 pH는 6.0 내지 7.0일 수 있다.
벡터 디자인
본 발명은 CMV 단백질 UL128, UL130, UL131, gH 및 gL을 코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 하나 이상의 벡터를 제공한다.
벡터는 박테리아 (예컨대, E. 콜라이), 효모 (예컨대, S. 세레비지아에), 곤충 세포 및/또는 포유동물 세포에서의 증식을 위한 요소를 함유할 수 있다. 바람직하게, 상기 벡터는 바큘로바이러스 벡터 또는 바큘로바이러스 BacMam 벡터이다.
BacMam 시스템에서, 바큘로바이러스 벡터는 포유동물 세포로 유전자를 전달하는 데 사용된다. BacMam 시스템은 숙주 세포로서 광범위한 세포주 및 1차 세포로 유전자를 전달하는 데 사용될 수 있고, 숙주에 관한 예시적인 목록은 본원 다른 곳에 포함되어 있다. 변형되지 않은 바큘로바이러스가 포유동물 세포 내로 진입할 수 있지만, 포유동물 인식가능한 프로모터가 관심 유전자 상류에 도입되지 않는다면, 유전자는 발현되지 못한다. 따라서, 본 발명의 BacMam 벡터는 본 발명의 오량체 복합체의 단백질을 코딩하는 유전자 상류에 포유동물 프로모터를 포함하는 것으로 구상된다. 벡터는 본원 다른 곳에 기술되어 있는 것과 같은 추가의 요소, 예컨대, 항생제 저항성 유전자, E. 콜라이, S. 세레비지아에 등에서의 증식을 위한 요소를 포함할 수 있다.
상기 바큘로바이러스 벡터에서, v-cath 및/또는 ChiA 유전자는 기능적으로 파괴될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 오량체 복합체의 CMV 단백질 UL128, UL130, UL131A, gH 및 gL을 코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)은 하나 이상의 벡터, 예컨대, 2개의 벡터 상에 존재할 수 있다. 따라서, ORF들 중 1, 2, 3 또는 4개는 제1 벡터 상에 존재하고, 나머지 ORF/ORF들은 제2 벡터 상에 존재한다. 그러나, 바람직하게는 상기 ORF는 단일 벡터 상에 존재한다. ORF는 또한 다유전자 형태로 존재할 수도 있다 (EP1945773).
ORF는 상기 벡터에서 5' → 3' 방향으로 하기 순서로 위치할 수 있다:
(i) gH, gL, UL128, UL130, UL131A; 또는
(ii) gL, UL128, UL130, UL131A, gH.
특히,
(a) (i)에서 gH ORF는 3' 방향으로 전사되고, gL ORF는 5' 방향으로 전사되고, UL128 ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL130 ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL131A ORF는 3' 방향으로 전사됨;
(b) (i)에서 gH ORF는 3' 방향으로 전사되고, gL ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL128 ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL130 ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL131A ORF는 3' 방향으로 전사됨;
(c) (ii)에서 gL ORF는 5' 방향으로 전사되고, UL128 ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL130 ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL131A ORF는 3' 방향으로 전사되고, gH ORF는 3' 방향으로 전사되는 것이 구상된다.
벡터의 추가의 예로는 CMV의 오량체 복합체의 생성을 위한 하기 벡터(pRBT136-x)가 있고 (상기 벡터의 구축 및 프로세싱은 PCT/EP2013/072717의 실시예 1에 기술되어 있다), 따라서, 이는 본 발명의 오량체 복합체의 발현을 위해 적용될 수 있는 바람직한 벡터이다. 따라서, 하기 표 1에 열거되어 있는 벡터는 오량체 복합체의 단백질 중 하나 이상의 것의 공동 발현을 위해 사용되는 벡터들 중 바람직한 예시적인 벡터이다. 특히, 하기 표 왼쪽 칸에 제시된 특정 뉴클레오티드 서열과 상관 없이, 하기 표 1에 제시된 바와 같은 오량체 복합체의 단백질을 코딩하는 유전자의 배열 또한 본 발명의 실시양태인 바람직한 배열이다.
약어: c: 컨센서스 서열; H: His-태그; SH: 스트렙트아비딘-His-태그; V: VR1814, pcI: 프레시션 프로테아제, pcII: 프레시션 및 TEV 프로테아제, DT: 이량체화 도구. 표 1에서 유전자 설명을 위해 단축형 CMV 명명법 (gB, gH, gL, gO 뿐만 아니라, 접두어가 없는 "UL" 및 접미어 "A"가 없는 UL48)이 사용된다.
<표 1>
Figure pct00001
본 발명에 바람직하게 사용되는 벡터 백본 pRBT136은 E. 콜라이의 복제 기점, 예컨대, pBR322ori, 및 효모의 복제 기점, 예컨대, 2 미크론 ori, 곤충 세포에서의 발현을 위한 polh 및 p10 프로모터, 종결 인자 SV40 및 HSVtk, 수개의 저항성 마커 (암피실린, 겐타마이신), 효모 선별 마커 (URA3), 트랜스포손 부위 (Tn) 및 다중 클로닝 부위 (MCS)를 함유한다.
예로서, 프로모터-관심 유전자-종결 인자를 함유하는 발현 카세트는 5' 부위에 35-40 nt의 오버행을 가지며 3' 부위에 추가로 상이한 35-40 nt의 오버행을 가지는 5' 부위에서 PCR 증폭되는 것이다. 동일한 구성을 가지는 제2 발현 카세트와의 상동성 재조합을 위해, PCR 생성물은 5' 부위에 이전 PCR 생성물의 3' 부위에 상보성인 35-40 nt 오버행 서열을 포함한다. 제1 PCR 생성물 5' 부위 및 제2 PCR 생성물 3' 부위의 나머지 오버행은 각각 선형화된 벡터 (pRBT136)의 3' 및 5' 단부에 상동성이다. 이어서, 서열에서의 상동성 재조합은 효모, 바람직하게, 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)에서 수행된다. 이전에 기술된 전략법과 병행하여 어셈블리되는 발현 카세트/PCR 생성물의 수는 어셈블리시키고자 하는 유전자의 필요한 수에 따라 증가된다. 이와 같은 수단에 의해, 다중 유전자/발현 카세트가 병행하여 어셈블리된다. 어셈블리되는 유전자는 트랜스포손 부위 측면에 위치한다. 이는 유전자의 바큘로바이러스 게놈으로의 전위에 사용된다. 생성된 바큘로바이러스 공동 발현 벡터는 동일한 단일 세포로부터 유전자가 공동 발현되는 것을 보장한다. 수율 및 생성물 조성은 단백질의 개수 및 제조 파라미터에 의존한다. 제조 파라미터, 예컨대, 세포주, 감염시 세포 계수 (CCI), 재조합 바이러스 접종물의 양 (감염 다중도, MOI) 및 수거 시간 (TOH)은 수율 및 조기 수거와 관련하여 매트릭스 시스템 및 소규모 제조 시스템 (2-20 ml; Ries, C., John C., Eibl R. (2011), A new scale down approach for the rapid development of Sf21/BEVS based processes - a case study. In Eibl R., Eibl D. (Editors): Single-use technology in Biopharmaceutical Manufacture, 207-213, John Wiley & Sons, Hoboken, New Jersey)을 사용함으로써 결정된다. 이어서, 대규모로 각 생성물을 제조하는 데 정의된 파라미터가 사용된다. 본 발명의 오량체 복합체는 높은 제조 용량을 가능케 하는 현대식 일회용 조직 배양 기술을 사용하여 제조된다.
벡터는 예컨대, 복제 기점, 프로모터, 클로닝 부위, 유전자 마커, 항생제 저항성 유전자, 에피토프, 리포터 유전자, 표적화 서열 및/또는 단백질 정제 태그를 비롯한, 하나 이상의 추가 요소를 함유할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 어떤 요소가 특정 발현 시스템에 적절한지 그에 대해 쉽게 알 수 있을 것이다.
특히, 본 발명에 따른 벡터는 박테리아 (E. 콜라이), 효모 (S. 세레비지아에), 곤충 세포 및/또는 포유동물 세포에서의 증식을 위한 요소, 예컨대, 복제 기점, 선별 마커 등을 추가로 함유할 수 있다.
벡터는 유전자 발현을 위한 프로모터를 포함한다는 것이 구상된다. 본원에 기술된 ORF는 각각 프로모터에 의해 구동된다. 프로모터는 바람직하게는 polh, p10 및 pXIV 최후기 바큘로바이러스 프로모터, vp39 바큘로바이러스 후기 프로모터, vp39polh 바큘로바이러스 후기/최후기 하이브리드 프로모터, pca/polh, pcna , etl, p35, egt , da26 바큘로바이러스 조기 프로모터; CMV-IE1, UBc. EF-1, RSVLTR, MT, 시미안(Simian) 바이러스 40 프로모터, CAG 프로모터 (CMV-IE1 인핸서를 포함하는 베타-액틴 프로모터), B형 간염 바이러스 프로모터/인핸서, 인간 유비퀴틴 C 프로모터, 하이브리드 신경 프로모터, pDS47, Ac5, 및 PGAL 및 PADH로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본원에 기술된 각 ORF 다음으로 종결 인자 서열, 예컨대, HSVtk 종결 인자, SV40 종결 인자, 또는 소 성장 호르몬 (BGH) 종결 인자가 이어진다.
본 발명의 오량체 복합체의 단백질 중 하나 이상의 것은 프리시전 프로테아제 또는 프리시전 및 TEV 프로테아제를 포함할 수 있다. 특히, 예컨대, gH 및/또는 gL 단백질은 프리시전 프로테아제 또는 프리시전 및 TEV 프로테아제를 포함할 수 있다는 것이 구상된다.
바큘로바이러스 v-cath 및/또는 ChiA 활성이 기능적으로 파괴될 수 있다는 것도 추가로 구상되는데, 이는 바람직하게는 어떤 기능적 v-cath 및/또는 ChiA도 존재하지 않고/거나, 발현되지 않는다는 것을 의미한다. 대부분의 바큘로바이러스는, 세포에서 유지되고, 바이러스 유도성 용해시 방출되어 감염 종료 시점에 숙주 사체를 액화시키는 키티나제 (chiA) 및 바이러스 카텝신 유사 프로테아제 (v- cath)를 코딩한다 (Hawtin, RE et al. Virology. 1997; 238, 243-253). 상기 유전자는 바큘로바이러스 복제는 비필수적이고, 따라서, 예컨대, 부분적 또는 완전한 결실, 삽입 돌연변유발에 의해 또는 하나 이상의 불활성화 점 돌연변이에 의해 불활성화될 수 있다.
