JP2017515503A - Cmvを処置するための手段および方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、組換えタンパク質生産およびワクチン製剤の分野に関する。特定には、本発明は、CMVの五量体gH/gL/UL128/UL130/UL131A複合体を生産するための手段および方法を提供する。より具体的には、本発明は、CMVに対するワクチンとして使用することができるバキュロウイルス系で生産されたCMVの五量体gH/gL/UL128/UL130/UL131A複合体を提供する。【選択図】 図9
Description
[01]サイトメガロウイルスは、ヘルペスウイルス科またはヘルペスウイルスとして知られているウイルスファミリーのウイルスの属である。サイトメガロウイルスは、典型的にはCMVと略記される。ヒトに感染する種は、一般的にはヒトCMV(HCMV)またはヒトヘルペスウイルス−5(HHV−5)として知られており、全てのサイトメガロウイルスのなかでも最も研究されている種である。地方病性の感染は、すでに成人集団の約60%および一部の国々では100%に達している。感染は通常、免疫が正常な対象では無症状であるが、時には単核球増加症のような疾患を引き起こす可能性がある。感染は、生涯にわたる潜伏が確立される原因となり、潜伏は、再活性化により時々中断される場合がある。しかしながら、がんもしくは移植患者、新生児またはHIV患者などの免疫不全の対象の場合、CMV感染は深刻な脅威であり、結果として死にも至る可能性がある。CMVは、宿主中で存続することが可能であり、これはなぜならウイルスゲノムは、ウイルス抗原のMHCクラスI提示に干渉する複数のタンパク質をコードするためである。1種のウイルスタンパク質が、ペプチドの小胞体内腔への移動をブロックし、同時に他の2種のウイルスタンパク質が、MHCクラスIタンパク質が細胞表面に到達する前にそれらの分解を引き起こす。
[02]現在の処置は、ガンシクロビル、フォスカーネット、アシクロビル、シドフォビルまたはレフルノミドなどの抗ウイルス剤を採用している。これらの薬剤は、移植患者や免疫不全患者には適する可能性があるものの、これらは、妊娠した女性には使用することができない。それに関して、高免疫グロブリン療法が好ましい。これまでに、従来技術において、弱毒化ワクチン、サブユニットタンパク質ワクチン、サブユニットウイルスベクターによってコードされたワクチンなどのワクチンを実現するために様々な試みがなされてきたが、利用可能なワクチンは未だない。
[03]サイトメガロウイルス(CMV)は、ヒト疾患の原因となる公知のウイルスのなかでも最も大きく最も複雑なウイルスである。235kbのゲノムは、少なくとも165種のタンパク質をコードするが、CMVワクチンの調査では、自然感染中に細胞または体液性免疫応答に影響を及ぼす限られた数のウイルスタンパク質に焦点が当てられてきた。pp65タンパク質は、細胞傷害性T細胞応答の主要な標的である。pp65は、キャプシドとウイルスエンベロープとの間の外被内に配置されており、CMVビリオンにおいて最も豊富なタンパク質である。IE1タンパク質も、ビリオン中には存在しないが感染後に細胞中で豊富に発現される重要な細胞傷害性T細胞の標的である。宿主細胞への侵入を媒介する数種のグリコプロテイン複合体が、ビリオン表面でエンベロープ中に埋め込まれている。グリコプロテインMおよびグリコプロテインNで構成されるヘテロ二量体は、ヘパリンに結合することによって宿主細胞との相互作用を開始させると考えられている。グリコプロテインHおよびグリコプロテインLで構成される第二のヘテロ二量体(gH/gL)は、ウイルスエンベロープと標的細胞膜との融合を促進するグリコプロテインB(gB)のコンフォメーション変化の開始においてピークに達する受容体相互作用を媒介する可能性がある。gH、gL、UL128、UL130、UL131Aで構成されるCMVの五量体複合体は、上皮および内皮細胞への侵入を媒介する。これらの複合体はいずれも、中和抗体として知られている特別な抗体クラスと結合するエピトープを含有するため、体液性免疫にとって重要な標的である。ワクチン開発における全体的な目標は、CMVによる上皮/内皮細胞感染と線維芽細胞感染の両方に対して中和活性を誘導することである。
[04]目下、単純なペプチドまたはサブユニット;gH/gLなどの組換えマルチサブユニット複合体、または完全な五量体複合体;天然五量体複合体、gB、pp65、および他のウイルス抗原を含有する不活性化CMVビリオン;ワクチンの免疫原性と不活性化ワクチンの安全性とを組み合わせることができる、遺伝学的に機能しないCMVを発現する天然五量体複合体;複製欠損ウイルスベクター(例えば、pox、アデノウイルス、アルファウイルス等)を発現するサブユニットまたはマルチサブユニット複合体;および上記のもののプライム/ブーストの組合せを包含する様々なワクチンアプローチが研究中である。
[05]魅力的なワクチン候補は、上皮および内皮細胞への侵入を媒介するCMV五量体複合体である。しかしながら、コンフォメーションおよび/またはマルチサブユニット依存性エピトープが五量体複合体の「中和エピトープ(epitome)」にどの程度の影響を及ぼすかは、不明確なままである。コンフォメーション的にその天然の状態の完全な五量体複合体を具体化する現実的な必要性が、17種の五量体複合体特異的な中和抗体のうち1種を除いて全てがマルチサブユニット依存性エピトープを認識したという自然感染した対象から単離されたモノクローナル抗体の研究によって示唆されている。
[06]従来技術において、CMV五量体複合体、特定にはHCMVを提供するための多くの試みがなされたが、本発明者らの知見の限りでは、これまでに、安定な形態且つ十分な量で、加えて理想的には高い純度も有する五量体複合体を提供することができなかった。しかしながら、ワクチン提供のために、高純度で十分な量の、免疫応答を誘導するために免疫原性を有する安定な五量体複合体が必要とされている。したがって本発明の根底にある技術的な問題は、この必要性を満たすことである。
[07]本発明は、CMV五量体複合体を生産するための新規の手段および方法を提供することによってこの問題を解決する。本発明は、特定には、五量体複合体は、昆虫細胞などの好適な宿主細胞中でバキュロウイルスベクターを使用して、高い収量で安定して発現させることができるという驚くべき発見に基づく。さらに本発明者らは、意外なことに、本発明の方法により得られた五量体複合体は、医薬および/またはワクチン組成物として特に有用であることを見出した。昆虫細胞で生産された組換えタンパク質は、免疫応答を調節する重要なパラメーターであるそれらの糖付加パターンの点でそれらの「天然の」対応物とは異なっているため、これは明らかに予想外であった。さらに、本発明者らは、高度に純粋で免疫原性の五量体複合体の大規模生産を可能にする発現系、特にバキュロウイルス系で生産された安定なCMV五量体複合体を提供することに初めて成功した。
概要(Summary)
[08]本発明者らは、安定な形態且つ高い収量および純度でCMV五量体複合体の生産を可能にする新しい手段および方法の確立の先駆けとなった。本発明者らは初めて、バキュロウイルスベクターを使用して大量にCMV五量体複合体のタンパク質成分を発現させ、機能的な五量体複合体の集合を観察した。
[08]本発明者らは、安定な形態且つ高い収量および純度でCMV五量体複合体の生産を可能にする新しい手段および方法の確立の先駆けとなった。本発明者らは初めて、バキュロウイルスベクターを使用して大量にCMV五量体複合体のタンパク質成分を発現させ、機能的な五量体複合体の集合を観察した。
[09]したがって、第一の形態では、本発明は、CMVタンパク質であるUL128、UL130、UL131A、gH(UL75)およびgL(UL115)で構成される五量体複合体であって、
(i)バキュロウイルスを使用することによって、UL128、UL130、UL131A、gH(UL75)およびgL(UL115)を宿主細胞中で共発現させること;
(ii)前記共発現により得られた宿主細胞および/または上清から、五量体複合体を精製すること;および
(iii)任意選択で、精製された五量体複合体を、キレート剤および/または安定化剤を含む緩衝溶液中で貯蔵すること
を含む方法によって入手可能である、上記CMVタンパク質に関する。
(i)バキュロウイルスを使用することによって、UL128、UL130、UL131A、gH(UL75)およびgL(UL115)を宿主細胞中で共発現させること;
(ii)前記共発現により得られた宿主細胞および/または上清から、五量体複合体を精製すること;および
(iii)任意選択で、精製された五量体複合体を、キレート剤および/または安定化剤を含む緩衝溶液中で貯蔵すること
を含む方法によって入手可能である、上記CMVタンパク質に関する。
[010]宿主細胞は、昆虫細胞または哺乳動物細胞であり得る。
[011]本発明の好ましい産生細胞株は、Sf9、Sf21、Super Sf9−1(VE−1)、Super Sf9−2(VE−2)、Super Sf9−3(VE−3)、Hi−5、Mimic Sf9、Vankyrin、Express Sf+、およびS2シュナイダー細胞などの昆虫細胞系であり、好ましくはSuper Sf9−2である[オックスフォードエクスプレッションテクノロジーズ(Oxford Expression Technologies)、カタログ番号600103、およびFath-Goodinら(2006)、Adv. Virus Res. 68、75〜90;Kroemerら(2006)、J. Virol.80(24)、12291〜12228、およびUS20060134743]。Super Sf−9細胞は、カンポレチス・ソノレンシス(Camoletis sonorensis)のイクノウイルス(ichnovirus)P−vank−1タンパク質を安定して発現するように操作されている。哺乳動物細胞、特定にはヒト細胞での発現のために、例えばHEK293、HEK293F、CHO、HeLa、HUVEC、HUAEC、Huh7、HepG2、BHK、MT−2、Cos−7、Cos−1、C127、3T3、ヒト包皮線維芽細胞(HFF)、骨髄線維芽細胞、ボウズ(Bowes)黒色腫、初代神経細胞、または上皮細胞が使用される、
[012]共発現の工程は、感染時に細胞約2×106個/mLの細胞数を有する前記宿主細胞を感染させる場合に、前記タンパク質を発現し、約107pfu/mLまたはそれより高い力価を有するバキュロウイルスで宿主細胞を感染させること;前記宿主細胞を好適な条件下で培養すること、および感染後56から65時間の間に前記宿主細胞および/または上清を回収することを包含していてもよい。
[011]本発明の好ましい産生細胞株は、Sf9、Sf21、Super Sf9−1(VE−1)、Super Sf9−2(VE−2)、Super Sf9−3(VE−3)、Hi−5、Mimic Sf9、Vankyrin、Express Sf+、およびS2シュナイダー細胞などの昆虫細胞系であり、好ましくはSuper Sf9−2である[オックスフォードエクスプレッションテクノロジーズ(Oxford Expression Technologies)、カタログ番号600103、およびFath-Goodinら(2006)、Adv. Virus Res. 68、75〜90;Kroemerら(2006)、J. Virol.80(24)、12291〜12228、およびUS20060134743]。Super Sf−9細胞は、カンポレチス・ソノレンシス(Camoletis sonorensis)のイクノウイルス(ichnovirus)P−vank−1タンパク質を安定して発現するように操作されている。哺乳動物細胞、特定にはヒト細胞での発現のために、例えばHEK293、HEK293F、CHO、HeLa、HUVEC、HUAEC、Huh7、HepG2、BHK、MT−2、Cos−7、Cos−1、C127、3T3、ヒト包皮線維芽細胞(HFF)、骨髄線維芽細胞、ボウズ(Bowes)黒色腫、初代神経細胞、または上皮細胞が使用される、
[012]共発現の工程は、感染時に細胞約2×106個/mLの細胞数を有する前記宿主細胞を感染させる場合に、前記タンパク質を発現し、約107pfu/mLまたはそれより高い力価を有するバキュロウイルスで宿主細胞を感染させること;前記宿主細胞を好適な条件下で培養すること、および感染後56から65時間の間に前記宿主細胞および/または上清を回収することを包含していてもよい。
[013]宿主細胞、特定には昆虫細胞は、融解および培養の後、15日目から50日目の間、好ましくは15日目から30日目の間、好ましくは18日目に感染させてもよい。
[014]精製は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよび/またはアフィニティークロマトグラフィーを包含し得る。
[014]精製は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよび/またはアフィニティークロマトグラフィーを包含し得る。
[015]キレート剤は、EDTAまたはEGTAであり得る。好ましくは、EDTAは、20mMまたはそれ未満、例えば3mMまたはそれ未満の濃度で前記緩衝溶液中に存在する。
[016]安定化剤は、ポリエチレングリコール、アルギニン、グリシン、ソルビトール、トレハロース、グリセロール、スクロース、グルコース、DMSO、TMAOおよび/またはNP−40であり得る。
[017]さらに、緩衝溶液は、トリス緩衝液、NaCl、MgCl2、および/またはKClを含んでいてもよい。
[018]CMVタンパク質であるUL128、UL130、UL131A、gHおよびgLをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)は、1つまたはそれより多くのベクターに、好ましくは単一のベクターに存在していてもよい。
[018]CMVタンパク質であるUL128、UL130、UL131A、gHおよびgLをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)は、1つまたはそれより多くのベクターに、好ましくは単一のベクターに存在していてもよい。
[019]ベクターは、細菌(大腸菌(E. coli))、酵母(S.セレビジエ(S. cerevisiaer))、昆虫細胞および/または哺乳動物細胞における繁殖のためのエレメントを含有していてもよい。
[020]ORFは、前記ベクター中で5’から3’に以下の順番:
(i)gH、gL、UL128、UL130、UL131;
または(ii)gL、UL128、UL130、UL131、gH
で配置されていてもよい。
(i)gH、gL、UL128、UL130、UL131;
または(ii)gL、UL128、UL130、UL131、gH
で配置されていてもよい。
[021]好ましくは、
(a)(i)において、gHのORFは、3’方向で転写され、gLのORFは5’方向で転写され、UL128のORFは3’方向で転写され、UL130のORFは3’方向で転写され、UL131AのORFは3’方向で転写され;
(b)(i)において、gHのORFは3’方向で転写され、gLのORFは3’方向で転写され、UL128のORFは3’方向で転写され、UL130のORFは3’方向で転写され、UL131AのORFは3’方向で転写され;
(c)(ii)において、gLのORFは5’方向で転写され、UL128のORFは3’方向で転写され、UL130のORFは3’方向で転写され、UL131AのORFは3’方向で転写され、gHのORFは3’方向で転写される。
(a)(i)において、gHのORFは、3’方向で転写され、gLのORFは5’方向で転写され、UL128のORFは3’方向で転写され、UL130のORFは3’方向で転写され、UL131AのORFは3’方向で転写され;
(b)(i)において、gHのORFは3’方向で転写され、gLのORFは3’方向で転写され、UL128のORFは3’方向で転写され、UL130のORFは3’方向で転写され、UL131AのORFは3’方向で転写され;
(c)(ii)において、gLのORFは5’方向で転写され、UL128のORFは3’方向で転写され、UL130のORFは3’方向で転写され、UL131AのORFは3’方向で転写され、gHのORFは3’方向で転写される。
[022]前記ORFのそれぞれは、p10プロモーター、polhプロモーター、IE−1プロモーター、mCMVプロモーター、vp39プロモーター、lef2プロモーター、CAGプロモーター、HepBSV40プロモーターまたは本明細書で説明される他のあらゆるプロモーター、およびそれに続いてターミネーター配列、例えばHSVtkターミネーターまたはSV40ターミネーターまたは本明細書で説明される他のあらゆるターミネーターによって駆動されてもよい。
[023]前記タンパク質の少なくとも1つはタグを含んでいてもよく、ここでタグは、His−タグ、Strep−タグ、His−Strep−タグ、StrepII−タグ、Softag 1、TC−タグ、myc−タグ、FLAG−タグ、HA−タグ、V5−タグ、Avi−タグ、カルモジュリン−タグ、ポリグルタメート−タグ、アミロイドベータ−タグ、GST−タグ、MBP−タグまたはS−タグであり得る。好ましくは、gHタンパク質は、His−タグ、好ましくは8個のHis残基を含むHis−タグを備えている。
[024]前記タンパク質の1種またはそれより多くは、プレシジョン(PreScission)プロテアーゼまたはプレシジョンおよびTEVプロテアーゼを含んでいてもよく、好ましくは、gHおよび/またはgLタンパク質は、プレシジョンプロテアーゼまたはプレシジョンおよびTEVプロテアーゼを含む。
[025]バキュロウイルス遺伝子v−cathおよび/またはChiA活性は、機能的に破壊されていてもよい。
[026]本発明の五量体複合体はまた、組成物の形態であってもよい。
[026]本発明の五量体複合体はまた、組成物の形態であってもよい。
[027]本発明の五量体複合体はまた、上皮/内皮(Epi/EC)および線維芽細胞の感染を両方とも阻害する中和活性を誘導することも可能である。
[028]第二の形態では、本発明はまた、CMVタンパク質であるUL128、UL130、UL131A、gH(UL75)およびgL(UL115)で構成される五量体複合体を生産するための方法であって、(i)バキュロウイルスCMVタンパク質であるUL128、UL130、UL131A、gH(UL75)およびgL(UL115)を宿主細胞中で共発現させること;(ii)前記共発現により得られた宿主細胞および/または上清から、五量体複合体を精製すること;および(iii)任意選択で、精製された五量体複合体を、キレート剤および/または安定化剤を含む緩衝溶液中で貯蔵することを含む、上記方法も提供する。
[028]第二の形態では、本発明はまた、CMVタンパク質であるUL128、UL130、UL131A、gH(UL75)およびgL(UL115)で構成される五量体複合体を生産するための方法であって、(i)バキュロウイルスCMVタンパク質であるUL128、UL130、UL131A、gH(UL75)およびgL(UL115)を宿主細胞中で共発現させること;(ii)前記共発現により得られた宿主細胞および/または上清から、五量体複合体を精製すること;および(iii)任意選択で、精製された五量体複合体を、キレート剤および/または安定化剤を含む緩衝溶液中で貯蔵することを含む、上記方法も提供する。
[029]第三の形態では、本発明の五量体複合体または本発明の方法によって入手可能な五量体複合体および任意選択で医薬的に許容される担体またはアジュバントを含む、医薬組成物またはワクチン組成物が提供される。
[030]第四の形態では、本発明の五量体複合体において、前記タンパク質の少なくとも1種、2種、3種または4種は、残りのタンパク質が誘導されたCMV株以外のCMV株から誘導されてもよい。
CMVタンパク質は、以下のCMV株、すなわちNCBIのGenBankに受託番号FJ616285.1で寄託されたゲノムを有するタウン(Towne)、トレド(Toledo)(GU937742.1)、AD169(FJ527563)、マーリン(Merlin)(AY446894.2)、TB20/E(KF297339.1)、VR1814(GU179289)から誘導されてもよい。Patroneら、J. Virol.、2005、79、8361〜8373によれば、204位のアミノ酸Yは、アミノ酸Fで置換されており、UL130の発現の主要な問題は、次のORFへのアミノ酸の拡張を引き起こす同じ位置におけるフレームシフトである。第五の形態では、本発明は、NCBIのGenBankに受託番号FJ616285.1で寄託されたゲノムを有し、UL130のORFのアミノ酸配列の204位にアミノ酸Fを有し、加えて結果として機能的なアミノ酸Yが生じるタウン実験株(ヒト包皮線維芽細胞で成長させた)の同じ位置におけるフレームシフトが修復された、改変CMVタウン株を提供する。
[031]単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、本明細書で使用される場合、文脈上明らかに別段の指示がない限り複数形の対象物を包含することに留意されたい。したがって、例えば、「試薬(a reagent)」への言及は、そのような様々な試薬の1種またはそれより多くを包含し、「方法」への言及は、等価な工程や、改変できる、または本明細書で説明される方法と置換できる当業者公知の方法への言及を包含する。
[032]特に他の指定がない限り、一連の要素の前に付けられる用語「少なくとも」は、その一連の要素それぞれに対して言及されていると理解されるものとする。当業者であれば、本明細書で説明される本発明の具体的な実施態様の多くの等価物を理解しているか、または慣例的な実験のみを使用して確認できると予想される。このような等価物は、本発明に包含されることが意図される。