본 발명의 오량체 복합체는 예컨대, 겔 전기영동에 의해 측정되는 바, 예컨대, 전체 단백질의 80질량%, 85질량%, 90질량%, 95질량%, 또는 99질량% 이상인 다양한 순도 수준으로 제조될 수 있다. 이와 같이 순도 수준이 높기 때문에 복합체는 예컨대, 진단 적용에서 면역원으로서, 또는 백신 제제에서 항원으로서 사용하는 데 적합하다. 상기와 같은 순도 수준은 바람직하게는 (i) 본원에 기술된 바와 같이 숙주 세포를 배양 배지로부터 제거하고, (ii) 본원에 기술된 바와 같이 크로마토그래피를 적용하고, 예컨대, 태그부착된 버전의 오량체 복합체가 숙주 세포에 의해 발현되는 경우, 친화성 크로마토그래피를 적용하고, 이어서, (iii) 바큘로바이러스 발현 시스템이 사용되는 경우에는 이온 교환 크로마토그래피, 특히, 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 바큘로바이러스를 제거함으로써 수득될 수 있다. 상기 단계 중 임의의 것이 반복될 수 있고, 바람직하게는 단계 (ii)가 최종 단계로서 반복된다. 상기 단계는 (i), (ii) 및 (iii); (ii), (i) 및 (iii); (i), (iii) 및 (ii); (iii), (ii) 및 (i); (ii), (iii) 및 (i); 또는 (iii), (i) 및 (ii) 순서일 수 있다. 바람직하게, 단계 (ii)가 최종 단계로서 반복된다.
조성물
본 발명의 오량체 복합체는 또한 조성물 형태일 수 있다. 본 발명의 조성물은 완충제, 환원제, 안정화제, 킬레이트화제, 벌크화제, 삼투 균형제 (장성 작용제); 계면활성제, 폴리올, 항산화제; 동결보호제; 소포제; 보존제; 및 착색제, 세제, 나트륨 염, 및/또는 항미생물제를 추가로 포함할 수 있다. 조성물은 폴리아크릴아미드를 함유하지 않을 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 폴리아크릴아미드를 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조성물은 겔이 아닌 액체, 예컨대, 수성 액체이다. 일부 실시양태에서, 단백질 복합체는 조성물 내에 고정화되어 있지 않다. 예를 들어, 상기 오량체 복합체는 겔 중, 또는 필름, 막, 종이 또는 슬라이드 상에 존재할 수 있다.
조성물은 멸균성 및/또는 발멸 물질 무함유일 수 있다. 조성물은 인간과 관련하여 등장성일 수 있다.
중화 활성
본 발명자들은 본 발명의 오량체 복합체가 면역원성 반응을 유도할 수 있다는 것을 발견하였다. "면역원성 반응"이라는 용어는 "적응성 면역 반응"을 의미하고, 일반적으로 바람직하게는 생체내 체액성 및/또는 세포 매개 면역 반응을 포함한다. 바람직하게, 면역원성 반응은 중화 활성 유도를 포함하며, 중화 활성은 바람직하게 중화 항체의 형태이다.
"중화 항체"는 항원의 생물학적 효과, 예컨대, 숙주에서 감염을 개시 및/또는 영구화시킬 수 있는 병원체의 능력을 중화 (폐지 또는 감소)시킬 수 있는 항체이다. 바람직하게, 본 발명의 오량체 단백질 복합체에 대한 반응으로 생성된 중화 항체는 CMV 비리온 입자와 교차 반응함으로써 CMV 감염에 대한 면역을 부여한다. 이론으로 제한하지 않으면서, 본 발명의 오량체 단백질 복합체에 대한 반응으로 생성된 중화 항체는 CMV 비리온 입자가 상피, 내피 (Epi/EC) 및/또는 섬유모세포 세포 내로 진입할 수 있는 능력을 폐지, 또는 적어도 감소시키는 것으로 여겨지며, "및" 조합이 바람직하다. 세포 내로의 침입 효율은 통상의 기술자에게 공지된 표준 시험에 의해 측정되는 바, 약 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 또는 100% 이상만큼 감소되는 것으로 구상된다. 본원에서 사용되는 바, "효율"은 항체 부재하에 감염된 세포에 대한 상대적인 비율로서의, 항체 존재하에 감염된 세포 개수로서 정의된다. 특히 중화 항체를 스크리닝/확인/측정하기 위한 중화 검정법은 도 3의 설명에서 및 실시예 3에서 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명의 오량체 복합체가 CMV 감염에 대한 면역을 유도할 수 있다는 것이 구상된다. 상기 두 기능 (즉, 면역원성 반응의 유도 및 면역 유도)은 중화 항체를 비롯한, 항체 생산을 유도할 수 있는 본 발명의 오량체 복합체 상의 에피토프의 보유에 의존한다. 오량체 복합체에 대한 다양한 입체구조적 에피토프가 공지되어 있고; 문헌 [Macagno (2010), Journal of Virology 84 (2010): 1005-13]을 참조할 수 있다.
상기 내용을 고려해 볼 때, 본 발명은 바람직하게, 상피/내피 (Epi/EC) 및 섬유모세포 감염, 둘 모두를 억제시키는 중화 활성을 유도할 수 있는 오량체 복합체를 제공한다.
제조 방법
제2 측면에서, 본 발명은 또한
(i) 숙주 세포에서 바큘로바이러스 CMV 단백질 UL128, UL130, UL131A, gH (UL75) 및 gL (UL115)을 공동 발현시키는 단계;
(ii) 상기 공동 발현으로부터 수득된 오량체 복합체를 숙주 세포 및/또는 상청액으로부터 정제하는 단계; 및
(iii) 임의적으로 정제된 오량체 복합체를 킬레이트화제 및/또는 안정화제를 포함하는 완충제 용액 중에서 보관하는 단계를 포함하는, CMV 단백질 UL128, UL130, UL131A, gH (UL75) 및 gL (UL115)로 구성된 오량체 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 오량체 복합체와 관련하여 기술된 실시양태는 또한 이를 준용하여 본 발명의 방법에도 적용된다는 점에 주의하여야 한다.
제약/백신 조성물
제3 측면에서, 본 발명의 오량체 복합체, 또는 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있는, 치료학상 유효량의 오량체 복합체, 및 임의적으로 제약상 허용되는 담체 또는 애주번트를 포함하는 제약 조성물 또는 백신 조성물을 제공한다. 본 발명의 제약 조성물 또는 백신 조성물은 또한 본원에 기술된 바와 같이 벡터를 포함할 수 있다.
"치료학상 유효량"은 원하는 치료 효과를 유도하는 데 충분한 양이다. 예컨대, 백신 조성물 중에서 치료학상 유효량은 예컨대, 대상체에서의 중화 항체 생산과 같은, 면역 반응을 유도하는 데 충분한 양일 수 있다. 대상체는 바람직하게, 포유동물일 수 있고, 이는 예를 들어, 마우스, 래트, 기니아 피그, 햄스터, 토끼, 개, 고양이, 또는 영장류일 수 있다. 바람직하게, 대상체는 인간이다.
"제약상 허용되는"이라는 용어는 특히 동물에서의 및 더욱 특히, 인간에서의 사용에 대하여 규제 기관 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에 의해 승인을 받았다는 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 제약/백신 조성물은 대상체의 치료학적 처치를 위해 구상된다. 그의 모든 문법적 형태의 "치료학적 처치"라는 용어는 치료학적 또는 예방학적 처치를 포함한다. "치료학적 또는 예방학적 처치"는 임상적 및/또는 병리학적 소견의 완전한 예방을 목적으로 하는 예방학적 처치 또는 임상적 및/또는 병리학적 소견의 호전 또는 관해를 목적으로 하는 치료학적 처치를 포함한다.
선천성 질환의 기회를 감소시키기 위해서는 모체의 최초 CMV 감염을 예방하는 예방용 백신이 바람직한 반면, 모체가 활동성 CMV 감염 진단을 받은 경우에는 효과적인 요법이 요구된다. 본 발명의 오량체 복합체는 특히 예컨대, 임산부, 아동 또는 이식 이전의 이식 환자를 위한 예방용 백신으로서 적용되는 것으로 구상된다.
백신 조성물은 gB 단백질, gM 단백질, pp65 단백질, IE-1 단백질, gL/gH 단백질의 이량체, gM/gN 단백질의 이량체, gL/gH/gO의 삼량체, 또는 하나 이상의 캡시드 또는 캡시드 전구체 단백질, CMV로부터의 하나 이상의 표면 단백질, 및/또는 하나 이상의 피막 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자 (VLP)를 추가로 포함할 수 있다. "gB"는 본원에서 UL55와 상호교환적으로 사용된다. "gM"은 본원에서 UL100과 상호교환적으로 사용된다. "pp65"는 본원에서 UL83과 상호교환적으로 사용된다. "IE-1"은 본원에서 UL123과 상호교환적으로 사용된다. "gO"는 본원에서 UL74와 상호교환적으로 사용된다. 상기 언급된 단백질은 특정 서열과 관련하여 한정되지 않는다는 점을 이해하여야 한다. 상기 언급된 단백질의 돌연변이화된 및 말단절단된 형태 또한 구상되고, 본 발명의 백신 조성물에 포함된다. 단백질은 또한 변형된 형태로 본 발명의 백신에 존재할 수 있다. 예시적인 변형은 본 발명의 오량체 복합체의 단백질과 관련하여 기술되었고, 이는 또한 gB, gM, pp65, IE-1 및 gO에 적용될 수 있다.
본 발명의 백신 또는 벡터 백신은 각각 가용성 형태의 보체 수용체 1형 (sCR1)을 추가로 포함할 수 있다.
"바이러스 유사 입자 (VLP)"는 바이러스 구조 단백질 (예컨대, 표면 단백질)의 복합체로서, 바이러스와 유사하지만, 바이러스 유전 물질을 함유하지 않으며, 따라서 비감염성인 것이다. 본 발명에 따라 사용되는 VLP는 원칙적으로 그에 대한 면역 반응 유도가 요구되는 것인 임의의 바이러스 단백질을 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따라 사용되는 VLP는 CMV 캡시드 또는 캡시드 전구체 단백질, 표면 단백질 및/또는 피막 단백질, B 세포 및/또는 T 세포 에피토프, 및/또는 추가의 외래 항원성 서열, 시토카인, CpG 모티프, g-CMSF, CD19 및 CD40 리간드 및/또는 형광성 단백질, 입자의 정제 목적에 또는 표지 부착에 유용한 단백질, 및/또는 수송 프로세스에 필요한 단백질성 구조체로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 포함한다.
추가로, 백신 조성물은 gB, gM, pp65, IE-1 또는 IE-2를 코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 예컨대, 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 예컨대, 핵산은 벡터 또는 플라스미드 형태일 수 있다. 복합체화 및 안정화된 형태 또한 구상된다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 오량체 복합체 또는 임의의 다른 CMC 복합체를 코딩하는 벡터를 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 상기 벡터는 DNA 또는 RNA 기반일 수 있다. 백신 조성물에 따라 사용하는 데 적합한 벡터로는 DNA 기반 벡터, 예컨대, 바큘로바이러스 벡터, BacMam 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, AAV 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 및 엡스타인-바(Eppstein-Barr) 바이러스 (EBV) 벡터를 포함한다. 네이키드 DNA; 예컨대, 플라스미드 형태, 및 임의적으로 복합체화 및/또는 안정화된 형태 (예컨대, 리포플렉스, 폴리플렉스, 덴드리머, 비로솜 및 무기 나노입자와의 복합체)의 것의 사용 또한 구상된다. 적합한 RNA 기반 벡터로는 레트로바이러스 벡터, 셈리키 포레스트(Semliki forest) 바이러스 (SFV), 신드비스(Sindbis) 바이러스 (SIN) 및 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (VEE) 벡터를 포함한다.
본 발명의 백신 조성물은 UL128, UL130, UL131, gH (UL75) 및 gL (UL115)로 구성된 CMV 오량체 복합체의 하나 이상의 단백질을 포함하는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(Ankara) (MVA)를 추가로 포함할 수 있다.
추가로, 본 발명은 대상체에게 프라이밍 조성물로서 백신 조성물을, 및 부스팅 조성물로서 (i) gH/gL 이량체, (ii) UL130/UL131A-이량체, (iii) gM/gN 이량체 (iv) gH/gL/UL128/UL130/UL131A-오량체, (v) gB, (vi) gM, (vii) pp65, (viii) IE-1, (ix) IE-2, (x) UL128, UL130, UL131, gH (UL75) 및 gL (UL115)로 구성된 CMV 오량체 복합체의 하나 이상의 단백질을 포함하는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA), (xi) gB, gH/gL 이량체, pp65 단백질 또는 IE-1 단백질을 포함하는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA), (xii) 하나 이상의 캡시드 또는 캡시드 전구체 단백질, CMV로부터의 하나 이상의 표면 단백질, 또는 하나 이상의 피막 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자 (VLP), (xiii) (i) 내지 (xii)에서 정의된 화합물 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 서열, (xiv) 플라젤린으로부터의 펩티드, (xv) CpG 모티프, 및/또는 (xvi) LCMV를 투여하는 단계를 포함하는 대상체에 CMV에 대한 백신을 접종하는 방법에서 사용하기 위한 백신 조성물을 제공한다.
상기 부스팅 조성물은 또한 프라이밍 조성물로서 사용될 수 있고, 상기 프라이밍 조성물은 부스팅 조성물로서 사용된다.
프라임 부스트 요법에서, 1차 면역화 (프라임 또는 프라이밍)에서 사용되는 백신, 및 부스터 면역화 (부스트 또는 부스팅)에서 사용되는 백신을 비롯한, 2가지 이상의 백신 유형으로 구성된 프라임/부스트 백신이 사용된다. 일반적으로, 1차 면역화에서 사용되는 백신, 및 부스터 면역화에서 사용되는 백신은 서로 상이한다. 1차 면역화 및 부스팅 면역화는 순차적으로 수행될 수 있지만, 즉, 이는 필수적인 것은 아니다. 프라임/부스트 요법은 제한 없이, 예컨대, DNA 프라임/단백질 부스트, DNA 프라임/바이러스 벡터 부스트 (예컨대, MVA 사용)를 포함한다.
담체
"담체" 및 "부형제"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 제약상 허용되는 부형제는 희석제 (충전제, 벌크화제, 예컨대, 락토스, 미정질 셀룰로스), 붕해제 (예컨대, 소듐 스타치 글리콜레이트, 크로스카멜로스 소듐), 결합제 (예컨대, PVP, HPMC), 윤활제 (예컨대, 마그네슘 스테아레이트), 활택제 (예컨대, 콜로이드성 SiO2), 용매/공용매 (예컨대, 수성 비히클, 프로필렌 글리콜, 글리세롤), 완충화제 (예컨대, 시트레이트, 글루코네이트, 락테이트), 보존제 (예컨대, Na 벤조에이트, 파라벤 (Me, Pr 및 Bu), BKC), 항산화제 (예컨대, BHT, BHA, 아스코르브산), 습윤제 (예컨대, 폴리소르베이트, 소르비탄 에스테르), 소포제 (예컨대, 시메티콘), 증점제 (예컨대, 메틸셀룰로스 또는 히드록시에틸셀룰로스), 감미제 (예컨대, 소르비톨, 사카린, 아스파르탐, 아세술팜), 향미제 (예컨대, 페퍼민트, 레몬 오일, 버터스카치 등), 보습제 (예컨대, 프로필렌, 글리콜, 글리세롤, 소르비톨)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 통상의 기술자는 예컨대, 제제 및 제약 조성물의 투여 경로에 따라 적합한 제약상 허용되는 부형제를 쉽게 선택할 수 있을 것이다.
예시적인 제약상 허용되는 부형제에 관한 완전하지 않은 목록은 (생체분해성) 리포솜; 생체분해성 중합체 폴리(D,L)-락틱-코-글리콜산 (PLGA)으로 제조된 미소구, 알부민 미소구; 합성 중합체 (가용성); 나노섬유, 단백질-DNA 복합체; 단백질 접합체; 적혈구; 또는 비로솜을 포함한다. 다양한 담체 기반 투여 형태는 고체 지질 나노입자 (SLN), 중합체 나노입자, 세라믹 나노입자, 히드로겔 나노입자, 공중합화된 펩티드 나노입자, 나노결정 및 나노현탁액, 나노결정, 나노튜브 및 나노와이어, 관능화된 나노캐리어, 나노구, 나노캡슐, 리포솜, 지질 에멀젼, 지질 미소관/마이크로실린더, 지질 마이크로버블, 지질구, 리포폴리플렉스, 역 지질 미셀, 덴드리머, 에토솜, 다중복합 초박 캡슐, 아쿠아솜, 파마코솜, 콜로이도솜, 니오솜, 디스콤, 프로니오솜, 미소구, 마이크로에멀젼 및 중합체 미셀을 포함한다. 다른 적합한 제약상 허용되는 부형제는 그 중에서도 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publishing Co., New Jersey (1991)] 및 [Bauer et al., Pharmazeutische Technologie, 5th Ed., Govi-Verlag Frankfurt (1997)]에 기술되어 있다.
애주번트
본 발명의 제약 또는 백신 조성물은 오량체 복합체에 대한 면역계의 반응을 자극하는 애주번트를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 예시적인 애주번트로는 무기 화합물, 예컨대, 알럼, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 칼슘 포스페이트 히드록시드, 광유, 예컨대, 파라핀 오일, 비로솜, 박테리아 생성물, 예컨대, 사멸된 박테리아 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 톡소이드, 비박테리아성 유기 화합물, 예컨대, 스쿠알렌, 티메로살, 세제 (퀼 A(Quil A)), 시토카인, 예컨대, IL-1, IL-2, IL-10 및 IL-12, 및 복합체 조성물, 예컨대, 프로인트 완전 애주번트, 및 프로인트 불완전 애주번트를 포함한다. 일반적으로, 본 발명에 따라 사용되는 애주번트는 바람직하게는 본 발명의 오량체 복합체에 대한 면역 반응을 강화시키고/거나, 면역 반응을 원하는 면역 반응 쪽으로 조절한다.
경구적으로, 국소적으로, 경피적으로, 피하로, 정맥내로, 복강내로, 근육내로 또는 안내로 투여하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 경로가 본 발명의 제약 또는 백신 조성물을 투여하는 데 적용될 수 있다. 그러나, 원하는 경우, 통상의 기술자는 임의의 다른 경로를 쉽게 선택할 수 있다.
본 발명의 제약/백신 조성물을 필요로 하는 대상체에게 투여되는 상기 제약/백신 조성물의 정확한 용량은 처치 목적 (예컨대, 급성 질환 치료 대 예방적 백신 접종)에 의존할 것이다. 투여 경로, 연령, 체중, 전반적 건강, 성별, 섭식, 투여 시간, 약물 상호작용 및 병태의 중증도에 맞게 조절하는 것이 필요할 수 있으며, 통상의 기술자는 통상의 실험을 통하여 그를 확인할 수 있을 것이다.
공급원
제4 측면에서, 본 발명의 오량체 복합체에서 상기 단백질 중 1, 2, 3, 또는 4개 이상은 나머지 단백질의 유래 기점이 되는 CMV 균주 이외의 다른 CMV 균주로부터 유래될 수 있다.
본 발명에 따른 "균주"란, CMV 유전자형 변이체를 의미한다. "CMV 균주"로부터의 발현은 본원에서 "CMV 균주로부터 유래된" 발현과 상호교환적으로 사용되고, 이는 본원에서 그의 가장 광범위한 의미로 에 대한 "근원 조사가 가능한(retraceable) 것"으로서, 즉, CMV 균주에 천연적으로 발생된 대응물 또는 조상을 가지는 것으로서 이해되어야 한다. 상기 용어는 또한 그의 천연적으로 발생된 대응물과 비교하여 변형된 단백질, 예컨대, 돌연변이, 예컨대, 아미노산 결실, 삽입 또는 전환을 가지는 단백질, 또는 태그부착된 단백질을 포함한다.
예를 들어, CMV 단백질은 CMV 균주 타운, 수탁 번호 FJ616285.1 하에 NCBI 진뱅크에 기탁된 게놈을 가지는 타운, 톨레도 (GU937742.1), AD169 (FJ527563), 메를린 (AY446894.2), TB20/E (KF297339.1), VR1814 (GU179289)로부터 유래될 수 있다. 문헌 [Patrone et al., J. Virol., 2005, 79, 8361-8373]에 따라 204번 위치의 aa Y는 aa F로 치환되었고, UL130의 발현에 있어 주된 문제는 동일 위치의 프레임시프트이며, 이는 다음 ORF까지 아미노산 확장을 일으킨다. 특히, CMV 균주 타운 (ACCN: FJ616285.1) 그 자체는 기능적 오량체 복합체를 발현하지 않지만; 그러나, 본 발명자들은 놀랍게도 유전자 합성을 위해 수탁 번호 FJ616285.1 하에 진뱅크에 기탁된 타운으로부터의 뉴클레오티드 서열 (ORF UL75 (단백질 ID: ACM48053.1), UL115 (ACM48085.1), UL128 (AAR31451.1), UL130, UL131A (AAR31453.1))을 사용할 때, 타운으로부터 기능적 오량체 복합체를 수득할 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 상기 오량체 복합체는 마우스에서 중화 항체의 생성을 유도하였고, 이로써, 섬유모세포 세포 내로의 CMV 침입을 막을 수 있었다. 따라서, 수탁 번호 FJ616285.1 하에 진뱅크에 기탁된 바와 같은 CMV 타운 균주의 UL75, UL115, UL128, UL130, UL131A의 ORF가 바람직하다. 유사하게, 상기 ORF에 의해 코딩된 단백질이 바람직하다.