[033]用語「および/または」は、本明細書のどこで使用されていても、「および」、「または」および「前記用語で接続される要素の全てまたは他のあらゆる組合せ」の意味を包含する。
[034]用語「約」または「およそ」は、本明細書で使用される場合、所与の値または範囲の20%以内、好ましくは10%以内、より好ましくは5%以内を意味する。しかしながらこれは、特定された数値も包含し、例えば約20は、20を包含する。
[035]用語「以下(less than)」または「以上(greater than)」は、特定された数値を包含する。例えば、20以下は、それ未満かまたはそれに等しいことを意味する。同様に、以上(more than)、または以上(greater than)は、それぞれ〜より多くかまたはそれに等しい、または〜より大きいかまたはそれに等しいことを意味する。
[036]以下に記載される明細書および特許請求の範囲全体にわたって、文脈からそうでないことが求められない限り、言葉「含む(comprise)」、ならびに「含む(comprises)」および「含むこと」などの変化形は、述べられている整数もしくは工程または整数もしくは工程の群の包含を必然的に伴うが、他のあらゆる整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を排除しないと理解されるものとする。用語「含む」は、本明細書で使用される場合、用語「含有する」または「包含する」で置き換えることができ、または本明細書で使用される場合、時には用語「有する」で置き換えることもできる。
[037]本明細書で使用される場合「からなる」は、特許請求の範囲の要素で特定されていない全ての要素、工程、または成分を排除する。「から本質的になる」は、本明細書で使用される場合、特許請求の範囲の基礎的な新規の特徴に著しく影響を与えない材料または工程を排除しない。
[038]本明細書におけるあらゆる場合において、用語「含む」、「本質的にからなる」および「からなる」のいずれも、他の2つの用語のいずれかで置き換えることができる。
[039]本発明は、本明細書で説明される特定の手法、プロトコール、材料、試薬、および物質などに限定されず、そのようなものとして変更が可能であることが理解されるものとする。本明細書において使用される用語は、特定の実施態様を説明することのみを目的とし、発明の範囲を限定することは意図されず、発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ定義される。
[039]本発明は、本明細書で説明される特定の手法、プロトコール、材料、試薬、および物質などに限定されず、そのようなものとして変更が可能であることが理解されるものとする。本明細書において使用される用語は、特定の実施態様を説明することのみを目的とし、発明の範囲を限定することは意図されず、発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ定義される。
[040]本明細書の文章全体にわたり引用された全ての出版物および特許(全ての特許、特許出願、科学出版物、製造元の仕様書、説明書などを包含する)は、上に記載されているかまたは下に記載されているかにかかわらず、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。本発明が先行発明のためにこのような開示に先行する権利がないことの承認として解釈されないものとする。参照により組み入れられる資料が本明細書と矛盾するかまたは一致しない程度に、本明細書が全てのこのような資料に優先すると予想される。
詳細な説明(Detailed Description)
[053]現在、CMVに対する免疫応答の予防的な中和を惹起する有力なCMV抗原を同定すること、および高い保護レベルを達成するCMVワクチンを開発することが求められている。CMVの五量体のgH/gL/UL128/UL130/UL131A複合体は、新規のCMVワクチンを開発するための有望なツールである。しかしながら、五量体複合体の大規模生産は、非効率的なタンパク質発現系により妨げられてきた。本発明者らは、タンパク質成分を共発現するためにバキュロウイルス系を初めて使用し、インビボで免疫原性応答を惹起できる機能的な五量体複合体が構築されたことを報告した。
[053]現在、CMVに対する免疫応答の予防的な中和を惹起する有力なCMV抗原を同定すること、および高い保護レベルを達成するCMVワクチンを開発することが求められている。CMVの五量体のgH/gL/UL128/UL130/UL131A複合体は、新規のCMVワクチンを開発するための有望なツールである。しかしながら、五量体複合体の大規模生産は、非効率的なタンパク質発現系により妨げられてきた。本発明者らは、タンパク質成分を共発現するためにバキュロウイルス系を初めて使用し、インビボで免疫原性応答を惹起できる機能的な五量体複合体が構築されたことを報告した。
[054]したがって、第一の形態では、本発明は、CMVタンパク質であるUL128、UL130、UL131A、gH(UL75)およびgL(UL115)で構成される五量体複合体であって、
(i)バキュロウイルスを使用することによって、CMVタンパク質であるUL128、UL130、UL131a、gH(UL75)およびgL(UL115)を宿主細胞中で共発現させること;
(ii)前記共発現により得られた宿主細胞および/または上清から、五量体複合体を精製すること;および
(iii)任意選択で、精製された五量体複合体を、キレート剤および/または安定化剤を含む緩衝溶液中で貯蔵すること
を含む本方法によって入手可能である、上記五量体複合体を提供する。
(i)バキュロウイルスを使用することによって、CMVタンパク質であるUL128、UL130、UL131a、gH(UL75)およびgL(UL115)を宿主細胞中で共発現させること;
(ii)前記共発現により得られた宿主細胞および/または上清から、五量体複合体を精製すること;および
(iii)任意選択で、精製された五量体複合体を、キレート剤および/または安定化剤を含む緩衝溶液中で貯蔵すること
を含む本方法によって入手可能である、上記五量体複合体を提供する。
[055]用語「CMV」は、ヘルペスウイルス科またはヘルペスウイルスのウイルス属であるサイトメガロウイルスを指す。一般的に、この用語は、とりわけヒトサイトメガロウイルス(HCMV)を含むCMVの全ての種を包含し、ヒトサイトメガロウイルスはまた、ヒトヘルペスウイルス5(HHV−5)、チンパンジーサイトメガロウイルス(CCMV)、サルサイトメガロウイルス(SCCMV)およびアカゲザルサイトメガロウイルス(RhCMV)としても知られている。好ましくは、本発明に係るCMVは、HCMVである。多数のHCMV株が公知であり、例えば、これらに限定されないが、TR、タウン、AD169、トレド、マーリン、TB40、デービスなどが挙げられる。
[056]典型的には、CMVは、少なくとも5個のキャプシドタンパク質(UL46、UL48A、UL85、UL86、UL104の遺伝子産物)、19個の調節タンパク質、17個の外被タンパク質(UL25、UL45、UL47、UL48、UL69、UL71、UL72、UL76、UL77、UL83[pp65]、UL88、UL93、UL94、UL95、UL97、UL99、UL103の遺伝子産物)、5個の表面またはエンベロープタンパク質(UL55[gB]、UL73[gN]、U74[gO]、UL75[gH]、UL100[gM]、UL115[gL]の遺伝子産物)、オープンリーディングフレームUL128、UL130、UL131Aからの未分類の遺伝子産物;15個のベータ−ヘルペスウイルス特異的な遺伝子からのタンパク質(UL23、UL24、UL32、UL33、UL35、UL36、UL38、UL43、UL74[gO]、UL78、UL82、UL96、IRS1、US22、TRS1)およびオープンリーディングフレーム(ORF)からのいわゆる機能性タンパク質、UL50、UL80.5を含む。
[057]用語「五量体複合体」は、本明細書では「複合体」のようにその短縮形でも使用されるが、標的細胞、特定には内皮、上皮および線維芽細胞へのウイルス侵入を容易にすると考えられる5種のCMVタンパク質であるUL128、UL130、UL131A、gH(UL75)およびgL(UL115)を含むタンパク質複合体を指す。五量体複合体およびそのタンパク質−タンパク質相互作用のモデルが、Ryckmann BJ らJ Virol. 2008;82(1):60〜70によって提唱されてきた。本発明の五量体複合体において、gH、gLおよびpUL128は、典型的にはジスルフィド結合を介して連結されると考えられ、UL130およびUL131Aは、典型的には、非共有結合の相互作用によって五量体複合体に取り込まれる(および/または五量体複合体と相互連結される)。五量体複合体の化学量論は、1:1:1:1:1と推定される(Ryckmann BJら、J Virol.2008;82(1):60〜70)。好ましくは、本発明の五量体複合体は、インビボで免疫学的にCMVビリオンと交差反応する抗体を惹起することができる。五量体複合体は、好ましくは可溶性である。しかしながら、本発明の五量体複合体はまた、膜に結合した形態であってもよいが、これはそれほど好ましくない。溶解性は、好ましくはgHの膜貫通ドメインを欠失させることによって達成される。用語「〜で構成される」は、本発明の五量体複合体の文脈で使用される場合、五量体複合体は、本明細書で説明されるような5種のタンパク質、すなわちgH、gL、UL128、UL130およびUL131Aを包含し/含み、加えて、さらなるCMVタンパク質を包含し得ることを意味する。しかしながら、好ましくは、五量体複合体は、5種のCMVタンパク質、すなわちgH、gL、UL128、UL130およびUL131Aのみを含有する。本発明の五量体複合体は、組成物の形態であってもよい。したがって、1種またはそれより多くの追加の薬剤が五量体複合体に添加されるかまたはそれと混合されることにより、結果として組成物がもたらされる。このような追加の薬剤、例えば緩衝液、キレート剤および/または安定化剤が本明細書で説明される。好適な組成物が本明細書でさらに説明される。
[058]本発明の五量体複合体において、タンパク質の1種またはそれより多くは、追加のBおよび/またはT細胞エピトープを含んでいてもよい。前記T細胞エピトープは、CD4T細胞エピトープまたはCD8T細胞エピトープであってもよい。好ましくは、前記エピトープは、配列番号22〜66に示されるエピトープのいずれか1つである。
[059]「エピトープ」は、免疫系、例えばB細胞またはT細胞によって認識される抗原の一部である。この用語は、コンフォメーショナルエピトープとリニア(または連続)エピトープの両方を包含する。コンフォメーショナルエピトープは、抗原のアミノ酸配列の不連続なセクションを含むが、それに対してリニアエピトープは、抗原のアミノ酸配列の連続的なセクションで構成される。この用語はさらに、クリプトトープおよびネオトープ(neotope)を包含する。「クリプトトープ」は、天然に存在する抗原、例えばウイルス中に隠れているが、抗原がその天然のコンフォメーションで存在していない場合に接近可能になり得るエピトープである。「ネオトープ」は、タンパク質単量体では見出されないがタンパク質の4次構造でのみで見出されるエピトープである。
[060]追加のエピトープが、五量体複合体の1つまたはそれより多くのタンパク質成分のアミノ酸配列に融合され得ることが想定される。本発明の複合体の望ましいタンパク質成分へのアミノ酸配列の融合は、当業者周知の遺伝子操作の標準的な方法によって達成することができる。
[061]本発明によれば、エピトープは、B細胞および/またはT細胞エピトープであってもよい。
[062]B細胞エピトープは、特定の膜結合型B細胞受容体(BCR)または抗体のいずれかによって認識される抗原(例えば、天然タンパク質)の領域である。B細胞エピトープを同定または選択するのに多数の方法が容易に利用することができ、このような方法としては、X線結晶学、アレイベースのオリゴペプチドスキャニング、部位特異的変異誘発、変異誘発マッピング、およびファージディスプレイ、加えてSunら、Comput Math Methods Med.2013;2013:943636によって概説されているようなコンピューターによる方法が挙げられる。例えば、好適な方法としては、構造ベースの予測モデルが挙げられ、これは、幾何学的な特性および特異的な物理化学的特性などの抗原およびエピトープに関連する傾向性スケールの3次元構造に頼っている。構造ベースのアルゴリズムおよびウェブサーバー(プログラム)としては、例えば、EPSVRおよびEPMeta(http://sysbio.unl.edu/services/)、EPCES(http://sysbio.unl.edu/services/EPCES/)、およびEpitopia(http://epitopia.tau.ac.il/)が挙げられる。ミモトープベースの予測方法は、入力値として抗体親和性により選択されたペプチドと抗原の3次元構造の両方を必要とするコンビナトリアル方法である。ミモトープベースの予測モデルに基づく例示的なアルゴリズムおよびプログラムとしては、例えば、MimoPro(http://informatics.nenu.edu.cn/MimoPro)、PepSurf(http://pepitope.tau.ac.il)およびEpiSearch(http://curie.utmb.edu/episearch.html)が挙げられる。さらに、Sunら、Comput Math Methods Med.2013;2013:943636で概説されているように、例えばBESTおよびZhangの方法などの抗原の一次配列のみに頼る配列ベースの予測モデルが利用可能である。加えて、例えばProMate、ConSurf、PINUP、およびPIERなどの、抗原と抗体の相互作用であるタンパク質−タンパク質相互作用の結合部位予測に的を絞った方法を推論する結合部位予測モデルを使用することができる。
[062]B細胞エピトープは、特定の膜結合型B細胞受容体(BCR)または抗体のいずれかによって認識される抗原(例えば、天然タンパク質)の領域である。B細胞エピトープを同定または選択するのに多数の方法が容易に利用することができ、このような方法としては、X線結晶学、アレイベースのオリゴペプチドスキャニング、部位特異的変異誘発、変異誘発マッピング、およびファージディスプレイ、加えてSunら、Comput Math Methods Med.2013;2013:943636によって概説されているようなコンピューターによる方法が挙げられる。例えば、好適な方法としては、構造ベースの予測モデルが挙げられ、これは、幾何学的な特性および特異的な物理化学的特性などの抗原およびエピトープに関連する傾向性スケールの3次元構造に頼っている。構造ベースのアルゴリズムおよびウェブサーバー(プログラム)としては、例えば、EPSVRおよびEPMeta(http://sysbio.unl.edu/services/)、EPCES(http://sysbio.unl.edu/services/EPCES/)、およびEpitopia(http://epitopia.tau.ac.il/)が挙げられる。ミモトープベースの予測方法は、入力値として抗体親和性により選択されたペプチドと抗原の3次元構造の両方を必要とするコンビナトリアル方法である。ミモトープベースの予測モデルに基づく例示的なアルゴリズムおよびプログラムとしては、例えば、MimoPro(http://informatics.nenu.edu.cn/MimoPro)、PepSurf(http://pepitope.tau.ac.il)およびEpiSearch(http://curie.utmb.edu/episearch.html)が挙げられる。さらに、Sunら、Comput Math Methods Med.2013;2013:943636で概説されているように、例えばBESTおよびZhangの方法などの抗原の一次配列のみに頼る配列ベースの予測モデルが利用可能である。加えて、例えばProMate、ConSurf、PINUP、およびPIERなどの、抗原と抗体の相互作用であるタンパク質−タンパク質相互作用の結合部位予測に的を絞った方法を推論する結合部位予測モデルを使用することができる。
[063]具体的な理論に縛られることは望まないが、本発明の複合体における1つまたはそれより多くのB細胞エピトープの存在は、好ましくは、例えばB細胞の活性化および/または分化をもたらし、例えば中和抗体の生成をもたらし得る免疫原性応答を惹起するB細胞への免疫刺激作用を有することが想定される。B細胞は、エピトープの免疫を刺激する可能性を決定するための当業界において公知の標準的なプロトコールに従って様々な方法で試験することができる。好適なアッセイとしては、リンパ球増殖アッセイ、特異的T細胞で誘導された活性化マーカーの検出、ELIspot、細胞質内サイトカイン染色(ICS)、およびサイトカイン分泌が挙げられる。
[064]T細胞エピトープは、典型的にはプロセシングされたタンパク質抗原から誘導される。本発明の内容において、T細胞エピトープは、CD4−T細胞エピトープまたはCD8T細胞エピトープであり得る。細胞毒性(CD8)T細胞は、MHCクラスI分子によってディスプレイされた細胞内ペプチド(CD8T細胞エピトープ)を認識するが、Tヘルパー細胞は、細胞外空間から取り込まれてMHCクラスII分子によってディスプレイされたペプチド(CD4T細胞エピトープ)を認識する。ペプチド:MHC複合体(pMHC)はT細胞受容体と相互作用し、その活性化とそれに続く細胞性免疫応答の誘導をもたらす。
[065]T細胞エピトープ予測および/または選択のための多数のインシリコ方法が利用可能である。CD8+T細胞エピトープ予測の場合、Larsenら、BMC Bioinformatics 2007、8:424で概説されているように、NetCTL−1.2(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)、EpiJen(http://www.ddg-pharmfac.net/epijen/EpiJen/EpiJen.htm)、またはMAPPP(http://www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/)を使用することができる。CD4+T細胞の場合、エピトープ予測のためのコンピューターによるモデルは、OyarzunPら、BMC Bioinformatics 2013、14:52によって概説されており、例えば、結合モチーフを同定するのにペプチド配列の比較を頼るデータ駆動型の方法、例えばRankpep(http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html)、TEPITOPE、およびNN−align(http://www.cbs.dtu.dk/services/NNAlign/)、加えて、結合エネルギーを推測するために分子モデリングの計算を行うことにより実験上の結合データへの非依存性をもたらす構造ベースの方法、例えばNetMHCIIPan−2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan-2.0/)、TEPITOPEpan(http://www.biokdd.fudan.edu.cn/Service/TEPITOPEpan/)、およびPredivac(http://predivac.biosci.uq.edu.au/)が挙げられる。
[066]具体的な理論に縛られることは望まないが、本発明の複合体における1つまたはそれより多くのT細胞エピトープの存在は、好ましくは、例えばT細胞の活性化および/または分化をもたらし、好ましくは免疫原性応答を惹起するT細胞への免疫刺激作用を有することが想定される。T細胞に対するエピトープの免疫を刺激する可能性を決定するための好適なとしては、MHCペプチド多量体アッセイ、固相MHC−ペプチド複合体アッセイ、リンパ球増殖アッセイ、特異的なT細胞で誘導された活性化マーカーの検出、ELIspot、細胞質内サイトカイン染色(ICS)、サイトカイン分泌および細胞表面捕獲(CSC)、ならびにLi Pira Gら、J Biomed Biotechnol. 2010;2010:325720で概説されているようなサイトカイン分泌およびウェル表面捕獲(Cell−ELISA)が挙げられる。
[067]本明細書で説明されるような五量体複合体の代替として、他のCMV複合体が本発明の手段および方法によって生産され、したがって本発明の形態および実施態様で適用されることも想定される。例えば、gH、gL、UL128、UL130およびUL131Aの2、3または4つで構成される複合体を生産することが想定される。二量体複合体の好ましい例は、gHとgLまたはUL130とUL131Aの複合体である。五量体複合体の代替物の別の好ましい例は、gH/gL/gOの三量体複合体である。したがって、五量体複合体に関連する本明細書で説明される全ての形態および実施態様は、必要な変更を加えれば、前に記載した二量体または三量体複合体に十分適用可能である。本明細書で説明される他のCMV複合体は、追加のBおよび/またはT細胞エピトープを含み得ることも想定される。前記T細胞エピトープは、本明細書で説明されるようなCD4T細胞エピトープまたはCD8T細胞エピトープであってもよい。
[068]本発明の複合体は、好ましくは、単離した形態で調製され使用される。用語「単離した」は、本明細書で使用される場合、その天然環境から取り出されていることを意味する。したがって、「単離した五量体複合体」または「単離した複合体」は、好ましくは、CMV感染細胞表面上または感染性CMVビリオン内のCMV膜タンパク質複合体を包含しない。