추가로, 본 발명자들은 UL130 ORF의 아미노산 서열의 204번 위치에 아미노산 F (Phe)를 가질 뿐만 아니라, (인간 포피 섬유모세포에서 성장시킨) 랩균주 타운의 동일 위치에 프레임시프트의 수복을 가짐으로써 기능적 아미노산 Y (Tyr)를 생성하는, CMV 균주 타운에 존재하는 ORF를 사용하는 것 또한 가능하다는 것을 발견하게 되었다. 변형된 pUL130을 사용하여도 계속해서 기능적 오량체 복합체를 제공할 수 있다.
바이러스
제5 측면에서, 본 발명은 수탁 번호 FJ616285.1 하에 NCBI 진뱅크에 기탁된 게놈을 가지고, UL130 ORF의 아미노산 서열의 204번 위치에 아미노산 F를 가질 뿐만 아니라, (인간 포피 섬유모세포에서 성장시킨) 랩균주 타운의 동일 위치에 프레임시프트의 수복을 가짐으로써 기능적 aa Y를 생성하는 변형된 CMV 타운 균주를 제공한다.
단지 예시 목적으로만 제공되는 하기 실시예로부터 본 발명 및 그의 이점을 더욱 잘 이해할 수 있을 것이다. 본 실시예는 어느 방식으로든 본 발명의 범주를 제공하고자 하지 않는다.
실시예
실시예 1: 오량체 CMV 복합체의 발현, 정제, 및 특징화
체계적인 최적화 (PCT/EP2013/072717의 실시예 1 참조)에 기반하여 정의된 단백질 발현 파라미터에 따라, 1회용 2 L 진탕 플라스크 (배양 부피 700 ml) 중 가을 거염 벌레(fall army worm) 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포 (Sf9)에서 단일 바큘로바이러스로부터의 공동 발현에 의해 gpUL75 (gH-His)-gpUL115 (gL)-gpUL128-gpUL130-gpUL131A를 포함하는 오량체 CMV 복합체를 제조한다 (서열식별번호: 18). 제조 파라미터는 하기와 같았다: 최초 감염시 세포 계수 (CCI) 2x106개의 세포/ml, 감염 다중도 (MOI) 0.25 pfu/ml, 27℃에서 100 rpm으로 인큐베이션. 감염 후 3일째 (p.i.) 생존능이 약 80%일 때 수거하였다. 매일 샘플링하여 세포 계수 및 생존능을 측정함으로써 제조를 조절하였다. 복합체 함유 상청액을 2x5 ml 히스트랩(HisTrap) 칼럼 (GE 헬스케어(GE Healthcare))에 로딩하였다. 50 칼럼 부피 (CV, 500 ml와 등가)에 걸쳐 이미다졸 0에서 500 mM까지의 선형 구배를 사용하여 복합체를 정제하였다. 상이한 크로마토그래피 분획을 생화학적 방법에 의해 분석하였다. 150 ㎕의 상이한 분획을 아세톤으로 침전시키고, 30 ㎕ 20 mM 트리스, 150 mM NaCl 완충제 (pH 7.4) 중에 재현탁시켰다. 4-12% 비스-트리스 NuPAGE 겔 (인비트로겐) 상에의 로딩을 위하여, 4x로딩 염료를 제조자의 프로토콜에 따라 첨가한 후, MOPS 전개 완충제를 사용하여 150 V로 15 min 동안, 및 180 V로 45 min 동안 전기영동하였다. 심플리블루 세이프스테인(SimplyBlue SafeStain) 시약 (인비트로겐)을 사용하여 겔을 밤새도록 염색하고, 물을 사용하여 탈색시켰다. 농축 및 추가 정제를 위하여, 1 ml 히스트랩 칼럼을 사용하여 0-500 mM 이미다졸 50 칼럼 부피에 걸친 선형 구배에 의해, 2차 IMAC 크로마토그래피를 수행하였다. 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 및 항-His 항체를 사용한 면역블롯팅에 의해, 1차 IMAC 단계와 같이 상이한 분획을 분석하였다. 모든 복합체 함유 분획을 풀링하고, 50 kDa 컷 오프의 아미콘(Amicon) 필터 장치 (밀리포어(Millipore))를 사용하여 5 ml의 최종 부피로 농축시킨 후, 최종 정제 단계를 위하여 크기 배제 칼럼 (XK16/69, 슈퍼덱스200pg)에 로딩하고, SDS-PAGE에 의해 분석한 후, 쿠마시 염색 및 항-His 항체를 사용하는 면역블롯팅을 수행하였다. 총 단백질은 96-웰 플레이트 포맷 (BCA, 피어스(Pierce))에 적합화된 브래드포드(Bradford) 검정법을 통하여 측정한다. 20 ㎕의 미지 또는 표준 샘플을 180 ㎕의 완충제에 희석하였다. 3회 반복으로 표준에 대하여 (순수 소 혈청 알부민), 또는 미지 샘플에 대하여 연속하여 2배 희석을 수행한다. 웰당 100　㎕의 2x 스톡 브래드포드 시약 (피어스)을 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 혼합하고, 마이크로타이터 플레이트 판독기에서 595 nm로 흡광도를 측정하였다. gpUL75에 첨가된 His-태그에 대한 특이적인 항체 (gH, 마우스-항-His, AbD 세로텍(Serotec)) 및 gpUL75 그 자체에 대한 특이적인 항체 (gH, 마우스-항-gH, 산타 크루즈)의 결합을 조사함으로써 크로마토그래피 기반 정제로부터의 상이한 분획에 함유되어 있는 오량체 CMV 복합체를 추가로 분석한다. 이에 따라, 상이한 샘플을 96-웰 미리 흡착된 ELISA 플레이트에서 100　㎕/웰의 코팅 완충제 (0.1 M Na2HPO4, pH 9) 중에 1:10으로 희석하고, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 이후, 195 ㎕/웰의 세척 완충제 (1xPBS, 0.05% 트윈 20)를 사용하여 플레이트를 3회 세척한 후, 이어서, 195 ㎕/웰의 1xPBS 용액 중 3% BSA를 사용하여 실온에서 1 h 차단하였다. 3회 수행된 세척 단계 후, 3% BSA, 1xPBS, 0.05% 트윈 20 (pH 7) 중 1 ㎍/ml의 농도로 특이적 항체인 항-His 항체 (항-His) 뿐만 아니라, 항-gpUL75 (항-gH)를 첨가하고 (100 ㎕/웰), 실온에서 1 h 동안 인큐베이션시킨 후, 추가로 3회에 걸친 세척 단계가 이어졌다. 검출을 위해, 적절한 2차 항체 (항-마우스-IgG-HRP, 3% BSA, 1xPBS, 0.05% 트윈20 (pH 7) 중 1:1,000 희석)를 사용하여 1　h 인큐베이션을 수행하였다. 100 ㎕/웰의 TMP 기질 시약 (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences: 미국 샌디에고); 제조자의 프로토콜에 따라 수행)을 사용하여 오량체 복합체에의 특이적 항체의 결합을 검출하였으며, 이를 위해 3-15 min 후 100 ㎕의 1 M HCl을 사용하여 반응을 정지시킨 후, 이어서, 마이크로플레이트 판독기에서 450 nm로 OD를 측정하였다. 높은 커버리지로 질량 분광법에 의해 오량체 복합체 단백질을 확인하였고, 오량체 복합체 단백질의 분자량은 하기와 같이 측정되었다: UL128 (MW: 19702.982), UL130 (MW: 24618.466, UL131A (MW: 14865.502), gL 8MW: 30894.892), gH (MW: 83203.292).
오량체 CMV 복합체 생성을 위한 예시적인 발현 벡터 (pRBT136-x)는 상기 표 1에 예시되어 있다.
발현 및 정제 후, 오량체 복합체를 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 예컨대, 킬레이트화제 및/또는 안정화제와 혼합하였다.
실시예 2: 마우스에서의 생체내 연구
생체내 연구를 위하여, 프라임-부스트-부스트 요법으로 Balb/C 마우스를 사용하였다. 각 군은 마우스 8마리씩 포함하였고, 각 마우스는 1회 주사당 20 ㎍의 단백질을 받았다. 마우스 격리 14일 후 (0일째), 면역전 혈청을 채취하였다. 10일 후 1차 주사를 수행하고, 42일째에 부스터 주사가 이어졌다. 49일째에 1차 채혈을 수행하였다. 61일째에 2차 부스터 주사를 수행한 후, 이어서, 70일째에 추가로 채혈하였다. 85일째에 최종 채혈을 수행한 후, 이어서, 체액성 및 세포성 면역 반응을 조사하였다.
실시예 3: 중화 검정법에 기반한 체액성 면역 반응
CMV 음성 및 CMV 양성 인간 혈액 기증자로부터의 혈청과 비교하여 실시예 2로부터의 마우스 혈청의 중화 검정법에 의해 오량체 복합체 (서열식별번호: 18)에 기반한 백신 후보의 체액성 면역 반응을 조사하였다. 실시예 9로부터의 마우스 혈청의 중화 잠재능을 시각화하기 위하여, 분석상의 이유로 GFP 분자를 보유하는 BAC (박테리아 인공 염색체)-재구성 VR1814 균주 (fix-EGFP)를 섬유모세포 (MRC-5) 및 상피 (ARPE-19) 세포의 감염에 사용하였다. 2x104개의 세포/웰을 96 웰 플레이트의 10% FCS (우태아 혈청)을 함유하는 RPMI 배지에 시딩하였다. 마우스 8마리의 혈청 풀을 생성하고, 2배 연속 희석으로 (1:20 내지 1:2,560) 100 ㎕/웰의 RPMI/FCS 배지에 첨가하였다. 상기 언급된 fix-EGFP VR1814 바이러스를 예비-검정법에서 결정된 1,000개의 바이러스 분자/웰인 조직 배양 감염 용량 (TCID)으로 첨가하였다. 96 웰 플레이트를 CO2 제어 대기하에 37℃에서 8일 동안 인큐베이션시켰다. 하기 파라미터를 사용하여 플레이트 판독기에서 녹색 세포를 측정하였다: 형광-필터 (여기 485/20, 방출 530/25), 저부 판독 모드, 시간: 0.1 sec, 96 h 인큐베이션 후 25x 측정/웰. 중화 효능은 50% 바이러스 감염 억제를 나타낼 수 있는 혈청의 희석률로 측정하였다. 하기의 대조군을 수행하였다: 세포 대조군 (세포 + PBS), 바이러스 대조군 (오직 감염된 세포만), 및 인간 혈액 기증자 유래의 5개의 CMV 양성 및 5개의 CMV 음성 혈청.
실시예 4: 엘리스폿 ( EliSpot ) 데이터 (다중 검정)에 기반한 세포성 면역 반응
생체내 연구 (실시예 2) 85일째에 마우스를 사멸시키고, 10종의 상이한 시토카인의 분석을 위하여 비장세포를 준비하였다. 비장세포의 재자극을 위해, 복합체 뿐만 아니라, 합성 펩티드 믹스를 사용하였다. 하기의 단백질들이 확인되었다: HIVgag, pUL83, gpUL75, gpUL115, gpUL55, gpUL128, gpUL130 및 gpUL131A. 수개의 생물정보공학 알고리즘을 사용하여 각 단백질의 에피토프를 예측하였다. 비장세포의 재자극을 위하여, 각 단백질에 대하여 4종 펩티드의 믹스를 생성하였다. HIVgag의 경우, 상업적으로 이용가능한, 130종 펩티드의 펩티드 믹스 (JPT: 베를린)를 사용하였다. 인비트로겐의 다중 검정용 키트에 의해 제조자의 프로토콜에 따라 시토카인 (IFN-감마, IL-1베타, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, gCMSF 및 TNF알파)을 조사하였다.