[069]用語「gH」は、本明細書で使用される場合、時には「UL75」または「pUL75」と称される場合もある。これらの用語のそれぞれは他のものと置き換えることができることから、これらの用語は同義的に使用される。用語「gH」は、配列番号1に示される参照配列と比べて突然変異を有するgHポリペプチドを包含し、さらに、本明細書で説明されるような配列番号1に示されるアミノ酸配列と所定の程度の同一性を共有するアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含する。前記用語はまた、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、または700個のアミノ酸の長さを有するgHポリペプチドのフラグメントも包含し、それによって前記フラグメントは、好ましくは、本明細書で説明されるように他の4つのタンパク質と五量体複合体を形成することことが可能である。好ましいgHポリペプチドは、膜貫通ドメイン(TM)を欠失している。TMドメインの非存在は、この改変されたポリペプチドが脂質二重層内に存在できないことを意味する。一部の実施態様において、gHポリペプチドは、全長天然TMドメインを欠失しており、他の実施態様において、gHポリペプチドは、天然TMドメインの一部を保持していてもよいが、脂質二重層中にタンパク質を存在させるには不十分な程度である。したがってポリペプチドは、天然gHのTMドメインの最大10個のアミノ酸(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のアミノ酸)を含有していてもよい。TMドメインの一部または全部が欠失していることに加えて、ポリペプチドはまた、CMVのgHの天然C末端ドメインを欠失していてもよいし、またはC末端ドメインの一部を欠失していてもよい。
[070]gHの細胞外ドメインは、疎水性膜貫通ドメイン(TM)を欠失しているgHの一部に対応する。細胞外ドメイン、シグナル配列およびTMドメインの配置および長さは、所与のgHタンパク質配列の長さに沿った疎水性のコンピューター分析に基づき予測することができる。シグナル配列およびTMドメインは、最大レベルの疎水性を有し、これらの2つの領域は、それより低い疎水性を有する細胞外ドメインの両側にある。
[071]用語「gL」は、本明細書で使用される場合、時には「UL115」または「pUL115」と称される場合もある。これらの用語のそれぞれは他のものと置き換えることができることから、これらの用語は同義的に使用される。用語「gL」は、配列番号2に示される参照配列と比べて突然変異を有するgLポリペプチドを包含し、さらに、本明細書で説明されるような配列番号2に示されるアミノ酸配列と所定の程度の同一性を共有するアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含する。前記用語はまた、50、100、150、200、または250個のアミノ酸の長さを有するgLポリペプチドのフラグメントも包含し、それによって前記フラグメントは、好ましくは、本明細書で説明されるように他の4つのタンパク質と五量体複合体を形成することことが可能である。
[072]用語「UL128」は、本明細書で使用される場合、時には「pUL128」と称される場合もある。これらの用語のそれぞれは他のものと置き換えることができることから、これらの用語は同義的に使用される。用語「UL128」は、配列番号3に示される参照配列と比べて突然変異を有するUL128ポリペプチドを包含し、さらに、本明細書で説明されるような配列番号3に示されるアミノ酸配列と所定の程度の同一性を共有するアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含する。前記用語はまた、50、100、または150個のアミノ酸の長さを有するUL128ポリペプチドのフラグメントも包含し、それによって前記フラグメントは、好ましくは、本明細書で説明されるように他の4つのタンパク質と五量体複合体を形成することことが可能である。
[073]用語「UL130」は、本明細書で使用される場合、時には「pUL130」、または「UL130A」と称される場合もある。これらの用語のそれぞれは他のものと置き換えることができることから、これらの用語は同義的に使用される。用語「UL130」は、配列番号4に示される参照配列と比べて突然変異を有するUL130ポリペプチドを包含し、さらに、本明細書で説明されるような配列番号4に示されるアミノ酸配列と所定の程度の同一性を共有するアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含する。前記用語はまた、50、100、150、または200個のアミノ酸の長さを有するUL130ポリペプチドのフラグメントも包含し、それによって前記フラグメントは、好ましくは、本明細書で説明されるように他の4つのタンパク質と五量体複合体を形成することことが可能である。
[074]用語「UL131A」は、本明細書で使用される場合、時には「pUL131A」、「UL131」または「pUL131」と称される場合もある。これらの用語のそれぞれは他のものと置き換えることができることから、これらの用語は同義的に使用される。用語「UL131a」は、配列番号5に示される参照配列と比べて突然変異を有するUL131Aポリペプチドを包含し、さらに、本明細書で説明されるような配列番号5に示されるアミノ酸配列と所定の程度の同一性を共有するアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含する。前記用語はまた、50、または100個のアミノ酸の長さを有するUL131Aポリペプチドのフラグメントも包含し、それによって前記フラグメントは、好ましくは、本明細書で説明されるように他の4つのタンパク質と五量体複合体を形成することことが可能である。
[075]述べられているように、本発明の各タンパク質、特定には、gH、gL、UL128、UL130およびUL131Aそれぞれ、またはそれらのフラグメントは、これらの突然変異が抗原としてのタンパク質の使用にとって有害ではない限り、特定には、少なくとも五量体複合体に結合できる抗体および/または前記五量体複合体の生物学的作用を中和できる抗体の生産を惹起することができる1つまたはそれより多くのエピトープをそれらが保持する限りは、配列番号1(gH)、配列番号2(gL)、配列番号3(UL128)、配列番号4(UL130)、および配列番号5(UL131A)それぞれに示される参照配列と比べて、突然変異、例えば挿入、欠失および置換を含有していてもよい。加えて、このような突然変異は、本発明の五量体複合体を形成するタンパク質の能力を妨害しないものであるべきである。本発明の五量体複合体を形成する能力は、タンパク質精製を行い、例えば非還元PAGE、ウェスタンブロットおよび/またはサイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質を分析することによって試験することができる。特定には、各タンパク質は、例えば、検出、精製を容易にする、および/または溶解性を強化する可能性があるタグを含んでいてもよい。本発明に従って使用することができる例示的なタグとしては、His−タグ、Strep−タグ、His−Strep−タグ、StrepII−タグ、Softag 1、TC−タグ、myc−タグ、FLAG−タグ、HA−タグ、V5−タグ、Avi−タグ、カルモジュリン−タグ、ポリグルタメート−タグ、アミロイドベータ−タグ、GST−タグ、MBP−タグまたはS−タグが挙げられ、好ましくはHis−タグである。His−タグは、6または8個のHis残基で構成されていてもよく、好ましくは8個のHis残基である。またタンパク質は、それらの成熟型にトランケートおよび/またはプロセシングされていてもよく、例えば、タンパク質は、それらの天然型および/または膜貫通ドメイン中に存在するシグナル配列を欠失していてもよい。
[076]前述したように、本発明のgHタンパク質またはそれらのフラグメントは、配列番号1への様々な程度の同一性を有していてもよく、例えば少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%が、配列番号1に列挙された配列に同一である。好ましいgHタンパク質は、(i)CMVのgLと二量体化することができ;(ii)三量体gH/gL/gO複合体の一部を形成することができ;(iii)五量体gH/gL/UL128/UL130/UL131A複合体の一部を形成することができ;(iv)膜貫通ドメインを欠失していてもよく;および/または(iv)インビボで免疫学的にCMVビリオンと交差反応する抗体を惹起することができる。
[077]前述したように、本発明のgLタンパク質またはそれらのフラグメントは、配列番号2への様々な程度の同一性を有していてもよく、例えば少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%が、配列番号2に列挙された配列に同一である。好ましいgLタンパク質は、(i)CMVのgHと二量体化することができ;(ii)三量体gH/gL/gO複合体の一部を形成することができ;(iii)五量体gH/gL/UL128/UL130/UL131A複合体の一部を形成することができ;および/または(iv)インビボで免疫学的にCMVビリオンと交差反応する抗体を惹起することができる。
[078]前述したように、本発明のUL128タンパク質またはそれらのフラグメントは、配列番号3への様々な程度の同一性を有していてもよく、例えば少なくとも60%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%が、配列番号3に列挙された配列に同一である。好ましいUL128タンパク質は、(i)五量体gH/gL/UL128/UL130/UL131A複合体の一部を形成することができ、および/または(ii)インビボで免疫学的にCMVビリオンと交差反応する抗体を惹起することができる。
[079]前述したように、本発明のUL130タンパク質またはそれらのフラグメントは、配列番号4への様々な程度の同一性を有していてもよく、例えば少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%が、配列番号4に列挙された配列に同一である。好ましいpUL130タンパク質は、(i)五量体gH/gL/UL128/UL130/UL131複合体を形成することができ;および/または(ii)インビボで免疫学的にCMVビリオンと交差反応する抗体を惹起することができる。
[080]前述したように、本発明のUL131Aタンパク質またはそれらのフラグメントは、配列番号5への様々な程度の同一性を有していてもよく、例えば少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%が、配列番号5に列挙された配列に同一である。好ましいUL131Aタンパク質は、(i)五量体gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131A複合体を形成することができ、および/または(ii)インビボで免疫学的にCMVビリオンと交差反応する抗体を惹起することができる。
[081]「配列同一性」または「%同一性」は、標準化したアルゴリズムを使用して並べられた少なくとも2つのポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の残基のマッチングのパーセンテージを指す。このようなアルゴリズムは、2つの配列間のアライメントを最適化することによって2つの配列のより有意義な比較を達成するために、標準化され再現可能な方法で比較される配列中にギャップを挿入する場合がある。本発明の目的のために、2つのアミノ酸配列またはヌクレオチド間の配列同一性は、NCBI BLASTプログラムバージョン2.2.29(2014年1月6日)(Altschulら、Nucleic Acids Res.(1997)25:3389〜3402)を使用して決定される。2つのアミノ酸配列の配列同一性は、以下のパラメーターに設定されたblastpを用いて決定することができる:マトリックス:BLOSUM62、文字サイズ:3;期待値:10;ギャップコスト:存在=11、伸長=1;フィルター=低複雑度、活性化;フィルターストリング:L;組成調整:条件付きの組成スコアマトリックス調整。本発明の目的のために、2つのヌクレオチド配列間の配列同一性は、以下の例示的なパラメーターに設定されたblastnと共にNCBI BLASTプログラムバージョン2.2.29(2014年1月6日)を使用して決定される:文字サイズ:11;期待値:10;ギャップコスト:存在=5、伸長=2;フィルター=低複雑度、活性化;マッチ/ミスマッチスコア:2、−3;フィルターストリング:L;m。
[082]用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、同義的に使用される。用語「ポリペプチド」は、2個またはそれより多くのアミノ酸、典型的には少なくとも3個、好ましくは少なくとも20個、より好ましくは少なくとも30個、例えば少なくとも50個のアミノ酸を含有するタンパク質またはペプチドを指す。したがって、ポリペプチドはアミノ酸配列を含み、したがって時にはアミノ酸配列を含むポリペプチドは、本明細書では「ポリペプチド配列を含むポリペプチド」と称される。したがって、本明細書において用語「ポリペプチド配列」は、用語「アミノ酸配列」と同義的に使用される。
[083]用語「アミノ酸」または「aa」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、加えて天然に存在するアミノ酸と類似の方式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされたものであり、加えて後で修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびO−ホスホセリンでもある。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ、すなわち炭素が水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基と結合している基礎的な化学構造を有する化合物を指し、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムである。このような類似体は、修飾されたR基(例えば、ノルロイシン)または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基礎的な化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似の方式で機能する化学物質を指す。
[084]本発明はまた、本明細書で説明されるようなgH、gL、UL128、UL130および/またはUL131Aタンパク質またはフラグメントをコードする核酸分子も提供する。これらの核酸分子は、例えば、前記タンパク質の1種またはそれより多くを発現する場合に使用されるか、または例えばワクチン接種用のもののような、核酸分子として使用される。前記タンパク質の1種またはそれより多くを発現する目的のために、それらは、一般的に公知であり本明細書で説明されるベクターにクローニングされる。
共発現(Co-expression)の工程
[085]「共発現」は、バキュロウイルス、例えば、バキュロウイルス発現系またはBacMam発現系を使用することによって、宿主細胞、好ましくは昆虫細胞または哺乳動物細胞中で1種またはそれより多くのCMVタンパク質が発現されることについて使用される用語である。「発現ベクター」は、本明細書では、遺伝物質を発現させることができる標的宿主細胞に遺伝物質を移動させるのに使用される運搬手段と定義される。特定には、バキュロウイルス発現系でCMVタンパク質を発現させることが想定される。「発現系」は、宿主細胞中での外来遺伝子発現を可能にするコンテクストを提供する、発現ベクターおよびベクターのための宿主細胞の組合せである。
[085]「共発現」は、バキュロウイルス、例えば、バキュロウイルス発現系またはBacMam発現系を使用することによって、宿主細胞、好ましくは昆虫細胞または哺乳動物細胞中で1種またはそれより多くのCMVタンパク質が発現されることについて使用される用語である。「発現ベクター」は、本明細書では、遺伝物質を発現させることができる標的宿主細胞に遺伝物質を移動させるのに使用される運搬手段と定義される。特定には、バキュロウイルス発現系でCMVタンパク質を発現させることが想定される。「発現系」は、宿主細胞中での外来遺伝子発現を可能にするコンテクストを提供する、発現ベクターおよびベクターのための宿主細胞の組合せである。
[086]本発明の複合体は、一時的に発現させてもよいし、または安定して発現させてもよい。
[087]バキュロウイルスは、主として昆虫で見出された棒状の二本鎖DNAウイルスである。
[087]バキュロウイルスは、主として昆虫で見出された棒状の二本鎖DNAウイルスである。
[088]バキュロウイルス発現系は、典型的には、例えば標的遺伝子を含有するトランスファーベクターとの相同組換えを介した必須ではないウイルスゲノム領域への外来遺伝子の導入に基づく。結果得られた組換えバキュロウイルスは、好適な宿主細胞中で発現させることができる異種タンパク質をコードする外来遺伝子で置き換えられた必須ではない遺伝子(例えばpolh、v−cath、ChiA)の1つを欠失していてもよい。これらの技術は、一般的に当業者公知であり、例えばKostaら、Nat Biotechnol. 2005;23(5):567〜75によって概説されている。組換えバキュロウイルスベクターを調製するための具体的なアプローチは、Bac−to−Bac(登録商標)バキュロウイルス系(インビトロジェン)である。
[089]本発明の組換えバキュロウイルス発現ベクターは、優先的には、宿主細胞中での、任意選択で大腸菌(E. coli)などの原核細胞中での複製が可能である。本発明によれば、タンパク質の組換え発現に一般的に使用されるバキュロウイルスから誘導されたあらゆるバキュロウイルス発現ベクターを使用することができる。例えば、バキュロウイルスベクターは、例えば、AcMNPV、カイコ(Bombyx mori;Bm)NPV、オオタバコガ(Helicoverpa armigera;Hear)NPV、またはシロイチモジヨトウ(Spodoptera exigua;Se)MNPVから誘導されてもよい。バキュロウイルスベクターは、バクミドであり得る。
[090]哺乳動物細胞におけるCMVタンパク質の発現は、生産されたCMVタンパク質が本来の哺乳動物の糖付加パターンを有し、したがって感染性CMVに提示されるエピトープを有することが公知であるため好ましいということは、従来技術における一般的な先入観である。したがって、免疫化に使用された場合、このようなタンパク質だけが感染中に天然に存在するCMV粒子に結合できる抗体の生成を可能にすることが予測された。
[091]驚くべきことに、本発明者らは、免疫原性五量体複合体は、哺乳動物細胞由来のバキュロウイルスベクターだけでなく、昆虫細胞由来のバキュロウイルスベクターを使用しても得られることを見出した。同時に、バキュロウイルス系の使用は、本発明の五量体複合体を、大量に高純度で生産することを可能にする。好ましくは、本発明の手段および方法により生産された五量体複合体は、特異的な糖付加パターン、すなわち昆虫の糖付加を示しており(HarrisonおよびJarvis(2006)、Adv. Virus Res.68、159〜191を参照)、それが五量体複合体をユニークなものにしており、したがって哺乳動物の糖付加とは異なっている。
[092]したがって、宿主細胞は、一般的に、昆虫細胞または哺乳動物細胞であり得る。一般的に、好ましくは、本発明の五量体複合体を生産するために核酸分子を発現するのに好適なあらゆる宿主細胞を使用することができる。本発明に従って使用される宿主細胞は、特定には昆虫細胞であってもよく、好ましくはSf9、Sf21、Super Sf9−1(VE−1)、Super Sf9−2(VE−2)、Super Sf9−3(VE−3)、Hi−5、エクスプレスSf+、およびS2シュナイダー細胞であり、好ましくはSuper Sf−9−2である[オックスフォードエクスプレッションテクノロジーズ(Oxford Expression Technologies)、カタログ番号600103、オックスフォード、英国;Fath-Goodinら(2006)、Adv. Virus Res.68、75〜90;Kroemerら(2006)、J. Virol.80(24)、12291〜12228およびUS20060134743]。本発明に従って使用するのに好適な例示的な哺乳動物の宿主細胞は、当業界において公知であり、例えば、これらに限定されないが、HEK293、HEK293F、CHO、HeLa、HUVEC、HUAEC、Huh7、HepG2、BHK、MT−2、Cos−7、Cos−1、C127、3T3、ヒト包皮線維芽細胞(HFF)、骨髄線維芽細胞、ボウズ(Bowes)黒色腫、一次神経細胞、または上皮細胞などのアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)より入手可能な不死化細胞株が挙げられる。哺乳動物細胞での発現は、生産されたタンパク質が本来の哺乳動物の糖付加パターンを有し、したがって感染性CMV粒子に提示されるエピトープを有することの原因となり得る。したがって、理論に縛られることはないが、哺乳動物細胞における本発明の五量体複合体の生産は、感染中に天然に存在するCMV粒子に結合できる抗体の生産をもたらすと予想される。しかしながら、本発明者らは、五量体複合体が昆虫細胞で生産された場合に中和活性を誘導することから、特に中和抗体は、上皮/内皮細胞および線維芽細胞へのCMV侵入を理想的にはブロックするかまたは少なくとも減少させることを観察した。