실시예 5: 엘리스폿 데이터 (다중 검정)에 기반한 세포성 면역 반응
생체내 연구 (실시예 2) 85일째에 마우스를 사멸시키고, 10종의 상이한 시토카인의 분석을 위하여 비장세포를 준비하였다. 비장세포의 재자극을 위해, 복합체 [2 ㎍/mL] 및 re-CMV-VLP [2 ㎍/mL]를 사용하여 동종 및/또는 이종 프라임-부스트 요법에 대한 초기 데이터를 받았다. 복합체에 대하여 하기 단백질이 확인되었다: gpUL75, gpUL115, gpUL128, gpUL130 및 gpUL131A. 인비트로겐의 다중 검정용 키트에 의해 제조자의 프로토콜에 따라 시토카인 (IFN-감마, IL-1베타, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, gCMSF 및 TNF알파)을 조사하였다. 복합체로 면역화된 마우스를 reCMV-VLP로 재자극시켰을 때, T 세포 반응이 유도되었는데, 이는 IL-4, gCMSF 및 IL-5의 분비로 확인할 수 있었다. 같은 혈청의 복합체에 의한 자극 이후의 시토카인 분비는 전자의 것과 비교할 때 그보다 낮았다. 본 결과에 기초하여 볼 때, (1-10 ug/마우스 범위의) 복합체를 이용한 프라이밍 및 (추가 단백질, 예컨대, gpUL83, gpUL55를 포함하는) reCMV-VLP를 이용한 부스팅이 유망한 접근법이 될 수 있다.
실시예 6: 상이한 두 균주로부터의 단백질을 포함하는 오량체 CMV 복합체의 발현, 정제, 및 특징화
체계적인 최적화 (PCT/EP2013/072717의 실시예 1 참조)에 기반하여 정의된 단백질 발현 파라미터에 따라, 1회용 진탕 플라스크 또는 웨이브 백 (배양 부피 최대 25 L) 중 가을 거염 벌레 스포돕테라 프루기페르다 세포의 변이체 (슈퍼-Sf9)에서 단일 바큘로바이러스로부터의 공동 발현에 의해 gpUL75 (gH-His)-gpUL115 (gL)-gpUL128-gpUL130-gpUL131A를 포함하는 오량체 CMV 복합체를 제조한다 (서열식별번호: 67). 상기 복합체는 상이한 두 HCMV 균주 (타운 [NCBI FJ616285.1 및 VR1814 [NCBI GU179289)로부터의 단백질을 함유한다. 제조 파라미터는 하기와 같았다: 최초 감염시 세포 계수 (CCI) 2x106개의 세포/ml, 감염 다중도 (MOI) 0.25 pfu/ml, 27℃에서 100 rpm으로 인큐베이션. 감염 후 3일째 (55-65h p.i.) 생존능이 약 80%일 때 수거하였다. 매일 샘플링하여 세포 계수, 평균 세포 직경, 응집 및 생존능을 측정함으로써 제조를 조절하였다. 복합체 함유 상청액을 벌크 부피에 의존하는 상이한 스케일로 Ni2 +-하전된 세파로스 칼럼 (GE 헬스케어)에 로딩하였다. 23 칼럼 부피 (CV, ~460 ml와 등가)에 걸쳐 이미다졸 0에서 500 mM까지의 단계 구배를 사용하여 복합체를 정제하였다. 상이한 크로마토그래피 분획을 생화학적 방법에 의해 분석하였다. 150-300 ㎕의 상이한 분획을 아세톤으로 침전시키고, 33 ㎕ 20 mM 트리스, 150 mM NaCl 완충제 (pH 7.4) 중에 재현탁시켰다. 4-12% 비스-트리스 NuPAGE 겔 (인비트로겐) 상에의 로딩을 위하여, 4x로딩 염료를 제조자의 프로토콜에 따라 첨가한 후, MOPS 전개 완충제를 사용하여 150 V로 15 min 동안, 및 180 V로 45 min 동안 전기영동하였다. 심플리블루 세이프스테인 시약 (인비트로겐)을 사용하여 1 h 이상 겔을 염색하고, 물을 사용하여 탈색시켰다. 농축 및 추가 정제를 위하여, 추가의 세파로스 칼럼 (5 mL 히스트랩) 및 0-500 mM 이미다졸로 31 칼럼 부피 (CV)에 걸친 선형 구배를 사용하여 2차 IMAC 크로마토그래피를 수행하였다. 쿠마시 염색된 SDS-PAGE에 의해, 1차 IMAC 단계와 같이 상이한 분획을 분석하였다. 모든 복합체 함유 분획을 통합하고, PALL 마크로셉 원심분리 장치에서 농축시키고, 25 mM 트리스, 150 mM NaCl, 3 mM KCl (pH 6.5), 3 mM EDTA를 함유하는 보관 완충제에 대하여 투석하였다. 정제된, 가용성 복합체를 SDS-PAGE에 의해 분석한 후 (상기 참조), 쿠마시 염색 및 상이한 양의 BSA에 따른 농도 계측 분석을 수행하였다.
오량체 CMV 복합체 생성을 위한 예시적인 발현 벡터 (pRBT136-x)는 상기 표 1에 예시되어 있다.
발현 및 정제 후, 오량체 복합체를 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 예컨대, 킬레이트화제 및/또는 안정화제와 혼합할 수 있다.
실시예 7: 상이한 항원을 포함하는 마우스에서의 생체내 연구
생체내 연구를 위하여, 프라임-부스트-부스트 요법으로 Balb/C 마우스를 사용하였다. 각 군은 마우스 8마리씩 포함하였고, 각 마우스는 애주번트와 함께 또는 그를 포함하지 않고, 1회 주사당 5 ㎍, 10 ㎍ 또는 20 ㎍ 단백질을 받았다. 음성 대조군으로서 PBS를 사용하였고, 양성 대조군은 불활성화된 AD169 용해물이었고, 남은 바큘로바이러스 (BV) 조사를 위해, 정제 이후에 남은 바큘로바이러스의 역가에 따라 생산 바이러스도 주사하였다. 마우스 격리 6일 후 (0일째), 면역전 혈청을 채취하였다. 10일 후 1차 주사를 수행하고, 28일째에 부스터 주사가 이어졌다. 36일째에 1차 채혈을 수행하였다. 48일째에 2차 부스터 주사를 수행한 후, 이어서, 55일째에 추가로 채혈하였다. 60일째에 최종 채혈을 수행한 후, 이어서, 체액성 및 세포성 면역 반응을 조사하였다. 체중을 매주 측정하였다 (도 12 참조).
실시예 8: 중화 검정법에 기반한 체액성 면역 반응
CMV 음성 및 CMV 양성 인간 혈액 기증자로부터의 혈청과 비교하여 실시예 7로부터의 마우스 혈청의 중화 검정법에 의해 오량체 복합체 변이체 (또한 바이러스 유사 입자 [VLP; UL86, UL85, UL48, UL83 및 UL74을 포함하는 캐리어 상의 서열식별번호: 6]와 함께 조합된 서열식별번호: 18; 서열식별번호: 67)에 기반한 백신 후보의 체액성 면역 반응을 조사하였다. 실시예로부터의 마우스 혈청의 중화 잠재능을 시각화하기 위하여, 분석상의 이유로 GFP 분자를 보유하는 BAC (박테리아 인공 염색체)-재구성 VR1814 균주 (fix-EGFP) 뿐만 아니라, TB40E를 섬유모세포 (MRC-5) 및 상피 (ARPE-19) 세포의 감염에 사용하였다. 2x104개의 세포/웰을 96 웰 플레이트의 10% FCS (우태아 혈청)을 함유하는 RPMI 배지에 시딩하였다. 마우스 8마리 중 마우스 4마리의 혈청 풀을 생성하고, 2배 연속 희석으로 (1:20 내지 1:2,560) 100 ㎕/웰의 RPMI/FCS 배지에 첨가하였다. 상기 언급된 fix-EGFP VR1814 바이러스 뿐만 아니라, TB40E를 예비-검정법에서 결정된 1,000개의 바이러스 분자/웰인 조직 배양 감염 용량 (TCID)으로 첨가하였다. 96 웰 플레이트를 CO2 제어 대기하에 37℃에서 8일 동안 인큐베이션시켰다. 하기 파라미터를 사용하여 플레이트 판독기에서 녹색 세포를 측정하였다: 형광-필터 (여기 485/20, 방출 530/25), 저부 판독 모드, 시간: 0.1 sec, 96 h 인큐베이션 후 25x 측정/웰. 중화 효능은 50% 바이러스 감염 억제를 나타낼 수 있는 혈청의 희석률로 측정하였다. 하기의 대조군을 수행하였다: 세포 대조군 (세포 + PBS), 바이러스 대조군 (오직 감염된 세포만), 및 인간 혈액 기증자 유래의 5 CMV 양성 및 5 CMV 음성 혈청. 흥미롭게도, 오량체 복합체를 이용한 면역화로부터 방출된 중화 항체는 또한 바이러스 균주와 상관 없이, 섬유모세포를 통한 바이러스 침입을 감소 또는 억제시킬 수 있는 능력도 가진다. 이들 데이터는 오량체 복합체를 함유하는 백신에 기반한 광범위한 면역 반응을 달성할 수 있다는 점에서 유망하다 (도 8 참조).
실시예 9: 엘리스폿 데이터 (다중 검정)에 기반한 세포성 면역 반응
생체내 연구 (실시예 2) 60일째에 마우스를 사멸시키고, 3종의 상이한 시토카인의 분석을 위하여 비장세포를 준비하였다. 비장세포의 재자극을 위해, AD169 바이러스 용해물을 사용하였다. 인비트로겐의 다중 검정용 키트에 의해 제조자의 프로토콜에 따라 시토카인 (IFN-감마, IL-4, IL-5)을 조사하였다. 비기능적 오량체 복합체를 함유하는 바이러스 용해물을 이용한 재자극 이후의 시토카인 분비가 Th-1 및 Th-2 반응을 일으켰다. 기능적 단백질을 이용한 재자극이 유망한 시토카인 유도를 일으킬 수 있었다. 애주번트는 IL-4 분비로 측정되는 특이적인 Th-2 반응을 증가시켰다. 보다 낮은 투여량 (5 ㎍)의 오량체 복합체가 고투여량 (10 ㎍)보다 더 유익한 것으로 보인다. 바큘로바이러스 항원은 단지 무시해도 될 정도의 양으로만 시토카인 분비를 일으켰다 (도 7 참조).