[093]しかしながら、本明細書で記載されるように、宿主細胞も、哺乳動物細胞であってもよい。例えば、BacMam系、バキュロウイルス発現ベクターは、哺乳動物細胞に遺伝子を送達するのに使用される。
[094]本発明者らは、意外なことに、例えば、高い収量の本発明の五量体複合体の生産を可能にする具体的なパラメーターを発見した。例えば、本発明の五量体複合体は、増殖培地1リットル当たり1.0mg以上(more than)(例えば、増殖培地1リットル当たり、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90100、200、300、400、500、600、650、680、700、800、900、1000mgまたはそれより高い)レベルに累積する可能性がある。
[095]前述のことに従って、共発現の工程は、宿主細胞を、本発明の五量体複合体のタンパク質を発現するバキュロウイルスに感染させることを含むことが想定される。好ましくは感染時に細胞約2×106個/mLの細胞数を有する前記宿主細胞を感染させる場合に、バキュロウイルスは、約107pfu/mLまたはそれより高いの力価を有することがさらに想定される。
[096]次いで、宿主細胞は、好適な条件下で培養される。好ましくは、感染後56〜65時間に、宿主細胞および/またはそれらの上清が回収される。代替として、宿主細胞の少なくとも80%(合計100%に対して)が生存可能である場合に、宿主細胞および/またはそれらの上清が回収される。宿主細胞の生存率は、例えば、細胞をトリパンブルーで染色することによって決定することができる。生存可能な細胞は色が付かず、一方で生存可能ではない細胞は色が付くと予想される。トリパンブルー染色は、以下のように行うことができる:1mlの細胞懸濁液を、0.4%トリパンブルー色素に約5分間晒し、続いて、全てのカウントされた細胞に対する生存可能な細胞/生存可能ではない細胞のパーセンテージを決定するために(すなわち全てのカウントされた細胞が100%と設定される)、好ましくは血球計算器を使用することにより顕微鏡観察する。
[097]「回収する」は、全てのその文法上の形態で、宿主細胞および/または上清を得る行為またはプロセスを意味し、例えば、トリプシン処理、ろ過、および/または遠心分離などを含み得る。本発明の五量体複合体をそれらの無傷のまたは機能的な形態で得ることができる限りは、どのような方法も考慮することができる。
[098]本発明の方法において、宿主細胞を、融解および培養の後、15日目から50日目の間、好ましくは15日目から30日目の間、好ましくは18日目に感染させることがさらに想定される。
[099]一部の実施態様において、本発明の五量体複合体は、それが発現される細胞から分泌される。本発明の他の実施態様において、本発明の五量体複合体は、分泌されない。好ましい実施態様は、五量体複合体のタンパク質のいずれも追加の分泌シグナルを含有しないことである。理論に縛られることはないが、宿主細胞、特に昆虫細胞中で五量体複合体が構築されたら、gHタンパク質は、複合体全体の分泌を媒介することが想定される。
精製
[0100]「精製すること」は、全てのその文法上の形態で、望ましくない化合物、例えば細胞、死細胞片、培養培地、バキュロウイルス、無傷のまたは無傷ではないバキュロウイルスのいずれかなどを除去することを意味する。発現系、収量などに応じた好適な精製方法は、従来技術において容易に利用することができる。例えば、精製は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよび/またはアフィニティークロマトグラフィーを包含していてもよく、これらは全て、これまでに詳細に説明されている。前述したように、精製工程は、とりわけバキュロウイルスを除去することを包含する。このようなバキュロウイルスは、バキュロウイルスベクターまたはBacMamベクターで感染させた宿主細胞から入手可能な培養培地および/または上清中に含有されている可能性がある。本発明の五量体複合体を精製する場合、このようなバキュロウイルスは除去されることが好ましい。本発明者らは、本明細書で説明されるような宿主細胞から入手可能な培養培地および/または上清からバキュロウイルスを除去するために、特定にはイオン交換クロマトグラフィー、より特定にはイオン交換クロマトグラフィーが適用され得ることを見出した。
[0100]「精製すること」は、全てのその文法上の形態で、望ましくない化合物、例えば細胞、死細胞片、培養培地、バキュロウイルス、無傷のまたは無傷ではないバキュロウイルスのいずれかなどを除去することを意味する。発現系、収量などに応じた好適な精製方法は、従来技術において容易に利用することができる。例えば、精製は、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよび/またはアフィニティークロマトグラフィーを包含していてもよく、これらは全て、これまでに詳細に説明されている。前述したように、精製工程は、とりわけバキュロウイルスを除去することを包含する。このようなバキュロウイルスは、バキュロウイルスベクターまたはBacMamベクターで感染させた宿主細胞から入手可能な培養培地および/または上清中に含有されている可能性がある。本発明の五量体複合体を精製する場合、このようなバキュロウイルスは除去されることが好ましい。本発明者らは、本明細書で説明されるような宿主細胞から入手可能な培養培地および/または上清からバキュロウイルスを除去するために、特定にはイオン交換クロマトグラフィー、より特定にはイオン交換クロマトグラフィーが適用され得ることを見出した。
[0101]精製はまた、本明細書で使用される場合、CMVタンパク質であるUL128、UL130、UL131A、gH(UL75)およびgL(UL115)を共に発現する宿主細胞が培養培地から除去され得ることも包含する。前記宿主細胞が好ましくは前記五量体複合体を分泌するため、前記培養培地は、好ましくは本発明の五量体複合体を含む。培養培地からの宿主細胞の除去は、機械的な力によって、例えば遠心分離またはろ過によって行われてもよい。ろ過は、好ましくは、ろ過媒体、例えば精密ろ過フィルターまたはデプスフィルターを使用することによってによって行われる。精密ろ過フィルターは、ポリエーテルスルホンまたは再生セルロースで構成されていてもよい。デプスフィルターは、ポリプロピレンまたはガラス繊維で構成されていてもよい。
[0102]しかしながら、前記宿主細胞が必ず前記五量体複合体を分泌しなければならない訳ではないことも想定される。そのような場合、前記宿主細胞が回収されてもよい。回収後、五量体複合体を放出させて本明細書で説明されるように精製できるように、前記宿主細胞は、例えば酵素的または機械的に破壊されていてもよい。
[0103]精製後、EDTAまたはEGTAなどのキレート剤を複合体に添加することが好ましい。好ましくは、EDTAは、20mMの最終濃度で存在する。その後、20mMのEDTAの最終濃度を、本明細書で説明されるように透析によって3mMの最終濃度またはそれ未満に低下させることが好ましい。
貯蔵
[0104]「貯蔵すること」は、全てのその文法上の形態で、好ましくは本発明の五量体複合体をその無傷のまたは機能的な形態で維持する条件下で保存すること(将来的な使用のために)を意味し、すなわち五量体複合体は、好ましくはその天然に存在する形態に類似しているか、および/または中和抗体を誘導することができる。したがって、貯蔵条件は、本発明の五量体複合体の崩壊を促進しない(または予防もする)ことが想定される。用語「崩壊」は、本明細書においてその最も広い意味で理解されるものとし、「分解」および/または「変性」を意味する場合もある。本発明の五量体複合体の貯蔵は、キレート剤および/または安定化剤を含む緩衝溶液中であることが想定される。
[0104]「貯蔵すること」は、全てのその文法上の形態で、好ましくは本発明の五量体複合体をその無傷のまたは機能的な形態で維持する条件下で保存すること(将来的な使用のために)を意味し、すなわち五量体複合体は、好ましくはその天然に存在する形態に類似しているか、および/または中和抗体を誘導することができる。したがって、貯蔵条件は、本発明の五量体複合体の崩壊を促進しない(または予防もする)ことが想定される。用語「崩壊」は、本明細書においてその最も広い意味で理解されるものとし、「分解」および/または「変性」を意味する場合もある。本発明の五量体複合体の貯蔵は、キレート剤および/または安定化剤を含む緩衝溶液中であることが想定される。
[0105]一般的に、本発明の五量体複合体の貯蔵を可能にし、その崩壊を促進しない限りは、どのようなキレート剤および/または安定化剤でも好適である。本発明の内容において例示的な有用なキレート剤は、EDTAである。EDTAは、20mMまたはそれ未満、例えば15mM、10mM、9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、または1mMの濃度で前記緩衝溶液中に存在していてもよい。特定には、EDTAは、3mMまたはそれ未満の濃度で存在していてもよい。本発明に従って使用するための例示的な安定化剤としては、グリコール、アルギニン、ソルビトール、グリセロールおよび/またはスクロースが挙げられる。特定には、緩衝溶液は、100〜200mMのアルギニン、100mMのソルビトール、20%グリセロール(w/v)、20%スクロース(w/v)、0.5%NP−40、0.2%Brij−35および0.5%Chapsを含んでいてもよい。
[0106]本発明に係る緩衝溶液は、トリス緩衝液、NaCl、KClを含んでいてもよく、pH6.5を有していてもよい。特定には、緩衝溶液は、25mMのトリス緩衝液、150mMのNaCl、3mMのKClを含んでいてもよい。また緩衝溶液も、リン酸ナトリウム/カリウム緩衝液であってもよい。前記緩衝液は、6.0から7.0の間のpHを有していてもよい。
ベクター設計
[0107]本発明は、CMVタンパク質であるUL128、UL130、UL131、gHおよびgLをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む1つまたはそれより多くのベクターを提供する。
[0107]本発明は、CMVタンパク質であるUL128、UL130、UL131、gHおよびgLをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む1つまたはそれより多くのベクターを提供する。
[0108]ベクターは、細菌(例えば大腸菌)、酵母(例えばS.セレビジエ(S. cerevisiae))、昆虫細胞および/または哺乳動物細胞における繁殖のためのエレメントを含有していてもよい。好ましくは、前記ベクターは、バキュロウイルスベクターまたはバキュロウイルスBacMamベクターである。
[0109]BacMam系において、哺乳動物細胞に遺伝子を送達するのにバキュロウイルスベクターが使用される。BacMam系は、宿主細胞として広範囲の細胞株および初代細胞に遺伝子送達するのに使用することができ、宿主細胞の例示的な列挙は本明細書の他所に記載されている。改変されていないバキュロウイルスは哺乳動物細胞に入ることができるが、その遺伝子は、哺乳動物の認識可能なプロモーターが目的の遺伝子上流に取り込まれていない限り発現されない。したがって、本発明のBacMamベクターは、本発明の五量体複合体のタンパク質をコードする遺伝子の上流に哺乳動物プロモーターを含むことが想定される。ベクターは、本明細書の他所で説明されるような追加のエレメント、例えば抗生物質耐性遺伝子、大腸菌、S.セレビジエなどにおける繁殖のためのエレメントを含んでいてもよい。
[0110]前記バキュロウイルスベクターにおいて、v−cathおよび/またはChiA遺伝子が機能的に破壊されていてもよい。
[0111]一般的に、本発明の五量体複合体のCMVタンパク質であるUL128、UL130、UL131A、gHおよびgLをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)が、1つまたはそれより多くのベクター、例えば2つのベクターに存在していてもよい。したがって、ORFの1、2、3、または4つが第一のベクターにあり、一方で残りのORF/ORF(複数)が第二のベクターにある。しかしながら、前記ORFが単一のベクターに存在することが好ましい。またORFは、多遺伝子性の形態で存在していてもよい(EP1945773)。
[0111]一般的に、本発明の五量体複合体のCMVタンパク質であるUL128、UL130、UL131A、gHおよびgLをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)が、1つまたはそれより多くのベクター、例えば2つのベクターに存在していてもよい。したがって、ORFの1、2、3、または4つが第一のベクターにあり、一方で残りのORF/ORF(複数)が第二のベクターにある。しかしながら、前記ORFが単一のベクターに存在することが好ましい。またORFは、多遺伝子性の形態で存在していてもよい(EP1945773)。
[0112]ORFは、例えば、前記ベクター中に5’から3’に以下の順番:
(i)gH、gL、UL128、UL130、UL131A;
または(ii)gL、UL128、UL130、UL131A、gH
で配置されていてもよい。
(i)gH、gL、UL128、UL130、UL131A;
または(ii)gL、UL128、UL130、UL131A、gH
で配置されていてもよい。
[0113]特定には、
(a)(i)において、gHのORFは、3’方向で転写され、gLのORFは5’方向で転写され、UL128のORFは3’方向で転写され、UL130のORFは3’方向で転写され、UL131AのORFは3’方向で転写され;
(b)(i)において、gHのORFは3’方向で転写され、gLのORFは3’方向で転写され、UL128のORFは3’方向で転写され、UL130のORFは3’方向で転写され、UL131AのORFは3’方向で転写され;
(c)(ii)において、gLのORFは5’方向で転写され、UL128のORFは3’方向で転写され、UL130のORFは3’方向で転写され、UL131AのORFは3’方向で転写され、gHのORFは3’方向で転写される
ことが想定される。
(a)(i)において、gHのORFは、3’方向で転写され、gLのORFは5’方向で転写され、UL128のORFは3’方向で転写され、UL130のORFは3’方向で転写され、UL131AのORFは3’方向で転写され;
(b)(i)において、gHのORFは3’方向で転写され、gLのORFは3’方向で転写され、UL128のORFは3’方向で転写され、UL130のORFは3’方向で転写され、UL131AのORFは3’方向で転写され;
(c)(ii)において、gLのORFは5’方向で転写され、UL128のORFは3’方向で転写され、UL130のORFは3’方向で転写され、UL131AのORFは3’方向で転写され、gHのORFは3’方向で転写される
ことが想定される。
[0114]ベクターのさらなる例は、CMVの五量体複合体を生成するための以下のベクター(pRBT136−x)であり(前記ベクターの構築およびプロセシングは、PCT/EP2013/072717の実施例1で説明されている)、したがって本発明の五量体複合体の発現に適用できる好ましいベクターである。したがって、以下の表1に列挙したベクターは、五量体複合体のタンパク質の1つまたはそれより多くの共発現に使用されるベクターの好ましい例示的なベクターである。注目すべきことに、以下の表の左の列に示される具体的なヌクレオチド配列とは別に、以下の表1で示されたような五量体複合体のタンパク質をコードする遺伝子のアレンジメントも、本発明の実施態様である好ましいアレンジメントである。略語:c:コンセンサス配列;H:His−タグ;SH:ストレプトアビジン−His−タグ;V:VR1814、pcI:プレシジョンプロテアーゼ、pcII:プレシジョンおよびTEVプロテアーゼ、DT:二量体化ツール。表1における遺伝子の説明には、より短いCMVの学術名(gB、gH、gL、gO、加えて接頭辞のない「UL」および接尾辞「A」のないUL48)が使用される。
[0115]本発明のために好ましく使用されるベクター骨格pRBT136は、大腸菌のための複製起点、例えばpBR322ori、および酵母、例えば2ミクロンori、昆虫細胞での発現のためのpolhおよびp10プロモーター、ターミネーターSV40およびHSVtk、数種の耐性マーカー(アンピシリン、ゲンタマイシン)、酵母選択マーカー(URA3)、トランスポゾン部位(Tn)、ならびに多重クローニング部位(MCS)を含有する。
[0116]一例として、プロモーター−目的の遺伝子−ターミネーターを含有する発現カセットは、35〜40ntのオーバーハングを有する5’部位、およびさらなる異なる35〜40ntのオーバーハングを有する3’部位で、PCRにより増幅される。同じ構成を有する第二の発現カセットとの相同組換えのために、PCR産物は、5’部位に、前のPCR産物の3’部位に対する35〜40ntのオーバーハングの相補的配列を含有する。第一のPCR産物の5’部位および第二のPCR産物の3’部位における残りのオーバーハングは、それぞれ直線状にしたベクター(pRBT136)の3’および5’末端に相同である。次いで酵母、好ましくはサッカロミセス・セレビジエ中で配列における相同組換えが実行される。以前に説明された戦略と平行して構築しようとする発現カセット/PCR産物の数は、構築しようとする遺伝子の必要な数に従って増加する。この手段によって、複数の遺伝子/発現カセットが平行して構築される。構築された遺伝子は、トランスポゾン部位を両側に有する。これらは、バキュロウイルスゲノムへの遺伝子の転位に使用される。結果得られたバキュロウイルス共発現ベクターは、同じ単一の細胞から遺伝子が確実に共発現されるようにする。収量および生成物の組成は、タンパク質および生産パラメーターの数によって様々である。細胞株、感染時の細胞数(CCI)、組換えウイルス接種材料の量(重複感染度、MOI)および回収時間(TOH)などの生産パラメーターは、マトリックスシステムおよびスモールスケールの生産システムを使用した収量および早期回収に関して決定される(2〜20ml; Ries, C.、John C.、Eibl R.(2011)、A new scale down approach for the rapid development of Sf21/BEVS based processes - a case study. In Eibl R.、Eibl D.(編集者):Single-use technology in Biopharmaceutical Manufacture、207〜213、ジョン・ワイリー&サンズ(John Wiley & Sons)、ニュージャージー州ホーボーケン)。次いで規定されたパラメーターは、それぞれの生成物をより大きいスケールで生産するのに使用される。本発明の五量体複合体は、高い製造能力を可能にする現行の使い捨ての組織培養技術を使用して製造される。
[0117]ベクターは、例えば、複製起点、プロモーター、クローニング部位、遺伝子マーカー、抗生物質耐性遺伝子、エピトープ、レポーター遺伝子、標的配列および/またはタンパク質精製タグなどの1つまたはそれより多くのさらなるエレメントを含有していてもよい。当業者は、具体的な発現系にとってどのエレメントが適切であるかを容易に理解するものと予想される。
[0118]特定には、本発明に係るベクターはさらに、細菌(大腸菌)、酵母(S.セレビジエ)、昆虫細胞および/または哺乳動物細胞における繁殖のためのエレメント、例えば複製起点、選択マーカーなどを含有していてもよい。
[0119]ベクターは、遺伝子発現のためのプロモーターを含むことが想定される。本明細書で説明されるORFのそれぞれは、プロモーターによって駆動される。プロモーターは、好ましくは、polh、p10およびpXIV超後期(very late)バキュロウイルスプロモーター、vp39バキュロウイルス後期プロモーター、vp39polhバキュロウイルス後期/超後期ハイブリッドプロモーター、pca/polh、pcna、etl、p35、egt、da26バキュロウイルス初期プロモーター;CMV−IE1、UBc.EF−1、RSVLTR、MT、シミアンウイルス40プロモーター、CAGプロモーター(CMV−IE1エンハンサーを含むベータ−アクチンプロモーター)、B型肝炎ウイルスプロモーター/エンハンサー、ヒトユビキチンCプロモーター、ハイブリッドニューロンプロモーター、pDS47、Ac5、ならびにPGALおよびPADHからなる群より選択される。本明細書で説明されるORFのそれぞれの後に、ターミネーター配列、例えばHSVtkターミネーター、SV40ターミネーター、またはウシ成長ホルモン(BGH)ターミネーターが続く。
[0120]本発明の五量体複合体のタンパク質の1つまたはそれより多くは、プレシジョンプロテアーゼまたはプレシジョンおよびTEVプロテアーゼを含んでいてもよい。例えば、gHおよび/またはgLタンパク質は、プレシジョンプロテアーゼまたはプレシジョンおよびTEVプロテアーゼを含み得ることが特に想定される。
[0121]バキュロウイルスv−cathおよび/またはChiA活性は、機能的に破壊され得ることがさらに想定され、これは、好ましくは機能的なv−cathおよび/またはChiAが存在しない、および/または発現されないことを意味する。ほとんどのバキュロウイルスは、キチナーゼ(chiA)およびウイルスカテプシン様プロテアーゼ(v−cath)をコードしており、これは、細胞中に保持されており、感染の最後に宿主の死骸を液化するためにウイルスによって誘導された溶解の際に放出される(Hawtin, REら、Virology.1997;238、243〜253)。これらの遺伝子はバキュロウイルス複製に必須ではないため、例えば、部分的または完全な欠失、挿入変異誘発によって、または1つまたはそれより多くの不活性化する点突然変異によって不活性化されてもよい。
[0122]本発明の五量体複合体は、例えばゲル電気泳動によって決定されたような質量に基づき、総タンパク質の例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、または99%の様々なレベルの純度で調製することができる。これらの高いレベルの純度は、複合体を、例えば診断用途における免疫原としての使用またはワクチン製剤における抗原としての使用にとって好適にする。このようなレベルの純度は、好ましくは、(i)本明細書で説明されるような培養培地から宿主細胞を取り出すこと、(ii)本明細書で説明されるようなクロマトグラフィーを適用すること、例えば、五量体複合体のタグを有するバージョンが宿主細胞によって発現される場合、アフィニティークロマトグラフィーを適用すること、それに続いて(iii)バキュロウイルス発現系が使用される場合、イオン交換クロマトグラフィー、特定にはイオン交換クロマトグラフィーを介してバキュロウイルスを取り出すことによって得ることができる。これらの工程はいずれも繰り返すことができ、好ましくは工程(ii)が最後の工程として繰り返される。これらの工程は、(i)、(ii)および(iii);(ii)、(i)および(iii);(i)、(iii)および(ii);(iii)、(ii)および(i);(ii)、(iii)および(i);または(iii)、(i)および(ii)の順番であってもよい。好ましくは、工程(ii)が最後の工程として繰り返される。
組成物
[0123]本発明の五量体複合体はまた、組成物の形態であってもよい。本発明の組成物は、緩衝液、還元剤、安定化剤、キレート剤、増量剤、浸透圧調整剤(osmotic balancing agent)(等張化剤);界面活性剤、ポリオール、抗酸化剤;凍結乾燥保護剤(lyoprotectant);消泡剤;保存剤;ならびに着色剤、洗浄剤、ナトリウム塩、および/または抗微生物剤などをさらに含んでいてもよい。組成物は、ポリアクリルアミド非含有でもよい。
[0123]本発明の五量体複合体はまた、組成物の形態であってもよい。本発明の組成物は、緩衝液、還元剤、安定化剤、キレート剤、増量剤、浸透圧調整剤(osmotic balancing agent)(等張化剤);界面活性剤、ポリオール、抗酸化剤;凍結乾燥保護剤(lyoprotectant);消泡剤;保存剤;ならびに着色剤、洗浄剤、ナトリウム塩、および/または抗微生物剤などをさらに含んでいてもよい。組成物は、ポリアクリルアミド非含有でもよい。
[0124]一部の実施態様において、組成物は、ポリアクリルアミドを含有しない。一部の実施態様において、組成物は、液体、例えば水性の液体であり、ゲルではない。一部の実施態様において、タンパク質複合体は、組成物内に固定されていない。例えば、前記五量体複合体は、ゲル中、またはフィルム、膜、ペーパーもしくはスライド上に存在していなくてもよい。
[0125]組成物は、滅菌されていてもよいし、および/またはパイロジェンフリーであってもよい。組成物は、ヒトに関して等張であってもよい。
中和活性
[0126]本発明者らは、本発明の五量体複合体は、免疫原性応答を誘導できることを発見した。用語「免疫原性応答」は、「適応免疫応答」を意味し、一般的に、好ましくはインビボでの体液性および/または細胞性免疫応答を包含する。免疫原性応答は、好ましくは中和活性の誘導を含み、ここで中和活性は、好ましくは中和抗体の形態である。
中和活性
[0126]本発明者らは、本発明の五量体複合体は、免疫原性応答を誘導できることを発見した。用語「免疫原性応答」は、「適応免疫応答」を意味し、一般的に、好ましくはインビボでの体液性および/または細胞性免疫応答を包含する。免疫原性応答は、好ましくは中和活性の誘導を含み、ここで中和活性は、好ましくは中和抗体の形態である。
[0127]「中和抗体」は、抗原の生物学的作用、例えば宿主において感染を開始および/または持続させる病原体の能力を中和する(消滅または減少させる)ことができる抗体である。好ましくは、本発明の五量体のタンパク質複合体に応答して生成した中和抗体は、CMVビリオン粒子と交差反応することによって、CMV感染に対する免疫性を付与する。理論に縛られることはないが、本発明の五量体のタンパク質複合体に応答して生成した中和抗体は、上皮、内皮(Epi/EC)および/または線維芽細胞に入るCMVビリオン粒子の能力を消滅させるか、または少なくとも減少させると考えられ、「および」の組合せが好ましい。細胞への侵入効率は、当業者に公知の標準化した試験によって決定した場合、少なくとも約25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99または100%減少することが想定される。「効率」は、本明細書で使用される場合、抗体の非存在下で感染した数に対するパーセンテージとしての、抗体の存在下で感染した細胞数と定義される。特定の中和抗体においてスクリーニング/同定/決定するための中和アッセイは、図3の凡例および実施例3で説明されるようにして行うことができる。
[0128]したがって、本発明の五量体複合体は、CMV感染に対する免疫性を誘導する可能性があることが想定される。これらの2つの機能(すなわち、免疫原性応答の誘導と免疫性の誘導)は、中和抗体を包含する抗体の生産を惹起することができる本発明の五量体複合体上におけるエピトープの保持に依存する。五量体複合体に関する様々なコンフォメーショナルエピトープが公知である;Macagno(2010)、Journal of Virology 84(2010):1005〜13を参照されたい。
[0129]前述したことを考慮すれば、本発明は、好ましくは、上皮/内皮(Epi/EC)および線維芽細胞の感染を両方とも阻害する中和活性を誘導することが可能な五量体複合体を提供する。
生産方法
[0130]第二の形態では、本発明はまた、CMVタンパク質であるUL128、UL130、UL131A、gH(UL75)およびgL(UL115)で構成される五量体複合体を生産するための方法であって、
(i)バキュロウイルスCMVタンパク質であるUL128、UL130、UL131A、gH(UL75)およびgL(UL115)を宿主細胞中で共発現させること;
(ii)前記共発現により得られた宿主細胞および/または上清から、五量体複合体を精製すること;および
(iii)任意選択で、精製された五量体複合体を、キレート剤および/または安定化剤を含む緩衝溶液中で貯蔵すること
を含む、上記方法も提供する。
[0130]第二の形態では、本発明はまた、CMVタンパク質であるUL128、UL130、UL131A、gH(UL75)およびgL(UL115)で構成される五量体複合体を生産するための方法であって、
(i)バキュロウイルスCMVタンパク質であるUL128、UL130、UL131A、gH(UL75)およびgL(UL115)を宿主細胞中で共発現させること;
(ii)前記共発現により得られた宿主細胞および/または上清から、五量体複合体を精製すること;および
(iii)任意選択で、精製された五量体複合体を、キレート剤および/または安定化剤を含む緩衝溶液中で貯蔵すること
を含む、上記方法も提供する。
[0131]本発明の五量体複合体の文脈で説明される実施態様は、必要な変更を加えて本発明の方法にも適用されることに留意されたい。
医薬/ワクチン組成物
[0132]第三の形態では、治療有効量の本発明の五量体複合体または本発明の方法によって入手可能な五量体複合体および任意選択で医薬的に許容される担体またはアジュバントを含む、医薬組成物またはワクチン組成物が提供される。また本発明の医薬組成物またはワクチン組成物は、本明細書で説明されるベクターを含んでいてもよい。
医薬/ワクチン組成物
[0132]第三の形態では、治療有効量の本発明の五量体複合体または本発明の方法によって入手可能な五量体複合体および任意選択で医薬的に許容される担体またはアジュバントを含む、医薬組成物またはワクチン組成物が提供される。また本発明の医薬組成物またはワクチン組成物は、本明細書で説明されるベクターを含んでいてもよい。
[0133]「治療有効量」は、望ましい治療効果を惹起するのに十分な量である。例えばワクチン組成物において、治療有効量は、免疫応答、例えば対象における中和抗体の生産を誘導するのに十分な量であり得る。対象は、好ましくは哺乳動物であってもよく、哺乳動物は、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、または霊長類であってもよい。好ましくは、対象は、ヒトである。
[0134]用語「医薬的に許容される」は、特定には、動物、より特定にはヒトでの使用に関する管理機関または他の一般的に認められた薬局方によって承認されていることを意味する場合がある。
[0135]本発明の医薬/ワクチン組成物は、対象の治療的処置のためであることが想定される。用語「治療的処置」は、全てのその文法上の形態で、処置的または予防的処置を包含する。「処置的または予防的処置」は、臨床的および/もしくは病理学的な兆候の完全な予防を目的とした予防的処置、または臨床的および/もしくは病理学的な兆候の緩和もしくは寛解を目的とした治療的処置を含む。
[0136]先天性疾患に罹る機会を低減するためには、母親の最初のCMV感染を予防するための予防ワクチンが望ましく、それに対して母親が活動性CMV感染と診断されているケースでは、有効な療法が必要である。本発明の五量体複合体は、例えば妊婦、子供または移植前の移植患者のための予防ワクチンとして適用されることが特に想定される。
[0137]ワクチン組成物は、gBタンパク質、gMタンパク質、pp65タンパク質、IE−1タンパク質、gL/gHタンパク質の二量体、gM/gNタンパク質の二量体、gL/gH/gOの三量体、1つまたはそれより多くのキャプシドもしくはキャプシド前駆タンパク質、CMV由来の1つまたはそれより多くの表面タンパク質、および/または1つまたはそれより多くの外被タンパク質を含むウイルス様粒子(VLP)をさらに含み得る。「gB」は、本明細書においてUL55と同義的に使用される。「gM」は、本明細書においてUL100と同義的に使用される。「pp65」は、本明細書においてUL83と同義的に使用される。「IE−1」は、本明細書においてUL123と同義的に使用される。「gO」は、本明細書においてUL74と同義的に使用される。上述のタンパク質は、具体的な配列に限定されないことが理解されると予想される。上述のタンパク質の突然変異およびトランケートされた形態も想定され、本発明のワクチン組成物に包含される。上述のタンパク質はまた、改変された形態で本発明のワクチン中に存在していてもよい。例示的な改変は、本発明の五量体複合体のタンパク質の文脈で説明されており、gB、gM、pp65、IE−1およびgOにも適用可能である。
[0138]本発明のワクチンまたはベクターワクチンはそれぞれ、可溶性の形態の補体受容体1型(sCR1)をさらに含んでいてもよい。
[0139]「ウイルス様粒子(VLP)」は、ウイルス構造タンパク質(例えば、表面タンパク質)の複合体であり、これは、ウイルスに類似しているが、いかなるウイルス遺伝物質も含有せず、したがって非感染性である。本発明に従って使用されるVLPは、原則的に、免疫応答が惹起されることが望ましいあらゆるウイルスタンパク質を含んでいてもよい。例えば、本発明に従って使用されるVLPは、CMVキャプシドもしくはキャプシド前駆タンパク質、表面タンパク質および/もしくは外被タンパク質、B細胞および/もしくはT細胞エピトープ、および/もしくは追加の外来抗原配列の群より選択されるタンパク質、サイトカイン、CpGモチーフ、g−CMSF、CD19およびCD40リガンドならびに/もしくは蛍光タンパク質、粒子の精製目的または標識の結合に有用なタンパク質、ならびに/または輸送プロセスに必要なタンパク質様の構造を含んでいてもよい。
[0139]「ウイルス様粒子(VLP)」は、ウイルス構造タンパク質(例えば、表面タンパク質)の複合体であり、これは、ウイルスに類似しているが、いかなるウイルス遺伝物質も含有せず、したがって非感染性である。本発明に従って使用されるVLPは、原則的に、免疫応答が惹起されることが望ましいあらゆるウイルスタンパク質を含んでいてもよい。例えば、本発明に従って使用されるVLPは、CMVキャプシドもしくはキャプシド前駆タンパク質、表面タンパク質および/もしくは外被タンパク質、B細胞および/もしくはT細胞エピトープ、および/もしくは追加の外来抗原配列の群より選択されるタンパク質、サイトカイン、CpGモチーフ、g−CMSF、CD19およびCD40リガンドならびに/もしくは蛍光タンパク質、粒子の精製目的または標識の結合に有用なタンパク質、ならびに/または輸送プロセスに必要なタンパク質様の構造を含んでいてもよい。
[0140]さらにワクチン組成物は、gB、gM、pp65、IE−1またはIE−2をコードする核酸分子を含んでいてもよい。例えば、核酸は、DNAまたはRNAであってもよい。例えば、核酸は、ベクターまたはプラスミドの形態であってもよい。複合体化され安定化された形態も想定される。
[0141]本発明はまた、本発明の五量体複合体または本明細書で説明されるような他のあらゆるCMC複合体をコードするベクターを含むワクチン組成物も提供する。前記ベクターは、DNAベースであってもよいし、またはRNAベースであってもよい。ワクチン組成物に従って使用するのに好適なベクターとしては、DNAベースのベクター、例えばバキュロウイルスベクター、BacMamベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、AAVベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、およびエプスタイン−バーウイルス(EBV)ベクターが挙げられる。また裸のDNAの使用も、例えばプラスミドの形態で、任意選択で複合体化および/または安定化された形態(例えばリポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、ビロソームおよび無機ナノ粒子との複合体)で想定される。好適なRNAベースのベクターとしては、レトロウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス(SFV)、シンドビスウイルス(SIN)およびベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEE)ベクターが挙げられる。
[0142]本発明のワクチン組成物は、UL128、UL130、UL131、gH(UL75)およびgL(UL115)で構成されるCMV五量体複合体の1つまたはそれより多くのタンパク質を含む改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)をさらに含んでいてもよい。
[0143]さらに、本発明は、プライミング組成物として前記ワクチン組成物を投与し、ブースティング組成物として(i)gH/gL二量体、(ii)UL130/UL131A−二量体、(iii)gM/gN二量体(iv)gH/gL/UL128/UL130/UL131A−五量体、(v)gB、(vi)gM、(vii)pp65、(viii)IE−1、(ix)IE−2、(x)UL128、UL130、UL131、gH(UL75)およびgL(UL115)で構成されるCMV五量体複合体の1つまたはそれより多くのタンパク質を含む改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)、(xi)gB、gH/gL二量体、pp65タンパク質またはIE−1タンパク質を含む改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)、(xii)1つまたはそれより多くのキャプシドもしくはキャプシド前駆タンパク質、CMV由来の1つまたはそれより多くの表面タンパク質、または1つまたはそれより多くの外被タンパク質を含むウイルス様粒子(VLP)、(xiii)(i)から(xii)で規定された化合物のいずれか1種をコードする核酸配列、(xiv)フラジェリン由来のペプチド、(xv)CpGモチーフ、および/または(xvi)LCMVを前記対象に投与することを含む、対象にCMVに対するワクチン接種をする方法で使用するためのワクチン組成物を提供する。
[0144]前記ブースティング組成物はまた、プライミング組成物としても使用でき、前記プライミング組成物は、ブースティング組成物として使用される。
[0145]プライムブーストレジメンにおいて、プライム/ブーストワクチンが使用され、これは、一次免疫化に使用されるワクチン(プライムまたはプライミング)およびブースター免疫化に使用されるワクチン(ブーストまたはブースティング)を包含する2種またはそれより多くのタイプのワクチンで構成される。通常、一次免疫化に使用されるワクチンおよびブースター免疫化に使用されるワクチンは、互いに異なる。一次免疫化およびブースティング免疫化は逐次的に行ってもよいが、これは必須ではない。プライム/ブーストレジメンとしては、これらに限定されないが、例えばDNAプライム/タンパク質ブースト、DNAプライム/ウイルスベクターブースト(例えばMVAを使用)が挙げられる。
[0145]プライムブーストレジメンにおいて、プライム/ブーストワクチンが使用され、これは、一次免疫化に使用されるワクチン(プライムまたはプライミング)およびブースター免疫化に使用されるワクチン(ブーストまたはブースティング)を包含する2種またはそれより多くのタイプのワクチンで構成される。通常、一次免疫化に使用されるワクチンおよびブースター免疫化に使用されるワクチンは、互いに異なる。一次免疫化およびブースティング免疫化は逐次的に行ってもよいが、これは必須ではない。プライム/ブーストレジメンとしては、これらに限定されないが、例えばDNAプライム/タンパク質ブースト、DNAプライム/ウイルスベクターブースト(例えばMVAを使用)が挙げられる。
担体
[0146]用語「担体」および「賦形剤」は、本明細書において同義的に使用される。医薬的に許容される賦形剤としては、これらに限定されないが、希釈剤(フィラー、増量剤、例えばラクトース、微結晶性セルロース)、崩壊剤(例えばデンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム)、結合剤(例えばPVP、HPMC)、潤滑剤(例えばステアリン酸マグネシウム)、滑剤(例えばコロイダルSiO2)、溶媒/共溶媒(例えば水性媒体、プロピレングリコール、グリセロール)、緩衝剤(例えばクエン酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩)、保存剤(例えば安息香酸Na、パラベン(Me、PrおよびBu)、BKC)、抗酸化剤(例えばBHT、BHA、アスコルビン酸)、湿潤剤(例えばポリソルベート、ソルビタンエステル)、消泡剤(例えばシメチコン)、増粘剤(例えばメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロース)、甘味剤(例えばソルビトール、サッカリン、アスパルテーム、アセスルファム)、矯味矯臭剤(例えばペパーミント、レモン油、バタースコッチなど)、潤滑剤(例えばプロピレン、グリコール、グリセロール、ソルビトール)が挙げられる。当業者であれば、例えば医薬組成物の製剤および投与経路に応じて好適な医薬的に許容される賦形剤を容易に選択できるものと予想される。
[0146]用語「担体」および「賦形剤」は、本明細書において同義的に使用される。医薬的に許容される賦形剤としては、これらに限定されないが、希釈剤(フィラー、増量剤、例えばラクトース、微結晶性セルロース)、崩壊剤(例えばデンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム)、結合剤(例えばPVP、HPMC)、潤滑剤(例えばステアリン酸マグネシウム)、滑剤(例えばコロイダルSiO2)、溶媒/共溶媒(例えば水性媒体、プロピレングリコール、グリセロール)、緩衝剤(例えばクエン酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩)、保存剤(例えば安息香酸Na、パラベン(Me、PrおよびBu)、BKC)、抗酸化剤(例えばBHT、BHA、アスコルビン酸)、湿潤剤(例えばポリソルベート、ソルビタンエステル)、消泡剤(例えばシメチコン)、増粘剤(例えばメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロース)、甘味剤(例えばソルビトール、サッカリン、アスパルテーム、アセスルファム)、矯味矯臭剤(例えばペパーミント、レモン油、バタースコッチなど)、潤滑剤(例えばプロピレン、グリコール、グリセロール、ソルビトール)が挙げられる。当業者であれば、例えば医薬組成物の製剤および投与経路に応じて好適な医薬的に許容される賦形剤を容易に選択できるものと予想される。