실시예 10: 타운 균주로부터의 단백질을 포함하는 오량체 CMV 복합체의 개선된 발현, 정제, 및 특징화
체계적인 최적화 (PCT/EP2013/072717의 실시예 1 참조)에 기반하여 정의된 단백질 발현 파라미터에 따라, 1회용 진탕 플라스크 또는 웨이브 백 (배양 부피 최대 25 L) 중 가을 거염 벌레 스포돕테라 프루기페르다 세포의 변이체 (슈퍼-Sf9)에서 단일 바큘로바이러스로부터의 공동 발현에 의해 gpUL75 (gH-His)-gpUL115 (gL)-gpUL128-gpUL130-gpUL131A를 포함하는 오량체 CMV 복합체를 제조한다 (서열식별번호: 67). 상기 복합체는 HCMV 균주 타운 ([NCBI FJ616285.1)로부터의 단백질을 함유한다. 제조 파라미터는 하기와 같았다: 최초 감염시 세포 계수 (CCI) 2x106개의 세포/ml, 감염 다중도 (MOI) 0.1 내지 1 범위, 27℃에서 100 rpm으로 인큐베이션. 감염 후 2-3일째 (48-65h p.i.) 생존능이 약 80%일 때 수거하였다 (표 3 참조). 매일 샘플링하여 세포 계수, 평균 세포 직경, 응집 및 생존능을 측정함으로써 제조를 조절하였다. 웨이브 백에서의 제조를 위해서는 다른 파라미터를 선택하였다: 속도 19 내지 22 rpm, 각 6 및 조절형 산소 공급기와 조합. 복합체 함유 상청액을 벌크 부피에 의존하는 상이한 스케일로 Ni2 +-하전된 세파로스 칼럼 (GE 헬스케어)에 로딩하였다. 7 내지 15 칼럼 부피 (CV)에 걸쳐 이미다졸 0에서 500 mM까지의 단계 구배를 사용하여 복합체를 정제하였다. 상이한 크로마토그래피 분획을 생화학적 방법에 의해 분석하였다. 15 ㎕를 직접 로딩하거나, 또는 150-300 ㎕의 상이한 분획을 아세톤으로 침전시키고, 33 ㎕ 20 mM 트리스, 150 mM NaCl 완충제 (pH 7.4) 중에 재현탁시켰다. 4-12% 비스-트리스 NuPAGE 겔 (인비트로겐) 상에의 로딩을 위하여, 4x로딩 염료를 제조자의 프로토콜에 따라 첨가한 후, MOPS 전개 완충제를 사용하여 150 V로 15 min 동안, 및 180 V로 45 min 동안 전기영동하였다. 심플리블루 세이프스테인 시약 (인비트로겐)을 사용하여 1 h 이상 겔을 염색하고, 물을 사용하여 탈색시켰다. 남은 바큘로바이러스의 양을 감소시키기 위하여, 음이온 교환 크로마토그래피를 음성 모드를 수행하였다. 오량체 복합체를 함유하는 통과액을 추가로 농축시키고, 추가의 세파로스 칼럼 (스케일은 부피에 의존) 및 0-500 mM 이미다졸로 15-30 칼럼 부피 (CV)에 걸친 단계 구배를 사용하여 2차 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 쿠마시 염색된 SDS-PAGE에 의해, 1차 IMAC 단계와 같이 상이한 분획을 분석하였다. 모든 복합체 함유 분획을 통합하고, 정질을 조절하였다. PALL 마크로셉 원심분리 장치를 이용한 농축을 통합할 수 있었다. 수회에 걸친 투석 단계에 이미다졸의 변위 치환을 수행하였다. 제1 투석 완충제는 20 mM EDTA를 함유하고, 이어서, 이를 보다 낮은 용량의 0-3 mM EDTA로 감소시킨다. PBS로의 완전한 완충제 교환도 가능하다. 복합체의 보관 및 안정화를 위하여, 상이한 화학적 작용제, 예컨대, 트윈20, 트윈80, 글리세롤을 첨가할 수 있었다. 정제된, 가용성 복합체를 SDS-PAGE에 의해 분석한 후 (상기 참조), 쿠마시 염색 및 상이한 양의 BSA에 따른 농도 계측 분석을 수행하였다. BCA 검정법 뿐만 아니라, 남은 바큘로바이러스에 의해 단백질 농도를 측정하였다. 남은 바큘로바이러스 게놈은 바이러스 참조 유전자 (IE-1)에 기반한 qPCR에 의해서 뿐만 아니라, 평형 염료의 조합을 이용하여 바이러스 계수기 (비로시트(Virocyt))로 바이러스 캡시드 중의 바이러스 게놈 (및 일반적으로 핵산) 및 단백질의 형광 측정에 의해 측정한다. 핵산 및 바이러스 막 단백질의 흡광도를 동시에 측정하는 상기 "조합" 접근법을 통하여 바이러스 입자의 총량을 검출할 수 있는 반면, 감염성 입자는 플라크 검정법에 의해 측정하였다. 인증받은 1회용 카트리지를 사용하여 내독소를 측정하는 데 LAL 검정법에 기반하는 찰스 리버(Charles River)로부터의 엔도세이프(Endosafe) 장치 (PTS20F)를 사용하였다. 최종 생성물 중 dsDNA 함량을 측정하는 데 인비트로겐으로부터의 콴티-iT™ 피코그린® 어세이(Quant-iT™ PicoGreen® Assay)(P7589)를 사용하였다.
DSP 프로세스 (IMAC-AEX-IMAC) 종료시 직접 ELISA를 통해 생성물의 정체를 확인하였다. α-gH-항체 (산타 크루즈, sc-58113) 및 α-His-항체 (AbD 세로텍, MCA1396)를 이용하여 복합체를 확인하고, α-마우스-HRP 항체 (셀 시그널링, 7076S)를 이용하여 검출하였다 (도 9 및 10 참조).
발현 및 정제 후, 오량체 복합체를 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 예컨대, 킬레이트화제 및/또는 안정화제와 혼합할 수 있다 (도 11 참조).
SEQUENCE LISTING <110> RedVax GmbH <120> MEANS AND METHODS FOR TREATING CMV <130> RBT15047PCT <160> 72 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 716 <212> PRT <213> Cytomegalovirus <400> 1 Met Arg Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Leu Ile Val Leu Ala Val Cys Leu 1 5 10 15 Leu Ser His Leu Leu Ser Ser Arg Tyr Gly Ala Glu Ala Ile Ser Glu 20 25 30 Pro Leu Asp Lys Ala Phe His Leu Leu Leu Asn Thr Tyr Gly Arg Pro 35 40 45 Ile Arg Phe Leu Arg Glu Asn Thr Thr Gln Cys Thr Tyr Asn Ser Ser 50 55 60 Leu Arg Asn Ser Thr Val Val Arg Glu Asn Ala Ile Ser Phe Asn Phe 65 70 75 80 Phe Gln Ser Tyr Asn Gln Tyr Tyr Val Phe His Met Pro Arg Cys Leu 85 90 95 Phe Ala Gly Pro Leu Ala Glu Gln Phe Leu Asn Gln Val Asp Leu Thr 100 105 110 Glu Thr Leu Glu Arg Tyr Gln Gln Arg Leu Asn Thr Tyr Ala Leu Val 115 120 125 Ser Lys Asp Leu Ala Ser Tyr Arg Ser Phe Ser Gln Gln Leu Lys Ala 130 135 140 Gln Asp Ser Leu Gly Glu Gln Pro Thr Thr Val Pro Pro Pro Ile Asp 145 150 155 160 Leu Ser Ile Pro His Val Trp Met Pro Pro Gln Thr Thr Pro His 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cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc 300 ttaatgcgcc gctacagggc gcgtccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg 360 gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag 420 gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag 480 tgcatagacc agccgcgtaa cctggcaaaa tcggttacgg ttgagtaata aatggatgcc 540 ctgcgtaagc gggtgtgggc ggacaataaa gtcttaaact gaacaaaata gatctaaact 600 atgacaataa agtcttaaac tagacagaat agttgtaaac tgaaatcagt ccagttatgc 660 tgtgaaaaag catactggac ttttgttatg gctaaagcaa actcttcatt ttctgaagtg 720 caaattgccc gtcgtattaa agaggggcgt ggccaagggc atggtaaaga ctatattcgc 780 ggcgttgtga caatttaccg aacaactccg cggccgggaa gccgatctcg gcttgaacga 840 attgttaggt ggcggtactt gggtcgatat caaagtgcat cacttcttcc cgtatgccca 900 actttgtata gagagccact gcgggatcgt caccgtaatc tgcttgcacg tagatcacat 960 aagcaccaag cgcgttggcc tcatgcttga ggagattgat gagcgcggtg gcaatgccct 1020 gcctccggtg ctcgccggag actgcgagat catagatata gatctcacta cgcggctgct 1080 caaacttggg cagaacgtaa gccgcgagag cgccaacaac 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tgttcgacgg tcacgacctg 2820 ctgttctcca ccgtgacccc ctgcctgcac cagggcttct acctcatcga cgagctgcgt 2880 tacgtgaaga tcaccctgac cgaggatttc ttcgtggtca ccgtgtccat cgacgacgac 2940 acccccatgc tgctgatctt cggtcacctc ccccgtgtgc tgttcaaggc tccctaccag 3000 cgtgacaact tcatcctgcg tcagaccgag aagcacgagc tgctggtgct ggtcaagaag 3060 gaccagctga accgtcactc ttacctgaag gaccccgact tcctggacgc tgctctggac 3120 ttcaactacc tggacctgtc cgctctgctg aggaactcct tccaccgtta cgctgtggac 3180 gtgctgaagt ccggtcgttg ccagatgctg gaccgtcgta ccgtcgagat ggctttcgct 3240 tacgccctgg ctctgttcgc tgctgctcgt caagaagagg ctggcgctca ggtgtccgtg 3300 ccccgtgctc tggaccgtca ggctgctctg ctgcagatcc aagagttcat gatcacttgc 3360 ctgtcccaga ccccccctcg taccaccctg ctgctgtacc ccaccgctgt ggacctggct 3420 aagcgtgctc tgtggacccc caaccagatc accgacatca cctccctcgt gcgtctggtg 3480 tacatcctgt ccaagcagaa ccagcagcac ctgatccccc agtgggctct gcgtcagatc 3540 gctgacttcg ctctgaagct gcacaagacc cacctggctt cattcctcag cgctttcgct 3600 cgccaagagc tgtacctgat gggttccctg gtgcactcca 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artificial <220> <223> synthetic sequence for expression of pentameric CMV complex <400> 72 ttgttccagt ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc 60 gaaaaaccgt ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt 120 tggggtcgag gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag 180 cttgacgggg aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg 240 gcgctagggc gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc 300 ttaatgcgcc gctacagggc gcgtcgcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg 360 aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg 420 caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg 480 ccagtgcata gaccagccgc gtaacctggc aaaatcggtt acggttgagt aataaatgga 540 tgccctgcgt aagcgggtgt gggcggacaa taaagtctta aactgaacaa aatagatcta 600 aactatgaca ataaagtctt aaactagaca gaatagttgt aaactgaaat cagtccagtt 660 atgctgtgaa aaagcatact ggacttttgt tatggctaaa gcaaactctt cattttctga 720 agtgcaaatt gcccgtcgta ttaaagaggg gcgtggccaa gggcatggta aagactatat 780 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tttccacggt gtgcgtcacc cggcaacctt gggcagcagc gaagtcgagg catttctgtc 1680 ctggctggcg aacgagcgca aggtttcggt ctccacgcat cgtcaggcat tggcggcctt 1740 gctgttcttc tacggcaagg tgctgtgcac ggatctgccc ttgcttcagg agatcggtag 1800 acctcggccg tcgcggcgct tgccggtggt gctgaccccg gatgaagtgg ttcgcatcct 1860 cggttttctg gaaggcgagc atcgtttgtt cgcccaggac tctagctata gttctagtgg 1920 ttggctacag ctttgtttgt actatcaaca ggttgaactg ctgatcaaca gatcctctac 1980 gcggccgcgg taccataact tcgtatagca tacattatac gaagttatct ggtttaaacg 2040 tacccgtagt ggctatggca gggcttgccg ccccgacgtt ggctgcgagc cctgggcctt 2100 cacccgaact tgggggttgg ggtggggaaa aggaagaaac gcgggcgtat tggtcccaat 2160 ggggtctcgg tggggtatcg acagagtgcc agccctggga ccgaaccccg cgtttatgaa 2220 caaacgaccc aacacccgtg cgttttattc tgtcttttta ttgccgtcat agcgcgggtt 2280 ccttccggta ttgtctcctt ccgtgtttca gttagcctcc cccatctccc ggtaccgcat 2340 gctatgcatc agctgctagc ttagcgagcg tccacagcct ggggaccgta acgggagtga 2400 gcgggcaggt tcacacgggt ctgcttcagc tcagggggca ggccagcgta gtacttgtcc 2460 aggtgacgca gcaggggggg gtccagctgg tgacgcaggc agaattcctt cacagcgttg 2520 tacaggccgt agaacagggt gataccctcg ggagcagcag cggtggacac gggcagacgc 2580 acagcacggt tggtacgggt agcctcgtta cggatagcca ccaccacgtt gaacagggag 2640 gggggcacca gctcgaaacc cagcacgtgt tcggtgaaga tggaacgacc gtaggacaga 2700 cgagtcaggt cgtaaccacg gcacaggtcg tccacgcaag tgtacacagc gggggaaccg 2760 tcgccgcact cggagtaacc gcgcatcacg gtcatccaac ggggagcggt gtcggaggac 2820 agcagggtca gcagagcacg cagctggtcg gggttgttgt acagcagggc cagggtgtcc 2880 aggaaagcgt cgtccagcag cacggagtta gcagcctcgg gggtcacggg acggtaacgg 2940 atcagctggg acaggggacc gtccctacgg gtcacgttga ccaggggacg cagccaggac 3000 tcgtacttgt cgccctggaa cacctctccc agcaggcaac gacgggtcag ctcggggcac 3060 tcagcgggca ccttctcagc cacggtggga gccacggaca cggtagcgga ggacacgatg 3120 ggcagcagca ggcagcacca cagcagagcc acgggaccgg gggagaagga gaaaccgcag 3180 tcgggacgac ggcacatggt ggctcgagat cccgggtgat caagtcttcg tcgagtgatt 3240 gtaaataaaa tgtaatttac agtatagtat tttaattaat atacaaatga tttgataata 3300 attcttattt aactataata tattgtgttg ggttgaatta aaggtccgta tactagtatc 3360 gattcgcgac ctactccgga atattaatag atcatggaga taattaaaat gataaccatc 3420 tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc gtaacagttt tgtaataaaa aaacctataa 3480 atattccgga ttattcatac cgtcccacca tcgggcgcgg atccgccacc atgtccccca 3540 agaacctgac ccccttcctg accgctctgt ggctgctgct gggccactcc cgtgtgcctc 3600 gtgtgcgtgc tgaggaatgc tgcgagttca tcaacgtgaa ccaccccccc gagcgctgct 3660 acgacttcaa gatgtgcaac cgtttcaccg tggctctgcg ttgccccgac ggcgaagtgt 3720 gctactcccc cgaaaagacc gctgagatcc gtggtatcgt gaccaccatg acccactccc 3780 tgacccgtca ggtggtgcac aacaagctga cctcttgcaa ctacaacccc ctgtacctcg 3840 aggctgacgg tcgtatccgt tgcggcaagg tcaacgacaa ggctcagtac ctgctgggtg 3900 ctgctggttc cgtgccctac cgttggatca acctcgagta cgacaagatc acccgtatcg 3960 tgggcctgga ccagtacctc gagtccgtga agaagcacaa gcgtctggac gtgtgccgtg 4020 ctaagatggg ttacatgctg cagcagctgt tgaattttga ccttcttaag cttgcgggag 4080 acgtcgagtc caaccctggg cccatgctgc gtctgctgct gcgtcaccac ttccactgcc 4140 tgctgctgtg cgctgtgtgg gctaccccct gcctggcttc cccctggttc accctgaccg 4200 ctaaccagaa cccctcccca ccctggtcca agctgaccta ccccaagccc cacgacgctg 4260 ctaccttcta ctgccccttc ctgtacccat ccccacctcg ttccccatcc cagttctccg 4320 gtttccagcg tgtgtccacc ggtcccgagt gccgtaacga gactctgtac ctgctgtaca 4380 accgcgaggg ccagaccctg gtcgagaggt cctccacctg ggtcaagaag gtcatctggt 4440 acttgtccgg tcgtaaccag accatcctgc agcgtatgcc ccgtaccgct tccaagccct 4500 ccgacggcaa cgtgcagatc tccgtcgagg acgctaagat cttcggtgct cacatggtgc 4560 ccaagcagac caagctgctg cgtttcgtgg tcaacgacgg cacccgttac cagatgtgcg 4620 tgatgaagct ggaatcctgg gctcacgtgt tccgtgacta ctccgtgtcc ttccaagtgc 4680 gcctgacctt caccgaggct aacaaccaga cctacacctt ctgcacccac cccaacctga 4740 tcgtgcagct gttgaatttt gaccttctta agcttgcggg agacgtcgag tccaaccctg 4800 ggcccatgcg tctgtgccgt gtgtggctgt ccgtgtgcct gtgcgctgtg gtgctgggac 4860 agtgccagcg tgaaaccgct gagaagaacg actactaccg tgtgccccac tactgggacg 4920 cttgctcccg tgctctgccc gaccagaccc gttacaagta cgtcgagcag ctggtggacc 4980 tgaccctgaa ctaccactac gacgcttccc acggcctgga caacttcgac gtgctgaagc 5040 gtatcaacgt gaccgaggtg tccctgctga tctccgactt ccgtcgtcag aaccgtcgtg 5100 gtggcaccaa caagcgtacc accttcaacg ctgctggttc cctggctccc cacgctcgtt 5160 ccttggagtt ctccgtgcgt ctgttcgcca accagctgtt gaattttgac cttcttaagc 5220 ttgcgggaga cgtcgagtcc aaccctgggc ccatgcgtcc cggcctgccc tcctacctga 5280 tcgtgctggc tgtgtgcctg ctgtcccacc tcctgtcctc ccgttacggt gctgaggcta 5340 tctccgagcc cctggacaag gctttccacc tcctgctgaa cacctacggt cgtcctatcc 5400 gtttcctgcg cgagaacacc acccagtgca cctacaactc ctccctgcgc aactccaccg 5460 tcgtccgcga gaacgctatc tccttcaact tcttccagtc ctacaaccag tactacgtgt 5520 tccacatgcc ccgttgcctg ttcgctggtc ccctggctga gcagttcctg aaccaggtgg 5580 acctgaccga gactctcgag cgttaccagc agcgtctgaa cacttacgct ctggtgtcca 5640 aggacctggc ttcctaccgt tccttcagcc agcagctgaa ggctcaggac tccctgggcg 5700 agcagcccac cactgtgcct ccccctatcg acctgtccat cccccacgtg tggatgcccc 5760 cccagaccac tcctcacggc tggaccgagt cccacaccac ctccggactg caccgtcccc 5820 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tgggttccct ggtgcactcc atgctggtgc acaccaccga gcgtcgcgag atcttcatcg 6720 tggaaaccgg cctgtgctcc ctggccgagc tgtcccactt cacccagctg ctggctcacc 6780 cccaccacga gtacctgtcc gacctgtaca ccccctgctc ctcttccggt cgtcgtgacc 6840 actccctgga acgtctgacc cgtctgttcc ccgacgctac cgtgcctacc accgtgcctg 6900 ctgctctgtc catcctgtct accatgcagc cctccaccct ggaaaccttc cccgacctgt 6960 tctgcctgcc tctgggcgag tccttctccg ctctgaccgt gtccgagcac gtgtcctacg 7020 tggtcaccaa ccagtacctg atcaagggca tctcctaccc cgtgtccacc accgtcgtgg 7080 gccagtccct gatcatcacc cagaccgact cccagaccaa gtgcgagctg acccgtaaca 7140 tgcacaccac tcactccatc accgctgctc tgaacatctc cctcgagaac tgcgctttct 7200 gccagtccgc tctgttggag tacgacgaca ctcagggtgt catcaacatc atgtacatgc 7260 acgactccga cgacgtgctg ttcgctctgg acccctacaa cgaggtggtg gtgtcctccc 7320 cccgtaccca ctacctgatg ctgctgaaga acggcaccgt gctggaagtg accgacgtgg 7380 tggtggacgc taccgactcc ggcgccctgg aagttctgtt ccaggggccc ggaagcggcg 7440 gaggggggtc tgggggggga ggcagccacc accatcacca ccaccatcac taagaattca 7500 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Claims (42)

  1. (i) 바큘로바이러스를 이용하여 숙주 세포에서 CMV 단백질 UL128, UL130, UL131A, gH (UL75) 및 gL (UL115)을 공동 발현시키는 단계;
    (ii) 상기 공동 발현으로부터 수득된 오량체 복합체를 숙주 세포 및/또는 상청액으로부터 정제하는 단계; 및
    (iii) 임의적으로 정제된 오량체 복합체를 킬레이트화제 및/또는 안정화제를 포함하는 완충제 용액 중에서 보관하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있는, CMV 단백질 UL128, UL130, UL131A, gH (UL75) 및 gL (UL115)로 구성된 오량체 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 숙주 세포가 곤충 세포 또는 포유동물 세포인 오량체 복합체.