[0147]例示的な医薬的に許容される賦形剤の限定的な列挙としては、(生分解性)リポソーム;生分解性ポリマーのポリ(D,L)−乳酸−co−グリコール酸(PLGA)で作製されるマイクロスフェア、アルブミンマイクロスフェア;合成ポリマー(可溶性);ナノ繊維、タンパク質−DNA複合体;タンパク質コンジュゲート;赤血球;またはビロソームが挙げられる。様々な担体ベースの剤形は、固体脂質ナノ粒子(SLN)、高分子ナノ粒子、セラミックナノ粒子、ヒドロゲルナノ粒子、共重合ペプチドナノ粒子、ナノ結晶およびナノサスペンジョン、ナノ結晶、ナノチューブおよびナノワイヤー、官能化したナノキャリアー、ナノスフェア、ナノカプセル、リポソーム、脂質エマルジョン、脂質マイクロチューブ/マイクロシリンダー、脂質マイクロバブル、リポスフェア、リポポリプレックス、逆脂質ミセル(inverse lipid micelle)、デンドリマー、エトソーム(ethosome)、多成分の超薄カプセル、アクアソーム(aquasome)、ファーマコソーム(pharmacosome)、コロイドソーム(colloidosome)、ニオゾーム(niosome)、ディスコーム(discome)、プロニオソーム(proniosome)、マイクロスフェア、マイクロエマルジョンおよび高分子ミセルを含む。他の好適な医薬的に許容される賦形剤は、とりわけRemington’s Pharmaceutical Sciences、第15版、マック・パブリッシング社(Mack Publishing Co.)、ニュージャージー州(1991)およびBauerら、Pharmazeutische Technologie、第5版、Govi-Verlag、フランクフルト(1997)で説明されている。
アジュバント
[0148]本発明の医薬またはワクチン組成物は、五量体複合体への免疫系の応答を刺激するためにアジュバントをさらに含んでいてもよい。本発明に従って使用するための例示的なアジュバントとしては、無機化合物、例えばアラム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化リン灰石(calcium phosphate hydroxide)、鉱油、例えばパラフィン油、ビロソーム、細菌産物、例えば死菌の百日咳菌(Bordetella pertussis)、ウシ型結核菌、トキソイド、非細菌性の有機物質、例えばスクアレン、チメロサール、洗浄剤(Quil A)、サイトカイン、例えばIL−1、IL−2、IL−10およびIL−12、ならびに複合組成物、例えばフロイント完全アジュバント、およびフロイント不完全アジュバントが挙げられる。一般的に、本発明に従って使用されるアジュバントは、好ましくは、本発明の五量体複合体に対する免疫応答の効能を高めたり、および/またはそれを望ましい免疫応答の方向に調節したりする。
[0148]本発明の医薬またはワクチン組成物は、五量体複合体への免疫系の応答を刺激するためにアジュバントをさらに含んでいてもよい。本発明に従って使用するための例示的なアジュバントとしては、無機化合物、例えばアラム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化リン灰石(calcium phosphate hydroxide)、鉱油、例えばパラフィン油、ビロソーム、細菌産物、例えば死菌の百日咳菌(Bordetella pertussis)、ウシ型結核菌、トキソイド、非細菌性の有機物質、例えばスクアレン、チメロサール、洗浄剤(Quil A)、サイトカイン、例えばIL−1、IL−2、IL−10およびIL−12、ならびに複合組成物、例えばフロイント完全アジュバント、およびフロイント不完全アジュバントが挙げられる。一般的に、本発明に従って使用されるアジュバントは、好ましくは、本発明の五量体複合体に対する免疫応答の効能を高めたり、および/またはそれを望ましい免疫応答の方向に調節したりする。
[0149]本発明の医薬またはワクチン組成物を投与するために様々な経路を適用することができ、このような経路としては、これらに限定されないが、経口的、局所、経皮、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内または眼内などが挙げられる。しかしながら、他のあらゆる経路も必要に応じて当業者により容易に選択することができる。
[0150]それらを必要とする対象に投与される本発明の医薬/ワクチン組成物の正確な用量は、処置の目的(例えば急性疾患の処置、それに対して予防ワクチン接種)によって決まると予想される。投与経路、年齢、体重、全体的な健康状態、性別、食事、投与時間、薬物の相互作用および状態の重症度を適合させることが必要な場合があり、当業者により慣例的な実験で確認が可能であると予想される。
供給源(Source)
[0151]第四の形態では、本発明の五量体複合体において、前記タンパク質の少なくとも1種、2種、3種または4種は、残りのタンパク質の由来となったCMV株以外のCMV株由来であってもよい。
[0151]第四の形態では、本発明の五量体複合体において、前記タンパク質の少なくとも1種、2種、3種または4種は、残りのタンパク質の由来となったCMV株以外のCMV株由来であってもよい。
[0152]本発明に係る「株」は、CMV遺伝子型バリアントを指す。「CMV株由来の」という表現は、本明細書において「CMV株から誘導された」という表現と同義的に使用され、本明細書におけるその最も広い意味で理解されるものとし、これは、CMV株に「戻ることができる」、すなわちCMV株において天然に存在する対応物または祖先を有することをいう。この用語はまた、改変タンパク質、例えばそれらの天然に存在する対応物と比べてアミノ酸の欠失、挿入または変換などの突然変異を有する改変タンパク質、またはタグを有するタンパク質も包含する。
[0153]例えば、CMVタンパク質は、以下のCMV株、すなわちNCBIのGenBankに受託番号FJ616285.1で寄託されたゲノムを有するタウン、トレド(GU937742.1)、AD169(FJ527563)、マーリン(AY446894.2)、TB20/E(KF297339.1)、VR1814(GU179289)から誘導されてもよい。Patroneら、J.Virol.、2005、79、8361〜8373によれば、204位のアミノ酸Yは、アミノ酸Fで置換されており、UL130の発現の主要な問題は、次のORFへのアミノ酸の拡張を引き起こす同じ位置におけるフレームシフトである。注目すべきことに、CMV株タウン(ACCN:FJ616285.1)それ自身は機能的な五量体複合体を発現しないが、本発明者らは、驚くべきことに、遺伝子合成のためにGenBankに受託番号FJ616285.1で寄託されたタウンからのヌクレオチド配列を使用した場合、機能的な五量体複合体をタウンから得ることができることを見出した(ORF UL75(タンパク質番号:ACM48053.1)、UL115(ACM48085.1)、UL128(AAR31451.1)、UL130、UL131A(AAR31453.1))。このような五量体複合体は、マウスにおいて線維芽細胞へのCMVの侵入を予防することができる中和抗体の生成を惹起した。したがって、GenBankに受託番号FJ616285.1で寄託されたCMVタウン株のUL75、UL115、UL128、UL130、UL131AをコードするORFが好ましい。同様に、前記ORFによってコードされたタンパク質が好ましい。
[0154]加えて、本発明者らは、UL130のORFのアミノ酸配列の204位にアミノ酸F(Phe)を有し、加えて結果として機能的なアミノ酸Y(Tyr)が生じるタウン実験株(ヒト包皮線維芽細胞で成長させた)の同じ位置におけるフレームシフトが修復されたCMV株タウン中に存在するORFの使用が可能であることも見出した。改変pUL130を使用することも、機能的な五量体複合体を提供する。
ウイルス
[0155]第五の形態では、本発明は、NCBIのGenBankに受託番号FJ616285.1で寄託されたゲノムを有し、UL130のORFのアミノ酸配列の204位にアミノ酸Fを有し、加えて結果として機能的なアミノ酸Yが生じるタウン実験株(ヒト包皮線維芽細胞で成長させた)の同じ位置におけるフレームシフトが修復された、改変されたCMVタウン株を提供する。
[0155]第五の形態では、本発明は、NCBIのGenBankに受託番号FJ616285.1で寄託されたゲノムを有し、UL130のORFのアミノ酸配列の204位にアミノ酸Fを有し、加えて結果として機能的なアミノ酸Yが生じるタウン実験株(ヒト包皮線維芽細胞で成長させた)の同じ位置におけるフレームシフトが修復された、改変されたCMVタウン株を提供する。
[0156]単に例示的な目的のために記載された以下の実施例から、本発明およびその利点のより十分な理解が得られると予想される。実施例は、発明の範囲を限定することを決して意図していない。
[0157]実施例1:五量体CMV複合体の発現、精製および特徴付け
系統的な最適化に基づき規定されたタンパク質発現パラメーターに従って(PCT/EP2013/072717の実施例1を参照)、gpUL75(gH−His)−gpUL115(gL)−gpUL128−gpUL130−gpUL131Aを含む五量体CMV複合体を、使い捨ての2L振盪フラスコ(700mlの培養体積)中、ヨトウムシであるスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞(Sf9)で、単一のバキュロウイルス(配列番号18)からの共発現によって生産する。生産パラメーターは以下の通りであった:細胞2×106個/mlの感染時における最初の細胞数(CCI)、0.25pfu/mlの重複感染度(MOI)、100rpmで27℃のインキュベーション。感染後(p.i.)3日目に回収を約80%の生存率で行った。毎日のサンプリング、細胞数および生存率を決定することによって生産を制御した。複合体を含有する上清を2×5mlのHisTrapカラム(GEヘルスケア(GE Healthcare))にローディングした。複合体を、500mlに等しいカラム体積(CV)の50倍量にわたりゼロから500mMのイミダゾールの直線状の勾配を使用して精製した。異なるクロマトグラフ画分を生化学方法によって分析した。150μlの異なる画分をアセトンで沈殿させ、30μlの20mMのトリス、150mMのNaCl緩衝液、pH7.4に再懸濁した。4〜12%ビストリスNuPAGEゲル(インビトロジェン)へのローディングのために、4×ローディング色素を製造元のプロトコールに従って添加し、続いてMOPSランニング緩衝液を使用して150Vで15分間および180Vで45分間電気泳動した。ゲルをシンプリーブルー・セーフステイン(SafeStain)試薬(インビトロジェン)で一晩染色し、水で脱色した。濃縮とさらなる精製のため、2回目のIMACクロマトグラフィーを、1mlのHisTrapカラムを使用して、カラム体積の50倍量にわたり0から500mMのイミダゾールの直線状の勾配によって行った。異なる画分を、1回目のIMAC工程のようにクーマシー染色されたSDS−PAGEおよび抗His抗体を使用した免疫ブロッティングによって分析した。全ての複合体を含有する画分をプールし、50kDaのカットオフのアミコン(Amicon)フィルターユニット(ミリポア(Millipore))を使用して5mlの最終容量になるまで濃縮し、最終的な精製工程のためにサイズ排除カラム(XK16/69、スーパーデックス200pg)にローディングし、SDS−PAGEとそれに続くクーマシー染色および抗His抗体を使用した免疫ブロッティングによって分析した。総タンパク質は、96−ウェルプレートフォーマットに適合させたブラッドフォードアッセイ(BCA、ピアース(Pierce))により決定される。20μlの未知または標準サンプルを180μlの緩衝液で希釈した。標準(純粋なウシ血清アルブミン)または未知のサンプルを3連で連続的に2倍希釈した。1ウェル当たり100μlの2×ストックのブラッドフォード試薬(ピアース)を添加した。次いでプレートを混合し、マイクロタイタープレートリーダーにおいて595nmで吸光度を測定した。クロマトグラフィーベースの精製からの異なる画分に含有される五量体CMV複合体を、gpUL75に付加したHis−タグ(gH、マウス抗His、AbDセロテック)およびgpUL75それ自身(gH、マウス抗gH、サンタクルズ)に対する特異的な抗体の結合を調査することによってさらに分析する。それゆえに、96ウェルの予備吸収させたELISAプレート中、100μl/ウェルのコーティング緩衝液(0.1MのNa2HPO4、pH9)で、異なるサンプルを1:10に希釈し、4℃で一晩インキュベートした。その後プレートを195μl/ウェルの洗浄緩衝液(1×PBS、0.05%トウィーン(Tween)20)で3回洗浄し、続いて1×PBS溶液中の195μl/ウェルの3%BSAを用いて室温で1時間ブロックした。3回の洗浄工程の後、特異的な抗体、抗His抗体(抗His)、加えて抗gpUL75(抗gH)を、3%BSA、1×PBS、0.05%トウィーン20(pH7)中1μg/mlの濃度で添加し(100μl/ウェル)、室温で1時間インキュベートし、続いてさらに3回洗浄工程を行った。検出のために、適切な二次抗体(抗マウス−IgG−HRP、3%BSA、1×PBS、0.05%トウィーン20、pH7で1:1000希釈)と共に1時間インキュベートした。五量体複合体への特異的な抗体の結合を、100μl/ウェルのTMP基質試薬(BDバイオサイエンス(BD Biosciences)、サンディエゴ、米国;製造元のプロトコールに従って)を使用して検出するために、3〜15分後に100μlの1MのHClで反応を止め、続いてマイクロプレートリーダーにおいて450nmでODを測定した。広い適用範囲の質量分析法によって五量体複合体のタンパク質を同定し、五量体複合体のタンパク質の分子量を以下のように決定した:UL128(MW:19702.982)、UL130(MW:24618.466、UL131A(MW:14865.502)、gL8MW:30894.892)、gH(MW:83203.292)。
系統的な最適化に基づき規定されたタンパク質発現パラメーターに従って(PCT/EP2013/072717の実施例1を参照)、gpUL75(gH−His)−gpUL115(gL)−gpUL128−gpUL130−gpUL131Aを含む五量体CMV複合体を、使い捨ての2L振盪フラスコ(700mlの培養体積)中、ヨトウムシであるスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞(Sf9)で、単一のバキュロウイルス(配列番号18)からの共発現によって生産する。生産パラメーターは以下の通りであった:細胞2×106個/mlの感染時における最初の細胞数(CCI)、0.25pfu/mlの重複感染度(MOI)、100rpmで27℃のインキュベーション。感染後(p.i.)3日目に回収を約80%の生存率で行った。毎日のサンプリング、細胞数および生存率を決定することによって生産を制御した。複合体を含有する上清を2×5mlのHisTrapカラム(GEヘルスケア(GE Healthcare))にローディングした。複合体を、500mlに等しいカラム体積(CV)の50倍量にわたりゼロから500mMのイミダゾールの直線状の勾配を使用して精製した。異なるクロマトグラフ画分を生化学方法によって分析した。150μlの異なる画分をアセトンで沈殿させ、30μlの20mMのトリス、150mMのNaCl緩衝液、pH7.4に再懸濁した。4〜12%ビストリスNuPAGEゲル(インビトロジェン)へのローディングのために、4×ローディング色素を製造元のプロトコールに従って添加し、続いてMOPSランニング緩衝液を使用して150Vで15分間および180Vで45分間電気泳動した。ゲルをシンプリーブルー・セーフステイン(SafeStain)試薬(インビトロジェン)で一晩染色し、水で脱色した。濃縮とさらなる精製のため、2回目のIMACクロマトグラフィーを、1mlのHisTrapカラムを使用して、カラム体積の50倍量にわたり0から500mMのイミダゾールの直線状の勾配によって行った。異なる画分を、1回目のIMAC工程のようにクーマシー染色されたSDS−PAGEおよび抗His抗体を使用した免疫ブロッティングによって分析した。全ての複合体を含有する画分をプールし、50kDaのカットオフのアミコン(Amicon)フィルターユニット(ミリポア(Millipore))を使用して5mlの最終容量になるまで濃縮し、最終的な精製工程のためにサイズ排除カラム(XK16/69、スーパーデックス200pg)にローディングし、SDS−PAGEとそれに続くクーマシー染色および抗His抗体を使用した免疫ブロッティングによって分析した。総タンパク質は、96−ウェルプレートフォーマットに適合させたブラッドフォードアッセイ(BCA、ピアース(Pierce))により決定される。20μlの未知または標準サンプルを180μlの緩衝液で希釈した。標準(純粋なウシ血清アルブミン)または未知のサンプルを3連で連続的に2倍希釈した。1ウェル当たり100μlの2×ストックのブラッドフォード試薬(ピアース)を添加した。次いでプレートを混合し、マイクロタイタープレートリーダーにおいて595nmで吸光度を測定した。クロマトグラフィーベースの精製からの異なる画分に含有される五量体CMV複合体を、gpUL75に付加したHis−タグ(gH、マウス抗His、AbDセロテック)およびgpUL75それ自身(gH、マウス抗gH、サンタクルズ)に対する特異的な抗体の結合を調査することによってさらに分析する。それゆえに、96ウェルの予備吸収させたELISAプレート中、100μl/ウェルのコーティング緩衝液(0.1MのNa2HPO4、pH9)で、異なるサンプルを1:10に希釈し、4℃で一晩インキュベートした。その後プレートを195μl/ウェルの洗浄緩衝液(1×PBS、0.05%トウィーン(Tween)20)で3回洗浄し、続いて1×PBS溶液中の195μl/ウェルの3%BSAを用いて室温で1時間ブロックした。3回の洗浄工程の後、特異的な抗体、抗His抗体(抗His)、加えて抗gpUL75(抗gH)を、3%BSA、1×PBS、0.05%トウィーン20(pH7)中1μg/mlの濃度で添加し(100μl/ウェル)、室温で1時間インキュベートし、続いてさらに3回洗浄工程を行った。検出のために、適切な二次抗体(抗マウス−IgG−HRP、3%BSA、1×PBS、0.05%トウィーン20、pH7で1:1000希釈)と共に1時間インキュベートした。五量体複合体への特異的な抗体の結合を、100μl/ウェルのTMP基質試薬(BDバイオサイエンス(BD Biosciences)、サンディエゴ、米国;製造元のプロトコールに従って)を使用して検出するために、3〜15分後に100μlの1MのHClで反応を止め、続いてマイクロプレートリーダーにおいて450nmでODを測定した。広い適用範囲の質量分析法によって五量体複合体のタンパク質を同定し、五量体複合体のタンパク質の分子量を以下のように決定した:UL128(MW:19702.982)、UL130(MW:24618.466、UL131A(MW:14865.502)、gL8MW:30894.892)、gH(MW:83203.292)。
上記の表1に、五量体CMV複合体を生成するための例示的な発現ベクター(pRBT136−x)を例示する。
発現および精製後、五量体複合体は、例えば本明細書で説明されるようなキレート剤および/または安定化剤と混合されてもよい。
発現および精製後、五量体複合体は、例えば本明細書で説明されるようなキレート剤および/または安定化剤と混合されてもよい。
[0158]実施例2:マウスにおけるインビボでの研究
インビボでの研究のために、プライム−ブースト−ブーストレジメンでBalb/Cマウスを使用した。各グループは8匹のマウスを含有しており、各マウスに注射1回当たり20μgのタンパク質を与えた。マウスの14日の検疫後に(0日目)、免疫前血清を採取した。10日後に第一の注射を行い、続いて42日目にブースター注射を行った。49日目に第一の採血を行った。61日目に2回目のブースター注射を行い、続いて70日目にさらに採血した。85日目に最後の採血を行い、続いて体液性および細胞性免疫応答の調査を行った。
インビボでの研究のために、プライム−ブースト−ブーストレジメンでBalb/Cマウスを使用した。各グループは8匹のマウスを含有しており、各マウスに注射1回当たり20μgのタンパク質を与えた。マウスの14日の検疫後に(0日目)、免疫前血清を採取した。10日後に第一の注射を行い、続いて42日目にブースター注射を行った。49日目に第一の採血を行った。61日目に2回目のブースター注射を行い、続いて70日目にさらに採血した。85日目に最後の採血を行い、続いて体液性および細胞性免疫応答の調査を行った。
[0159]実施例3:中和アッセイに基づく体液性免疫応答
五量体複合体(配列番号18)に基づくワクチン候補の体液性免疫応答を、CMV陰性およびCMV陽性ヒト血液ドナーからの血清と比較した実施例2からのマウス血清の中和アッセイによって調査した。分析上の理由のためのGFP分子を有するBAC(細菌人工染色体)再構成VR1814株(固定EGFP)を、線維芽細胞(MRC−5)および上皮(ARPE−19)細胞の感染に使用して、実施例9からのマウス血清の中和可能性を可視化した。細胞2×104個/ウェルを、10%FCS(ウシ胎児血清)を含有するRPMI培地中の96ウェルプレートに植え付けた。8匹のマウスの血清プールを作製し、100μl/ウェルのRPMI/FCS培地での2倍連続希釈液(1:20から1:2560)に添加した。上述した固定EGFP VR1814ウイルスを、事前のアッセイで決定されたウイルス分子1000個/ウェルの組織培養感染量(TCID)で添加した。96ウェルプレートを、CO2が制御された雰囲気中で37℃で8日間インキュベートした。プレートリーダーで以下のパラメーターを用いて緑色細胞の決定を行った:フルオレセインフィルター[励起485/20、放出530/25)、ボトムの読み取りモード、時間:0.1秒、96時間のインキュベーション後に測定25回/ウェル。中和効力を、50%のウイルス感染阻害を示すことができる血清の希釈率として決定した。以下の対照:細胞対照(細胞+PBS)、ウイルス対照(感染細胞のみ)ならびにヒト血液ドナーからの5つのCMV陽性および5つのCMV陰性血清を用いた。