  3. 제2항에 있어서, 곤충 세포가 Sf9, Sf21, 하이파이브(HighFive), S2, 슈퍼(Super) Sf9-1, 슈퍼 Sf9-2, 또는 슈퍼 Sf-9-3인 오량체 복합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 공동 발현 단계가
    (i) 숙주 세포를, 상기 단백질을 발현하며, 감염시 약 2*106개의 세포/mL의 세포 계수를 가지는 상기 숙주 세포를 감염시켰을 때 약 107 pfu/mL 이상의 역가를 가지는 바큘로바이러스로 감염시키고;
    (ii) 상기 숙주 세포를 적합한 조건하에서 배양하고,
    (iii) 감염 후 56-65 h에 상기 숙주 세포 및/또는 상청액을 수거하는 것을 포함하는 것인 오량체 복합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 해동 및 배양 후 15일째 내지 50일째, 바람직하게, 15일째 내지 30일째, 바람직하게 18일째 감염되는 것인 오량체 복합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 정제가 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및/또는 친화성 크로마토그래피를 포함하는 것인 오량체 복합체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 킬레이트화제가 EDTA 또는 EGTA인 오량체 복합체.
  8. 제7항에 있어서, EDTA가 상기 완충제 용액 중에 20 mM 이하, 예컨대, 3 mM 이하인 농도로 존재하는 것인 오량체 복합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 안정화제가 폴리에틸렌 글리콜, 아르기닌, 소르비톨, 글리세롤, 수크로스 및/또는 NP-40인 오량체 복합체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충제 용액이 트리스 완충제, NaCl, KCl을 포함하는 것인 오량체 복합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, CMV 단백질 UL128, UL130, UL131A, gH 및 gL을 코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)이 하나 이상의 벡터, 바람직하게, 단일 벡터 상에 존재하는 것인 오량체 복합체.
  12. 제11항에 있어서, 벡터가 박테리아 (E. 콜라이(E. coli)), 효모 (S. 세레비지아에(S. cerevisiae)), 곤충 세포 및/또는 포유동물 세포에서의 증식을 위한 요소를 함유하는 것인 오량체 복합체.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, ORF가 상기 벡터에서 5' → 3' 방향으로 하기 순서:
    (i) gH, gL, UL128, UL130, UL131A; 또는
    (ii) gL, UL128, UL130, UL131A, gH로 위치하는 것인 오량체 복합체.
  14. 제13항에 있어서,
    (a) (i)에서 gH ORF는 3' 방향으로 전사되고, gL ORF는 5' 방향으로 전사되고, UL128 ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL130 ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL131A ORF는 3' 방향으로 전사됨;
    (b) (i)에서 gH ORF는 3' 방향으로 전사되고, gL ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL128 ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL130 ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL131A ORF는 3' 방향으로 전사됨;
    (c) (ii)에서 gL ORF는 5' 방향으로 전사되고, UL128 ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL130 ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL131A ORF는 3' 방향으로 전사되고, gH ORF는 3' 방향으로 전사되는 것인 오량체 복합체.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 상기 ORF가 p10 프로모터, polh 프로모터, IE-1 프로모터, mCMV 프로모터, vp39 프로모터, lef2 프로모터, CAG 프로모터, 또는 HepB SV40 프로모터에 의해 구동되고, 다음으로 종결 인자 서열, 예컨대, HSVtk 종결 인자 또는 SV40 종결 인자가 이어지는 것인 오량체 복합체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 중 1개 이상이 태그를 포함하는 것인 오량체 복합체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 태그가 His-태그, Strep-태그, His-Strep-태그, StrepII-태그, Softag 1, TC-태그, myc-태그, FLAG-태그, HA-태그, V5-태그, Avi-태그, 칼모듈린-태그, 폴리글루타메이트-태그, 아밀로이드 베타-태그, GST-태그, MBP-태그 또는 S-태그인 오량체 복합체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 중 하나 이상의 것이 프리시전(PreScission) 프로테아제 또는 프리시전 및 TEV 프로테아제를 포함하고, 바람직하게, gH 및/또는 gL 단백질이 프리시전 프로테아제 또는 프리시전 및 TEV 프로테아제를 포함하는 것인 오량체 복합체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바큘로바이러스에서 v-cath 및/또는 ChiA 활성이 기능적으로 파괴된 것인 오량체 복합체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 형태인 오량체 복합체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상피/내피 (Epi/EC) 및 섬유모세포 감염 둘 모두를 억제시키는 중화 활성을 유도할 수 있는 오량체 복합체.
  22. (i) 바큘로바이러스를 이용하여 숙주 세포에서 CMV 단백질 UL128, UL130, UL131A, gH (UL75) 및 gL (UL115)을 공동 발현시키는 단계;
    (ii) 상기 공동 발현으로부터 수득된 오량체 복합체를 숙주 세포 및/또는 상청액으로부터 정제하는 단계; 및
    (iii) 임의적으로 정제된 오량체 복합체를 킬레이트화제 및/또는 안정화제를 포함하는 완충제 용액 중에서 보관하는 단계를 포함하는, CMV 단백질 UL128, UL130, UL131A, gH (UL75) 및 gL (UL115)로 구성된 오량체 복합체를 제조하는 방법.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 중 하나 이상의 것이 추가의 B 및/또는 T 세포 에피토프를 포함하는 것인 오량체 복합체.
  24. 제23항에 있어서, 상기 T 세포 에피토프가 CD4 T 세포 에피토프 또는 CD8 T 세포 에피토프인 오량체 복합체.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 에피토프가 서열식별번호(SEQ ID NO.): 22-66에 제시된 에피토프 중 어느 하나인 오량체 복합체.
  26. 제1항 내지 제21항 및 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항의 오량체 복합체 또는 제22항의 방법에 의해 수득될 수 있는 오량체 복합체, 및 임의적으로 제약상 허용되는 담체 또는 애주번트를 포함하는 제약 조성물 또는 백신 조성물.
  27. 제1항 내지 제21항 및 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 또는 제26항에 있어서, 상기 단백질 중 1, 2, 3, 또는 4개 이상이 나머지 단백질의 유래 기점이 되는 CMV 균주 이외의 다른 CMV 균주로부터 유래되는 것인 오량체 복합체, 또는 제약 조성물.
  28. 제27항에 있어서, CMV 단백질이 CMV 균주 타운(Towne), 수탁 번호 FJ616285.1 하에 NCBI 진뱅크(NCBI GenBank)에 기탁된 게놈을 가지는 타운, 톨레도(Toledo) (GU937742.1), AD169 (FJ527563), 메를린(Merlin) (AY446894.2), TB40/E (KF297339.1), VR1814 (GU179289)로부터 유래된 것인 오량체 복합체.
  29. 제26항에 있어서, gB 단백질, gM 단백질, pp65 단백질, IE-1 단백질, gL/gH 단백질의 이량체, gM/gN 단백질의 이량체, gL/gH/gO의 삼량체, 또는 하나 이상의 캡시드 또는 캡시드 전구체 단백질, CMV로부터의 하나 이상의 표면 단백질, 및/또는 하나 이상의 피막 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자 (VLP)를 추가로 포함하는 것인 백신 조성물.
  30. 제26항에 있어서, gB, gM, pp65, IE-1 또는 IE-2를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 것인 백신 조성물.
  31. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 오량체 복합체를 코딩하는 벡터를 포함하는 백신 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 벡터가 DNA 또는 RNA 기반인 백신 조성물.
  33. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, UL128, UL130, UL131, gH (UL75) 및 gL (UL115)로 구성된 CMV 오량체 복합체의 하나 이상의 단백질을 포함하는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(Ankara) (MVA)를 추가로 포함하는 백신 조성물.
  34. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 프라이밍 조성물로서 상기 백신 조성물을, 및 부스팅 조성물로서 (i) gH/gL 이량체, (ii) UL130/UL131A-이량체, (iii) gM/gN 이량체 (iv) gH/gL/UL128/UL130/UL131A-오량체, (v) gB, (vi) gM, (vii) pp65, (viii) IE-1, (ix) IE-2, (x) UL128, UL130, UL131, gH (UL75) 및 gL (UL115)로 구성된 CMV 오량체 복합체의 하나 이상의 단백질을 포함하는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA), (xi) gB, gH/gL 이량체, pp65 단백질 또는 IE-1 단백질을 포함하는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA), (xii) 하나 이상의 캡시드 또는 캡시드 전구체 단백질, CMV로부터의 하나 이상의 표면 단백질, 또는 하나 이상의 피막 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자 (VLP), (xiii) (i) 내지 (xii)에서 정의된 화합물 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 서열, (xiv) 플라젤린으로부터의 펩티드, (xv) CpG 모티프, 및/또는 (xvi) LCMV를 투여하는 단계를 포함하는 대상체에 CMV에 대한 백신을 접종하는 방법에서 사용하기 위한 백신 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 부스팅 조성물이 프라이밍 조성물로서 사용되고, 상기 프라이밍 조성물이 부스팅 조성물로서 사용되는 것인 백신 조성물.
  36. CMV 단백질 UL128, UL130, UL131, gH 및 gL을 코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 하나 이상의 벡터.
  37. 제36항에 있어서, 박테리아 (예컨대, E. 콜라이), 효모 (예컨대, S. 세레비지아에), 곤충 세포 및/또는 포유동물 세포에서의 증식을 위한 요소를 함유하는 벡터.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 바큘로바이러스 벡터 또는 바큘로바이러스 BacMam 벡터인 벡터.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바큘로바이러스 벡터에서 v-cath 및/또는 ChiA 유전자가 기능적으로 파괴되고,
    (a) ORF가 상기 벡터에서 5' → 3' 방향으로 하기 순서:
    (b) gH, gL, UL128, UL130, UL131; 또는
    (c) gL, UL128, UL130, UL131, gH로 위치하는 것인 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항의 벡터인 벡터.
  40. 제39항에 있어서,
    (a) (i)에서 gH ORF는 3' 방향으로 전사되고, gL ORF는 5' 방향으로 전사되고, UL128 ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL130 ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL131 ORF는 3' 방향으로 전사됨;
    (b) (i)에서 gH ORF는 3' 방향으로 전사되고, gL ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL128 ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL130 ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL131 ORF는 3' 방향으로 전사됨;
    (c) (ii)에서 gL ORF가 5' 방향으로 전사되고, UL128 ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL130 ORF는 3' 방향으로 전사되고, UL131 ORF는 3' 방향으로 전사되고, gH ORF는 3' 방향으로 전사되는 것인 벡터.
  41. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 상기 ORF가 p10 프로모터, polh 프로모터, IE-1 프로모터, mCMV 프로모터, vp39 프로모터, lef2 프로모터, CAG 프로모터, 또는 HepB SV40 프로모터에 의해 구동되고, 다음으로 종결 인자 서열, 예컨대, HSVtk 종결 인자 또는 SV40 종결 인자가 이어지는 것인 벡터.
  42. 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항의 벡터, 및 임의적으로 제약상 허용되는 담체 또는 애주번트를 포함하는 백신.
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