五量体複合体(配列番号18)に基づくワクチン候補の体液性免疫応答を、CMV陰性およびCMV陽性ヒト血液ドナーからの血清と比較した実施例2からのマウス血清の中和アッセイによって調査した。分析上の理由のためのGFP分子を有するBAC(細菌人工染色体)再構成VR1814株(固定EGFP)を、線維芽細胞(MRC−5)および上皮(ARPE−19)細胞の感染に使用して、実施例9からのマウス血清の中和可能性を可視化した。細胞2×104個/ウェルを、10%FCS(ウシ胎児血清)を含有するRPMI培地中の96ウェルプレートに植え付けた。8匹のマウスの血清プールを作製し、100μl/ウェルのRPMI/FCS培地での2倍連続希釈液(1:20から1:2560)に添加した。上述した固定EGFP VR1814ウイルスを、事前のアッセイで決定されたウイルス分子1000個/ウェルの組織培養感染量(TCID)で添加した。96ウェルプレートを、CO2が制御された雰囲気中で37℃で8日間インキュベートした。プレートリーダーで以下のパラメーターを用いて緑色細胞の決定を行った:フルオレセインフィルター[励起485/20、放出530/25)、ボトムの読み取りモード、時間:0.1秒、96時間のインキュベーション後に測定25回/ウェル。中和効力を、50%のウイルス感染阻害を示すことができる血清の希釈率として決定した。以下の対照:細胞対照(細胞+PBS)、ウイルス対照(感染細胞のみ)ならびにヒト血液ドナーからの5つのCMV陽性および5つのCMV陰性血清を用いた。
[0160]実施例4:EliSpotデータ(マルチプレックスアッセイ)に基づく細胞性免疫応答
インビボでの研究(実施例2)の85日目にマウスを殺し、10種の異なるサイトカインの分析のために脾臓細胞を準備した。脾臓細胞の再刺激のために、複合体に加えて合成ペプチドの混合物を使用した。以下のタンパク質:HIVgag、pUL83、gpUL75、gpUL115、gpUL55、gpUL128、gpUL130およびgpUL131Aを検証した。各タンパク質のエピトープ予測を数種のバイオインフォマティクスアルゴリズムを使用して行った。各タンパク質につき4種のペプチドの混合物を脾臓細胞の再刺激のために生成した。HIVgagの場合、130種のペプチドの市販のペプチド混合物(JPT、ベルリン)を使用した。サイトカイン(IFN−ガンマ、IL−1ベータ、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−12、gCMSFおよびTNFアルファ)を、インビトロジェンからのマルチプレックスアッセイキットにより製造元のプロトコールに従って調査した。
インビボでの研究(実施例2)の85日目にマウスを殺し、10種の異なるサイトカインの分析のために脾臓細胞を準備した。脾臓細胞の再刺激のために、複合体に加えて合成ペプチドの混合物を使用した。以下のタンパク質:HIVgag、pUL83、gpUL75、gpUL115、gpUL55、gpUL128、gpUL130およびgpUL131Aを検証した。各タンパク質のエピトープ予測を数種のバイオインフォマティクスアルゴリズムを使用して行った。各タンパク質につき4種のペプチドの混合物を脾臓細胞の再刺激のために生成した。HIVgagの場合、130種のペプチドの市販のペプチド混合物(JPT、ベルリン)を使用した。サイトカイン(IFN−ガンマ、IL−1ベータ、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−12、gCMSFおよびTNFアルファ)を、インビトロジェンからのマルチプレックスアッセイキットにより製造元のプロトコールに従って調査した。
[0161]実施例5:EliSpotデータ(マルチプレックスアッセイ)に基づく細胞性免疫応答
インビボでの研究(実施例2)の85日目にマウスを殺し、10種の異なるサイトカインの分析のために脾臓細胞を準備した。脾臓細胞の再刺激のために、複合体[2μg/mL]およびre−CMV−VLP[2μg/mL]を使用して、同種および/または異種プライム−ブーストレジメンのための最初のデータを得た。以下のタンパク質:gpUL75、gpUL115、gpUL128、gpUL130およびgpUL131Aを複合体に関して検証した。サイトカイン(IFN−ガンマ、IL−1ベータ、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−12、gCMSFおよびTNFアルファ)を、インビトロジェンからのマルチプレックスアッセイキットにより製造元のプロトコールに従って調査した。複合体で免疫化されたマウスのreCMV−VLPでの再刺激は、IL−4、gCMSFおよびIL−5の分泌によって検証されたT細胞応答の誘導をもたらした。同じ血清の複合体で再刺激された後のサイトカイン分泌は、前述のものと比較してより低かった。これらの結果に基づけば、複合体(1〜10μg/マウスの範囲で)でプライミングし、reCMV−VLP(さらなるタンパク質、例えばgpUL83、gpUL55を含む)でブースティングすることは、有望なアプローチであり得る。
インビボでの研究(実施例2)の85日目にマウスを殺し、10種の異なるサイトカインの分析のために脾臓細胞を準備した。脾臓細胞の再刺激のために、複合体[2μg/mL]およびre−CMV−VLP[2μg/mL]を使用して、同種および/または異種プライム−ブーストレジメンのための最初のデータを得た。以下のタンパク質:gpUL75、gpUL115、gpUL128、gpUL130およびgpUL131Aを複合体に関して検証した。サイトカイン(IFN−ガンマ、IL−1ベータ、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−12、gCMSFおよびTNFアルファ)を、インビトロジェンからのマルチプレックスアッセイキットにより製造元のプロトコールに従って調査した。複合体で免疫化されたマウスのreCMV−VLPでの再刺激は、IL−4、gCMSFおよびIL−5の分泌によって検証されたT細胞応答の誘導をもたらした。同じ血清の複合体で再刺激された後のサイトカイン分泌は、前述のものと比較してより低かった。これらの結果に基づけば、複合体(1〜10μg/マウスの範囲で)でプライミングし、reCMV−VLP(さらなるタンパク質、例えばgpUL83、gpUL55を含む)でブースティングすることは、有望なアプローチであり得る。
[0162]実施例6:2種の異なる株からのタンパク質を含む五量体CMV複合体の発現、精製および特徴付け
系統的な最適化に基づき規定されたタンパク質発現パラメーターに従って(PCT/EP2013/072717の実施例1を参照)、gpUL75(gH−His)−gpUL115(gL)−gpUL128−gpUL130−gpUL131Aを含む五量体CMV複合体を、使い捨ての振盪フラスコまたはウェーブバッグ(最大25Lの培養体積)中、ヨトウムシであるスポドプテラ・フルギペルダ細胞のバリアント(Super−Sf9)で、単一のバキュロウイルス(配列番号67)からの共発現によって生産する。この複合体は、2種の異なるHCMV株(タウン[NCBI FJ616285.1およびVR1814[NCBI GU179289)由来のタンパク質を含有する。生産パラメーターは以下の通りであった:細胞2×106個/mlの感染時における最初の細胞数(CCI)、0.25pfu/mlの重複感染度(MOI)、100rpmで27℃のインキュベーション。感染後3日目に(感染後55〜65時間)回収を約80%の生存率で行った。毎日のサンプリング、細胞数、平均細胞直径、凝集および生存率を決定することによって生産を制御した。複合体を含有する上清をNi2+充填済みセファロースカラム(GEヘルスケア)にバルクの体積に応じた異なるスケールでローディングした。複合体を、約460mlに等しいカラム体積(CV)の23倍量にわたりゼロから500mMのイミダゾールの段階的な勾配を使用して精製した。異なるクロマトグラフ画分を生化学方法によって分析した。150〜300μlの異なる画分をアセトンで沈殿させ、33μlの20mMのトリス、150mMのNaCl緩衝液、pH7.4に再懸濁した。4〜12%ビストリスNuPAGEゲル(インビトロジェン)へのローディングのために、4×ローディング色素を製造元のプロトコールに従って添加し、続いてMOPSランニング緩衝液を使用して150Vで15分間および180Vで45分間電気泳動した。ゲルをシンプリーブルー・セーフステイン試薬(インビトロジェン)で少なくとも1時間染色し、水で脱色した。濃縮とさらなる精製のため、2回目のIMACクロマトグラフィーを、さらなるセファロースカラム(5mLのHisTrap)およびカラム体積(CV)の31倍量にわたり0から500mMのイミダゾールの段階的な勾配を使用して行った。異なる画分を、1回目のIMAC工程のようにクーマシー染色されたSDS−PAGEによって分析した。全ての複合体を含有する画分を統合し、PALLマイクロセップ遠心デバイスで濃縮して、25mMトリス、150mMのNaCl、3mMのKCl、pH6.5、3mMのEDTAを含有する貯蔵緩衝液に対して透析した。精製された可溶性複合体をSDS−PAGE(上述の通り)、それに続くクーマシー染色および様々な量のBSAと比較した濃度測定分析によって分析した。
系統的な最適化に基づき規定されたタンパク質発現パラメーターに従って(PCT/EP2013/072717の実施例1を参照)、gpUL75(gH−His)−gpUL115(gL)−gpUL128−gpUL130−gpUL131Aを含む五量体CMV複合体を、使い捨ての振盪フラスコまたはウェーブバッグ(最大25Lの培養体積)中、ヨトウムシであるスポドプテラ・フルギペルダ細胞のバリアント(Super−Sf9)で、単一のバキュロウイルス(配列番号67)からの共発現によって生産する。この複合体は、2種の異なるHCMV株(タウン[NCBI FJ616285.1およびVR1814[NCBI GU179289)由来のタンパク質を含有する。生産パラメーターは以下の通りであった:細胞2×106個/mlの感染時における最初の細胞数(CCI)、0.25pfu/mlの重複感染度(MOI)、100rpmで27℃のインキュベーション。感染後3日目に(感染後55〜65時間)回収を約80%の生存率で行った。毎日のサンプリング、細胞数、平均細胞直径、凝集および生存率を決定することによって生産を制御した。複合体を含有する上清をNi2+充填済みセファロースカラム(GEヘルスケア)にバルクの体積に応じた異なるスケールでローディングした。複合体を、約460mlに等しいカラム体積(CV)の23倍量にわたりゼロから500mMのイミダゾールの段階的な勾配を使用して精製した。異なるクロマトグラフ画分を生化学方法によって分析した。150〜300μlの異なる画分をアセトンで沈殿させ、33μlの20mMのトリス、150mMのNaCl緩衝液、pH7.4に再懸濁した。4〜12%ビストリスNuPAGEゲル(インビトロジェン)へのローディングのために、4×ローディング色素を製造元のプロトコールに従って添加し、続いてMOPSランニング緩衝液を使用して150Vで15分間および180Vで45分間電気泳動した。ゲルをシンプリーブルー・セーフステイン試薬(インビトロジェン)で少なくとも1時間染色し、水で脱色した。濃縮とさらなる精製のため、2回目のIMACクロマトグラフィーを、さらなるセファロースカラム(5mLのHisTrap)およびカラム体積(CV)の31倍量にわたり0から500mMのイミダゾールの段階的な勾配を使用して行った。異なる画分を、1回目のIMAC工程のようにクーマシー染色されたSDS−PAGEによって分析した。全ての複合体を含有する画分を統合し、PALLマイクロセップ遠心デバイスで濃縮して、25mMトリス、150mMのNaCl、3mMのKCl、pH6.5、3mMのEDTAを含有する貯蔵緩衝液に対して透析した。精製された可溶性複合体をSDS−PAGE(上述の通り)、それに続くクーマシー染色および様々な量のBSAと比較した濃度測定分析によって分析した。
[0163]上記の表1に、五量体CMV複合体を生成するための例示的な発現ベクター(pRBT136−x)を例示する。
[0164]発現および精製後、五量体複合体は、例えば本明細書で説明されるようなキレート剤および/または安定化剤と混合されてもよい。
[0164]発現および精製後、五量体複合体は、例えば本明細書で説明されるようなキレート剤および/または安定化剤と混合されてもよい。
[0165]実施例7:異なる抗原を含むマウスにおけるインビボでの研究
インビボでの研究のために、プライム−ブースト−ブーストレジメンでBalb/Cマウスを使用した。各グループは8匹のマウスを含有しており、各マウスに、アジュバント含有または非含有のいずれかで注射1回当たり5μg、10μgまたは20μgのタンパク質を与えた。陰性対照としてPBSを使用し、陽性対照は、不活性化AD169溶解産物であり、残りのバキュロウイルス(BV)の調査のために、精製後に残りのバキュロウイルスの一致した力価を有する生産ウイルスを同様に注射した。マウスの6日の検疫後に(0日目)、免疫前血清を採取した。10日後に第一の注射を行い、続いて28日目にブースター注射を行った。36日目に第一の採血を行った。48日目に2回目のブースター注射を行い、続いて55日目にさらに採血した。60日目に最後の採血を行い、続いて体液性および細胞性免疫応答の調査を行った。体重を毎週測定した(図12を参照)。
インビボでの研究のために、プライム−ブースト−ブーストレジメンでBalb/Cマウスを使用した。各グループは8匹のマウスを含有しており、各マウスに、アジュバント含有または非含有のいずれかで注射1回当たり5μg、10μgまたは20μgのタンパク質を与えた。陰性対照としてPBSを使用し、陽性対照は、不活性化AD169溶解産物であり、残りのバキュロウイルス(BV)の調査のために、精製後に残りのバキュロウイルスの一致した力価を有する生産ウイルスを同様に注射した。マウスの6日の検疫後に(0日目)、免疫前血清を採取した。10日後に第一の注射を行い、続いて28日目にブースター注射を行った。36日目に第一の採血を行った。48日目に2回目のブースター注射を行い、続いて55日目にさらに採血した。60日目に最後の採血を行い、続いて体液性および細胞性免疫応答の調査を行った。体重を毎週測定した(図12を参照)。
[0166]実施例8:中和アッセイに基づく体液性免疫応答
五量体複合体バリアント(配列番号18;配列番号67、加えてウイルス様粒子と組み合せた[VLP;配列番号6、UL86、UL85、UL48、UL83およびUL74を含む担体上])に基づくワクチン候補の体液性免疫応答を、CMV陰性およびCMV陽性ヒト血液ドナーからの血清と比較した実施例7からのマウス血清の中和アッセイによって調査した。分析上の理由のためのGFP分子を有するBAC(細菌人工染色体)再構成VR1814株(固定EGFP)、加えてTB40E株を、線維芽細胞(MRC−5)および上皮(ARPE−19)細胞の感染に使用して、実施例からのマウス血清の中和可能性を可視化した。細胞2×104個/ウェルを、10%FCS(ウシ胎児血清)を含有するRPMI培地中の96ウェルプレートに植え付けた。8匹のマウスのうち4匹マウスの血清プールを作製し、100μl/ウェルのRPMI/FCS培地での2倍連続希釈液(1:20から1:2560)に添加した。上述した固定EGFP VR1814ウイルス、加えてTB40Eを、事前のアッセイで決定されたウイルス分子1000個/ウェルの組織培養感染量(TCID)で添加した。96ウェルプレートを、CO2が制御された雰囲気中で37℃で8日間インキュベートした。プレートリーダーで以下のパラメーターを用いて緑色細胞の決定を行った:フルオレセインフィルター[励起485/20、放出530/25)、ボトムの読み取りモード、時間:0.1秒、96時間のインキュベーション後に測定25回/ウェル。中和効力を、50%のウイルス感染阻害を示すことができる血清の希釈率として決定した。以下の対照:細胞対照(細胞+PBS)、ウイルス対照(感染細胞のみ)ならびにヒト血液ドナーからの5つのCMV陽性および5つのCMV陰性血清を用いた。興味深いことに、五量体複合体での免疫化により放出された中和抗体は、ウイルス株とは無関係に線維芽細胞を介したウイルス侵入を低減または阻害する能力を同様に有する。これらのデータから、五量体複合体を含有するワクチンに基づく広範な免疫応答の達成が可能になることが期待される(図8を参照)。
五量体複合体バリアント(配列番号18;配列番号67、加えてウイルス様粒子と組み合せた[VLP;配列番号6、UL86、UL85、UL48、UL83およびUL74を含む担体上])に基づくワクチン候補の体液性免疫応答を、CMV陰性およびCMV陽性ヒト血液ドナーからの血清と比較した実施例7からのマウス血清の中和アッセイによって調査した。分析上の理由のためのGFP分子を有するBAC(細菌人工染色体)再構成VR1814株(固定EGFP)、加えてTB40E株を、線維芽細胞(MRC−5)および上皮(ARPE−19)細胞の感染に使用して、実施例からのマウス血清の中和可能性を可視化した。細胞2×104個/ウェルを、10%FCS(ウシ胎児血清)を含有するRPMI培地中の96ウェルプレートに植え付けた。8匹のマウスのうち4匹マウスの血清プールを作製し、100μl/ウェルのRPMI/FCS培地での2倍連続希釈液(1:20から1:2560)に添加した。上述した固定EGFP VR1814ウイルス、加えてTB40Eを、事前のアッセイで決定されたウイルス分子1000個/ウェルの組織培養感染量(TCID)で添加した。96ウェルプレートを、CO2が制御された雰囲気中で37℃で8日間インキュベートした。プレートリーダーで以下のパラメーターを用いて緑色細胞の決定を行った:フルオレセインフィルター[励起485/20、放出530/25)、ボトムの読み取りモード、時間:0.1秒、96時間のインキュベーション後に測定25回/ウェル。中和効力を、50%のウイルス感染阻害を示すことができる血清の希釈率として決定した。以下の対照:細胞対照(細胞+PBS)、ウイルス対照(感染細胞のみ)ならびにヒト血液ドナーからの5つのCMV陽性および5つのCMV陰性血清を用いた。興味深いことに、五量体複合体での免疫化により放出された中和抗体は、ウイルス株とは無関係に線維芽細胞を介したウイルス侵入を低減または阻害する能力を同様に有する。これらのデータから、五量体複合体を含有するワクチンに基づく広範な免疫応答の達成が可能になることが期待される(図8を参照)。
[0167]実施例9:EliSpotデータ(マルチプレックスアッセイ)に基づく細胞性免疫応答
インビボでの研究(実施例2)の60日目にマウスを殺し、脾臓細胞を3種の異なるサイトカインの分析のために調製した。脾臓細胞の再刺激のために、AD169ウイルス溶解産物を使用した。サイトカイン(IFN−ガンマ、IL−4、IL−5)を、インビトロジェンからのマルチプレックスアッセイキットにより製造元のプロトコールに従って調査した。機能的ではない五量体複合体を含有するウイルス溶解産物での再刺激後のサイトカイン分泌は、Th−1およびTh−2応答を引き起こした。機能性タンパク質での再刺激は、有望なサイトカイン誘導を引き起こすことが可能であった。アジュバントは、IL−4分泌を介した測定された特異的なTh−2応答の増加を引き起こした。低い五量体複合体の投薬量(5μg)のほうが、高い投薬量(10μg)より有益のようである。バキュロウイルス抗原は、ごくわずかなサイトカイン分泌のみを引き起こした(図7を参照)。
インビボでの研究(実施例2)の60日目にマウスを殺し、脾臓細胞を3種の異なるサイトカインの分析のために調製した。脾臓細胞の再刺激のために、AD169ウイルス溶解産物を使用した。サイトカイン(IFN−ガンマ、IL−4、IL−5)を、インビトロジェンからのマルチプレックスアッセイキットにより製造元のプロトコールに従って調査した。機能的ではない五量体複合体を含有するウイルス溶解産物での再刺激後のサイトカイン分泌は、Th−1およびTh−2応答を引き起こした。機能性タンパク質での再刺激は、有望なサイトカイン誘導を引き起こすことが可能であった。アジュバントは、IL−4分泌を介した測定された特異的なTh−2応答の増加を引き起こした。低い五量体複合体の投薬量(5μg)のほうが、高い投薬量(10μg)より有益のようである。バキュロウイルス抗原は、ごくわずかなサイトカイン分泌のみを引き起こした(図7を参照)。
[0168]実施例10:タウン株由来のタンパク質を含む五量体CMV複合体の改善された発現、精製および特徴付け
系統的な最適化に基づき規定されたタンパク質発現パラメーターに従って(PCT/EP2013/072717の実施例1を参照)、gpUL75(gH−His)−gpUL115(gL)−gpUL128−gpUL130−gpUL131Aを含む五量体CMV複合体を、使い捨ての振盪フラスコまたはウェーブバッグ(最大25Lの培養体積)中、ヨトウムシであるスポドプテラ・フルギペルダ細胞のバリアント(Super−Sf9)で、単一のバキュロウイルス(配列番号67)からの共発現によって生産する。この複合体は、HCMV株タウン([NCBI FJ616285.1)由来のタンパク質を含有する。生産パラメーターは以下の通りであった:細胞2×106個/mlの感染時における最初の細胞数(CCI)、0.1から1の範囲の重複感染度(MOI)、100rpmで27℃のインキュベーション。感染後2〜3日目に(感染後48〜65時間)回収を約80%の生存率で行った(表3を参照)。毎日のサンプリング、細胞数、平均細胞直径、凝集および生存率を決定することによって生産を制御した。ウェーブバッグ中での生産のために、異なるパラメーター:19から22rpmの間の回転数、6の角度および制御された酸素供給との組合せが選択された。複合体を含有する上清をNi2+充填済みセファロースカラム(GEヘルスケア)にバルクの体積に応じた異なるスケールでローディングした。複合体を、カラム体積(CV)の7〜15倍量にわたりゼロから500mMのイミダゾールの段階的な勾配を使用して精製した。15μlの直接のローディング、または150〜300μlの様々な画分のアセトン沈殿(33μlの20mMのトリス、150mMのNaCl緩衝液、pH7.4に再懸濁した)のいずれかによって、異なるクロマトグラフ画分を生化学方法によって分析した。4〜12%ビストリスNuPAGEゲル(インビトロジェン)へのローディングのために、4×ローディング色素を製造元のプロトコールに従って添加し、続いてMOPSランニング緩衝液を使用して150Vで15分間および180Vで45分間電気泳動した。ゲルをシンプリーブルー・セーフステイン試薬(インビトロジェン)で少なくとも1時間染色し、水で脱色した。残りのバキュロウイルスの量を少なくするために、陰イオン交換クロマトグラフィーをネガティブモードで行った。さらなるセファロースカラム(スケールは体積に依存する)とカラム体積(CV)の15〜30倍量にわたり0から500mMのイミダゾールの段階的な勾配を使用した2回目のアフィニティークロマトグラフィーによって、五量体複合体を含有する通過画分をさらに濃縮し、精製した。異なる画分を、1回目のIMAC工程のようにクーマシー染色されたSDS−PAGEによって分析した。全ての複合体を含有する画分を統合し、品質をコントロールした。PALLマイクロセップ遠心デバイスを用いた濃縮物は、統合することができた。イミダゾールの排出を数種の透析工程によって行った。第一の透析緩衝液は、20mMのEDTAを含有しており、次いでそれより少量の0〜3mMのEDTAに低減される。例えばPBSへの完全な緩衝液の切り替えも可能である。複合体の貯蔵および安定化のために、トウィーン20、トウィーン80、グリセロールなどの様々な化学物質が添加されてもよい。精製された可溶性複合体をSDS−PAGE(上述の通り)、それに続くクーマシー染色および様々な量のBSAと比較した濃度測定分析によって分析した。タンパク質濃度を、BCAアッセイ、同様に残りのバキュロウイルスによって決定した。残りのバキュロウイルスのゲノムは、ウイルス参照遺伝子(IE−1)に基づくqPCRに加えて、平衡色素(equilibrium dye)の組合せを使用したウイルスカウンター(ヴィロサイト(Virocyt))でのウイルスキャプシド中のウイルスゲノム(および一般的には核酸)およびタンパク質の蛍光測定によって決定される。核酸およびウイルス膜タンパク質の同時の吸光度決定によるこの「組合せ」のアプローチはウイルス粒子総量の検出を可能にし、それに対して感染性の粒子は、プラークアッセイによって測定した。LALアッセイをベースとしたチャールスリバー(Charles River)製のエンドセーフ(Endosafe)デバイス(PTS20F)を、認証を受けた使い捨てのカートリッジを使用した内毒素決定に使用した。インビトロジェン製のQuant−iT(商標)PicoGreen(登録商標)アッセイ(P7589)を、最終産物中のdsDNA含量決定に使用した。
系統的な最適化に基づき規定されたタンパク質発現パラメーターに従って(PCT/EP2013/072717の実施例1を参照)、gpUL75(gH−His)−gpUL115(gL)−gpUL128−gpUL130−gpUL131Aを含む五量体CMV複合体を、使い捨ての振盪フラスコまたはウェーブバッグ(最大25Lの培養体積)中、ヨトウムシであるスポドプテラ・フルギペルダ細胞のバリアント(Super−Sf9)で、単一のバキュロウイルス(配列番号67)からの共発現によって生産する。この複合体は、HCMV株タウン([NCBI FJ616285.1)由来のタンパク質を含有する。生産パラメーターは以下の通りであった:細胞2×106個/mlの感染時における最初の細胞数(CCI)、0.1から1の範囲の重複感染度(MOI)、100rpmで27℃のインキュベーション。感染後2〜3日目に(感染後48〜65時間)回収を約80%の生存率で行った(表3を参照)。毎日のサンプリング、細胞数、平均細胞直径、凝集および生存率を決定することによって生産を制御した。ウェーブバッグ中での生産のために、異なるパラメーター:19から22rpmの間の回転数、6の角度および制御された酸素供給との組合せが選択された。複合体を含有する上清をNi2+充填済みセファロースカラム(GEヘルスケア)にバルクの体積に応じた異なるスケールでローディングした。複合体を、カラム体積(CV)の7〜15倍量にわたりゼロから500mMのイミダゾールの段階的な勾配を使用して精製した。15μlの直接のローディング、または150〜300μlの様々な画分のアセトン沈殿(33μlの20mMのトリス、150mMのNaCl緩衝液、pH7.4に再懸濁した)のいずれかによって、異なるクロマトグラフ画分を生化学方法によって分析した。4〜12%ビストリスNuPAGEゲル(インビトロジェン)へのローディングのために、4×ローディング色素を製造元のプロトコールに従って添加し、続いてMOPSランニング緩衝液を使用して150Vで15分間および180Vで45分間電気泳動した。ゲルをシンプリーブルー・セーフステイン試薬(インビトロジェン)で少なくとも1時間染色し、水で脱色した。残りのバキュロウイルスの量を少なくするために、陰イオン交換クロマトグラフィーをネガティブモードで行った。さらなるセファロースカラム(スケールは体積に依存する)とカラム体積(CV)の15〜30倍量にわたり0から500mMのイミダゾールの段階的な勾配を使用した2回目のアフィニティークロマトグラフィーによって、五量体複合体を含有する通過画分をさらに濃縮し、精製した。異なる画分を、1回目のIMAC工程のようにクーマシー染色されたSDS−PAGEによって分析した。全ての複合体を含有する画分を統合し、品質をコントロールした。PALLマイクロセップ遠心デバイスを用いた濃縮物は、統合することができた。イミダゾールの排出を数種の透析工程によって行った。第一の透析緩衝液は、20mMのEDTAを含有しており、次いでそれより少量の0〜3mMのEDTAに低減される。例えばPBSへの完全な緩衝液の切り替えも可能である。複合体の貯蔵および安定化のために、トウィーン20、トウィーン80、グリセロールなどの様々な化学物質が添加されてもよい。精製された可溶性複合体をSDS−PAGE(上述の通り)、それに続くクーマシー染色および様々な量のBSAと比較した濃度測定分析によって分析した。タンパク質濃度を、BCAアッセイ、同様に残りのバキュロウイルスによって決定した。残りのバキュロウイルスのゲノムは、ウイルス参照遺伝子(IE−1)に基づくqPCRに加えて、平衡色素(equilibrium dye)の組合せを使用したウイルスカウンター(ヴィロサイト(Virocyt))でのウイルスキャプシド中のウイルスゲノム(および一般的には核酸)およびタンパク質の蛍光測定によって決定される。核酸およびウイルス膜タンパク質の同時の吸光度決定によるこの「組合せ」のアプローチはウイルス粒子総量の検出を可能にし、それに対して感染性の粒子は、プラークアッセイによって測定した。LALアッセイをベースとしたチャールスリバー(Charles River)製のエンドセーフ(Endosafe)デバイス(PTS20F)を、認証を受けた使い捨てのカートリッジを使用した内毒素決定に使用した。インビトロジェン製のQuant−iT(商標)PicoGreen(登録商標)アッセイ(P7589)を、最終産物中のdsDNA含量決定に使用した。
DSPプロセス(IMAC−AEX−IMAC)の最後における生成物の同一性を直接のELISAを介して確認した。α−gH−抗体(サンタクルズ、sc−58113)およびα−His−抗体(AbDセロテック、MCA1396)で複合体を検証し、α−マウス−HRP抗体(セルシグナリング、7076S)で検出した(図9および10を参照)。
発現および精製後、五量体複合体は、例えば本明細書で説明されるようなキレート剤および/または安定化剤と混合されてもよい(図11を参照)。
Claims (42)
- CMVタンパク質であるUL128、UL130、UL131A、gH(UL75)およびgL(UL115)で構成される五量体複合体であって、
(i)バキュロウイルスを使用することによって、CMVタンパク質であるUL128、UL130、UL131A、gH(UL75)およびgL(UL115)を宿主細胞中で共発現させること;
(ii)前記共発現により得られた宿主細胞および/または上清から、五量体複合体を精製すること;および
(iii)任意選択で、精製された五量体複合体を、キレート剤および/または安定化剤を含む緩衝溶液中で貯蔵すること
を含む方法によって入手可能である、上記五量体複合体。 - 前記宿主細胞が、昆虫細胞または哺乳動物細胞である、請求項1に記載の五量体複合体。
- 前記昆虫細胞が、Sf9、Sf21、HighFive、S2、Super Sf9−1、Super Sf9−2、またはSuper Sf−9−3である、請求項2に記載の五量体複合体。
- 前記共発現の工程が、
(i)感染時に細胞約2×106個/mLの細胞数を有する前記宿主細胞を感染させる際に、前記タンパク質を発現し、約107pfu/mLまたはそれより高い力価を有するバキュロウイルスで宿主細胞を感染させること;
(ii)前記宿主細胞を好適な条件下で培養すること、および
(iii)感染後56から65時間の間に前記宿主細胞および/または上清を回収すること
を包含する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の五量体複合体。 - 前記宿主細胞を、融解および培養の後、15日目から50日目の間、好ましくは15日目から30日目の間、好ましくは18日目に感染させる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の五量体複合体。
- 精製が、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよび/またはアフィニティークロマトグラフィーを包含する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の五量体複合体。
- 前記キレート剤が、EDTAまたはEGTAである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の五量体複合体。
- EDTAが、20mMまたはそれ未満、例えば3mMまたはそれ未満の濃度で前記緩衝溶液中に存在する、請求項7に記載の五量体複合体。
- 前記安定化剤が、ポリエチレングリコール、アルギニン、ソルビトール、グリセロール、スクロースおよび/またはNP−40である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の五量体複合体。
- 前記緩衝溶液が、トリス緩衝液、NaCl、KClを含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の五量体複合体。
- CMVタンパク質であるUL128、UL130、UL131A、gHおよびgLをコードする前記オープンリーディングフレーム(ORF)が、1つまたはそれより多くのベクターにあり、好ましくは単一のベクターにある、請求項1〜10のいずれか一項に記載の五量体複合体。
- 前記ベクターが、細菌(大腸菌)、酵母(S.セレビジエ)、昆虫細胞および/または哺乳動物細胞における繁殖のためのエレメントを含有する、請求項11に記載の五量体複合体。
- 前記ORFが、前記ベクター中に5’から3’に以下の順番:
(i)gH、gL、UL128、UL130、UL131A;または
(ii)gL、UL128、UL130、UL131A、gH
で配置されている、請求項11または12に記載の五量体複合体。 - (a)(i)において、gHのORFは、3’方向で転写され、gLのORFは5’方向で転写され、UL128のORFは3’方向で転写され、UL130のORFは3’方向で転写され、UL131AのORFは3’方向で転写され;
(b)(i)において、gHのORFは3’方向で転写され、gLのORFは3’方向で転写され、UL128のORFは3’方向で転写され、UL130のORFは3’方向で転写され、UL131AのORFは3’方向で転写され;
(c)(ii)において、gLのORFは5’方向で転写され、UL128のORFは3’方向で転写され、UL130のORFは3’方向で転写され、UL131AのORFは3’方向で転写され、gHのORFは3’方向で転写される、請求項13に記載の五量体複合体。 - 前記ORFのそれぞれが、p10プロモーター、polhプロモーター、IE−1プロモーター、mCMVプロモーター、vp39プロモーター,lef2プロモーター、CAGプロモーター、またはHepB SV40プロモーター、およびそれに続いてターミネーター配列、例えばHSVtkターミネーターまたはSV40ターミネーターによって駆動される、請求項11〜14のいずれか一項に記載の五量体複合体。
- 前記タンパク質の少なくとも1つが、タグを含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の五量体複合体。
- 前記タグが、His−タグ、Strep−タグ、His−Strep−タグ、StrepII−タグ、Softag 1、TC−タグ、myc−タグ、FLAG−タグ、HA−タグ、V5−タグ、Avi−タグ、カルモジュリン−タグ、ポリグルタメート−タグ、アミロイドベータ−タグ、GST−タグ、MBP−タグまたはS−タグである、請求項16に記載の五量体複合体。
- 前記タンパク質の1種またはそれより多くが、プレシジョンプロテアーゼまたはプレシジョンおよびTEVプロテアーゼを含み、好ましくは、gHおよび/またはgLタンパク質が、プレシジョンプロテアーゼまたはプレシジョンおよびTEVプロテアーゼを含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の五量体複合体。
- 前記バキュロウイルスにおいて、v−cathおよび/またはChiA活性が、機能的に破壊されている、請求項1〜18のいずれか一項に記載の五量体複合体。
- 組成物の形態である、請求項1〜19のいずれか一項に記載の五量体複合体。
- 上皮/内皮(Epi/EC)および線維芽細胞の感染を両方とも阻害する中和活性を誘導することが可能な、請求項1〜20のいずれか一項に記載の五量体複合体。
- CMVタンパク質であるUL128、UL130、UL131A、gH(UL75)およびgL(UL115)で構成される五量体複合体を生産するための方法であって、
(i)バキュロウイルスを使用することによって、CMVタンパク質であるUL128、UL130、UL131A、gH(UL75)およびgL(UL115)を宿主細胞中で共発現させること;
(ii)前記共発現により得られた宿主細胞および/または上清から、五量体複合体を精製すること;および
(iii)任意選択で、精製された五量体複合体を、キレート剤および/または安定化剤を含む緩衝溶液中で貯蔵すること
を含む、上記方法。 - 前記タンパク質の1種またはそれより多くが、追加のBおよび/またはT細胞エピトープを含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載の五量体複合体。
- 前記T細胞エピトープが、CD4T細胞エピトープまたはCD8T細胞エピトープである、請求項23に記載の五量体複合体。
- 前記エピトープが、配列番号22〜66に示されるエピトープのいずれか1つである、請求項23または24に記載の五量体複合体。
- 請求項1〜21および23〜25のいずれか一項に記載の五量体複合体または請求項22に記載の方法によって入手可能な五量体複合体、および任意選択で医薬的に許容される担体またはアジュバントを含む、医薬組成物またはワクチン組成物。
- 前記タンパク質の少なくとも1種、2種、3種または4種が、残りのタンパク質の由来となったCMV株以外のCMV株である、請求項1〜21および23〜25のいずれか一項に記載の五量体複合体または請求項26に記載の医薬組成物。
- 前記CMVタンパク質が、以下のCMV株、すなわちNCBIのGenBankに受託番号FJ616285.1で寄託されたゲノムを有するタウン、トレド(GU937742.1)、AD169(FJ527563)、マーリン(AY446894.2)、TB40/E(KF297339.1)、VR1814(GU179289)由来である、請求項27に記載の五量体複合体。
- gBタンパク質、gMタンパク質、pp65タンパク質、IE−1タンパク質、gL/gHタンパク質の二量体、gM/gNタンパク質の二量体、gL/gH/gOの三量体、ウイルス様粒子(VLP)であって1つまたはそれより多くのキャプシドもしくはキャプシド前駆タンパク質、CMV由来の1つまたはそれより多くの表面タンパク質、および/または1つまたはそれより多くの外被タンパク質を含むVLP、をさらに含む、請求項26に記載のワクチン組成物。
- gB、gM、pp65、IE−1またはIE−2をコードする核酸分子をさらに含む、請求項26に記載のワクチン組成物。
- 請求項1〜25のいずれか一項に記載の五量体複合体をコードするベクターを含むワクチン組成物。
- 前記ベクターが、DNAベースであるか、またはRNAベースである、請求項31に記載のワクチン組成物。
- UL128、UL130、UL131、gH(UL75)およびgL(UL115)で構成されるCMV五量体複合体の1つまたはそれより多くのタンパク質を含む改変ワクシニアウイルス アンカラ(MVA)、をさらに含む、請求項26〜32のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
- 対象にCMVに対するワクチン接種をする方法で使用するための、請求項26〜33のいずれか一項に記載のワクチン組成物であって、
該方法は、プライミング組成物として前記ワクチン組成物を、
ブースティング組成物として(i)gH/gL二量体、(ii)UL130/UL131A−二量体、(iii)gM/gN二量体、(iv)gH/gL/UL128/UL130/UL131A−五量体、(v)gB、(vi)gM、(vii)pp65、(viii)IE−1、(ix)IE−2、(x)UL128、UL130、UL131、gH(UL75)およびgL(UL115)で構成されるCMV五量体複合体の1つまたはそれより多くのタンパク質を含む改変ワクシニアウイルス アンカラ(MVA)、(xi)gB、gH/gL二量体、pp65タンパク質またはIE−1タンパク質を含む改変ワクシニアウイルス アンカラ(MVA)、(xii)1つまたはそれより多くのキャプシドもしくはキャプシド前駆タンパク質、CMV由来の1つまたはそれより多くの表面タンパク質、または1つまたはそれより多くの外被タンパク質を含むウイルス様粒子(VLP)、(xiii)(i)から(xii)で規定された化合物のいずれか1種をコードする核酸配列、(xiv)フラジェリン由来のペプチド、(xv)CpGモチーフ、および/または(xvi)LCMVを、
前記対象に投与することを含む、前記ワクチン組成物。 - 前記ブースティング組成物が、プライミング組成物として使用され、前記プライミング組成物が、ブースティング組成物として使用される、請求項34に記載のワクチン組成物。
- CMVタンパク質であるUL128、UL130、UL131、gHおよびgLをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む1つまたはそれより多くのベクター。
- 前記ベクターが、細菌(例えば大腸菌)、酵母(例えばS.セレビジエ)、昆虫細胞および/または哺乳動物細胞における繁殖のためのエレメントを含有する、請求項36に記載のベクター。
- 前記ベクターが、バキュロウイルスベクターまたはバキュロウイルスBacMamベクターである、請求項36または37に記載のベクター。
- 前記バキュロウイルスベクターにおいて、v−cathおよび/またはChiA遺伝子が、機能的に破壊されている、請求項36〜38のいずれか一項に記載のベクター。
(a)前記ORFが、前記ベクター中に5’から3’に以下の順番で配置されている、請求項24〜27のいずれか一項に記載のベクター:
(b)gH、gL、UL128、UL130、UL131;または
(c)gL、UL128、UL130、UL131、gH。 - (a)(i)において、gHのORFは、3’方向で転写され、gLのORFは5’方向で転写され、UL128のORFは3’方向で転写され、UL130のORFは3’方向で転写され、UL131のORFは3’方向で転写され;
(b)(i)において、gHのORFは3’方向で転写され、gLのORFは3’方向で転写され、UL128のORFは3’方向で転写され、UL130のORFは3’方向で転写され、UL131のORFは3’方向で転写され;
(c)(ii)において、gLのORFは5’方向で転写され、UL128のORFは3’方向で転写され、UL130のORFは3’方向で転写され、UL131のORFは3’方向で転写され、gHのORFは3’方向で転写される、請求項39に記載のベクター。 - 前記ORFのそれぞれが、p10プロモーター、polhプロモーター、IE−1プロモーター、mCMVプロモーター、vp39プロモーター,lef2プロモーター、CAGプロモーター、またはHepB SV40プロモーター、およびそれに続いてターミネーター配列、例えばHSVtkターミネーターまたはSV40ターミネーターによって駆動される、請求項36〜40のいずれか一項に記載のベクター。
- 請求項36〜41のいずれか一項に記載のベクターおよび任意選択で医薬的に許容される担体またはアジュバントを含むワクチン。
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